ES2345780T3 - Ensayo para determinar la actividad de toxina clostridial combinando fret y polarizacion de fluorescencia. - Google Patents
Ensayo para determinar la actividad de toxina clostridial combinando fret y polarizacion de fluorescencia. Download PDFInfo
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Abstract
Un procedimiento para determinar la presencia o actividad de una toxina clostridial, que comprende las etapas de: (a)tratamiento con una muestra, en condiciones adecuadas para la actividad proteasa de la toxina clostridial, un sustrato de toxina clostridial, comprendiendo dicho sustrato de toxina clostridial (i)un fluoróforo donante; (ii)un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que solapa con el espectro de emisión de dicho fluoróforo donante; y (iii)un péptido o peptidomimético que comprende una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que comprende un sitio de escisión, en el que dicho sitio de escisión se interpone entre dicho fluoróforo donante y dicho aceptor y en el que, en las condiciones apropiadas, se muestra transferencia resonante de energía entre dicho fluoróforo donante y dicho aceptor; en el que la escisión de dicho sustrato de toxina clostridial da como resultado un cambio en polarización de fluorescencia de al menos 3 unidades de milipolarización (mP); (b)excitación de dicho fluoróforo donante con luz polarizada plana; y (c)determinación de la polarización de fluorescencia de dicho sustrato tratado con relación a un sustrato control, en la que un cambio en la polarización de fluorescencia de al menos 3 mP de dicho sustrato tratado en comparación con dicho sustrato control es indicativo de la presencia o actividad de dicha toxina clostridial en dicha muestra.
Description
Ensayo para determinar la actividad de toxina
clostridial combinando FRET y polarización de fluorescencia.
La presente invención se refiere de forma
general a ensayos de proteasa, y más específicamente, a
procedimientos para determinar la presencia o actividad de toxinas
clostridiales tales como toxinas botulínicas y toxinas del tétanos
usando polarización de fluorescencia.
Neurotoxinas producidas por bacterias del género
Clostridium causan el síndrome neuroparalítico del tétanos y
la enfermedad rara pero potencialmente fatal, botulismo. Estas
neurotoxinas clostridiales son venenos altamente potentes y
específicos de células neurales, con la dosis letal para humanos de
las toxinas botulínicas en el orden de los nanogramos. Así pues, la
presencia de incluso niveles mínimos de toxinas botulínicas en
alimentos representa un peligro para la salud pública que debe
evitarse mediante ensayos rigurosos.
Sin embargo, a pesar de sus potenciales efectos
deletéreos, se han usado bajas dosis controladas de neurotoxinas
botulínicas de manera exitosa como terapias y para algunas
aplicaciones cosméticas. En particular, las toxinas botulínicas se
han usado en el tratamiento terapéutico de una diversidad de
distonías focales y segmentales, estrabismo y otras condiciones en
las que se desea una depresión reversible de la actividad terminal
del nervio colinérgico. Los usos terapéuticos establecidos de las
neurotoxinas botulínicas en humanos incluyen, sin limitación,
tratamiento de blefaroespasmo, espasmo hemifacial, distonía
laringea, hiperhidrosis focal, hipersalivación, distonía
oromandibular, distonía cervical, tortícolis, estrabismo, distonía
de las extremidades, calambres ocupacionales y mioquimia (Rossetto
y col., Toxicon 39:27-41 (2001)). Por ejemplo, la
inyección intramuscular de tejido espástico con pequeñas cantidades
de neurotoxina botulínica A se ha usado eficazmente para tratar la
espasticidad debida a lesión cerebral, lesión de la médula espinal,
apoplejía, esclerosis múltiple y parálisis cerebral. Otros posibles
usos clínicos de las neurotoxinas clostridiales están siendo
investigados actualmente.
Dado el peligro potencial asociado con pequeñas
cantidades de toxinas botulínicas en alimentos y la necesidad de
preparar formulaciones farmacéuticas precisas, se emplean
actualmente ensayos para neurotoxinas botulínicas en las industrias
alimentaria y farmacéutica. La industria alimentaria requiere
ensayos para las neurotoxinas botulínicas para validar nuevos
procedimientos de empaquetamiento de alimentos y para asegurar la
seguridad de la comida. El creciente uso clínico de las toxinas
botulínicas necesita de ensayos precisos para la actividad de la
neurotoxina botulínica para la formulación de productos así como el
control de calidad. En ambas industrias, un ensayo de letalidad en
ratones es actualmente el único ensayo aceptable para la potencia de
la neurotoxina botulínica.
Desafortunadamente, el ensayo de letalidad en
ratones sufre de diversos inconvenientes: coste debido al gran
número de animales de laboratorio requerido; falta de especificidad;
imprecisión potencial a no ser que se usen grandes grupos de
animales; y sacrificio de vida animal. Así pues, existe una
necesidad para nuevos procedimientos basados en sustratos
sintéticos convenientes que puedan complementar y reducir la
necesidad del ensayo de letalidad en ratón. La presente invención
satisface esta necesidad proporcionando nuevos ensayos para
determinar la presencia o actividad de una toxina clostridial y
proporciona además ventajas relacionadas.
Se desvela un procedimiento para determinar la
presencia o actividad de una toxina clostridial mediante (a) el
tratamiento con una muestra, en condiciones adecuadas para la
actividad proteasa de la toxina clostridial, un sustrato de la
toxina clostridial que incluye un fluoróforo; un grupo formador de
volumen y una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que
contiene un sitio de escisión que se interpone entre el fluoróforo
y el grupo formador de volumen; (b) la excitación del fluoróforo con
luz polarizada plana; y (c) la determinación de polarización de
fluorescencia del sustrato tratado con relación a un sustrato
control en el que un cambio de la polarización de fluorescencia del
sustrato tratado se compara con la polarización de fluorescencia del
sustrato control es indicativa de la presencia o actividad de la
toxina clostridial.
La presente invención proporciona un
procedimiento para determinar la presencia o actividad de una toxina
clostridial mediante (a) el tratamiento con una muestra, en
condiciones adecuadas para la actividad proteasa de la toxina
clostridial, de un sustrato de toxina clostridial que contiene (i)
un fluoróforo donante; (ii) un aceptor que tiene un espectro de
absorción que solapa con el espectro de emisión del fluoróforo
donante; y (iii) una secuencia de reconocimiento de toxina
clostridial que contiene un sitio de escisión, en la que el sitio
de escisión se interpone entre el fluoróforo donante y el aceptor y
en la que, en las condiciones apropiadas se muestra transferencia
resonante de energía entre el fluoróforo donante y el aceptor; (b)
la excitación del fluoróforo donante con luz polarizada plana; y
(c) la determinación de polarización de fluorescencia de al menos 3
mP de dicho sustrato tratado con relación a un sustrato control, en
el que un cambio en la polarización de fluorescencia de la
sustancia tratada al compararse con la polarización de fluorescencia
del sustrato control es indicativo de la presencia o actividad de la
toxina clostridial.
El documento WO 03/020948 desvela un
procedimiento para determinar la presencia o actividad de una toxina
clostridial usando un sustrato que comprende un fluoróforo donante,
un aceptor y una secuencia de reconocimiento de toxina
clostridial.
El documento WO 02/25284 desvela ensayos de alto
rendimiento para las actividades proteolíticas de las neurotoxinas
clostridiales usando sustratos FRET.
El documento US 2001/046668 desvela un
procedimiento para la determinación de la actividad de proteasas
usando ensayos de polarización de fluorescencia para proteasas
virales.
La figura 1 muestra un diagrama de las cuatro
etapas requeridas para la actividad de toxina del tétanos y
botulínica en las neuronas centrales y periféricas.
La figura 2 muestra la localización subcelular y
los sitios de escisión de SNAP-25, VAMP y sintaxina.
VAMP se une a la membrana de la vesícula sináptica, mientras que
SNAP-25 y sintaxina se unen a la membrana plasmática
diana. BoNT/A y /E escinden SNAP-25 cerca del
extremo carboxiterminal, liberando nueve o 26 restos,
respectivamente. BoNT/B, /D, /F, /G y TeNT actúan en la porción
central conservada de VAMP (punteada) y liberan la porción
aminoterminal de VAMP al citosol. BoNT/C1 escinde
SNAP-25 cerca del extremo
carboxi-terminal así como corta la sintaxina en un
sitio único cerca de la superficie de la membrana citosólica. La
acción de BoNT/B, /C1, /D, /F, /G y TeNT da como resultado la
liberación de una porción grande del dominio citosólico de VAMP o
sintaxina, mientras que sólo una pequeña porción de
SNAP-25 se libera por proteólisis selectiva de
BoNT/A, /C1 o /E.
La figura 3 muestra un alineamiento de varias
proteínas SNAP-25. SNAF-25 Humana
(SEC ID Nº 1; acceso GenBank g4507099; véase, también, secuencia
SNAP-25 humana relacionada g2135800);
SNAP-25 de ratón (SEC ID Nº 2; acceso GenBank
G6755588); SNAP-25 de Drosophila (SEC ID Nº
3; acceso GenBank G548941); SNAP-25 de carpa dorada
(SEC ID Nº 4; acceso GenBank g2133923); SNAP-25 de
erizo de mar (SEC ID Nº 5; acceso GenBank g2707818) y
SNAP-25 de pollo (SEC ID Nº 6; acceso GenBank
g481202) se representan.
La figura 4 muestra un alineamiento de varias
proteínas VAMP. Se representan la VAMP-1 humana (SEC
ID Nº 7; acceso GenBank g135093); VAMP-2 humana (SEC
ID Nº 8; acceso GenBank g135094); VAMP-2 de ratón
(SEC ID Nº 9; acceso GenBank g2501081); VAMP bovina (SEC ID Nº 10;
acceso GenBank g89782); VAMP de rana (SEC ID Nº 11; acceso GenBank
g6094391); y VAMP de erizo de mar (SEC ID Nº 12; acceso GenBank
g5031415).
La figura 5 muestra un alineamiento de varias
proteínas de sintaxina. Se representan la sintaxina 1A humana (SEC
ID Nº 13; acceso GenBank g15079184), sintaxina 1B2 humana (SEC ID Nº
14; acceso GenBank g15072437), sintaxina 1A de ratón (SEC ID Nº 15;
acceso GenBank g15011853), sintaxina 1A de Drosophila (SEC ID
Nº 16; acceso GenBank g2501095); sintaxina A de C. elegans
(SEC ID Nº 17; acceso GenBank g7511662) y sintaxina de erizo de mar
(SEC ID Nº 18; acceso GenBank g13310402).
La figura 6 muestra (A) un diagrama del plásmido
pQBI GFP-SNAP25_{(134-206)}.
6XHIS-C y (B) las secuencias de ácido nucleico y
aminoácidos (SEC ID Nº^{s} 19 y 20) de pQBI
GFP-SNAP25_{(134-206)}-6XHIS-C.
La figura 7 muestra (A) el espectro de absorción
y (B) los espectros de excitación (punteado) y emisión (negrita) de
GFP-SNAP
25_{(134-206)}-His6C.
La figura 8 muestra (A) el espectro de absorción
de UV-VIS y (B) los espectros de excitación
(negrita) y emisión (punteado) de
GFP-SNAP25_{(134-206)}-His6C-Alexa
Fluor® 594.
La figura 9 muestra la renovación del sustrato
de
GFP-SNAP25_{(134-206)})-His6C-Alexa
Fluor® 594 usando BoNT/A reducida a varias concentraciones. La
flecha cuando se añade el complejo de toxina reducido.
La figura 10 muestra la renovación del sustrato
de
GFP-SNAP25_{(134-206)})-His6C-Alexa
Fluor® 546 usando una cadena ligera recombinante BoNT/A. La flecha
indica la adición de la cadena ligera de BoNT/A.
La invención proporciona nuevos procedimientos
para determinar la presencia o actividad de toxinas clostridiales
incluyendo toxinas botulínicas de todos los serotipos así como
toxinas del tétanos. Los nuevos procedimientos de la invención, que
se basan en un sustrato de toxina clostridial útil, para el análisis
por polarización de fluorescencia, reducen la necesidad de estudios
de toxicidad animal y pueden usarse para analizar muestras brutas y
masivas así como toxinas de doble cadena o cadena sencilla altamente
purificadas o productos de toxina formulados. Los procedimientos
basados en polarización de fluorescencia de la invención son
ventajosos en tanto que son ensayos sensibles que son resistentes
en términos de interferencia de la fluorescencia de fondo presente
en las muestras. Además, los nuevos procedimientos de la invención
pueden realizarse como ensayos de fase de solución homogénea y son
responsables de formatos automatizados de alto rendimiento.
Como se desvela en el presente documento, en el
Ejemplo I, un sustrato de toxina clostridial se preparó con Alexa
Fluor® 594 como un fluoróforo, proteína verde fluorescente (GFP)
como grupo formador de volumen y una porción de SNAP25 (restos
134-206) como secuencia de reconocimiento de toxina
clostridial para BoNT/A. El espectro de absorción de la proteína
GFP-SNAP25_{(134-205)}-His6-Cys
marcada con Alexa Fluor® 594 se muestran en el presente documento
en la figura 8A y los espectros de excitación y emisión de
GFP-SNAP25_{(134-206)}-His6-C-Alexa
Fluor® 594 se muestran en el presente documento en la figura 8B.
Como se desvela posteriormente en el presente documento en el
Ejemplo II, el sustrato de
GFP-SNAP25_{(134-206)}-His6-C
Alexa Fluor® 594 se ensayó con respecto a su utilidad como un
sustrato adecuado mediante el ensayo con respecto a la actividad de
la toxina masiva reducida BoNT/A mediante el registro del cambio de
polarización de fluorescencia a lo largo del tiempo. Como se
muestra en la figura 9 existió una reducción en la polarización de
fluorescencia en el momento o poco después de que se añadiera la
toxina BoNT/A masiva diluida, y la actividad de la toxina se detectó
a una concentración tan baja como 50 ng/ml (véase panel 9D). Estos
resultados demuestran que la presencia o actividad de toxinas
clostridiales puede determinarse usando sustratos sintéticos
ensayados mediante polarización de fluorescencia.
Como se desvela además en el presente documento,
la polarización de fluorescencia puede combinarse con transferencia
resonante de energía de fluorescencia para ensayar de manera
sensible con respecto a la presencia o actividad de una toxina
clostridial. Como se desvela en el ejemplo 1, una proteína
GFP-SNAP25_{(134-206)}-His6-C
se marcó para sitio específico en el resto cisteína carboxiterminal
con Alexa Fluor® 546; las propiedades de fotoselección de GFP y
Alexa Fluor® 546 posibilitan la transferencia resonante de energía
de fluorescencia (FRET) entre el fluoróforo donante GFP y el
aceptor Alexa Fluor® 546. Como se desvela en el ejemplo 3 y se
muestra en la figura 10, la polarización de fluorescencia aumentó
tras la adición de la cadena ligera recombinante de BoNT/A. Sin
desear quedar ligado a lo siguiente, FRET en el sustrato intacto
conduce a una aparente despolarización de la emisión de Alexa
Fluor® 546 debido al ángulo significativo entre el dipolo
seleccionado inicialmente (GFP) y el dipolo que se seleccionaría
por excitación directa de Alexa Fluor® 546. Tras la proteólisis, el
efecto FRET se suprime y la polarización por consiguiente aumenta
incluso aunque la rotación del colorante Alexa Fluor® aumenta. La
combinación de transferencia resonante de energía de fluorescencia
con polarización de fluorescencia potenció el cambio de
polarización tras la renovación, aumentando la sensibilidad del
ensayo (véase figura 10). Estos resultados indican que la
polarización de fluorescencia puede combinarse con transferencia
resonante de energía de fluorescencia para potenciar la sensibilidad
en los ensayos con respecto a la presencia o actividad de una toxina
clostridial.
Se desvela un procedimiento para determinar la
presencia o actividad de una toxina clostridial mediante (a) el
tratamiento con una muestra, en condiciones adecuadas para la
actividad proteasa de la toxina clostridial, un sustrato de toxina
clostridial que incluye un fluoróforo; un grupo formador de volumen;
y una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que
contiene un sitio de escisión que se interpone entre el fluoróforo
y el grupo formador de volumen; (b) la excitación del fluoróforo con
luz polarizada plana; y (c) la determinación de la polarización de
fluorescencia del sustrato tratado con relación al sustrato de
control, en el que un cambio de la polarización de fluorescencia
del sustrato tratado en comparación con la polarización de
fluorescencia del sustrato control es indicativa de la presencia o
actividad de la toxina clostridial. En dicho procedimiento, el
cambio de la polarización de fluorescencia es una disminución de la
polarización de fluorescencia. En otro procedimiento, la etapa (c)
incluye la determinación del cambio en la polarización de
fluorescencia del sustrato tratado a lo largo del tiempo.
En un procedimiento de la invención, un
fluoróforo puede tener, sin limitación, un tiempo de vida de la
fluorescencia de al menos 0,5 nanosegundos, o al menos 5
nanosegundos, o al menos 10 nanosegundos. Cualquiera de una
diversidad de fluoróforos puede ser útil en los procedimientos de
la invención incluyendo, pero no limitados a, colorantes Alexa
Fluor®; fluoresceína y derivados de fluoresceína tales como
diaminotiacinilamino-fluoresceína (DTAF); derivados
de biarsénico de fluoresceína tales como colorante de unión a
horquilla arsénico de fluoresceína (FlAsH^{TM}) y colorante
biarsénico rojo (ReAsH^{TM}) carboxifluoresceína (FAM); Texas
Red^{TM}; tetrametilcarboxi-rodamina (TMR);
carboxi-x-rodamina (ROX); verde
rodamina; Oregon Green 488; BODIPY-TR®;
BODIPY-TMR; BODIPY®-FL; Cy3; Cy^{TM}3B y dansilo.
En una realización, el fluoróforo es un colorante Alexa Fluor® tal
como, sin limitación, Alexa Fluor® 594. En otras realizaciones, el
fluoróforo es FlAsH^{TM} o ReAsH^{TM}.
Una diversidad de grupos formadores de volumen
son útiles en los procedimientos de la invención, incluyendo, sin
limitación, proteínas fluorescentes tales como la proteína verde
fluorescente. En una realización, un procedimiento de la invención
se practica de tal modo que el cambio en masa molecular tras la
escisión del sustrato de toxina clostridial es de al menos 1000 Da.
En otra realización, un procedimiento de la invención se practica
de tal modo que la disminución de la polarización de fluorescencia
es de al menos 5 ud de milipolarización (mP). En una realización
más, un procedimiento de la invención se practica de tal modo que la
disminución de la polarización de fluorescencia es de al menos 15
mP.
Puede incluirse una diversidad de secuencias de
reconocimiento en el sustrato de toxina clostridial útiles en un
procedimiento de la invención. En una realización, la secuencia de
reconocimiento es una secuencia de reconocimiento BoNT/A tal como,
sin limitación, una secuencia de reconocimiento BoNT/A que contiene
al menos 6 restos consecutivos de SNAP-25,
incluyendo los seis restos consecutivos Gln-Arg, o
un peptidomimético de los mismos. Dicha secuencia de reconocimiento
BoNT/A puede incluir, por ejemplo, los restos 134 a 206 de SEC ID
Nº 2. Una secuencia de reconocimiento incluida en un sustrato de
toxina clostridial útil en un procedimiento de la invención también
puede ser, sin limitación, una secuencia de reconocimiento BoNT/B.
Dicha secuencia de reconocimiento BoNT/B puede contener, por
ejemplo, al menos seis restos consecutivos de VAMP, incluyendo los
seis restos consecutivos Gln-Phe, o un péptido
mimético de los mismos. En una realización más, una secuencia de
reconocimiento incluida en un sustrato de toxina clostridial útil en
un procedimiento de la invención es una secuencia de reconocimiento
BoNT/C1. Dicha secuencia de reconocimiento BoNT/C1 puede contener,
sin limitación, al menos seis restos consecutivos de sintaxina,
incluyendo los seis restos consecutivos Lys-Ala o un
peptidomimético de los mismos. Una secuencia de reconocimiento
BoNT/C1 útil en la invención también puede contener al menos seis
restos consecutivos de SNAP-25, incluyendo los seis
restos consecutivos Arg-Ala o un peptidomimético de
los mismos.
