DE69928255T2

DE69928255T2 - Biolumineszentes resonanz-energie-transfersystem (bret) und seine anwendung

Info

Publication number: DE69928255T2
Application number: DE69928255T
Authority: DE
Inventors: Erik Joly; H. Carl JOHNSON; W. David PISTON
Original assignee: PerkinElmer Biosignal Inc; Vanderbilt University
Current assignee: PerkinElmer Biosignal Inc; Vanderbilt University
Priority date: 1998-06-16
Filing date: 1999-06-16
Publication date: 2006-11-09
Anticipated expiration: 2019-06-17
Also published as: EP1088233B1; EP1088233B9; WO1999066324A9; EP1088233A2; CA2335305C; CA2335305A1; AU4254299A; WO1999066324A2; DE69928255D1; WO1999066324A3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft das Gebiet der molekularen Interaktionen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Interaktionen zwischen Proteinen und anderen Molekülen spielen eine wichtige Regulationsrolle bei fast jedem biologischen Prozess. Daher wurden viele Techniken zum Erkennen und Charakterisieren dieser Interaktionen entwickelt. Diese Hilfsmittel reichen von In-vitro-Bindungs-Assays zu bibliothekenbasierten Verfahren und umfassen genetische Verfahren wie die Suche nach extragenen Suppressoren (Phizicky, E. M. & Fields, S., (1995) Microbiol. Rev., 59, 94-123). Derzeit ist das populärste bibliothekenbasierte Verfahren das Hefe-Zwei-Hybrid-System, das die Auswahl von Hefestämmen ermöglicht, die zwei interagierende Peptide, das Zielpeptid und ein anderes aus der Bibliothek, enthalten (Fields, S. & Song, O. K., (1989) Nature (London) 340, 245-246). Dieses Verfahren hat sich zwar als wertvolle Technik zum Erkennen von potenziellen Proteininteraktionen erwiesen, aber es weist einige Beeinträchtigungen auf, von denen die wesentlichste ist, dass die Interaktion nur in dem Kern einer Hefezelle untersucht wird. Das bedeutet, dass Interaktionen, die von zelltypspezifischer Reifung und/oder Kompartimentierung abhängen, von dem Zwei-Hybrid-System nicht nachgewiesen werden.
Eine andere Technik zum Ermitteln von Protein-Protein-Interaktion basiert auf Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET). Bei diesem Prozess überträgt ein Fluorophor (der „Donator") seine Energie im erregten Zustand an ein anderes Fluorophor (der „Akzeptor"), der normalerweise Fluoreszenz einer unterschiedlichen Farbe aussendet. FRET-Effizienz hängt von drei Parametern ab: (i) der Überlappung zwischen dem Absorptionsspektrum des zweiten Fluorophors und dem Emissionsspektrum des ersten Fluorophors; (ii) der relativen Orientierung zwischen dem Emissionsdipol des Donators und dem Absorptionsdipol des Akzeptors; und (iii) der Distanz zwischen den Fluorophoren. Abhängig von der spektralen Überlappung und den Dipol- Orientierungen kann die Distanz, über die FRET auftritt, zwischen 10 und 100 Å betragen (Wu, P. & Brand, L., (1994) Anal. Biochem., 218, 1-13). FRET wurde dazu verwendet, Protein-Protein-Nähe in vitro und in vivo zu testen, indem Fluorphore, wie Fluoreszein und Rhodamin, chemisch an Paare gereinigter Proteine angeheftet werden und Fluoreszenzspektren von Proteinmischungen oder Zellen, die mit den markierten Proteinen mikroinjiziert wurden, gemessen werden (Adams, S. R. u. a., (1991) Nature, 349, 694-7). Das Klonen und die Expression von grün fluoreszierendem Protein (GFP) in heterologen Systemen eröffnete die Möglichkeit genetischer Anheftung von Fluorophoren an Proteine. Zusätzlich ermöglichte die Verfügbarkeit von GFP-Mutanten mit veränderten Wellenlängen (Heim u. a., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 12501-12504) deren Verwendung als FRET-Paare. Zum Beispiel wurde GFP und sein blau fluoreszierender Mutant, BFP, zuerst verwendet, um FRET zwischen GFP-Molekülen nachzuweisen (Heim, R. & Tsien, R. Y., (1996) Curr. Biol., 6, 178-182). Andere GFP-Paare, wie das cyanfarbige CFP und das gelbgrüne YFP erweiterten erheblich die Anwendungen, bei denen FRET zum Messen von Protein-Protein-Interaktionen eingesetzt werden kann (Miyawaki u. a., (1997) Nature (London), 388, 882-887).
Eine attraktive Anwendung, die durch GFP-basierten FRET ermöglicht wird, ist der In-vivo-Assay von Proteininteraktionen in anderen Organismen als Hefe. Zum Beispiel zeigte die Verschmelzung von GFP und BFP mit dem Säugertranskriptionsfaktor Pit-1 Homodimerisation von Pit-1 in lebenden HeLa-Zellen (Periasamy, A. und Day, R. N., (1998) J. Biomed. Opt., 3, 1-7). Bei dieser Versuchsform können Interaktionen in dem natürlichen Organismus des Proteins untersucht werden, so dass zelltypspezifische Modifizierungen und/oder Kompartimentierung der Proteine erhalten bleiben. Zusätzlich ist die Kompartimentierung dieser interagierenden Proteine potenziell unter dem Mikroskop sichtbar. FRET weist jedoch einige Beschränkungen auf. Wie bei jeder Fluoreszenztechnik kann Photobleichung des Fluorophors und Eigenfluoreszenz der Zellendes Gewebes die Nützlichkeit von FRET erheblich einschränken und bei hoch eigenfluoreszierenden Geweben ist FRET im Wesentlichen unverwendbar. Außerdem ist, wenn das Gewebe leicht durch das Erregungslicht beschädigt wird, die Technik möglicherweise nicht in der Lage, einen Wert für gesunde Zellen zu liefern. Zuletzt könnte, wenn die zu prüfenden Zellen/Gewebe photoreaktiv sind (z. B. Retina), FRET impraktikabel sein, da die Photoreaktion ausgelöst werden könnte, sobald eine Messung vorgenommen wird.
Die europäische Patentanmeldung Nr. EP 0 070 686 stellt eine strahlungslose immunochemische Energietransfertechnik bereit, bei der Antigen-Assays durchgeführt wurden, indem eine antigenhaltige Probe in eine Reagenslösung eingebracht wird, die einen absorber-emitterkonjugierten Antikörper und einen mit chemilumineszierendem Katalysator konjugierten Antikörper enthält, wobei die konjugierten Antikörper in enger Nähe an das Antigen gebunden sind, um Energietransfer an den Absorber-Emitter zu ermöglichen. Die resultierende Lichtemission von dem Absorber-Emitter ist mit der in der Probe vorhandenen Menge an Antigen verbunden.
Grün fluoreszierendes Protein (GFP) ist ein lichtausstrahlendes Protein, das aus der Qualle Aequorea victoria gereinigt wurde. GFP kann grünes Licht ausstrahlen, indem es den Energietransfer von Quellen annehmen kann, die exogenes blaues Licht und durch Renilla-Luciferase katalysierte Reaktionen beinhalten. Das Gen für GFP wurde geklont und seine cDNA ist ein starkes Reportergen in einer Vielzahl von lebenden Systemen, zu denen auch Bakterien, Pilze und Säugergewebe gehören. Die durch UV-Licht stimulierte GFP-Fluoreszenz erfordert keine Cofaktoren und das Genprodukt allein kann ausreichen, um den Nachweis von lebenden Zellen unter dem Lichtmikroskop zu ermöglichen.
Renilla-Luciferase ist ein aus Renilla reniformis gereinigtes Enzym. Das Enzym katalysiert die oxidative Decarboxylierung von Coelenterazin in Anwesenheit von Sauerstoff zum Erzeugen von blauem Licht mit einer Emissionswellenlänge von maximal 478 nm. Bei Renilla reniformis-Zellen wird jedoch diese Reaktion auf Grund eines Energietransfers zu einem grün fluoreszierenden Protein nach Grün mit einer maximalen Wellenlänge von 510 nm verschoben.
Das Gen für Renilla-Luciferase (ruc) wurde geklont und die Nützlichkeit seiner cDNA als Reportergen in verschiedenen lebenden Systemen wurde nachgewiesen. D. C. Prasher u. a., Gene, 1992, 111:229-33. Durch Bereitstellen geeigneter Promotoren für die cDNA als Genkassetten wurde das Gen in Bakterien, transformierten Pflanzenzellen und Säugerzellen exprimiert. Die hohe Effizienz von Renilla-Luciferase ist ein nützliches Merkmal als Markierungsenzym für Genexpressionsstudien. Die internationale Patentanmeldung WO 98/14605 offenbart Fusionsgenkonstrukte, die die cDNA von Renilla-Luciferase und die cDNA des „humanisierten" grün fluoreszierenden Proteins von Aequorea umfassen.
Ein Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfersystem (BRET) und dessen Anwendung auf interagierende Zirkadianuhrproteine wurde in Yao u. a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), 151-156, beschrieben.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt ein Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfersystem (BRET) bereit, das vier Teile umfasst: 1) ein biolumineszentes Protein, das Luciferaseaktivität aufweist; 2) ein Akzeptor-Fluorophor, das die Energie von dem biolumineszenten Protein annehmen kann, wenn sie in Anwesenheit des geeigneten Substrats in Verbindung gebracht werden; 3) einen Modulator, der die Nähe oder die Ausrichtung des biolumineszenten Proteins und des Fluorophors beeinflusst; und 4) ein geeignetes Substrat zum Aktivieren der Luciferaseaktivität des biolumineszenten Proteins. Die Komponenten dieses Systems interagieren, um die räumliche Beziehung zwischen dem biolumineszenten Protein und dem Fluorophor zu beeinflussen, die durch die Lichtemission von dem System demonstriert wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist eine bildhafte Beschreibung eines BRET-Systems, bei dem die Luciferase und das Fluorophor an unterschiedliche Proteine oder Peptide angeheftet sind.
2 ist eine bildhafte Beschreibung eines BRET, bei dem die Luciferase und das Fluorophor an dasselbe Protein oder Peptid angeheftet sind.
3 zeigt in vivo Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET) von RLUC in E.coli-Zellen, die das RLUC·EYFP-Fusionsprotein exprimieren. (a) Diagramme der Expressionskassetten von pT7/Eyfp, pT7/Rluc und pT7/Rluc·Eyfp. Abkürzungen: P_T7 = T7-Promotor-Region; Ter = Transkriptionsterminator-Region. Antibiotika-Resistenzen werden in Klammern angegeben. Die Linker-Sequenz zwischen Rluc und Eyfp in dem Rluc·Eyfp-Fusionskonstrukt wird unter dem pT7/Rluc·Eyfp-Diagramm gezeigt. (b) Lumineszenz- (lum) oder Fluoreszenz- (fluor) Emissionsspektren von transformierten Stämmen, die die Proteine RLUC oder EYFP oder das Fusionsprotein RLUC·EYFP exprimieren. Alle Spektren wurden normiert.
4 demonstriert ein In-vivo-BRET-Assay für Clock-Protein-Interaktion im Tagesrythmus (a) Diagramme der Genfusionskassetten von pT7/Eyfp·kaiB, pT7/Rluc·kaiB und pT7/Eyfp·kaiA. (b) Lumineszenz-Emissionsspektren von den transformierten Stämmen, die RLUC und EYFP (b1), RLUC·KaiB und EYFP·KaiB (b2) und RLUC·KaiB und EYFP·KaiA (b3) exprimieren.
5 zeigt die Clock-Protein-KaiB-KaiB-Assoziation u. zwar in vitro durch BRET nachgewiesen. Extrakte, die Fusionsproteine EYFP·KaiB enthielten, wurden in gleichen Proportionen mit denjenigen gemischt, die RLUC·KaiB enthielten. Die Biolumineszenzemissionsprofile wurden zu den angegebenen Zeiten gemessen, nachdem die Extrakte vereinigt und bei Raumtemperatur inkubiert wurden.
6 demonstriert die bildliche Darstellung von Biolumineszenz von transformierten E.coli-Stämmen durch Interferenz-Bandpassfilter, die Licht von 480 ± 5 nm (linke Felder) oder 530 ± 5 nm (rechte Felder) übertragen. Zeile (a) ist der Stamm, der nur RUC produziert; Zeile (b) ist der Stamm, der das RLUC·EYFP-Fusionsprotein exprimiert; Zeile (c) ist der Stamm, der die Fusionsproteine RLUC·KaiB und EYFP·KaiA exprimiert; und Zeile (d) ist der Stamm, der die Fusionsproteine RLUC·KaiB und EYFP·KaiB produziert. (Die blaue Farbe ist Pseudofarbe, die die Intensität der Lichtemission anzeigt; sie zeigt nicht die tatsächliche Farbe des ausgestrahlten Lichts an).
7 zeigt eine Quantitätsbestimmung der BRET-Intensität und der Verhältnisse in den Bildern von 6. Oberes Feld: Quantitätsbestimmung von Lumineszenzintensität (in relativen Lichteinheiten) bei 480 nm und 530 nm der in 6 abgebildeten Kulturen. Unteres Feld: Berechnung der 530 nm/480 nm-Verhältnisse. Die Stämme sind in 6 wie folgt gekennzeichnet: (a) RLUC, (b) RLUC·EYFP, (c) RLUC·KaiB und EYFP·KaiA und (d) RLUC·KaiB und EYFP·KaiB.
8 zeigt die Ergebnisse eines In-vitro-Enterokinase-Assays unter Verwendung der BRET-Zählung und demonstriert, dass nur das Verhältnis für das Konstrukt Rluc:Enterokinase:EYFP in Anwesenheit des Enterokinase-Enzyms im Verlauf der Zeit sinkt.
9 stellt den Zeitverlauf der Interaktion der unterschiedlichen kai-Proteine bei 25 °C unter Verwendung von BRET-Zählung dar. Nur das Verhältnis für Rluc-kaiB EYFP-kaiB steigt im Verlauf der Zeit für beide Transfektionsbedingungen (unter Verwendung von 4 oder 0,5 μg Vektor-DNA pro Mikrotiterplattenkammer). Die Verhältnisse für alle negativen Kontrollen zu Rluc-kaiB und Rluc-kaiB+EYFP-kaiA steigen nicht mit der Zeit an. Das bedeutet, dass Energietransfer nur bei Rluc-kaiB+EYFP-kaiB auftritt, was den Erwartungen entspricht, da sich kaiB nur mit sich selbst verbindet und nicht mit kaiA.
10 zeigt einen Zeitverlauf der Induktion des CAMP-Sensors durch Calcitonin und Forskolin.
11 zeigt eine dosisabhängige-Wirkung von Calcitonin unter Verwendung einer mit CAMP-Sensor transfizierten CHO-K1-Zelllinie.
12 zeigt einen Zeitverlauf der Induktion von β₂-Rezeptor durch Isoproterenol.
13 zeigt eine dosisabhängige-Wirkung von Isoproterenol auf die mit CAMP-Sensor CBP:CREB transfizierten Zellen. Die Daten wurden 45 Minuten nach Hinzufügen des Isoproterenols und des Coelenterazins erfasst.
14 demonstriert die Ergebnisse eines Zeitverlaufexperiments über die Aktivierung von CCR5-Rezeptor unter Verwendung von Forskolin und MIP-1β, einem selektiven Agonisten für CCR5.
15 demonstriert die Ergebnisse eines Zeitverlaufexperiments über die Aktivierung von CCR5-Rezeptor unter Verwendung von Forskolin und MIP-1β.
16 zeigt eine EGF-dosisabhängige-Wirkung auf die mit TKR-Sensor transfizierten GH4-C1-Zellen.
17 zeigt ein Zeitverlaufexperiment an Zellen, die mit den unterschiedlichen β2-Konstrukten transfiziert wurden.
18 zeigt einen Vergleich des BRET-Verhältnisses 20 Minuten nach Hinzufügen von Coelenterazin.
19 stellt die Ergebnisse von Experimenten dar, die die Kinetik von β2-Dimerisation demonstrieren.
20 zeigt eine Dosis-Wirkungs-Analyse unter Verwendung von Zellen, die mit den unterschiedlichen β2-Konstrukten transfiziert wurden.
21 zeigt die Ergebnisse eines BRET-Assays, der unter Verwendung von BRET-Zählung durchgeführt wurde.
22 stellt eine Spektralanalyse der BRET-Reaktion zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Hinzufügen von Coelenterazin unter Verwendung des Spex dar. Die Y-Achse stellt das CPS dar und die X-Achse stellt die Wellenlänge (nm) dar.
23 demonstriert die Wirkung der Zelldichte pro Mikrotiterplattenkammer. (cont(+) stellt Zellen dar, die mit Fusionsgen Rluc·EYSP transformiert wurde; cont(–) stellt Zellen dar, die allein mit Rluc-Gen transformiert wurden.)
24 zeigt die Ergebnisse von Experimenten zur Bestimmung von Rluc-Lumineszenz in PBS Ca2+/Mg2+ in Anwesenheit oder Abwesenheit von DTT.
25 zeigt die Ergebnisse von Experimenten zur Bestimmung von Rluc-Lumineszenz in PBS Ca2+/Mg2+ + Glucose in Anwesenheit oder Abwesenheit von DTT.
26 zeigt die Ergebnisse von Experimenten zur Bestimmung von Rluc-Lumineszenz in DMEM ohne Phenolrot in Anwesenheit oder Abwesenheit von DTT.
27 demonstriert die Wirkung von pH auf das BRET-Verhältnis.
28 zeigt das Verhältnis die Hinzufügung von HEPES-basiertem Puffer auf das Rluc-Konstrukt-Verhältnis.
29 zeigt die Hinzufügung von HEPES-basiertem Puffer auf das Rluc::EYFP-Konstrukt-Verhältnis.
30 zeigt die Hinzufügung von DMSO auf den Energietransfer.
31 zeigt Apoptoseinduktion unter Verwendung von Staurosporin in HeLa-Zellen, die mit dem Apoptosesensor transfiziert waren.
32 zeigt Ergebnisse des MiniScreen-Assays.
33 stellt die Ergebnisse eines Experiments dar, das ein Calcitonin-Dosis-Verhalten auf CHO-K1-Zellen, die mit dem cAMP-Sensor transfiziert waren (CBP:CREB-Konstrukte), demonstriert.
34 zeigt eine Isoprotenerol-dosisabhängige-Wirkung auf CHO-K1-Zellen, die mit dem cAMP-Sensor transfiziert waren (CBP:CREB-Konstrukte). In diesem Fall wurde das Verhältnis unter Verwendung der in Beispiel XIV vorgelegten Algorithmusformel korrigiert.
35 zeigt Ergebnisse eines Zelllinearitätsexperiments.
36 zeigt Ergebnisse einer Zeitverlaufsstudie der Rluc-Lumineszenz.
37 zeigt eine dosisabhängige Wirkung von Coelenterazin-Derivaten.
38 zeigt Ergebnisse einer Studie, bei der lysierte und nichtlysierte Zellen verglichen werden.
39 zeigt LucLite-Stabilisierung von Rluc-Lumineszenz in lebenden Zellen.
40 zeigt Ergebnisse einer Verhältnisstabilitätsstudie bei Verwendung von Coelenterazin h in LucLite.
41 zeigt Ergebnisse einer Verhältnisstabilitätsstudie bei Verwendung von natürlichem Coelenterazin in LucLite.
42 zeigt BRET-Nachweis bei Zellen, die mit 10 Mal weniger DNA transfiziert waren.
43 zeigt Ergebnisse, die BRET-Nachweis bei Zellen, die mit 20 Mal weniger DNA transfiziert waren, demonstrieren.
44 zeigt Ergebnisse einer Studie zu BRET-Nachweis, wenn Zellen lysiert sind. Die Transfektionen erfolgten unter Verwendung der „normalen" DNA-Menge.
