KR20080021018A - 단리된 광단백질 ａｑ디케이 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 AQ디케이 광단백질, 그의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열 및 AQ디케이 광단백질의 활성 및 용도에 관한 것이다.

광단백질, AQ디케이, 애쿠오린

Description

단리된 광단백질 ＡＱ디케이 및 그의 용도 {Isolated AQdecay Photoprotein and Use Thereof}

본 발명은 광단백질 AQ디케이(AQdecay), 그의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 및 광단백질 AQ디케이의 활성 및 용도에 관한 것이다.

광단백질

살아 있는 유기체에 의한 빛의 발생 현상을 생물발광이라 지칭한다. 이는 세포에서의 생화학 반응의 결과이고, 이 반응에서 화학적 에너지가 광 양자 (화학발광에 의한 냉방출이라 명명되는 것)의 형태로 방출된다. 이러한 방식으로 생성되는 빛은 분리된 전자 이동과 관련되어 방출되기 때문에 단색이지만, 제2 발광 염료 (예를 들어 애쿠오리아(Aequoria) 속의 발광 해파리의 경우에는 형광 단백질)에 의해 보다 긴 파장의 스펙트럼 영역으로 이동될 수 있다.

생물발광은 다양한 생물학적 기능을 갖는데, 200 내지 1000 m (중심해) 깊이의 바다에서, 모든 살아 있는 유기체 중 약 90％가 발광한다. 이 경우, 발광 신호는 속임수로 및 유혹물로서 파트너를 유인하기 위해 사용된다. 글로웜(Glowworm) 및 반딧불이도 파트너를 찾기 위해 광 신호를 이용한다. 반면, 박테리아, 진균 및 단세포 조류의 발광의 의미는 명확하지 않다. 이는 많은 단일 개체들을 거대 인구로 통합하기 위해 사용되거나 일종의 생체 시계를 나타낸다고 추정된다.

매우 많은 수의 강장동물은 생물발광성이다 (Morin et al., 1974). 이들 유기체는 청색 또는 녹색 광을 방출한다. 단리된 단백질로서, 애쿠오리아 빅토리아(Aequoria victoria)로부터 유도되고 (Shimomura et al., 1969) 1962년에 최초의 광-생산 단백질로 확인된 애쿠오린은, 애쿠오리아 빅토리아의 경우에 표현형으로 관찰된 바에 따르면 녹색 광이 아닌 청색 광을 방출한다. 그 후에, 애쿠오린에 의해 활성화됨으로써 애쿠오리아 빅토리아로 하여금 표현형으로 녹색을 나타내도록 하는 녹색 형광 단백질 (GFP)이 상기 해파리로부터 단리되었다 (Johnson et al., 1962; Hastings et al., 1969; Inouye et al., 1994). 또한 확인되어 기재되어 있는 다른 광단백질은 클리틴 (Inouye et al., 1993), 미트로코민 (Fagan et al., 1993) 및 오벨린 (Illarionov et al., 1995)이다.

몇몇 광단백질의 개요. 이 표는 명칭, 단백질이 단리된 유기체 및 데이타베이스 기입의 확인 번호 (Acc.No.)를 제공한다.

명칭	유기체	확인 번호
오벨린	오벨리아 제니쿨라타(Obelia geniculata)	AAL86372
클리틴	클리티아 그레가리아(Clytia gregaria)	CAA49754
애쿠오린	애쿠오레아 마크로닥틸라(Aequorea macrodactyla)	AAK02061
애쿠오린	애쿠오레아 파르바(Aequorea parva)	AAK02060
미트로코민	미트로코마 셀룰라리라(Mitrocoma cellularia)	AAA29298
폴라신	폴라스 닥틸루스(Pholas dactylus)	AAM18085
?	심플렉토테우티스 오우알라니엔시스(Symplectoteuthis oualaniensis)	AX305029

몇몇 광단백질의 개요. 이 표는 단백질이 단리된 유기체, 광단백질의 명칭 및 특허 또는 출원의 선택을 제공한다.

유기체	형광 단백질	특허/출원
오벨리아 제니쿨라타	오벨린	WO03006497
클리티아 그레가리아	클리틴	WO03006497
애쿠오리아 빅토리아	애쿠오린	WO200168824 US-0908909 US 6,152,358 JP-0176125
폴라스 닥틸루스	폴라신	WO0028025 GB-0024357

요즘 생물발광은 기술분야에서 매우 다양한 방법으로, 예를 들어 환경 오염의 생물 지표의 형태로 또는 생화학에서 단백질을 감도높게 검출하거나 특정 화합물을 정량하기 위해서, 또는 세포에서의 유전자 조절 연구와 관련된 리포터로 명명되는 것으로서 사용된다.

광단백질은 그의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 뿐만 아니라 그의 생화학적 성질 및 물성도 상이하다.

광단백질의 물성 및 생화학적 성질은 이들 단백질의 아미노산 서열을 변형시킴으로써 변화시킬 수 있음이 입증되어 있다. 돌연변이된 광단백질의 예는 문헌에 기재되어 있다 (US 6,495,355; US 5,541,309; US 5,093,240; Shimomura et al., 1986).

상기 기재한 광단백질은 코엘렌테라진을 산화시킴으로써 빛을 발생한다 (Haddock et al., 2001; Jones et al., 1999).

리포터 시스템

일반적으로, 유전자 산물을 단순한 생화학적 또는 조직화학적 방법을 이용하여 쉽게 검출할 수 있는 유전자를 리포터 유전자 또는 지표 유전자라고 명명한다. 적어도 2개 유형의 리포터 유전자가 구분된다.

1. 내성 유전자. 이는 유전자의 발현으로 세포에서 항생제 또는 다른 물질에 대한 내성이 나타나는 유전자에 대해 사용되는 용어로서, 성장 배지에 항생제 또는 다른 물질이 존재할 때 내성 유전자가 없다면 세포의 죽음이 유도된다.

2. 리포터 유전자. 리포터 유전자의 산물은 유전적 조작에서 융합되거나 융합되지 않은 지표로서 사용된다. 가장 보편적인 리포터 유전자로는 베타-갈락토시다제 (Alam et al., 1990), 알칼리성 포스파타제 (Yang et al., 1997; Cullen et al., 1992), 및 루시퍼라제 및 기타 광단백질 (Shinomura, 1985; Phillips GN, 1997; Snowdowne et al., 1984)이 포함된다.

가시 스펙트럼 범위 내의 광자의 방출 (상기 방출은 여기된 방출물 분자에 의해 수행됨)을 발광이라 명명한다. 형광과 반대로, 이 경우에 에너지는 외부로부터 보다 짧은 파장의 방사 형태로 공급되지 않는다.

화학발광과 생물발광 사이에는 차이가 존재한다. 여기된 전자가 기저 상태로 되돌아올 때 그 자체가 발광하는, 여기된 분자를 유도하는 화학적 반응을 화학발광이라 명명한다. 상기 반응이 효소에 의해 촉매된다면, 이 현상은 생물발광이라고 언급된다. 상기 반응과 연관된 효소는 일반적으로 루시퍼라제라고 명명한다.