\newpage
En una realización más, una secuencia de
reconocimiento incluida en un sustrato de toxina clostridial útil
en un procedimiento de la invención es una secuencia de
reconocimiento BoNT/D. Dicha secuencia de reconocimiento BoNT/D
puede contener, por ejemplo, al menos seis restos consecutivos de
VAMP, incluyendo los seis restos consecutivos
Lys-Leu o un peptidomimético de los mismos. Una
secuencia de reconocimiento útil en la invención también puede ser,
por ejemplo, una secuencia de reconocimiento BoNT/E. Dicha secuencia
de reconocimiento BoNT/E puede incluir, sin limitación, los restos
134 a 206 de la SEC ID Nº 2, o puede contener al menos seis restos
consecutivos de SNAP25, incluyendo los seis restos consecutivos
Arg-Ile o un peptidomimético de los mismos. En otra
realización más, una secuencia de reconocimiento incluida en un
sustrato de toxina clostridial útil en un procedimiento de la
invención es una secuencia de reconocimiento de BoNT/F. Las
secuencias de reconocimiento BoNT/F útiles en la invención abarcan,
sin limitación, las que tienen al menos seis restos consecutivos de
VAMP, incluyendo los seis restos consecutivos
Gln-Lys, o un peptidomimético de los mismos. Una
secuencia de reconocimiento incluida en un sustrato de toxina
clostridial útil en un procedimiento de la invención también puede
ser una secuencia de reconocimiento BoNT/G. Dichas secuencias de
reconocimiento BoNT/G abarcan, sin limitación, las que tienen al
menos seis restos consecutivos de VAMP, incluyendo los seis restos
consecutivos Ala-Ala, o un peptidomimético de los
mismos. En otra realización más, una secuencia de reconocimiento
incluida en un sustrato de toxina clostridial útil en un
procedimiento de la invención es una secuencia de reconocimiento
TeNT. Dicha secuencia de reconocimiento TeNT puede ser, sin
limitación, una secuencia que contiene al menos seis restos
consecutivos de VAMP, incluyendo los seis restos consecutivos
Gln-Phe, o un peptidomimético de los mismos.
Cualquiera de una diversidad de sustratos de
toxina clostridial son útiles para determinar la presencia o
actividad de una toxina clostridial de acuerdo con un procedimiento
de la invención. En una realización, un sustrato de toxina
clostridial es un péptido o peptidomimético que tiene al menos cien
restos. En otra realización, un sustrato de toxina clostridial es
un péptido o peptidomimético que tiene al menos doscientos restos.
Además, cualquiera de una diversidad de muestras puede ensayarse de
acuerdo con un procedimiento de la invención que incluye, pero no
se limita a, lisados de células en bruto, toxinas clostridiales
aisladas incluyendo cadenas ligeras de toxinas clostridiales
aisladas; y productos de toxina clostridial formulados tales como,
sin limitación, productos de toxina BoNT/A, BoNT/B o BoNT/E
formulados.
Las neurotoxinas del tétanos y botulínicas que
pueden ensayarse de acuerdo con un procedimiento de la invención se
producen por Clostridia. Estas toxinas causan los síndromes
neuroparalíticos del tétanos y botulismo, actuando la toxina del
tétanos principalmente dentro del sistema nervioso central y
actuando la toxina botulínica en el sistema nervioso periférico.
Las neurotoxinas clostridiales comparten un mecanismo similar de
intoxicación celular en el que la liberación de neurotransmisores
se bloquea. En estas toxinas, que se componen de dos cadenas
polipeptídicas unidas por disulfuro, la subunidad mayor es
responsable de unión neuroespecífica y translocación de la
subunidad menor hacia el citoplasma. Tras la translocación y
reducción en neuronas, la cadena menor presenta actividad peptidasa
específica para componentes proteínicos involucrados en la
neuroexocitosis. Los objetivos proteínicos "SNARE" de las
toxinas clostridiales son comunes a la exocitosis en una diversidad
de tipos no neuronales; en estas células, como en las neuronas, la
actividad peptidasa de cadena ligera inhibe la exocitosis.
La neurotoxina del tétanos y las neurotoxinas
botulínicas B, D, F y G reconocen específicamente VAMP (también
conocida como sinaptobrevina), una proteína integral de la membrana
de la vesícula sináptica. VAMP se escinde en enlaces distintos
dependiendo de la neurotoxina. Las neurotoxinas botulínicas A y E
reconocen y escinden específicamente SNAP-25, una
proteína de la membrana presináptica, en dos sitios diferentes de la
porción carboxi terminal de la proteína. La neurotoxina botulínica
C escinde la sintaxina, una proteína del plasmalema neuronal,
además de SNAP-25. Las tres proteínas diana de las
neurotoxinas clostridiales se conservan desde la levadura hasta los
humanos aunque los sitios de escisión y la susceptibilidad a toxina
no están necesariamente conservados (véase posteriormente; véase,
también, Humeau y col., Bichimie 82:427-446 (2000);
Niemann y col., Trends in Cell Biol. 4:179-185
(1994); y Pellizzari y col., Phil. Trans. R. Soc. Londres
354:259-268 (1999)).
Las neurotoxinas del tétanos y botulínicas de
origen natural se producen como cadenas polipeptídicas de 150 kDa
sin una secuencia líder. Estas toxinas pueden escindirse por
proteinasas bacterianas o tisulares en un bucle expuesto sensible a
proteasa, generando una toxina de doble cadena activa. La escisión
proteolítica selectiva activa las toxinas mediante la generación de
dos cadenas unidas por disulfuro: una cadena L de 50 kDa y una
cadena H de 100 kDa, que se compone de dos dominios indicados como
H_{N} y H_{C}. Esta toxina de doble cadena está más activa que
la toxina no fragmentada. Las toxinas clostridiales de origen
natural contienen un puente disulfuro intercatenario sencillo que
entrecruza la cadena pesada y la cadena ligera; tal puente es
importante para la neurotoxicidad de la toxina añadida
extracelularmente (Montecucco y Schiavo, Quarterly Rev. Biophysics
28:423-472 (1995)).
Las toxinas clostridiales parecen estar plegadas
en tres dominios distintos de aproximadamente 50 kDa que se
conectan mediante bucles, teniendo cada dominio un papel funcional
distinto. Como se ilustra en la figura 1, el mecanismo de
intoxicación celular de las toxinas clostridiales consiste en cuatro
etapas distintas: (1) unión; (2) internalización; (3) translocación
de membrana; y (4) modificación de la diana enzimática. El dominio
carboxiterminal de la cadena pesada (H_{c}) actúa en la unión
neuroespecífica, mientras que el dominio
amino-terminal de la cadena H (H_{N}) actúa en la
translocación de membrana desde el endosoma al citoplasma celular.
Después de la reducción del enlace disulfuro dentro de la célula, la
actividad cinc-endopeptidasa de la cadena L se
libera (Montecucco y Schiavo, mencionado anteriormente, 1995).
\newpage
Las secuencias de aminoácidos de ocho serotipos
humanos de neurotoxina clostridial se han derivado de los genes
correspondientes (Niemann, "Molecular Biology of Clostridial
Neurotoxins" en Sourcebook of Bacterial Protein Toxins Alouf y
Freer (Eds.) pp. 303-348 Londres Academia Press
1991). La cadena L y la cadena H se componen de aproximadamente 439
y 843 restos respectivamente. Los segmentos homólogos se separan por
regiones de poca o ninguna similitud. Las regiones mejor
conservadas de la cadena L son la porción aminoterminal (100
restos) y la región central (que corresponde a los restos 216 a 244
de TeNT), así como las dos cisteínas que forman el enlace disulfuro
intercatenario. La región 216 a 244 contiene un motivo de unión
His-Glu-X-X-His
característico de cinc-endopeptidasas.
Las cadenas pesadas de toxina clostridial están
menos conservadas que las cadenas ligeras, siendo la porción
carboxi-terminal de H_{c} correspondiente a los
restos 1140 a 1315 de TeNT la más variable. Ésta es consistente con
la participación del dominio H_{c} en la unión a terminales
nerviosas y el hecho de que diferentes neurotoxinas parezcan unirse
a diferentes receptores.
La comparación de las secuencias de nucleótidos
y de aminoácidos de las toxinas clostridiales indica que derivan de
un gen ancestral común. La proliferación de estos genes se ha
facilitado por el hecho de que los genes de la neurotoxina
clostridial están localizados en elementos genéticos móviles. Como
se discute en mayor medida posteriormente, las variantes
secuenciales de las siete toxinas botulínicas se conocen en la
técnica. Véase, por ejemplo, Humeau y col., mencionado
anteriormente, 2000.
Como se ha discutido anteriormente, la dianas
naturales de las neurotoxinas clostridiales incluyen VAMP,
SNAP-25 y sintaxina. VAMP se asocia con la membrana
de la vesícula sináptica, mientras que SNAP-25 y la
sintaxina se asocian con la membrana diana (véase figura 2). BoNT/A
y BoNT/E escinden SNAP25 en la región carboxiterminal, liberando
nueve o veintiséis restos aminoácidos, respectivamente, y BoNT/C1
también escinde SNAP25 cerca del extremo carboxiterminal. Los
serotipos botulínicos BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F y BoNT/G y la toxina
del tétanos, actúan en la porción central conservada de VAMP, y
liberan la porción aminoterminal de VAMP al citosol. BoNT/C1
escinde la sintaxina en un sitio único cerca de la superficie de la
membrana citosólica. Así pues, la proteólisis de BoNT/B, BoNT/C1,
BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o TeNT da como resultado la liberación de una
gran porción del dominio citosólico de VAMP o sintaxina, mientras
que solamente una pequeña porción de SNAP-25 se
libera por la escisión de BoNT/A, BoNT/C1 o BoNT/E (Montecucco y
Schiavo, mencionado anteriormente, 1995).
La SNAP25 de origen natural, una proteína de
aproximadamente 206 restos sin segmento transmembrana, se asocia
con la superficie citosólica del plasmalema neuronal (Figura 2;
véase, también, Hodel y col., Int. J. Biochemistry y Cell Biology
30:1069-1073(1998)). Además de los homólogos
altamente conservados desde Drosophila hasta mamíferos, las
proteínas relacionadas con SNAP25 también se han clonado de
levadura. Se requiere SNAP25 para el crecimiento axonal durante el
desarrollo y puede requerirse para la plasticidad de los terminales
nerviosos en el sistema nervioso maduro. En humanos, se expresan
diferencialmente dos isoformas durante el desarrollo; la isoforma a
se expresa de forma constitutiva durante el desarrollo fetal
mientras que la isoforma b aparece en el nacimiento y predomina en
la vida adulta. Los análogos de SNAP-25 tales como
SNAP-23 también se expresan fuera del sistema
nervioso, por ejemplo, en células pancreáticas.
VAMP de origen natural es una proteína de
aproximadamente 120 restos, con una longitud exacta que depende de
la especie y el isotipo. Como se muestra en la figura 2, VAMP
contiene un segmento carboxiterminal corto dentro del lumen de la
vesícula mientras que la mayor parte de la molécula está expuesta al
cistosol. Los 30 residuos amino-terminales ricos en
prolina son divergentes entre especies e isoformas mientras que la
porción central de VAMP (restos 30 a 96), que es rica en restos
cargados e hidrófilos e incluye sitios de escisión conocidos, está
altamente conservada. VAMP se colocaliza con la sinaptofisina en
membranas de vesículas sinápticas.
Una diversidad de homólogos entre especies de
VAMP se conocen en la técnica incluyendo homólogos humanos, de
rata, bovinos, de Torpedo, de Drosophila, de levadura,
de calamar y de Aplysia. Además, se han identificado
múltiples isoformas de VAMP incluyendo VAMP-1,
VAMP-2 y celubrevina, y formas insensibles a
escisión de toxina se han identificado en células no neuronales.
VAMP parece estar presente en todos los tejidos de vertebrados
aunque la distribución de VAMP-1 y
VAMP-2 varía en diferentes tipos celulares. Las
VAMP-1 de pollo y rata no se escinden por TeNT o
BoNT/P. Estos homólogos de VAMP-1 tienen una valina
en lugar de la glutamina presente en VAMP-1 de
humano y ratón en el sitio de escisión TeNT o BoNT/B. La sustitución
no afecta a BoNT/D, /F o /G, que escinden tanto
VAMP-1 como VAMP-2 con tasas
similares.
La sintaxina se localiza en la superficie del
citosol del plasmalema neuronal y se ancla a la membrana mediante
un segmento carboxiterminal, con la mayor parte de la proteína
expuesta al citosol. La sintaxina se colocaliza con canales de
calcio a las zonas activas de la membrana presináptica, donde tiene
lugar la liberación del neurotransmisor. Además, la sintaxina
interactúa con sinaptotagmina, una proteína de la membrana SSV, que
forma un puente funcional entre el plasmalema y las vesículas. Se
han identificado una diversidad de isoformas de sintaxina. Se han
identificado dos isoformas de longitud ligeramente diferente (285 y
288 restos) en neuronas (isoformas 1A y 1B), expresándose las
isoformas 2, 3, 4 y 5 en otros tejidos. Las diferentes isoformas
tienen sensibilidades distintas a BoNT/C1, con las isoformas de
sintaxina 1A, 1B, 2 y 3 escindidas por esta toxina.
\newpage
Los procedimientos de la invención se basan, en
parte, en el uso de polarización de fluorescencia. De acuerdo con
la teoría de polarización de fluorescencia, cuando una molécula
marcada fluorescentemente se excita con luz polarizada plana, emite
luz que tiene un grado de polarización que es inversamente
proporcional a su rotación molecular. Como consecuencia, para
moléculas marcadas fluorescentemente grandes, que se mantienen
relativamente estacionarias durante su estado excitado
(aproximadamente 4 ns por fluoresceína), la polarización se mantiene
relativamente constante entre excitación y emisión. Por el
contrario, moléculas pequeñas marcadas fluorescentemente rotan
rápidamente durante el estado excitado, de tal modo que la
polarización de la luz cambia significativamente entre la
excitación y la emisión. Por lo tanto, como una generalización, las
moléculas pequeñas tienen valores de polarización bajos, y las
moléculas grandes tienen valores de polarización altos. Véase, por
ejemplo, Weber, "Polarization of the Fluorescence of
Solutions" en Fluorescence & Phosphorescence Analysis páginas
217-241 Wiley Interscience (1996), y Jameson y
Seifried, Methods Enzym. 19: 222-233 (1999).
Los ensayos de polarización de fluorescencia son
homogéneos en tanto que no requieren una etapa de separación y no
requieren unión del sustrato a una fase inmovilizada. Además, los
valores de polarización pueden medirse repetidamente. Además, la
polarización de fluorescencia es una técnica sensible que puede
usarse para medir valores de polarización de fluoróforos desde
niveles bajos picomolares y micromolares. La plarización también es
independiente de la intensidad de fluorescencia.
La anisotropía de fluorescencia (comúnmente
indicada como "r" o a veces "A") es una definición
alternativa de cómo un plano de luz polarizada cambia entre la
excitación y la emisión con un fluoróforo rotatorio. La
polarización de fluorescencia y la anisotropía se conocen bien en la
técnica como se ha descrito en Lundblad y col., Mol. Endocrin.
10:607-612 (1996); Nasir y col., Thompson y col.,
Biotechniques 3234-40 (1997); Lakowixz y col., J.
Biomol. Screen. 5:123-132 (2000); y Fernandes, Curr.
Opin. Chem. Biol. 2:597-603 (1998).
En particular, la proliferación de fluorescencia
(P) y la anisotropía (r) se definen como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y
\vskip1.000000\baselineskip
en las que I Vertical es la
intensidad de la luz de emisión paralela al plano de la luz de
excitación e I Horizontal es la intensidad de la luz de emisión
perpendicular al plano de la luz de excitación. P y r, que son
relaciones de intensidades de luz, son adimensionales. Los datos
experimentales pueden expresarse en unidades de milipolarización, en
las que una unidad de polarización = 1000 unidades de mP o en
unidades de milianisotropía, en las que 1 unidad de
anisotropía = 1000 unidades de mA.
anisotropía = 1000 unidades de mA.
\vskip1.000000\baselineskip
Las fórmulas para interconvertir polarización en
anisotropía son como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Fundamentalmente, la polarización es una
relación del tiempo de vida de la fluorescencia y cuan rápido un
fluoróforo rota en el tiempo entre excitación y emisión. Los
factores principales que controlan la rotación son el volumen molar
(V), la temperatura absoluta (T), y la viscosidad (\eta). El
tiempo de correlación rotacional (\theta) y el tiempo de
relajación rotacional (\rho_{o}) se toman del trabajo de Perrin
y Weber. En particular, el tiempo de correlación rotacional
(\theta) se toma de la ecuación de Perrin como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
y se define
como:
Tiempo de correlación rotacional
\vskip1.000000\baselineskip
Además, el tiempo de relajación rotacional
(\rho_{o}) se toma de la ecuación Perrin/Weber (Perrin, J. Phys.
Rad. 7:390-401 (1926)), como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
y se define
como:
Tiempo de relajación rotacional
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R es la constante de
gases, T es el tiempo de vida de la fluorescencia, P es la
polarización, y P_{0} es la polarización
limitante.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de lo anterior, puede verse que, cuando
el tiempo de vida, la viscosidad, y la temperatura se mantienen
constantes, el volumen molecular (y por tanto la polarización o
anisotropía) determina la rotación. Cuanto mayor sea el volumen
molecular más lento gira la molécula y mayores son los valores de
polarización y anisotropía. Además, como resulta evidente a partir
de las ecuaciones anteriores, el tiempo de relajación rotacional
será exactamente 3 veces más largo que el tiempo de correlación
rotacional.
Un procedimiento de la invención se basa en un
sustrato de toxina clostridial que incluye, en parte, un fluoróforo.
Como se usa en el presente documento, el término "fluoróforo"
se refiere a una molécula que, cuando se irradia con luz de una
cierta longitud de onda, emite luz, también llamada fluorescencia,
de una longitud de onda diferente, el término fluoróforo es sinónimo
en la técnica con el término "fluorocromo".
Los fluoróforos útiles en la invención, así como
los fluoróforos donantes que se discuten posteriormente, incluyen
los que tienen tiempos de vida de la fluorescencia adecuados para el
análisis de polarización de fluorescencia. Los fluoróforos útiles
incluyen, sin limitación, colorantes Alexa Fluor®; fluoresceína y
derivados de fluoresceína tales como
diaminotriacinilamino-fluoresceína (DTAF); derivados
biarsénicos de fluoresceína tales como colorante de unión en
horquilla arsénico de fluoresceína (FlAsH^{TM}) y colorante rojo
biarsénico (ReAsH^{TM}); carboxifluoresceína (FAM); Texas
Red^{TM}; tetrametilcarboxi-rodamina (TMR);
carboxi-x-rodamina (ROX); verde
rodamina; Oregon Green 488; BODIPY-TR®;
BODIPY-TMR; BODIPY®-FL; Cy3, Cy^{TM}3B y dansilo.
Se conocen en la técnica fluoróforos adicionales para la
polarización de fluorescencia, incluyendo, pero no limitados a,
fluoróforos de larga longitud de onda tales como
BODIPY-TMR y BODIPY-TR® (Molecular
Probes), que tienden a minimizar la interferencia en el ensayo, y
fluoróforos insensibles a pH tales como BODIPY-FL.
Véase, por ejemplo, Owicki, J. Biomol. Screening 5:
297-306 (2000); Burke y col., Comb. Chem. & High
Throughput Screen. 6:183-194 (2003); y Jameson y
Croney Comb. Chem. & High Throughput Screen.
6:167-176 (2003). Están disponibles en el mercado
una diversidad de fluoróforos y fluoróforos donantes útiles para la
polarización de fluorescencia de varias fuentes tales como
Molecular Probes (Eugene, Oregon) y Amershan Pharmacia Biotech
(Piscataway, New Jersey). Un experto en la materia entiende que
éstos y otros fluoróforos adecuados para la polarización de
fluorescencia se conocen en la técnica y pueden ser útiles en los
procedimientos de la invención.