45 zeigt Ergebnisse einer Vergleichsstudie zwischen PBS und DMEM/F12 (ohne Phenolrot) zum Prüfen von BRET.
46 zeigt DTT-Wirkungen auf die Rluc-Emissionsstabilität.
47 demonstriert Rluc-Emissionsstabilität im Lauf der Zeit.
48 zeigt Rluc-Emissionsniveaus gegenüber Zelldichte zu einem festen Zeitpunkt.
49 zeigt Rluc-Emissionsstabilität in Anwesenheit einer festgesetzten Anzahl von Zellen.
50 zeigt eine Darstellung von Rluc-Emissionsniveaus gegenüber der Zelldichte zu festen Zeitpunkten nach Hinzufügung von Coelenterazin.
51 zeigt eine Darstellung der Wirkung von Temperatur auf die Rluc-Emission.
52 zeigt eine Darstellung der Wirkung der Temperatur auf das BRET-Verhältnis (LumiCount).
53 zeigt eine Darstellung der Wirkung der Temperatur auf das BRET-Verhältnis (BRETCount).
54 zeigt eine Darstellung der Wirkung von DTT auf die Rluc-Emission.
55 zeigt eine Darstellung der Wirkung von DTT auf die Rluc-Emission. Und das BRET-Verhältnis (BRET-Zählung). Diese Ergebnisse wurden mit den stabilen Zelllinien, die nur Rluc (negative Kontrolle) exprimieren, erzielt.
56 zeigt eine Darstellung der Wirkung von DTT auf die Rluc-Emission. Und das BRET-Verhältnis (BRET-Zählung). Diese Ergebnisse wurden mit den stabilen Zelllinien, die die Fusion Rluc::EYFP (positive Kontrolle) exprimieren, erzielt.
57 zeigt die DNA-Sequenz für das Rluc-EYSP-Konstrukt (SEQ ID NO:26).
58 zeigt die DNA-Sequenz für das Rluc-Enterokinase-EYFP-Konstrukt (SEQ ID NO:27).
59 zeigt die DNA-Sequenz für das Rluc-Caspase-EYFP-Konstrukt (SEQ ID NO:28).
60 zeigt die DNA-Sequenz für das EYSP-CREB-Konstrukt (SEQ ID NO:29).
61 zeigt die DNA-Sequenz für das RLUC-CBP-Konstrukt (SEQ ID NO:30).
62 zeigt die DNA-Sequenz für das EYFP-SH2-Konstrukt (SEQ ID NO:31).
63 zeigt die DNA-Sequenz für das Rluc-PTB-Konstrukt (SEQ ID NO:32).
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Definitionen
Soweit nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung wie dies von einer Person mit üblicher Erfahrung auf dem Fachgebiet, zu dem diese Erfindung gehört, zu verstehen ist. Im Allgemeinen sind die hierin verwendete Nomenklatur und die Laborabläufe bei Spektroskopie, Wirkstoffforschung, Zellkultur, Molekulargenetik, Kunststoffherstellung, Polymer-Chemie, Diagnose, Aminosäure- und Nukleinsäure-Chemie und Zuckerchemie, die nachfolgend beschrieben werden, diejenigen, die wohlbekannt sind und üblicherweise auf dem Fachgebiet eingesetzt werden. Zur Herstellung von Kunststoffen, zur Signalerfassung, für Verfahren rekombinanter Nukleinsäure, zur Polynucleotid-Synthese und für Mikrobenkultur und für Transformation (z. B. Elektroporation, Lipofektion) werden typischerweise Standardtechniken verwendet.
Die Techniken und Verfahrensweisen werden im Allgemeinen nach herkömmlichen Verfahren auf dem Fachgebiet und verschiedenen allgemeinen Referenzen (siehe im Allgemeinen Sambrook u. a., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, und Lakowicz, J. R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, New York: Plenum Press (1983) zu Fluoreszenztechniken) durchgeführt, die für dieses gesamte Dokument vorgesehen werden. Für chemische Synthesen, chemische Analysen und biologische Assays werden Standardtechniken verwendet. Im Rahmen ihrer Verwendung über die gesamte Offenbarung sind die folgenden Begriffe, soweit nicht anders angegeben, so zu verstehen, als hätten sie die folgenden Bedeutungen:
„Biolumineszentes Protein" bezieht sich auf eine Form von Chemilumineszenz, die als Ergebnis einer Energie liefernden chemischen Reaktion entsteht, bei der eine spezifische biochemische Substanz, ein Luciferin (ein natürlich auftretendes Fluorophor), durch ein Enzym mit einer Luciferaseaktivität oxidiert wird. Eine große Vielfalt von Organismen, sowohl prokaryotisch als auch eukaryotisch, darunter auch Arten von Bakterien, Algen, Pilzen, Insekten, Fischen und anderen marinen Formen, kann Lichtenergie auf diese Weise ausstrahlen und jede weist spezifische Luciferaseaktivitäten und Luciferine auf, die sich chemisch von denen anderer Organismen unterscheiden. Luciferin/Luciferase-Systeme sind in Form, Chemie und Funktion sehr verschieden. Zum Beispiel gibt es Luciferaseaktivitäten, die kontinuierliche Chemilumineszenz erleichtern, wie dies von manchen Bakterien und Pilzen gezeigt wird, und diejenigen, die dazu eingerichtet sind, sporadische oder reizinduzierte Emissionen zu erleichtern, wie im Falle von Dinoflagellat-Algen. Als Phänomen, das die Umwandlung von chemischer Energie zu Lichtenergie mit sich bringt, ist Biolumineszenz weder auf lebende Organismen beschränkt noch erfordert sie die Anwesenheit lebender Organismen. Es einfach eine Art von chemilumineszierender Reaktion, die eine Luciferaseaktivität erfordert, deren Ursprünge an einem bestimmten Punkt bei einem biologischen Katalysator liegen. Daher reicht die Konservierung oder Konstruktion der wesentlichen Aktivitäten und Chemikalien aus, um über die Einrichtungen zu verfügen, biolumineszente Phänomene entstehen zu lassen. Biolumineszente Proteine mit Luciferaseaktivität sind daher von einer Vielzahl von Quellen oder durch eine Vielzahl von Einrichtungen verfügbar. Beispiele für biolumineszente Proteine mit Luciferaseaktivität sind in den US-Patenten Nr. 52229285, 5219737, 5843746, 5196524, 5670356 zu finden.
„Fluorophor" bezieht sich auf jedes Molekül, das Energie von dem biolumineszenten Protein mit Luciferaseaktivität annehmen und diese als Lichtenergie wieder ausstrahlen kann. Es gibt eine Reihe von unterschiedlichen Fluorophoren, die bei dieser Erfindung eingesetzt werden können. Zu einer sehr bekannten Gruppe von Fluorophoren gehören das grün fluoreszierende Protein von der Qualle Aequorea victoria und zahlreiche andere Varianten (GFP), die sich aus der Anwendung von Molekularbiologie ergeben, wie z. B. Technologien für Mutagenese und chimäres Protein (R. Y. Tsien, (1998), Ann. Rev. Biochem., 63:509-544). GFP werden auf Basis der Unterscheidungskomponente ihrer Chromophoren klassifiziert, wobei jede Klasse unterscheidende Erregungs- und Emissionswellenlängen aufweist: Klasse 1, Wildtyp-Mischung von neutralem Phenol und anionischem Phenolat; Klasse 2, Phenolatanion; Klasse 3, neutrales Phenol; Klasse 4, Phenolatanion mit gestapeltem n-Elektronensystem; Klasse 5, Indol; Klasse 6, Imidazol; und Klasse 7, Phenyl (R. Y. Tsien, (1998), supra).
GFP oder andere Fluorophore, biolumineszente Proteine mit Luciferaseaktivitäten und die geeigneten Substrate wurden zu lumineszenzbasierten Assay-, Markierungs-, Such- und Protein-Protein-Interaktionsnachweis-Systemen kombiniert; Beispiele sind in den US-Patenten Nr. 5786162, 4614712, 5650289, 5837465, 5897990, 57002883, 54016229, 5221623, 5854010, 5770391, 4665022, 5854004 zu finden.
„Substrat" bezieht sich auf eine Einrichtung zum Aktivieren des biolumineszenten Proteins mit Luciferaseaktivität. Bei einer bevorzugten Ausführung wird Renilla-Luciferase (Rluc)(Cormier, (1978), Methods Enzymol., 57, 237-244) oder eines ihrer Derivate als Donor-Fluorophor verwendet, da ihr Emissionsspektrum cyanfarbigem ECFP (1 max. Å 480 nm) ähnlich ist, bei dem nachgewiesen wurde, dass es FRET mit EYFP zeigt (Miyawaki u. a., (1997) Nature (London) 388, 882-887). Das Coelenterazin-Substrat für RLUC ist ein hydrophobes Molekül, das für die meisten Zelltypen permeabel ist.
„Protein" bezieht sich auf ein vollständiges Protein oder Fragment davon, wie eine Proteindomäne oder einen Bindungsort für einen zweiten Messenger, einen Cofaktor, ein Ion usw. Es kann ein Peptid oder eine Aminosäuresequenz sein, die als Signal für ein anderes Protein in dem System fungieren, wie ein proteolytischer Spaltungsort.
„Funktionelle Genomanalyse" bezieht sich auf das Gebiet, das die Bestimmung der Zellfunktion eines neuen Gens betrifft. Eine Form der Bestimmung der Funktion eines Proteins be steht darin, die Identität seines Bindungspartners zu bestimmen. Eine Anwendung des BRET-Systems besteht darin, die Identifizierung eines Genprodukts oder seines Zielorts innerhalb einer Zelle oder der Proteine, Nucleinsäuresequenzen oder anderen Biomoleküle, mit denen es interagiert, zu ermöglichen.
„Bindungspaar" bezieht sich auf zwei Anteile (z. B. chemisch oder biochemisch), die eine Affinität zueinander aufweisen. Zu Beispielen für Bindungspaare gehören Homodimere, Heterodimere, Antigen/Antikörper, Lectin/Avidin, Ziel-Polynucleotide/Sonde, Oligonucleotid, Antikörper/Anti-Antikörper, Rezeptor/Ligand, Enzym/Ligand und Ähnliches. „Ein Glied eines Bindungspaars" bezieht sich auf einen Anteil des Paars, wie ein Antigen oder Ligand.
„Membranpermeantes Derivat" bezieht sich auf ein chemisches Derivat einer Verbindung, das im Vergleich zu einer underivatisierten Verbindung gesteigerte Membranpermeabilität aufweist. Zu Beispielen gehören Ester-, Ether- und Carbamat-Derivate. Bei diesen Derivaten wurde die Fähigkeit, Zellmembrane zu passieren, d. h. Membranpermeanz, verbessert, da hydrophile Gruppen maskiert werden, um stärker hydrophobe Derivate bereitzustellen. Außerdem sind Maskierungsgruppen so konstruiert, dass sie von einem Präkursor (z. B. fluorogener Substratpräkursor) in der Zelle abgespaltet werden, um das abgeleitete Substrat intrazellulär zu erzeugen. Da das Substrat hydrophiler ist als das membranpermeante Derivat, wird es nun in den Zellen zurückgehalten.
„Modulator" bedeutet ein Molekül oder Moleküle, die als Reaktion auf eine Interaktion mit einem anderen Molekül eine Konformationsänderung durchlaufen, wodurch die Nähe und/oder die Ausrichtung des biolumineszenten Proteins und des Fluorophors beeinflusst wird. Ein Modulator kann ein Peptid, ein Protein, eine Nucleinsäure oder ein anderes synthetisches oder natürliches Molekül sein. Zu Beispielen für Modulatoren für diese Erfindung gehören ein Proteaseort, ein Bindungsort für zweiten Messenger, ein Ionenbindungsmolekül, ein Homodimer- oder Heterodimer-Molekül, eine Nucleinsäuresequenz, ein Kinasesubstrat oder anderes Enzymsubstrat, ein Rezeptor oder ein Rezeptorligand.
„Isoliertes Polynucleotid" bezieht sich auf ein Polynucleotid genomischen, cDNA- oder synthetischen Ursprungs oder eine Kombination davon, wobei das „isolierte Polynucleotid" auf Grund seines Ursprungs (1) nicht mit der Zelle assoziiert ist, in der das „isolierte Polynucleotid" in der Natur zu finden ist, oder (2) wirkungsmäßig an ein Polynucleotid gekoppelt ist, an das es in der Natur nicht gekoppelt ist.
„Isoliertes Protein" bezieht sich auf ein Protein von cDNA, rekombinanter RNA oder synthetischem Ursprung oder einer Kombination davon, wobei das „isolierte Protein" auf Grund seines Ursprungs (1) nicht mit Proteinen assoziiert ist, mit denen es normalerweise in der Natur zu finden ist, oder (2) von der Zelle, in der es normalerweise auftritt, isoliert ist oder (3) frei von anderen Proteinen, z. B. frei von menschlichen Proteinen, aus derselben Zellquelle isoliert ist, oder (4) durch eine Zelle von einer unterschiedlichen Art exprimiert ist oder (5) nicht in der Natur auftritt. „Isoliertes natürlich auftretendes Protein" bezieht sich auf ein Protein, wobei das „isolierte natürlich auftretende Protein" auf Grund seines Ursprungs (1) nicht mit Proteinen assoziiert ist, mit denen es normalerweise in der Natur zu finden ist, oder (2) von der Zelle, in der es normalerweise auftritt, isoliert ist oder (3) frei von anderen Proteinen, z. B. frei von menschlichen Proteinen, aus derselben Zellquelle isoliert ist.
„Polypeptid" ist so, wie es hierin verwendet wird, ein Gattungsbegriff, der sich auf natives Protein, Fragmente oder Analoge einer Polypeptidsequenz bezieht. Daher sind natives Protein, Fragmente oder Analoge Arten der Polypeptidgattung.
„Natürlich vorkommend" bezieht sich so, wie es hierin verwendet wird, bei Anwendung auf ein Objekt auf den Umstand, dass ein Objekt in der Natur zu finden ist. Zum Beispiel ist eine Polypeptid- oder Polynucleotidsequenz, die in einem Organismus (einschließlich Viren) vorhanden ist, die von einer Quelle in der Natur isoliert werden kann und die nicht absichtlich vom Menschen im Labor modifiziert wurde, natürlich vorkommend.
„Wirkungsmäßig gekoppelt" bezieht sich auf eine Aneinanderlagerung, bei der sich die so beschriebenen Komponenten in einer Beziehung befinden, die es ihnen ermöglicht, auf ihre beabsichtigte Weise zu funktionieren. Eine Kontrollsequenz, die mit einer Codierse-quenz „wirkungsmäßig gekoppelt" ist, ist so ligiert, dass Expression der Codiersequenz unter Bedingungen erreicht wird, die mit der Kontrollsequenz kompatibel sind.
„Kontrollsequenz" bezieht sich auf Polynucleotidsequenzen, die erforderlich sind, um die Expression von codierenden und nichtcodierenden Sequenzen, mit denen sie ligiert sind, zu bewirken. Die Art solcher Kontrollsequenzen unterscheidet sich in Abhängigkeit vom Wirtsorga nismus: Bei Prokaryoten umfassen solche Kontrollsequenzen im Allgemeinen den Promotor, den ribosomalen Bindungsort und die Transkriptsionsterminationssequenz; bei Eukaryoten umfassen solche Kontrollsequenzen im Allgemeinen die Promotoren und die Transkriptsionsterminationssequenz. Der Begriff „Kontrollsequenzen" soll mindestens Komponenten beinhalten, deren Anwesenheit Expression beeinflussen kann, und kann außerdem zusätzliche Komponenten beinhalten, deren Anwesenheit vorteilhaft ist, wie zum Beispiel Leader-Sequenzen und Fusionspartnersequenzen.
„Polynucleotid" bezieht sich auf eine polymere Form von wenigstens 10 Basen langen Nucleotiden entweder Ribonucleotide oder Desoxynucleotide oder eine modifizierte Form von einem der beiden Nucleotidtypen. Der Begriff umfasst einzel- und doppelsträngige Formen von DNA.
„Korrespondiert mit" bezieht sich darauf, dass eine Polynucleotidsequenz zu einer vollständigen oder einem Teil einer Polynucleotidsequenz homolog (d. h. identisch ist, nicht streng evolutionär verwandt) ist oder dass eine Polypeptidsequenz mit einer Referenz-Polypeptidsequenz identisch ist. Im Unterschied dazu wird der Begriff „komplementär zu" hierin so verwendet, dass er bedeutet, dass die komplementäre Sequenz zu einer vollständigen oder einem Teil einer Referenz-Polynucleotidsequenz homolog ist. Zur Illustration die Nucleotidsequenz „TATAC" korrespondiert mit einer Referenzsequenz „TATAC" und ist komplementär zu einer Referenzsequenz „GTATA".
„Polypeptidfragment" bezieht sich auf ein Polypeptid, das eine Amino-Terminus- und/oder Carboxy-Terminus-Deletion aufweist, wobei jedoch die restliche Aminosäuresequenz normalerweise mit den korrespondierenden Positionen in der natürlich auftretenden Sequenz, die zum Beispiel von einer cDNA-Sequenz vollständiger Länge abgeleitet wurde, identisch ist. Fragmente weisen typischerweise wenigstens eine Länge von 5, 6, 8 oder 10 Aminosäuren, vorzugsweise wenigstens eine Länge von 14 Aminosäuren auf, stärker bevorzugt eine Länge von wenigstens 20 Aminosäuren, normalerweise eine Länge von wenigstens 50 Aminosäuren und mehr bevorzugt eine Länge von wenigstens 70 Aminosäuren aufweisen.
„Platte" bezieht sich auf eine Platte mit mehreren Kammern, soweit dies nicht in dem Kontext davon anders modifiziert wird.
Der Begriff „Versuchschemikalie" bezieht sich auf eine Chemikalie, die durch ein oder mehrere Screening-Verfahren der Erfindung als vermeintlicher Kandidat zu prüfen ist.
Die Begriffe „Markierung" und „markiert" beziehen sich auf den Einbau eines nachweisbaren Markers, z. B. durch Einbau einer radioaktiv markierten Aminosäure oder Anheftung an ein Polypeptid von Biotinylanteilen, der durch markiertes Avidin (z. B. Streptavidin, das einen fluoreszierenden Marker oder Enzymaktivität beinhaltet, was durch optische oder kolorimetrische Verfahren nachgewiesen werden kann) nachgewiesen werden kann. Verschiedene Verfahren zum Markieren von Polypeptiden und Glycoproteinen sind auf dem Gebiet bekannt und können verwendet werden. Zu Beispielen für Markierungen für Polypeptide gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, die Folgenden: Radioisotope (z. B..³H,.¹⁴C, ³⁵S, ¹²⁵I ¹³¹I, fluoreszierende Markierungen (z. B. FITC, Rhodamin, Lanthanidphosphore), enzymatische Markierungen (oder Reportergene) (z. B. Meerrettichperoxidase, β-Galactosidase, β-Latamase, Luciferase, alkalische Phosphatase), chemilumineszente Biotinylgruppen, prädeterminierte Polypeptidepitope, die durch einen sekundären Reporter erkannt werden (z. B. Leucin-Zipper-Paar-Sequenzen, Bindungsorte für sekundäre Antikörper, Metallbindungsdomänen, Epitopmarkierungen). Bei manchen Ausführungen werden Markierungen durch Abstandshalterarme verschiedener Längen angeheftet, um potenzielle sterische Hinderung zu reduzieren.
„Genotoxizität" bezieht sich auf die Wirkung einer toxischen Verbindung auf die Stabilität von Genen oder Genomen.
Zu üblichen Beispielen für zweite Messenger gehören cAMP, cGMP, Ca²⁺, IP3, NO, DAG, Ceramid und Derivate davon und Arachidonsäure und Derivate davon.
