CN101223188A

CN101223188A - 分离的发光蛋白AQdecay及其应用

Info

Publication number: CN101223188A
Application number: CNA2006800255080A
Authority: CN
Inventors: S·戈尔茨; E·维索特斯基; S·马科瓦; G·A·斯特彭尤克; L·弗兰克
Original assignee: Bayer Healthcare AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2005-05-13
Filing date: 2006-05-03
Publication date: 2008-07-16
Also published as: EP1881992A2; JP2008539741A; US20090203888A1; DE102005022146A1; WO2006122650A2; WO2006122650A3; CA2608004A1; TW200716177A; KR20080021018A

Abstract

本发明涉及发光蛋白AQdecay，其核苷酸序列和氨基酸序列，以及发光蛋白Aqdecay的活性和用途。

Description

分离的发光蛋白AQdecay及其应用

技术领域

本发明涉及发光蛋白AQdecay，涉及它的核苷酸和氨基酸序列，并且涉及发光蛋白AQdecay的活性和应用。

背景技术

发光蛋白

活有机体发出光的现象被称为生物发光。这是细胞中生物化学反应的结果，在该反应中化学能以光量子的形式发射出(称为通过化学发光进行的冷发射)。通过这种方式产生的光是单色光，因为它的发射与分散的电子转移相联系，因此它可以被二级荧光染料(例如，在水母属(Aequoria)发光水母(Leuchtquallen)的情况下为荧光蛋白质)迁移到较长波长的光谱区。

生物发光具有多种生物功能：在200～1000m(Mesopelagial)的海洋深度下，大约90％的所有生活有机体都发光。在这种情况下，发光信号用于吸引配偶、伪装和作为诱饵。萤火虫和火萤同样使用光信号寻找配偶。另一方面，细菌、真菌和单细胞藻类中荧光的重要性尚不明确。可以假定其用于配合大量数目的多个单独个体或者表示一种类型的生物钟。

多种腔肠动物都是生物发光体(Morin等人，1974)。这些有机体发射蓝色或者绿色光。作为分离的蛋白质，来源于水母(Aequoria Victoria)(Shimomura等人，1969)、在1962年被首先确定为发光蛋白的水母发光蛋白(Aequorin)，在水母的情形中进行表型观察时，发射蓝光而不是绿光。由于受水母发光蛋白活化的结果，导致水母呈现绿色表型的绿色荧光蛋白(GFP)随后从该水母中分离得到(Johnson等人，1962；Hastings等人，1969；Inouye等人，1994)。其它也被鉴定和描述的发光蛋白为Clytin(Inouye等人，1993)、Mitrocomin(Fagan等人，1993)和奥贝林(Obelin)(Illarionov等人，1995)。

表1：一些发光蛋白的综述。该表给出了名称、分离蛋白质的有机体和数据库入口的识别编号(Acc.No.)。

名称	有机体	识别编号
名称	有机体	识别编号	奥贝林	曲膝薮枝螅	AAL86372
Clytin	Clyta gregaria	CAA49754	奥贝林	曲膝薮枝螅	AAL86372
Clytin	Clyta gregaria	CAA49754	水母发光蛋白	大型多管水母	AAK02061
水母发光蛋白	细小多管水母	AAK02060	水母发光蛋白	大型多管水母	AAK02061
水母发光蛋白	细小多管水母	AAK02060	Mitrocomin	Mitrocoma cellularia	AAA29298
Pholasin	海笋	AAM18085	Mitrocomin	Mitrocoma cellularia	AAA29298
Pholasin	海笋	AAM18085	？	鸢乌贼oualaniensis	AX305029

表2：一些发光蛋白的综述。该表给出了分离蛋白质的有机体、发光蛋白的名称和选择的专利或者申请。

有机体	荧光蛋白	专利/申请
有机体	荧光蛋白	专利/申请	曲膝薮枝螅	奥贝林	WO03006497
Clytia gregaria	Clytin	WO03006497	曲膝薮枝螅	奥贝林	WO03006497
Clytia gregaria	Clytin	WO03006497	水母	水母发光蛋白	WO200168824US-0908909US 6,152,358JP-0176125
海笋	Pholasin	WO0028025GB-0024357	水母	水母发光蛋白	WO200168824US-0908909US 6,152,358JP-0176125

当前，生物发光以多种不同的方式用于技术中，例如以环境污染生物指示物的形式，或者用于生物化学中以灵敏检测蛋白质或者定量具体化合物，或者作为与研究细胞中基因调节相联系的所谓指示器(Reporter)。

发光蛋白的相互区别之处不仅在于它们的核苷酸和氨基酸序列不同，而且在于它们的生物化学和物理性质不同。

已经证实，发光蛋白的物理和生化性质可以通过改变这些发光蛋白质的氨基酸序列得到改变。诱变处理的发光蛋白的实例描述在文献中(US 6,495,355；US 5,541,309；US 5,093,240；Shimomura等人，1986)。

上述发光蛋白通过氧化腔肠发光(Haddock等人，2001；Jones等人，1999)。

指示器系统

通常，其基因产物可以通过使用简单的生物化学或者组织化学方法得到轻易检测的基因被称为报导基因(Reportergen)或者指针基因(Indikatorgen)。至少两种类型的报导基因已经得到了区分。

1.抗性基因。作为抗性基因表示其在细胞上表达使得细胞对抗生素或者对如果抗性基因不存在时，在生长培养基中的存在导致细胞死亡的其它物质产生抗性的基因。

2.报导基因。报导基因的产品在基因工程中被用作融合或者未融合的指针。一般的报导基因包括β-半乳糖苷酶(Alam等人，1990)、碱性磷酸酶(Yang等人，1997；Cullen等人，1992)和荧光素酶以及其它发光蛋白(Shinomura，1985；Phillips GN，1997；Snowdowne等人，1984)。

光子在可见光谱范围内的发射称为发光，其中该发射受激发的发射体分子的影响。与荧光不同的是，在这种情况下，能量并不由外部以较短波辐射的形式提供。

化学发光和生物发光之间存在区别。导致当受激发的电子返回到其基态时，自身发光的激发分子的化学反应称为化学发光。如果该反应受酶的催化，那么该现象称为生物发光。在反应中涉及的酶通常称为荧光素酶。

制备变种(Mutante)

为了制备变种，利用分子生物学方法在89位[Y89F](GenBank#AAA27716；SEQ ID 5的89位)和139位[Y139F](GenBank#AAA27716；SEQ ID 5的139位)嵌入突变体。为了实现该目的，使用Stratagene公司的“Quick change”方法(目录编号#200521；修正#063001b；2003版)。将(SEQ ID NO：3)和(SEQ ID NO：4)用作引物。媒介物表示为pET22b-AQdecay。

AQdecay

由于单个氨基酸被取代而显示出改变的光谱或者生化性质的发光蛋白已经在文献中进行了描述。这些发光蛋白包括奥贝林W92F(Vysotski等人，2003)和水母发光蛋白(Shrestha等人，2002；Ohmiya等人，1993)。