Como se usa en el presente documento, la
expresión "grupo formador de volumen" se refiere a un resto que
tiene suficiente volumen hidrodinámico tal que, tras la escisión de
un sustrato de toxina clostridial en el que se incorpora el grupo
formador de volumen, hay un cambio de polarización de al menos 3
unidades de milipolarización (mP).
Cualquiera de una diversidad de restos puede ser
útil como un grupo formador de volumen en un procedimiento de la
invención incluyendo restos físicos, químicos y biológicos que
pueden incorporarse covalentemente o no covalentemente a un
sustrato de toxina clostridial. En una realización, el grupo
formador de volumen se expresa como una proteína de fusión con otro
componente de sustrato de toxina clostridial. Los grupos formadores
de volumen útiles en la invención abarcan restos naturales y
artificiales y además abarcan, sin limitación, restos inertes así
como con actividad biológica o de otro tipo. Un grupo formador de
volumen útil en la invención puede ser, sin limitación, un resto
que tiene un tamaño mayor de 1000 Da. Un grupo formador de volumen
útil en la invención también puede ser, sin limitación, un resto
que tiene un tamaño de más de 2 kDa, 3 kDa, 4 kDa, 5 kDa, 10 kDa,
15 kDa, 20 kDa, 25 kDa, 30 kDa, 35 kDa o 40 kDa. Véase, también,
Mattinson y col., Application Note for Protein Solutions
Inc., Febrero 2001. Un experto en la materia entiende que un
fluoróforo con un tiempo de vida adecuado se seleccionará
dependiendo, en parte, del tamaño del grupo formador de volumen.
Una diversidad de grupos formadores de volumen
puede ser útil en la invención. Como ejemplos no limitantes, un
grupo formador de volumen útil en la invención puede ser una
proteína inerte o activa, péptido o peptidomimético; un anticuerpo;
un compuesto químico orgánico; partículas de látex u otro tipo; o un
resto tal como estreptavidina. Otros grupos formadores de volumen
útiles en la invención abarcan, sin limitación, fagos y otros virus;
células; liposomas; matrices poliméricas y no poliméricas; oro y
otras partículas; y microdispositivos y nanodispositivos. Como
ejemplos no limitantes, un grupo formador de volumen útil en la
invención puede ser una proteína fluorescente tal como GFP o BFP, o
un fragmento de la misma; una proteína útil para purificación por
afinidad tal como
glutatión-S-transferasa (GST) o
proteína de unión a maltosa (MBP); o un anticuerpo tal como, sin
limitación, un anti-FLAG,
anti-hemaglutinina (HA) o anticuerpo
anti-myc. La estreptavidina también puede ser un
grupo formador de volumen útil en la invención. Como un ejemplo no
limitante, una secuencia de biotinilación puede incluirse
covalentemente en un sustrato de toxina clostridial, posibilitando
la asociación con estreptavidina; la escisión enzimática puede
detectarse mediante el seguimiento del cambio de polarización de
fluorescencia tras la adición de estreptavidina como se describe en
Levin y
col., "Measurement of specific protease activity utilizing fluorescence polarization", Anal. Biochem. 247:83-88 (1997).
col., "Measurement of specific protease activity utilizing fluorescence polarization", Anal. Biochem. 247:83-88 (1997).
Un sustrato de toxina clostridial útil en la
invención contiene un sitio de escisión que "se interpone"
entre un fluoróforo y un grupo formador de volumen. Así pues, el
sitio de escisión se sitúa entre el fluoróforo y el grupo formador
de volumen de tal modo que la proteólisis en el sitio de escisión da
como resultado un primer producto de escisión que contiene el
fluoróforo y un segundo producto de escisión que contiene el grupo
formador de volumen. Se entiende que todo o sólo una porción de la
secuencia de reconocimiento de toxina clostridial puede interponerse
entre el fluoróforo y el grupo formador de volumen.
Un sustrato de toxina clostridial útil en la
invención contiene, en parte, una secuencia de reconocimiento de
toxina clostridial que incluye un sitio de escisión. Por definición,
un sustrato de toxina clostridial es susceptible a la escisión por
al menos una toxina clostridial en condiciones adecuadas para la
actividad proteasa de la toxina clostridial.
Como se usa en el presente documento, la
expresión "secuencia de reconocimiento de toxina clostridial"
se refiere a un enlace escindible junto con elementos de
reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficiente para
detectar proteólisis en el enlace escindible por una toxina
clostridial en condiciones adecuadas para la actividad proteasa de
la toxina clostridial. Se discute una diversidad de secuencia de
reconocimiento de toxina clostridial posteriormente en el presente
documento.
En realizaciones particulares, un sustrato de
toxina clostridial útil en la invención es un péptido o
peptidomimético que tiene una longitud definida. Un sustrato de
toxina clostridial puede ser, por ejemplo, un péptido o
peptidomimético que tiene al menos 100, al menos 150, al menos 200,
al menos 250, al menos 300, al menos 350, al menos 500, al menos
600, al menos 700, al menos 800 o al menos 900 restos. En otras
realizaciones, un sustrato de toxina clostridial tiene como máximo
20 restos, como máximo 30 restos, como máximo 40 restos, como máximo
50 restos, como máximo 60 restos, como máximo 70 restos, como
máximo 80 restos, como máximo 90 restos, como máximo 100 restos,
como máximo 150 restos, como máximo 200 restos, como máximo 250
restos, como máximo 300 restos, como máximo 350 restos o como máximo
400 restos.
Se entiende que un sustrato de toxina
clostridial útil en la invención puede incluir opcionalmente uno o
más componentes adicionales. Como ejemplo no limitante, una
secuencia espaciadora flexible tal como GGGGS (SEC ID Nº: 21) puede
incluirse en un sustrato de toxina clostridial útil en la invención.
Un sustrato de toxina clostridial útil puede además incluir, sin
limitación, uno o más de los siguientes: un marcador de afinidad
tal como HIS6; biotina o una secuencia de biotinilación; o un
epítopo tal como FLAG, hemaglutinina (HA), c-myc, o
AU1; una región bisagra de inmunoglobulina; un enlazador
N-hidroxisuccinimida; un giro en horquilla de
péptido o peptidomimético; una secuencia hidrófila u otro
componente o secuencia que, por ejemplo, facilita purificación o
promueve la solubilidad o estabilidad del sustrato de toxina
clostridial.
Como se explica posteriormente, se entiende que
los procedimientos de la invención son aplicables a muestras en
bruto así como toxinas de cadena sencilla y de cadena doble
altamente purificadas. Como ejemplos no limitantes, un
procedimiento de la invención puede ser útil para determinar la
presencia o actividad de una toxina clostridial en una muestra de
comida o bebida; para ensayar una muestra de humano o animal, por
ejemplo, expuesto a toxina clostridial o que tiene uno o más
síntomas de una toxina clostridial; para seguir la actividad durante
la producción y purificación de una toxina clostridial; o para
ensayar los productos de toxina clostridial formulados tales como
productos farmacéuticos o cosméticos.
Una diversidad de muestras son útiles en los
procedimientos de la invención. Como se usa en el presente
documento, el término "muestra" se refiere a cualquier materia
biológica que contiene o potencialmente contiene una toxina
clostridial activa. Así pues, el término muestra abarca, pero no se
limita a, toxina clostridial parcialmente purificada o purificada;
toxina de doble cadena o cadena sencilla recombinante con una
secuencia de origen natural o no natural; toxina clostridial
recombinante con una especificidad de proteasa modificada; toxina
clostridial recombinante con una especificidad celular alterada;
toxina quimérica que contiene elementos estructurales de múltiples
especies o subtipos de toxina clostridial; toxina masiva; producto
de toxina formulado; células o lisados celulares en bruto
fraccionados o parcialmente purificados, por ejemplo, obtenidos por
ingeniería genética para incluir un ácido nucleico recombinante que
codifica una toxina clostridial; lisados bacterianos, báculovirales
y de levaduras; alimentos crudos, cocinados, parcialmente cocinados
o procesados; bebidas; alimento animal; muestras de suelo; muestras
de agua; sedimentos de estanque; lociones; cosméticos; y
formulaciones clínicas. Se entiende además que el término muestra
abarca muestras tisulares, incluyendo, sin limitación, muestras
tisulares de mamífero, muestras tisulares de ganado tales como
muestras tisulares de oveja, vaca y cerdo; muestras tisulares de
primate; muestras tisulares humanas. Tales muestras abarcan, sin
limitación, muestras intestinales tales como muestras intestinales
infantiles, y muestras de tejido obtenidas de una herida.
Como se discute posteriormente, una diversidad
de condiciones adecuadas para la actividad proteasa de la toxina
clostridial son útiles en los procedimientos de la invención. Por
ejemplo, pueden proporcionarse condiciones adecuadas para la
actividad proteasa de la toxina clostridial de tal modo que al menos
el 10% del sustrato se escinde. De forma similar, pueden
proporcionarse las condiciones adecuadas para la actividad proteasa
de la toxina clostridial de modo que al menos el 20%, 30%, 40%,
50%, 60%, 70%, 80%, 90% ó 95% del sustrato de toxina clostridial se
escinde, o de tal modo que el 100% del sustrato de toxina
clostridial se escinde. En una realización, las condiciones
adecuadas para la actividad proteasa de toxina clostridial se
seleccionan de tal modo que el ensayo es lineal. En otra
realización, se proporcionan las condiciones adecuadas para la
actividad proteasa de toxina clostridial de modo que al menos el 90%
de sustrato de toxina clostridial se escinde. En una realización
más, se proporcionan las condiciones adecuadas para la actividad
proteasa de toxina clostridial de tal modo que como máximo el 25%
del sustrato de toxina clostridial se escinde. En otras
realizaciones más, se proporcionan las condiciones adecuadas para
la actividad proteasa de toxina clostridial de tal modo que como
máximo el 5%, 10%, 15% ó 20% del sustrato de toxina clostridial se
escinde.
En los procedimientos de la invención, el
sustrato de toxina clostridial puede tratarse con una muestra en
fase de disolución. Como se usa en el presente documento en
referencia al sustrato de toxina clostridial, la expresión "en
fase de disolución" se refiere a que el sustrato es soluble y,
durante la proteólisis, no se restringe o inmoviliza en un soporte
sólido tal como una columna o placa.
En los procedimientos de la invención, una
muestra se trata con sustrato de toxina clostridial en condiciones
adecuadas para la actividad proteasa de la toxina clostridial. Se
conocen bien en la técnica condiciones ejemplares adecuadas para la
actividad proteasa de toxina clostridial, y pueden además
determinarse por procedimientos rutinarios. Véase, por ejemplo
Hallis y col., J. Clin. Microbiol. 34: 1934-1938
(1996); Ekong y col., Microbiol, 143: 3337-3347
(1997); Shone y col., WO 95/33850; Schmidt y Bostian, mencionado
anteriormente, 1995; Schmidt y Bostian, mencionado anteriormente,
1997; Schmidt y col., mencionado anteriormente, 1998; y Schmidt y
Bostian, Patente de Estados Unidos Nº 5.965.699. Se entiende que
las condiciones adecuadas para la actividad proteasa de toxina
clostridial pueden depender, en parte, del tipo o subtipo de toxina
clostridial específico que está ensayándose y la pureza de la
preparación de toxina. Las condiciones adecuadas para la actividad
proteasa de toxina clostridial incluyen generalmente un tampón, tal
como HEPES, Tris o fosfato de sodio, típicamente en el intervalo de
pH 5,5 a 9,5, por ejemplo, en el intervalo de pH 6,0 a 9,0, pH 6,5 a
8,5 o pH 7,0 a 8,0. Las condiciones adecuadas para la actividad
proteasa de toxina clostridial también pueden incluir, si se desea,
ditiotreitol, \beta-mercaptoetanol u otro agente
reductor, por ejemplo, cuando se está ensayando una toxina de doble
cadena (Ekong y col., mencionado anteriormente, 1997). En una
realización, las condiciones incluyen DTT en el intervalo de 0,01
mM a 50 mM; en otras realizaciones, las condiciones incluyen DTT en
el intervalo de 0,1 mM a 20 mM, 1 a 20 mM, ó 5 a 10 mM. Si se
desea, una toxina clostridial o muestra aislada puede preincubarse
con un agente reductor, por ejemplo, con ditiotreitol 10 mM (DTT)
durante aproximadamente 30 minutos antes de la adición de sustrato
de toxina clostridial.
Las toxinas clostridiales son cinc
metaloproteasas, y una fuente de cinc, tal como cloruro de cinc o
acetato de cinc, típicamente en el intervalo de 1 a 500 \muM, por
ejemplo, 5 a 10 \muM, puede incluirse, si se desea, como parte de
las condiciones adecuadas para la actividad proteasa de toxina
clostridial. Un experto en la materia entiende que los quelantes de
cinc tales como EDTA generalmente se excluyen de un tampón para
determinar la actividad de la toxina clostridial.
Las condiciones adecuadas para la actividad
proteasa de toxina clostridial pueden incluir opcionalmente un
detergente tal como TWEEN-20, que puede usarse, por
ejemplo, en lugar de la albúmina de suero bovino.
TWEEN-20 puede proporcionarse, por ejemplo, en el
intervalo de 0,001% a 10% (v/v), o en el intervalo de 0,01% a 1,0%
(v/v). Como un ejemplo no limitante, TWEEN-20 puede
incluirse a una concentración de 0,1% (v/v).
Las condiciones adecuadas para la actividad
proteasa de la toxina clostridial también pueden incluir, si se
desea, albúmina de suero bovino (BSA) u otro agente que actúa como
estabilizador proteínico, agente solubilizante o bloqueador de
pérdida de superficie. Por ejemplo, cuando se incluye, BSA
típicamente se proporciona en el intervalo de 0,1 mg/ml a 10 mg/ml.
En una realización, BSA se incluye a una concentración de 1 mg/ml.
Véase, por ejemplo, Schmidt y Bostian, mencionado anteriormente,
1997. En otra realización, BSA se incluye a una concentración
de
0,1% (p/v).
0,1% (p/v).
\newpage
La cantidad de sustrato de toxina clostridial
puede variarse en un procedimiento de la invención. Un sustrato de
toxina clostridial puede proporcionarse, por ejemplo, a una
concentración de 1 \muM a 500 \muM, 1 \muM a 50 \muM, 1
\muM a 30 \muM, 5 \muM a 20 \muM, 50 \muM a 3,0 mM, 0,5 mM
a 3,0 mM, 0,5 mM a 2,0 mM, ó 0,5 mM a 1,0 mM. El experto en la
materia entiende que la concentración de sustrato de toxina
clostridial o la cantidad de muestra pueden limitarse, si se desea,
de tal modo que el ensayo es lineal. En una realización, un
procedimiento de la invención se basa en una concentración de
sustrato de toxina clostridial de menos de 100 \muM. En más
realizaciones, un procedimiento de la invención se basa en una
concentración de sustrato de toxina clostridial de menos de 50
\muM o menos de 25 \muM. En otra realización, un procedimiento
de la invención se basa en una concentración de sustrato de toxina
clostridial de 10 \muM a 20 \muM. Si se desea, un ensayo lineal
también puede realizarse mediante la mezcla de sustrato de toxina
clostridial con el correspondiente sustrato "no marcado" que
carece de fluoróforo. La dilución apropiada puede determinarse, por
ejemplo, mediante la preparación de diluciones seriadas de sustrato
de toxina clostridial en el sustrato no marcado correspondiente.
La concentración de toxina clostridial
purificada o parcialmente purificada que va a ensayarse en un
procedimiento de la invención generalmente está en el intervalo de
aproximadamente 0,0001 ng/ml a 500 \mug/ml de toxina, por
ejemplo, aproximadamente de 0,0001 ng/ml a 50 \mug/ml de toxina,
0,001 ng/ml a 500 \mug/ml de toxina, 0,001 ng/ml a 50 \mug/ml
de toxina, 0,0001 a 5000 ng/ml de toxina, por ejemplo,
aproximadamente de 0,001 ng/ml a 5000 ng/ml, de 0,01 ng/ml a 5000
ng/ml, 0,1 ng/ml a 5000 ng/ml, 1 ng/ml a 5000 ng/ml, 10 ng/ml a 5000
ng/ml, 50 ng/ml a 5000 ng/ml, 50 ng/ml a 500 ng/ml ó 100 ng/ml a
5000 ng/ml de toxina, que puede ser, por ejemplo toxina de doble
cadena recombinante purificada o producto de toxina clostridial
formulado que contiene albúmina de suero humano y excipientes.
Generalmente, la cantidad de toxina purificada ensayada en un
procedimiento de la invención está en el intervalo de 0,1 pg a 100
\mug, por ejemplo, 0,1 pg a 50 \mug ó 0,1 pg a 10 \mug.
La concentración de toxina clostridial
purificada o parcialmente purificada ensayada en un procedimiento de
la invención puede estar, por ejemplo, en el intervalo de
aproximadamente 0,1 pM a 100 \muM, 0,1 pM a 10 \muM, 0,1 pM a 1
\muM, 0,1 pM a 500 nM, 0,1 pM a 100 nM, por ejemplo, 0,1 pM a 2000
pM, 1 pM a 200 pM, 1 pM a 50 pM, 1 nM a 1 \muM, 1 nM a 500 nM, 1
nM a 200 nM, 1 nm a 100 nM ó 3 nM a 100 nM de toxina, que puede
ser, por ejemplo, toxina nativa purificada o recombinante de cadena
ligera o doble cadena o producto de toxina clostridial formulado
que contiene albúmina de suero humano y excipientes. En
realizaciones particulares, la concentración de cadena ligera o
cadena doble de BoNT/A o BoNT/E recombinante purificada o
parcialmente purificada o producto de toxina formulado está en el
intervalo de 1 pM a 2000 pM, 10 pM a 2000 pM, 20 pM a 2000 pM, 40
pM a 2000 pM, ó 1 pM a 200 pM. En más realizaciones, la
concentración de cadena ligera o cadena doble de BoNT/C
recombinante purificado o parcialmente purificado o producto de
toxina formulada está en el intervalo de 1 a 200 nM, 4 a 100 nM, 10
a 100 nM, ó 4 a 60 nM. Un experto en la materia entiende que la
concentración de toxina clostridial purificada o parcialmente
purificada dependerá del serotipo de la toxina ensayada, así como
de la pureza o secuencia recombinante de la toxina, la presencia de
componentes inhibidores, y las condiciones de ensayo.
Adicionalmente se entiende que las muestras purificadas,
parcialmente purificadas o en bruto pueden diluirse hasta dentro de
un intervalo conveniente para su ensayo con respecto a actividad
proteasa de la toxina clostridial frente a una curva convencional.
De forma similar, se entiende que una muestra puede diluirse, si se
desea, hasta que el ensayo sea lineal.
La condiciones adecuadas para la actividad
proteasa de la toxina clostridial también incluyen generalmente,
por ejemplo, temperaturas en el intervalo de aproximadamente 20ºC a
aproximadamente 45ºC, por ejemplo, en el intervalo de 25ºC a 40ºC,
o el intervalo de 35ºC a 39ºC. Los volúmenes de ensayo con
frecuencia están en el intervalo de aproximadamente 5 a
aproximadamente 200 \mul, por ejemplo, en el intervalo de
aproximadamente 10 \mul a 100 \mul o aproximadamente 0,5 \mul
a 100 \mul, aunque también pueden usarse volúmenes de reacción en
nanolitros con los procedimientos de la invención. Los volúmenes de
ensayo también pueden estar, por ejemplo, en el intervalo de 100
\mul a 2,0 ml o en el intervalo de 0,5 ml a 1,0 ml.
Un experto en la materia entiende que las
reacciones de polarización de fluorescencia pueden interrumpirse o
no y los tiempos de ensayo pueden variarse por el experto en la
materia según sean apropiados. Los tiempo de ensayo generalmente de
penden, en parte de la concentración, pureza y actividad de la
toxina clostridial y generalmente varían, sin limitación, en el
intervalo de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 5 horas.