Der Begriff Analyt bezieht sich auf eine Substanz, für die die Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge zu bestimmen ist. Ein Analyt ist typischerweise ein kleines Molekül oder ionisches Gelöstes wie K⁺, H⁺, Ca²⁺, CO₂, Na⁺, Cl^–, Mg², O₂, HCO₃, NO und ATP.
Wie über den ganzen Text festzustellen ist, werden manche Begriffe austauschbar verwendet, um äquivalente Konzepte zu bezeichnen. Zum Beispiel wird der Begriff „Sensor" verwendet, um ein Modulatorgebilde zu bezeichnen, das eine spezifische Funktion ausübt.
Zu üblichen Beispielen für Innenkanäle gehören K⁺-gekoppelter Rezeptor, Ca²⁺-Kanäle, K⁺-spannungsempfindliche Kanäle, K⁺-Kanal Ca²⁺-empfindlich.
Andere Chemiebegriffe hierin werden nach der in dem Fachgebiet üblichen Gebrauchsweise verwendet, wie dies beispielhaft in The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Hrsg. Parker, S., 1985), McGraw-Hill, San Francisco) erläutert wird.
Die Ausführungen der Erfindung, für die Schutz erbeten wird, werden in den Ansprüchen definiert.
Die Erfindung stellt ein biolumineszentes Resonanz-Energie-Transfersystem (BRET) bereit, das vier Teile aufweist: 1) ein biolumineszentes Protein, das Luciferaseaktivität besitzt; 2) ein Akzeptor-Fluorophor, das die Energie von dem biolumineszenten Protein annehmen kann, wenn sie in Anwesenheit des geeigneten Substrats in Verbindung gebracht werden; 3) einen Modulator, der die Nähe oder die Ausrichtung des biolumineszenten Proteins und des Fluorophors beeinflusst; und 4) ein geeignetes Substrat zum Aktivieren der Luciferaseaktivität des biolumineszenten Proteins. Die Komponenten dieses Systems interagieren, um die räumliche Beziehung zwischen dem biolumineszenten Protein und dem Fluorophor, die durch die Lichtemission von dem System demonstriert wird, zu beeinflussen. Der Modulator kann eine Einzeleinheit sein, die sowohl an das biolumineszente Protein als auch das Fluorophor kovalent angeheftet ist, wie in 1 demonstriert, oder er kann zwei getrennte Einheiten sein, wobei jede kovalent an entweder das biolumineszente Protein oder das Fluorophor gekoppelt ist, wie in 2 demonstriert, oder eine alternative Konfiguration, die in den Umfang der Erfindung fällt.
Dieses System kann bei In-vitro-Assays verwendet werden, um molekulare Änderungen bei einer breiten Vielzahl von Anwendungen zu ermitteln, und ist für Automation offen. Im Besonderen ist es nützlich für Untersuchungen zum Ermitteln von Änderungen bei Protein-Protein-Interaktionen und der Konzentration von Analyten oder Signalstoffmolekülen in Zellen oder in Lösungen. Es ist nützlich zur Wirkstoffentdeckung, Analyt-Screening, Second-Messenger-Prüfung, Wirkstoffscreening, Messung der Wirkung einer toxischen Verbindung auf die Genomstabilität in der Genotoxizität, Messung der Anwesenheit und Konzentration von toxischen Verbindungen in der Toxikologie und Bestimmung der zellulären Funktion eines Gens durch Bestimmen seines Bindungspartners in der funktionellen Genomforschung.
Eine bevorzugte Ausführung dieses Systems ist in 1 beispielhaft dargestellt. Bei dieser Ausführung gibt es im Allgemeinen zwei Einheiten, die den Modulator beinhalten, wobei das biolumineszente Protein kovalent an eine Modulatoreinheit angeheftet ist und das Fluorophor kovalent an die zweite Modulatoreinheit angeheftet ist. Die Interaktion zwischen den beiden Modulatoreinheiten bestimmt die Nähe und die Ausrichtung zwischen dem biolumineszenten Protein und dem Fluorophor und daher die Lichtemission von dem System.
Diese Ausführung kann dazu verwendet werden, um die Interaktion (Zusammenbewegung, Auseinanderbewegung oder Änderung der Ausrichtung zueinander) der beiden Modulatorgebilde nachzuweisen. Bei einem Beispiel, bei dem diese Ausführung zum Ermitteln von Bindungspartnern verwendet werden kann, kann das biolumineszente Protein an ein Genprodukt angeheftet werden und das Fluorophor kann an ein unbekanntes Genprodukt angeheftet werden, so dass Interaktion zwischen den beiden Genprodukten durch die Lichtemission des Fluorophors angezeigt wird. Bei einer anderen Anwendung, wie der Wirkstoffentdeckung, wird diese Ausführung verwendet, um zu bestimmen, ob eine chemische oder molekulare Substanz die molekularen Gebilde, wie Homodimere oder Heterodimere, veranlasst, sich zusammenzubewegen oder sich auseinanderzubewegen. Durch Anheften des biolumineszenten Proteins an eines der Dimer-Proteine und des Fluorophors an das andere Dimer-Protein werden sich Änderungen bei der räumlichen Beziehung zwischen den Dimer-Proteinen als Reaktion auf eine chemische Verbindung, wie einem Wirkstoffkandidaten, zu der räumlichen Beziehung zwischen dem biolumineszenten Protein und dem Fluorophor translatieren, was durch eine Änderung der Lichtemission von dem System signalisiert wird.
Eine andere bevorzugte Ausführung ist in 2 beispielhaft dargestellt. Bei dieser Ausführung sind das biolumineszente Protein und das Fluorophor an einen gemeinsamen Linker angeheftet, der die Modulatorkomponente des Systems enthält. Ein typisches Beispiel für diese Ausführung ist die Verwendung des Modulators als Sensor, der Änderungen bei einer Komponente in der Umgebung ermittelt, die den Sensor veranlassen, sich einer Konformationsänderung zu unterziehen, die die räumliche Beziehung des biolumineszenten Proteins und des Fluorophors beeinflusst, was durch die Lichtemission von dem System signalisiert wird.
Dieses Biolumineszente Protein-Modulator-Fluorophor-Konstrukt (BMFC) kann auf eine Reihe von Arten produziert werden. Es kann unter vollständiger Verwendung rekombinanter Verfahren produziert werden, indem eine rekombinante DNA, die das BMFC-Fusionsprotein codiert, angefertigt und exprimiert wird. Alternativ kann es produziert werden, indem die Komponentenproteine von einem rekombinanten System isoliert werden und die Einheiten dann unter Verwendung chemischer Mittel kovalent angeheftet werden. Alternativ kann das Fusionsproteinkonstrukt in zwei Teilen produziert werden, wobei das biolumineszente Protein und das Fluorophor unter Verwendung von rekombinanten Verfahren produziert werden und wahlweise mit einem Peptid-Linker oder einem Teil der Modulatorkomponente fusioniert werden. In der letzteren Situation kann der Modulator vollständig oder teilweise chemisch an jeden Peptid-Linker oder direkt an das biolumineszente Protein oder das Fluorophor angeheftet werden, um dadurch ein lineares Konstrukt zu erzeugen, wobei das biolumineszente Protein über den Peptid-Linker, der den Modulator enthält, mit dem Fluorophor verbunden wird. Der Modulator kann ein Einzelgebilde oder zwei interagierende Einheiten sein. Der Modulator kann weiters entweder biologisch abgeleitet oder chemisch synthetisiert werden oder ein modifiziertes biologisches Molekül sein. Eine andere Option besteht darin, das biolumineszente Protein und/oder das Fluorophor von natürlichen Quellen zu isolieren und sie chemisch an den Modulator zu binden.
Es gibt eine breite Vielzahl von Beispielen, um die Vielseitigkeit und Nützlichkeit des BRET-Systems zu demonstrieren.
Zum Beispiel wird ein Biolumineszentes Protein-Modulator-Fluorophor-Konstrukt (BMFC) in Beispiel IV dargestellt.
Die Verwendung des BRET-Untersuchungen für Protein-Protein-Interaktionen bei zellbasierten Assays
Das BRET-System ist nützlich bei zellbasierten Untersuchungen. Im Allgemeinen werden die Proteine eingebracht, indem eine Zelle mit einem oder mehreren Vektoren, die die rekombinante DNA enthalten, die manche der Komponenten des Systems codiert, transformiert oder transfiziert wird. Die Zelle produziert das Protein und BRET tritt auf, wenn sich die Luciferase, das Fluorophor und das Substrat in der entsprechenden räumlichen Beziehung befinden. Das Substrat kann entweder hinzugefügt werden oder in seiner Nucleinsäureform, wie über einen Vektor mit einem induzierbaren Promotor, eingeleitet werden.
Die Verwendung der BRET-Untersuchungen für Protein-Protein-Interaktionen bei In-vitro-Assays
Die Komponenten des BRET-Systems können unter Verwendung von molekularbiologischen Techniken produziert oder von natürlichen Quellen isoliert werden. Nach der Reinigung können sie bei nichtzellbasierten In-vitro-Untersuchungen verwendet werden.
Eine Anwendung dieses Systems bei einem In-vitro-System wird durch die Ergebnisse demonstriert, die in 3 dargestellt sind, die Spektren darstellt, die aus dem Mischen von E.coli-Extrakten aus zwei unterschiedlichen Kulturen, wobei die eine RLUC·KaiB exprimiert und die andere EYFP·KaiB exprimiert, hergeleitet wurden. In dem Lumineszenzspektrum, das unmittelbar nach dem Mischen ermittelt wurde, gab es keinen Nachweis für eine zweite Spitze. Nach Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten bildete sich eine signifikante Schulter bei dem Spektrum der gemischten Extrakte heraus. Zum Zeitpunkt der 30-minütigen Inkubation ist außerdem die Intensität der RLUC-Lumineszenz auf ungefähr 60 % des Werts für Zeitpunkt 0 gesunken. Dieser Rückgang der Lumineszenzintensität ist wahrscheinlich auf Proteolyse in dem Extrakt zurückzuführen. Nach zweistündigem Inkubieren bei Raumtemperatur zeigte die Lumineszenz ein klares bimodales Spektrum, obwohl die Gesamt-Lumineszenzintensität nur ungefähr 6 % des Anfangswerts betrug. Auch wenn die Untersuchung weiterer Optimierung bedarf, zeigt die Entwicklung einer Schulter gefolgt von einer offensichtlichen Bimodalität an, dass BRET in vitro geprüft werden kann.
Die Verwendung der BRET-Untersuchungen bei Hochdurchsatz-Screening
Wie in Beispiel XI demonstriert wird, ist das BRET-System besonders für Automation und Hochdurchsatz-Screening zugänglich.
Dieses Beispiel demonstriert ebenfalls, dass das BRET-System bei zellbasierten Untersuchungen nützlich sein kann. Zum Beispiel kann das Verhältnis der Lumineszenzintensitäten bei 480 nm bis 530 nm gemessen werden, um die BRET-Stärke zu bestimmen und Unterschiede bei den Gesamt-Expressionsniveaus von RLUC EYFP-Fusionsproteinen zu korrigieren. Um die Machbarkeit der bildlichen Darstellung des BRET-Verhältnisses zu prüfen, haben wir mit einer gekühlten CCD-Kamera Bilder von E.coli-Kulturen, die unsere Konstrukte exprimierten, gesammelt. 4 zeigt Bilder von flüssigen E.coli-Kulturen, wie sie durch 10-nm-Bandpass-Interferenzfilter, die bei 480 nm und 530 nm gemittelt waren, zu sehen sind. In den Kulturen, die einen Kontrollstrang (RLUC allein) oder eine nichtinteragierende Kombination (RLUC·KaiB und EYFP·KaiA) enthalten, wird bei 530 nm viel weniger Licht ausgestrahlt als bei 480 nm. Bei dem Fusionskonstrukt (RLUC·EYFP) oder der interagierenden Kombination (RLUC·KaiB und EYFP·KaiB) ist die Menge an Licht, das bei 480 nm und 530 nm ausgestrahlt wird, ungefähr gleich, was anhand der in 1 und 2(b2) gezeigten Spektren vorherzusagen wäre. Diese Bilder können quantifiziert werden, wie in 5 gezeigt. Die 530nm/480nm-Lumineszenzverhältnisse für die RLUC-Kontrolle und das nichtinteragierende Paar KaiB und KaiA sind niedrig (ungefähr 0,4), während die 530nm/480nm-Verhältnisse für das Fusionskonstrukt und für die interagierenden KaiB-Fusionsproteine über 0,9 liegen.
Die Verwendung der BRET-Untersuchung für Protein-Protein-Interaktionen zum chemischen Nachweis
Es gibt mehrere neue Anwendungen, bei denen das FRET-Verhältnis-Prinzip verwendet wird, z. B. zum Messen von Genexpression (Zlokarnik u. a., 1998) oder zum Messen interzellulärer Kalziumionenniveaus (Romoser u. a., 1997; Miyawaki u. a., 1997). BRET könnte bei diesen Anwendungen verwendet werden und könnte in der Tat Vorteile gegenüber der Verwendung von FRET aufweisen. Zum Beispiel haben zwei Gruppen über ein neuartiges Verfahren zur bildlichen Darstellung des Verhältnisses von Ca⁺⁺ berichtet, das auf der Verwendung von zwei GFP-Varianten (z. B. BFP, CFP, GFP, YFP), die durch eine Ca⁺⁺-bindende Calmodulin-Sequenz gekoppelt sind (Romoser u. a., 1997; Miyawaki u. a., 1997) basiert. Wenn die Linker-Sequenz Ca⁺⁺ bindet, unterzieht sie sich einer Konformationsänderung, die die GFP-Varianten enger zusammenführt, wodurch FRET ermöglicht wird. In Abwesenheit von ausreichend Ca⁺⁺ bleiben die GFP-Varianten weit entfernt und FRET tritt nicht auf. Daher ist die Stärke von FRET ein Indikator für Ca⁺⁺-Niveaus; da dies ein Verhältnisverfahren ist, bringen Unterschiede beim Expressionsniveau des Ca⁺⁺-Indikators keine Artefakte in die Messung ein.
Dieses Prinzip kann an BRET angepasst werden, indem ein Konstrukt konstruiert wird, bei dem Rluc über denselben Calmodulin-Linker mit Eyfp gekoppelt wird. Hier sollte das Verhältnis von Lumineszenz bei 530 nm gegenüber 480 nm einen Schätzwert für Ca⁺⁺ liefern. Die potenziellen Vorteile des BRET-Ansatzes sind dieselben wie diejenigen, die oben dargelegt wurden: Ein BRET-Indikator dürfte sich besser zum Messen von Ca⁺⁺ in photoreaktivem oder eigenfluoreszierendem Gewebe eignen und es gibt keine Photobleichung von Fluorophoren. Weiters kann, da keine direkte Erregung des Akzeptor-Fluorophors erfolgt, mit BRET eine bessere Verhältnismessung von Ca⁺⁺ erzielt werden.
Anpassbarkeit von BRET an Automation und Hochdurchsatz-Screening
Das BRET-System kann an Einrichtungen der Automation und des Hochdurchsatz-Screenings angepasst werden.
Das in den 4 und 5 gezeigte Experiment schlägt ein relativ simples Schema zum Konstruieren eines zellbasierten Bibliothek-Screening-Systems für Protein-Protein-Interaktion unter Verwendung von BRET vor. Durch empfindliches Messen der Lichtemission, die durch Interferenzfilter gesammelt wurde, könnte das 530nm/480nm-Lumineszenzverhältnis von E.coli- (oder Hefe-)Kolonien, die ein mit RLUC fusioniertes „Köderprotein" und eine Bibliothek von „Beutemolekülen", die mit EYFP fusioniert sind, exprimieren (oder umgekehrt), gemessen werden. Kolonien, die ein über dem Hintergrund liegendes Verhältnis exprimieren, könnten gesichert und die „Beute-DNA-Sequenz" könnte weiter charakterisiert werden. Expressionsvektoren benötigten die folgenden Merkmale: Mehrfachklonierungsstellen zur Insertion der Köder- und Beutebibliotheken, um sowohl N-terminale als auch C-terminale Fusionen des Ködermoleküls und der Beutebibliothek mit RLUC und EYFP zu ermöglichen, und eine Auswahl an antibiotischen oder anderen Markern, um das Prüfen verschiedener Kombinationen von Expression/Terminalfusion zu ermöglichen. Bei geeigneter Instrumentierung ist Hochdurchsatz-Screening unter Verwendung von BRET eine Möglichkeit. Bei Verwendung eines Bilddarstellungsinstruments, das demjenigen, das hier von uns verwendet wurde, ähnelt, wäre es möglich, Bakterien- oder Hefekolonien auf Agarplatten zu prüfen. Andererseits könnte ein Photovervielfacher-Instrument, welches dazu ausgebildet ist, die Lumineszenz von flüssigen Kulturen in 96-Kammer-Platten zu messen, ideal für Hochdurchsatz BRET screening durch das Einfügen von schaltbaren 480 oder 530mm Interferenzfilter vor der Photovervielfacherröhre gemacht werden.
PRÄPARIEREN DES BRET-SYSTEMS
Auswählen geeigneter Biolumineszenz-Protein/Fluorophor-Paare
Zum Konstruieren eines Systems wählt man zuerst ein biolumineszentes Protein mit Luciferaseaktivität und ein Fluorophor. In der Natur interagieren manche Paarungen aus biolumineszentem Protein und Fluorophor direkt miteinander. In anderen Fällen wird die Paa rungsinteraktion durch andere Proteine vermittelt, wobei in deren Abwesenheit interaktive Kopplung mit einer signifikant geringeren Affinität auftritt. Liegt eine solche herabgesetzte Affinität mit Expressionsniveaus, die zum Erreichen von BRET erforderlich sind, vor, wenn das biolumineszente Protein mit Luciferaseaktivität und das Fluorophor jeweils mit anderen Proteinanteilen gekoppelt sind, dann ist eine solche Paarung für BRET geeignet. Zu Beispielen für solche Systeme, die natürlich auftreten, gehören Renilla-Luciferase(RLUC)/Renilla-GFP-Kopplung (Cormier (1978), Methods Enzymol., 57:237-244) und die Aequorin/Aequorea-GFP-Kopplung (Wilson und Brand (1998), Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 14:197-230). Ein Beispiel für ein konstruiertes System, das für BRET geeignet ist, ist eine Paarung aus RLUC und verstärktem gelben Mutanten von GFP (EYFP), die bei Abwesenheit von vermittelnden Proteinen zu einem signifikanten Grad nicht direkt allein miteinander interagieren (Y. Xu et.al. (1999), PNAS, 96:151-156).
Zu anderen Fluorophoren, die geeignete Paarungen für RLUC sind, gehören Fluorophore der GFP-Klassen 1, 2, 4 und manche von 5. Zu spezifischen Beispielen für geeignete Fluorophore gehören, ohne notwendigerweise darauf beschränkt zu sein: Wildtyp-GFP, Cycle 3, EGFP, Emerald, Topaz, 10C Q69K und 10C.
Zu anderen Kriterien, die beim Bestimmen geeigneter Paarungen für BRET berücksichtigt werden sollten, gehört das relative Emission/Fluoreszenz-Spektrum des Fluorophors im Vergleich zu dem von biolumineszentem Protein mit Luciferaseaktivität. Zum Beispiel wurde demonstriert, dass, basierend auf feststellbaren Emissionsspektrumsspitzen, eine RLUC/EGFP-Paarung nicht so gut ist wie eine RLUC/EYEF-Paarung (Y. Xu (1999), supra, und Wang u. a. (1997) in Bioluminescence and Chemiluminescence: Molecular Reporting with Photons, Hrsg. Hastings u. a. (Wiley, New York), S. 419-422).