돌연변이체 제조

돌연변이체의 제조를 위해, 분자 생물학적 방법을 사용하여 89번 위치 [Y89F] (진뱅크 #AAA27716; 서열 5의 89번 위치) 및 139 번 위치 [Y139F] (진뱅크 #AAA27716; 서열 5의 139번 위치)에 돌연변이를 삽입하였다. 이를 위해, 스트라타젠(Stratagene)의 "빠른 변화(Quick change)" 방법 (카탈로그 번호 #200521; 수정 #063001b; 2003년판)을 사용하였다. (서열: 3) 및 (서열: 4)를 프라이머로 사용하였다. 벡터를 pET22b-AQ디케이로 지칭하였다.

AQ디케이

각각의 아미노산을 치환함으로써 변형된 스펙트럼 또는 생화학적 성질을 나타내는 광단백질은 이미 문헌에 기술되어 있다. 이러한 광단백질에는 오벨린 W92F (Vysotski et al., 2003) 및 애쿠오린 (Shrestha et al., 2002; Ohmiya et al., 1993)이 포함된다.

애쿠오린 돌연변이체 AQ디케이는 광단백질 애쿠오린 또는 다른 광단백질과 비교하여 연대기적으로 변형된 광 방출을 나타낸다.

광 방출에서의 연대기적 변화에 관여하는 139번 위치의 돌연변이를 89번 위치의 돌연변이와 조합시켰다. 89번 위치의 변화는 이미 기술되어 있으며 이는 광단백질의 스펙트럼 성질의 변화를 유발한다. 광 방출의 연대기적 변화를 나타내는 것 이외에, 선택된 조합은 또한 변형된 스펙트럼 성질을 나타낸다. 다른 아미노산의 치환과 139번 위치의 변화를 조합하는 것 또한 가능하다. 존재하는 애쿠오린 광단백질의 야생형 서열과 139번 위치의 변화를 조합하는 것 또한 가능하다.

광단백질 AQ디케이는 놀랍게도 상기 기재된 지연된 광 방출 또는 발광 동력학을 나타낸다. 통상적으로 가능한 사용이외에, 이러한 성질은 특히 진핵 세포 또는 다른 계에서의 매우 빠른 칼슘 방출과 관련되는 반응 또는 메카니즘을 조사하는데 광단백질을 사용할 수 있게 한다. 상기 기재된 광단백질 돌연변이체 또는 야생형 광단백질로부터의 광 방출의 동력학은 "플래시" 동력학으로 기술되는데, 이는 활성화 후 (예를 들어, 칼슘에 의한 활성화), 광은 매우 짧은 시간에 걸쳐 방출되며, 그 후 반응은 멈추거나 또는 적어도 현저하게 약화된다. 이러한 빠른 동력학을 측정하기 위해서는 특별한 측정 기구가 요구된다. 기술된 광단백질 돌연변이체 AQ디케이, 또는 이의 등가물은 단지 다른 측정 기구 또는 측정 방법을 사용할 수 있게 할 뿐 아니라, 특히, 매우 빠른 동력학을 연구할 수 있게 한다. 이러한 동력학은 예를 들면, P2X 계열에 속하는 이온 채널과 관련하여 나타날 수 있다.

최대 470　nm를 갖는 애쿠오린의 스펙트럼은 기술되어 있다 (Shimomuro et al., 1966). 코엘렌테라진의 스펙트럼 성질은 시노무로(Shinomuro)에 의해 조사되었다 (Shimomura et al., 2000).

광단백질 AQ디케이는 99%의 동일성으로 애쿠오리아 빅토리아로부터의 애쿠오린과 아미노산 수치에서의 가장 높은 상동성을 나타낸다 (실시예 8에 나타냄). 서열 비교를 위해 BLAST 방법을 사용하였다 (Altschul et al., 1997).

본 발명은 서열 2로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 광단백질 AQ디케이에 관한 것이다. 본 발명은 또한 서열 1로 나타낸 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명은 또한 AQ디케이의 기능적 등가물에 관한 것이다. 기능적 등가물은 필적하는 물리화학적 성질을 갖는 단백질이다.

본 발명은 아미노산 129-149번 위치, 124-134번 위치, 바람직하게는 137-141번 위치, 특히 138-140번 위치 (진뱅크 #AAA27716에 기초함)의 영역에서, 생물발광 성질의 변화를 유도하는 1 이상의 아미노산 돌연변이를 나타내는 애쿠오린 광단백질에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 139번 위치에서, 생물발광 성질의 변화를 유도하는 아미노산 돌연변이를 나타내는 애쿠오린 광단백질에 관한 것이다 (진뱅크 #AAA27716에 기초함). 이와 관련하여, 애쿠오린 광단백질은 또한 134-145번의 아미노산 영역에서, 절단된 애쿠오린의 잔기와 유사한 잔기를 나타내는 광단백질일 수 있다 (진뱅크 #AAA27716). 이 때, 유사한 잔기를 갖는 영역은 이러한 영역에서, 80%, 바람직하게는 90%의 동일성을 나타내는 서열로서 여겨진다.

본 발명은 79-99번 위치, 84-94번 위치, 바람직하게는 87-91번 위치, 특히 88-90번 위치의 아미노산 영역에서 형광 스펙트럼 또는 생물발광 스펙트럼의 변화를 유도하는 1 이상의 아미노산 돌연변이를 나타내는 애쿠오린 광단백질의, 139번 위치의 아미노산 영역 (진뱅크 #AAA27716에 기초함)의 돌연변이와의 조합에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 89번 위치에서 (진뱅크 #AAA27716에 기초함) 형광 스펙트럼 또는 생물발광 스펙트럼의 변화를 유도하는 아미노산 돌연변이를 나타내는 애쿠오린 광단백질의, 139번 위치의 아미노산 영역의 돌연변이와의 조합에 관한 것이다. 이와 관련하여, 480-520　nm, 바람직하게는 485-515　nm, 특히 바람직하게는 490-510　nm, 495 내지 505의 범위, 특히 500 nm에서 최대 형광 스펙트럼 또는 생물발광 스펙트럼을 나타내는 광단백질이 바람직하다. 이와 관련하여, 애쿠오린 광단백질은 또한 89-94번의 아미노산 영역에서, 절단된 애쿠오린의 잔기와 유사한 잔기를 나타내는 광단백질일 수 있다 (진뱅크 #AAA27716). 이 때, 유사한 잔기를 갖는 영역은 이러한 영역에서, 80%, 바람직하게는 90%의 동일성을 나타내는 서열로서 여겨진다.

AQ디케이 단백질의 기능적 단편, 또는 이러한 단편을 코딩하는 핵산 또한 본 발명에 따른다.

본 발명에 따른 다른 단백질의 절단된 기능적 단편, 또는 이러한 단편을 코딩하는 핵산 또한 본 발명의 일부를 형성한다.