Como ejemplos no limitantes, los tiempos de ensayo ejemplares
incluyen incubación, por ejemplo a 37ºC durante 30 minutos, 45
minutos, 60 minutos, 75 minutos o 90 minutos. En realizaciones
particulares, al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%,
95% ó 100% del sustrato de toxina clostridial se escinde. En más
realizaciones, la reacción de proteasa se detiene antes de que se
escinda más del 5%, 10%, 15%, 20%, 25% ó 50% del sustrato de toxina
clostridial. Se entiende que las reacciones de proteasa pueden
interrumpirse mediante el reactivo apropiado, que generalmente
depende del fluoróforo y otros componentes del sustrato. Como un
ejemplo no limitante, la reacción de proteasa basada en un sustrato
que contiene GFP como el fluoróforo donante puede interrumpirse
mediante la adición de cloruro de guanidinio, por ejemplo, hasta una
concentración final de entre 1 y 2 M. Las reacciones de proteasa
también pueden interrumpirse mediante la adición de H_{2}SO_{4};
adición de aproximadamente 0,5 a 1,0 de borato de sodio, pH 9,0 a
9,5; o adición de quelantes de cinc. Un experto en la materia,
entiende que las reacciones de proteasa pueden interrumpirse, si se
desea, antes de excitar el fluoróforo o fluoróforo donante con luz
polarizada plana.
Como un ejemplo no limitante, las condiciones
adecuadas para la actividad proteasa de toxina clostridial tal como
actividad proteasa BoNT/A pueden ser incubación a 37ºC durante 90
minutos en un tampón que contiene, HEPES 50 mM (pH 7,2), ZnCl_{2}
10 \muM, DTT 10 mM y TWEEN-20 0,1% (v/v) con un
sustrato 10-16 \muM. Si se desea, las muestras
que contienen BoNT/A, particularmente BoNT/A de doble cadena, pueden
preincubarse con ditiotreitol, por ejemplo, durante 20 ó 30 minutos
antes de la adición del sustrato. Como otro ejemplo no limitante,
las condiciones adecuadas para la actividad proteasa de BoNT/A
pueden ser de incubación a 37ºC en un tampón tal como HEPES 30 mM
(pH 7,3) que contiene un agente reductor tal como ditiotreitol 5 mM;
y una fuente de cinc tal como cloruro de cinc 25 \muM
(aproximadamente 7 nM; Schmidt y Bostian, mencionado anteriormente,
1997). También puede incluirse BSA en el intervalo de 0,1 mg/ml a 10
mg/ml, por ejemplo, BSA de 1 mg/ml cuando se trata una muestra con
un sustrato de toxina clostridial (Schmidt y Bostian, mencionado
anteriormente, 1997). Como otro ejemplo no limitante, las
condiciones adecuadas para la actividad proteasa de toxina
clostridial, por ejemplo actividad de BoNT/B, pueden ser incubación
en HEPES 50 mM, pH 7,4, con cloruro de cinc 10 \muM, suero bovino
fetal al 1% y ditiotreitol 10 mM, con incubación durante 90 minutos
a 37ºC (Shone y Roberts, Eur. J. Biochem,
225:263-270 (1994) Hallis y col., mencionado
anteriormente, 1996); o puede ser, por ejemplo, incubación en
fosfato de sodio 40 mM, pH 7,4 con ditiotreitol 10 mM, incluyendo
opcionalmente Triton X-100 al 0,2% (v/v), con
incubación durante 2 horas a 37ºC (Shone y col., mencionado
anteriormente, 1993). Las condiciones adecuadas para la actividad
proteasa de la toxina de tétanos o la actividad proteasa de otra
toxina clostridial puede ser, por ejemplo, incubación en HEPES 20
mM, pH 7,2, y NaCL
100 mM durante 2 horas a 37ºC con sustrato peptídico 25 \muM (Cornille y col., mencionado anteriormente, 1994).
100 mM durante 2 horas a 37ºC con sustrato peptídico 25 \muM (Cornille y col., mencionado anteriormente, 1994).
En una realización, las condiciones adecuadas
para la actividad proteasa de la toxina clostridial incluyen
poliaminoácidos catiónicos tales como poliarginina en un tampón de
fuerza iónica adecuada. Cuando hay una diferencia de carga en el
sustrato de la toxina clostridial en comparación con el producto de
escisión, la polarización de fluorescencia puede observarse en
presencia de poliarginina u otro poliaminoácido catiónico (Simeonov
y col., Analytical Biochemistry 304:193-199 (2002)).
Como un ejemplo no limitante, si la carga iónica neta de un
producto de escisión marcado con fluorescencia se vuelve negativa
después del tratamiento de sustrato de toxina clostridial con una
muestra de toxina, la poliarginina se unirá selectivamente al
producto escindido marcado con fluorescencia, generando de este
modo un aumento medible de la polarización.
Se entiende que cualquiera de una diversidad de
sustratos control son útiles en los procedimientos de la invención.
Un sustrato control puede ser, por ejemplo, un sustrato de toxina
clostridial que no está tratado con muestra activa, que contenga
toxina; un valor de polarización determinado antes de la adición de
la muestra; o un sustrato similar, pero diferente que no contiene
un sitio de escisión de toxina o secuencia de reconocimiento
funcional.
Se entiende que los procedimientos de la
invención pueden automatizarse y pueden configurarse en un formato
de alto rendimiento o ultra alto rendimiento usando, sin limitación,
placas de 96 pocillos, 384 pocillos ó 1536 pocillos. Cualquiera de
una diversidad de espectrofluorímetros equipados con un polarizador
apropiado pueden usarse para ensayar el cambio de polarización de
fluorescencia a lo largo del tiempo incluyendo, sin limitación un
espectrofluorímetro Cary Eclipse; el lector de placa multimodo
Beckmann Affinity^{TM}, TECAN GeniusPro; y otros sistemas de, por
ejemplo, Perkin Elmer.
Se proporcionan además en el presente documento
procedimientos para determinar la presencia o actividad de una
toxina clostridial mediante (a) el tratamiento con una muestra, en
condiciones adecuadas para la actividad proteasa de toxina
clostridial, del sustrato de toxina clostridial que contienen (i) un
fluoróforo donante; (ii) un aceptor que tiene un espectro de
absorbancia que solapa con el espectro de emisión del fluoróforo
donante; y (iii) una secuencia de reconocimiento de toxina
clostridial que contiene un sitio de escisión, en la que el sitio
de escisión se interpone entre el fluoróforo donante y el aceptor y
en la que, en las condiciones apropiadas, se muestra transferencia
resonante de energía entre el fluoróforo donante y el aceptor; (b)
la excitación del fluoróforo donante con luz polarizada plana; y
(c) la determinación de la polarización de fluorescencia de los
sustratos tratados con relación a un sustrato control, en la que un
cambio de la polarización de fluorescencia de al menos 3 mP de
dicho sustrato tratado en comparación con la polarización de
fluorescencia del sustrato control es indicativa de la presencia o
actividad de la toxina clostridial. En una realización, la etapa (c)
incluye la determinación del cambio de polarización de
fluorescencia del sustrato tratado a lo largo del tiempo.
En los procedimientos de la invención basados en
polarización de fluorescencia asistida por FRET, el cambio en
polarización de fluorescencia puede ser un aumento o disminución de
la polarización de fluorescencia. En una realización, el fluoróforo
donante tiene un tiempo de vida de fluorescencia de al menos 0,5
nanosegundos. En otra realización el fluoróforo donante tiene un
tiempo de vida de fluorescencia de al menos 5 nanosegundos. Un
fluoróforo donante útil en la invención puede ser, sin limitación,
una proteína verde fluorescente (GFP) proteína azul fluorescente
(BFP); proteína cian fluorescente (CFP); proteína amarilla
fluorescente (YFP); proteína roja fluorescente (RFP); colorante
Alexa Fluor®; fluoresceína; un derivado de fluoresceína;
diaminotriacinilamino-fluoresceína (DTAF); un
derivado biarsénico de fluoresceína; colorante de unión en horquilla
arsénico de fluoresceína (FlAsH^{TM}); colorante rojo biarsénico
(ReAsH^{TM}); carboxifluoresceína (FAM); Texas Red^{TM};
tetrametilcarboxi-rodamina (TMR);
carboxi-x-rodamina (ROX); verde
rodamina; Oregon Green 488; BODIPY®-TR; BODIPY®-TMR; BODIP®-FL; Cy3,
Cyt^{TM}3B o dansilo. En realizaciones particulares, el
fluoróforo donante es una proteína verde fluorescente; proteína
azul fluorescente; proteína cian fluorescente; proteína amarilla
fluorescente o proteína roja fluorescente. En una realización, el
fluoróforo donante es una proteína verde fluorescente (GFP). En otra
realización el fluoróforo aceptor es Alexa Fluor® 546.
Cualquiera de una diversidad de secuencias de
reconocimiento puede incluirse en un sustrato de toxina clostridial
útil en un procedimiento de la invención. En una realización, la
secuencia de reconocimiento es una secuencia de reconocimiento
BoNT/A tal como, sin limitación, una secuencia de reconocimiento
BoNT/A que contiene al menos seis restos consecutivos de
SNAP-25, incluyendo los seis restos consecutivos
Gln-Arg, o un peptidomimético de los mismos. Dicha
secuencia del reconocimiento BoNT/A puede incluir, por ejemplo,
restos 134 a 206 de SEC ID Nº 2. Una secuencia de reconocimiento
incluida en un sustrato de toxina clostridial útil en un
procedimiento de la invención también puede ser, sin limitación,
una secuencia de reconocimiento BoNT/B. Dicha secuencia de
reconocimiento BoNT/B puede contener, por ejemplo, al menos seis
restos consecutivos de VAMP, incluyendo los seis restos
consecutivos Gln-Phe, o un péptido mimético de los
mismos. En una realización posterior, con una secuencia de
reconocimiento incluida en un sustrato de toxina clostridial útil en
un procedimiento de la invención es una secuencia de reconocimiento
BoNT/C1. Dicha secuencia de reconocimiento BoNT/C1 puede contener,
sin limitación, al menos seis restos consecutivos de sintaxina,
incluyendo los seis restos consecutivos Lys-Ala, o
un peptidomimético de los mismos. Una secuencia de reconocimiento
BoNT/C1 útil en la invención también puede contener al menos seis
restos consecutivos de SNAP-25, incluyendo los seis
restos consecutivos Arg-Ala, o un peptidomimético de
los mismos.
En otra realización, una secuencia de
reconocimiento incluida en un sustrato de toxina clostridial útil en
un procedimiento de la invención es una secuencia de reconocimiento
BoNT/D. La secuencia de reconocimiento BoNT/D puede contener, por
ejemplo, al menos seis restos consecutivos de VAMP, incluyendo los
seis restos consecutivos Lys-Leu, o un
peptidomimético de los mismos. Una secuencia de reconocimiento útil
en la invención también puede ser, por ejemplo, una secuencia de
reconocimiento BoNT/E. Dicha secuencia de reconocimiento BoNT/E
puede contener, sin limitación, al menos seis restos consecutivos de
SNAP-25, incluyendo los seis restos consecutivos
Arg-Ile, o un peptidomimético de los mismos. En otra
realización más, una secuencia de reconocimiento incluida en un
sustrato de toxina clostridial útil en un procedimiento de la
invención es una secuencia de reconocimiento BoNT/F. Las secuencias
de reconocimiento BoNT/F útiles en la invención abarcan, si
limitación, aquellas que tienen al menos seis restos consecutivos
de VAMP, incluyendo los seis restos consecutivos
Gln-Lys, o un peptidomimético de los mismos. Una
secuencia de reconocimiento incluida en un sustrato de toxina
clostridial útil en un procedimiento de la invención también puede
ser una secuencia de reconocimiento BoNT/G. Dichas secuencias de
reconocimiento BoNT/G abarcan, sin limitación, las que tienen al
menos seis restos consecutivos de VAMP, incluyendo los seis restos
consecutivos Ala-Ala, o un peptidomimético de los
mismos. En otra realización más, una secuencia de reconocimiento
incluida en un sustrato de toxina clostridial útil en un
procedimiento de la invención es una secuencia de reconocimiento
TeNT. Dicha secuencia de reconocimiento TeNT, puede ser, sin
limitación, una secuencia que contiene al menos seis restos
consecutivos de VAMP, incluyendo los seis restos consecutivos
Gln-Phe, o un peptidomimético de los mismos.
Cualquiera de una diversidad de sustratos de
toxina clostridial pueden ser útiles en los procedimientos de la
invención, incluyendo péptidos y peptidomiméticos que tienen al
menos 100 restos, o que tienen al menos 200 restos. Además,
cualquiera de una diversidad de muestras pueden ensayarse de acuerdo
con un procedimiento de la invención que incluye, sin limitación,
lisados de células en bruto, toxinas clostridiales aisladas que
incluyen cadenas ligeras de toxina clostridiales aisladas; y
productos de toxina clostridial formulados tales como productos de
toxina BoNT/A, BoNT/B o BoNT/E formulados.
Cuando un procedimiento de la invención implica
transferencia resonante de energía de fluorescencia, el
procedimiento se basa en un sustrato de toxina clostridial que
incluye, en parte, un fluoróforo donante. Como un "fluoróforo",
un "fluoróforo donante" es una molécula que, cuando se irradia
con luz de una cierta longitud de onda, emite luz, también
denominada fluorescencia, de una diferente longitud de onda. Un
fluoróforo donante es un fluoróforo que, cuando se empareja con un
aceptor adecuado, transfiere energía al aceptor.
Como se usa en el presente documento, el término
"aceptor" se refiere a una molécula que puede absorber energía
a partir de, y tras la excitación de, un fluoróforo donante. Un
aceptor útil en un sustrato de toxina clostridial tiene un espectro
de absorbancia que solapa con el espectro de emisión de un
fluoróforo donante incluido en el sustrato. Un aceptor útil en la
invención generalmente tiene una absorción más bien baja a una
longitud de onda adecuada para la excitación del fluoróforo
donante.
Como se ha expuesto anteriormente, un aceptor
tiene un espectro de absorbancia que solapa con el espectro de
emisión del fluoróforo donante. El término "solapar", como se
usa en el presente documento en referencia al espectro de
absorbancia de un aceptor y el espectro de absorbancia de un
fluoróforo donante, se refiere a un espectro de absorbancia y
espectro de emisión que están compartidos parcialmente o en su
totalidad. Así pues, en dichos espectros solapantes, el extremo
superior del intervalo del espectro de emisión del fluoróforo
donante es mayor que el extremo inferior del intervalo del espectro
de absorbancia del aceptor.
Como se ha expuesto anteriormente, cualquiera de
una diversidad de fluoróforos donantes puede ser útil en la
invención, incluyendo, sin limitación, la proteína verde
fluorescente; proteína azul fluorescente; proteína cian
fluorescente; proteína amarilla fluorescente; proteína roja
fluorescente; un colorante Alexa Fluor®; fluoresceína; un derivado
de fluoresceína; diaminotriacinilamino-fluoresceína
(DTAF); un derivado biarsénico de fluoresceína; colorante de unión
en horquilla arsénico de fluoresceína (FlAsH^{TM}); colorante rojo
biarsénico (ReAsH^{TM}); carboxifluoresceína (FAM); Texas
Red^{TM}; tetrametilcarboxi-rodamina (TMR);
carboxi-x-rodamina (ROX); verde
rodamina; Oregon Green 488; BODIPY®-TR; BODIPY®-TMR; BODIP®-FL; Cy3,
Cyt^{TM}3B o dansilo. Una diversidad de aceptores también pueden
ser útiles en la invención incluyendo, pero no limitados a,
colorantes Alexa Fluor® tales como Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor®
568, Alexa Fluor® 610, Alexa Fluor® 660 y Alexa Fluor® 750; QSY® 7;
tetrametilrodamina; octadecilrodamina; flavodoxina, citocromo c
peroxidasa; y rubredoxina.
Los pares fluoróforo
donante-aceptor ejemplares que exhiben FRET y son
útiles en los procedimientos de la invención abarcan, sin
limitación, GFP y Alexa Fluor® 546; fluoresceína y QSY® 7;
fluoresceína y tetrametilrodamina; y dansilo y octadecilrodamina.
Más pares fluoróforo donante-aceptor ejemplares que
son útiles en los procedimientos de la invención abarcan, sin
limitación, Alexa Fluor® 633 y Alexa Fluor® 660; Alexa Fluor® 594 y
Alexa Fluor® 610; Alexa Fluor® 700 y Alexa Fluor® 750; y Alexa
Fluor® 555 y Alexa Fluor® 568. Los aceptores adicionales útiles en
la invención incluyen aquellos en los que el aceptor es una proteína
con un cromóforo visible tales como, sin limitación, flavodoxina,
citocromo c peroxidasa o rubredoxina; dicha proteína puede tener,
por ejemplo, un peso molecular en el intervalo de 6 a 34 kDa y un
cromóforo que absorbe fuertemente en la región entre 400 y 500 nm.
Los pares de fluoróforo donante-aceptor ejemplares
basados en dichas proteínas incluyen, pero no se limitan a,
5-(((2-yodoacetil)aminoletil)amino)naftaleno-1-ácido
sulfónico (1,5 IAEDANS) y flavodoxina;
4-acetamido-4' maleimidilestilbeno
2,2' ácido disulfónico y citocromo c peroxidasa; y Alexa Fluor® 488
y rubredoxina. Éstos y otros fluoróforos donantes adecuados para la
polarización de fluorescencia pueden emparejarse con cualquiera de
una diversidad de aceptores que tienen un espectro de absorbancia
que solapa con el espectro de emisión del fluoróforo donante.
Los procedimientos basados en polarización de
fluorescencia asistida por FRET utilizan opcionalmente un sustrato
que incluye un grupo formador de volumen además del fluoróforo
donante y aceptor. Un experto en la materia entiende que la
inclusión opcional de un grupo formador de volumen depende del peso
molecular y características de volumen del fluoróforo donante y
aceptor seleccionados. Una diversidad de grupos formadores de
volumen son opcionalmente útiles, incluyendo aquellos descritos
posteriormente en el presente documento.
Los sustratos útiles en la invención pueden
prepararse por procedimientos recombinantes o usando procedimientos
químicos sintéticos, o una combinación de los mismos. Como se
describe en el presente documento en el ejemplo 1, una proteína de
fusión que contiene un grupo formador de volumen fusionado con una
secuencia de reconocimiento de la toxina clostridial BoNT/A y una
cisteína carboxi-terminal se preparó mediante
procedimientos recombinantes. La cisteína
carboxi-terminal se usó para la unión de un
fluoróforo para producir el sustrato de toxina clostridial
completo. Los procedimientos recombinantes para la preparación de
sustrato de toxina clostridial que son proteínas de fusión se
conocen bien en la técnica como se describe, por ejemplo, en
Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology Jhon Wiley &
Sons, Inc., New York 2000.
Los procedimientos químicos para modificar una
proteína, péptido o peptidomimético para que contenga un fluoróforo
y un grupo formador de volumen, o un fluoróforo donante y un
aceptor, se conocen bien en la técnica (Fairclough y Cantor,
Methods Enzymol, 48: 347-379 (1978); Glaser y col.,
Chemical Modification of Proteins Elsevier Biochemical Press.
Amsterdam (1975) Haugland, Excited States of Biopolymers (Steiner
Ed.) pag. 29-58, Plenum Press, New York (1983);
Means and Feeney, Bicongujate Chem. 1:2-12 (1990);
Matthews y col., Methods Enzymol. 208:468-496
(1991); Lundblad, Chemical Reagents for Proteins Modification 2ª
Ed., CRC Press, Boca Ratan, Florida (1991); Haugland, mencionado
anteriormente, 1996). Una diversidad de grupos pueden usarse para
acoplar un fluoróforo, grupo formador de volumen, fluoróforo
donante o aceptor, por ejemplo, a un péptido o peptidomimético que
contiene una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial. Un
grupo tiol, por ejemplo, puede usarse para acoplar un fluoróforo,
un grupo formador de volumen, fluoróforo donante o aceptor a la
posición deseada en un péptido o peptidomimético para producir un
sustrato de toxina clostridial útil en la invención (véase Ejemplo
1). Los reactivos de marcaje haloacetilo y maleimida también pueden
usarse para acoplar un fluoróforo, grupo formador de volumen,
fluoróforo donante o aceptor al preparar un sustrato de toxina
clostridial útil en la invención. Véase, por ejemplo, Wu y Brand,
mencionado anteriormente, 1994.
