KR100909996B1

KR100909996B1 - 카스파제-3(ｃａｓｐａｓｅ-3)의 활성 검출용 융합 단백질및 이를 이용한 카스파제-3의 활성 검출방법

Info

Publication number: KR100909996B1
Application number: KR1020070095418A
Authority: KR
Inventors: 정봉현; 김문일; 박경숙; 이소연
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2007-09-19
Filing date: 2007-09-19
Publication date: 2009-07-29
Also published as: KR20090030089A

Abstract

본 발명은 카스파제의 활성을 측정하는 데 있어 향상된 민감성과 선별력을 제공하는 카스파제-3의 활성 검출용 융합단백질, 상기 융합단백질이 기질상에 고정되어 있는 단백질 칩 및 이들을 이용한 카스파제-3의 활성 검출방법에 대한 것이다.

본 발명은 기존의 인공적인 형광생성 기질(fluorogenic substrate, DEVD-AFC)을 사용한 형광기반 분석(fluorometric assay)으로 인한 카스파제-3과 펩타이드 기질간의 상호작용시 간섭의 문제점을 최소화하고, 동시에 간단하고 경제적이며 정량적인 측정이 가능한 카스파제-3의 활성 검출용 융합단백질 및 이를 이용한 검출방법을 제공함으로써 아폽토시스의 경로를 타겟으로 하는 각종 아폽토시스 관련 질환의 치료전략을 효과적으로 수립하는데 유용하다.

아폽토시스, 카스파제-3, GST, MBP, 헥사히스티딘, 링커, DEVD 아미노산 서열, 형광단백질, 활성 검출용 융합단백질

Description

카스파제-3(ｃａｓｐａｓｅ-3)의 활성 검출용 융합 단백질 및 이를 이용한 카스파제-3의 활성 검출방법{Fusion Protein for Detecting Caspase-3 Activity and Method for Detecting Caspase-3 Activity Using the Same}

아폽토시스(apoptosis)는 많은 질병의 병인 및 치료에 있어서 중요한 역할을 하는 유전적으로 보존되는 세포의 작용이다 (Ashkenazi, A. & Dixit, V.M., Science, 281:1305, 1998; Elmore, S., Toxieol . Pathol ., 35:495, 2007; Nagata, S., Cell , 88:355, 1997). 아폽토시스가 일어나는 세포들은 막 리모델링(membrane remodeling), 핵응축(nuclear condensation), DNA 단편화(DNA fragmentation) 및 카스파제(caspase)라 하는 세포 내 시스테인 분해효소 족의 활성화처럼 독특한 형태적 변화 및 생화학적 변화를 보인다 (Earnshaw, W.C. et al., Annu . Rev . Biochem., 68:383, 1999; Hengartner, M.O., Nature , 407:770, 2000; Thornberry, N.A. & Lazebnik, Y., Science , 281:1312, 1998). 아폽토시스에 관여하는 카스파제는 그들의 기질 특이성에 따라 구별할 수 있는데 (Thornberry, N.A. et al., J. Biol. Chern ., 272:17907, 1997), 특히, 카스파제-3 혹은 카스파제-7을 포함한 일차 이펙터 카스파제(primary effector caspase)는 4개의 아미노산 인식서열인 DEVD를 포함하는 기질에 대해 선호성을 보이는데, 이는 세포질 혹은 핵의 카스파제 기질에서 많이 발견된다 (Thornberry, N.A. et al., J. Biol . Chern ., 272:17907, 1997; Zhivotovsky, B., Essays Biochem ., 39:25, 2003). 카스파제-3은 크로모좀의 뉴클레오좀 단편화 (nucleosomal fragmentation)로 분해되고 다른 이펙터 카스파제의 활성을 촉진하기 때문에, 이 프로테아제는 아폽토시스의 실행에서 중추역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Boatright, K.M. & Salvesen, G.S., Curro . Opin . Cell Biol ., 15:725, 2003; Grutter, M.G., Struet . Biol ., 10:649, 2000). 또한, 활성화된 카스파제-3은 폴리-(ADP-리보오즈) 폴리머레이즈 (poly-(ADP-ribose) polymerase, PARP), CAD (caspase-activated deoxyribonuclease)의 inhibitor (ICAD), 및 세포사멸 (cell death)을 일으키는 알파-포드린 (alpha-fodrin)과 같은 다수의 세포기질을 자른다 (Counis, M.F. & Torriglia, A., Biochem . Cell Biol ., 78:405, 2000; Janicke, R.U. et al., J. Biol . Chem ., 273:15540, 1998; Stroh, C. & Schulze-Osthoff, K., Cell Death . Differ ., 5:997, 1998).

최근 연구들은 FRET에 기반한 분석 (FRET-based assay)이 카스파제-3의 분해 활성을 탐지하는데 이용될 수 있다고 기재하고 있다 (E1phick, L.M. et al., Anal . Bioehem., 349:148, 2006; Jones, J. et al., J. Biomol . Screen , 5:307, 2000; Luo, K.Q. et al ., Biochem . Biophys . Res . Commun ., 283:1054, 2001; Wu, Y. et al., Cancer Lett ., 235:239, 2006). FRET은 2개의 다른 형광단백질 (공여체와 수여체)이 서로 링크되어 있고, 에너지의 전이가 공여체에서 수여체로 일어날 때 발생하는데, 카스파제-3의 활성을 스펙트럼-기반방법으로 측정하면, 링커가 프로테아제에 의하여 분리될 때, FRET이 관찰되지 않는다. FRET에 기반한 방법은 다른 세포 내 과정의 이해에 매우 유용하나, FRET의 측정이 공여체와 수여체 파장 사이의 exitation 세기의 겹침에 의해 방해될 수 있기 때문에 정량적인 결과를 얻는 것은 매우 어렵다 (Nguyen, A.W. & Daugherty, P.S., Nat . Biotechnol ., 23:355, 2005; Tsien, R.Y., Annu . Rev . Biochem ., 67:509, 1998).