광단백질 AQ디케이는 세포계, 특히 수용체, 이온 채널, 수송자, 전사 인자 또는 유도성 계에 대한 리포터 유전자로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 AQ디케이는 또한 세포 기관, 특히 미토콘드리아를 표지, 확인 및 특성화함으로써 리포터 유전자로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 AQ디케이는 또한 세포 기관, 특히 미토콘드리아 내부 및 외부의 파라미터, 특히 칼슘 농도를 결정하기 위한 리포터 유전자로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 AQ디케이는 박테리아계 및 진핵생물계, 특히 포유동물 세포, 박테리아, 효모, 바큘로바이러스 및 식물에서 리포터 유전자로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 AQ디케이는 생물발광계 또는 화학발광계, 특히 루시퍼라제, 옥시게나제 또는 포스파타제를 이용하는 계와 함께 세포계에 대한 리포터 유전자로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 AQ디케이는 특히 수용체, 이온 채널, 수송자, 전사 인자, 프로티나제, 키나제, 포스포디에스테라제, 히드롤라제, 펩티다제, 트랜스퍼라제, 막 단백질 및 당단백질에 대한 융합 단백질로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 AQ디케이는 특히 항체, 비오틴, 또는 자기 또는 자화성 지지체에 의해 고정되기에 적합하다.

광단백질 AQ디케이는 에너지 전달 시스템, 특히 FRET (형광 공명 에너지 전달), BRET (생물발광 공명 에너지 전달), FET (전계 효과 트랜지스터), FP (형광 편광) 및 HTRF (균질 시간차 형광) 시스템에 대한 단백질로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 AQ디케이는 특히 프로테아제, 키나제 또는 트랜스퍼라제에 대한 기질 또는 리간드를 표지하기에 적합하다.

광단백질 AQ디케이는 박테리아계에서 특히 역가 결정을 위해, 또는 생화학 시스템, 특히 프로티나제 및 키나제에 대한 기질로서 발현되기에 적합하다.

광단백질 AQ디케이는 특히 항생제, 효소, 수용체 또는 이온 채널 및 다른 단백질에 커플링된 표지로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 AQ디케이는 특히 HTS (고 작업량 스크리닝)에서 약리학적 활성 화합물의 검색을 위한 리포터 유전자로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 AQ디케이는 특히 p2x, TRP, SCN, KCN, CNG 또는 ACCN 유형의 이온 채널을 특성화, 동정, 및 관찰하는 리포터 유전자로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 AQ디케이는 특히 ELISA (효소-결합 면역흡수 분석법), 면역조직화학, 웨스턴 블롯팅 또는 공초점 현미경법에 대한 검출 시스템의 성분으로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 AQ디케이는 상호작용, 특히 단백질-단백질 상호작용, DNA-단백질 상호작용, DNA-RNA 상호작용, RNA-RNA 상호작용, 또는 RNA-단백질 상호작용 (DNA: 데옥시리보핵산; RNA: 리보핵산)을 분석하기 위한 표지로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 AQ디케이는 유전자도입 유기체, 특히 마우스, 래트, 햄스터 및 다른 포유동물, 영장류, 어류, 벌레 또는 식물에서의 발현에 대한 표지 또는 융합 단백질로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 AQ디케이는 배아 발달을 분석하기 위한 표지 또는 융합 단백질로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 AQ디케이는 커플링 매개체, 특히 비오틴, NHS (N-히드록시술포숙신이미드) 또는 CN-Br을 위한 표지로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 AQ디케이는 핵산, 특히 DNA 또는 RNA에 커플링되는 리포터로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 AQ디케이는 단백질 또는 펩티드에 커플링되는 리포터로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 AQ디케이는 세포내 또는 세포외 칼슘 농도를 측정하기 위한 리포터로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 AQ디케이는 세포계에서의 신호 단계반응을 특성화하기에 적합하다.

핵산 또는 펩티드에 커플링되는 광단백질 AQ디케이는 특히 노던 블롯, 서던 블롯, 웨스턴 블롯, ELISA, 핵산 서열화, 단백질 분석 또는 칩 분석을 위한 프로브로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 AQ디케이는 약리학적 제제, 특히 전염제, 항체 또는 "소분자"를 표지하기에 적합하다.

광단백질 AQ디케이는 특히 해양, 지하수 및 강류에 대한 지질 연구를 위해 사용되기에 적합하다.

광단백질 AQ디케이는 발현계, 특히 시험관내 번역계, 박테리아계, 효모계, 바큘로바이러스계, 바이러스계 및 진핵생물계에서 발현되기에 적합하다.

광단백질 AQ디케이는 수술적 개입, 특히 침습성, 비침습성 및 최소 침습성 개입과 관련하여 조직 또는 세포를 가시화하기에 적합하다.

광단백질 AQ디케이는 또한 특히 조직학적 연구 및 수술적 개입과 관련하여 종양 조직 및 다른 표현형으로 변형된 조직을 표지하기에 적합하다.

본 발명은 또한 특히 야생형 단백질, 융합 단백질 및 돌연변이된 단백질로서의 광단백질 AQ디케이의 정제에 관한 것이다.

광단백질 AQ디케이는 발현계(복합계)에서 상이한 리포터 유전자를 동시에 측정하기에 적합하다.

본 발명은 또한 화장품 분야, 특히 목욕 첨가제, 로션, 비누, 바디 염료, 치약 및 바디 파우더에서의 광단백질 AQ디케이의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 염색, 특히 식품, 목욕 첨가제, 잉크, 직물 및 플라스틱의 염색을 위한 광단백질 AQ디케이의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 종이, 특히 연하장, 종이 제품, 벽지 및 수공예 용품을 염색하기 위한 광단백질 AQ디케이의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 액체, 특히 물총, 분수, 음료수 및 얼음용 액체를 염색하기 위한 광단백질 AQ디케이의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 장난감, 특히 손가락 염료 및 분장용구를 제조하기 위한 광단백질 AQ디케이의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 서열 2로 기재된 폴리펩티드 또는 기능적 등가물 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.

또한, 본 발명은

a) 서열 2로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자;

b) 서열 1로 서술된 서열을 함유하는 핵산 분자;

c) 상보적 가닥이 엄격한 조건 하에서 a) 또는 b)로부터의 핵산 분자와 혼성화되며, 발현 산물이 광단백질의 생물학적 기능을 나타내는 핵산 분자; 및

(핵산 분자의 엄격한 혼성화는 68℃에서 0.2 × SSC (1× 표준 염수-시트레이트 = 150 mM NaCl, 15 mM 시트르산 삼나트륨)를 포함하는 수용액 중에서 수행할 수 있음 (Sambrook et al., 1989))

d) 유전 코드의 축퇴성으로 인해 c)에서 언급된 핵산 분자와 상이한 핵산 분자;

로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 분자 또는 이의 기능적 등가물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.

본 발명은 서열이 광단백질-코딩 서열 또는 리더- 또는 신호-서열-코딩 서열의 5'에 기능적 프로모터를 함유하는 상기 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명은 또한 재조합 DNA 또는 RNA 벡터의 일부를 형성하는 상기 기재한 바와 같은 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명은 이러한 벡터를 보유하는 유기체에 관한 것이다.

본 발명은 상기 기재한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 광단백질에 관한 것이다.