Los restos reticulantes también pueden ser
útiles para preparar un sustrato de toxina clostridial. Los
reticuladores se conocen bien en la técnica e incluyen
reticuladores homo- y hetero-bifuncionales tales
como BMH y SPDP. Cuando un fluoróforo, grupo formador de volumen,
fluoróforo donante o aceptor es una proteína, pueden emplearse
procedimientos químicos bien conocidos para unir específicamente
moléculas al extremo amino o carboxi-terminal.
Véase, por ejemplo, "Chemical Approaches to Protein
Engineering" en Protein Engineering: A Practical Approach Rees y
col., (Eds) Oxford University Press, 1992.
Cuando un sustrato de toxina clostridial
contiene un fluoróforo y un grupo formador de volumen, el sitio de
escisión de la toxina clostridial se posiciona entre el fluoróforo y
el grupo formador de volumen. El fluoróforo se posiciona en sentido
carboxi-terminal del sitio de escisión mientras que
el grupo formador de volumen se posiciona en el sentido
amino-terminal del sitio de escisión. Como
alternativa, el fluoróforo se posiciona en sentido
amino-terminal del sitio de escisión mientras que el
grupo formador de volumen se posiciona en sentido
carboxi-terminal del sitio de escisión.
Cuando un sustrato de toxina clostridial
contiene un fluoróforo donante y un aceptor, el sitio de escisión
de toxina clostridial se posiciona entre el fluoróforo donante y el
aceptor. En una realización, el fluoróforo donante se posiciona en
sentido amino-terminal del sitio de escisión
mientras que el aceptor se posiciona en sentido
carboxi-terminal del sitio de escisión. En otra
realización, el fluoróforo donante se posiciona en sentido
carboxi-terminal del sitio de escisión mientras que
el aceptor se posiciona en sentido amino-terminal
del sitio de escisión.
Un experto en la materia entiende que existen
varias consideraciones a la hora de seleccionar y posicionar un
fluoróforo donante y un aceptor, en un sustrato de toxina
clostridial útil en la invención. El fluoróforo donante y el
aceptor, generalmente se posicionan para minimizar la interferencia
con la unión de sustrato a, o proteólisis por, toxina clostridial.
Así pues un fluoróforo donante y aceptor, puede seleccionarse y
posicionarse, por ejemplo, de modo que se minimice la disrupción de
interacciones enlazadas y no enlazadas que son importantes para la
unión, y para minimizar el impedimento estérico. Además, como se
discute posteriormente, la distancia espacial entre un aceptor y un
fluoróforo donante generalmente está limitada para conseguir una
transferencia de energía eficaz del fluoróforo donante al
aceptor.
Como se ha explicado anteriormente, la eficacia
de la transferencia de energía de un fluoróforo donante a un
aceptor es dependiente, en parte, de la separación espacial entre
las moléculas del fluoróforo donante y aceptoras. A medida que
aumenta la distancia entre el fluoróforo donante y aceptor, existe
menos transferencia de energía al aceptor, y la señal del
fluoróforo donante por lo tanto aumenta. La transferencia de energía
global entre el fluoróforo donante y aceptor es dependiente de
muchos factores, incluyendo la distancia de separación entre el
fluoróforo donante y el aceptor en el sustrato, el solapamiento
espectral entre el fluoróforo donante y el aceptor, y la
concentración de sustrato. Un experto en la materia entiende que, a
medida que la concentración de sustrato aumenta, el apagado
intermolecular del donante, incluso después de la escisión
proteolítica, puede convertirse en un factor. Este fenómeno se
denomina como "efecto del filtro interior". Un experto en la
materia entiende además que la concentración de sustrato puede
controlarse como se ha descrito anteriormente.
La distancia Förster que es la separación entre
un fluoróforo donante y un aceptor para una transferencia de
energía del 50%, representa una separación espacial entre el
fluoróforo donante y aceptor que proporciona una buena
sensibilidad. Para sustratos peptídicos, los restos adyacentes están
separados por una distancia de aproximadamente 3,6\ring{A} en la
conformación más extendida. Por ejemplo, la distancia Förster para
un par fluoresceína/tetrametilrodamina es de 55\ring{A}, que
representaría una separación espacial entre la fluoresceína y la
tetrametilrodamina de aproximadamente 15 restos en la conformación
más extendida. Puesto que los péptidos y peptidomiméticos en
solución raramente tienen una conformación completamente extendida,
los fluoróforos donantes y aceptores pueden estar más ampliamente
separados de lo esperado basándose en un cálculo realizado usando
3,6 A por resto y aun así permanecer dentro de la distancia de
Förster como se muestra, por ejemplo, por la aparición de FRET
entre pares donante aceptor separados por aproximadamente 50
aminoácidos (Graham y col., Analyt. Biochem. 296:
208-217 (2001)).
La teoría de Förster se basa en interacciones
muy débiles entre un fluoróforo donante y un aceptor; las
propiedades espectroscópicas tales como absorción de un fluoróforo
no deberían alterarse en presencia del otro, definiendo el
intervalo de distancia más corto en el cual la teoría es válida. Se
entiende que, para muchos pares fluoróforo
donante-aceptor, la teoría de Förster es válida
cuando los fluoróforos donantes y los aceptores están separados por
aproximadamente entre 10\ring{A} y 100\ring{A}. Sin embargo,
para pares de fluoróforo donante-aceptor
particulares, la teoría de Förster es válida por debajo de
10\ring{A} como se determina por técnicas de subpicosegundos
(Kaschke y Ernsting, Ultrafast Phenomenon in Spectroscopy (Klose and
Wilhelmi (Eds.)) Springer-Verlag, Berlín 1990).
En realizaciones particulares, la invención
proporciona un procedimiento que se basa en un sustrato de toxina
clostridial en el que el fluoróforo donante está separado
espacialmente del aceptor por una distancia de cómo máximo
100\ring{A}. En otras realizaciones la invención proporciona un
procedimiento que se basa en un sustrato de toxina clostridial en
el que el fluoróforo donante está separado espacialmente del aceptor
por una distancia de cómo máximo 90\ring{A}, 80\ring{A},
70\ring{A}, 60\ring{A}, 50\ring{A}, 40\ring{A}, 30\ring{A}
ó 20\ring{A}. En más realizaciones, la invención proporciona un
procedimiento que se basa en un sustrato de toxina clostridial en
el que el fluoróforo donante está separado espacialmente del aceptor
por una distancia de entre 10\ring{A} y 100\ring{A}, entre
10\ring{A} y 80\ring{A}, entre 10\ring{A} y 60\ring{A},
entre 10\ring{A} y 40\ring{A}, entre 10\ring{A} y
20\ring{A}, entre 20\ring{A} y 100\ring{A}, entre
20\ring{A} y 80\ring{A}, entre 20\ring{A} y 60\ring{A},
entre 20\ring{A} y 40\ring{A}, entre 40\ring{A} y
100\ring{A}, entre 40\ring{A} y 80\ring{A} ó entre
40\ring{A} y 60\ring{A}. En otras realizaciones más, la
invención proporciona un procedimiento que se basa en un sustrato de
toxina clostridial en el que el fluoróforo donante y el aceptor
están separados en la secuencia de aminoácido primaria por como
máximo 6 restos, máximo 8 restos, máximo 10 restos, máximo 12
restos, máximo 15 restos, máximo 20 restos, máximo 25 restos,
máximo 30 restos, máximo 35 restos, máximo 40 restos, máximo 45
restos, máximo 50 restos, máximo 60 restos, máximo 70 restos,
máximo 80 restos, máximo 90 restos, máximo 100 restos, máximo 150
restos, máximo 200 restos o hasta la longitud completa de una
proteína diana de toxina clostridial de origen natural.
Un experto en la materia entiende que un
sustrato de toxina clostridial útil en la invención puede
designarse, si se desea para optimizar la eficacia de FRET. Un
experto en la materia entiende que un fluoróforo donante puede
seleccionarse, si se desea, con una alta eficacia cuántica, y el
aceptor puede seleccionarse, si se desea, con un coeficiente de
extinción alto para maximizar la distancia de Förster. Un experto en
la materia entiende además que la fluorescencia que deriva de la
excitación directa de un aceptor puede ser difícil de distinguir de
la fluorescencia que resulta de la transferencia resonante de
energía. Así pues se reconoce que pueden seleccionarse un
fluoróforo donante y un aceptor que tienen relativamente poco
solapamiento de sus espectros de excitación de modo que el donante
puede excitarse a una longitud de onda que no da como resultado una
excitación directa del aceptor. Se reconoce además que un sustrato
de toxina clostridial útil en la invención puede designarse de modo
que los espectros de emisión del fluoróforo donante y el aceptor se
solapan relativamente poco de modo que las dos emisiones pueden
distinguirse fácilmente.
Los sitios de escisión específicos y distintos
para diferentes toxinas clostridiales se conocen bien en la
técnica. BoNT/A escinde un enlace Gln-Arg; BoNT/B y
TeNT escinden un enlace Gln-Phe; BoNT/C1 escinde un
enlace Lys-Ala o Arg-Ala; BoNT/D
escinde un enlace Lys-Leu; BoNT/E escinde un enlace
Arg-Ile; BoNT/F escinde un enlace
Gln-Lys; y BoNT/G escinde un enlace
Ala-Ala (véase Tabla A). En la nomenclatura
convencional, la secuencia que rodea a un sitio de escisión de
toxina clostridial se denomina
P_{5}-P_{4}-P_{3}-P_{2}-P_{1}-P_{1}'-P_{2}'-P_{3}'-P_{4}'-P_{5}'-,
representando P_{1}-P_{1}' el enlace escindible.
Se entiende que un sitio P_{1} ó P_{1}', o ambos, puede
sustituirse con otro aminoácido o mimético de aminoácido en lugar
del resto de origen natural. Por ejemplo, se han preparado sustratos
BoNT/A en los que la posición P_{1} (Gln) se modifica para ser un
resto de alanina, ácido 2-aminobutínico o
asparagina; estos sustratos se hidrolizan mediante BoNT/A en el
enlace P_{1}-Arg (Schmidt y Bostian, J. Protein
Chem. 16:19-26 (1997)). Mientras se reconoce que
pueden introducirse sustituciones en la posición P_{1} del enlace
escindible, por ejemplo, un enlace escindible BoNT/A, se reconoce
además que la conservación del resto P_{1} puede ser ventajosa
(Vaidyanathan y col., J. Neurochem. 72:327-337
(1999)). Así pues, en realizaciones particulares, la invención
proporciona un procedimiento que se basa en un sustrato de toxina
clostridial que tiene una secuencia de reconocimiento de toxina
clostridial en la que el resto P_{1}' no se modifica o sustituye
con relación a el resto de origen natural en una proteína diana
escindida por la toxina clostridial. En otras realizaciones, la
invención proporciona un procedimiento que se basa en un sustrato
de toxina clostridial que tiene una secuencia de reconocimiento en
la que el resto P_{1} se modifica o sustituye con relación a el
resto de origen natural de una proteína diana escindida por la
toxina clostridial; dicho sustrato de toxina clostridial retiene
susceptibilidad a la escisión del enlace peptídico entre los restos
P_{1} y P_{1}'.
\vskip1.000000\baselineskip
SNAP-25, VAMP y sintaxina
comparten un motivo corto localizado dentro de las regiones que se
predice que adoptan una conformación
\alpha-helicoidal. Este motivo está presente en
las isoformas de SNAP-25, VAMP y sintaxina
expresadas en animales sensibles a las neurotoxinas. Por el
contrario, los homólogos de Drosophila y levadura que son
resistentes a estas neurotoxinas e isoformas de sintaxina no
involucradas en exocitosis contienen variaciones de secuencia en las
regiones del motivo \alpha-helicoidal de estas
proteínas de VAMP y sintaxina.
Múltiples repeticiones del motivo
\alpha-helicoidal están presentes en las proteínas
sensibles a escisión por toxinas clostridiales: cuatro copias están
presentes de manera natural en SNAP-25; dos copias
están presentes de manera natural en VAMP; y dos copias están
presentes de manera natural en sintaxina. Además, los péptidos que
corresponden a la secuencia específica de los motivos
\alpha-helicoidales pueden inhibir la actividad
neurotóxica in vitro e in vivo, y dichos péptidos
pueden inhibir de forma cruzada diferentes neurotoxinas. Además,
los anticuerpos surgidos contra dichos péptidos pueden reaccionar de
forma cruzada entre las tres proteínas diana, lo que indica que
este motivo \alpha-helicoidal se expone en la
superficie de la proteína y adopta una configuración similar en
cada una de las tres proteínas diana. De forma consistente con estos
hallazgos, las neurotoxinas específicas de SNAP-25,
específicas de VAMP y específicas de sintaxina se inhiben de forma
cruzada entre sí por competición por el mismo sitio de unión, aunque
no escinden dianas de manera no específica. Estos resultados
indican que una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial
puede incluir, si se desea, al menos un motivo
\alpha-helicoidal. Se reconoce que no se requiere
un motivo \alpha-helicoidal para la escisión
mediante una toxina clostridial, como demuestran los sustratos
16-mer y 17-mer para BoNT/A
conocidos en la técnica.
Aunque múltiples motivos
\alpha-helicoidales se encuentran en las proteínas
diana SNAP-25, VAMP y sintaxina de origen natural,
una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial útil en un
sustrato de toxina clostridial puede tener un motivo
\alpha-helicoidal simple. En realizaciones
particulares, un procedimiento de la invención se basa en una
secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que incluye dos o
más motivos \alpha-helicoidales. Una secuencia de
reconocimiento de BoNT/A o BoNT/E puede incluir, por ejemplo, el
motivo \alpha-helicoidal S4, solo o combinado con
uno o más motivos \alpha-helicoidales adicionales;
la secuencia de reconocimiento BoNT/B, BoNT/G o TeNT puede incluir,
por ejemplo, el motivo \alpha-helicoidal V2, solo
o combinado con uno o más motivos
\alpha-helicoidales adicionales; una secuencia de
reconocimiento BoNT/C1 puede incluir, por ejemplo, el motivo
\alpha-helicoidal S4, solo o combinado con uno o
más motivos \alpha-helicoidales adicionales, o el
motivo \alpha-helicoidal X2, solo o combinado con
uno o más motivos \alpha-helicoidales adicionales;
y una secuencia de reconocimiento BoNT/D o BoNT/F puede incluir,
por ejemplo, el motivo \alpha-helicoidal V1, solo
o combinado con uno o más motivos
\alpha-helicoidales adicionales.
Como se usa en el presente documento, la
expresión "secuencia de reconocimiento de serotipo A de toxina
botulínica" es sinónimo de "secuencia de reconocimiento
BoNT/A" y se refiere a un enlace escindible junto con elementos
de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes
para detectar proteólisis en el enlace escindible por un BoNT/A en
condiciones adecuadas para la actividad proteasa de la toxina
clostridial. Un enlace escindible escindido por BoNT/A puede ser,
por ejemplo, Gln-Arg.
Una diversidad de secuencias de reconocimiento
de BoNT/A se conocen bien en la técnica y son útiles en la
invención. Una secuencia de reconocimiento de BoNT/A puede tener,
por ejemplo, los restos 134 a 206 ó los restos 137 a 206 de la
SNAP-25 humana (Ekong y col., mencionado
anteriormente, 1997; Patente de Estados Unidos Nº 5.962.637). Una
secuencia de reconocimiento de BoNT/A también puede incluir, sin
limitación la secuencia
Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met
(SEC ID Nº 30) o un peptidomimético de la misma, que corresponde a
los restos 190 a 202 de la SNAP-25 humana;
Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys
(SEC ID Nº 31) o un peptidomimético de la misma, que corresponde a
los restos 187 a 201 de SNAP-25 humana;
Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met
(SEC ID Nº 32) o un peptidomimético de la misma, que corresponde a
los restos 187 a 202 de SNAP-25 humana;
Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met
(SEC ID Nº 33) o un peptidomimético de la misma, que corresponde a
los restos 187 a 203 de SNAP-25 humana;
Asp-Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met
(SEC ID Nº 34) o un peptidomimético de la misma, que corresponde a
los restos 186 a 202 de SNAP-25 humana; o
Asp-Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met-Leu
(SEC ID Nº 35) o un peptidomimético de la misma, que corresponde a
los restos 186 a 203 de SNAP-25 humana. Véase, por
ejemplo, Schmidt y Bostian, J. Protein Chem.
14:703-708 (1995); Schmidt y Bostian, mencionado
anteriormente, 1997; Schmidt y col., FEBS Letters
435:61-64 (1998); y Schmidt y Bostian, Patente de
Estados Unidos Nº 5.965.699. Si se desea, una secuencia de
reconocimiento BoNT/A similar puede prepararse a partir de un
segmento correspondiente (homólogo) de otra isoforma u homólogo de
SNAP-25 sensible a BoNT/A tal como, por ejemplo,
SNAP-25 murina, de rata, de carpa dorada, o de pez
cebra o puede ser cualquiera de los péptidos descritos en el
presente documento o conocidos en la técnica, por ejemplo, en la
Patente de Estados Unidos Nº 5.965.699.
Una secuencia de reconocimiento de BoNT/A útil
en la invención puede corresponder a un segmento de una proteína
que es sensible a escisión por serotipo A de toxina botulínica, o
puede ser sustancialmente similar a un segmento de una proteína
sensible a BoNT/A. Como se ilustra en la Tabla B, una diversidad de
proteínas de origen natural sensibles a escisión por BoNT/A se
conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo,
SNAP-25 humana, de ratón y de rata; y
SNAP-25A y SNAP-25B de carpa dorada.
Así pues, una secuencia de reconocimiento de BoNT/A útil en la
invención puede corresponder, por ejemplo, a un segmento de
SNAP-25 humana, SNAP-25 de ratón,
SNAP-25 de rata, SNAP-25A o
SNAP-25B de carpa dorada, u otra proteína de origen
natural sensible a escisión por BoNT/A. Además, la comparación de
secuencias de aminoácidos de SNAP-25 nativa
escindida por BoNT/A revela que dichas secuencias no están
conservadas de manera absoluta (véase Tabla B y Figura 3), lo que
indica que una diversidad de sustituciones y modificaciones de
aminoácidos relativas a una secuencia de SNAP-25
sensible a BoNT/A de origen natural puede tolerarse en una
secuencia de reconocimiento de BoNT/A útil en la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Un sustrato de toxina clostridial, tal como un
sustrato que contiene una secuencia de reconocimiento BoNT/A, puede
tener una o múltiples modificaciones en comparación con una
secuencia de origen natural que se escinde por la toxina
clostridial correspondiente. Por ejemplo, en comparación con un
17-mer que corresponde a los restos 187 a 203 de
SNAP-25 humana, la sustitución de Asp193 con Asn en
el sustrato de BoNT/A dio como resultado una tasa relativa de
proteólisis de 0,23; la sustitución de Glu 194 con Gln dio como
resultado una tasa relativa de 2,08; la sustitución de Ala 195 con
ácido 2-aminobutírico dio como resultado una tasa
relativa de 0,38; y la sustitución de Gln 197 con Asn, ácido
2-aminobutírico o Ala dio como resultado una tasa
relativa de 0,66, 0,25 ó 0,19, respectivamente (véase Tabla C).
Además, la sustitución de Ala 199 con ácido
2-aminobutírico dio como resultado una tasa
relativa de 0,79; a sustitución de Thr 200 con Ser o ácido
2-aminobutírico dio como resultado una tasa
relativa de 0,26 ó 1,20 respectivamente; la sustitución de Lys 201
con Ala dio como resultado una tasa relativa de 0,12; y la
sustitución de Met 202 con Ala o norleucina dio como resultado una
tasa relativa de 0,38 ó 1,20 respectivamente. Véase Schmidt y
Bostian, mencionado anteriormente, 1997. Estos resultados indican
que una diversidad de restos pueden sustituirse en un sustrato de
toxina clostridial en comparación con una secuencia sensible a
toxina de origen natural. En el caso de BoNT/A esos resultados
indican que los restos incluyen pero no se limitan a Glu 194, Ala
195, Gln 197, Ala 199, Thr 200 y Met 202, Leu 203, Gly 204, Ser
205, y Gly 206, así como restos más distales del enlace escindible
Gln-Arg, puede sustituirse o conjugarse con un
fluoróforo, grupo formador de volumen, fluoróforo donante o aceptor
en un sustrato de BoNT/A útil en la invención. Dicho sustrato
BoNT/A se proteoliza de forma detectable en el enlace escindible
por BoNT/A en condiciones adecuadas para la actividad proteasa de la
toxina clostridial. Así pues, un sustrato de BoNT/A puede incluir,
si se desea, una o varias sustituciones de aminoácidos, adiciones o
deleciones relativas a una secuencia de SNAP-25 de
origen natural.