카스파제-3의 활성화를 모니터링하기 위하여 가장 대중적으로 사용되는 실험적인 방법은 카스파제-3에 대한 인공적인 형광생성 기질 (fluorogenic substrate, DEVD-AFC)을 사용한 형광기반 분석 (fluorometric assay)이다 (Stennicke, H.R. & Salvesen, G.S., J. Bioi . Chern ., 272:25719, 1997). 그러나, 비록 형광기반분석이 민감하고, 적은 양의 효소활성을 측정하는데 적합하다고 해도, 펩타이드 기질의 생물학적 활성이 인위적인 라벨 (label)에 의해 영향을 받을 수 있고, 이로 인하여 카스파제-3과 펩타이드 기질간의 상호작용시 간섭이 일어날 수 있는 문제점이 있었다 (Su, J. et al., Anal . Chern ., 78:4945, 2006). 또한, 한국공개특허 제2002-8122호 역시 세포소기관 막에 존재하는 카스파제의 활성을 측정하기 위하여 DEVD- amc 기질을 혼합반응시켜 방출된 amc 형광을 측정한 발명으로 상기와 동일한 문제점이 있었다.

한편, 변종 삽입형 형광단백질 (Peridot)에 카스파제 인지서열을 삽입하여 제조한 재조합 형광단백질에 관한 한국공개특허 제2003-76734호와, 양이온성 켄쳐가 카스파제에 의해 잘려 나가면서 형광제의 형광을 억제함으로써 효소 활성을 분석하는 방법발명인 한국공개특허 제2006-113882호가 공개되었으나, 카스파제의 활성을 측정하는데 있어 활용도 및 민감성이 높지 않았다. 상기 켄칭 기반 측정 방식은 직접 모니터닝 방식이 아닌 카스파제에 의해 잘려나간 켄쳐가 형광제를 다시 켄칭함으로써 발생하는 형광의 감소를 측정하는 간접측정방식이기 때문이다. 이에 향상된 민감성과 선별력을 제공하는 카스파제-3의 활성 측정방법이 요구되었다.

이에 본 발명자들은 기존의 인공적인 형광생성 기질 (fluorogenic substrate, DEVD-AFC)을 사용한 형광기반 분석 (fluorometric assay)으로 인한 카스파제-3과 펩타이드 기질간의 상호작용으로 인한 간섭의 문제점을 최소화하는 동시에, 간단하고 경제적이며 정량적인 측정이 가능한 카스파제-3의 활성 검출용 융합단백질 및 이를 이용한 검출방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 고체 지지체 결합용 단백질, 형광단백질, 상기 고체 지지체 결합용 단백질 및 형광단백질 사이에 위치하고 DEVD 아미노산 서열을 포함하는 링커를 포함하는 카스파제-3 (caspase-3)의 활성 검출용 융합 단백질을 제작한 다음, 이를 이용하여 카스파제-3의 활성을 측정하여 카스파제-3 대 펩타이드 기질 상호작용의 간섭 없이 경제적이고 정량적으로 활성을 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국 본 발명의 주된 목적은 카스파제의 활성을 측정하는 데 있어 향상된 민감성과 선별력을 제공하는 카스파제-3의 활성 검출용 융합단백질 및 상기 융합단백질이 기질상에 고정되어 있는 단백질 칩을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합단백질 및 상기 융합단백질이 기질상에 고정되어 있는 단백질 칩 및 상기 단백질 칩을 이용한 카스파제-3의 활성 검출방법을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고체 지지체 결합용 단백질-L-형광단백질로 구성되는 카스파제-3 (caspase-3)의 활성 검출용 융합단백질을 제공한다:

여기서, 상기 L은 서열번호 1의 DEVD 아미노산 서열을 포함하는 링커임.

서열번호 1: Asp Glu Val Asp (DEVD)

본 발명에 있어서, 상기 고체 지지체 결합용 단백질은 글루타치온-S 전이효소 (glutathinoe-S transferase, GST), 말토오즈 결합단백질 (Maltose Binding Protein, MBP) 및 헥사히스티딘 (6×Histidine)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 고체 지지체로는 비드, 막, 슬라이드, 플레이트, 시험관, 스트렙타비딘으로 코팅된 구, 중합체 미소구, 실리카 미소구, 유기 나노입자, 무기 나노입자 등을 사용할 수 있는데, 이러한 고체 지지체는 상기 고체 지지체 결합용 단백질과 결합하는 분자물을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 고체 지지체 결합용 단백질로 GST을 사용하는 경우에는 글루타치온을, MBP를 사용하는 경우에는 아밀로오스를, 헥사히스티딘을 사용하는 경우에는 니켈을 고체 지지체 표면에 코팅시키거나 스팟시켜 융합단백질이 고체 지지체에 결합될 수 있도록 한다.