Es dürfte für eine Person mit Erfahrung auf dem Gebiet offensichtlich sein, dass andere Nicht-GFP-Fluorophore oder andere biolumineszente Proteine mit Luciferaseaktivität für das BRET-System der vorliegenden Erfindung geeignet sein können, wenn die Schlüsselkriterien für die Paarung erfüllt werden. Zu anderen Quellen können zum Beispiel Paarungen gehören, die aus Insekten isoliert oder konstruiert wurden (US-Patent Nr. 5670356). Alternativ könnte es immer noch zu bevorzugen sein, dass das biolumineszente Protein mit Luciferaseaktivität und das Fluorophor von vollständig unterschiedlichen Quellen abgeleitet werden, um die Möglichkeit direkter Affinität zwischen den Paarungen zu minimieren.
Bei einer bevorzugten Ausführung werden eine Proteinfusion einer blaustrahlenden Luciferase (RLUC) und eines GFP-Mutant-Akzeptor-Fluorophors in E.coli exprimiert. Anfänglich probierten wir EGFP als Akzeptor aus, aber wie zuvor von Wang u. a. (1997) bei einem ähnli chen Fusionsprotein berichtet wurde, wurde lediglich eine kaum wahrnehmbare Schulter bei 508 nm zu dem RLUC-Emissionsspektrum hinzugefügt (Daten nicht gezeigt). Diese Schulter wurde als für eine Verwendung als BRET-Assay für Protein-Protein-Interaktion zu klein beurteilt. Wir prüften dann EYFP als Akzeptor-Fluorophor (Orm u. a., 1996), wobei die verwendeten ersten Konstrukte in 1(a) gezeigt werden. Das RLUC·EYFP-Fusionskonstrukt enthielt eine intergene Sequenz von 11 Aminosäureresten. Die Biolumineszenz/Fluoreszenz-Spektren von E.coli, die RLUC-, EYFP- und RLUC·EYFP-Konstrukte unter der Kontrolle des T7-Promotors enthielten, sehen so aus wie sie in 1(b) gezeigt sind. Sowohl die Erregungs- als auch die Fluoreszenzspektren der EYFP-exprimierenden E.coli sind gegenüber EGFP rotverschoben mit einer Erregungsspitze bei 480 nm und einer Fluoreszenzspitze bei 527 nm. Das Lumineszenzprofil der E.coli-Zellen, die das RLUC-Konstrukt exprimieren, zeigte ein typisches Emissionsspektrum für Renilla-Luciferase: ein eher breites Emissionsspektrum mit einer Einzelspitze bei 480 nm (1b). Das Lumineszenzspektrum von Zellen, die das RLUC·EYFP-Fusionskonstrukt exprimieren, lieferte hingegen ein bimodales Spektrum, wobei eine Spitze bei 480 nm zentriert war (wie bei RLUC) und eine neue Spitze bei 527 nm zentriert war (wie bei EYFP-Fluoreszenz). Diese Daten lassen darauf schließen, dass ein Anteil der RLUC-Lumineszenz an EYFP übertragen wurde und mit seiner charakteristischen Wellenlänge wieder emittiert wurde.
Es sollte bestätigt sein, dass sich die Donator- und Akzeptorfluorophore nicht unerwünscht miteinander assoziieren. Dies kann wie folgt erreicht werden:
Bei einer bevorzugten Ausführung unter Verwendung von RLUC und EYFP ist bestätigt, dass sich diese beiden nicht unerwünscht miteinander assoziieren und somit ein gutes BRET-Paar für eine Protein-Protein-Interaktionsuntersuchung zu sein scheinen. Nach Koexpression von separatem RLUC und EYFP (die beiden oberen Konstrukte in 1(a)) in denselben E.coli-Zellen (ohne IPTG-Induktion) sieht das Lumineszenzspektrum aus wie ein unverändertes RLUC-Spektrum und es gibt keinen Nachweis für eine zweite Spitze. Wenn jedoch EYFP und RLUC durch IPTG-Induktion überexprimiert wurden, stellten wir manchmal eine kleine zweite Spitze fest, was darauf schließen lässt, dass es schwachen BRET zwischen den beiden Proteinen gibt, der durch Überexpression erzwungen werden kann. Da wir ausreichende Signalniveaus unter Verwendung des T7-Promotors ohne IPTG-Zusatz erreichen konnten, konnten wir eine Verfahrensweise verwenden, bei dem sich RLUC und EYFP nicht durch sich selbst assoziieren. Alle weiteren Experimente, über die in dieser Schrift berichtet wird, wurden unter Bedingungen durchgeführt, bei denen wir nachwiesen, dass sich keine zweite Spitze in den RLUC und EYFP exprimierenden Zellen entwickelte.
Es sollten Prüfungen durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob die Donator- und Akzeptor-Fluorophore weiterhin BRET erzeugen, wenn sie mit interagierenden Proteinen fusioniert werden. Dies kann wie folgt durchgeführt werden:
Bei einer bevorzugten Ausführung wird geprüft, ob RLUC und EYFP weiterhin BRET erzeugen, wenn sie mit interagierenden Proteinen fusioniert werden. Als unsere Prüfproteine wählten wir die Tagesrythmus-Clock-Proteine KaiA, KaiB und KaiC aus dem Cyanobakterium Synechococcus (Ishiura et.al, 1998). Hefe-Zwei-Hybrid-Untersuchungen zeigen an, dass KaiB-Proteine ein Homodimer bilden können (Iwasaki u. a., 1998). Daher stellten wir Fusionskonstrukte von kaiB zu den Eyfp- bzw. Rluc-Genen her (2(a)) und ermittelten die Lumineszenzspektren von E.coli, die diese Konstrukte exprimierten. Wie in 2(b2) gezeigt, bildet sich eine zweite Spitze aus den Zellen, die sowohl RLUC·KaiB als auch EYFP·KaiB exprimieren, heraus. Die Ähnlichkeit zwischen dem Spektrum, das in 1(b) für das Fusionskonstrukt gezeigt wird, und 2(b2) lässt stark darauf schließen, dass Interaktion unter KaiB-Molekülen RLUC und EYFP in enge Nähe gebracht hat, so dass Energietransfer für –50 % der RLUC-Lumineszenz auftritt. Um zu demonstrieren, dass dieses bimodale Spektrum für die KaiB-Interaktion spezifisch ist, fusionierten wir EYFP mit KaiA und koexprimierten es mit RLUC·KaiB. In diesem Fall gibt es keinen Nachweis für eine zweite Lumineszenzspitze und somit kein Anzeichen für Interaktionen zwischen KaiA und KaiB (2(b3)). Wir fanden außerdem keine BRET-prüfbare Interaktion zwischen KaiB und dem dritten cyanobakteriellen Clock-Protein KaiC. Dieses letztgenannte Ergebnis ist etwas überraschend, da mit der Hefe-Zwei-Hybrid-Untersuchung eine KaiB-KaiC-Interaktion festgestellt wurde (Iwasaki u. a., 1998). Dieses negative Ergebnis war nicht auf veränderte Expressionsniveaus oder optische Aktivität der RLUC- und EYFP-Fusionsproteine zurückzuführen, da die RLUC-Signale und EYFP-Fluoreszenzniveaus bei allen E.coli-Stämmen ähnlich waren. Es könnte jedoch auf den Umstand zurückzuführen sein, dass wir nur N-terminale Fusionen von RLUC und EYFP mit den Kai-Proteinen untersucht haben und dass diese Ausrichtung das Auftreten von BRET verhinderte. Wie auch immer die Erklärung für die fehlende Kaib-KaiC-Interaktion bei unseren Messungen lautet, die Daten lassen darauf schließen, dass falsche Positiva bei dem BRET-Assay selten sein könnten.
Verfahren für chemisches oder genetisches Anheften der biolumineszenten und fluoreszierenden Proteine an die Proteine oder Polypeptide von Interesse
Es gibt eine Reihe von auf dem Gebiet wohlbekannten Verfahren zum chemischen oder genetischen Anheften des biolumineszenten Donor-Proteins und des fluoreszierenden Akzeptor-Proteins an die Zielproteine oder Polypeptide von Interesse.
VORTEILE UND BESCHRÄNKUNGEN DES BRET-SYSTEMS
Derzeit ist das Hefe-Zwei-Hybrid-System die populärste bibliothekenbasierte Technik zum Erkennen von Proteininteraktionen. Da dies eine Auswahltechnik ist, können potenzielle Interaktoren schnell erkannt und ohne extensives Screenen weiter charakterisiert werden. Abgesehen von diesem einzigen (jedoch zugegebenermaßen wichtigen) Vorteil sind optische Energietransfertechniken (d. h. FRET und BRET) dem Hefe-Zwei-Hybrid-System beim Prüfen von Proteininteraktionen potenziell überlegen. Zum Beispiel muss beim Hefe-Zwei-Hybrid-System Interaktion im Kern auftreten, während FRET- oder BRET-Interaktionen in unterschiedlichen Zellkompartimenten geprüft werden können, indem die markierten Konstrukte entsprechend zielgerichtet werden. Dieses Merkmal ist besonders wichtig bei interagierenden Membranproteinen, bei denen unwahrscheinlich ist, dass sie ein positives Resultat bei dem Zwei-Hybrid-Untersuchung erzielen. Darüber hinaus werden Interaktionen, die von zelltypspezifischen posttranslationalen Modifizierungen, die nicht in Hefe auftreten, abhängen, bei dem Zwei-Hybrid-Untersuchung offensichtlich nicht nachgewiesen. Theoretisch sollten FRET oder BRET in der Lage sein, diese Interaktionen aufzudecken. Nachdem ein mögliches interagierendes Paar mit dem Hefe-Zwei-Hybrid-Untersuchung gefunden wurde, ist weitere Charakterisierung durch Analysentechniken erforderlich. Dagegen können FRET und BRET sowohl Screening- als auch Analysetechniken sein. Potenzielle Interaktoren können durch Screenen von Bibliotheken in E.coli, Hefe oder dem Originalzelltyp identifiziert werden. Nachfolgende FRET/BRET-Analysen dieser Kandidaten können dann am Originalzelltyp durchgeführt werden, so dass die zelltypspezifische posttranslationale Modifikation und/oder Kompartimentierung der Proteine erhalten bleibt. Schließlich kann es in manchen Fällen möglich sein, FRET/BRET zum In-vivo-Prüfen der Kinetik von Änderungen bei Proteininteraktionen zu verwenden. All diese Vorteile sind besonders nützlich für Untersuchungen von Proteininteraktionen bei Säugerzellen mit Anwendungen für Membranproteininteraktionen und Hochdurchsatz-Screening.
Vergleich von BRET mit FRET
Da BRET keine Verwendung von Anregungsbelichtung erfordert, besitzt er gegenüber FRET potenzielle Vorteile. BRET dürfte bei Zellen überlegen sein, die entweder photoreaktiv sind (z. B. Retina oder lichtempfindliches Gewebe) oder durch die Wellenlänge von Licht, das zum Anregen von FRET verwendet wird (typischerweise nahes UV; Periasamy und Day, 1998), beschädigt werden. Zellen, die signifikante Eigenfluoreszenz aufweisen, würden ebenfalls besser durch BRET als durch FRET geprüft. Eigenfluoreszenz ist kein unübliches Problem; zusätzlich zu den Zelltypen, die ungewöhnliche Eigenfluoreszenzpigmente oder -kristalle aufweisen, besitzen fast alle Zellen Breitspektrum-Eigenfluoreszenz von NAD(P)H, ausgelöst durch nahes UV-Licht. Außerdem ist, während Photobleichung der Fluorophoren eine ernste Beschränkung für FRET sein kann, dies für BRET irrelevant. Eine subtilerer, aber dennoch signifikanter, Vorteil von BRET gegenüber FRET besteht darin, dass FRET für Komplikationen auf Grund von zeitgleicher Anregung sowohl der Donator- als auch der Akzeptor-Fluorophore anfällig ist. Im Besonderen ist es selbst bei monochromatischer Laser-Anregung praktisch unmöglich, nur den Donator anzuregen, ohne in gewissem Grad das Akzeptor-Fluorophor anzuregen. Daher müssen spezifische Nur-Akzeptor-Kontrollexperimente für FRET durchgeführt werden. Dagegen muss, da BRET keine optische Anregung beinhaltet, sämtliches Licht, das von dem Fluorophor emittiert wird, aus dem Resonanztransfer resultieren. In dieser Hinsicht ist BRET theoretisch FRET beim Quantifizieren von Resonanztransfer überlegen, aber es muss noch bestimmt werden, wie signifikant dieser Vorteil bei praktischen Anwendungen ist.
Manche Beschränkungen des BRET-Assays sollten beim Konstruieren des Systems berücksichtigt werden. Zum Beispiel ist der Förster-Resonanzenergietransfer von korrekter Ausrichtung der Donator- und Akzeptor-Dipole abhängig. Bei manchen Ausführungen der vorliegenden Erfindung können Konformationszustände der Fusionsproteine die Dipole in einer Geometrie fixieren, die für Energietransfer ungünstig ist. Da die Fluorophor/Luciferase-Markierungen mit Enden der potenziell interagierenden Moleküle fusioniert werden, ist es weiters möglich, dass manche Teile der Kandidatenmoleküle interagieren, ohne den Fluorophor/Luciferase-Markierungen zu ermöglichen, ausreichend eng angenähert zu sein, damit Energietransfer auftreten kann. Folglich könnten zwei Proteine auf eine Weise interagieren, die für die FRET/BRET-Technik blind ist. Mit anderen Worten: Ein negatives Ergebnis mit einer Resonanztransfertechnik ist kein Beweis für Nicht-Interaktion.
Eine andere Beschränkung, die mit der Verwendung von GFP-Varianten als Fluorophormarkierungen konkomitiert, besteht darin, dass GFP sich nicht schnell erneuert. Erstens dauert es wenigstens eine Stunde, bis sich das GFP-Molekül korrekt faltet (Chalfie u. a., 1994; Heim u. a., 1995; Heim u. a., 1995). Zweitens ist das GFP, sobald es gefaltet ist, bemerkenswert resistent gegen Proteolyse in Fremdzellen. Daher kann in manchen Fällen die langsame Kinetik des GFP-Umsatzes das Messen der Interaktionskinetik behindern. Dagegen leidet Renilla-Luciferase nicht unter denselben Nachteilen bei der Umsatzgeschwindigkeit. Daher könnte es, wenn sich eines der interagierenden Proteine schneller erneuert als das andere, für Kinetikschätzungen nützlich sein, das labilere Protein mit RLUC zu fusionieren.
Jedoch ist auch BRET nicht ohne eigene Einschränkungen. RLUC erfordert ein Substrat, das Coelenterazin. Coelenterazin ist hydrophob und scheint viele Zelltypen (E.coli, Hefe, Pflanzensaaten, Säugerzellkulturen) zu permeieren, aber es ist möglich, dass es manche Zellen gibt, die für Coelenterazin nicht permeabel sind. Coelenterazin kann außerdem signifikante Eigenlumineszenz in bestimmten Medien zeigen. Wir stellen wenig bis keine Coelenterazin-Eigenlumineszenz in einfachen Salzmedien fest, aber dies könnte ein ernsteres Problem in komplexen Medien sein. Darüber hinaus könnte mangelnde Empfindlichkeit in manchen Fällen das Verwenden von BRET behindern. Je nach Expressionsniveau von RLUC kann die Lumineszenz vage sein und für Verhältnisabbildung wird lediglich ein kleiner Anteil des Gesamtlichts gesammelt. Daher ist eine sehr empfindliche Messvorrichtung erforderlich.
BEISPIELE
BEISPIEL I: KONSTRUKTION DER RLUC·EYFP-FUSIONS-EXPRESSIONSKASSETTE
Die Vektoren, die zum Erzeugen von Expressionskassetten von RLUC, EGFP, EYFP und deren Fusionen verwendet wurden, lauteten wie folgt: RLUC verwendete pRL- null (Promega, Madison, WI), während EGFP und EYFP pEGFP-N1 bzw. pEYFP verwendeten (beide von CLONTECH, Palo Alto, CA). pRSET wurde außerdem als Shuttle-Vektor verwendet (Invitrogen, Carlsbad, CA). Tabelle 1 nennt die verwendeten Konstrukte. Tabelle 1 Expressionsstämme, die bei dieser Studie verwendet wurden

*Km: Kanamycin; Amp: Ampicillin

Eine RLUC·EGFP-Fusionskassette wurde konstruiert, indem das Stoppcodon TAA von Renilla-Luciferase-cDNA (Rluc) entfernt wurde und Linker-Sequenzen hinzugefügt wurden, so dass die stromabwärts gelegene EGFP-codierende Region mit der des stromaufwärts gelegenen RLUC in Phase befand. Basierend auf pRL-Null-DNA-Sequenzen wurden zwei Primer zum Klonen der RLUC-codierenden Region mit einem T7-Promotor unter Verwendung von Pwo-DNA-Polymerase (BOEHRINGER MANNHEIM, Indianapolis, IN) konstruiert: 5'-(NdeI)CATATGCTTAAGGCTAGAGTACT-3' (SEQ ID NO:1) und 5'-(ApaI)GGGCCCGTTGTTCATTTTTGAGAAC-3' (SEQ ID NO:2), wobei die Linker-Sequenzen unterstrichen sind. Diese Primer wurden verwendet, um ein 992 bp-Fragment von der pRL-Null-Matrize zu amplifizieren, das dann in die NdeI/ApaI-Stelle des Vektors pEGFP-N1, der ein verstärktes grün fluoreszierendes Proteingen (Egfp) enthielt, inseriert wurde, um das Plasmid pRluc·Egfp unter der Kontrolle eines T7-Promotors zu ergeben, was eine P_T7/Rluc·Egfp-Fusions-Expressionskassette hervorbrachte. Diese Insertion entfernte außerdem den Human-Cytomegalovirus(CMV)-Promotor von pEGFP-N1. Die intergene Sequenz, die zwischen Rluc und Egfp erzeugt wurde, lautete 27bp:5'-CGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACC-3' (SEQ ID NO:3). Dieses Genfusionskonstrukt wurde durch DNA-Sequenzierung, RLUC-Lumineszenz und GFP-Fluoreszenz bestätigt.
Zum Herstellen der Rluc·Eyfp-Genfusion wurde die EGFP-codierende Region in dem pRluc·Egfp durch das BamHI/NotI-Fragment von verstärkter gelb fluoreszierendes Protein co dierender Sequenz (Eyfp) aus dem Vektor pEYFP (von CLONTECH) ersetzt, um das Plasmid pT7/Rluc·Eyfp zu produzieren, bei dem sich das EYFP-Open-Reading-Frame mit dem von RLUC in Phase befindet. Es gibt 11 Codons zwischen Rluc und Eyfp bei dieser Genfusion, wie in 3(a) gezeigt. Zum Erzeugen des pT7/Rluc-Plasmids wurde die EYFP-codierende Region aus pRluc·Eyfp durch Digestion mit BamHI und NotI, Endabstumpfung und Selbst-Ligation entfernt.