본 발명은 박테리아, 진핵생물 세포 또는 시험관내 발현계에서 본 발명에 따른 광단백질 폴리펩티드를 발현시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 광단백질 폴리펩티드를 정제/단리하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 특히 약리학적 활성 화합물을 검색하기 위한 및 진단을 위한 마커 유전자 또는 리포터 유전자로서의 본 발명에 따른 광단백질 코딩 핵산의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 표지 또는 리포터로서, 및 각각 마커 유전자 또는 리포터 유전자로서의 본 발명에 따른 광단백질 또는 본 발명에 따른 광단백질 코딩 핵산의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 특히 약리학적 활성 화합물을 검색하기 위한 및 진단을 위한 표지 또는 리포터로서, 및 각각 마커 또는 리포터 유전자로서의 광단백질 AQ디케이 (서열 2)의 용도 또는 이의 기능적 단편 또는 등가물, 광단백질 AQ디케이를 코딩하는 핵산 또는 이의 기능적 단편 또는 등가물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 특히 약리학적 활성 화합물을 검색하기 위한 및 진단을 위한 마커 유전자 또는 리포터 유전자로서의 서열 1에 서술된 핵산의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드를 인식하는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체에 관한 것이다.

본 발명은 또한 광단백질 AQ디케이 (서열 2)를 인식하는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 단락에서 기재한 바와 같고 코딩 서열의 5'에 기능적 프로모터를 함유하는 핵산에 관한 것이다.

본 발명은 상기 기재한 핵산을 함유하는 재조합 DNA 또는 RNA 벡터를 포함한다.

상기 기재한 바와 같은 벡터를 보유하는 유기체도 본 발명에 따른다.

상기 기재한 바와 같은 핵산 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드 또한 본 발명의 일부를 형성한다.

박테리아, 진핵생물 세포 또는 시험관내 발현계에서 상기 폴리펩티드를 발현시키는 방법 또한 본 발명에 따른다.

본 발명에 따른 폴리펩티드를 정제/단리하는 방법 또한 본 발명의 일부를 형성한다.

본 발명은 마커 유전자 또는 리포터 유전자로서의 본 발명에 따른 핵산의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 표지 또는 리포터로서의 본 발명에 따른 광단백질의 용도에 관한 것이다.

1 이상의 루시퍼라제 및/또는 1 이상의 광단백질과 조합되는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 용도 또한 본 발명의 일부를 형성한다.

129-149번 위치, 124-134번 위치, 바람직하게는 137-141번 위치, 특히 138-140번 위치 영역 (진뱅크 #AAA27716에 기초함)에서 1 이상의 돌연변이를 가지며, 변형되고, 특히 지연된 생물발광 신호를 나타내는 광단백질 또는 이의 기능적 단편 또한 본 발명에 따른다.

상기 두개의 단락에 따른 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자 또한 본 발명에 따른다.

본 발명은 또한 1 이상의 돌연변이를 진뱅크 #AAA27716에 기초로, 129-149번 위치, 124-134번 위치, 바람직하게는 137-141번 위치, 특히 138-140번 위치에 의해 정의된 영역에서 광단백질에 도입시켜, 생물발광의 변화를 나타내는 것을 특징으로 하는, 광단백질의 제조 방법에 관한 것이다.

상기 단락에 기술된 바와 같은 방법에 의해 제조된 광단백질 또한 본 발명에 따른다.

본 발명은 또한 아미노산 서열에서의 1 이상의 변화에 따라, 변형된 광 방출 동력학을 나타내는 다른 광단백질에 관한 것이다.

본 발명은 또한 광단백질 AQ디케이의 기술된 용도에 대한 다른 변형된 광단백질의 용도에 관한 것이다.

변형된 광 방출 동력학, 특히 지연된 광 방출 또는 광 방출의 연장된 시간을 갖는 광단백질은 특히 세포-기재 방법에서, 특히 약리학적 활성 화합물의 검색 및 특징화, 특히 진단에서의 리포터 유전자로서 사용하기에 적합하다.

변형된 광 방출 동력학, 특히 지연된 광 방출 또는 광 방출의 연장된 시간을 갖는 광단백질은 특히 이온 채널의 조사에 적합하다.

본 발명은 또한 생화학적 또는 물리화학적 성질의 변형, 특히 개선된 발현, 특히 변형된 안정성을 위한 본 발명에 따른 단백질의 코돈-최적화된 변이체에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 단백질의, 본 발명에 따른 단백질을 세포 소기관 또는 구획내(로)의 수송 또는 위치화를 위한 인식 펩티드와의 융합물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 스펙트럼 성질, 발광 광도, 물질 특이성, 보조 인자의 사용, 칼슘 친화도 또는 다른 물리화학적 또는 생화학적 성질의 변화를 유도하는 본 발명에 따른 단백질의 변이체에 관한 것이다.

본 발명의 광단백질의 발현

유전자가 적합한 숙주 세포로 도입된 후, 발현 벡터로 클로닝된 외래 유전자를 전사시키고 번역시키는 분자의 생산을 발현이라 명명한다. 발현 벡터는 원핵생물 또는 진핵생물 세포에서 유전자를 발현시키기 위해 요구되는 조절 신호를 함유한다.

원칙적으로, 발현 벡터는 두가지 상이한 방법으로 구축될 수 있다. 전사 융합이라고 명명되는 방법의 경우, 클로닝되어 들어온 외래 유전자에 의해 코딩된 단백질은 진정한 생물학적 활성 단백질로서 합성된다. 상기 목적을 위해, 발현 벡터는 발현을 위해 요구되는 모든 5' 및 3' 조절 신호를 보유한다.

번역 융합이라고 명명되는 방법의 경우, 클로닝되어 들어온 외래 유전자에 의해 코딩된 단백질은 혼성 단백질로서 쉽게 검출될 수 있는 다른 단백질과 함께 발현된다. 개시 코돈을 포함하고 형성될 혼성 단백질의 N-말단 영역을 코딩하는 서열의 일부를 포함할 수 있는, 발현에 요구되는 5' 및 3' 조절 신호는 벡터로부터 기원된다. 추가의 삽입된 단백질 잔기는, 많은 경우에, 클로닝되어 들어온 외래 유전자에 의해 코딩된 단백질을 세포 프로테아제에 의한 파괴에 대항하여 안정화시킬 뿐 아니라, 형성된 혼성 단백질을 검출하고 단리하기 위해 사용될 수 있다. 발현은 일시적으로 또는 안정되게 일어날 수 있다. 적합한 숙주 유기체는 박테리아, 효모, 바이러스 또는 진핵생물계이다.

본 발명의 광단백질의 정제

단백질의 단리 (단백질이 과발현된 후에도 마찬가지)는 종종 단백질 정제라고 명명된다. 단백질 정제를 위해서는 확립된 다수의 방법을 이용할 수 있다.

고체/액체 분리는 단백질 단리와 관련된 기본적 작업이다. 배양 배지로부터 세포를 분리할 때, 세포를 붕괴시키고 세포 잔해를 제거한 후 조 추출물을 정화할 때, 그리고 침강 후 침전물을 분리해 낼 때 등에서 상기 절차상의 단계가 요구된다. 이는 원심분리 및 여과로 수행된다.