본 발명에 있어서, 상기 형광단백질은 EGFP (enhanced green fluorescent protein), ECFP (enhanced cyan fluorescent protein), EBFP (enhanced blue fluorescent protein), EYFP (enhanced yellow fluorescent protein) 및 RFP (red fluorescent protein)로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아 니다.

본 발명에 있어서, 상기 링커는 6~9개의 아미노산으로 구성되는 것을 특징으로 할 수 있다. 이때, 바람직하게는 상기 링커는 서열번호 1의 DEVD 아미노산 서열의 N 및 C 말단에 각각 2개의 글리신 (glycine)으로 구성되는 연결 펩타이드를 포함한다.

본 발명은 또한, 상기 융합단백질이 기질 상에 고정되어 있는 것을 카스파제-3의 활성 검출용 단백질 칩을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 기질은 금속인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 상기 금속은 골드 (Au)를 사용한다.

본 발명에 있어서, 상기 금속 기질에 고정되는 융합단백질의 고체 지지체 결합용 단백질로 GST를 사용하는 경우, 상기 GST를 글루타치온 금속 기질 표면의 글루타치온에 결합시킴으로써 상기 융합단백질을 기질 상에 고정시킬 수 있다. 한편, 본 발명에 따른 단백질 칩은 상기 GST를 글루타치온 유리 기질 표면의 글루타치온에 결합시킴으로써 상기 융합단백질을 기질 상에 고정시킬 수 있다. 여기서 '글루타치온 금속 기질'이란 글루타치온이 금속 칩의 표면에 코팅되거나 스팟되어 있는 금속 칩을 의미하고, '글루타치온 유리 기질'이란 글루타치온이 유리 칩의 표면에 코팅되거나 스팟되어 있는 유리 칩을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 단백질 칩에 고정되는 상기 융합단백질의 고체 지지체 결합용 단백질로서 말토오즈 결합단백질 (Maltose Binding Protein, MBP)를 사 용하는 경우, 상기 글루타치온 대신 아밀로오스를 사용할 수 있으며, 고체 지지체 결합용 단백질로 헥사히스티딘 (6×Histidine)를 사용하는 경우, 니켈을 사용하여 카스파제-3 (caspase-3)의 활성 검출용 단백질 칩을 제조할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 융합단백질을 이용하는 것을 특징으로 하는 카스파제-3 활성 검출방법을 제공한다.

본 발명에 따른 융합단백질을 이용한 카스파제-3 활성 검출방법은 (a) 고체 지지체에 상기 융합단백질을 고정시키는 단계; (b) 상기 고체 지지체 상에 고정된 융합단백질에 카스파제-3을 처리하는 단계; 및 (c) 상기 카스파제-3 처리된 융합단백질의 형광단백질의 형광 시그널을 분석하여 상기 카스파제-3의 활성을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 융합단백질을 이용한 카스파제-3의 활성 검출방법은 또한, (a) 상기 융합단백질에 카스파제-3을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 카스파제-3 처리된 융합단백질에 상기 융합단백질의 고체 지지체 결합용 단백질에 대한 항체를 이용하여 면역블로팅 (immunoblotting)을 수행하여 처리된 카스파제-3의 활성을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 카스파제-3의 활성 검출용 융합단백질이 기질 상에 고정되어 있는 단백질 칩을 이용한 카스파제-3 활성 검출방법을 제공한다.

본 발명에 따른 단백질 칩의 기질이 금속인 경우, 본 발명에 따른 카스파제- 3 활성 검출방법은 (a) 상기 단백질 칩의 표면에 카스파제-3을 도입하여 반응시키는 단계; 및 (b) 상기 반응시킨 단백질 칩의 SPR (surface plasmon resonance) 이미지를 분석하여 도입된 카스파제-3의 활성을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이때, 상기 금속으로는 골드 (Au)를 사용하는 것이 바람직하다.

상세하게는, 상기 (b)단계의 SPR 이미지 분석은 카스파제-3 도입된 금속 칩의 SPR 이미지와 카스파제-3 미도입된 금속 칩 (상기 융합단백질이 고정된 글루타치온 금속 칩)의 SPR 이미지를 비교하여 SPR 이미지의 변화가 있는 경우, 카스파제-3이 활성상태인 것으로 결정할 수 있으며, 이때 상기 SPR 이미지의 변화의 정도로 카스파제-3의 활성을 정량할 수 있다.

카스파제-3 활성 검출방법은 또한, (a) 본 발명에 따른 단백질 칩의 표면에 카스파제-3을 도입하여 반응시키는 단계; 및 (c) 상기 반응시킨 단백질 칩의 형광 이미지를 분석하여 도입된 카스파제-3의 활성을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 카스파제-3 (caspase-3)의 활성 검출용 융합단백질은 다음과 같은 단계에 따라 제조될 수 있다. 즉, (a) 형광단백질을 코딩하는 유전자를 DEVD 아미노산 서열에 대응하는 염기서열을 포함하는 프라이머를 이용하여 증폭시키는 단계; (b) 상기 증폭된 산물을 고체 지지체 결합용 단백질 유전자가 포함된 플라스미드에 도입하여 융합 유전자를 생성시키는 단계; 및 (c) 상기 융합된 유전자를 포함한 플라스미드를 미생물 내에 형질전환시킨 후, 상기 융합된 유전자를 발 현시키는 단계로 구성된다.

바람직하게는, 상기 프라이머는 5' 프라이머로써 서열번호 2의 서열로 구성되는 염기서열을 사용하고, 3' 프라이머는 서열번호 3의 서열로 구성되는 염기서열을 사용할 수 있다.