BEISPIEL II: KLONIERUNG VON CYANOBAKTERIELLES CLOCK PROTEIN CODIERENDEN REGIONEN
Das aus Genkomplementierungsexperimenten gewonnene Plasmid p48N, das den cyanobakteriellen Tagesrythmus-Clock-Gencluster kaiA, kaiB und kaiC trägt (Ishiura u. a., (1998) Science, 281, 1519-1523), wurde als Matrize zur Klonierung der kai-codierenden Regionen verwendet. Um die Codierregion-Sequenzen für kaiA oder kaiB in Phase mit His-Tag (einer ProBond-Bindungsdomäne) zu fusionieren, wurden die folgenden beiden Primer-Paare konstruiert und sie enthalten die unterstrichenen Linker-Sequenzen: 5'-(BgIII)AGATCTATGCTCTTGGAGTATGC-3' (SEQ ID NO:4) und 5'-(HindIII) AAGCTTCGAGCTTAAGACCTCCT-3' (SEQ ID NO:5) (zum Klonieren von kaiA); 5'-(BglII) AGATCTATGAGCCCTCGTAAAACCTAC-3' (SEQ ID NO:6) und 5'-(HindIII) AAGCTTGCAGTTAACGACAGTTAGAAG-3' (SEQ ID NO:7) (zum Klonieren von kaiB), wobei die Restriktionsorte unterstrichen sind und die Startcodons fett gedruckt sind. Das 766-bp-kaiA-Fragment und das 323-bp-kaiB-Fragment, das durch Pwo-DNA-Polymerase amplifiziert wurde, wurden jeweils in die BglII/HindIII-Stelle des Expressionsvektors pRSET-B kloniert, um die Plasmide pHis·kaiA bzw. pHis·kaiB entstehen zu lassen. Beide Sequenzen dieser Konstrukte und die korrekten Molekülmassen der Fusionsproteine His·KaiA und His·KaiB wurden durch Techniken, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind und/oder die hierin beschrieben werden, bestätigt.
Fusion der codierenden Sequenzen für cyanobakterielle Tagesrythmus-Clock-Proteine mit Rluc oder Eyfp
Nachdem das Plasmid pHis·kaiB mit HindIII verdaut wurde, wurden die zurückgesetzten 3'-Enden mit dem Klenow-Fragment von E.coli-DNA-Polymerase gefüllt. Die linearisierten Plasmide wurden dann vollständig mit BamHI verdaut. Die gereinigten HindIII (stumpfes Ende)/BamHI-Fragmente der kaiB-codierenden Region vollständiger Länge wurden verwendet, um die EYFF-codierende Region in dem pRluc·Eyfp-Plasmid zu ersetzen, die mit NotI (stumpfes Ende durch Klenow-Fragment-Digestion erzeugt) und BamHI verdaut wurde, um pRluo·kaiB zu produzieren, bei dem sich die kaiB-codierende Region in Phase mit der von RLUC befindet. Das Konstrukt wurde durch Restriktionsenzymanalyse und In-vivo-RLUC-Lumineszenz-Assay, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind und/oder die hierin beschrieben werden, bestätigt.
Zum Erzeugen von Expressionskassetten mit einer phasengleichen Fusion von Clock-Proteinen mit EYFP, wurde eine EYFP-codierende Sequenz ohne Stoppcodon durch Konstruktion der folgenden beiden Primer synthetisiert, wobei die unterstrichenen Linker-Sequenzen enthalten waren: 5'-(NdeI)CATATGGTGAGCAAGGGCGA-3' (SEQ ID NO:8) und 5'-(BglII)AGATCTCTTGTACAGCTCGTCCA-3' (SEQ ID NO:9), wobei die Restriktionssequenzen unterstrichen sind und die ersten und letzten Codons für EYFP fett gedruckt sind. Dieses Fragment wurde in die NdeI/BgIII-Stellen von pHis·kaiB bzw. pHis·kaiB inseriert. Durch diese Insertion wurde das His-Tag und die Enterokinase-Stellen-Sequenzen von pRSET entfernt und die beiden Plasmide pEyfp·kaiA und pEyfp·kaiB produziert. Diese Konstrukte wurden durch DNA-Sequenzierung und In-vivo-EYFP-Fluoreszenz-Untersuchungen, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind und/oder die hierin beschrieben werden, bestätigt. Die kaiB-codierende Region in pEyfp·kaiB wurde durch Digestion mit BglII und HpaI entfernt und ligiert, um das Plasmid pT7/Eyfp herzustellen.
Bakterienstämme und bakterielle Transformation
Der zum Klonieren verwendete Wirtsstamm war E.coli DH5α. Zur Expression von Rluc, Eyfp und aller Genfusionen, die durch T7-Promotor kontrolliert wurden, wurde E.coli BL21 (DE3) als Wirtsstamm verwendet (Novagen, Madison, WI). Der Expressions-Wirtsstamm wurde mit Einzel- oder Doppelplasmiden transformiert, wobei mit Kalziumchlorid präparierte kompetente Zellen verwendet wurden. Alle Transformanten wurden mit Lumineszenz- und/oder Fluoreszenz-Untersuchungen bestätigt. Für diese Studie wurden verschiedene Stämme, die mögliche Kombinationen von Fusionsproteinen enthielten, hergestellt und analysiert. Tabelle 1 führt diese transformierten Stämme auf.
BEISPIEL III: IN VIVO BIOLUMINESZENZ- UND FLUORESZENZ-UNTERSUCHUNG
Über Nacht wurden E. coli-Stämme in LB-Medium, das 50 μg/ml Kanamycin und/oder 100 μg/ml Carbenicillin (für ampicillinresistente Stämme) enthielt, bei 37 °C gezüchtet. Da LB-Medium Hintergrundfluoreszenz aufweist, wurden die E.coli-Stämme vor der Untersuchung gewaschen und in M9-Minimalsalzmedium resuspendiert. Zum Prüfen von EYFP-Fluoreszenz wurden 1,5 ml E.coli-Zellen in M9-Medium (OD₆₀₀ = 0,8-1,0) in eine 2-ml-Küvette übertragen. Die Fluoreszenzanregungs- und Emissionsmessungen wurden auf einem SPEX (Edison, NJ) Fluorolog Spektrofluorometer mit einer 250 W Xenonbogenlampe durchgeführt. EYFP-Fluoreszenz wurde bei 470 nm angeregt und ihre Emission von 505 bis 580 nm gescannt. Für die Lumineszenz-Untersuchung wurde die Lampe ausgeblendet und die Küvette wurde sanft mit Luft durchperlt, um ausreichend Sauerstoff für die Renilla-Luciferase-Reaktion, die dem Zusatz von Coelenterazin (BioSynth) folgte, zuzuführen, wobei sich eine Schlusskonzentration von 1 μM ergab. Die Biolumineszenzspektren wurden zwischen den Wellenlängen 440 bis 580 nm erfasst.
3a zeigt die unterschiedlichen Konstrukte und die Linker-Region, die für dieses Beispiel hergestellt wurden. EYFP wurde als Akzeptor-Fluorophor mit den in 3a gezeigten Konstrukten geprüft. Die Biolumineszenz- und Fluoreszenzspektren von E. coli, die Rluc-, EYFP- und Rluc::EYFP-Konstrukte unter der Kontrolle von T7-Promotor enthielten, sind in 3b gezeigt. Das Lumineszenzprofil der E.coli-Zellen, die das Rluc-Konstrukt exprimieren, zeigte ein typisches Emissionsspektrum für Rluc (Renilla-Luciferase) mit einer einzelner Wertspitze bei 480 nm (3b). Das Lumineszenzspektrum von Zellen, die das Rluc::EYFP-Fusionskonstrukt bei Coelenterazinzusatz exprimieren, ergab ein bimodales Spektrum, wobei eine Wertspitze bei 480 nm (Rluc) zentriert war und eine neue Wertspitze bei 527 nm (wie bei EYFP-Fluoreszenz) zentriert war. Diese Daten lassen darauf schließen, dass ein signifikanter Anteil der Rluc-Energie übertragen und mit der charakteristischen Wellenlänge von EYFP emittiert wurde. Da Rluc und EYFP ein gutes BRET-Paar für eine Protein-Protein-Interaktions-Untersuchung zu sein scheinen, wollten wir nachweisen, dass sie sich nicht unerwünscht miteinander assoziieren. Nach Koexpression von separatem Rluc und EYFP (die beiden oberen Konstrukte in 3a) in denselben E.coli-Zellen (ohne IPTG-Induktion) sieht das Lumines zenzspektrum wie ein unverändertes Rluc-Spektrum aus – es gibt keinen Nachweis für eine zweite Wertspitze (4b, Spektrum b1).
Auf der Basis des Beispiels von interagierendem Clock-Protein, das bei Xu u. a. ((1999), Proc. Natl. Acad. Sci. 96, S. 151-156) beschrieben wurde, entschieden wir, zu prüfen, ob die BRET-Untersuchung dazu verwendet werden kann, um Interaktion zwischen den kai-Proteinen zu entdecken. Daher stellten wir Fusionskonstrukte von kaiB mit den EYFP- bzw. Rluc-Genen her (4a) und ermittelten die Luminenzspektren von E.coli, die diese Konstrukte exprimieren. Wie in 4b (Spektrum b2) gezeigt, erscheint eine zweite Wertspitze aus Zellen, die sowohl Rluc::kaiB als auch EYFP::kaiB exprimieren. Die Ähnlichkeit zwischen dem Spektrum, das in 3b für das Fusionskonstrukt (Rluc::EYFP) gezeigt wird, und der Kombination von Rluc::kaiB und EYFP::kaiB in 4b (b2)lässt stark darauf schließen, dass Interaktion unter kaiB-Molekülen Rluc und EYFP in enge Nähe gebracht hat, so dass Energietransfer zwischen Rluc und EYFP auftritt. Um zu demonstrieren, dass dieses bimodales Spektrum nicht unspezifisch auftritt, fusionierten wir EYFP mit einem leicht gestutzten kaiA (siehe 4a) und koexprimierten es mit Rluc::kaiB-Konstrukt. Wie erwartet gibt es, da kaiA und kaiB nicht gemeinsam interagieren sollten, keine zweite Lumineszenzspitze (4b, Diagramm b3) und somit keinen Hinweis auf Interaktion zwischen kaiA und kaiB.
BEISPIEL IV: IN VITRO BRET-UNTERSUCHUNG FÜR KAIB-KAIB-INTERAKTION
Bei diesem Beispiel wird das BRET-Verfahren demonstriert, indem Interaktionen zwischen Proteinen, die durch Tagesrythmus-Clockgene codiert werden, geprüft werden. Bei Cyanobakterien, Drosophila (Gekakis u. a., (1995) Science 270, 811-81) und Säugern (King et. al., (1997) Cell, 89, 641-653; Tei et. al., (1997) Nature (London) 389, 512-516; und Albrecht et. al., (1997)) scheinen Interaktionen zwischen Proteinen, die durch Clockgene codiert werden, eine wichtige Rolle bei der Funktion der Zeitmessschleife zu spielen. Die Tagesrythmus-Clockgene kaiA und B von Cyanobakterien (Ishiura u. a., (1998) Science, 281, 1519-1523) wurden daher verwendet, um das BRET-Prinzip zu demonstrieren.
Zwei Expressionsstämme, RLUC·KaiB und EYFP·KaiB, wurden verwendet, um KaiB-zu-KaiB-Interaktion in vitro zu untersuchen, und der RLUC·EYFP-Fusionsstamm (pRluc·Eyfp) wurde als positive Kontrolle verwendet. Eine Einzelkolonie von jedem Stamm wurde in LB-Medium mit 50 μg/ml Kanamycin oder 100 μg/ml Carbenicillin inokuliert und über Nacht bei 37 °C gezüchtet. Die Zellen wurden ein Mal mit frischem LB-Medium gewaschen und in demselben Medium, das 1 mM IPTG enthielt, resuspendiert. Nach dreistündiger Inkubation bei 37 °C wurden die Zellen gesammelt und ein Mal in Untersuchungs-Puffer (50 mM KCl, 50 mM NaCl, 2,5 mM MgCl₂, 2 mM EDTA, 5mM DTT, 0,2 % NP40, 100 μg/ml PMSF, 2 μg/ml Leupeptin, 2 μg/ml Aprotinin und 20 mM HEPES, pH 8,0) gewaschen. Die Zellen wurden dann in frischem Untersuchungs-Puffer, der 10 μg/ml Lysozym enthielt, bei 4 °C resuspendiert und 30 min auf Eis gehalten. Mikrozentrifugengläser, die die Zellen enthielten, wurden in ein EtOH-Bad von –70 °C platziert, um die Zellen schnell einzufrieren, und wurden dann auf Eis platziert. Ein gleiches Volumen an frischem Untersuchungs-Puffer wurde in die Zelllysate hinzugefügt. Nachdem die Mischungen 5 min in einer Mikrozentrifuge bei 8.000 U/min (4 °C) geschleudert wurden, wurden die Überstände wie oben auf Fluoreszenz und Lumineszenz geprüft, wobei jedoch keine Luft in die Extrakte eingeperlt wurde. Um KaiB-KaiB-Interaktion in vitro durch BRET zu überwachen, wurden RLUC·KaiB-Extrakte 1:1 mit EYFP·KaiB-Extrakten gemischt und danach bei Raumtemperatur inkubiert; die Lumineszenzspektren wurden 0 min, 30 min und 120 min nach dem Mischen aufgenommen.
5 stellt Spektren dar, die aus dem Mischen von E.coli-Extrakten aus zwei unterschiedlichen Kulturen abgeleitet wurden, wobei eine Rluc::kaiB exprimierte und die andere EYFP::kaiB exprimierte. Sofort nach dem Mischen gibt es keinen Nachweis für die zweite Wertspitze. Nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur (zweites Diagramm), hat sich eine signifikante Schulter an dem Spektrum herausgebildet. Am 30-Minuten-Inkubationspunkt hat die Intensität der Rluc-Lumineszenz abgenommen, wahrscheinlich auf Grund von Proteolyse in dem Extrakt. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur zeigte die Lumineszenz ein klares bimodales Spektrum.
BEISPIEL V: BRET-ABBILDUNG VON E.COLI-KULTUREN
Ungefähr 1,5 ml E.coli-Kulturen, die über Nacht bei 37 °C in LB-Medium mit geeigneten Antibiotika gezüchtet wurden, wurden zwei Mal mit M9-Medium gewaschen. Das Zellpellet wurde in 300 ml M9-Medium, das 3 μM Coelenterazin enthielt, resuspendiert. Fünf Mikroliter der Suspension wurden sofort zu den Kammern einer Nunc-Mikrotiterplatte hinzugefügt. Das kleine Volumen der Probe ermöglichte guten Gasaustausch und daher war kein Durchperlen erforderlich (6). Für jeden Stamm wurden acht Duplikate hergestellt, die dann in zwei Grup pen aufgeteilt wurden. Eine Gruppe wurde durch einen 480nm(± 5 nm)-Interferenzfilter sichtbar gemacht und die andere durch einen 530nm(± 5 nm)-Filter (Ealing Electro-Optics, Holliston, MA). Die Bilder wurden mit einer gekühlten CCD-Kamera (TE/CCD512BKS, Princeton Instruments, Trenton, N. J.) festgehalten, wobei dies durch eine spezielle Software, die von Dr. Takao Kondo (Kondo et.al., (1994) Science 266:1233-1236) gesteuert und analysiert wurde. Dieses Beispiel zeigte außerdem, dass BRET unter Verwendung einer Technologie auf CCD-Kamera-Basis nachgewiesen und gemessen werden kann.
7 stellt die Quantifizierungsanalyse der Lumineszenzintensität (in RLU) von 6 dar, wenn die beiden Interferenzfilter 480 nm und 530 nm (oberes Diagramm) verwendet werden. Das untere Diagramm zeigt das Lumineszenzintensitätsverhältnis, das mit dem 530nm-Filter ermittelt wurde, gegenüber der Lumineszenzintensität, die mit dem 480nm-Filter ermittelt wurde. Die in beiden 6 und 7 zu findenden a, b, c und d stellen jeweils Rluc, Rluc::EYFP, Rluc::kaiB und EYFP::kaiA und Rluc::kaiB und EYFP::kaiB dar. Die 530/480nm-Lumineszenzverhältnisse für die Rluc-Kontrolle (a) und das nichtinteragierende Paar kaiA und kaiB (c) sind niedrig (ungefähr 0,4), während die 530/480nm-Verhältnisse für das Rluc::EYFP-Fusionskonstrukt und für die interagierenden kaiB-Fusionsproteine über 0,9 liegen.
BEISPIEL VI: DEMONSTRATION DER VERWENDUNG DES VERFAHRENS FÜR IN-VITRO-FUSIONSUNTERSUCHUNG
Fusionsuntersuchungen werden erreicht, wenn der Rluc-Anteil (Donator) entweder genetisch oder chemisch an den Fluorophor-Akzeptor-Anteil, das EYFP, angeheftet wird. Eine Linker-Region ist zwischen den beiden Anteilen zu finden. Spezifische Orte mit spezifischen Funktionen könnten in diese Linker-Region eingeführt werden. Bei diesem Beispiel wurde ein spezifischer Protease-Ort für die Enterokinase zwischen dem Rluc und dem EYFP eingeführt. Bei Interaktion der Enterokinase mit ihrem Ort in dem Sensor (Rluc-Enerokinase-EYFP) zerschneidet das Enzym die Linker-Region, die wiederum die zwei Anteile trennt. Daher sollten wir ein Absinken von BRET beobachten (d. h. das Verhältnis 550/470 nm sollte abnehmen).
Die DNA-Konstrukte, die zur Durchführung dieses Experiments erzeugt wurden, sind die folgenden: Rluc Ursprung des Gens (pRL-CMV-Promega, Madison, WI), Rluc·EYFP Ursprung des Gens (Xu et.al., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA, 96:151-156) und Rluc:Enerokinase:EYFP Ursprung des Gens (dieses Konstrukt wird durch Einleitung von DNA- Sequenzen, die die Lnterokinase-Erkennungsstelle codieren, in die Linker-Region am Rluc·EYFP-Konstrukt konstruiert).
Die Enterokinase-Stelle wird in die Linker-Region von Rluc·EYFP (Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Leu) eingeführt, wenn das Enterokinase-Enzym die vier Asp und das Lys erkennt und den Peptid-Linker, der sich nach der Aminosäure Lys befindet, abschneidet.
Die beiden Oligonucleotide (Sense und Antisense), die mit der Enterokinase-Stelle korrespondieren (BRL/Gibco-Life Technologies, Gaethersburg, MD), waren zueinander komplementär und wurden unter Verwendung von Molekularbiologietechniken, die den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt sind, per Annealing miteinander verbunden. Der DNA-Doppelstrang wurde so konstruiert, dass er nach dem Annealing kohäsive Enden (BamHI(5'-Ende) und KpnI(3'-Ende)) aufwies, und wurde an den BamHI-KpnI-Stellen in das Rluc·EYFP-Konstrukt subkloniert.
Die folgenden sind die DNA-Sequenzen, die mit der Enterokinase-Stelle korrespondieren (Sense und Antisense) und kohäsive Enden aufweisen:
5'GATCCGGGCGACGATGACGATAAGTTGGCGGTA3' (SEQ ID NO:10) Sense-Oligonucleotid
5'CGCCAACTTATCGTCATCGTCGCCCG' (SEQ ID NO:11) Antisense-Oligonucleotid
Die drei vorgenannten DNA-Konstrukte wurden verwendet, um ihre korrespondierenden Proteine in Bakterien zu produzieren, die wiederum als Substrate für das Enterokinase-Enzym in dem BRET-Assay verwendet wurden (siehe unten).
Alle drei DNA-Konstrukte werden phasengleich mit den His-Tag-Sequenzen in das pQE-Plasmid (Qiagen, Mississauga, ON) subkloniert. Dies erfolgt durch Einführen einer His-Markierung an dem N-Terminus der Konstrukte. Die His-Markierung dient dazu, die unterschiedlichen Genprodukte aus den Bakterienlysaten unter Verwendung der Technologie auf Nickel(Ni)-Kügelchen-Basis (QIAexpress kits, Qiagen, Mississauga, ON) zu reinigen. Alle Kon trukte (Rluc-Gen allein, Rluc·EYFP und Rluc::Enterokinase:EYFP) werden an den folgenden Restriktionsorten in den pQE-32-Vektor subkloniert: Tabelle II

*All diese Orte wurden abgestumpft, bevor sie in das pQE-32-Plasmid subkloniert wurden, wobei das Klenow-Enzym unter Standard-Molekularbiologietechniken, die den Fachleuten auf dem relevanten Gebiet bekannt sind, verwendet wurde (Ausubel, F. M. et.al., Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1 (1995), John Wiley & Sons, Inc., und Sambrook, J. u. a., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Die DNA-Sequenzen für die beiden Fusionskonstrukte, die bei diesem Beispiel erforderlich sind, werden in den 57 und 58 dargestellt. Rluc-DNA-Sequenz ist bei GeneBank unter der Zugangsnr. M63501 zu finden.