세포내 단백질을 수득하기 위하여, 세포벽은 파괴되거나 투과가능하게 되어야 한다. 규모 및 유기체에 따라, 고압 균질화기 또는 교반기 볼 밀 또는 유리 비드 밀을 상기 목적을 위해 사용한다. 특히 실험관 규모에서는 기계적 세포 통합 및 초음파 처리를 사용한다.

세포외 단백질의 경우와 세포내 단백질의 경우 모두에서 (세포 붕괴 후), 염 (특히 황산암모늄) 또는 유기 용매 (알콜 또는 아세톤)를 사용하는 다양한 침강 방법은 단백질 농축을 위한 신속하고 효율적인 방법을 대표한다. 세포내 단백질을 정제하는 경우, 가용성 핵산 (예를 들어, 황산스트렙토마이신 또는 황산프로타민과의 침전물)을 제거하는 것이 바람직하다. 세포외 단백질을 단리하는 경우, 취급하기 보다 용이한 침전물을 수득하기 위하여, 침강제를 첨가하기 전에 담체 (예를 들어, 전분 또는 규조토)를 종종 첨가한다.

수많은 색층분석 방법 및 분배 방법 (흡수 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과, 친화도 크로마토그래피 및 전기영동)이 고급의 정제를 위해 이용가능하다. 컬럼 크로마토그래피는 또한 산업적 규모에 사용된다. 단계 당 수백가지 이하의 정제 인자를 가능하게 하는 친화도 크로마토그래피가 실험실 규모에서 특히 중요하다.

세포외 단백질은 비교적 희석된 용액에서 생긴다. 세포외 단백질처럼, 이는 추가로 사용되기 전에 농축되어야 한다. 이미 언급한 방법 이외에, 초여과가 또한 산업적 규모에 가치있는 것으로 입증되었다.

단백질을 수반하는 무기염은 종종 특정 분야의 경우에 바람직하지 않다. 이는 특히 겔 여과, 투석 및 정용여과로 제거될 수 있다.

수많은 단백질이 건조 제형으로서 사용된다. 중요한 건조 방법은 진공 건조, 동결 건조 및 분무 건조이다.

뉴클레오티드 및 아미노산 서열

광단백질 AQ디케이는 하기 뉴클레오티드 서열 (서열 1)로 코딩된다:

이는 (서열 2)의 아미노산 서열을 수득한다:

프라이머

(서열 3)

(서열 4)

(서열 5)

(서열 6)

광단백질 애쿠오린(진뱅크: AAA27716)은 다음의 아미노산 서열(서열: 7)을 갖는다. 89 및 139번 위치를 진하고 밑줄로 나타낸다.

상기 서열은 서열 목록에서 재현된다.

도 1: 도 1은 벡터 pET22b-AQ디케이의 플라스미드 지도를 나타낸다.

도 2: 도 2는 벡터 pcDNA3-AQ디케이의 플라스미드 지도를 나타낸다.

도 3: 도 3은 CHO 세포에서의 AQ디케이의 진핵적 발현의 결과를 나타낸다. 실험은 실시예 4에 기술된 바와 같이 수행하였다 (Y = 상대적 광 단위, RLU; X = log 농도 (ATP/mol/l).

도 4: 도 4는 AQ디케이의 박테리아 발현의 결과를 나타낸다. 실험은 실시예 3에 기술된 바와 같이 수행하였다 (Y = 상대적 광 단위, RLU; X = 시간 (초); 검은색 곡선: AQ 디케이; 회색 곡선: 야생형 애쿠오린).

도 5: 도 5는 AQ디케이의 생물발광 동력학을 나타낸다 (CHO 세포에서의 발현). 실험은 실시예 4에 기술된 바와 같이 수행하였다 (Y = 상대적 광 단위, RLU; X = 시간 (초); 검은색 곡선: AQ 디케이; 회색 곡선: 야생형 애쿠오린).

실시예 1

돌연변이체를 제조하기 위해, 분자 생물학적 방법을 사용하여 132번 위치(절단되 애쿠오린의 132번 위치: 진뱅크 #AAA27716)에 돌연변이를 삽입하였다. 이를 위해 스트라타젠(미국)에 의해 제공되는 "빠른 변화" 방법을 사용하였다. 사용된 프라이머는 (서열 3) 및 (서열 4)였다. cDNA를 벡터 pET22b (Novagen)의 NdeI/XhoI 절단 부위에 삽입하였다. 벡터를 pET22b-AQ디케이로 지칭하였다.

도 1은 벡터 pET22b-AQ디케이의 플라스미드 지도를 나타낸다.

실시예 2

클론테크(Clontech)에 의해 공급된 플라스미드 pcDNA3.1(+)를 하기 기재하는 구조체를 제조하기 위한 벡터로서 사용하였다. 벡터의 유도체를 pcDNA3-AQ디케이라 지칭하였다. 벡터 pcDNA3-AQ디케이를 진핵생물계에서 AQ디케이를 발현시키기 위해 사용하였다.

도 2는 벡터 pcDNA3-AQ디케이의 플라스미드 지도를 나타낸다.

실시예 3

박테리아 발현

박테리아를 발현 플라스미드 pET22b-AQ디케이로 형질전환시킴으로써, 박테리아 발현을 이. 콜라이에서 수행하였다. 형질전환된 박테리아를 37℃에서 3시간 동안 LB 배지에서 인큐베이션하고, 발현을 제조자(Novagen)의 지시에 따라 유도하였다. 유도된 박테리아를 원심분리로 수거하고, 50 mM Tris/HCl (pH 9.0) + 5 mM EDTA 중에 재현탁시키고, 초음파처리로 붕괴시켰다. 그 후, 용균체를 13,000 rpm (16,000 ref)에서 15분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 상청액 (Tris/HCl pH 9.0로 1:5, 1:10; 1:20 및 1:50 희석)을 암소에서 3시간 동안 코엘렌테라진 (Tris/HCl pH 9.0 중 10E-07 M 코엘렌테라진)과 인큐베이션하였다. 5 mM 염화칼슘을 첨가한 직후 발광분석기로 생물발광을 측정하였다. 측정 통합 시간은 40 초이었다.

도 4은 박테리아에서 AQ디케이의 생물발광의 측정 동력학을 나타낸다.

실시예 4

진핵생물 발현

일시적 실험으로 세포를 발현 플라스미드 pcDNA3-AQ디케이 및 pcDNA3.1(+)로 형질감염시킴으로써, 구조적 진핵생물 발현을 CHO 세포에서 수행하였다. 이를 위하여, 웰 당 10,000개의 세포를 DMEM-F12 배지 중에서 96-웰 미량역가 플레이트에 플레이팅하고, 플레이트를 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다. 푸진(Fugene) 6 키트 (로슈)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 형질감염을 수행하였다. 형질감염된 세포를 DMEM-F12 배지에서 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 배지를 제거하고, 코엘렌테라진 (PBS 중 10E-07 M 코엘렌테라진) 50 ㎕로 대체하였다. 세포를 28℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후, ATP (아데노신 트리포스페이트)를 최종 농도 1 μM로 첨가하였다. 첨가 직후 발광분석기로 측정을 시작하였다. 통합 시간은 1초이었고, 총 측정 시간은 60 초이었다.