同发光蛋白水母发光蛋白或者其它发光蛋白相比，水母发光蛋白变种AQdecay表现出随时间变化而变化的光释放。

将造成光释放随时间变化而变化的139位突变体与89位突变体组合。89位上的改变已经得到了描述，其导致发光蛋白的光谱性质发生变化。除了表现光释放随时间变化而变化之外，所述选择的组合还表现出改变的光谱性质。可以将139位的改变与其它氨基酸的取代结合。还可以将139位的改变与剩余发光蛋白水母发光蛋白的野生型序列结合。

发光蛋白AQdecay惊人地表现出迄今尚未描述的光释放或者荧光的延迟动力学。除了通常的可能应用之外，该性质使得发光蛋白可以具体用于研究真核细胞或者其它系统中涉及非常快速钙释放的反应或者机制。光从迄今所述的发光蛋白变种或者发光蛋白野生型蛋白的释放动力学被称为“闪现”动力学，这是因为在激活(例如，用钙)之后，光在较短的时间内释放，然后反应停止或者至少变得显著较弱。为了测量该快速动力学，需要特定的测量装置。所述的发光蛋白变种AQdecay或者它的等价物，不仅使得其可以应用其它测量装置或者测量方法，而且，特别是，可以研究非常快速的动力学。该动力学可以，例如，在P2X家族的离子通道联合引发。

在470nm处具有最大值的水母发光蛋白光谱已经得到了描述(Shimomuro等人，1966)。腔肠的光谱性能已经由Shinomuro进行了考察(Shimomura等人，2000)。

发光蛋白AQdecay在氨基酸水平上显示了与得自于水母的水母发光蛋白最高程度的同源性，具有99％的同一性(示于实施例8中)。BLAST方法用于序列比较(Altschul等人，1997)。

发明内容

本发明涉及发光蛋白AQdecay，其具有由SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列。本发明同样涉及在SEQ ID NO：1中描述的核酸分子。

本发明还涉及AQdecay的功能等价物。功能等价物是那些具有可比拟的物理化学性能的蛋白质。

本发明涉及水母发光蛋白发光蛋白，其在氨基酸位置129-149，124-134的区域，优选137-141，特别是138-140(基于GenBank#AAA27716)，表现出一个或者多个导致生物发光发生变化性质的氨基酸突变体。此外，本发明涉及水母发光蛋白发光蛋白，其在139位(基于GenBank#AAA27716)，表现出导致生物发光性能发生变化的氨基酸突变体。就此而言，水母发光蛋白发光蛋白还可以为在氨基酸134-145区域表现出与截断的水母发光蛋白(GenBank#AAA27716)相似的基序的发光蛋白。就此而言，具有类似基序的区域被认为是在该区域内表现出80％等同性的序列，优选90％。

本发明涉及在氨基酸位置79-99，84-94，优选87-91，特别是88-90(基于GenBank#AAA27716)的区域内的表现出一个或者多个导致荧光光谱或者生物发光光谱产生变化的氨基酸突变体的水母发光蛋白发光蛋白，其具有在氨基酸1 39位区域内的突变体。此外，本发明涉及在89位(基于GenBank#AAA27716)表现出导致荧光光谱或者生物发光光谱发生变化的氨基酸突变体的水母发光蛋白发光蛋白，其具有氨基酸139位区域内的突变体。就此而言，优选在480-520nm的范围内显示出荧光光谱或者生物发光光谱最大值的那些发光蛋白，优选485-515nm，特别优选490-510nm、495-505nm，或者特别是在500nm。就此而言，水母发光蛋白发光蛋白还可以为在氨基酸84-94区域内表现出与截断的水母发光蛋白(GenBank#AAA27716)相似的基序的那些发光蛋白。就此而言，具有类似基序的区域被认为是在该区域内表现出80％等同性(

)的那些序列，优选90％。

根据本发明，AQdecay蛋白的功能片段或者编码所述片段的核酸是类似的。

根据本发明的其它蛋白的截断的官能片段或者编码这些片段的核酸同样构成本发明的一部分。

所述发光蛋白AQdecay适于用作细胞系统，特别是受体、离子通道、转运蛋白、转录因子或者诱导系统的报导基因。

所述发光蛋白AQdecay还适于用作标记、鉴定和表征细胞器的报导基因，特别是线粒体的报导基因。

所述发光蛋白AQdecay还适于用作确定细胞器，特别是线粒体，内外参数，特别是钙浓度，的报导基因。

所述发光蛋白AQdecay适于在细菌和真核系统(特别是哺乳动物细胞)、细菌、酵母、Bacculo、和植物中用作报导基因。

所述发光蛋白AQdecay适于结合生物发光或者化学发光系统，特别是使用荧光素酶、使用加氧酶或者使用磷酸酶的系统，用作细胞系统的报导基因。

所述发光蛋白AQdecay适于用作融合蛋白，特别是受体、离子通道、转运蛋白、转录因子、蛋白酶、激酶、磷酸二酯酶、水解酶、肽酶、转移酶、膜蛋白和糖蛋白的融合蛋白。

所述发光蛋白AQdecay适用于进行固定，特别是通过抗体、通过生物素或者通过磁性或者可磁化载体进行固定。

所述发光蛋白AQdecay适于用作能量转移系统的蛋白，特别是FRET(荧光共振能量传递)、BRET(生物发光共振能量传递)、FET(场效晶体管)、FP(荧光偏振)和HTRF(均质时间分辨荧光)系统。

所述发光蛋白AQdecay适于标记底物或者配体，特别是蛋白酶、激酶或者转移酶。

所述发光蛋白AQdecay适于在细菌系统中进行表达，特别是用于滴定度测定，或者作为生物化学系统的底物，特别是蛋白酶和激酶的底物。

所述发光蛋白AQdecay适于用作标记物，特别是偶联在抗体上、偶联的酶上、偶联在受体上或者偶联在离子通道和其它蛋白上的标记物。

所述发光蛋白AQdecay适于在寻找药理学活性化合物中作为报导基因联合使用，特别是在HTS(高通量筛选)中。

所述发光蛋白AQdecay适于在表征、鉴定和研究离子通道中作为报导基因使用，特别是p2x、TRP、SCN、KCN、CNG或者ACCN类型离子通道。

所述发光蛋白AQdecay适于用作检测系统的组件，特别是用于ELISA(酶联免疫吸附测定)、免疫组织化学、Western印迹法或者共焦显微学。

所述发光蛋白AQdecay适于用作分析相互作用的标记物，特别是蛋白质-蛋白质相互作用、DNA-蛋白质相互作用、DNA-RNA相互作用、RNA-RNA相互作用或者RNA-蛋白质相互作用(DNA：脱氧核糖核酸；RNA：核糖核酸)。