Die DNA-Konstrukte in den pQE-32-Vektoren wurden dann in ein geeignetes Bakterium (M15) zur Proteinexpression transfiziert. Die Bakterien wurden in 100 ml LB-Medium inokuliert und 4 Stunden bei 37 °C gezüchtet, bis sie eine Dichte von 0,6 OD₆₀₀ erreichten. Die Proteinexpression wurde induziert durch Hinzufügen von IPTG (1 mM) in die Bakterienkulturen für 16 Stunden bei 37 °C. Die unterschiedlichen Proteine wurden von den Bakterienlysaten unter Verwendung von 0,5 ml Ni-NTA-Harz gereinigt, wie durch ein Standard-Protokoll des Herstellers beschrieben (Qiagen, Mississauga, ON). Die gereinigten Proteine wurden dann entsalzt und konzentriert (auf ein Volumen zwischen 400 bis 700 ul), wobei ein Centriprep-10 oder -30 und Centricon-10 oder 30 (Amicon, Beverly, MA) mit einem PBS+NaCl-250mM-Puffer verwendet wurden. Proteinkonzentrationen wurden durch den Bradford-Assay (Bradford, M. M., 1976, Anal. BioChem, 72:248-254) unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard bestimmt. Nach der Reinigung wurden die Proteine bei der Enterokinase-BRET-Untersuchung verwendet. Die Reinheit des extrahierten Proteins, die zwischen 60 bis 80 % liegt, wurde durch SDS-PAGE bestimmt.
Die BRET-Untersuchung wurde durchgeführt, indem 60 bis 100 μg gereinigte Proteine für jede Kammer mit dem BRET-Untersuchungs-Puffer (PBS+Ca2+ 1mM Mg2+0,5 mM + Glucose (1 g/l) + 10 mM DTT) zu einem Gesamtvolumen von 150 μl gemischt wurden. Jede Untersuchung wurde als Triplikat (d. h. drei Kammern) in der 96-Kammer-Optiplate-Platte (Packard, USA) ausgeführt. Die Hälfte der Untersuchung erfolgte in Anwesenheit von zwei Einheiten des Enterokinase-Enzyms (Invitrogen, Carlsbad, CA). Coelenterazin h (Molecular Probes, Eugene, OR) mit einer Konzentration von 20 μM/50 μl wurden jeder Kammer hinzugefügt, um die Biolumineszenzreaktion von Rluc zu starten. Die Endkonzentration von Coelenterazin h betrug 5 μM. Das Gesamtvolumen der Untersuchung betrug 200 μl. Nach dem Zusatz des Coelenterazin h wurden die Mikrotiterplatten in den BRETCount^TM eingebracht. Der Nachweis erfolgte unter Verwendung des BRET-Count bei 30 °C für vier Stunden. Für jeden Zeitpunkt und Untersuchung wurden Verhältnisse berechnet, indem der Emissionslichtausstoß bei 550 nm durch den Emissionslichtausstoß bei 470 nm dividiert wurde.
Ein Beispiel für die Ergebnisse lautet wie folgt. Nur das Verhältnis für das Konstrukt Rluc::Enterokinase:EYFP nahm in Anwesenheit des Enterokinase-Enzyms (E) im Verlauf der Zeit ab (8), wodurch demonstriert wurde, dass im Verlauf der Zeit immer mehr Konstrukte geschnitten wurden. Die Verhältnisse aus den negativen Kontrollen (Rluc und Rluc·EYFP) zeigten in Anwesenheit (E) oder Abwesenheit des Enterokinase-Enzyms keine Veränderung im Verlauf der Zeit.
Im Allgemeinen zeigt diese Untersuchung, dass BRET mit teilweise gereinigten Proteinen durchgeführt werden kann. Weiters demonstriert sie die Nützlichkeit des Fusionstyps von BRET durch die Insertion spezifischer Aminosäuresequenzen (Proteaseort, Phosphorylierungsort oder ein Ort, der Analyte erkennt, z. B. Ca2+) zwischen den beiden Anteilen.
Der TopCount ist ein Mikrotiterplattenszintillations- und Lumineszenzzähler, der von Packard Instrument (Meriden, CT) vertrieben wird. Im Gegensatz zu einem klassischen Zähler, bei dem zwei Photoelektronenvervielfacher (PMT) in Koinzidenz verwendet wurden, um Rauschentwicklung zu reduzieren, wird bei dem TopCount eine Einzel-PMT-Technologie und eine zeitaufgelöste Impulszählung zur Reduzierung der Rauschentwicklung eingesetzt, um das Zählen bei einer opaken Standardformat-Mikrotiterplatte zu ermöglichen. Die Verwendung von opaken Mikrotiterplatten kann optische Kreuzkopplung auf zu vernachlässigende Niveaus reduzieren.
Der TopCount ist in verschiedenen Formaten (z. B. 1, 2, 6, 12 Detektoren (PMT)) erhältlich, die je nach Format 1, 2, 6 oder 12 Proben gleichzeitig lesen können.
Ein modifizierter 2-Detektoren-TopCount (BRETCount) wurde zum Messen von BRET verwendet. Zu den Modifikationen gehörten das Positionieren der Bandpass-Interferenzfilter unter jedem TopCount-PMT (zwischen dem PMT und der Detektorbefestigungsplatte) und Anpassen der TopCount-Software, um jedem PMT zu ermöglichen, jede Kammer einer Mikrotiterplatte zu lesen. Diese Änderungen ermöglichen den sequenziellen Nachweis von Licht bei spezifischen Wellenlängen, die von den Proben emittiert wurden. Entsprechend erhielten wir für jede Kammer (oder Probe) zwei Lichtausgabewerte entsprechend jedem Filter. Neben seinem Durchsatz (Mikrotiterplattenleser) ist der TopCount ein temperaturgesteuertes Instrument, das beim Durchführen von zellbasierten Untersuchung oder Zeitverlaufexperimenten nützlich ist.
Die Bandpass-Interferenzfilter wurden auf Basis von Emissionsspektren, die in 3b und 22 zu finden sind, konstruiert. Die beiden verwendeten Filter waren 1) für die Akzeptor-Emission (Fluorophor): 550DF80 (Omega Optical Inc., Brattleboro, VT); und 2) für die Donator-Emission (biolumineszentes Protein): 470DF60 (Omega Optical Inc., Brattleboro, VT).
BRET wird entweder durch Teilen des Lichtausstoßes für die 550nm-Filter durch die 470nm (Akzeptor/Donator) oder das Gegenteil gemessen. Die Instrumentenparameter, die für den BRETCount verwendet wurden, waren Lumineszenz-SPC-Modus und Leselänge von 1 sec für jeden PMT.
BEISPIEL VII: KONSTITUTIVE PROTEIN-PROTEIN-INTERAKTION
Die Interaktion der kaiB-Domäne, die an dem Tageszyklus von Bakterien beteiligt ist, mit sich selbst ist wohldokumentiert worden (Xu et.al., 1999, Proc. Natl. Sci, USA, 96:151-156). Dieses System besteht aus drei Proteinen, die als kai A, B und C identifiziert wurden, und wird zum Untersuchen der BRET-Technologie verwendet.
Die kai-basierten Konstrukte (Xu et. al., 1999, Proc. Natl. Sci, USA, 96:151-156) wurden wie folgt in Säuger-Expressionsvektoren subkloniert: Die beiden Konstrukte (pT7/EYFP-KaiB; pT7/EYFP-kaiA) wurden mit dem Restriktionsenzym XbaI-HindIII geschnitten, um das resultierende Fusionsgen (EYFP-kaiB; EYFP-kaiA) zu gewinnen. Das verbleibende Konstrukt pT7/Rluc-kaiB wurde mit dem Restriktionsenzym NheI-HpaI geschnitten, um das Rluc-kaiB-Fusionsgen zu gewinnen. Die Fusionsgene wurden dann in die Mehrfachklonierungsstelle von pCDNA3.1(–)zeo (Invitrogen, Carlsbad, CA) inseriert und mit demselben Enzym verdaut, das zum Erzeugen des jeweiligen Fusionsgens verwendet wurde.
Die BRET-Untersuchung wurde wie folgt durchgeführt. Zuerst wurden CHO-K1-Zellen unter Verwendung der Ausrüstung LipofectAMINE^TM (BRL/Gibco-Life technology, Geathersburg, MD) in 100mm-Platten mit den folgenden Kombinationen der DNA-Konstrukte vorübergehend transfiziert: pCDNA3.1/Rluc-kaiB allein; pCDNA3.1/Rluc-kaiB + pCDNA3.1/EYFP-kaiB und pCDNA3.1/Rluc-kaiB + pCDNA3.1/EYFP-kaiA.
Wenn Kombinationen von Vektoren verwendet wurden, wurde eine Gesamtmenge von 8 μg DNA verwendet. Jede Zellprobe wurde mit 4 oder 5 μg von jedem Konstrukt mit ausreichender Träger-DNA (pCDNA3.1(–) Wildtyp) transfiziert, um die Menge insgesamt auf 8 μg zu bringen.
Nach der Transfektion wurden die Zellen 48 Stunden später mit einer Mischung aus PBS Ca2+ 1 mM/Mg2+ 0,5 mM + Glucose 1 g/l + Aprotinin 2 μg/ml + DTT 10 mM gewaschen und gezählt. Die transfizierten Zellen werden in eine weiße Optiplate mit 96 Kammern (Packard, USA) mit einer ausreichenden Dichte verteilt, um eine gute Biolumineszenzreaktion zu gewährleisten (bei diesem Beispiel wurden 50.000 Zellen pro Kammer in 150 μl verwendet). Die Zellen wurden in denselben Puffer, der für die Wäsche benutzt wurde, plattiert. Zum Starten der Biolumineszenzreaktion wurden 50 μl Coelenterazin h (Molecular Probes, Eugene, OR) mit einer Konzentration von 20 μM zu jeder Kammer hinzugefügt. Die Endkonzentration von Coelenterazin betrug 5 μM. Die Mikrotiterplatten wurden dann in den BRETCount geladen, um die Lichtemissionsmessungen bei 25 °C unter Verwendung einer Leselänge von 1 sec pro Filter durchzuführen.
BEISPIEL VIII: REGULIERTE PROTEIN-PROTEIN-INTERAKTION
Das cAMP-Reaktionselementbindungs(CREB)-Protein ist ein wohlbekannter Transkriptionsfaktor, der an dem cAMP-Weg beteiligt ist. Wenn die zellulären cAMP-Niveaus durch Aktivierung des cAMP-Wegs steigen, löst dies die Aktivierung der Proteinkinase A (PKA) aus, was wiederum CREB phosphoryliert. Sobald die Phosphorylierung erfolgt ist, wird CREB durch die anderen zellulären Faktoren, wie dem CREB-Bindungsprotein (CBP) erkannt. Das CBP bindet sich dann unter Verwendung einer spezifischen Proteindomäne an CREB Phosphoryliertes CREB allein oder gebunden an CBP stimuliert Transkriptionsaktivitäten von Promotoren, die ein cAMP-Reaktionselement (CRE) aufweisen.
Bei dem folgenden Beispiel haben wir zwei Verfahren verwendet, um die zellulären cAMP-Niveaus anzuheben:
Zuerst wird ein chemisches Verfahren unter Verwendung von Forskolin verwendet, das direkt das Enzym, das cAMP produziert, die Adenylatcyclase, aktiviert. Zweitens können die cAMP-Niveaus biologisch unter Verwendung eines G-Protein gekoppelten Rezeptors (GPCR) und eines Agonisten für den Rezeptor erhöht werden. Zu Beispielen für GPCR, die verwendet werden können, gehören der Calcitonin-Rezeptor und sein Agonist Calcitonin und der b2-Rezeptor (adrenerger Rezeptor) mit seinem Agonisten Isoproterenol. Von beiden Rezeptoren ist bekannt, dass sie mit einem Gs-G-Protein gekoppelt sind, das cAMP-Produktion stimuliert. Wir verwendeten außerdem einen Rezeptor (CCR5), der mit einem Gi-Protein, das cAMP-Niveaus senkt, gekoppelt ist.
Die für das Experiment benötigte CREB-Domäne wurde zwischen Aminosäure 1-283 gefunden. Von dieser Region ist wohlbekannt, dass sie von PKA an dem ser133 erkannt und phosphoryliert wird. Diese Region wurde durch PCR amplifiziert, wobei der Vektor pFA-CREB (Stratagene, La Jolla, CA) als Matrize verwendet wurde, der das humane CREB-Gen vollständiger Länge codiert. Die für die PCR-Reaktion verwendeten Primer lauten wie folgt:
Oligonucleotid Sense: 5'GGAAGATCTATGACCATGGACTCTGGAG (SEQ ID NO:12); und Oligonucleotid Antisense: 5'CCAAGCTTTGCTGCTTCTTCAGCAGG (SEQ ID NO:13).
Um das Subklonieren zu vereinfachen, wurden die Oligonucleotide mit zwei unterschiedlichen Restriktionstellen (einer pro Oligonucleotid) an deren 5'-Ende konstruiert. Das Sense-Oligonucleotid besitzt eine Bgl II-Restriktionsstelle und das Antisense-Oligonucleotid besitzt eine Hind III-Restriktionsstelle. Daher wurde nach der Amplifizierung das amplifizierte Produkt gereinigt und mit diesen Enzymen verdaut. pT7/EYFP-kaiB (Xu et. al. 1999, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96:151-156) wurde unter Verwendung desselben Restriktionsenzyms zum Entfernen des kaiB-Gens verdaut. Die amplifizierte CREB-Domäne wurde dann am C-Ende von EYFP in dem pT7/EYFP-Konstrukt subkloniert. Ein Linker aus zwei Aminosäuren wurde zwischen der EYFP- und der CREB-Domänen erzeugt.
Das neue Fusionsprotein (EYFP-CREB) aus dem bakteriellen pT7-Expressionsvektor wurde dann in den Säuger-Expressionsvektor pCDNA3.1(+) zeo (Invitrogen, Carlsbad, CA) subkloniert. Zu diesem Zweck wurde das pT7 EYFP-CREB mit XbaI und HindIII verdaut und der pCDNA3.1 wurde durch NheI (das XbaI-kompatibel ist) und HindIII verdaut.
Ein SV40-Kernlokalisierungssignal (NLS) wurde am C-Ende des EYFP-CREB-Fusionsgens eingeführt, um zu gewährleisten, dass das Konstrukt nach Expression in dem Kern lokalisiert wurde. Mittels Annealing verbinden wir zwei neue komplementäre Oligonucleotide, die das folgende SV40 NLS codierten: Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Stoppcodon:
Oligonucleotid Sense: 5'GATCCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGTGACCGGTC (SEQ ID NO:14)
Oligonucleotid Antisense: 5'TCGAGACCGGTCACACCTTCCTCTTCTTCTTGGGG (SEQ ID NO:15).
Nach dem Annealing der Oligonucleotide bilden sie eine Doppelstrang-DNA mit zwei kohäsiven Restriktionsorten an beiden Enden (BamHI am 5' und AgeI am 3'). Das Konstrukt pCDNA3.1-EYFP-CREB wurde unter Verwendung dieser Enzyme verdaut und das mittels Annealing verbundene Doppel-Oligonucleotid wurde subkloniert. Eine Linker-Region aus acht Aminosäuren wurde zwischen dem CREB und dem NLS erzeugt. Das Endkonstrukt wird als pCDNA3.1/EYFP-CREB-NLS bezeichnet.
Die für das Experiment benötigte CBP-Domäne wurde zwischen Aminosäure (462-661) festgestellt. Diese Region ist wohlbekannt dafür, dass sie phosphoryliertes CREB bindet (Chrivia, J. C. et. al., 1993, Nature, 365:855-859; Shih, H.-M. et. al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:13896-13901); Kwok, R. P. S. et. al., 1994, Nature, 370:223-226; Arias, J. et. al., 1994, Nature, 370:226-229). Diese Region wurde durch RT-PCR unter Verwendung einer cDNA-Bibliothek humaner Plazenta amplifiziert. Diese Bibliothek wurde unter Verwendung von mRNA von humaner Plazenta (von Clontech, Palo Alto, CA) und der Marathon-Fertigausrüstung (Clontech, Palo Alto, CA) hergestellt. Die verwendeten Oligonucleotide lauten wie folgt:
Oligonucleotid Sense: 5'CGGGTACCGACAGGGCAACAGAATGCC (SEQ ID NO:16)
Oligonucleotid Antisense: 5'ATGCGGCCGCTATCTTGTAGATTTTCTCTGC (SEQ ID NO:17).
Um das Subklonieren zu vereinfachen, wurden die Oligonucleotide mit zwei unterschiedlichen Restriktionstellen (einer pro Oligonucleotid) an deren 5'-Ende konstruiert. Das Sense-Oligonucleotid besitzt eine Kpn I-Restriktionsstelle und das Antisense-Oligonucleotid besitzt eine Not I-Restriktionsstelle. Nach der Amplifizierung wurde das amplifizierte Produkt gereinigt und mit diesen Enzymen verdaut. Das pCDNA3.1/Rluc-EYFP (das bei BioSignal aus dem pT7/Rluc-EYFP-Vektor hergestellt wurde) wurde unter Verwendung desselben Restriktionsenzyms zum Entfernen des EYFP-Gens verdaut. Die amplifizierte CBP-Domäne wurde dann am C-Ende von Rluc in das pT7/Rluc-EYFP-Konstrukt, dem das EYFP-Gen fehlte, subkloniert. Ein Linker aus acht Aminosäuren wurde zwischen der EYFP- und der CREB-Domäne erzeugt.
Ein SV40-Kernlokalisierungssignal (NLS) wurde am C-Ende des Rluc-CBP-Fusionsgens eingeführt, um zu gewährleisten, dass das Konstrukt nach Expression in dem Kern lokalisiert wurde. Mittels Annealing wurden zwei neue komplementäre Oligonucleotide verbunden, die das folgende SV40 NLS codierten: Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Stoppcodon:
Mit dem NLS korrespondierendes Oligonucleotid Sense: 5'TCGAGGATTCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGTAGGTTT (SEQ ID NO:19)
Mit dem NLS korrespondierendes Oligonucleotid Antisense: 5'AAACCTACACCTTCCTCTTCTTCTTGGGGAATTC (SEQ ID NO:20).
Nach dem Annealing bilden die Oligonucleotide eine Doppelstrang-DNA mit einem kohäsiven Restriktionsort an dem 5'-Ende XhoI und ein stumpfes Ende am 3'. Das pCDNA3.1-Rluc-CBP wurde unter Verwendung von XhoI-Enzym und PmeI (das ein stumpfes Ende erzeugt) verdaut. Das per Annealing verbundene Doppel-Oligonucleotid wurde in diese Stellen subkloniert. Eine Linker-Region aus sechs Aminosäuren wurde zwischen dem CBP und dem NLS erzeugt. Das Endkonstrukt wird als pCDNA3.1/Rluc-CBP-NLS bezeichnet.
Die DNA-Sequenzen für sämtliche Konstrukte, die bei diesem Beispiel benötigt wurden, sind in den 60 und 61 dargestellt.
BRET-Untersuchung:
Die pCDNA3.1/Rluc-CBP-NLS- und pCDNA3.1/EYFP-CREB-NLS DNA-Konstrukte wurden unter Verwendung von LipofectAMINE^TM (BRL/Gibco-Life technology, Gaethersburg, MD) vorübergehend in CHO-K1, CHO-CCR5 oder CHW-β2-Zelllinien transfiziert, wobei eine gleiche Menge (4 μg) an DNA für jedes Konstrukt in 100mm-Schalen verwendet wurde.