도 3은 CHO 세포에서 AQ디케이의 생물발광의 측정 결과를 나타낸다.

도 5는 CHO 세포에서 AQ디케이의 생물발광의 측정 동력학을 나타낸다.

실시예 5

BLAST

아미노산 수준에서의 AQ디케이의 BLAST 분석 결과:

>emb|CAC93774.1| 명명되지 않은 단백질 산물 [애쿠오레아 빅토리아]

길이 = 196, 스코어 = 410 bits (1054), 예상치(Expect) = e-113, 동일성 = 194/196 (98%), 양성 = 196/196 (100%)

>pir||A26623 애쿠오린-1 전구체 - 히드로헤파린(hydromedusa) (애쿠오레아 빅토리아) sp|P07164|AEQ1_AEQVI 애쿠오린 1 전구체 gb|AAA27716.1| 애쿠오린 1 전구체

길이 = 196, 스코어 = 410 bits (1054), 예상치 = e-113, 동일성 = 194/196 (98%), 양성 = 196/196 (100%)

>gb|AAB14842.1| 특허 US 5541309로부터의 서열 1 gb|AAA55424.1| 특허 EP 0187519로부터의 서열 2

길이 = 196, 스코어 = 407 bits (1046), 예상치 = e-113, 동일성 = 193/196 (98%), 양성 = 195/196 (99%)

>gb|AAB14845.1| 특허 US 5541309로부터의 서열 4

길이 = 196, 스코어 = 405 bits (1041), 예상치 = e-112, 동일성 = 192/196 (97%), 양성 = 194/196 (98%)

>gb|AAB14846.1| 특허 US 5541309로부터의 서열 5

길이 = 196, 스코어 = 405 bits (1040), 예상치 = e-112, 동일성 = 192/196 (97%), 양성 = 194/196 (98%)

>gb|AAB14844.1| 특허 US 5541309로부터의 서열 3

길이 = 196, 스코어 = 405 bits (1040), 예상치 = e-112, 동일성 = 192/196 (97%), 양성 = 194/196 (98%)

>emb|CAC93778.1| 명명되지 않은 단백질 산물 [애쿠오레아 빅토리아]

길이 = 196, 스코어 = 402 bits (1034), 예상치 = e-111, 동일성 = 191/196 (97%), 양성 = 193/196 (98%)

>dbj|BAC81730.1| 아포애쿠오린 [애쿠오레아 빅토리아]

길이 = 196, 스코어 = 401 bits (1031), 예상치 = e-111, 동일성 = 189/196 (96%), 양성 = 195/196 (99%)

>emb|CAC93779.1| 명명되지 않은 단백질 산물 [애쿠오레아 빅토리아]

길이 = 196, 스코어 = 400 bits (1029), 예상치 = e-111, 동일성 = 190/196 (96%), 양성 = 192/196 (97%)

>emb|CAC93780.1| 명명되지 않은 단백질 산물 [애쿠오레아 빅토리아]

길이 = 196, 스코어 = 400 bits (1028), 예상치 = e-110, 동일성 = 190/196 (96%), 양성 = 192/196 (97%)

>pdb|1SL8|A 사슬 A, 에쿠오레아 빅토리아로부터의 칼슘-로딩된 아포-애쿠오린

길이 = 191, 스코어 = 395 bits (1015), 예상치 = e-109, 동일성 = 187/190 (98%), 양성 = 189/190 (99%)

>gb|AAB14843.1| 특허 US 5541309로부터의 서열 2

길이 = 189, 스코어 = 394 bits (1011), 예상치 = e-108, 동일성 = 186/189 (98%), 양성 = 188/189 (99%)

>emb|CAC93777.1| 명명되지 않은 단백질 산물 [애쿠오레아 빅토리아]

길이 = 189, 스코어 = 391 bits (1005), 예상치 = e-108, 동일성 = 185/189 (97%), 양성 = 187/189 (98%)

>emb|CAC93781.1| 명명되지 않은 단백질 산물 [애쿠오레아 빅토리아]

길이 = 189, 스코어 = 391 bits (1004), 예상치 = e-108, 동일성 = 184/189 (97%), 양성 = 187/189 (98%)

>emb|CAC93775.1| 명명되지 않은 단백질 산물 [애쿠오레아 빅토리아]

길이 = 196, 스코어 = 384 bits (985), 예상치 = e-105, 동일성 = 176/196 (89%), 양성 = 192/196 (97%)

>dbj|BAC81731.1| 아포애쿠오린 [애쿠오레아 빅토리아]

길이 = 196, 스코어 = 384 bits (985), 예상치 = e-105, 동일성 = 176/196 (89%), 양성 = 192/196 (97%)

실시예 6

BLAST

핵산 수준에서의 AQ디케이의 BLAST 분석 결과:

>gb|M16103.1|AEVAEQA 애쿠오레아 빅토리아 (해파리) 애쿠오린 1 mRNA, 완전 화합물

길이 = 672, 스코어 = 1104 bits (557), 예상치 = 0.0, 동일성 = 569/573 (99%)

>dbj|AB103337.1| 아포애쿠오린에 대한 애쿠오레아 빅토리아, 클론:UTAEQ04

길이 = 591, 스코어 = 961 bits (485), 예상치 = 0.0, 동일성 = 551/573 (96%)

>dbj|AB103338.1| 아포애쿠오린에 대한 애쿠오레아 빅토리아 mRNA, 클론:UTAEQ09

길이 = 591, 스코어 = 739 bits (373), 예상치 = 0.0, 동일성 = 523/573 (91%)

>gb|L29571.1|AEVAQ440X 애쿠오레아 빅토리아 애쿠오린 (AQ440) mRNA, 완전 화합물

길이 = 925, 스코어 = 731 bits (369), 예상치 = 0.0, 동일성 = 522/573 (91%)

>gb|M11394.1|AEVAEQD 애쿠오레아 빅토리아 (해파리) 애쿠오린 mRNA, 완전 화합물

길이 = 861, 스코어 = 731 bits (369), 예상치 = 0.0, 동일성 = 522/573 (91%)

>dbj|AB103336.1| 아포애쿠오린에 대한 애쿠오레아 빅토리아 mRNA, 클론:UTAEQ01

길이 = 591, 스코어 = 724 bits (365), 예상치 = 0.0, 동일성 = 521/573 (90%)

>dbj|AB103339.1| 아포애쿠오린에 대한 애쿠오레아 빅토리아 mRNA, 클론:UTAEQ11

길이 = 591, 스코어 = 716 bits (361), 예상치 = 0.0, 동일성 = 520/573 (90%)

>gb|AY601106.1| 애쿠오레아 빅토리아 애쿠오린 mRNA, 완전 화합물

길이 = 600, 스코어 = 716 bits (361), 예상치 = 0.0, 동일성 = 517/569 (90%)

>gb|AY604002.1| 애쿠오레아 빅토리아 클론 AEQ_V44A 개질된 애쿠오린 mRNA, 완전 화합물

길이 = 600, 스코어 = 708 bits (357), 예상치 = 0.0, 동일성 = 516/569 (90%)