所述发光蛋白AQdecay适于用作转基因生物体中表达的标记物或者融合蛋白，特别是在小鼠、大鼠、仓鼠和其它哺乳动物、灵长类动物、鱼类、蠕虫或者植物中。

所述发光蛋白AQdecay适于用作分析胚胎发育的标记物或者融合蛋白。

所述发光蛋白AQdecay适于通过偶联介质用作标记物，特别是通过Biotin、NHS(N-羟基磺基琥珀酰亚胺)或者CN-Br。

所述发光蛋白AQdecay适于用作偶联在核酸上的指示器(Reporter)，特别是偶联在DNA或者RNA上的指示器。

所述发光蛋白AQdecay适于用作偶联在蛋白或者肽上的指示器。

所述发光蛋白AQdecay适于用作测量胞内或者胞外钙浓度的指示器。

所述发光蛋白AQdecay适于表征细胞系统中的信号级联。

与核酸或者肽偶联的发光蛋白AQdecay适于用作探针，特别是用于Northern印迹、Southern印迹、Western印迹、ELISA、核酸排序、蛋白质分析或者碎片分析的探针。

所述发光蛋白AQdecay适用于标记药理学制剂，特别是感染药物、抗体或者“小分子”。

所述发光蛋白AQdecay适用于地质研究，特别是海洋、地下水和河流。

所述发光蛋白AQdecay适于在表达系统中进行表达，特别是体外翻译系统、细菌系统、酵母系统、杆状病毒系统、病毒系统或者真核系统。

所述发光蛋白AQdecay适于在外科手术中直观观察组织或者细胞，特别是在侵入性手术、非侵入性手术和最少量侵入性手术中。

所述发光蛋白AQdecay还适于标记肿瘤组织和其它表型改变的组织，特别是在组织学研究或者在外科手术中。

本发明还涉及发光蛋白AQdecay的纯化，特别是为野生型蛋白质、融合蛋白质或者诱变处理蛋白质的发光蛋白AQdecay的纯化。

所述发光蛋白AQdecay适于在表达系统中同时测量不同的报导基因(多路技术)。

本发明还涉及发光蛋白AQdecay在化妆品领域的应用，特别是沐浴添加剂、洗液、肥皂、人体染料、牙膏和面霜领域。

本发明还涉及发光蛋白AQdecay用于染色的应用，特别是食物、沐浴添加剂、油墨、纺织物和塑料。

本发明还涉及发光蛋白AQdecay用于对纸染色的应用，特别是贺卡、纸制品、壁纸和手工艺品。

本发明还涉及发光蛋白AQdecay用于染色液体的应用，特别是玩具喷水枪、喷泉、饮料和冰。

本发明还涉及发光蛋白AQdecay用于生产消遣品的应用，特别是指画和装饰。

本发明涉及编码由SEQ ID NO：2或者其功能等价物或者功能片段揭示的多肽的核酸分子。

本发明进一步涉及核酸分子或者其功能等价物或者功能片段，其选自：

a)编码包含由SEQ ID NO：2揭示的氨基酸序列的多肽的核酸分子；

b)含有SEQ ID NO：1所表明的序列的核酸分子；

c)在严格条件下，其互补链与a)或者b)的核酸分子杂交并且其表达产物表现出发光蛋白的生物功能的核酸分子；

核酸分子的严格杂交在68℃下，在含有0.2×SSC(1×标准盐水-柠檬酸盐＝150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)的水溶液中进行(Sambrook等人，1989)；

d)由于遗传密码的退化而不同于c)中记载的核酸分子。

本发明涉及上述核酸分子，其中所述序列含有功能启动子5′至发光蛋白-编码序列或者至编码前导序列或者信号序列的序列。

本发明还涉及如先前所述的核酸分子，其形成部分重组DNA或者RNA媒介物。

本发明涉及包含所述媒介物的有机体。

本发明涉及通过先前所述的核苷酸序列编码的发光蛋白。

本发明涉及在细菌、真核细胞或者体外表达系统中表达根据本发明的发光蛋白多肽的方法。

本发明还涉及纯化/分离根据本发明的发光蛋白多肽的方法。

本发明涉及根据本发明的发光蛋白-编码核酸作为标记基因或者报导基因的用途，特别是用于寻找药理学活性化合物和用于诊断学。

本发明涉及根据本发明的发光蛋白或者根据本发明的发光蛋白-编码核酸分别作为标记物或者指示器或作为标记基因或者报导基因的用途。

本发明涉及发光蛋白AQdecay(SEQ ID NO：2)或者它的功能片段或者等价物、或涉及发光蛋白AQdecay-编码核酸或者它的功能片段或者等价物分别作为标记物或者指示器或作为标记基因或者报导基因的用途，特别是用于寻找药理学活性化合物和用于诊断学。

本发明涉及在SEQ ID NO：1中表明的核酸作为标记基因或者报导基因的用途，特别是用于寻找药理学活性化合物和用于诊断学。

本发明还涉及识别根据本发明的多肽的多克隆或者单克隆抗体。

本发明还涉及识别发光蛋白AQdecay(SEQ ID NO：2)的单克隆或者多克隆抗体。

本发明还涉及如前一段落所述的核酸，其含有功能启动子5′至编码序列。

本发明包括含有先前所述的核酸的重组DNA或者RNA媒介物。

含有如先前所述的媒介物的有机体同样对应于本发明。

通过如上所述的核酸序列编码的多肽同样构成本发明的一部分。

按照本发明还涉及在细菌、真核细胞或者体外表达系统中表达先前所记载的多肽的方法。

纯化/分离根据本发明的多肽的方法同样构成本发明的一部分。

本发明涉及根据本发明的核酸作为标记基因或者报导基因的用途。

本发明还涉及根据本发明的发光蛋白作为标记物或者指示器的用途。

根据本发明的多肽结合一种或者多种荧光素酶和/或一种或者多种发光蛋白的用途也构成本发明的一部分。

在129-149，124-134，优选137-141，特别是138-140区域(基于GenBank#AAA27716)具有一个或者多个突变体并且表现出改变的，特别是延迟的生物发光信号的发光蛋白或者其功能片段对应于本发明。

包含编码根据前两个段落的蛋白质的序列的核酸分子同样对应于本发明。

此外，本发明的一部分涉及制备发光蛋白的方法，其特征在于，基于GenBank#AAA27716，将一个或者多个突变体引入到发光蛋白的129-149，124-134位限定的区域，优选137-141，特别是138-140位限定的区域，由此导致生物发光发生变化。

通过如前一段落所述的方法制备的发光蛋白同样对应于本发明。

本发明还涉及其它发光蛋白，其由于氨基酸序列上的一个或者多个改变而显示出改变的光释放动力学。

本发明还涉及其它改变的发光蛋白用于发光蛋白AQdecay的所述应用的用途。

具有改变的光释放动力学，特别是其中光释放被延迟的光释放或者延迟的持续时间的发光蛋白特别适于在基于细胞的方法中用作报导基因，特别是在寻找和表征药理学活性化合物中和特别是在诊断学中。