서열번호 2: 5'-CGGGATCCGGAGGGGATGAGGTGGATGGGGGCATGGTGAGCAAGGGCGAG

서열번호 3: 5'-CGGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATG

한편, 카스파제-3은 아폽토시스의 과정에서 중요한 핵심 역할을 하는 것으로 알려져 있는 것으로써, 카스파제-3의 조절은 아폽토시스 경로를 타겟으로 하는 치료전략을 가능하게 한다. 도 1은 본 발명에 따른 카스파제-3 활성 검출용 융합단백질을 예시하는데, 도 1에서 볼 수 있듯이 활성화된 카스파제-3은 DEVD 아미노산 서열에 대한 분해활성을 가지며, DEVD 서열의 바로 뒤, 즉 Asp 서열 뒤에서 펩타이드의 절단을 가져온다.

본 발명의 융합단백질을 구성하는 형광단백질은 카스파제 활성에 의해 변화된 형광을 측정할 수 있게 할 뿐만 아니라, 잘려나간 형광단백질의 감소된 분자량을 측정하는 분석적 접근을 가능하게 해 준다.

이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명은 카스파제의 활성을 측정하는 데 있어 향상된 민감성과 선별력을 제공하는 카스파제-3의 활성 검출용 융합단백질, 상기 융합단백질이 고정되어 있는 단백질 칩 및 이들을 이용한 카스파제-3 활성 검출방법을 제공한다.

상기에 따른 융합단백질을 이용한 카스파제-3의 활성 검출방법은 간단하고, 경제적이며, 라벨-프리 시스템이어서 카스파제-3 대 펩타이드 기질 상호작용의 간섭의 문제점을 최소화할 수 있다.

결국 본 발명은 더욱 민감하고 선별력있는 카스파제-3의 활성 검출방법을 제공함으로써 아폽토시스의 경로를 타겟으로 하는 각종 아폽토시스 관련 질환의 치료전략을 효과적으로 수립하는데 유용하다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1> 카스파제 -3 ( caspase -3) 활성 검출용 융합단백질의 제조

1. 균주, 벡터 및 효소들

E. coli 균주 DH5α를 서브클로닝을 위한 숙주로 사용하였고, E. coli BL21 (DE3) (Novagen, W1)를 유전자 발현을 위한 숙주로 사용하였다. 실험 시 E. coli 균주들은 37℃ LB 배지에서 배양시켰으며, 앰피실린은 50㎎/ℓ의 농도로 플라스미드 가 포함된 균주에 처리하였다. 서브클로닝 및 유전자 전체 (full-length gene)의 증폭을 위한 벡터로는 pBluescript SK+ (Stratagene, CA)를, 발현을 위한 벡터로는 pGEX 4T-1 (Amersham Pharmacia Biotech, CA)을 사용하였으며, 제한효소 및 modifiying 효소는 Boehringer-Mannheim (Germany)에서 구입한 후, 공급자의 추천에 따라 사용하였다. 벡터 DNA의 준비에는 QIAEX∥ 겔 추출 키트 (QIAEX∥ gel extraction kit, Qiagen, Germany)를 사용하였다.

2. 유전자 클로닝, 발현 및 재조합 융합단백질의 분리

본 발명에 따른 카스파제-3 활성 검출용 융합단백질인 글루타치온-S 전이효소 (glutathinoe-S transferase, GST)-L-EGFP (L은 DEVD 아미노산 서열을 포함한 링커)를 제조하기 위하여, 먼저 GST:DEVD:EGFP 융합 유전자의 클로닝을 수행하였다. 여기서 GST:DEVD:EGFP 융합 유전자란 (ⅰ) GST 유전자, (ⅱ) EGFP 유전자 및 (ⅲ) 상기 DEVD 아미노산 서열을 포함하는 링커 (L)에 대응하며, 상기 GST 및 EGFP 유전자를 연결하는 염기서열로 구성되는 융합 유전자를 의미한다.

GST:DEVD:EGFP 융합 유전자를 클로닝하기 위하여, EGFP를 코딩하는 전체 길이의 유전자를 서열번호 2의 5'프라이머와 서열번호 3의 3' 프라이머를 사용하여 PCR (polymerase chain reaction)을 통하여 증폭하였는데, 5말단과 3말단은 BamHI과 EcoRI 제한효소 절단부위를 포함하도록 디자인하였다.