>gb|AY604001.1| 애쿠오레아 빅토리아 클론 AEQ_Q168R 개질된 애쿠오린 mRNA, 완전 화합물

길이 = 600, 스코어 = 708 bits (357), 예상치 = 0.0, 동일성 = 516/569 (90%)

>gb|AY604000.1| 애쿠오레아 빅토리아 클론 AEQN26D 개질된 애쿠오린 mRNA, 완전 화합물

길이 = 600, 스코어 = 708 bits (357), 예상치 = 0.0, 동일성 = 516/569 (90%)

>gb|AY603999.1| 애쿠오레아 빅토리아 클론 AEQ_L170I 개질된 애쿠오린 mRNA, 완전 화합물

길이 = 600, 스코어 = 708 bits (357), 예상치 = 0.0, 동일성 = 516/569 (90%)

>gb|AY603998.1| 애쿠오레아 빅토리아 클론 AEQ_F149S 개질된 애쿠오린 mRNA, 완전 화합물

길이 = 600, 스코어 = 708 bits (357), 예상치 = 0.0, 동일성 = 516/569 (90%)

>gb|AY603997.1| 애쿠오레아 빅토리아 클론 AEQ_E35G 개질된 애쿠오린 mRNA, 완전 화합물

길이 = 600, 스코어 = 708 bits (357), 예상치 = 0.0, 동일성 = 516/569 (90%)

>gb|AY603996.1| 애쿠오레아 빅토리아 클론 AEQ_E128G 개질된 애쿠오린 mRNA, 완전 화합물

길이 = 600, 스코어 = 708 bits (357), 예상치 = 0.0, 동일성 = 516/569 (90%)

>gb|AY603995.1| 애쿠오레아 빅토리아 클론 AEQ_D153G 개질된 애쿠오린 mRNA, 완전 화합물

길이 = 600, 스코어 = 708 bits (357), 예상치 = 0.0, 동일성 = 516/569 (90%)

>gb|AY603994.1| 애쿠오레아 빅토리아 클론 AEQ_D117G 개질된 애쿠오린 mRNA, 완전 화합물

길이 = 600, 스코어 = 708 bits (357), 예상치 = 0.0, 동일성 = 516/569 (90%)

>gb|AY603993.1| 애쿠오레아 빅토리아 클론 AEQ-Q168A-L170V 개질된 애쿠오린 mRNA, 완전 화합물

길이 = 600, 스코어 = 676 bits (341), 예상치 = 0.0, 동일성 = 512/569 (89%)

실시예 7

도 7은 아미노산 수준에서의 애쿠오린 (야생형; wt)에 의한 AQ디케이의 정렬을 보여준다.

실시예 8

박테리아에서 발현된 AQ디케이의 동력학적 분석

AQ디케이의 생물발광의 동력학적 분석을 위해, 이. 콜라이 BL21 (DE3)을 pET22b-AQ디케이 또는 pET22b (통합된 cDNA가 전혀 없음)로 형질감염시켰다. 박테리아를 실시예 3에 기재된 바와 같이 증식시키고 파괴시켰다. 측정 데이타를 1초의 통합 시간을 이용하여 60초의 기간 동안 모았다.

도 4는 박테리아에서의 AQ디케이의 동력학적 분석 결과를 나타낸다.

실시예 9

CHO 세포에서 발현된 AQ디케이의 동력학적 분석

AQ디케이의 생물발광의 동력학적 분석을 위해, CHO 세포 (차이니즈 햄스터 난소 세포)를 pcDNA3-AQ디케이 또는 pcDNA (통합된 cDNA가 전혀 없음)로 일시적으로 형질감염시켰다. 실시예 4에 기재된 바와 같이 감염시키고 측정하였다. 측정 데이타를 1초의 통합 시간을 이용하여 60초의 기간 동안 모았다.

도 5는 CHO 세포에서의 AQ디케이의 동력학적 분석 결과를 나타낸다.

실시예 10

복합계 실험에서의 AQ디케이의 사용

광단백질 AQ디케이는 실험 혼합물에서 몇몇 리포터 유전자 (예, 루시퍼라제 또는 광단백질)를 사용하는 복합계 판독 방법의 구성으로서 사용하기에 적합하다. 이를 위해, AQ디케이-발현 CHO 세포를 야생형 애쿠오린을 발현하는 CHO 세포와 1:1 (또는 1:2, 1:3,..)의 비율로 혼합시켰다. 야생형 애쿠오린을 발현하는 세포는 또한 G 단백질-커플링 수용체 (예를 들어, 뉴로메딘 U 수용체 2)를 발현하였다. 세포 혼합물을 96-웰, 384-웰 또는 1536-웰 미량역가 플레이트에 플레이팅한 후, 이를 37℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다.

그 후 세포를 (실시예 4에 기재된) 코엘렌테라진으로 로딩시켰다. G 단백질 수용체 아고니스트를 첨가하여 칼슘을 세포내로 방출시켰다. 야생형 애쿠오린을 사용하여 상기 방출을 읽을 수 있다 (야생형 애쿠오린에 의한 광 방출). 그 후 내인성 CHO 수용체를 활성화시키는 아고니스트 (예, ATP)를 첨가함으로써 제2 세포 유형의 AQ디케이를 활성화시킬 수 있다.

실시예 11

세포 소기관 또는 구획에서의 AQ디케이의 위치화

광단백질 AQ디케이 또는 이의 등가물은 특별한 세포 구획 또는 소기관으로의 수송 또는 위치화의 목적을 위해 펩티드, 리더 서열, 전좌 신호, 단백질 또는 단백질 단편과 융합되기에 적합하다. 광단백질 AQ디케이의 수송, 및 그 후의 위치화를 위해, 본 발명에 따른 광단백질을 펩티드 MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSLPPEGKL과 융합시켰다. AQ디케이 아미노산 서열의 펩티드 상류의 융합은 융합 단백질을 진핵 숙주 세포의 미토콘드리아 내로 전좌시킨다. 미토콘드리아 위치화된 광단백질 AQ디케이는 미토콘드리아 내에서의 칼슘 농도를 측정하는데 사용할 수 있다. AQ디케이 광단백질의 아미노산 서열의 기재된 펩티드 상류의 융합은 표준 분자 생물학적 방법을 사용하여 핵산 수준에서 행해졌다.