具有改变的光释放动力学，特别是其中光释放被延迟的光释放或者延迟的持续时间的发光蛋白特别适于研究离子通道。

本发明还涉及根据本发明的蛋白质的密码子得到最优化的变体，以改变其生物化学或者物理化学性能，特别是改良的表达，特别是改变的稳定性。

本发明还涉及根据本发明的蛋白质与识别肽的融合，以将根据本发明的蛋白质运送或者定位于细胞器或者隔区中。

本发明还涉及根据本发明的蛋白质的变体，其导致蛋白质在光谱性能、发光强度、底物特异性、辅因子的使用、钙亲合性或者其它物理化学或者生化性能上发生变化。

本发明发光蛋白的表达

在基因已经被引入到适宜的宿主细胞之后，使得被克隆入表达载体的异体基因能够被转录和翻译的分子的形成被称为表达。表达载体含有在原核或者真核细胞中表达基因所需的控制信号。

原则上，表达载体可以以两种不同的方式进行构造。在称为转录融合的情形中，被克隆异体基因编码的蛋白质被合成为可信的、生物学活性的蛋白质。基于该目的，表达载体带有全部表达所需的5′和3′控制信号。

在称为翻译融合的情形中，被克隆异体基因编码的蛋白质与另一种可以被轻易检测的蛋白质一起表达为杂化蛋白。对表达所需的5′和3′控制信号，包括起始密码子以及可能的编码欲形成的杂化蛋白的N-末端区域的部分序列来源于媒介物。在多数情况下，其它嵌入的蛋白质部分不仅稳定通过克隆异体基因编码的蛋白质，防止其被细胞蛋白酶裂解；而且还用于检测和分离所形成的杂化蛋白。所述表达可以或者短暂地或者稳定地进行。适宜的宿主有机体为细菌、酵母、病毒或者真核系统。

本发明发光蛋白的纯化

蛋白质的分离(在它们也被过表达之后)通常称为蛋白质纯化。可以使用多种已经证实的方法和工艺纯化蛋白质。

固体/液体分离是涉及蛋白质分离的基本操作。当从培养介质中分离细胞时，当使细胞断裂和除去细胞碎片之后净化粗提取物时，和在沉淀之后分离沉积物等等时，都需要该工艺步骤。它通过离心和过滤的方式进行。

为了获得胞内蛋白质，必须将细胞壁破坏或者使其可渗透。取决于度量和有机体，可以将高压匀浆器或者搅拌器球磨机或者玻璃珠研磨机用于该目的。其中在实验室规模时，使用机械细胞粉碎机和超声波处理。

在胞外蛋白质的情形和在胞内蛋白质的情形中(在细胞分裂之后)，多种使用盐(特别是硫酸铵)或者有机溶剂(醇或者丙酮)的沉淀方法都代表着浓缩蛋白质的快速和经济方法。当对胞内蛋白质进行纯化时，可以合意地除去可溶性核酸(用，例如硫酸链霉素或者鱼精蛋白硫酸盐进行沉淀)。当对胞外蛋白质进行分离时，为了获得易于处理的沉积物，通常将载体(例如淀粉或者硅藻土)在加入沉淀剂之前加入。

为了获得高度纯化，可以使用多种层析法和分离法(吸收色谱学和离子交换色谱法、凝胶过滤、亲和色谱法和电泳法)。在工业规模上，还使用柱色谱法。可以每步纯化因子最高达数百的亲和色谱法对于实验室规模是特别重要的。

胞外蛋白质在相对较稀的溶液中繁殖。正如胞外蛋白质一样，在进一步使用之前，必要要对它们进行浓缩。除了上述已经记载的方法之外，在工业规模上，超过滤法也被证实是有价值的。

作为蛋白质的夹带物质的无机盐对于特定应用常常是不期望的。它们可以通过特别是凝胶过滤、渗析和渗透过滤(Diafiltration)除去。

多种蛋白质作为无水制剂使用。重要的干燥方法为真空干燥、冷冻干燥和喷雾干燥。

核苷酸和氨基酸序列

发光蛋白AQdecay通过以下核苷酸序列(SEQ ID NO：1)进行编码：

5`-

ATGTCAGTCAAGCTTACACCAGACTTCGACAACCCAAAATGGATTGGACGACACAAGC

ACATGTTTAATTTTCTTGATGTCAACCACAATGGAAGGATCTCTCTTGACGAGATGGTC

TACAAGGCGTCCGATATTGTTATAAACAATCTTGGAGCAACACCTGAACAAGCCAAAC

GTCACAAAGATGCTGTAGAAGCCTTCTTCGGAGGAGCTGGAATGAAATATGGTGTAGA

AACTGAATGGCCTGAATTTATCGAAGGATGGAAAAGACTGGCTTCCGAGGAATTGAA

AAGGTATTCAAAAAACCAAATCACACTTATTCGTTTATGGGGTGATGCATTGTTCGAT

ATCATTGACAAAGACCAAAATGGAGCTATTTCACTGGATGAATGGAAAGCATTCACCA

AATCTGCTGGCATCATCCAATCGTCAGAAGATTGCGAGGAAACATTCAGAGTGTGCGA

TATTGATGAAAGTGGACAGCTCGATGTTGATGAGATGACAAGACAACATTTAGGATTT

TGGTACACCATGGATCCTGCTTGCGAAAAGCTCTACGGTGGAGCTGTCCCCTAA-3`.

这得到了以下(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列：

MTSEQYSVKLTPDFDNPKWIGRHKHMFNFLDVNHNGRISLDEMVYKASDIVINNLGATPE

QAKRHKDAVEAFFGGAGMKYGVETEWPEFIEGWKRLASEELKRYSKNQITLIRLWGDAL

FDIIDKDQNGAISLDEWKAFIKSDGIIQSSEDCEETFRVCDIDESGQLDVDEMTRQHLGFW

YTMDPACEKLYGGAVP

引物：

(SEQ ID NO：3)：

5’-GAATGGCCTGAATTTATCGAAGGATGGAA-3’

(SEQ ID NO：4)：

5’-TTCCATCCTTCGATAAATTCAGGCCATTC-3’

(SEQ ID NO：5)：

5’-GAATGGAAAGCATTCACCAAATCTGCTG-3’

(SEQ ID NO：6)：

5’-CAGCAGATTTGGTGAATGCTTTCCATTC-3’

发光蛋白水母发光蛋白(Genbank：AAA27716)具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。89和139位以粗体和下划线印刷。