Como se usa en el presente documento, la
expresión "secuencia de reconocimiento del serotipo B de toxina
botulínica" es sinónima de "secuencia de reconocimiento de
BoNT/B" y se refiere a un enlace escindible junto con elementos
de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes
para detectar proteólisis en el enlace escindible por una BoNT/B en
condiciones apropiadas. Un enlace escindible escindido por BoNT/B
puede ser, por ejemplo, Gln-Phe.
Una diversidad de secuencias de reconocimiento
de BoNT/B se conoce bien en la técnica o pueden definirse por
procedimientos rutinarios. Dichas secuencias de reconocimiento
BoNT/B pueden incluir, por ejemplo, una secuencia que corresponde a
parte de, o todo, el núcleo hidrófilo de una proteína VAMP tal como
VAMP-1 humana o VAMP-2 humana. Una
secuencia de reconocimiento de BoNT/B puede incluir, sin limitación,
los restos 33 a 94, restos 45 a 94, restos 55 a 94, restos 60 a 94,
restos 65 a 94, restos 60 a 88 ó restos 65 a 88 de
VAMP-2 humana (SEC ID Nº 8), o restos 60 a 94 de
VAMP-1 humana (SEC ID Nº 7). Véase, por ejemplo,
Shone y col., Eur J. Biochem. 217:965-971 (1993), y
Patente de Estados Unidos Nº 5.962.637. Si se desea, puede
prepararse una secuencia de reconocimiento de BoNT/B similar a
partir de un segmento correspondiente (homólogo) de otra isoforma u
homólogo de VAMP sensible a BoNT/B tal como VAMP-1
humana o VAMP-2 de rata o pollo.
Así pues, se entiende que una secuencia de
reconocimiento de BoNT/B puede corresponder a un segmento de una
proteína que es sensible a la escisión por serotipo B de toxina
botulínica, o puede ser sustancialmente similar a dicho segmento de
una proteína sensible a BoNT/B. Como se muestra en la Tabla D, una
diversidad de proteínas de origen natural sensibles a escisión por
BoNT/B se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo,
VAMP-1 y VAMP-2 humana, de ratón y
bovina; VAMP-2 de rata; celubrevina de rata;
VAMP-2 de pollo, VAMP-1 de
Torpedo; VAMP de erizo de mar; VAMP de Aplysia; VAMP
de calamar; VAMP de C. elegans; n-syb de
Drosophila; y VAMP de sanguijuela. Así pues, una secuencia
de reconocimiento de BoNT/B incluida en un sustrato de BoNT/B puede
corresponder, por ejemplo, a un segmento de VAMP-1 o
VAMP-2 humana, VAMP-1 o
VAMP-2 de ratón, VAMP-1 o
VAMP-2 bovina, VAMP-2 de rata;
celubrevina de rata; VAMP-2 de pollo,
VAMP-1 de Torpedo; VAMP de erizo de mar;
VAMP de Aplysia; VAMP de calamar; VAMP de C. elegans;
n-syb de Drosophila; y VAMP de sanguijuela,
u otra proteína de origen natural sensible a escisión por BoNT/B.
Además, como se muestra en la Tabla D, la comparación de secuencias
de aminoácidos de VAMP nativas escindidas mediante BoNT/B revela que
dichas secuencias no están conservadas de manera absoluta (véase,
también, Figura 4), lo que indica que una diversidad de
sustituciones y modificaciones de aminoáci-
dos con relación a una secuencia de VAMP de origen natural pueden tolerarse en un sustrato BoNT/B de la invención.
dos con relación a una secuencia de VAMP de origen natural pueden tolerarse en un sustrato BoNT/B de la invención.
Como se usa en el presente documento, la
expresión "secuencia de reconocimiento de serotipo C1 de toxina
botulínica" es sinónimo de "secuencia de reconocimiento de
BoNT/C1" y se refiere a un enlace escindible junto con elementos
de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes
para detectar proteólisis en el enlace escindible por una BoNT/C1
en condiciones apropiadas. Un enlace escindible escindido por
BoNT/C1 puede ser, por ejemplo, Lys-Ala o
Arg-Ala.
Se entiende que una secuencia de reconocimiento
de BoNT/C1 puede corresponder a un segmento de una proteína que es
sensible a escisión por el serotipo C1 de toxina botulínica, o puede
ser sustancialmente similar a un segmento de proteína sensible a
BoNT/C1. Como se muestra en la Tabla E, una diversidad de proteínas
de origen natural sensibles a escisión por BoNT/C1 se conocen en la
técnica e incluyen, por ejemplo, sintaxina 1a y 1B humana, de rata,
de ratón y bovina; sintaxinas 2 y 3 de rata; sintaxina de erizo de
mar; sintaxina 1 de Aplysia; sintaxina de calamar; Dsint1 de
Drosophila; y sintaxina 1 de sanguijuela. Así pues, una
secuencia de reconocimiento de BoNT/C1 útil en un sustrato de
BoNT/C1 puede corresponder, por ejemplo, a un segmento de sintaxina
1A ó 1B humana, de rata, de ratón o bovina, sintaxina 2 de rata,
sintaxina 3 de rata, sintaxina de erizo de mar, sintaxina 1 de
Aplysia, sintaxina de calamar, Dsint1 de Drosophila,
sintaxina 1 de sanguijuela, u otra proteína de origen natural
sensible a escisión por BoNT/C1. Además, la comparación de
secuencias de aminoácidos de sintaxina nativas escindidas mediante
BoNT/C1 revela que dichas secuencias no están conservadas de manera
absoluta (véase Tabla E y Figura 5), lo que indica que una
diversidad de sustituciones y modificaciones de aminoácidos con
relación a una secuencia de sintaxina sensible a BoNT/C1 de origen
natural puede tolerarse en un sustrato de BoNT/C1 útil en la
invención.
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Una diversidad de proteínas
SNAP-25 de origen natural también son sensibles a
escisión por BoNT/C1, incluyendo SNAP-25 humana, de
ratón y de rata, SNAP-25A y SNAP-25B
de carpa dorada; y SANP-25 de Drosophila y
sanguijuela. Así pues, una secuencia de reconocimiento de BoNT/C1
útil en un sustrato de BoNT/C1 puede corresponder, por ejemplo, a
un segmento de SNAP-25 humana, de ratón o de rata,
SNAP-25A o 25B de carpa dorada,
SNAP-25 de Torpedo, SNAP-25
de pez cebra, SNAP-25 de Drosophila,
SNAP-25 de sanguijuela, u otra proteína de origen
natural sensible a escisión por BoNT/C1. Como se ha discutido
anteriormente con respecto a variantes de secuencias de sintaxina
de origen natural, la comparación de secuencias de aminoácidos
SNAP-25 nativas escindidas por BoNT/C1 revela una
variabilidad de secuencias significativa (véase Figura 3 y Tabla B
anteriormente), lo que indica que una diversidad de sustituciones y
modificaciones de aminoácidos con relación a una secuencia
SNAP-25 sensible a BoNT/C1 de origen natural puede
tolerarse en un sustrato de BoNT/C1 útil en la invención.
\newpage
La expresión "secuencia de reconocimiento de
serotipo D de toxina botulínica" es sinónimo de "secuencia de
reconocimiento BoNT/D" y se refiere a un enlace escindible junto
con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos,
suficientes para detectar proteólisis en el enlace escindible por
una BoNT/D en condiciones apropiadas. Un enlace escindible escindido
por BoNT/D puede ser, por ejemplo, Lys-Leu.
Una diversidad de secuencias de reconocimiento
de BoNT/D se conocen bien en la técnica o pueden definirse por
procedimientos rutinarios. Una secuencia de reconocimiento de BoNT/D
puede incluir, por ejemplo, restos 27 a 116; restos 37 a 116;
restos 1 a 86; restos 1 a 76; o restos 1 a 69 de
VAMP-2 de rata (SEC ID Nº 90; Yamasaki y col., J.
Biol Chem. 269:12764-12772 (1994)). Así pues, una
secuencia de reconocimiento BoNT/D puede incluir, por ejemplo, los
restos 27 a 89 o restos 37 a 69 de VAMP-2 de rata
(SEC ID Nº 90). Si se desea puede prepararse una secuencia de
reconocimiento de BoNT/D similar a partir de un segmento
correspondiente (homólogo) de otra isoforma u homólogo de VAMP
sensible a BoNT/D tal como VAMP-1 humana o
VAMP-2 humana.
Una secuencia de reconocimiento BoNT/D puede
corresponder a un segmento de una proteína que es sensible a
escisión por serotipo D de toxina botulínica, o puede ser
sustancialmente similar a un segmento de proteína sensible a
BoNT/D. Como se muestra en la Tabla D, una diversidad de proteínas
de origen natural sensibles a la escisión por BoNT/D se conocen en
la técnica e incluyen, por ejemplo, VAMP-1 y
VAMP-2 humana, de ratón o bovinas;
VAMP-1 y VAMP-2 de rata; celubrevina
de rata; VAMP-1 y VAMP-2 de pollo;
VAMP-1 de Torpedo; VAMP de Aplysia;
VAMP de calamar; syb n-syb de Drosophila; y
VAMP de sanguijuela. Así pues, una secuencia de reconocimiento
BoNT/D puede corresponder, por ejemplo, a un segmento de
VAMP-1 o VAMP-2 humana,
VAMP-1 o VAMP-2 de ratón,
VAMP-1 o VAMP-2 bovina,
VAMP-1 o VAMP-2 de rata, celubrevina
de rata, VAMP-1 o VAMP-2 de pollo,
VAMP-1 de Torpedo, VAMP de Aplysia,
VAMP de calamar, syb n-syb de Drosophila,
VAMP de sanguijuela u otra proteína de origen natural sensible a
escisión por BoNT/D. Además, como se muestra en la Tabla D
anteriormente, la comparación de secuencias de aminoácidos de VAMP
nativas escindidas por BoNT/D revela variabilidad de secuencia
significativa (véase, también, Figura 4), lo que indica que una
diversidad de sustituciones y modificaciones de aminoácidos con
relación a una secuencia VAMP sensible a BoNT/D de origen natural
puede tolerarse en un sustrato de BoNT/D útil en la invención.
Como se usa en el presente documento, la
expresión "secuencia de reconocimiento de serotipo E de toxina
botulínica" es sinónimo de "secuencia de reconocimiento
BoNT/E" y se refiere a un enlace escindible junto con elementos
de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes
para detectar proteólisis en el enlace escindible por una BoNT/E en
condiciones apropiadas. Un enlace escindible escindido por BoNT/E
puede ser, por ejemplo,
Arg-Ile.
Arg-Ile.
Un experto en la materia comprende que una
secuencia de reconocimiento BoNT/E puede corresponder a un segmento
de una proteína que es sensible a escisión por serotipo E de toxina
botulínica, o puede ser sustancialmente similar a un segmento de
proteína sensible a BoNT/E. Una diversidad de proteínas de origen
natural sensibles a escisión por BoNT/E se conocen en la técnica e
incluyen, por ejemplo, SNAP-25 humana, de ratón y de
rata; SNAP-23 de ratón; SNAP-25 de
pollo; SNAP-25A y SNAP-25B de carpa
dorada; SNAP-25 de pez cebra;
SNAP-25 de C. elegans; y
SNAP-25 de sanguijuela (véase Tabla B). Así pues,
una secuencia de reconocimiento BoNT/E puede corresponder, por
ejemplo, a un segmento de SNAP-25 humana,
SNAP-25 de ratón, SNAP-23 de rata,
SNAP-23 de ratón, SNAP-25 de pollo,
SNAP-25A o SNAP-25B de carpa dorada,
SNAP-25 de C. elegans,
SNAP-25 de sanguijuela u otra proteína de origen
natural sensible a escisión por BoNT/E. Además, como se muestra en
la Tabla B y la Figura 3 anteriormente, la comparación de las
secuencias de aminoácidos de SNAP-23 y
SNAP-25 nativas escindidas por BoNT/E revela que
dichas secuencias no están conservadas de forma absoluta, lo que
indica que una variedad de sustituciones y modificaciones de
aminoácidos con relación a una secuencia SNAP-23 o
SNAP-25 sensible a BoNT/E de origen natural puede
tolerarse en un sustrato de BoNT/E útil en la invención.
La expresión "secuencia de reconocimiento de
serotipo F de toxina botulínica", como se usa en el presente
documento, es sinónimo de "secuencia de reconocimiento BoNT/F"
y se refiere a un enlace escindible junto con elementos de
reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para
detectar proteólisis en el enlace escindible por un BoNT/F en
condiciones apropiadas. Un enlace escindible escindido por BoNT/F
puede ser, por ejemplo,
Gln-Lys.
Gln-Lys.
Una diversidad de secuencias de reconocimiento
BoNT/F se conocen bien en la técnica o pueden definirse por
procedimientos rutinarios. Una secuencia de reconocimiento BoNT/F
puede incluir, por ejemplo, restos 27 a 116; restos 37 a 116;
restos 1 a 86; restos 31 a 76; o restos 1 a 69 de
VAMP-2 de rata (SEC ID Nº 90; Yamasaki y col.,
mencionado anteriormente, 1994). Una secuencia de reconocimiento de
BoNT/F también puede incluir, por ejemplo, los restos 27 a 69 o
restos 37 a 69 de VAMP-2 de rata (SEC ID Nº 90). Se
entiende que una secuencia de reconocimiento de BoNT/F similar
puede prepararse, si se desea, a partir de un segmento
correspondiente (homólogo) de otra isoforma u homólogo de VAMP
sensible a BoNT/F tal como VAMP-1 humana o
VAMP-2 humana.
Una secuencia de reconocimiento de BoNT/F puede
corresponder a un segmento de una proteína que es sensible a
escisión por serotipo F de toxina botulínica, o puede ser
sustancialmente similar a un segmento de proteína sensible a
BoNT/F. Una diversidad de proteínas de origen natural sensibles a la
escisión por BoNT/F se conocen en la técnica e incluyen, por
ejemplo, VAMP-1 y VAMP-2 humana, de
ratón y bovina; VAMP-1 y VAMP-2 de
rata; celubrevina de rata; VAMP-1 y
VAMP-2 de pollo; VAMP-1 de
Torpedo; VAMP de Aplysia; syb de Drosophila; y
VAMP de sanguijuela (véase Tabla D). Así pues, una secuencia de
reconocimiento BoNT/F puede corresponder, por ejemplo, a un
segmento de VAMP-1 o VAMP-2 humana,
VAMP-1 o VAMP-2 de ratón,
VAMP-1 o VAMP-2 bovina,
VAMP-1 o VAMP-2 de rata,
celubrevina de rata, VAMP-1 o VAMP-2
de pollo, VAMP-1 de Torpedo, VAMP de
Aplysia, syb de Drosophila, VAMP de sanguijuela u
otra proteína de origen natural sensible a escisión por BoNT/F.
Además, como se muestra en la Tabla D anteriormente, la comparación
de secuencias de aminoácidos de VAMP nativas escindidas mediante
BoNT/F revela que dichas secuencias no están conservadas de manera
absoluta (véase, también, Figura 4), lo que indica que una
diversidad de sustituciones o modificaciones de aminoácidos con
relación a una secuencia de VAMP sensible a BoNT/F de origen
natural puede tolerarse en un sustrato BoNT/F útil en la
invención.
Como se usa en el presente documento, la
expresión "secuencia de reconocimiento de serotipo G de toxina
botulínica" es sinónimo de "secuencia de reconocimiento
BoNT/G" y se refiere a un enlace escindible junto con elementos
de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes
para detectar proteólisis en el enlace escindible por una BoNT/G en
condiciones apropiadas. Un enlace escindible escindido por BoNT/G
puede ser, por ejemplo,
Ala-Ala.
Ala-Ala.
Una secuencia de reconocimiento de BoNT/G puede
corresponder a un segmento de una proteína que es sensible a
escisión por serotipo G de toxina botulínica, o puede ser
sustancialmente similar a dicho segmento sensible a BoNT/G. Como se
ilustra en la Tabla D anteriormente, una diversidad de proteínas de
origen natural sensibles a la escisión por BoNT/G se conocen en la
técnica e incluyen, por ejemplo, VAMP-1 y
VAMP-2 humana, de ratón y bovina;
VAMP-1 y VAMP-2 de rata; celubrevina
de rata; VAMP-1 y VAMP-2 de pollo; y
VAMP-1 de Torpedo. Así pues, una secuencia
de reconocimiento BoNT/G puede corresponder, por ejemplo, a un
segmento de VAMP-1 o VAMP-2 humana,
VAMP-1 o VAMP-2 de ratón,
VAMP-1 o VAMP-2 bovina,
VAMP-1 o VAMP-2 de rata, celubrevina
de rata, VAMP-1 o VAMP-2 de pollo,
VAMP-1 de Torpedo u otra proteína de origen
natural sensible a escisión por BoNT/G. Además, como se muestra en
la Tabla D anteriormente, la comparación de secuencias de
aminoácidos de VAMP nativas escindidas mediante BoNT/G revela que
dichas secuencias no están conservadas de manera absoluta (véase,
también, Figura 4), lo que indica que una diversidad de
sustituciones y modificaciones de aminoácidos con relación a una
secuencia de VAMP sensible a BoNT/G de origen natural puede
tolerarse en un sustrato BoNT/G útil en la invención.
Como se usa en el presente documento, la
expresión "secuencia de reconocimiento de toxina del tétanos"
se refiere a un enlace escindible junto con elementos de
reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes
para detectar proteólisis en el enlace escindible por una toxina del
tétanos en condiciones adecuadas. Un enlace escindible escindido por
TeNT puede ser, por ejemplo, Gnl-Phe.
Una diversidad de secuencias de reconocimiento
de TeNT se conocen bien en la técnica o pueden definirse por
procedimientos rutinarios e incluyen secuencias que corresponde a
parte de, o todo, el núcleo hidrófilo de una proteína VAMP tal como
VAMP-1 humana o VAMP-2 humana. Una
secuencia de reconocimiento TeNT puede incluir, por ejemplo, los
restos 25 a 93 ó los restos 33 a 94 de VAMP-2 humana
(SEC ID Nº 8, Cornille y col., Eur. Biochem.
222:173-181 (1994); Foran y col., Biochem.
15365-15374 (1994)); restos 51 a 93 ó restos 1 a 86
de VAMP-2 de rata (SEC ID Nº 90; Yamasaki y col.,
mencionado anteriormente, (1994)); o restos 33 a 94 de
VAMP-1 humana (SEC ID Nº 7). Una secuencia de
reconocimiento TeNT también puede incluir, por ejemplo, los restos
25 a 86, restos 33 a 86 ó restos 51 a 86 de VAMP-2
humana (SEC ID Nº 8) o VAMP-2 de rata (SEC ID Nº
90). Se entiende que una secuencia de reconocimiento TeNT puede
prepararse, si se desea, a partir de un segmento correspondiente
(homólogo) de otra isoforma u homólogo de especie de VAMP sensible a
TeNT tal como VAMP-1 humana o VAMP de erizo de mar o
Aplysia.