서열번호 2: 5'-CGGGATCCGGAGGGGATGAGGTGGATGGGGGCATGGTGAGCAAGGGCGAG

서열번호 3: 5'-CGGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATG

상기 PCR 산물을 DNA 분리 키트 (DNA purification kit, Qiagen)를 사용해 분리한 후, BamHI과 EcoRI 제한효소 부위에서 절단하였다. 그 후, 결과물인 DNA 단편은 GST 유전자를 포함한 pGEX 4T-1 플라스미드에 도입하여, pGST:DEVD:EGFP의 인 프레임 (in-frame) 융합을 발생시켰다. 이때, GST:DEVD:EGFP 융합 유전자는 DNA 시퀀싱 (DNA sequencing)으로 확인하였다. 재조합 융합단백질의 발현을 위하여, 상기 pGST:DEVD:EGFP를 Escherichia coli BL21(DE3)에 도입하였다. 형질전환된 세포들은 1mM IPTG (isopropyl β-D-thiogalactopyranoside)로 유도하고, 추가적으로 3시간 동안 배양시킨 후, 4℃에서 6,000×g로 10분간 원심분리하여 수득하였다. 그 후 수득물에서 융합단백질인 GST:DEVD:EGFP를 분리하기 위하여, 10㎖의 조 세포 용해물을 GST miniexcellose affinity 컬럼 (Biorogen Co., Korea)에 로딩하고, 10㎖의 균형 버퍼 (PBS, pH 7.4)로 3번 씻어내었다. 여기서 'GST:DEVD:EGFP'는 GST 단백질-DEVD 아미노산서열을 포함하는 링커 (L)-형광단백질인 EGFP의 융합단백질을 의미하는 것으로서 편의상 이하 'GST:DEVD:EGFP'로서 표시한다. 한편, 부가적으로 음성대조군으로서 GST와 EGFP의 융합단백질인 GST:EGFP를 PCR 기술을 이용하여 제작하였고, 역시 상기와 동일한 방법으로 분리하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 분리된 GST:EGFP 융합단백질과 본 발명에 따른 GST:DEVD:EGFP 융합단백질은 SDS-PAGE 상에서 대략 51kDa 및 52kDa에 해당하는 것으로 나타났으며, 이는 각 융합단백질의 분자량으로 기대된 것과 일치하였다. 서열번호 2 및 3의 프라이머를 이용하여 제조된 GST:DEVD:EGFP 융합단백질의 링커는 카스파제-3 절단을 위한 서열인 DEVD를 포함하며, DEVD의 N- 또는 C- 말단 의 연결링커 (도 1의 Linker-1 및 Linker-2)들은 각각 2개의 글리신으로 구성된다.

분리된 융합단백질 GST:EFGP와 GST:DEVD:EGFP는 그 후 카스파제-3 분해활성 특성의 in vitro 모니터닝을 위해 면역블라팅 분석, 글루타치온-아가로즈 비드 분석, SPR 이미지 단백질 칩 기술 및 형광 기반 탐지 방법으로 하기 실시예와 같이 분석하였다.

< 실시예 2> 카스파제 -3 ( caspase -3) 활성 검출용 융합단백질을 이용한 단백질 칩의 제조

표면처리되지 않은 골드 칩 (bare gold chip; K-MAC, Korea)을 농축된 'Pirnaha' 용액 (70%(v/v) H₂SO₄, 30%(v/v) H₂O₂)으로 씻고, 증류수와 에탄올로 완전히 헹구어내었다. 그리고 나서, 골드 칩을 10mM MUA(11-mercapto-1-undecanoic acid)를 포함한 에탄올에 16시간 동안 담갔다. 골드 칩 위에 자기 조립된 MUA의 단층(self-assembled monolayer, SAM)은 증류수에서 0.1 M NHS(N-hydroxy-succinimide) 및 0.4M EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride)의 혼합물과 함께 10분간 배양되어 하이드록실숙신이미딜 에스테르(hydroxysuccinimidyl ester)로 활성화되었다. 표면활성 후, 아미노-덱스트란(amino-dextran) 1㎎/㎖를 포함하는 PBS 버퍼(pH 7.4)를 골드 표면에 처리하고, 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 친수성인 덱스트란 표면을 PBS 버퍼(pH 7.4)에서 0.1㎎/㎖ BMPS (N-(β-maleimidopropyloxy) succinimide ester)를 사용하여 2시간 동안 활성화시켰다. 그 후, 활성화된 골드 표면을 개조시키기 위하여 1㎎/㎖ L-글루타치온(L-glutathione(환원형))을 포함한 PBS 버퍼(pH 7.4)에서 2시간 동안 칩을 배양한 후, 칩을 증류수로 씻었다. 결과물인 글루타치온 골드 칩은 4℃ PBS 버퍼(pH 7.4)에서 보존하였다. MUA와 NHS는 Sigma-Aldrich에서 구매하였으며, EDC와 BMPS는 Pierce (IL, USA)로부터 구매하였으며, 아미노-덱스트란 (M.W. 500,000)은 Molecular Probes (OR, USA)에서 구매하였다.

이후, 실시예 1에서 제조된 카스파제-3(caspase-3)의 활성 검출용 융합단백질인 GST:DEVD:EGFP 리포터를 글루타티오닐레이티드 골드 칩 표면에 고정하여 본 발명의 단백질 칩을 제조하였다.

< 실시예 3> 카스파제 -3( caspase -3) 활성 측정을 위한 SDS - PAGE 및 면역블로팅 분석( SDS - PAGE and immunoblotting assay )

실시예 1에서 수득된 pGST:DEVD:EGFP로 형질전환시킨 E. coli BL21(DE3)의 배양액을 50mM Tris-HCL 버퍼(pH 8.0)에 현탁하고, 초음파로 세포 파쇄 후, 10,000g에서 10분간 원심분리하여 용해성 파쇄부과 비용해성 파쇄부로 분리하였다. 총 세포 용해물, 즉 용해성 파쇄부와 비용해성 파쇄부를 12% SDS 겔에 재용해한 후, 니트로셀룰로즈 막으로 전이시켰다. 겔은 Coomassiae Brilliant Blue R250로 염색하였고, 단백질 정량은 농도계 (densitometer, Bio-Rad Model GS-700, CA)를 사용하여 스캐너 (HP ScanJet 6100C, CA)로 300dpi의 회색 스케일 픽셀 density에서 스캔한 코마시로 염색된 겔의 밴드의 강도를 읽어 결정하였고, 단백질 농도는 소혈청 알부민을 기준으로 하는 Bradford 방법으로 결정하였다. 면역블로팅(immunoblotting) 분석은 Glutathion S-transferase (GST)에 대한 항체를 사용하여 상기 기술된 바와 같이 (Porter, A.G. & Janicke, R.U., Cell Death . Differ., 6:99, 1999) 수행하였다.