MTSEQYSVKLTPDFDNPKWIGRHKHMFNFLDVNHNGRISLDEMVYKASDIVINNLGATPE

QAKRHKDAVEAFFGGAGMKYGVETEWPE

IEGWKRLASEELKRYSKNQITLIRLWGDAL

FDIIDKDQNGAISLDEWKA

TKSDGIIQSSEDCEETFRVCDIDESGQLDVDEMTRQHLGFW

YTMDPACEKLYGGAVP

这些序列又在序列表中找到。

附图简述

图1：图1显示了媒介物pET22b-AQdecay的质粒图。

图2：图2显示了媒介物pcDNA3-AQdecay的质粒图。

图3：图3显示了AQdecay在CHO细胞中真核表达的结果。该试验如实施例4所述进行。(Y＝相对光单元，RLU；X＝logATP浓度/mol/l)

图4：图4显示了AQdecay的细菌表达的结果。该试验如实施例3所述进行。(Y＝相对光单元，RLU；X＝时间(以秒为单位)；黑曲线：AQdecay；灰色曲线：野生型水母发光蛋白)

图5：图5显示了AQdecay(在CHO细胞表达)的生物发光动力学。该试验如实施例4所述进行。(Y＝相对光单元，RLU；X＝时间(以秒为单位)；黑曲线：Aqdecay；灰色曲线：野生型水母发光蛋白)。

具体实施方式

实施例

实施例1

为了制备变种，借助于分子生物学方法将突变体嵌入到132位(截断水母发光蛋白的132位；GenBank#AAA27716)。为了实现该目的，使用Stragene公司(USA)提供的“Quick change”方法。使用的引物为(SEQ ID NO：3)和(SEQ ID NO：4)。将cDNA嵌入到媒介物pET22b(Novagen)的NdeI/XhoI切割位点中。媒介物表示为pET22b-AQdecay。

图1显示了媒介物pET22b-AQdecay的质粒图。

实施例2

将Clontech公司提供的质粒pcDNA3.1(+)用作制备如下所述构造的媒介物。将所述媒介物的衍生物表示为pcDNA3-AQdecay。媒介物pcDNA3-AQdecay用于在真核系统中表达AQdecay。

图2显示了媒介物pcDNA3-AQdecay的质粒图。

实施例3

细菌表达

通过用表达质粒pET22b-AQdecay转化细菌，细菌在大肠杆菌中的表达得到实现。在LB介质中在37℃下将转化的细菌培养3小时，和其表达根据制造商(Novagen)指导书进行诱发。通过离心收集诱发的细菌，将其再悬浮于50mM Tris/HCl(pH 9.0)+5mM EDTA中并且通过超声处理使其断裂。然后，在13000rpm(16000rcf)下将所得溶胞产物离心15分钟，并且将上清液除去。在暗处，用腔肠(在Tris/HCl pH9.0中的10E-07 M腔肠)将上清液(用Tris/HCl pH 9.0稀释的1∶5；1∶10；1∶20和1∶50稀释物)培养3小时。在加入5mM氯化钙之后，立即在光度计中对生物发光进行测量。测定累积时间为40秒。

图4显示了AQdecay在细菌中生物发光测量的动力学。

实施例4

真核表达

结构真核表达在CHO细胞中进行，所述CHO细胞是瞬态实验中用表达质粒pcDNA3-AQdecay和pcDNA3.1(+)转染细胞而得到的CHO细胞。对此，将在DMEM-F12介质中的10000个细胞/孔从96-孔微过滤板中滤出，并且在37℃下将板培养过夜。使用Fugene 6试剂盒(Roche)，根据制造商指导书，转染得到实现。在37℃下，在DMEM-F12介质中将转染的细胞培养过夜。然后将介质除去和替换为50ul腔肠(在PBS中的10E-07M腔肠)。在28℃下将细胞培养24小时，在此之后将ATP(腺苷三磷酸)加入其中直至最终浓度为1μM。在此次加入之后，立即启动光度计进行测量。累积时间为1秒，总测定持续时间为60秒。

图3显示了在CHO细胞中AQdecay生物发光测定的结果。

图5显示了在CHO细胞中AQdecay生物发光测定的动力学。

实施例5

BLAST

氨基酸水平的AQdecay的BLAST分析的结果

＞emb|CAC93774.1|未命名的蛋白产品[Aequorea victoria]

长度＝196，记分＝410节(1054)，预期＝e-113，同一性＝194/196(98％)，阳性＝196/196(100％)

＞pir||A26623水母发光蛋白-1前体-水螅水母类(Aequorea victoria)sp|P07164|AEQl_AEQVI水母发光蛋白1前体gb|AAA27716.1|水母发光蛋白1前体

＞gb|AAB14842.1|专利US 5541309的序列1gb|AAA55424.1|专利EP0187519的序列2

长度＝196，记分＝407节(1046)，预期＝e-113，同一性＝193/196(98％)，阳性＝195/196(99％)

＞gb|AAB14845.1|专利US5541309的序列4

长度＝196，记分＝405节(1041)，预期＝e-112，同一性＝192/196(97％)，阳性＝194/196(98％)

＞gb|AAB14846.1|专利US5541309的序列5

长度＝196，记分＝405节(1040)，预期＝e-112，同一性＝192/196(97％)，阳性＝194/196(98％)

＞gb|AAB14844.1|专利US5541309的序列3

＞emb|CAC93778.1|未命名的蛋白产品[Aequorea victoria]

长度＝196，记分＝402节(1034)，预期＝e-111，同一性＝191/196(97％)，阳性＝193/196(98％)

＞dbj|BAC81730.1|apoaequorin[Aequorea victoria]

长度＝196，记分＝401节(1031)，预期＝e-111，同一性＝189/196(96％)，阳性＝195/196(99％)

＞emb|CAC93779.1|未命名的蛋白产品[Aequorea victoria]

长度＝196，记分＝400节(1029)，预期＝e-111，同一性＝190/196(96％)，阳性＝192/196(97％)

＞emb|CAC93780.1|未命名的蛋白产品[Aequorea victoria]

长度＝196，记分＝400节(1028)，预期＝e-110，同一性＝190/196(96％)，阳性＝192/196(97％)

＞pdb|1SL8|A链A，得自于Aequorea Victoria的负载钙的Apo-水母发光蛋白

长度＝191，记分＝395节(1015)，预期＝e-109，同一性＝187/190(98％)，阳性＝189/190(99％)

＞gb|AAB14843.1|专利US5541309的序列2

长度＝189，记分＝394节(1011)，预期＝e-108，同一性＝186/189(98％)，阳性＝188/189(99％)

＞emb|CAC93777.1|未命名的蛋白产品[Aequorea victoria]

长度＝189，记分＝391节(1005)，预期＝e-108，同一性＝185/189(97％)，阳性＝187/189(98％)

＞emb|CAC93781.1|未命名的蛋白产品[Aequorea victoria]

长度＝189，记分＝391节(1004)，预期＝e-108，同一性＝184/189(97％)，阳性＝187/189(98％)

＞emb|CAC93775.1|未命名的蛋白产品[Aequorea victoria]