Así, una secuencia de reconocimiento de TeNT
puede corresponder a un segmento de una proteína que es sensible a
escisión por toxina del tétanos, o puede ser sustancialmente similar
a un segmento de una proteína sensible a TeNT. Como se muestra en
la Tabla D anteriormente, una diversidad de proteínas de origen
natural sensibles a la escisión por TeNT se conocen en la técnica e
incluyen, por ejemplo, VAMP-1 y
VAMP-2 humana, de ratón o bovina;
VAMP-2 de rata; celubrevina de rata;
VAMP-2 de pollo; VAMP-1 de
Torpedo; VAMP de erizo de mar; VAMP de Aplysia; VAMP
de calamar; VAMP de C. elegans; n-syb de
Drosophila; y VAMP de sanguijuela. Así pues, una secuencia
de reconocimiento TeNT puede corresponder, por ejemplo, a un
segmento de VAMP-1 o VAMP-2 humana,
VAMP-1 o VAMP-2 de ratón,
VAMP-1 o VAMP-2 bovina,
VAMP-2 de rata, celubrevina de rata,
VAMP-2 de pollo, VAMP-1 de
Torpedo, VAMP de erizo de mar; VAMP de Aplysia, VAMP
de calamar, VAMP de C. elegans, n-syb de
Drosophila, VAMP de sanguijuela, u otra proteína de origen
natural sensible a escisión por TeNT. Además, la comparación de
secuencias de aminoácidos de VAMP nativas escindidas por TeNT revela
que dichas secuencias no están conservadas de manera absoluta
(Tabla D y Figura 4). Este hallazgo indica que una diversidad de
sustituciones y modificaciones de aminoácidos con relación a una
secuencia de VAMP sensible a TeNT de origen natural puede tolerarse
en un sustrato TeNT útil en la invención.
Como se usa en el presente documento, la
expresión "peptidomimético" se usa en líneas generales para
referirse a una molécula de tipo peptídico que se escinde por la
misma toxina clostridial que el sustrato peptídico en el que se
basa estructuralmente. Tales peptidomiméticos incluyen péptidos
modificados químicamente, moléculas de tipo peptídico que contienen
aminoácidos de origen no natural y peptoides, que son moléculas de
tipo peptídico resultantes ensamblaje oligomérico de glicinas
N-sustituidas, y se escinden por la misma toxina
clostridial que el sustrato peptídico del que deriva el
peptidomimético (véase, por ejemplo, Goodman y Ro, Peptidomimetics
for Drugs Design, en "Burger's Medicinal Chemistry and Drug
Discovery" Vol. 1 (ed;. E. Wolff; John Wiley & Sons 1995),
páginas 803-861).
\newpage
Una diversidad de peptidomiméticos se conocen en
la técnica incluyendo, por ejemplo, moléculas de tipo peptídico que
contienen un aminoácido limitado, un componente no peptídico que
mimetiza la estructura secundaria peptídica, o un isóstero de
enlace amida. Un peptidomimético que contiene un aminoácido limitado
de origen no natural puede incluir, por ejemplo, un aminoácido
\alpha-metilado, una
\alpha,\alpha-dialquil-glicina o
ácido \alpha-aminocicloalcano carboxílico; un
aminoácido N^{\alpha}-C^{\alpha} ciclado; un
aminoácido N^{\alpha}-metilado; un ácido \beta-
o \gamma-amino cicloalcano carboxílico; un
aminoácido \alpha,\beta-insaturado; un
aminoácido \beta,\beta-dimetil o
\beta-metil; un aminoácido
\beta-sustituido-2,3-metano;
un aminoácido NC^{\delta} o
C^{\alpha}-C^{\delta} ciclado; o una prolina
sustituida u otro mimético de aminoácido. Además, un
peptidomimético que mimetiza la estructura secundaria peptídica
puede contener, por ejemplo, un mimético de giro \beta no
peptídico; mimético de giro \gamma; mimético de estructura
\beta-laminar; o mimético de estructura
helicoidal, cada uno de los cuales se conoce bien en la técnica. Un
peptidomimético también puede ser una molécula de tipo peptídico
que contiene, por ejemplo, un isóstero de enlace amida tal como una
modificación retro-inversa; enlace amida reducido;
enlace metilentioéter o metilensulfóxido; enlace metilenéter;
enlace etileno; enlace tioamida; enlace transolefina o fluorolefina;
anillo de tetrazol 1,5-disustituido; enlace
cetometileno o fluorocetometileno u otro isóstero amídico. Un
experto en la materia entiende que estos y otros peptidomiméticos
están abarcados dentro del significado del término
"peptidomimético" como se usa en el presente documento.
En cualquiera de los procedimientos de la
invención, un sustrato de toxina clostridial puede incluir uno o
múltiples sitios de escisión de toxina clostridial para las mismas o
diferentes toxinas clostridiales. En realizaciones particulares, la
invención proporciona procedimientos que se basan en un sustrato de
toxina clostridial que contiene un sitio de escisión de toxina
clostridial único. En otras realizaciones, la invención proporciona
procedimientos que se basan en un sustrato de toxina clostridial que
contiene múltiples sitios de escisión para la misma toxina
clostridial. Estos sitios de escisión pueden incorporarse dentro de
las mismas secuencias de reconocimiento de toxina clostridial o
diferentes. Como ejemplos no limitantes, un sustrato de toxina
clostridial puede tener múltiples sitios de escisión para la misma
toxina clostridial que se interponen entre el mismo fluoróforo y
grupo formador de volumen o el mismo fluoróforo donante y aceptor.
Un sustrato de toxina clostridial útil en la invención pueden
contener, por ejemplo, dos o más, tres o más, cinco o más, o diez o
más sitios de escisión para la misma toxina clostridial. Un sustrato
de toxina clostridial útil en la invención también puede tener, por
ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez
sitios de escisión para la misma toxina clostridial; los múltiples
sitios de escisión pueden interponerse entre los mismos o
diferentes
fluoróforos y grupos formadores de volumen, o entre los mismos o diferentes fluoróforos donantes y aceptores.
fluoróforos y grupos formadores de volumen, o entre los mismos o diferentes fluoróforos donantes y aceptores.
Un sustrato de toxina clostridial útil en la
invención también puede incluir sitios de escisión para diferentes
toxinas clostridiales. En realizaciones particulares, la invención
proporciona un procedimiento que se basa en un sustrato de toxina
clostridial que incluye múltiples sitios de escisión para diferentes
toxinas clostridiales interponiéndose todas entre el mismo
fluoróforo y grupo formador de volumen, o entre el mismo fluoróforo
donante y aceptor. Un sustrato de toxina clostridial puede incluir,
por ejemplo, sitios de escisión para dos o más, tres o más, o cinco
o más diferentes toxinas clostridiales interponiéndose todas entre
el mismo fluoróforo y grupo formador de volumen. Un sustrato de
toxina clostridial también puede incluir, por ejemplo, sitios de
escisión para dos o más, tres o más, o cinco o más toxinas
clostridiales interponiéndose todas entre el mismo fluoróforo
donante y aceptor. Un sustrato de toxina clostridial también puede
incorporar, por ejemplo, sitios de escisión para dos o más, tres o
más, o cinco o más diferentes toxinas clostridiales que se
interponen entre al menos dos pares de
fluoróforo-grupo formador de volumen o entre al
menos dos pares de fluoróforo donante-aceptor. En
realizaciones particulares, la invención proporciona un sustrato de
toxina clostridial que tiene sitios de escisión para dos, tres,
cuatro, cinco, seis, siete, u ocho toxinas clostridiales diferentes,
en las que los sitios de escisión se interponen entre el mismo o
diferentes fluoróforos y grupos formadores de volumen, o entre el
mismo o diferentes fluoróforos donantes y aceptores. En más
realizaciones, la invención proporciona un sustrato de toxina
clostridial que tiene cualquier combinación de dos, tres, cuatro,
cinco, seis, siete, u ocho sitios de escisión para cualquier
combinación de las siguientes toxinas clostridiales: BoNT/A, BoNT/B,
BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G Y TeNT.
Un procedimiento de la invención puede
realizarse opcionalmente con múltiples sustratos. En un
procedimiento de la invención que se basa en un sustrato de toxina
clostridial que contiene un par fluoróforo
donante-aceptor, un sustrato de toxina clostridial
se trata con una muestra, incluyendo el sustrato un primer
fluoróforo donante, un primer aceptor que tiene un espectro de
absorbancia que solapa con el espectro de emisión del primer
fluoróforo donante, y una primera secuencia de reconocimiento de
toxina clostridial que contiene un sitio de escisión, en la que el
sitio de escisión se interpone entre el fluoróforo donante y el
aceptor y en la que, en las condiciones apropiadas, se muestra
transferencia resonante de energía entre el primer fluoróforo
donante y el primer aceptor. Si se desea, se puede incluir un
segundo sustrato de toxina clostridial en el mismo ensayo; este
segundo sustrato contiene un segundo fluoróforo donante y un
segundo aceptor que tiene un espectro de absorbancia que solapa con
el espectro de emisión del segundo fluoróforo donante, y una segunda
secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que se escinde
por una toxina clostridial diferente de la toxina que escinde la
primera secuencia de reconocimiento de toxina clostridial. El par
fluoróforo donante-aceptor en el segundo sustrato
puede ser el mismo o diferente del par fluoróforo
donante-aceptor del primer sustrato. De esta manera,
una muestra sencilla puede ensayarse simultáneamente con respecto a
la presencia de más de una toxina clostridial.
En un procedimiento de la invención que se basa
en un sustrato de toxina clostridial que contiene un par fluoróforo
donante-aceptor, se entiende que puede ensayarse con
respecto a cualquier combinación de toxinas clostridiales, por
ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más toxinas
clostridiales. Se puede ensayar, por ejemplo, cualquier combinación
de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho de BoNT/A, BoNT/B,
BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G y TeNT. Por ejemplo, un
ensayo puede realizarse con siete sustratos, cada uno de los cuales
incluye fluoresceína y tetrametilrodamina que flanquean una
secuencia de reconocimiento BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D,
BoNT/E, BoNT/F o BoNT/G y un sitio de escisión. Estos sustratos
pueden tratarse con una muestra en condiciones adecuadas para la
actividad de la toxina botulínica antes de excitar la fluoresceína
donante con luz polarizada plana a una longitud de onda de absorción
de aproximadamente 488 nm y determinar la polarización de
fluorescencia. Un cambio en la polarización de fluorescencia es
indicativo de la presencia o actividad de al menos una toxina
clostridial. Dicho ensayo puede ser útil, por ejemplo, para ensayar
muestras de alimento o muestras tisulares con respecto a la
presencia de cualquier toxina botulínica u otra toxina clostridial
y puede combinarse, si se desea, con uno o más ensayos posteriores
para toxinas clostridiales individuales o combinaciones específicas
de toxinas clostridiales.
En otra realización, una muestra sencilla se
ensaya con respecto a dos o más toxinas clostridiales usando dos o
más sustratos de toxinas clostridiales diferentes, conteniendo cada
sustrato un par fluoróforo donante-aceptor
diferente. El uso de múltiples sustratos puede ser útil para
extender el intervalo dinámico de un ensayo, como se describe, por
ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 6.180.340. Como ejemplo
del uso de múltiples sustratos de toxina clostridial, una muestra
sencilla puede ensayarse con respecto a la presencia o actividad de
BoNT/A y BoNT/B usando los sustratos primero y segundo de toxina
clostridial: el primer sustrato de toxina clostridial contiene el
fluoróforo donante Alexa Fluor® 555 y el aceptor Alexa Fluor® 568
con una secuencia de reconocimiento de BoNT/A intermedia, y un
segundo sustrato de toxina clostridial contiene el fluoróforo
donante Alexa Fluor® 700 y el aceptor Alexa Fluor® 750 con una
secuencia de reconocimiento BoNT/B intermedia. Los expertos en la
materia entienden que el primer fluoróforo donante puede excitarse
antes o después de la excitación del segundo fluoróforo donante, y
que el cambio en polarización de fluorescencia del primer sustrato
puede determinarse antes, a la vez, o después de determinar la
transferencia de energía del segundo sustrato.
En otra realización, un procedimiento de la
invención es útil para ensayar dos o más toxinas clostridiales
aisladas o purificadas diferentes usando dos o más sustratos de
toxina clostridial diferentes, conteniendo cada sustrato el mismo
par de fluoróforo donante-aceptor. En el formato de
puntos finales, la presencia o actividad de diferentes serotipos se
ensaya mediante la adición de los serotipos secuencialmente y la
espera entre las adiciones para que se estabilice la respuesta.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos se pretende que ilustren
pero no limiten la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo describe la construcción de
sustratos adecuados para ensayar en cuanto a la presencia o
actividad de toxina clostridial usando polarización de
fluorescencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó un sustrato como una proteína de
fusión que contenía proteína verde fluorescente (GFP), restos
134-206 de SNAP-25 murina, un
marcador de afinidad por polihistidina (6xHis), y una cisteína
carboxi-terminal, con varios componentes separados
por enlazadores peptídicos. Como se describe posteriormente, el
sustrato se diseñó de tal modo que la GFP y la cisteína terminal se
presentaban en extremos opuestos de
SNAP-25_{(134-206)}.
La secuencia SNAP-25 se obtuvo
de pT25FL, un plásmido que contiene el gen SNAP-25
de ratón de longitud completa insertado en fase con el extremo 3'
del gen de la
glutatión-S-transferasa (GST)
(GST-SNAP-25_{(1-206)}),
proporcionado por el Profesor Dolly (O'Sullivan y col., J. Biol.
Chem. 274:36897-36904 (1999)). La secuencia
SNAP-25 de pT25FL se incorporó a un segundo vector de expresión, que se diseñó para tener una secuencia de señal BirAsp para biotinilación y un marcador de afinidad de polihistidina fusionado al extremo amino-terminal de los restos 134 a 206 de SNAP-25 (BirAsp-poliHis-SNAP-25_{(134-206)}), denominado "BA-SNAP"). La secuencia de ADN que codifica SNAP-25_{(134-206)} se generó por amplificación por PCR de la región apropiada del plásmido pT25FL con cebadores de PCR 5'-GCT AGA TCT CGA GTT AAC CAC TTC CCA GCA TCT TTG-3' (SEC ID Nº: 91; antisentido) y 5'-ATC CGG AGG GTA ACA AAC GAT GCC-3' (SEC ID Nº: 92; con sentido) para producir un producto de PCR de SNAP-25_{(134-206)} que contiene un sitio de restricción BglII (producto A de PCR).
SNAP-25 de pT25FL se incorporó a un segundo vector de expresión, que se diseñó para tener una secuencia de señal BirAsp para biotinilación y un marcador de afinidad de polihistidina fusionado al extremo amino-terminal de los restos 134 a 206 de SNAP-25 (BirAsp-poliHis-SNAP-25_{(134-206)}), denominado "BA-SNAP"). La secuencia de ADN que codifica SNAP-25_{(134-206)} se generó por amplificación por PCR de la región apropiada del plásmido pT25FL con cebadores de PCR 5'-GCT AGA TCT CGA GTT AAC CAC TTC CCA GCA TCT TTG-3' (SEC ID Nº: 91; antisentido) y 5'-ATC CGG AGG GTA ACA AAC GAT GCC-3' (SEC ID Nº: 92; con sentido) para producir un producto de PCR de SNAP-25_{(134-206)} que contiene un sitio de restricción BglII (producto A de PCR).
La secuencia Bir-Asp, un
sustrato natural para la biotinilación, así como un marcador de
afinidad de polihistidina, se obtuvieron por ingeniería genética
para la fusión aguas arriba y en fase con la secuencia
SNAP-25_{(134-206)} usando los
oligonucleótidos sintéticos SEC ID N^{os} 93 y 94, que contenían
una región complementaria de 20 pares de bases. Estos
oligonucleótidos, 5'-CGA ATT CCG CGG GCC ACC
ATG GGA GGA GGA CTG AAC GAC ATC TTC GAG GCT CAA AAG
ATC-3' (SEC ID Nº 93; sentido; sitio SacII
subrayado) y 5'-TCG TTT GTT ACC CTC CGG ATA TGA TGA TGA TGA
TGA TGA TGA TGG GAT CCA TGC CAC TCG ATC TTT TGA GCC TCG AAG
A-3' (SEC ID Nº: 94; antisentido), se hibridaron, y
se rellenaron los salientes monocatenarios mediante amplificación
por PCR para producir producto B de PC.
Los dos productos de PCR bicatenarios que
contienen las secuencias codificantes de
SNAP-25_{(134-206),} denominados
producto A de PCR, y BirAsp y polihistidina, denominada producto B
de PCR, se desnaturalizaron e hibridaron. La secuencia
complementaria de 20 pb en los dos fragmentos génicos se muestra en
cursiva en los cebadores de PCR SEC ID nº 92 y SEC ID Nº 94.
Después de rellenar los salientes por PCR, el producto se amplificó
con los cebadores SEC ID nº 93 y SEC ID Nº 91. El producto de PCR
resultante, que codificaba
BirAsp-poliHis-SNAP-25_{(134-206)}
(designado "BA-SNAP"), se digirió con
SacII y BglII, y el inserto génico aislado ligado al
vector pQBI25FA2 se digirió con SacII y BamHI, para
producir el plásmido pNTP12 (pQBI25fA2 que contiene
BA-SNAP).
Para la expresión y purificación desde E.
coli, el gen BA-SNAP se transfirió a un plásmido
pTrc99A (Amersham Pharmacia Biotech). El gen
BA-SNAP se aisló de pNTP12 por digestión con
NcoI y XhoI seguido de purificación en gel.
Separadamente, el plásmido pTrc99A se digirió con NcoI y
SalI y se ligó el vector aislado al gen
BA-SNAP para producir el plásmido pNTP14 (pTrc99A
que contiene BA-SNAP).
Para la clonación del gen
BA-SNAP en el plásmido pQE-50, el
fragmento BA-SNAP se amplificó por PCR a partir de
pNTP14 con el cebador SEC ID Nº 91 y el cebador SEC ID Nº 95
(5'-CGA AGA TCT GGA GGA CTG AAC GAC ATC
TTC-3' (sentido; sitio BglII subrayado).
Después de la digestión con BglII y XhoI, el producto
de PCR amplificado se ligó en el vector pQE-50, que
se había digerido con BamHI y SalI. El plásmido
resultante, que representa a pQE50 que contiene
BA-SNAP, se designó pNTP26.
Un plásmido que codifica el sustrato de proteína
de fusión de la proteína verde fluorescente (GFP) se preparó
mediante la modificación del vector pQBI T7-GFP
(Quantum Biotechnologies; Carlsbad, CA) en tres fases como se
describe posteriormente. Primero, el vector pQBI
T7-GFP se modificó por PCR para retirar el codón de
parada en el extremo 3' de la secuencia que codifica GFP y para
insertar la secuencia codificante de una porción del enlazador
peptídico que separa GFP del fragmento de SNAP-25.
Segundo, un fragmento de ADN que codifica para
SNAP-25_{(134-206)} se amplificó
por PCR a partir de pNTP26 usando cebadores de PCR diseñados para
incorporar la secuencia codificante para el resto del enlazador
peptídico fusionado en sentido 5' al gen de
SNAP-25_{(134-206)} y un marcador
de afinidad 6xHis fusionado en sentido 3' del gen. El producto de
PCR resultante se clonó en el vector pQBI modificado descrito
anteriormente para producir pQBI
GFP-SNAP-25_{(134-206)}.
El plásmido pQBI
GFP-SNAP-25_{(134-206)}
se modificó después por mutagénesis dirigida para añadir un codón
de cisteína en el extremo carboxi-terminal usando el
cebador SEC ID Nº: 96
(5'-GATGGTGATGGTGATGACAGCCGCC
ACCGCCACC-3' (cebador antisentido, con los nucleótidos añadidos subrayados) y su complemento invertido (cebador sentido). El plásmido resultante, denominado pQBI GFP-SNAP-25 (Cys-Parada), se muestra en la Figura 6A y se usó para la expresión de GFP-SNAP-25_{(134-206)}-6xHis-Cys. El ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos predicha para la construcción GFP-SNAP25_{(134-206)}-6xHis-cisteína se muestra en el presente documento en la Figura 6B.
ACCGCCACC-3' (cebador antisentido, con los nucleótidos añadidos subrayados) y su complemento invertido (cebador sentido). El plásmido resultante, denominado pQBI GFP-SNAP-25 (Cys-Parada), se muestra en la Figura 6A y se usó para la expresión de GFP-SNAP-25_{(134-206)}-6xHis-Cys. El ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos predicha para la construcción GFP-SNAP25_{(134-206)}-6xHis-cisteína se muestra en el presente documento en la Figura 6B.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector de expresión pQBI
GFP-SNAP-25
(Cys-Parada) se transformó en células E. coli
BL21 (DE3) (Novagen; Madison, WL; o Invitrogen; Carlsbad, CA) o en
células E. coli BL21-Codon Plus®
(DE3)-RIL (Stratagene) que contenían el gen de la
ARN polimerasa T7. Las células transformadas se seleccionaron en
placas con LB-ampicilina durante una noche a 37ºC.