BRET-Untersuchung unter Verwendung der transfizierten Zellen in Suspension.
48 Stunden nach Transfektion ließ man die transfizierten Zellen 2 Stunden in einer Mischung aus PBS+Ca2+ 1mM/Mg2+ 0,5 mM + Glucose 1g/l + Aprotinin 2 μg/ml bei 37 °C hungern, bevor sie geerntet wurden, wusch sie mit einer Mischung aus PBS Ca2+/Mg2+ + Glucose + Aprotinin 2 μg/ml und zählte sie. Für die BRET-Untersuchung wurden, um ein ausreichendes Signal zu gewährleisten, 50.000 Zellen pro Kammer in weißen Optiplates mit 96 Kammern (Packard, Meriden, CT) verwendet.
BRET-Untersuchung unter Verwendung der transfizierten Zellen, die an dem Boden der Mikrotiterplatte angeheftet waren.
Bei manchen Experimenten wurden Zellen 24 Stunden nach Transfektion geerntet und mit einer Dichte von 25.000 Zellen pro Kammer auf eine CulturePlate^TM-Mikrotiterplatte mit 96 Kammern (Packard, Meriden, CT) geimpft. 48 Stunden nach Transfektion, die Zellen wurden, wie vorstehend ausgeführt, hungern gelassen, gewaschen und dann ohne Ernten analysiert.
Bei Untersuchungsbedingungen für beide Verfahren (Zellen in Suspension oder angeheftet) befanden sich die Zellen in PBS Ca2+Mg2+ + Glucose + Aprotinin 2 μg/ml in einem Volumen von 100 ml. Liganden oder Forskolin in PBS Ca2+Mg2+ + Glucose (bei verschiedenen Konzentrationen; siehe Diagramme) wurden zu den Zellen hinzugefügt, um ein Zwischenvolumen von 150 μl herzustellen. Zu diesem wurden 50 μl Coelenterazin h (20 mM in PBS Ca2+Mg2+ + Glucose + Aprotinin 2 μg/ml) in jede Kammer hinzugefügt, um die Biolumineszenzreaktion zu starten (Endkonzentration von Coelenterazin h 5 μM). Das Gesamtvolumen der Reaktion betrug 200 μl. Nach Hinzufügen von Coelenterazin h zu jeder Kammer wurde die Mikrotiterplatte in den BRETCount für den Nachweis bei 25 °C geladen. Jede Kammer wurde unter Verwendung beider Filter für jeweils 1 Sekunde gelesen.
Wirkung von Adenylatcyclaseaktivierung durch Forskolin- oder Calcitonin-Rezeptor auf cAMP-Sensor
Die CHO-K1-Zellen wurden mit beiden Konstrukten transfiziert. 48 Stunden nach Transfektion würden die Zellen 2 Stunden hungern gelassen, gewaschen, geerntet und gezählt. Insgesamt wurden 50.000 Zellen zu einer 96-Kammer-Mikrotiterplatte hinzugefügt. Jeder Kammer wurde Forskolin zu einer Endkonzentration von 10 μM hinzugefügt. Jeder Kammer wurde dann Coelenterazin hinzugefügt, um die Reaktion zu starten. Die Mikrotiterplatte wurde in den BRET-Zählung geladen und die Lichtabgaben bei 470 nm und 550 nm wurden an mehreren Punkten bestimmt, um einen Zeitverlauf zu bestimmen (10). Bei Forskolin wurde der Agonist Calcitonin außerdem zum Erhöhen der cAMP-Niveaus verwendet. Die CHO-K1-Zellen exprimieren den Calcitonin-Rezeptor endogen und koppelt nach Aktivierung an das Gs-Typ-G-Protein. Die Gs-Typ-G-Proteine sind dafür bekannt, dass sie Adenylatcyclase aktivieren und daher zelluläre cAMP-Niveaus erhöhen. Bei diesem Beispiel wurden 2 nm und 10 nm Calcitonin verwendet. Die Ergebnisse demonstrieren, dass der Sensor für Veränderungen des cAMP-Niveaus empfindlich ist. Die Verhältnisse stiegen im Verlauf der Zeit in Anwesenheit von Calcitonin oder Forskolin im Vergleich zu Kammern, die nicht induziert wurden (Puffer allein). Jeder Zeitpunkt stellt einen Mittelwert +/– SD (Standardabweichung) für vier Kammern dar (die Assays erfolgten als Quadruplikate).
Das Zeitverlaufexperiment von 10 wurde wiederholt, wobei diesmal angeheftete Zellen und verschiedene Konzentrationen von Calcitonin (im Bereich von 0 bis 3,1 × 10^–8 M) verwendet wurden. Die Dosis-Wirkungs-Kurve (11) wurde unter Verwendung des Datenpunkts bei 45 Minuten nach Hinzufügen von Coelenterazin erstellt. Die dosis-abhängige Wirkung ergab ein EC50 von 0,027 nM, was in der Nähe derjenigen lag, die in der Literatur für einen funktionellen Assay zu finden sind (0,03 bis 0,06 nM). Jeder Zeitpunkt stellt einen Mittelwert +/– SD für vier Kammern dar (die Assays erfolgten als Quadruplikate).
Wirkung der Aktivierung eines überexprimierten GPCR auf den CAMP-Sensor
Statt einen endogenen GPCR oder Forskolin zum Erhöhen zellulärer cAMP-Niveaus zu verwenden, wurden die Konstrukte in eine stabile Zelllinie transfiziert, die einen heterologen GPCR exprimierte. Für diesen Zweck wurde die CHW-β2-Zelllinie verwendet. Sie exprimiert den humanen adrenergen β2-GPCR (Expressionsniveau: 0,77 pmol/mg Membranprotein) und wie Calcitonin-Rezeptor wird dies mit Gs-G-Protein gekoppelt. Es wurde gezeigt, dass dieser Rezeptor funktionell mit dem cAMP-Weg gekoppelt ist; bei Bindung seines Agonisten Isoproterenol löst er die Produktion von zellulärem cAMP aus. 48 Stunden nach Transfektion der Sensorkonstrukte wurden wie oben angegeben die Zellen hungern gelassen, gewaschen, geerntet und gezählt. Insgesamt wurden 50.000 Zellen pro Kammer zu einer weißen Optiplate (Packard, Meriden, CT) mit 96 Kammern gemeinsam mit zwei Konzentrationen von Isoproterenol hinzugefügt. Bei mehreren Kammern wurden die Zellen mit Forskolin als Kontrolle inkubiert (wie oben). 12 stellt die Induktion von β2-Rezeptoren durch Isoproterenol im Lauf der Zeit dar. Erneut stiegen die Verhältnisse in Anwesenheit von Isoproterenol oder Forskolin, was darauf hindeutete, dass die beiden Anteile (Rluc und EYFP) in enge Nähe gebracht werden, wenn cAMP-Niveaus steigen.
13 stellt die dosis-abhängige Wirkung von Isoproterenol in den transfizierten CHW-β2-Zellen aus einem anderen Experiment dar. In diesem Fall wurden die transfizierten Zellen 24 Stunden nach Transfektion analysiert. Anhand der Kurve wurde ein EC50 von 0,013 nM berechnet. Dieser Wert ähnelt den Werten, die in der Literatur für b2-Rezeptor unter Verwendung einer funktionellen Untersuchung, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist, zu finden sind.
Gi-gekoppelter Rezeptor
Der cAMP-Sensor kann verwendet werden, um Rezeptoraktivierung (bei Ligandenbindung) für den Gs-gekoppelten Rezeptor zu überwachen, da die Gs-gekoppelten Rezeptoren dafür bekannt sind, dass sie zelluläre cAMP-Niveaus erhöhen. Bei diesem Experiment wurde untersucht, ob der cAMP-Sensor für Gi-gekoppelten Rezeptor zu verwenden ist. Diese Rezeptoren koppeln an unterschiedliche G-Proteine, die zelluläre cAMP-Niveaus senken, sobald der Ligand an seine Rezeptoren bindet. Es wurde eine stabile Zelllinie verwendet, die konstitutiv den Chemokin-CCR5-Rezeptor exprimierte (BioSignal, Montreal, PQ). Der CCR5 wird mit einem Gi-Typ-G-Protein gekoppelt, sobald er aktiviert ist. Es wurden zwei unterschiedliche Ansätze verwendet, um zu bestimmen, ob der cAMP-Sensor die herabgesetzten cAMP-Niveaus überwachen kann.
Bei dem ersten Verfahren wurden transfizierte CHO-CCR5-Zellen verwendet, die in 100mm-Schalen plattiert waren. Diese Zellen wurden hungern gelassen und in 96-Kammer- Platten, wie zuvor beschrieben geimpft, sie wurden dann mit Forskolin bei einer Endkonzentration von 1 μM, um deren cAMP-Gehalt zu erhöhen, und mit MIP-1β indiziert, was ein selektiver Agonist für den CCR5-Rezeptor ist. Jeder Kammer wurde Coelenterazin hinzugefügt, um die Reaktion zu starten.
Alternativ wurden die Zellen nicht hungern gelassen und es wurde nur MIP-1β hinzugefügt. Da die cAMP-Niveaus in Zellen von Natur aus hoch sind, haben wir die Zellen nicht hungern gelassen, um das cAMP-Niveau mit Forskolin „künstlich" zu erhöhen und den Inhibitoreffekt des CCR5 auf die Adenylatcyclase nachzuweisen.
Die 14 und 15 stellen jeweils die vorgenannten beiden Ansätze dar. In beiden Fällen wurde die Aktivierung des CCR5 durch seinen Agonisten überwacht. Die Verhältnisse nehmen im Verlauf der Zeit in Anwesenheit des Agonisten MIP-1β ab.
BEISPIEL IX: PROTEIN-PROTEIN-INTERAKTION UNTER VERWENDUNG VON TYROSIN-KINASE-REZEPTOR (TKR)
Diese Untersuchung/diesen Sensor ist der CBP:CREB-Untersuchung ähnlich. Sie weist TKR-Aktivitäten nach (Heldin, C. H., et. al., 1998, Biochim. Biophys. Acta., 1378:F79-F113). Die TKR sind eine Familie von Rezeptoren, die eine Transmembranregion teilen (statt 7 wie bei den GPCR) und Tyrosin-Kinase(TK)-Aktivitäten aufweisen. Zu Beispielen für diese Familie gehören EGF, PDGF, Insulin usw. Die TK-Domäne befindet sich an dem C-Ende des Proteins innerhalb der Zelle. Diese Domäne wird durch die Ligandenbindungsdomäne, die sich am N-Ende (außerhalb der Zelle) befindet, reguliert. Bei Ligandenbindung homodimerisiert der Rezeptor und die TK-Domäne wird aktiviert. Sobald die Aktivierung erfolgt ist, phosphoryliert (an einem Tyr) ein Rezeptor seinen Partner (Selbstphosphorylierung), Diese Phosphorylierung wird dann durch die zellulären Adapterproteine erkannt, die wiederum stromabwärts befindliche Effektoren aktivieren. Zwei dieser Adapterproteine wurden konstruiert: SHC und Grb2. Beide dieser Proteine konnten einen tyr-phosphorylierten Rezeptor erkennen und an diesen binden (an unterschiedlichen Sequenzen). Am häufigsten (wenigstens bei den EGF- und PDGF-Rezeptoren) wirken diese Proteine sequenziell (Yajnik, V. et. al., 1996, J. Biol. Chem., 271:1813-1816; Sasaoka, T. et. al., 1996, J. Biol. Chem. 271:20082-20087; Gram, H. et. al., 1997, Eur. J. Biochem., 246:633-637; Rozakis-Adcock, M. et. al., 1992, Nature, 360:689-692; Sakaguchi, K. et.al., 1998, Mole. Endocrin., 12:526-543). Das Adapterprotein SHC erkannte und band als erstes an den tyr phosphorylierten Rezeptor (direkt an der spezifischen Phosphorylierungsstelle). Die Proteindomäne, die für das Binden von SHC an den Rezeptor verantwortlich ist, befindet sich am N-Ende von SHC und wird Phosphortyrosin-Bindung genannt (hiernach PTB). Diese Domäne besitzt eine andere Sequenzsignatur im Vergleich zu dem bekannten Prototyp SH2, der dieselbe phosphoryliertes Tyr-Bindungs-Aktivität teilt (Yajnik, V. et. al., 1996, J. Biol. Chem., 271:1813-1816; Schaffhausen, B., 1995, Biochem. Biophys. Acta., 1242:61-75; Songyang, Z. et.al., 1993, Cell, 72:767-778). Sobald es an den Rezeptor gebunden ist, wird SHC durch den Rezeptor phosphoryliert (an einem spezifischen Tyr). Grb2 erkennt dann und bindet das phosphorylierte SHC unter Verwendung seiner SH2-Domäne (SH2 von Grb2:SHC besitzt außerdem eine SH2-Domäne, aber es wird für einen anderen Signalweg verwendet)(SH2:Src Homologie 2). Bei unserer Untersuchung haben wir diesen Link zwischen SHC und Grb2 gemessen, um die RTK-Aktivität zu messen.
Zum Aufbau der Untersuchung war es erforderlich, die an der RTK-Aktivität beteiligten Proteindomänen mit dem Rluc und dem EYFP zu fusionieren. Das Folgende ist eine Beschreibung des Vorgehens.
EYFP-SH2
SH2 wurde an das C-Ende von EYFP fusioniert. Die SH2-Domäne von Grb2 (Aminosäure 49-164) wurde durch PCR (Standardtechnik) amplifiziert, wobei als Matrize ein humanes EST (Expressed Sequence Tag – exprimierte tag-Sequenz) und spezifische Oligonucleotide verwendet wurden:
Oligonucleotid Sense: 5=GGAAGATCTCCCAAGAACTACATAGAAATG (SEQ ID NO:21)
Oligonucleotid Antisense: 5=CCAAGCTTTCAGAGGGCCTGGACGTATG (SEQ ID NO:22)
EST Nr.: Human Image Clone Nr. 26670
Um das Subklonieren zu vereinfachen, wurden die PCR-Oligonucleotide mit zwei unterschiedlichen Restriktionstellen (eine pro Oligonucleotid) an deren 5=-Ende (unterstrichen) kon struiert. Das Sense-Oligonucleotid besitzt einen Bgl II- und das Antisense-Oligonucleotid besitzt einen Hind III-Ort. Daher wurde nach der Amplifizierung das amplifizierte Produkt gereinigt und mit diesen Enzymen verdaut. pT7/EYFP-kaiB (Xu) wurde unter Verwendung desselben Restriktionsenzyms zum Entfernen des kaiB-Gens verdaut. Die amplifizierte CREB-Domäne wurde dann am C-Ende von EYFP in dem pT7/EYFP-Konstrukt subkloniert. Ein Linker aus zwei Aminosäuren wurde zwischen der EYFP- und der CREB-Domäne erzeugt.
Das EYFP-SH2-Fusionsgen wurde dann unter Verwendung der Restriktionsorte XbaI und HindIII in den pCDNA3.1(–)-Hygromycin-Säuger-Expressionsvektor subkloniert.
Rluc-PTB
Die PTB-Domäne von SHC wurde an das C-Ende von Rluc fusioniert. Die PTB-Domäne von SHC (Aminosäure 111-487 der p66^SHC-Variante) wurde durch RT-PCR amplifiziert, wobei eine HeLa-cDNA-Bibliothek als Matrize verwendet wurde. Diese Bibliothek wurde unter Verwendung von Gesamt-RNA von HeLa-Zelle und der SuperScript II Rnase H^– Reverse Transcriptase (BRL/Gibco-Life Technologies, Gaethersburg, MD) mit dem Oligo-dT-Primer hergestellt, wie dies im Herstellerprotokoll beschrieben ist.
PCR wurde unter Verwendung von Standardtechnik, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist, und der folgenden Primer durchgeführt:
Oligonucleotid Sense: 5' CGGGTACCGATGAACAAGCTGAGTGGA (SEQ ID NO:18)
Oligonucleotid Antisense: 5' TAGCGGCCGCTCAGGGCTCCCCTCGGAGC (SEQ ID NO:24)
Um das Subklonieren zu vereinfachen, wurden die PCR-Oligonucleotide mit zwei unterschiedlichen Restriktionsstellen (eine pro Oligonucleotid) an deren 5'-Ende konstruiert. Das Sense-Oligonucleotid besitzt einen KpnI- und das Antisense-Oligonucleotid besitzt eine NotI-Stelle. Daher wurde nach der Amplifizierung das amplifizierte Produkt gereinigt und mit diesen Enzymen verdaut. PCDNA3.1/Rluc-EYFP (dieses Konstrukt wurde bei BioSignal (Montreal, Kanada) unter Verwendung des pT7/Rluc-EYFP der Vanderbilt University unter Verwendung der Restriktionsorte NheI-NotI von pCDNA3.1 zeo(+)hergestellt) wurde unter Verwendung desselben Restriktionsenzyms zum Entfernen des EYFP-Gens verdaut. Die amplifizierte PTB-Domäne wurde dann am C-Ende von Rluc in pT7/Rluc subkloniert. Ein Linker aus acht Aminosäuren wurde zwischen dem Rluc und der PTB-Domäne erzeugt.
Die DNA-Sequenzen für die beiden Konstrukte, die für dieses Beispiel benötigt wurden, werden in den 62 und 63 dargestellt.
BRET-Untersuchung
Die beiden Konstrukte pCDNA3.1/Rluc-PTB und pCDNA3.1/EYFP-SH2 wurden mit LipofectAMINE (BRL/Gibco-Life Technologies, Gaethersburg, MD) in die GH4-C1-Zelllinie kotransfiziert, wobei das Herstellerprotokoll bei 100mm-Schalen verwendet wurde. Die GH4-C1-Zelllinie wurde verwendet, weil sie dafür bekannt ist, dass diese Zellen die für die Untersuchung benötigten EGF-Rezeptoren endogen exprimieren. 48 Stunden nach Transfektion die transfizierten Zellen in MEM ohne Serum 2 Stunden hungern gelassen, mit PBS gewaschen Ca2+/Mg2+ + Glucose + Aprotinin, geerntet und in eine 96-Kammer-Mikrotiterplatte bei einer Zelldichte von 50.000 Zellen pro Kammer in dem PBS Ca2+/Mg2+ + Glucose + Aprotinin-Untersuchungs-Puffer geimpft. Der Agonist EGF wurde dann bei verschiedenen Konzentrationen hinzugefügt, um an diesem Punkt ein Gesamtvolumen von 150 ml herzustellen. 50 ml Coelenterazin h (mit einer Konzentration von 20 mM) wurden in jede Kammer hinzugefügt, um die Biolumineszenzreaktion zu starten. Die Mikrotiterplatten wurden zum Messen von Rluc- und EYFP-Emissionen in den BRETCount geladen. Lesezeit pro Filter: 1 Sek. Die Nachweistemperatur betrug 25 °C.
16 stellt eine dosis-abhängige Wirkung von EGF auf die transfizierten Zellen 45 Minuten nach Induktion (mit EGF) dar. Anhand dieser Kurve wurde ein EC50 von 0,92 nM berechnet, das dem Wert, der in der Literatur zu finden ist, ähnelt. Dieser Sensor ist ein wertvolles Hilfsmittel zum Überwachen von TKR-Aktivität und wäre daher nützlich für Wirkstoffentdeckung.
