CN110057805B - 一种三磷酸腺苷荧光检测水产品新鲜度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及食品质量分析领域,具体来说是一种检测水产品新鲜度的方法。步骤包括:样品预处理,金属有机框架/铜纳米团簇、水产品上清液以及Tris‑HCl缓冲液混合孵育,通过测定其荧光发射强度,并将强度值代入线性方程,确定ATP的浓度范围。本发明合成的复合材料低毒无污染、成本低、简单易得,用于检测ATP,具有灵敏度高,抗干扰能力强,方法简便易操作以及可实现快速检测等优点,在优化后的最佳实验条件下,可以准确快速地实现水产品中ATP含量的检测,并以此作为水产品质鲜度的评价指标。
Description
技术领域
本发明涉及食品质量分析领域,具体涉及一种腺苷三磷酸荧光检测水产品新鲜度的方法。
背景技术
水产品作为人类日常饮食的一部分,其新鲜度不仅影响其自身的口感还会对人类健康产生一定影响。K值是目前用来衡量水产品新鲜度最常用的指标,活体水产品的肌肉运动都需要腺苷三磷酸(ATP)来提供能量,死后的水产品体内的ATP就会在酶的作用下被降解为其他物质。K值可表示为次黄嘌呤核苷、次黄嘌呤量之和与ATP及降解产物总量的百分比。另一方面,ATP还是生物体的最直接能量来源。具有代谢活性的细胞含有一定量的ATP,而在凋亡或者坏死的细胞中ATP含量则迅速下降,因此,ATP还可作为细胞活性的标志物。
目前,对ATP的检测方法主要有层析法,毛细管电泳法,液相色谱串联质谱法等。这些传统方法大多需要繁琐的样品前处理过程,仪器操作复杂,价格昂贵。
发明内容
针对上述现有技术的不足,本发明提供一种腺苷三磷酸荧光检测水产品新鲜度的方法。该方法具有灵敏度高,抗干扰能力强,方法简便易操作以及可实现快速检测等优点。
一种腺苷三磷酸荧光检测水产品新鲜度的方法,步骤包括:
(1)将水产品肉质经破碎、调pH至7.4,Tris-HCl缓冲液定容后,以8000转/min离心5 min,滤膜过滤后获得上清液;
(2)将步骤(1)得到的上清液1mL加入到1–2 mL 金属有机框架/铜纳米团簇CuNCs/ZIF-90水溶液中,混匀后加入1 mL的Tris-HCl缓冲液;在25–37℃温度下孵育5–30分钟;在365 nm的激发波长下测定其荧光发射强度,并将强度值代入线性关系式,确定腺苷三磷酸ATP的浓度范围;
(3)根据腺苷三磷酸ATP的浓度大小判断水产品新鲜度:浓度越高,水产品越新鲜。
进一步的,所述的水产品为海水鱼、爬虾或青虾。
进一步的,所述的金属有机框架/铜纳米团簇CuNCs/ZIF-90的合成方法:称取0.5960 g Zn(NO3)2· 6H2O和0.0961 g 咪唑-2-甲醛(2-ICA)于20 mL DMF溶液中,超声10–20分钟至完全溶解,搅拌状态下加入5 mL合成的混有Al3+的铜纳米团簇溶液,并搅拌12 h,将搅拌12 h后的混合溶液静置30-60分钟,将上清液移除,剩下的以8000–10000转/min离心5–10分钟,接着用5-10 mL DMF溶液洗涤3次,洗涤后再以8000–10000转/min离心5–10分钟,最终得到的沉淀置于真空干燥箱中并在45–60 ℃的温度下烘干,即得金属有机框架/铜纳米团簇;
所述合成的混有Al3+的铜纳米团簇溶液的制备方法:在合成的pH=7–7.4的CuNCs溶液中加入50–100 μL的Al3+水溶液(0.1 M),搅拌5–10分钟,混合液由澄清透明状态变至白色浑浊状态,即得;
合成铜纳米团簇(CuNCs)的方法:将2.5–5 mL的50 mM谷胱甘肽水溶液与2.5–5 mL的10 mM CuSO4·5H2O水溶液充分混合,然后在搅拌状态下用1 M NaOH溶液调节混合液pH值至7–7.4,混合液由白色悬浊状态变至澄清透明状态,即得。
进一步的,所述的线性关系式的获得方法为:分别取1 mL的0-10 mM不同浓度的ATP水溶液分别加入盛有1 mL的CuNCs/ZIF-90水溶液的离心管中,混合均匀后加入1 mLTris-HCl缓冲液,37 ℃孵化10分钟,以365 nm为激发波长测定发射强度,并将得到的实验数据整理作图获得线性方程,线性关系为F0-F/F0=0.0004c+0.1042;
F0为不加ATP的荧光强度;
F为加入不同浓度ATP后的荧光强度;
线性相关系数R2=0.9950。
进一步的,所述0–10 mM不同浓度ATP水溶液浓度分别为0、0.001、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、1、2、3、4、5、10 mM。