长度＝196，记分＝384节(985)，预期＝e-105，同一性＝176/196(89％)，阳性＝192/196(97％)

＞dbj|BAC81731.1|apoaequorin[Aequorea victoria]

长度＝196，记分＝384节(985)，预期＝e-105，同一性＝176/196(89％)，阳性＝192/196(97％)。

实施例6

BLAST

核酸水平的AQdecay的BLAST分析的结果

＞gb|M16103.1|AEVAEQAA.Victoria(水母)水母发光蛋白1mRNA，完全cds

长度＝672，记分＝1104节(557)，预期＝0.0，同一性＝569/573(99％)

＞dbj|AB103337.1|apoaequorin的Aequorea victoria mRNA，克隆：UTAEQ04

长度＝591，记分＝961节(485)，预期＝0.0，同一性＝551/573(96％)

＞dbj|AB103338.1|apoaequorin的Aequorea victoria mRNA，克隆：UTAEQ09

长度＝591，记分＝739节(373)，预期＝0.0，同一性＝523/573(91％)

＞gb|L29571.1|AEVAQ440X Aequorea victoria水母发光蛋白(AQ440)mRNA，完全cds

长度＝925，记分＝731节(369)，预期＝0.0，同一性＝522/573(91％)

＞gb|M11394.1|AEVAEQD Aequorea victoria(水母)水母发光蛋白mRNA，完全cds

长度＝861，记分＝731节(369)，预期＝0.0，同一性＝522/573(91％)

＞dbj|AB103336.1|apoaequorin的Aequorea victoria mRNA，克隆：UTAEQ01

长度＝591，记分＝724节(365)，预期＝0.0，同一性＝521/573(90％)

＞dbj|AB103339.1|apoaequorin的Aequorea victoria mRNA，克隆：UTAEQ 11

长度＝591，记分＝716节(361)，预期＝0.0，同一性＝520/573(90％)

＞gb|AY601106.1|Aequorea victoria水母发光蛋白mRNA，完全cds

长度＝600，记分＝716节(361)，预期＝0.0，同一性＝517/569(90％)

＞gb|AY604002.1|Aequorea victoria克隆AEQ_V44A改性的水母发光蛋白mRNA，完全cds

长度＝600，记分＝708节(357)，预期＝0.0，同一性＝516/569(90％)

＞gb|AY604001.1|Aequorea victoria克隆AEQ_Q168R改性的水母发光蛋白mRNA，完全cds

长度＝600，记分＝708节(357)，预期＝0.0，同一性＝516/569(90％)

＞gb|AY604000.1|Aequorea victoria克隆AEQN26D改性的水母发光蛋白mRNA，完全cds

长度＝600，记分＝708节(357)，预期＝0.0，同一性＝516/569(90％)

＞gb|AY603999.1|Aequorea victoria克隆AEQ_L170I改性的水母发光蛋白mRNA，完全cds

长度＝600，记分＝708节(357)，预期＝0.0，同一性＝516/569(90％)

＞gb|AY603998.1|Aequorea victoria克隆AEQ_F149S改性的水母发光蛋白mRNA，完全cds

长度＝600，记分＝708节(357)，预期＝0.0，同一性＝516/569(90％)

＞gb|AY603997.1|Aequorea victoria克隆AEQ_E35G改性的水母发光蛋白mRNA，完全cds

长度＝600，记分＝708节(357)，预期＝0.0，同一性＝516/569(90％)

＞gb|AY603996.1|Aequorea victoria克隆AEQ_E128G改性的水母发光蛋白mRNA，完全cds

长度＝600，记分＝708节(357)，预期＝0.0，同一性＝516/569(90％)

＞gb|AY603995.1|Aequorea victoria克隆AEQ_D153G改性的水母发光蛋白mRNA，完全cds

长度＝600，记分＝708节(357)，预期＝0.0，同一性＝516/569(90％)

＞gb|AY603994.1|Aequorea victoria克隆AEQ_D117G改性的水母发光蛋白mRNA，完全cds

长度＝600，记分＝708节(357)，预期＝0.0，同一性＝516/569(90％)

＞gb|AY603993.1|Aequorea victoria克隆AEQ-Q168A-L170V改性的水母发光蛋白mRNA，完全cds

长度＝600，记分＝676节(341)，预期＝0.0，同一性＝512/569(89％)。

实施例7

图7显示了氨基酸水平的具有水母发光蛋白(野生型；wt)的AQdecay的顺序(Alignment)

WT MTSEQYSVKLTPDFDNPKWIGRHKHMFNFLDVNHNGRISLDEMVYKASDIVINNL

DECAY MTSEQYSVKLTPDFDNPKWIGRHKHMFNFLDVNHNGRISLDEMVYKASDIVINNL

WT GATPEQAKRHKDAVEAFFGGAGMKYGVETEWPEFIEGWKRLASEELKRYSKNQIT

DECAY GATPEQAKRHKDAVEAFFGGAGMKYGVETEWPEYIEGWKRLASEELKRYSKNQIT

WT LIRLWGDALFDIIDKDQNGAISLDEWKAFTKSDGIIQSSEDCEETFRVCDIDESG

DECAY LIRLWGDALFDIIDKDQNGAISLDEWKAYTKSDGIIQSSEDCEETFRVCDIDESG

WT QLDVDEMTRQHLGFWYTMDPACEKLYGGAVP

DECAY QLDVDEMTRQHLGFWYTMDPACEKLYGGAVP

实施例8

在细菌中表达的AQdecay的动力学分析

为了动力学分析AQdecay的生物发光，用pET22b-AQdecay或者pET22b(没有结合的cDNA)对大肠杆菌BL21(DE3)进行转化。如实施例3所述进行细菌的繁殖和断裂。利用1秒钟的累积时间，将测量数据收集60秒的时间。

图4显示了AQdecay在细菌中的动力学分析结果。

实施例9

在CHO细胞中表达的AQdecay的动力学分析

为了动力学分析AQdecay的生物发光，用pcDNA3-AQdecay或者pcDNA3(没有结合的cDNA)对CHO(中国仓鼠卵巢细胞)细胞进行短暂转染。如实施例4所示进行转染和测量。利用1秒钟的累积时间，将测量数据收集60秒的时间。

图5显示了AQdecay在CHO细胞中的动力学分析结果。

实施例10

在多路化试验中使用AQdecay

发光蛋白Aqdecay适于在多路化读出方法用作组分，在多路化读出方法中将多种报导基因(例如荧光素酶或者发光蛋白)用于试验混合物中。对此，将AQdecay表达的CHO细胞以1.1(或者1∶2，1∶3，...)的比例与表达野生型水母发光蛋白的CHO细胞混合。表达野生型水母发光蛋白的细胞另外表达G蛋白偶联受体(例如神经介肽U受体2)。将细胞混合物置于96-孔、384-孔或者1536-孔微滴定板上，然后在37℃下将其培养24小时。