Escherichia coli BL21 (DE3)에서 발현시킨 활성 카스파제-3은 Stennicke와 Salvesen(Nguyen, A.W. & Daugherty, P.S., Nat . Biotechnol ., 23:355, 2005)에 기술된 바와 같이 분리하였다. 분리된 활성 카스파테-3의 반응에 의한 GST:DEVD:EGFP 융합단백질의 절단효율을 확인하기 위하여, 분리한 GST:EGFP와 GST:DEVD: EGFP 융합단백질을 형광 분석에 사용되는 합성 형광 기질(DEVD-AFC)의 완벽한 분해 절단을 얻는 것으로 알려진 카스파제-3의 농도에서 배양하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 상대적인 카스파제-3 활성은 대략 그 농도에 비례하는 것으로 나타났으며, 카스파제-3 활성의 증가는 카스파제-3 분해활성이 포화되는 것으로 예상되는 농도인 300 U/ml까지 지속되었다.

이에 GST:DEVD:EGFP 융합단백질을 이용한 카스파제-3 분해활성의 in vitro 모니터닝을 위하여 300 U/ml의 카스파제-3을 처리하였다. 카스파제-3으로 처리한 GST:EGFP 와 GST:DEVD:EGFP 융합단백질에 안티-GST 항체를 이용하여 면역블라팅 분석을 하였다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, GST:DEVD:EGFP의 대부분의 파편은 GST:EGFP의 파편과 비교할 때 완전히 절단되었다. 이는 GST:DEVD:EGFP의 구성이 카스파제-3 분해활성 탐지를 위한 리포터로 사용될 수 있음을 의미한다.

< 실시예 4> 카스파제 -3( caspase -3) 활성 측정을 위한 글루타치온 - 아가로스 비드 분석( Glutathine - agarose bead assay )

카스파제-3 활성을 비드 체제에서 탐지하기 위해 실시예 1에서 제조된 GST:DEVD:EGFP 융합단백질을 글루타치온-아카로즈에 고정시켰다. GST:DEVD:EGFP와 결합된 비드는 녹색 형광을 띠게 되어 쉽게 인식되는데, 이를 카스파제-3 의존적인 분해활성 모니터닝을 위해 사용하였다. 활성화된 카스파제-3과의 배양 시 EGFP 부분은 글루타치온-아카로즈 비드에 고정된 GST:DEVD:EGFP로부터 분리된다 (도 5).

GST:EGFP 혹은 GST:DEVD:EGFP와 결합된 10 ㎕ 글루타치온-아가로스 비드는 300 (U/㎖)의 카스파제-3와 함께 20mM의 PBS (phosphate buffered saline) 버퍼(pH 7.4)에서 4℃로 1시간 동안 배양한 후, 동일한 버퍼로 3번 씻어내었다. 상기 세척 후, GST:DEVD:EGFP와 결합된 10 ㎕ 글루타치온-아가로스 비드에서 EGFP는 융합단백질로부터 분리되었다. 도 6에 나타난 바와 같이, GST:DEVD:EGFP를 카스파제-3과 함께 1시간 배양시 EGFP 형광 시그널이 완전히 사라짐을 관찰할 수 있었으나, GST:EGFP의 경우 활성화된 카스파제-3의 처리와 상관없이 녹색형광을 나타내었다. 즉, 상기 방법 역시 카스파제-3의 활성을 모니터닝하는데 적용할 수 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 5> 카스파제 -3( caspase -3) 활성 측정을 위한 SPR 이미징 시스템의 이용

카스파제-3 활성을 탐지하기 위한 SPR 이미징 분석을 위해, 2차원 표면 플라즈몬 공명 (2D-SPR (surface plasmon resonance)) 이미징 시스템을 사용하였다. 광 원으로는 150-W 석영 텅스텐-할로겐 램프(quartz tungsten-halogen lamp; Schott, Germany)를 사용하였으며, 빛은 액체 광원 가이드(liquid light guide; Oriel Instruments, USA)를 사용하여 고니오미터 부(goniometer arm; Physik Instrumente, Germany)로 전달하였다.

렌즈에 의해 조준된 빛은 좁은 간섭 필터(750nm, △λ=1nm; Oriel Instruments)와 특히 단색성이고 선형의 편광된 광선으로 전환시키는 편광자(polarizer; Newport, USA)에 통과되었고, 이 광선의 직경은 대략 2㎝이었다. 단백질이 스팟된 골드 센서 칩은 인덱스 matching oil(n_D=1.517)을 사용하여 광학적으로 프리즘 커플러(prism coupler; Korea Electro-optics, Korea)와 결합하고, goniometer의 중심에 위치시켰고, 고니오미터는 DC Servo 모터 컨트롤러 (Physik Instrumente)에 의하여 전기적으로 조절하였다. 골드 칩으로부터 반영된 이미지는 ½인치 CCD(charge coupled device) 카메라(Sony, Japan)로 찍었는데, 대조상(contrast images)은 퍼스널 컴퓨터로 모니터하였다. 렌즈의 조합은 명확한 이미지를 얻기 위하여 표면처리하지 않은 CCD 칩(bare CCD chip)의 정면에 위치시켰다. 그 후, 이미지는 B/W 프레임 그래버(B/W frame grabber; National Instrument, USA)를 사용하여 퍼스널 컴퓨터에 디지털로 저장되었다.