进一步的,所述Tris-HCl缓冲液浓度为100 mM,pH=7.4。
有益效果:
本发明利用ATP破坏ZIF-90的框架后与Al3+发生配位反应将CuNCs从ZIF-90中释放出来,从而使CuNCs/ZIF-90复合材料的荧光发生猝灭的荧光分析法来检测ATP,具有灵敏度高(检出限为0.67 μM),选择性好,实验简便易操作,变化直观,可实现待测样品的快速检测等。
本发明通过六水合硝酸锌和咪唑-2甲醛合成ZIF-90金属有机框架,本发明合成的金属有机框架大大提高了复合材料的亲水性能,在保护铜纳米团簇自身性质不被改变的情况下极大地增强了铜纳米团簇的稳定性,且合成步骤简便,只需简单的混合即可实现荧光材料的快速合成。
本发明侧重于在食品中的应用,为食品质量分析提供一种新的评价方法,尤其是在水产品鲜度的评估中,可利用基于该复合材料的ATP荧光试剂盒来评估水产品的新鲜度。
本发明提供的ATP荧光检测试剂盒不需复杂的前处理,检测范围宽,灵敏度高,选择性强,实验条件要求较低,在正常环境下就可以实现ATP的快速、准确检测。
附图说明
图1为本发明提供的CuNCs/ZIF-90复合材料制备以及腺苷三磷酸(ATP)使其荧光发生猝灭的原理图。
图2为本发明实施例合成的CuNCs(A)与CuNCs/ZIF-90(B)的透射电镜图(TEM)。
图3为本发明实施例合成的CuNCs/ZIF-90的X射线光电子能谱图(XPS)。
图4为本发明实施例提供的加入ATP水溶液(浓度从0至10 mM)后CuNCs/ZIF-90水溶液的荧光猝灭光谱图。
图5为本发明实施例提供的检测ATP的变化趋势图(A)和紫外灯照射下的照片以及在浓度10 μM-2 mM的线性关系图(B)。
图6为本发明实施例提供的检测ATP的选择性对比图。
图7为本发明实施例提供的检测第一天时(A)和第三天时(B)新鲜程度不同的鱼虾样品中ATP含量的相应荧光光谱图。
具体实施方式
实施例1:
一种腺苷三磷酸荧光检测水产品新鲜度的方法,步骤包括:
(1)样品预处理:将新鲜的鱼虾水产品(鲳鱼、爬虾、青虾)清洗干净,去除外壳。取水产品的肉质各2 g于50 mL离心管中,加入预冷的20 mL高氯酸溶液(10%),用玻璃棒将大块的肉质预先捣散,然后在冰浴条件下放入超声细胞破碎仪中裂解提取5 min,然后迅速以8000转/min离心5 min;得到的上清液用10 M KOH溶液调pH至7.4,Tris-HCl缓冲液定容至50 mL,接着以8000转/min离心5 min,并用0.45 μm的滤膜过滤此处获得的上清液,备用。
(2)取1 mL 金属有机框架/铜纳米团簇(CuNCs/ZIF-90)水溶液于5 mL的离心管中,随后加入1 mL的水产品上清液样液,混匀后加入1 mL的Tris-HCl缓冲液,在37℃温度下孵育10分钟。
(3)通过测定其荧光发射强度,并将强度值代入线性方程,确定ATP的浓度范围。
图7为本发明所述实施例1水产品中ATP含量的检测相应荧光光谱图,其中A所示为第一天时鲳鱼、爬虾、青虾体内的ATP浓度范围,即鲳鱼约1840 μM、爬虾约1735 μM、青虾约910 μM;B所示为第三天时在冰箱冷藏(4℃)和室内温度(15℃)下鲳鱼、爬虾、青虾体内的ATP浓度范围,即在冷藏和室温条件下,鲳鱼ATP含量分别约740 μM和720 μM、爬虾ATP含量分别约1083 μM和860 μM、青虾ATP含量分别约690 μM和415 μM。
作为本发明的一个实施例,上述Tris-HCl缓冲液的配制:
①准确称取1.2114 g的Tris于盛有50 mL超纯水的烧杯中,超声溶解,备用;
②取1 mL的HCl(12 mol/L)溶液稀释至120 mL,即得浓度为0.1 mol/L的HCl溶液;
③将上述50 mL的三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液与42 mL的HCl(0.1 mol/L)溶液混合,再加入8 mL的超纯水,调节pH至7.4即得Tris-HCl缓冲液。
作为本发明的一个实施例,上述金属有机框架/铜纳米团簇(CuNCs/ZIF-90)水溶液的制备:
1)铜纳米团簇(CuNCs)的制备:
2.5 mL谷胱甘肽(GSH)水溶液与2.5 mL CuSO4·5H2O水溶液充分混合,然后在搅拌状态下用1 M NaOH水溶液调节混合液pH=7,混合液由白色悬浊状态变至澄清透明状态,放置待用;
2)铜纳米团簇加Al离子混合溶液(CuNCs+Al3+)的制备:
在上述合成的pH=7的CuNCs溶液中加入100 μL的Al离子水溶液(0.1 M),搅拌5分钟,混合液由澄清透明状态变至白色浑浊状态,放置备用;
3)金属有机框架/铜纳米团簇(CuNCs/ZIF-90)水溶液的合成:
称取0.5960 g Zn(NO3)2·6H2O和0.0961 g 咪唑-2-甲醛(2-ICA)于20 mL DMF溶液中,超声10–20分钟至完全溶液,搅拌状态下加入上述合成的5 mL混有Al3+的铜纳米团簇(CuNCs+Al3+)溶液,并搅拌12 h,将搅拌12 h后的混合溶液静置30分钟,将上清液移除,剩下的以8000转/min离心5分钟,接着用5 mL DMF溶液洗涤3次,洗涤后再以8000转/min离心5分钟,最终得到的沉淀置于真空干燥箱中并在60 ℃的温度下烘干,即得金属有机框架/铜纳米团簇(CuNCs/ZIF-90)复合材料。干燥后的CuNCs/ZIF-90每2 mg溶于1 mL超纯水中,超声细胞破碎仪超声溶解3 min至形成分散均匀的CuNCs/ZIF-90水溶液,以365 nm做为激发波长测定其发射强度(发射波长在605 nm)。
图2为上述合成的CuNCs(A)与CuNCs/ZIF-90(B)的透射电镜图(TEM)。其中A所示为谷胱甘肽包裹铜离子形成的铜纳米团簇(CuNCs),所制备的CuNCs粒径在20 nm以内,大小相似呈圆球状,分散均匀不团聚; B所示为复合金属有机框架的铜纳米团簇(CuNCs/ZIF-90),对比CuNCs,所合成的CuNCs/ZIF-90粒径明显增大,呈团聚状,表明CuNCs/ZIF-90成功合成。
图3为上述合成的CuNCs/ZIF-90的X光电子能谱图(XPS),从图中可以看出CuNCs/ZIF-90含有C、N、O、S、Cu、Zn这些元素,结合图2,表明合成了CuNCs/ZIF-90纳米材料。
作为本发明的一个实施例,线性方程的获得是,取1 mL不同浓度的(0-10 mM)ATP水溶液分别加入盛有1 mL的CuNCs/ZIF-90水溶液的离心管中,混合均匀后加入1 mL Tris-HCl缓冲液,37 ℃的条件下孵化10分钟,以365 nm为激发波长测定发射强度,并将得到的实验数据整理作图获得线性方程。
进行选择性实验是,分别取1 mL浓度为100 μM的干扰物(血清胺盐酸盐、GMP、DA、AA、葡萄糖、GSH、鸟嘌呤、UA)加入盛有1 mL的CuNCs/ZIF-90水溶液的离心管中,,混合均匀后加入1 mL Tris-HCl缓冲液,37 ℃的条件下孵化10分钟,以365 nm为激发波长测定发射强度,与加入100 μM ATP后的荧光强度对比。
图4、图5为本发明实施例1中所述加入0、0.001、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、1、2、3、4、5、10 mM的ATP溶液后CuNCs/ZIF-90水溶液的荧光猝灭图,图5中A为加入不同浓度ATP溶液后CuNCs/ZIF-90水溶液的荧光颜色变化图,这与荧光强度猝灭是一致的;图5中B所示为检测ATP浓度在0.01-2 mM呈现出良好的线性关系,线性关系为F0-F/F0=0.0004c+0.1042 (F0为不加ATP的荧光强度,F为加入不同浓度ATP后的荧光强度),线性相关系数R2=0.9950。
如图1所示,本发明的原理是在金属有机框架/铜纳米团簇复合物的水溶液中,ATP首先与Zn2+发生配位反应并取代2-ICA,使ZIF-90框架坍塌,由于ATP与Al3+配位的能力高于与Cu2+配位的能力,剩余的ATP可以夺取Al3+,最后单独的CuNCs从坍塌的ZIF-90中释放出来导致荧光发生猝灭(见图4)并伴随着颜色的变化,这种变化与ATP浓度在一定范围内呈现出线性关系(见图5)。
图6为本实施例1中所述的选择性实验,1为ATP、2为血清胺盐酸盐、3为GMP、4为DA、5为AA、6为葡萄糖、7为GSH、8为鸟嘌呤、9为UA,在同样100 μM的浓度下,ATP的猝灭效果更明显,且不易受其他干扰物的影响。
ATP浓度越高说明水产品越新鲜,其体内的ATP被酶和微生物降解成二磷酸腺苷等的程度比较低;反之,则表明水产品鲜度较差,说明水产品体内的ATP在酶和微生物的共同作用下降解为二磷酸腺苷等的程度较高,并伴随着一定的腐败味道产生。