참고문헌/특허

SEQUENCE LISTING <110> Bayer HealthCare AG <120> Isolated photoprotein AQdecay, and its use <130> BHC 05 1 042 <160> 7 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 576 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> aequorin mutatnt <400> 1 atgtcagtca agcttacacc agacttcgac aacccaaaat ggattggacg acacaagcac 60 atgtttaatt ttcttgatgt caaccacaat ggaaggatct ctcttgacga gatggtctac 120 aaggcgtccg atattgttat aaacaatctt ggagcaacac ctgaacaagc caaacgtcac 180 aaagatgctg tagaagcctt cttcggagga gctggaatga aatatggtgt agaaactgaa 240 tggcctgaat ttatcgaagg atggaaaaga ctggcttccg aggaattgaa aaggtattca 300 aaaaaccaaa tcacacttat tcgtttatgg ggtgatgcat tgttcgatat cattgacaaa 360 gaccaaaatg gagctatttc actggatgaa tggaaagcat tcaccaaatc tgctggcatc 420 atccaatcgt cagaagattg cgaggaaaca ttcagagtgt gcgatattga tgaaagtgga 480 cagctcgatg ttgatgagat gacaagacaa catttaggat tttggtacac catggatcct 540 gcttgcgaaa agctctacgg tggagctgtc ccctaa 576 <210> 2 <211> 196 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> aequorin mutant <400> 2 Met Thr Ser Glu Gln Tyr Ser Val Lys Leu Thr Pro Asp Phe Asp Asn 1 5 10 15 Pro Lys Trp Ile Gly Arg His Lys His Met Phe Asn Phe Leu Asp Val 20 25 30 Asn His Asn Gly Arg Ile Ser Leu Asp Glu Met Val Tyr Lys Ala Ser 35 40 45 Asp Ile Val Ile Asn Asn Leu Gly Ala Thr Pro Glu Gln Ala Lys Arg 50 55 60 His Lys Asp Ala Val Glu Ala Phe Phe Gly Gly Ala Gly Met Lys Tyr 65 70 75 80 Gly Val Glu Thr Glu Trp Pro Glu Phe Ile Glu Gly Trp Lys Arg Leu 85 90 95 Ala Ser Glu Glu Leu Lys Arg Tyr Ser Lys Asn Gln Ile Thr Leu Ile 100 105 110 Arg Leu Trp Gly Asp Ala Leu Phe Asp Ile Ile Asp Lys Asp Gln Asn 115 120 125 Gly Ala Ile Ser Leu Asp Glu Trp Lys Ala Phe Thr Lys Ser Asp Gly 130 135 140 Ile Ile Gln Ser Ser Glu Asp Cys Glu Glu Thr Phe Arg Val Cys Asp 145 150 155 160 Ile Asp Glu Ser Gly Gln Leu Asp Val Asp Glu Met Thr Arg Gln His 165 170 175 Leu Gly Phe Trp Tyr Thr Met Asp Pro Ala Cys Glu Lys Leu Tyr Gly 180 185 190 Gly Ala Val Pro 195 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 3 gaatggcctg aatttatcga aggatggaa 29 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 4 ttccatcctt cgataaattc aggccattc 29 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 5 gaatggaaag cattcaccaa atctgctg 28 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 6 cagcagattt ggtgaatgct ttccattc 28 <210> 7 <211> 196 <212> PRT <213> Aequoria victoria <400> 7 Met Thr Ser Glu Gln Tyr Ser Val Lys Leu Thr Pro Asp Phe Asp Asn 1 5 10 15 Pro Lys Trp Ile Gly Arg His Lys His Met Phe Asn Phe Leu Asp Val 20 25 30 Asn His Asn Gly Arg Ile Ser Leu Asp Glu Met Val Tyr Lys Ala Ser 35 40 45 Asp Ile Val Ile Asn Asn Leu Gly Ala Thr Pro Glu Gln Ala Lys Arg 50 55 60 His Lys Asp Ala Val Glu Ala Phe Phe Gly Gly Ala Gly Met Lys Tyr 65 70 75 80 Gly Val Glu Thr Glu Trp Pro Glu Tyr Ile Glu Gly Trp Lys Arg Leu 85 90 95 Ala Ser Glu Glu Leu Lys Arg Tyr Ser Lys Asn Gln Ile Thr Leu Ile 100 105 110 Arg Leu Trp Gly Asp Ala Leu Phe Asp Ile Ile Asp Lys Asp Gln Asn 115 120 125 Gly Ala Ile Ser Leu Asp Glu Trp Lys Ala Tyr Thr Lys Ser Asp Gly 130 135 140 Ile Ile Gln Ser Ser Glu Asp Cys Glu Glu Thr Phe Arg Val Cys Asp 145 150 155 160 Ile Asp Glu Ser Gly Gln Leu Asp Val Asp Glu Met Thr Arg Gln His 165 170 175 Leu Gly Phe Trp Tyr Thr Met Asp Pro Ala Cys Glu Lys Leu Tyr Gly 180 185 190 Gly Ala Val Pro 195

Claims (18)

1. a) 서열 2로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자;

   b) 서열 1로 서술된 서열을 함유하는 핵산 분자;

   c) 상보적 가닥이 엄격한 조건 하에서 a) 또는 b)로부터의 핵산 분자와 혼성화되며, 발현 산물이 광단백질의 생물학적 기능을 나타내는 핵산 분자; 및

   d) 유전 코드의 축퇴성으로 인해 c)에서 언급된 핵산 분자와 상이한 핵산 분자

   로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 분자 또는 이의 기능적 단편.
2. 제1항에 따른 핵산 서열에 의해 코딩되고 광단백질의 성질을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편.
3. 서열 7을 기초로 129 내지 149번 위치에서 1 이상의 돌변변이를 가지며 변형된 연대기적 생물발광을 나타내는 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편.
4. 서열 7을 기초로 139번 위치에서 돌변변이를 가지며 변형된 연대기적 생물발광을 나타내는 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편.
5. 제3항 또는 제4항에 따른 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자.
6. 코딩 서열의 5'에 기능적 프로모터를 함유하는 제1항 또는 제5항에 따른 핵산 분자.
7. 제6항에 따른 핵산 분자를 함유하는 재조합 DNA 또는 RNA 벡터.
8. 제7항에 따른 벡터를 보유하는 유기체.
9. 제1항 또는 제5항에 따른 핵산 분자의 구성 서열과 동일하거나 또는 이와 상보적인 10개 초과의 연속적 뉴클레오티드를 갖는 올리고뉴클레오티드.
10. 박테리아, 진핵 세포 또는 시험관내 발현계에서의 제2항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 발현 방법.
11. 제10항에 따라 발현되는 광단백질 폴리펩티드의 정제/단리 방법.
12. 제1항 또는 제5항에 따른 핵산의 마커 유전자 또는 리포터 유전자로서의 용도.
13. 다른 리포터 유전자와 조합된 제1항 또는 제5항에 따른 핵산의 마커 유전자 또는 리포터 유전자로서의 용도.
14. 서열 7을 기초로 137 내지 141번 위치에 의해 정의된 영역에서 광단백질에 1 이상의 돌연변이를 도입시켜, 연대기적 생물발광의 변화를 유도하는 것을 특징으로 하는, 광단백질의 제조 방법.
15. 제14항에 따른 방법에 의해 제조된 광단백질.
16. 제2항, 제3항, 제4항 및 제15항 중 어느 한 항에 따른 광단백질의 표지 또는 리포터로서의 용도.
17. 다른 리포터 유전자와 조합된 제2항, 제3항, 제4항 및 제15항 중 어느 한 항에 따른 광단백질의 표지 또는 리포터로서의 용도.
18. 변형된 연대기적 생물발광을 나타내는 광단백질 애쿠오린의 변이체.

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