然后，用腔肠对细胞进行负载(如实施例4所示)。加入G蛋白受体激动剂导致钙在胞内释放，该释放可以利用野生型水母发光蛋白读出(通过野生型水母发光蛋白进行的光释放)。第二细胞类型的AQdecay可以通过随后加入活化CHO内源性受体的激动剂(例如ATP)得到活化。

实施例11

在细胞器或者隔室中定位AQdecay

为了运送入或者定位于特定细胞小室或者细胞器中，发光蛋白AQdecay或者其等价物适于与肽、前导序列、易位信号、蛋白质或者蛋白质片段融合。为了运送和随后进行定位，使发光蛋白AQdecay，根据本发明的发光蛋白与肽MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSLPPEGKL融合。AQdecay氨基酸序列上游肽的融合导致融合蛋白质移位入真核宿主细胞的线粒体内。线粒体定位的发光蛋白AQdecay可以用于测量线粒体内的钙浓度。借助于分子生物学标准方法，AQdecay发光蛋白的氨基酸序列上游的所述肽的融合可以在核酸水平上得到实现。

参考文献/专利

US 6,495,355

US 5,541,309

US 5,093,240

US-0908909

US 6,152,358

JP-0176125

GB-0024357

WO03006497

WO200168824

Alam J，Cook JL.Reporter genes：application to the study of mammalian gene transcription.AnalBiochem.1990 Aug 1；188(2)：245-54

Altschul，Stephen F.，Thomas L. Madden，Alejandro A.

，Jinghui Zhang，ZhengZhang，Webb Miller，和David J.Lipman(1997)；Gapped BLAST and PSI-BLAST：a newgeneration of protein database search programs；Nucleic Acids Res.25：3389-3402

Chiesa A，Rapizzi E，Tosello V，Pinton P，de Virgilio M，Fogarty KE，Rizzuto R.Recombinantaequorin and green fluorescent protein as valuable tools in the study of cell signalling.Biochem J.2001 Apr 1；355(Pt 1)：1-12.

Claros，M.G.，Vincens，P.(1996)；Computational method to predict mitochondrially importedproteins and their targeting seqeunces.Eur.J.Biochem 241，779-786.

Cullen Bryan R.，Malim Michael H.，Secreted placental alkaline phosphatase as a eukaryoticreporter gene.Methods in Enzymology.216：362ff

Fagan TF，Ohmiya Y，Blinks JR，Inouye S，Tsuji FI.Cloning，expression and sequence analysisof cDNA for the Ca(2+)-binding photoprotein，mitrocomin.FEBS Lett.1993 Nov 1；333(3)：301-5

Hastings，J.W.和Morin，J.G.(1969)Comparative biochemistry of calcium-activatedphotoproteins from the ctenophore，Mnemiopsis and the coelenterates Aequorea，Obelia，andPelagia.Biol.Bull.137，402.

Haddock SH，Rivers TJ，Robison BH.Can coelenterates make coelenterazine？Dietaryrequirement for luciferin in cnidarian bioluminescence.Proc Natl Acad Sci USA 2001 Sep25；98(20)：11148-51

Inouye S，Tsuji FI.(1994)Aequorea green fluorescent protein.Expression of the gene andfluorescence characteristics of the recombinant protein.FEBS Lett 1994 Mar 21；341(2-3)：277-80

Inouye S，Tsuji FI.Cloning and sequence analysis of cDNA for the Ca(2+)-activatedphotoprotein，clytin.FEBS Lett.1993 Jan 11；315(3)：343-6.

Illarionov BA，Bondar VS，Illarionova VA，Vysotski ES.Sequence of the cDNA encoding theCa(2+)-activated photoprotein obelin from the hydroid polyp Obelia longissima.Gene.1995 Feb14；153(2)：273-4.

Jones K，Hibbert F，Keenan M.Glowing jellyfish，luminescence and a molecule calledcoelenterazine.Trends Biotechnol 1999 Dec；17(12)：477-81

Johnson，F.H.，Shimomura，O.，Saiga，Y.，Gershman，L.C.，Reynolds，G.T.，and Waters，J.R.(1962)Quantum efficiency of Cypridina luminescence，with a note on that of Aequorea.J.CellComp.Physiol.60，85-103.

Morin，J.G.和Hastings，J.W.(1971)Biochemistry of the bioluminescence of colonial hydroidsand other coelenterates.J.Cell.Physiol.77，305-311.

Ohmiya Y，Tsuji FI.Bioluminescence of the Ca(2+)-binding photoprotein，aequorin，afterhistidine modification.FEBS Lett.1993 Apr 12；320(3)：267-70.

Phillips GN.Structure and dynamics of green fluorescent protein.Curr Opin Struct Biol.1997Dec；7(6)：821-7

Sambrook，J.，Fritsch，E.Maniatis，T.1989，Molecular cloning.A laboratory manual Vol 1-3，Cold Spring Harbor，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press

Shimomura O，Johnson FH.Properties of the bioluminescent protein aequorin.Biochemistry.1969 Oct；8(10)：3991-7

Shimomura O.，Bioluminescence in the sea：photoprotein systems.Symp Soc Exp Biol.1985；39：351-72

Shimomura，O.和Teranishi K.(2000)Luminescence 15，51-58.

Shimomura O.Isolation and properties of various molecular forms of aequorin.Biochem J.1986 Mar 1；234(2)：271-7.

Shimomura，O.和Johnson，F.H.(1966)in：Bioluminescence in Progress(Johnson，F.H.andHaneda，Y.，Eds.)pp.496-521，Princeton University Press，Princeton，NJ.

Shrestha S，Paeng IR，Deo SK，Daunert S.Cysteine-free mutant of aequorin as a photolabel inimmunoassay development.Bioconjug Chem.2002 Mar-Apr；13(2)：269-75

Snowdowne KW，Borle AB.Measurement of cytosolic free calcium in mammalian cells withaequorin.Am J Physiol.1984 Nov；247(5 Pt 1)：C396-408.

Vysotski ES，Liu ZJ，Markova SV，Blinks JR，Deng L，Frank LA，Herko M，Malikova NP，Rose JP，Wang BC，Lee J.Violet bioluminescence and fast kinetics from W92F obelin：structure-based proposals for the bioluminescence triggering and the identification of the emitting species.Biochemistry.2003 May 27；42(20)：6013-24.

Ward，W.W.(1998)Biochemical and physical properties of green fluorescent protein.In：GreenFluorescent Protein：Properties，Applications，and Protocols(Chalfie，M.and Kain，S.，eds)pp.45-70.Wiley-Liss，Inc.