表1列举出了在不同时间和不同保存温度下的水产品体内的ATP含量,结果表明,随着放置时间的延长,水产品体内的ATP含量均下降,且室温放置会加速水产品的不新鲜程度,也说明了低温更有利于水产品的贮藏。我们提出的基于CuNCs/ZIF-90复合材料的荧光传感器可用于检测水产品中的ATP水平,可作为水产品质鲜度评价的新方法。本发明基于ATP可使复合金属有机框架的铜纳米团簇(CuNCs/ZIF-90)的荧光发生猝灭来检测ATP,具有灵敏度高,抗干扰能力强,易于操作,可实现待测样品的快速检测等优点。
表1 不同时间和不同保存温度下的水产品体内的ATP含量检测值
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此,无论从哪一点来看,本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明,权利要求书指出了本发明的范围,而上述的说明并未指出本发明的范围,因此,在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变,都应认为是包括在本发明的权利要求书的范围内。
Claims (5)
1.一种腺苷三磷酸荧光检测水产品新鲜度的方法,其特征在于,步骤包括:
(1)将水产品肉质经破碎、调pH至7.4,Tris-HCl缓冲液定容后,以8000转/min离心5min,滤膜过滤后获得上清液;
(2)将步骤(1)得到的上清液1mL加入到1–2mL 金属有机框架/铜纳米团簇CuNCs/ZIF-90水溶液中,混匀后加入1 mL的Tris-HCl缓冲液;在25–37℃温度下孵育5–30分钟;在365nm的激发波长下测定其荧光发射强度,并将强度值代入线性关系式,确定腺苷三磷酸ATP的浓度范围;
(3)根据腺苷三磷酸ATP的浓度大小判断水产品新鲜度:浓度越高,水产品越新鲜;
所述的金属有机框架/铜纳米团簇CuNCs/ZIF-90的合成方法为:称取0.5960 g Zn(NO3)2· 6H2O和0.0961 g 咪唑-2-甲醛于20 mL DMF溶液中,超声10–20分钟至完全溶解,搅拌状态下加入5 mL合成的混有Al3+的铜纳米团簇溶液,并搅拌12 h,将搅拌12 h后的混合溶液静置30-60分钟,将上清液移除,剩下的以8000–10000转/min离心5–10分钟,接着用5-10 mLDMF溶液洗涤3次,洗涤后再以8000–10000转/min离心5–10分钟,最终得到的沉淀置于真空干燥箱中并在45–60 ℃的温度下烘干,即得金属有机框架/铜纳米团簇;
所述合成的混有Al3+的铜纳米团簇溶液的制备方法为:在合成的pH=7–7.4的CuNCs溶液中加入50–100 μL的浓度为0.1 M 的Al3+水溶液,搅拌5–10分钟,混合液由澄清透明状态变至白色浑浊状态,即得;
合成铜纳米团簇(CuNCs)的方法:将2.5–5 mL的50 mM谷胱甘肽水溶液与2.5–5 mL 的10 mM CuSO4·5H2O水溶液充分混合,然后在搅拌状态下用1M NaOH溶液调节混合液pH值至7–7.4,混合液由白色悬浊状态变至澄清透明状态,即得。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的水产品为海水鱼、爬虾或青虾。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述线性关系式的获得方法为:分别取1 mL的0-10 mM不同浓度的腺苷三磷酸ATP水溶液分别加入盛有1 mL的CuNCs/ZIF-90水溶液的离心管中,混合均匀后加入1 mL Tris-HCl缓冲液,37 ℃的条件下孵化10分钟,以365 nm为激发波长测定发射强度,并将得到的实验数据整理作图获得线性方程,线性关系为F0-F/F0=0.0004c+0.1042;
F0为不加腺苷三磷酸ATP的荧光强度;
F为加入不同浓度腺苷三磷酸ATP后的荧光强度;
线性相关系数R2=0.9950。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述0–10 mM不同浓度ATP水溶液浓度分别为0、0.001、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、1、2、3、4、5、10 mM。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述Tris-HCl缓冲液浓度为100 mM,pH=7.4。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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