SPR 이미징 시스템을 이용하여 카스파제-3 의존적인 분해활성을 분석하기 위하여 사용한 글루타치온 골드 칩은 상기 실시예 2에서 제작된 것으로, SPR 이미징 시스템을 이용하여 카스파제-3의 분해활성을 모니터를 위해 GST:DEVD:EGFP 융합단 백질이 고정된 골드 칩의 표면에 활성 카스파제-3을 처리하였다. 이론적으로, EGFP의 사라짐은 GST:DEVD:EGFP 리포터의 분자량에서 대응하는 감소를 가져오고, 결과적으로 SPR 이미지 신호 정도에 변화를 가져온다(도 7).

SPR 이미지를 측정한 결과, GST:EGFP에서 골드 표면 위의 SPR 이미지가 더 밝은 것으로 관찰되었고, GST:DEVD:EGFP에서 상대적으로 시각적인 이미지는 실질적으로 흐릿하였는데, 이는 칩의 표면에 고정된 융합단백질 GST:DEVD:EGFP로부터 EGFP가 분리되었음을 나타낸다. 즉, GST:DEVD:EGFP 융합단백질이 고정된 단백질 칩 상에서 활성 카스파제-3이 DEVD 서열의 Asp(D) 뒤를 절단하였음을 나타내었다(도 8). 이것은 도 3의 형광발생 펩타이드 분석 결과와도 일치하였다. SPR 이미지는 SPR 이미지 중 강도의 차이가 최대인 오직 PBS 혹은 BSA에 대응하는 칩 표면의 SPR 각보다 약간 더 작은 입사각으로 기록되어졌다. 이러한 이유로 SPR 이미지에서 더 밝은 영역은 골드 칩 표면의 본래의 GST:DEVD:EGFP 단백질의 존재를 나타낸다(도 8).

도 8을 살펴볼 때, 본 발명에 따른 융합단백질인 GST:DEVD:EGFP의 경우 활성 카스파제-3의 처리 시 SPR 시그널의 강도가 상대적으로 약화된 것으로 나타났는데, 이는 카스파제-3의 분해활성으로 융합단백질 GST:DEVD:EGFP에서 EGFP(대략 25kDa)의 분리로 인하여 GST:DEVD(27kDa)만이 골드 칩에 잔존해 있는 것을 의미한다. 그러나 골드 표면의 GST:EGFP의 밝은 SPR 이미지는 카스파제-3의 처리와는 관계가 없는 것으로 관찰되었다. PBS 혹은 BSA는 음성대조군으로 사용하였는데, 어떠한 시각적 이미지도 나타내지 않았다.

< 실시예 6> 카스파제 -3( caspase -3) 활성 측정을 위한 형광기반 모니터닝

GST:DEVD:EGFP 융합단밸질에 대한 카스파제-3 분해활성을 칩 상에서 시각화하기 위하여, GST:DEVD:EGFP가 고정된 유리 칩을 상기 골드 칩에 SPR 분석을 위하여 채택한 것과 동일한 과정을 통하여 제작하였다. 글루타치온으로 코팅된 유리 칩에 상기 GST:DEVD:EGFP 융합 단백질을 고정화시킨 후, 형광 기반한 분석을 위하여 활성 카스파제-3 300 U/ml를 융합단백질인 GST:DEVD:EGFP가 고정된 유리 칩에 처리하였다. 형광 이미지는 GenPix 4200A 488mm laser 및 마이크로어레이 스캐너(Axon Inc., USA)를 이용하여 측정하였다.

EGFP 단백질의 분리는 녹색형광이 감소하는 것으로 나타나며, 쉽게 형광판독기를 이용하여 카스파제-3의 분해활성을 측정할 수 있다. 그러므로, EGFP를 시각화하기 위하여, 녹색 필터가 장착된 형광 현미경으로 유리 칩 상의 융합단백질 GST:DEVD:EGFP에 대한 카스파제-3의 분해활성을 측정하였다. 그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 활성 카스파제-3과 배양하였을 때, 융합단백질 GST:DEVD:EGFP를 고정한 유리 칩의 표면에서는 어떠한 녹색 형광도 감지되지 않았는바, 이는 융합단백질 GST:DEVD:EGFP의 DEVD 부위의 Asp 잔기 뒤에서 분해가 일어나 EGFP 단백질이 유리 칩 위에 고정된 융합단백질 GST:DEVD:EGFP로부터 분리되었음을 의미한다.

한편, 도 10은 카스파제-3 활성을 형광기반 탐지법으로 분석한 결과를 정량적으로 나타낸 것으로, 형광의 세기를 정량적으로 표시하기 위해 라인이 지나가는 곳의 형광세기를 나타내주는 라인 플롯 프로파일 사진이다. 즉, 상기 방법을 이용 하여 카스파제-3의 활성을 정량적으로 측정할 수 있음을 보여준다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 카스파제-3 특이적인 절단부위인 DEVD 서열을 갖는 본 발명에 따른 카스파제-3 활성 검출용 융합단백질을 예시하는 도면이다.