Yang Te-Tuan，Sinai Parisa，Kitts Paul A.Kain Seven R.，Quantification of gene expresssionwith a secreted alkaline phosphatase reporter system.Biotechnique.1997 23(6)1110ff

序列表

<110>Bayer HealthCare AG

<120>分离的发光蛋白AQdecay及其应用

<130>BHC 051042

<160>7

<170>专利版本3.3

<210>1

<211>576

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>水母发光蛋白突变体

<400>1

atgtcagtca agcttacacc agacttcgac aacccaaaat ggattggacg acacaagcac 60

atgtttaatt ttcttgatgt caaccacaat ggaaggatct ctcttgacga gatggtctac 120

aaggcgtccg atattgttat aaacaatctt ggagcaacac ctgaacaagc caaacgtcac 180

aaagatgctg tagaagcctt cttcggagga gctggaatga aatatggtgt agaaactgaa 240

tggcctgaat ttatcgaagg atggaaaaga ctggcttccg aggaattgaa aaggtattca 300

aaaaaccaaa tcacacttat tcgtttatgg ggtgatgcat tgttcgatat cattgacaaa 360

gaccaaaatg gagctatttc actggatgaa tggaaagcat tcaccaaatc tgctggcatc 420

atccaatcgt cagaagattg cgaggaaaca ttcagagtgt gcgatattga tgaaagtgga 480

cagctcgatg ttgatgagat gacaagacaa catttaggat tttggtacac catggatcct 540

gcttgcgaaa agctctacgg tggagctgtc ccctaa 576

<210>2

<211>196

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>水母发光蛋白突变体

<400>2

Met Thr Ser Glu Gln Tyr Ser Val Lys Leu Thr Pro Asp Phe Asp Asn

1 5 10 15

Pro Lys Trp Ile Gly Arg His Lys His Met Phe Asn Phe Leu Asp Val

20 25 30

Asn His Asn Gly Arg Ile Ser Leu Asp Glu Met Val Tyr Lys Ala Ser

35 40 45

Asp Ile Val Ile Asn Asn Leu Gly Ala Thr Pro Glu Gln Ala Lys Arg

50 55 60

His Lys Asp Ala Val Glu Ala Phe Phe Gly Gly Ala Gly Mat Lys Tyr

65 70 75 80

Gly Val Glu Thr Glu Trp Pro Glu Phe Ile Glu Gly Trp Lys Arg Leu

85 90 95

Ala Ser Glu Glu Leu Lys Arg Tyr Ser Lys Asn Gln Ile Thr Leu Ile

100 105 110

Arg Leu Trp Gly Asp Ala Leu Phe Asp Ile Ile Asp Lys Asp Gln Asn

115 120 125

Gly Ala Ile Ser Leu Asp Glu Trp Lys Ala Phe Thr Lys Ser Asp Gly

130 135 140

Ile Ile Gln Ser Ser Glu Asp Cys Glu Glu Thr Phe Arg Val Cys Asp

145 150 155 160

Ile Asp Glu Ser Gly Gln Leu Asp Val Asp Glu Met Thr Arg Gln His

165 170 175

Leu Gly Phe Trp Tyr Thr Met Asp Pro Ala Cys Glu Lys Leu Tyr Gly

180 185 190

Gly Ala Val Pro

195

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

gaatggcctg aatttatcga aggatggaa 29

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

ttccatcctt cgataaattc aggccattc 29

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

gaatggaaag cattcaccaa atotgctg 28

<210>6

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

cagcagattt ggtgaatgct ttccattc 28

<210>7

<211>196

<212>PRT

<213>Aequoria victoria

<400>7

Met Thr Ser Glu Gln Tyr Ser Val Lys Leu Thr Pro Asp Phe Asp Asn

1 5 10 15

Pro Lys Trp Ile Gly Arg His Lys His Met Phe Asn Phe Leu Asp Val

20 25 30

Asn His Asn Gly Arg Ile Ser Leu Asp Glu Met Val Tyr Lys Ala Ser

35 40 45

Asp Ile Val Ile Asn Asn Leu Gly Ala Thr Pro Glu Gln Ala Lys Arg

50 55 60

His Lys Asp Ala Val Glu Ala Phe Phe Gly Gly Ala Gly Met Lys Tyr

65 70 75 80

Gly Val Glu Thr Glu Trp Pro Glu Tyr Ile Glu Gly Trp Lys Arg Leu

85 90 95

Ala Ser Glu Glu Leu Lys Arg Tyr Ser Lys Asn Gln Ile Thr Leu Ile

100 105 110

Arg Leu Trp Gly Asp Ala Leu Phe Asp Ile Ile Asp Lys Asp Gln Asn

115 120 125

Gly Ala Ile Ser Leu Asp Glu Trp Lys Ala Tyr Thr Lys Ser Asp Gly

130 135 140

Ile Ile Gln Ser Ser Glu Asp Cys Glu Glu Thr Phe Arg Val Cys Asp

145 150 155 160

Ile Asp Glu ser Gly Gln Leu Asp Val Asp Glu Met Thr Arg Gln His

165 170 175

Lau Gly Phe Trp Tyr Thr Met Asp Pro Ala Cys Glu Lya Lau Tyr Gly

180 185 190

Gly Ala Val Pro

195

Claims

1.核酸分子或者其功能片段，其选自：

b)含有SEQ ID NO：1所表明的序列的核酸分子；

d)由于遗传密码的退化而不同于c)中记载的核酸分子。

2.多肽或者其功能片段，其通过根据权利要求1的核酸序列进行编码并且具有发光蛋白的性能。

3.发光蛋白或者其功能片段，基于SEQ ID NO：7，其在129至149位具有一个或多个突变体并且表现出随时间改变而改变的生物发光。

4.发光蛋白或者其功能片段，基于SEQ ID NO：7，其在139位具有突变体并且表现出随时间改变而改变的生物发光。

5.核酸分子，其包含编码根据权利要求3和4的蛋白的序列。

6.根据权利要求1或5的核酸，其含有功能启动子5′至编码序列。

7.重组DNA或者RNA媒介物，其含有根据权利要求6的核酸。

8.有机体，其包含根据权利要求7的媒介物。

9.低聚核苷酸，其具有多于10个与根据权利要求1或5的核酸分子的结构序列等同或者互补的连续核苷酸。

10.在细菌、真核细胞或者体外表达系统中表达根据权利要求2、3或者4的多肽的方法。

11.纯化/分离已经根据权利要求10表达的发光蛋白多肽的方法。

12.根据权利要求1或5的核酸作为标记基因或者报导基因的用途。

13.根据权利要求1或5的核酸作为标记基因或者报导基因联合其它报导基因的用途。

14.制备发光蛋白的方法，其特征在于，将一个或者多个突变体引入到基于SEQ ID NO：7的137至141位限定的区域内的发光蛋白中，由此导致生物发光随时间改变而改变。

15.发光蛋白，其根据权利要求14的方法制备。

16.根据权利要求2、3、4或者15的发光蛋白作为标记或者指示器的用途。

17.根据权利要求2、3、4或者15的发光蛋白作为标记或者指示器联合其它报导基因的用途。

18.发光蛋白水母发光蛋白的变体，其表现出随时间改变而改变的生物发光。