Las colonias individuales se usaron para inocular cultivos con de 1
a 3 ml de material de partida, que a su vez se usaron para inocular
cultivos de 0,5 a 1,0 litros. Los cultivos grandes se cultivaron a
37ºC con agitación hasta que A_{595} alcanzó
0,5-0,6, momento en el cual se retiraron de la
incubadora y se permitió que se enfriaran brevemente. Después de la
inducción de la expresión de proteína con IPTG 1 mM, el sustrato
GFP-SNAP25_{(134-206)}-His6-C
se expresó a partir del plásmido pQBI
GFP-SNAP-25
(Cys-Parada) durante la noche con agitación a 16ºC
con el fin de facilitar la formación del fluoróforo de GFP. Se
recogieron las células de alícuotas de 250 ml de los cultivos de
expresión mediante centrifugación (30 minutos, 6.000 g, 4ºC) y se
almacenaron a -80ºC hasta que fueron necesarios.
Los sustratos se purificaron a 4ºC mediante un
procedimiento en dos etapas que comporta purificación IMAC, seguido
de una etapa de desalación para retirar NaCl e imidazol, produciendo
típicamente más de 150 mg/L de sustrato purificado como sigue. Los
sedimentos celulares de cultivos de 250 ml se resuspendieron cada
uno en entre 7 y 12 ml de tampón de enlace a columna (HEPES 25 mM,
pH 8,0; NaCl 500 mM; \beta-mercaptoetanol 1 mM;
imidazol 10 mM), se lisaron por exposición a ultrasonidos (1 minuto
40 segundos en impulsos de 10 segundos a 38% de amplitud), y se
aclararon por centrifugación (16000 rpm, 4ºC, 1 hora). La resina de
afinidad (3-5 ml de SuperFlow Talon Co^{2+} por
sedimento celular) se equilibró en un soporte en columna de vidrio o
desechable (Bio-Rad) mediante el aclarado con 4
volúmenes en columna de ddH_{2}O estéril y 4 volúmenes en columna
de tampón de enlace a columna. El lisado aclarado se aplicó a la
columna de una de dos maneras: (1) el lisado se añadió a la resina
y se unió en lote por incubación horizontal durante una hora con
agitación suave o (2) se aplicó el lisado a la columna vertical y
se permitió que en entrara la columna lentamente por flujo por
gravedad. Después de la unión en lote solamente, la columna se
corrigió y la solución se drenó, se recogió y se pasó por la resina
de nuevo. En ambos casos, después de que se hubiera aplicado el
lisado se lavó la columna con 4-5 volúmenes de
columna de tampón de enlace a columna. En algunos casos la columna
se lavó además con 1-2 volúmenes de columna de
tampón de lavado de columna (HEPES 25 mM, pH 8,0; NaCl 500 mM;
\beta-mercaptoetanol 1 mM; imidazol 20 mM). La
proteína se eluyó con entre 1,5 y 2,0 volúmenes de columna de tampón
de Elución de Columna (HEPES 25 mM, pH 8,0; NaCl 500 mM;
\beta-mercaptoetanol 1 mM; imidazol 250 mM), que
se recogió en fracciones de \sim 1,4 ml. Las fracciones verdes se
combinaron, se concentraron con un filtro de centrifugación (límite
de peso molecular de 10.000 ó 30.000) y se desaló mediante FPLC (Bio
Rad Biologic DuoLogic, QuadTec UV-Vis detector) con
una columna de exclusión de tamaño 26/10 HiPrep (Pharmacia) y una
fase móvil isostática de tampón de desalación de proteína de fusión
helado (HEPES 50 mM, pH 7,4, 4ºC) a un caudal de 10 ml/minuto. La
proteína desalada se recogió como una fracción sencilla, y la
concentración se determinó usando un ensayo de proteína Bio Rad. El
sustrato de
GFP-SNAP25_{(134-206)}-His6-C
se analizó por SDS-PAGE reductor. La solución
proteínica se dividió posteriormente en alícuotas de 500 \mul, se
congeló rápidamente con nitrógeno líquido y se almacenó a -80ºC. Una
vez descongelado, se almacenó una alícuota operativa a 4ºC,
protegida de la luz.
\vskip1.000000\baselineskip
La construcción
GFP-SNAP25_{(134-206)}-His6-C
contiene un resto único de cisteína que está expuesto al disolvente
aunque existen tres restos de cisteína internados dentro del GFP que
no están disponibles para modificación química (Selvin, mencionado
anteriormente, 2000; Heyduk, Curr. Opin. Biotech.
13:292-296 (2002)). El resto de cisteína
carboxi-terminal puede por lo tanto marcarse
selectivamente usando un fluoróforo-maleimida a pH
neutral. Se muestran en las Figuras 7A y 7B respectivamente, los
espectros de absorción y emisión/excitación de la proteína
GFP-SNAP25_{(134-206)}-His6-C purificada. Se determinó que la concentración de la solución de proteína era 2,74 mg/ml basándose en el coeficiente de extinción molar teórico de 20.250 M^{-1}cm^{-1} como se calculó a partir de la secuencia primaria de la construcción. Se confirmó que el peso molecular de la proteína GFP-SNAP25_{(134-206)}-His6-C purificada era de aproximadamente 37.000 usando espectrometría de masas del tiempo de paso de la absorción por láser asistida por Matriz (MALDI-TOF).
GFP-SNAP25_{(134-206)}-His6-C purificada. Se determinó que la concentración de la solución de proteína era 2,74 mg/ml basándose en el coeficiente de extinción molar teórico de 20.250 M^{-1}cm^{-1} como se calculó a partir de la secuencia primaria de la construcción. Se confirmó que el peso molecular de la proteína GFP-SNAP25_{(134-206)}-His6-C purificada era de aproximadamente 37.000 usando espectrometría de masas del tiempo de paso de la absorción por láser asistida por Matriz (MALDI-TOF).
El marcaje con Alexa Fluor® 594 se realizó
esencialmente como sigue. El resto de cisteína
C-terminal de la proteína
GFP-SNAP25_{(134-206)}-His6-C
se marcó mediante la adición de una solución concentrada de Alexa
Fluor® 594 (Molecular Probes, Inc.) en dimetil formamida seca (DMF)
hasta una concentración final de 20:1 de exceso molar de fluoróforo
frente a proteína. La solución de proteína/fluoróforo se mantuvo a
4ºC en la nevera durante una noche y se dializó posteriormente
contra HEPES 20 mM pH 6,9.
El espectro de absorción de la proteína
GFP-SNAP25_{(134-206)}-His6-C
marcada con Alexa Fluor® 594 se muestra en la Figura 8A después de
la diálisis frente a HEPES 20 mM pH 6,9, que es el pH usado para
ensayar la actividad enzimática de la toxina masiva reducida o la
cadena ligera de BoNT/A purificada. La relación de marcaje, como se
calcula a partir del espectro de absorción usando el coeficiente de
extinción teórico de la construcción
GFP-SNAP25_{(134-206)}-His6-C,
era aproximadamente 3:1 (proteína: sonda Alexa). Se muestran en la
Figura 8B los espectros de excitación y emisión de
GFP-SNAP25_{(134-206)}-His6-C-Alexa
Fluor® 594 marcada después de diálisis exhaustiva durante 20 horas
con tres cambios de tampón para retirar la sonde libre.
El marcaje con Alexa Fluor® 546 se realizó
esencialmente como sigue con todos los procedimientos llevados a
cabo en hielo o a 4ºC. Se añadieron 4 \mul de una solución acuosa
de Alexa Fluor® 546 C_{5} maleimida 10 mM (PM 1.034,37; Molecular
Probes) a 200 \mul de
GFP-SNAP25_{(134-206)}-His6-C
(135 \muM en tampón HEPES 25 mM, pH 7,2), se mezcló bien, y se
incubó a 4ºC durante una noche. Las reacciones se transfirieron a
filtros de centrifugación Biomax Ultrafree (límite de peso molecular
nominal 30 kDa; Millipore), se concentraron, y después se
reconcentraron dos veces a partir de HEPES 25 mM, pH 7,2, para
retirar la mayor parte del exceso de Alexa Fluor® 546. Para retirar
el resto de Alexa Fluor® 546 no reaccionado, la soluciones
concentradas se transfirieron a Microdializadores de centrifuga
(Harvard Apparatus) y cada una se dializó contra 500 ml de HEPES 20
mM, pH 6,9, durante 1 hora, y contra 3 x 250 ml de ese tampón
durante aproximadamente 1,5 horas cada una. Se retiró una pequeña
alícuota para mediciones de fluorescencia, y el balance de la
reacción se congeló rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenó a
-80ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo demuestra que un ensayo de
polarización de fluorescencia puede usarse para determinar la
presencia o actividad de una toxina clostridial.
La proteína
GFP-SNAP25_{(134-206)}-His6-C
marcada con Alexa Fluor® 594 se ensayó con respecto a su utilidad
como sustrato adecuado para la toxina masiva reducida BoNT/A
mediante el registro del cambio en polarización a lo largo del
tiempo. Se usó un espectrofluorímetro Cary Eclipse (Varian, Inc.,
Palo Alto, California) equipado con polarizadores de película
delgada motorizados para controlar la reacción. La longitud de onda
de excitación se ajustó a 590 nm, y la emisión polarizada se
registro a 620 nm.
Se prepararon varias diluciones de toxina masiva
BoNT/A o cadena ligera de BoNT/A, y se controló la polarización de
fluorescencia a lo largo del tiempo. Para tanto la toxina masiva
como la cadena ligera, la polarización de fluorescencia se redujo en
el momento, o poco después del momento, en que se añadió la toxina
diluida. La Figura 9 muestra los datos para la proteólisis por
toxina BoNT/A masiva de
GFP-SNAP25_{(134-206)}-His6-C
Alexa Fluor® 594. Como
se muestra en el panel 9D, la toxina se detectó a una concentración tan pequeña como aproximadamente 50 ng/ml.
se muestra en el panel 9D, la toxina se detectó a una concentración tan pequeña como aproximadamente 50 ng/ml.
Estos resultados demuestran que la presencia o
actividad de una toxina clostridial puede determinarse sensiblemente
usando los sustratos sintéticos ensayados por polarización de
fluorescencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo demuestra que la polarización de
fluorescencia puede ensayarse para determinar la presencia o
actividad de toxina clostridial usando un sustrato que muestra
transferencia resonante de energía de fluorescencia.
La proteína
GFP-SNAP25_{(134-206)}-His6-C
marcada con Alexa Fluor® 546 como se ha descrito anteriormente se
utilizó como sustrato de BoNT/A. Como se ha indicado anteriormente
las propiedades fotoselectivas de GFP y Alexa Fluor® 546 permiten
la transferencia resonante de energía de fluorescencia (FRET) entre
el GFP fluoróforo donante y el Alexa Fluor® 546 aceptor. Las
mediciones de polarización de estado estacionario se llevaron a
cabo en un espectrofotómetro Cary Eclipse (Varian). La excitación
fue a 474 nm, la excitación máxima del componente GFP. La emisión
se midió a la fluorescencia máxima de Alexa Fluor® 546 de 570 nm. En
todos los casos, se utilizó una cubeta de longitud dual (10 mm por
2 mm), y la emisión se observó a través de la vía de 2 mm. Una
solución de 390 \mul de tampón de reacción a la toxina (HEPES 50
mM, pH 7,2; TWEEN-20 0,1% v/v; ZnCl_{2} 10 \muM,
DTT 10 mM) y se colocaron 10 \mul de
GFP-SNAP25_{(134-206)}-His6-C-Alexa
Fluor® 546 en la cubeta y se permitió que se equilibrara hasta
30ºC. Cuando las medidas de polarización, que se tomaron a
intervalos de 30 segundos, se estabilizaron, se añadieron 10 \mul
de cadena ligera de BoNT/A recombinante (rLC/A) a una concentración
de 1,0 \mug/\mul, 0,5 \mug/\mul, 0,25 \mug/\mul ó 0,1
\mug/\mul a la cubeta. Las mediciones continuaron tomándose
hasta que la polarización volvió a estabilizarse.
Como se muestra en la Figura 10, la polarización
de fluorescencia aumentó tras la adición de cadena ligera de BoNT/A
recombinante que da como resultado escisión del sustrato. En
comparación con el sustrato que tiene GFP y Alexa Fluor® 594, la
transferencia resonante de energía de fluorescencia potenció el
cambio de polarización tras la renovación, aumentando así la
sensibilidad del ensayo. El cambio global en polarización usando el
sustrato de
GFP-SNAP25_{(134-206)}-His6-C-Alexa
Fluor® 546 fue de aproximadamente 40 mP, dos veces la magnitud de
la despolarización de aproximadamente 20 mP observada durante la
proteólisis de
GFP-SNAP25_{(134-206)}-His6-C-Alexa
Fluor® 594.
Estos resultados indican que la polarización de
fluorescencia puede combinarse con transferencia resonante de
energía de fluorescencia para potenciar la sensibilidad en el ensayo
con respecto a la presencia o actividad de una toxina
clostridial.
Aunque la invención se ha descrito con
referencia a los ejemplos proporcionados anteriormente, debería
entenderse que pueden hacerse varias modificaciones. En
consecuencia, la invención se limita solamente por las siguientes
reivindicaciones.
<110> Verhagen, Marc
\hskip1cmWilliams, Dudley J.
\hskip1cmGilmore, Marcella
\hskip1cmSteward, Lance
\hskip1cmAoki, Kei Roger
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Ensayos de Polarización de
Fluorescencia para la Determinación de Actividad de Toxina
Clostridial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 66872-040
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 96
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 206
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 206
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Drosophila sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 203
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Carassius auratus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Strongylcentrotas
purpuratus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 249
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gallus gallus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bos taurus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Xenopus laevis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Strongylocentrotus
purpuratus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 288
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 288
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 288
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 291
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Drosophila sp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 291
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> C. elegans
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 288
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Strongylocentrotus
purpuratus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1005
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Plásmido
pQPIGFP-SNAP25
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)...(1005)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 334
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Plásmido pQBI
GFP-SNAP25
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
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<211> 5
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Clostridium sp.
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
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\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
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\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
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<210> 25
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
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<400> 25
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\hskip1cm
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<210> 26
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<211> 8
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
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<400> 26
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\hskip1cm
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<210> 27
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<211> 8
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
\newpage
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<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
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<211> 8
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
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\hskip1cm
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<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gallus gallus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Carassius auratus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Carassius auratus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Torpedo sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Strongylocentrotus
purpuratus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> C. elegans
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Drosophila sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hirudinida sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Abu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Abu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Abu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
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<222> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Abu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bos taurus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gallus gallus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gallus gallus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Torpedo sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Strongylocentrotus
purpuratus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aplysia sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Teuthoida sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> C. elegans
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Drosophila melanogaster
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Drosophila melanogaster
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hirudinida sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bos taurus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus Rattus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus Rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus Rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gallus gallus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Strongylocentrotus
purpuratus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aplysia sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Teuthoida sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Drosophila melanogaster
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hirudinida sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus sp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctagatctc gagttaacca cttcccagca tctttg
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatccggaggg taacaaacga tgcc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgaattccgc gggccaccat gggaggagga ctgaacgaca tcttcgaggc tcaaaagatc
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgaagatctg gaggactgaa cgacatcttc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatggtgatg gtgatgacag ccgccaccgc cacc
\hfill34
Claims (13)
1. Un procedimiento para determinar la presencia
o actividad de una toxina clostridial, que comprende las etapas
de:
- (a)
- tratamiento con una muestra, en condiciones adecuadas para la actividad proteasa de la toxina clostridial, un sustrato de toxina clostridial, comprendiendo dicho sustrato de toxina clostridial
- (i)
- un fluoróforo donante;
- (ii)
- un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que solapa con el espectro de emisión de dicho fluoróforo donante; y
- (iii)
- un péptido o peptidomimético que comprende una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que comprende un sitio de escisión, en el que dicho sitio de escisión se interpone entre dicho fluoróforo donante y dicho aceptor y en el que, en las condiciones apropiadas, se muestra transferencia resonante de energía entre dicho fluoróforo donante y dicho aceptor;
- \quad
- en el que la escisión de dicho sustrato de toxina clostridial da como resultado un cambio en polarización de fluorescencia de al menos 3 unidades de milipolarización (mP);
- (b)
- excitación de dicho fluoróforo donante con luz polarizada plana; y
- (c)
- determinación de la polarización de fluorescencia de dicho sustrato tratado con relación a un sustrato control,
- \quad
- en la que un cambio en la polarización de fluorescencia de al menos 3 mP de dicho sustrato tratado en comparación con dicho sustrato control es indicativo de la presencia o actividad de dicha toxina clostridial en dicha muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho cambio en la polarización de fluorescencia es un
aumento en la polarización de fluorescencia.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho fluoróforo donante tiene un tiempo de vida de
fluorescencia de al menos 0,5 nanosegundos, al menos 5 nanosegundos,
o al menos 10 nanosegundos.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho fluoróforo donante se selecciona del grupo de proteína
verde fluorescente, proteína azul fluorescente, proteína cian
fluorescente, proteína amarilla fluorescente y proteína roja
fluorescente, una fluoresceína o un derivado de fluoresceína, una
rodamina o un derivado de rodamina, y una cianina o un derivado de
cianina.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho aceptor se selecciona del grupo de Alexa Fluor® 546;
Alexa Fluor® 568; Alexa Fluor® 610; Alexa Fluor® 660; Alexa Fluor®
750; QSY®7; tetrametilrodamina, octadecilrodamina; flavodoxina,
citocromo c peroxidasa; y rubredoxina.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicha secuencia de reconocimiento es una secuencia de
reconocimiento BoNT/A, una secuencia de reconocimiento BoNT/B, una
secuencia de reconocimiento BoNT/C1, una secuencia de reconocimiento
BoNT/D, una secuencia de reconocimiento BoNT/E, una secuencia de
reconocimiento BoNT/F, o una secuencia de reconocimiento BoNT/G.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicha secuencia de reconocimiento es una secuencia de
reconocimiento TeNT.
8. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho sustrato de toxina clostridial comprende un péptido o
peptidomimético que tiene al menos 100 restos, al menos 200 restos,
al menos 300 restos, al menos 400 restos, al menos 500 restos, al
menos 600 restos, al menos 700 restos, al menos 800 restos, o al
menos 900 restos.
9. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho sustrato de toxina clostridial comprende un péptido o
peptidomimético que tiene como máximo 20 restos, como máximo 40
restos, como máximo 50 restos, como máximo 100 restos, como máximo
150 restos, como máximo 200 restos, como máximo 300 restos, o como
máximo 400 restos.
10. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicha muestra es un lisado celular en bruto, una toxina
clostridial aislada, una cadena ligera de toxina clostridial
aislada, o un producto de toxina clostridial formulado.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, en
el que dicho producto de toxina clostridial formulado es un producto
de BoNT/A formulado, un producto de BoNT/B formulado, un producto de
BoNT/C1 formulado, un producto de BoNT/D formulado, un producto de
BoNT/E formulado, un producto de BoNT/F formulado, un producto de
BoNT/G formulado o un producto de TeNT formulado.
12. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho cambio de polarización de fluorescencia de dicho
sustrato tratado en la etapa (c) es de al menos 5 mP en comparación
con dicho sustrato control, siendo dicho cambio de polarización de
fluorescencia indicativo de la presencia o actividad de dicha toxina
clostridial en dicha muestra, o al menos de 15 mP en comparación con
dicho sustrato control, siendo dicho cambio de polarización de
fluorescencia indicativo de la presencia o actividad de dicha toxina
clostridial en dicha muestra.
13. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho cambio de polarización de fluorescencia de dicho
sustrato tratado en la etapa (c) comprende la determinación del
cambio de polarización de fluorescencia de dicho sustrato tratado a
lo largo del tiempo, siendo dicho cambio de polarización a lo largo
del tiempo indicativo de la presencia o actividad de dicha toxina
clostridial en dicha muestra.
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