도 2는 대조군인 GST:EGFP 융합단백질과 본 발명에 따른 GST:DEVD:EGFP 융합단백질의 크기를 SDS-PAGE 상에서 나타내는 사진이다.

도 3은 카스파제-3의 농도에 따른 상대적인 카스파제-3 활성을 나타내는 그래프이다.

도 4는 대조군인 GST:EGFP 융합단백질과 본 발명에 따른 GST:DEVD:EGFP 융합단백질에 대한 GST 항체를 이용한 면역블로팅 결과를 나타내는 사진이다.

도 5는 글루타치온-아카로즈 비드에 고정된 GST:DEVD:EGFP에 카스파제-3 처리 시의 개략도이다.

도 6은 대조군인 GST:EGFP 융합단백질과 본 발명에 따른 GST:DEVD:EGFP 융합단백질에 대한 글루타치온-아가로스 비드 분석 결과를 나타내는 사진이다.

도 7은 카스파제-3 활성에 기반한 SPR 이미지 분석을 위한 개략도이다.

도 8은 본 발명에 따른 GST:DEVD:EGFP 융합단백질에 대한 SPR 이미지 분석결과를 나타내는 사진이다.

도 9 및 도 10은 카스파제-3 활성을 형광기반 탐지법으로 분석한 결과를 나타내는 사진(GenePix 4200A 488nm laser)이다.

도 10은 카스파제-3 활성을 형광기반 탐지법으로 분석한 결과를 정량적으로 보여주는 라인 프로파일 사진이다.

<110> Technology Licensing Center Dong-A University <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING SEPSIS CONTAINING WKTMVm OR ITS DERIVATIVES <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 acagcctgta ctttcgac 18 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ctggaagtta gagcccgttc 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gtcaagatca acagaagaac c 21 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gggctctctc aagactataa gg 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 atggatgatg atatggccgc g 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tctccatgtc gtcccagttc 20

Claims

고체 지지체 결합용 단백질-L-형광단백질로 구성되는 카스파제-3(caspase-3) 활성 검출용 융합단백질:

여기서, 상기 L은 DEVD 아미노산 서열을 포함하는 링커임.
제1항에 있어서, 상기 고체 지지체 결합용 단백질은 글루타치온-S 전이효소(glutathinoe-S transferase, GST), 말토오즈 결합단백질(Maltose Binding Protein, MBP) 및 헥사히스티딘(6×Histidine)으로 구성된 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 융합단백질.
제1항에 있어서, 상기 형광단백질은 EGFP(enhanced green fluorescent protein), ECFP (enhanced cyan fluorescent protein), EBFP (enhanced blue fluorescent protein), EYFP (enhanced yellow fluorescent protein) 및 RFP (red fluorescent protein)로 구성된 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 융합단백질.
제1항에 있어서, 상기 링커는 6~9개의 아미노산으로 구성되는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 융합단백질이 기질 상에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 카스파제-3 활성 검출용 단백질 칩.
제5항에 있어서, 상기 기질은 금속인 것을 특징으로 하는 단백질 칩.
제6항에 있어서, 상기 융합단백질의 고체 지지체 결합용 단백질은 GST이고, 융합단백질의 GST가 글루타치온 금속 기질 표면의 글루타치온에 결합함으로써 고정된 것임을 특징으로 하는 단백질 칩.
제7항에 있어서, 상기 금속은 골드(Au)인 것을 특징으로 하는 단백질 칩.
제5항에 있어서, 상기 융합단백질의 고체 지지체 결합용 단백질은 GST이고, 상기 GST가 글루타치온 유리 기질 표면의 글루타치온에 결합함으로써 고정된 것임 을 특징으로 하는 단백질 칩.
제1항의 융합단백질을 이용하는 것을 특징으로 하는 카스파제-3의 활성 검출방법.
제10항에 있어서, 다음의 단계를 포함하는 카스파제-3의 활성 검출방법:

(a) 고체 지지체에 제1항의 융합단백질을 고정시키는 단계;

(b) 상기 고체 지지체 상에 고정된 융합단백질에 카스파제-3을 처리하는 단계; 및

(c) 상기 카스파제-3 처리된 융합단백질의 형광단백질의 형광 시그널을 분석하여 상기 카스파제-3의 활성을 검출하는 단계.
제10항에 있어서, 다음의 단계를 포함하는 카스파제-3의 활성 검출방법:

(a) 제1항의 융합단백질에 카스파제-3을 처리하는 단계; 및

(b) 상기 카스파제-3 처리된 융합단백질에 상기 융합단백질의 고체 지지체 결합용 단백질에 대한 항체를 이용하여 면역블로팅(immunoblotting)을 수행하여 처리된 카스파제-3의 활성을 검출하는 단계.
제5항의 단백질 칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 카스파제-3의 활성 검출방법.
다음의 단계를 포함하는 카스파제-3의 활성 검출방법:

(a) 제6항의 단백질 칩의 표면에 카스파제-3을 도입하여 반응시키는 단계; 및

(b) 상기 반응시킨 단백질 칩의 SPR(surface plasmon resonance) 이미지를 분석하여 도입된 카스파제-3의 활성을 검출하는 단계.
다음의 단계를 포함하는 카스파제-3의 활성 검출방법:

(a) 제5항의 단백질 칩의 표면에 카스파제-3을 도입하여 반응시키는 단계; 및

(c) 상기 반응시킨 단백질 칩의 형광 이미지를 분석하여 도입된 카스파제-3의 활성을 검출하는 단계.