BEISPIEL X: PROTEIN-PROTEIN-INTERAKTION UNTER VERWENDUNG VON TOPAZ STATT EYFP
Der Nachweis, dass GPCR assoziieren, um Dimer- oder Multimer-Spezies zu bilden, bleibt schwierig und stützt sich allein auf in vitro durchgeführte biochemische Experimente. Bei diesem Beispiel sind wir darangegangen zu untersuchen, ob GPCR-Dimerisation in der lebenden Zelle auftritt. Zu diesem Zweck wurden Anteile innerhalb des Rahmens am C-Ende des b2-Rezeptors fusioniert. Somit wurden zwei Fusionskonstrukte erzeugt: 1- b2-Rluc und b2-Topaz. Topaz ist eine andere GFP-Variante mit ähnlichen spektralen Eigenschaften im Vergleich zu EYFP.
Die folgende Untersuchunge demonstriert die Ergebnisse, die β2-Dimerisation in lebenden Zellen unter Verwendung von BRET zeigen.
Die DNA sowohl von Rluc- (von pRL-CMV, Promega) als auch von Topazgenen (pGFPtpz-N1, Packard) wurde am C-Ende des humanen β2-Gens ohne ihr Stoppcodon inseriert, wobei sie Spacer von vier bzw. fünf Aminosäuren aufwies. Topaz wird an Stelle von EYFP verwendet, da es einen höheren Extinktionskoeffizienten und höhere Quantenausbeute aufweist. Beide Fusionsproteine wurden dann in einen pRSV-Vektor subkloniert, um deren Expression in Säugerzellen zu ermöglichen.
HEK-293- und CHO-K1-Zellen wurden vorübergehend transfiziert, wobei Ca2+-Phosphatfällung bzw. LipofectAMINE^TM (BRL/Gibco, Gaethersburg, MD) in 100mm-Schalen verwendet wurden. Die Transfektionseffizienzen zwischen 40 und 60 % wurden im Allgemeinen unter Verwendung dieser Technik (wenn unter Verwendung eines GFP-Reportervektors und Fluoreszenzmikroskops analysiert wurde) für CHO-K1-Zellen erzielt und ungefähr 20 bis 30 für HEK-293-Zellen. Die Zellen wurden stets mit derselben Menge an Gesamt-DNA transfiziert.
Die Untersuchungen wurden 48 Stunden nach Transfektion vierfach durchgeführt. Die Zellen wurden unter Verwendung von Versen (PBS + EDTA) geerntet, gezählt und in PBS (das Ca2+/Mg2+ enthielt) auf ungefähr 50.000 Zellen pro Kammer in einer weißen Optiplate (Packard, Meriden, CT) verdünnt. Bei der Durchführung der Untersuchungen können entweder suspendierte oder anhaftende Zellen verwendet werden. Wenn die Untersuchungen mit anhaftenden Zellen durchgeführt wurden, wurden die Zellen aus 100mm-Schalen 24 Std. nach Transfektion geerntet, gezählt und in eine 96-Kammer-Platte geimpft, bevor am nächsten Tag der Nachweisschritt durchgeführt wurde. Lichtemission wurde durch den Zusatz von Coelenterazin 5 uM ausgelöst. Die Emissionen wurden zu verschiedenen Zeiten nach dem Zusatz des Coelenterazins un ter Verwendung des BRETCount nachgewiesen. Die für den BRETCount verwendeten Parameter waren Lumineszenz-SPC-Modus, eine Leselänge von 1 Sek. für jede Wellenlänge bei 25 °C und 470DF60- und 550DF80-Filter.
1- Pharmakologische Charakterisierung der b2-Rluc und -Topaz-Fusionsproteine
Für die pharmakologische Charakterisierung wurden 293 Zellen mit entweder einem β2-wt-Expressionsvektor, einem β2-Rluc-Expressionsvektor oder einem β2-Topaz-Expressionsvektor transfiziert. Die Sättigungsbindungsexperimente unter Verwendung von Isoproterenol wurden an den 293 Zellen durchgeführt. Tabelle III zeigt das K_D, das aus den Sättigungskurven ermittelt wurde. Die für die Fusionsproteine ermittelten Werte unterschieden sich zwar signifikant von β2-wt-Rezeptor, aber die Fusionsproteine zeigten immer noch eine hohe Affinität für den Agonisten.
Tabelle III: Aus den 293 vorübergehend transfizierten Zellen erzeugtes K_D (pM).
2- Nachweis von β2-Rezeptor-Dimerisation unter Verwendung von BRET
Zum Nachweis von β2-Rezeptor-Dimerisation wurden 293 Zellen mit β2-Rluc-Vektor allein oder in Kombination mit β2-Topaz oder CCR5-Topaz transfiziert. Die Ergebnisse dieser Untersuchung (17) beinhalteten außerdem die Ergebnisse von Tri-Transfektionen, bei denen mit β2-Rluc und β2-Topaz transfizierte Zellen weiters mit β2-wt- oder V2-Rezeptor-DNA transfiziert wurden. 48 Std. Nach Transfektion wurden die Zellen geerntet, gewaschen, gezählt und in eine 96-Kammer-Platte (50.000 Zellen pro Kammer) in PBS verteilt. Nach Zusatz von Coelenterazin wurden die Mikrotiterplatten zu unterschiedlichen Zeiten gelesen (17). In 18 wurden die Zellen 24 Std. nach Transfektion geerntet, gezählt und in 96-Kammer-Platten verteilt, bevor nach 48 Std. die Analyse erfolgte. Bei Anwendung dieses Vorgehens haften die Zellen vor der Analyse am Boden der Kammer. Obwohl dieser Prozess die Zellen nicht verändert, neigten die erzielten Verhältnisse dazu, im Vergleich zu der Analyse, die mit geernteten Zellen durchgeführt wurde, niedriger zu sein.
Die 17 und 18 demonstrieren, dass das BRET-Verhältnis im Vergleich zu β2-Rluc allein erhöht ist, wenn β2-Rluc mit β2-Topaz koexprimiert wird, was darauf hindeutet, dass sich diese Fusionsrezeptoren in enger Nähe befanden (dimerisiert waren). Somit wird ein Teil des Rezeptor-Pools selbst in Abwesenheit von Agonist in einer dimerisierten Form vorgefunden. Diese Assoziation war selbst bei Fortsetzung der Rluc/Coelenterazin-Reaktion wenigstens 20 Minuten stabil (17). Diese Assoziation konnte durch den Zusatz von β2-wt-DNA-Konstrukt (mit 5-facher Menge der Fusionen) während der Transfektion gestört werden (Raute, 17). Dagegen hatte V2-Rezeptor-Expression keine Wirkung auf die Dimerisation von β2-Rezeptoren. CCR5-Rezeptor wurde mit Topaz wie bei β2 fusioniert und als negative Kontrolle verwendet (18). Dieses Fusionsprotein wurde pharmakologisch charakterisiert (Daten nicht gezeigt). Bei Kotransfektion mit β2-Rluc wurde eine signifikante Erhöhung des BRET-Verhältnisses beobachtet.
3- Kinetik der β2-Rezeptor-Dimerisation
Die Wirkung des Agonisten Isoproterenol auf den Dimerisationszustand von β2-Rezeptoren wurde bestimmt. Nach dem Ernten der Zellen wurden die Zellen 10 Minuten mit 1 mM Isoproterenol bei 37 °C vorinkubiert. Nach dieser Zeitdauer wurden die Zellen in die 96-Kammer-Platte verteilt und es wurde Coelenterazin hinzugefügt, um die Reaktion zu starten. Die BRET-Analyse wurde dann bei 25 °C im BRETCount fortgeführt. 19 zeigt, dass das BRET-Verhältnis 15 Minuten stieg und dann zu sinken begann.
4- Dosis-Wirkung-Experimente
Es wurden außerdem Dosis-Wirkung-Experimente an den vorübergehend transfizierten Zellen durchgeführt. 48 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen geerntet, in die 96-Kammer-Platte geimpft und mit verschiedenen Konzentrationen von Isoproterenol inkubiert. Nach 10 Minuten bei 37 °C wurde Coelenterazin hinzugefügt, um die Rluc-Reaktion zu starten. Das Hinzufügen des Agonisten erzeugte eine Dosis-Wirkung-Kurve mit einem EC50 von 2 nM (20). Dieser durch BRET-Analyse ermittelte EC50-Wert ähnelt dem, der bei der Ligandenbindungsanalyse ermittelt wurde. Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt, wenn die Untersuchungen unter Verwendung von anhaftenden Zellen an Stelle von suspendierten Zellen wiederholt wurden.
Die Verwendung der BRET-Technologie bei den vorgenannten Beispielen wies erstmals β2-Rezeptor-Dimerisation bei lebenden Zellen nach. Zuvor wurde β2-Dimerisation nur durch Immunfällungsversuche nachgewiesen. Die Verwendung der BRET-Technologie zeigte außerdem, dass der Zusatz des Agonist die Dimerisation durch die Veränderung des BRET-Verhältnisses beeinflusst. BRET-Untersuchungen unter Verwendung von anderen Agonisten, Antagonisten und sogar von inversen Agonisten (Daten nicht gezeigt) wurden ebenfalls durchgeführt und erbrachten pharmakologische Daten. Die vorgenannten Beispiele geben die Anwendung der BRET-Technologie wieder.
Aus der vorstehenden Beschreibung kann ein Fachmann auf dem Gebiet die wesentlichen Merkmale dieser Erfindung feststellen und kann, ohne von ihrem Geist und Umfang abzuweichen, verschiedene Änderungen und Modifizierungen an der Erfindung vornehmen, um sie an verschiedene Verwendungen und Bedingungen anzupassen. Folglich liegen solche Änderungen und Modifizierungen angemessenerweise, billigerweise und „mit Absicht" im vollen Äquivalenzbereich der folgenden Ansprüche.
BEISPIEL XI: NACHWEIS, DASS DAS VERFAHREN FÜR AUTOMATION ZUGÄNGLICH IST
Um die Machbarkeit von BRET-Verhältnis-Abbildung zu prüfen, wurden mit einer gekühlten CCD-Kamera Bilder von E.coli-Kulturen, die bestimmte Konstrukte exprimierten, gesammelt. Für diese Anwendungen kann das Verhältnis von Lumineszenzintensitäten bei 480 nm bis 530 nm gemessen werden, um das Ausmaß von BRET zu bestimmen und um Unterschiede bei den Gesamtniveaus der Expression von RLUC- und EYFP-Fusionsproteinen zu korrigieren. 4 zeigt Bilder von flüssigen E.coli-Kulturen, wie sie durch 10nm-Bandpass-Interferenzfilter, die bei 480 nm und 530 nm zentriert sind, zu sehen waren. Bei den Kulturen, die einen Kontrollstamm (RLUC allein) oder eine nichtinteragierende Kombination (RLUC·KaiB & EYFP·KaiA) enthalten, wird viel weniger Licht bei 530 nm emittiert als bei 480 nm. Bei dem Fusionskonstrukt (RLUC·EYFP) oder der interagierenden Kombination (RLUC·KaiB & EYFP·KaiB) ist die Menge an emittiertem Licht bei 480 nm und 530 nm ungefähr gleich, wie dies anhand der in den 1 und 2(b2) gezeigten Spektren vorherzusagen wäre. Diese Bilder können quantifiziert werden, wie in 5 gezeigt. Die 530nm/480nm-Lumineszenzverhältnisse für die RLUC-Kontrolle und das nichtinteragierende KaiB&KaiA-Paar sind niedrig (ungefähr 0,4), während die 530nm/480nm-Verhältnisse für das Fusionskonstrukt und für die interagierenden KaiB-Fusionsproteine über 0,9 liegen.
Auf Grund des besseren Durchsatzes des BRETCount im Vergleich zum LumiCount ist es möglich, verschiedene Untersuchungs-Parameter zu entwickeln und zu prüfen, um den Nachweis des BRET-Signals zu verbessern und den BRET-Nachweis an Hochdurchsatz-Screening (HTS) anzupassen. Die Untersuchungs-Parameter wurden charakterisiert. Die geprüften Parameter lauteten: Zelldichte pro Kammer, Medientyp, Verwendung des Proteaseinhibitors, Wirkung des pH, Wirkung von HEPES, Wirkung von BSA, Wirkung von DMSO, Sonstige.
CHO-K1-Zellen wurden unter Verwendung von LipofectAMINE (BRL/Gibco Life Sciences, Gaethersburg, MD) in 100mm-Schalen nach dem Herstellerprotokoll (0,2 mg DNA pro Konstrukt + X mg Träger-DNA für eine Gesamtmenge von 8 mg) vorübergehend transfiziert. Bei Verwendung dieser Technik wurden Transfektionseffizienzen zwischen 40 und 60 % erzielt (wenn die Analyse unter Verwendung eines GFP-Reportervektors und eines Fluoreszenzmikroskops erfolgte). 48 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen unter Verwendung einer niedrigen Konzentration an Trypsin geerntet, gezählt und in D-PBS (das Ca²⁺/Mg²⁺ enthielt) verdünnt. Bei den meisten der nachfolgend angegebenen Beispielen wurden 50.000 Zellen pro Kammer in weißer Optiplate (Packard, Meriden, CT) verwendet. Die Untersuchungen wurden vierfach in einer Gesamtmenge von 200 μl durchgeführt. Lichtemissionen wurden durch den Zusatz von Coelenterazin h (5 μM; Zusatz von 50 μl von einem Stamm von 20 μM) ausgelöst.
Die Untersuchungen wurden durchgeführt, indem der BRET-Zählung zu verschiedenen Zeiten nach dem Zusatz des Coelenterazins verwendet wurde. Die für den BRET-Zählung verwendeten Parameter waren: Lumineszenz-SPC-Modus, eine Leselänge von 1 Sek. für jede Wellenlänge bei 25 °C, 470DF60- und 550DF80-Filter.
Die Spektralanalyse der BRET-Reaktion wurde unter Verwendung eines SPEX-Instruments (Instrument S. A.) bei abgeschalteter Anregungslampe, einer Integrationszeit von 0,4 Sek., einer Abtastung von 400 bis 600 nm, einem Emissionsspalt von 10 bis 12 nm, 2-nm-Schritt bei 25 °C durchgeführt (22).
Es folgen Beispiele für Untersuchungen zum Nachweis der Wirkung von wechselnden unterschiedlichen Untersuchungs-Parametern:
1- Zellenzahl pro Kammer
Es wurde ein Standard-BRET-Untersuchung durchgeführt (21), wobei der BRET-Zähler mit den Untersuchungs-Parametern, die für den LumiCount genutzt wurden (modifizierter LucLite-Puffer, Coelenterazin h 5 μM, weiße Optiplate, Gesamtvolumen 200 μl usw.), verwendet wurde.
Die BRET-Verhältnisse waren im Zeitverlauf stabil. Die positive Kontrolle stieg leicht an und gleichzeitig gingen die beiden negativen Kontrolle leicht zurück. Die Rluc-Emissions- und Energietransferspitzen ändern ihre Form während der Lichtemission (siehe 22). Das Verhältnis stieg im Verlauf der Zeit, da die Rluc/Coelenterazin Reaktion zerfällt und weniger Licht produziert, während der Energietransfer immer noch bei seiner maximalen Effizienz liegt. Die Wirkung der Zellenzahl pro Kammer wird in 23 gezeigt. Unterschiedliche Gesamtzellenzahlen wurden in die Kammern der Mikrotiterplatte verteilt. Nach dem Zusatz des Coelenterazin h wurde die Mikrotiterplatte zu unterschiedlichen Zeiten gelesen. 23 zeigt, dass die Anzahl der Zellen pro Kammer geringe Wirkung auf die Verhältnisse hat. Es wurden lediglich 2000 Zellen pro Kammer (bei einer 96-Kammer-Platte) ohne signifikante Veränderungen der Verhältnisse verwendet. Es ist zu beachten, dass bei dieser geringen Zellenzahl große Schwankungen bei den BRET-Verhältnissen im späten Verlauf (über 75 min.) der Untersuchungen beobachtet wurden, was auf die zahlreichen Plattenbewegungen und die Zellanhaftung an das Gefäß zurückgeführt werden könnte.
2- Medientyp
Die Wirkung des Medientyps auf die Lumineszenz des Rluc wurde in Abwesenheit oder in Anwesenheit von verschiedenen Mengen an DTT geprüft. Transfizierte CHO-Zellen wurden gesammelt und in der 96-Kammer-Platte unter Verwendung von unterschiedlichen Medienbedingungen neu verteilt (24 bis 26). Die Lumineszenzzeitverläufe bei 470 nm (TopCount) wurden bei 25 °C nach Hinzufügen von Coelenterazin durchgeführt. Die Wirkungen von drei verschiedenen Medien wurden geprüft: PBS Ca²⁺/Mg²⁺ (24), PBS Ca²⁺/Mg²⁺ + Glucose (25) und DMEM ohne Phenolrot (26).
Bei Abwesenheit von DTT ergab PBS allein eine höhere langzeitige Rluc-Emission und daher die beste langfristige Rluc-Emissionsstabilität, gefolgt von PBS + Glucose und DMEM. Ähnliche Ergebnisse wurden in Anwesenheit von 100 mM DTT festgestellt: PBS allein ergab höhere Langzeitzählungen. Wie erwartet verbesserte das Erhöhen der DTT-Konzentration die Rluc-Stabilität in allen drei Medien. Leider wurden durch hohe Mengen an DTT (50 und 100 mM), die die beste Stabilität ergaben, die Zellen beschädigt: Die Lebensfähigkeit wurde unter Verwendung von Trypanblaufarbstoff geprüft und sank über einen Zeitraum von 2 Stunden mehr als 20 %. Ein guter Kompromiss zwischen Lebensfähigkeit (weniger als 15 %) und Rluc-Stabilität wurde bei 10 mM erreicht. Diese Konzentration wurde für die BRET-Untersuchungen gewählt. Der Zusatz von DTT modifiziert das BRET-Verhältnis der positiven und negativen Kontrollen, modifiziert jedoch nicht den dynamischen Bereich (DR). DTT ist jedoch für ein effizientes Auftreten der BRET-Reaktion nicht erforderlich, da es als Verstärker für die langzeitige Rluc-Emission wirkt.
3- Verwendung von Proteaseinhibitor
Um Zellbeschädigung während des Untersuchungs-Vorgangs und während der Zeitverlaufsexperimente zu vermeiden, wurde eine Analyse durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Verwendung von Aprotinin die ratiometrischen Messungen stört. Aprotinin ist ein Proteaseinhibitor, der oft bei der Zellkultur zur Wahrung der Zellintegrität verwendet wird. Aprotinin mit einer Konzentration von 2 μg/ml half bei der Wahrung der Zelllebensfähigkeit über einen Zeitraum von 2 Stunden. Bei Anwesenheit von Aprotonin sank die Lebensfähigkeit um weniger als 10 % gegenüber mehr als 15 % bei Abwesenheit des Proteaseinhibitors. Im selben Zeitraum wurden die BRET-Verhältnisse nicht signifikant durch die Anwesenheit von Aprotinin beeinflusst (Daten nicht gezeigt).
4- Wirkung des pH-Werts
Die Wirkung des Zellmedien-pH-Werts auf BRET-Verhältnisse wurde analysiert. Zu diesem Zweck nahmen wir stabile Transfektionen von Nur-Rluc- und R1uc·EYSP-Zelllinien vor. Stabile Rluc- und Rluc·EYFP-CHO-Zelllinien wurden geimpft unter Verwendung von (PBS) Medien mit unterschiedlichen pH-Werten. Bei Substratzusatz wurde ein BRET-Zeitverlauf gestartet und die Verhältnisse wurden berechnet. 27 zeigt die Wirkung des Medien-pH-Werts auf BRET-Verhältnisse. Die Verhältnisse neigten bei abnehmenden pH-Wert zum Ansteigen.
Dies galt für Nur-Rluc, jedoch nicht notwendigerweise für die Rluc·EYFP-Fusion. Das beste Signal-Rausch-Verhältnis wurde bei pH 7,1 festgestellt, was in der Nähe des PBS-pH-Werts (7,2) liegt. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass ein pH-Stabilisierer wie HEPES beim Wirkstoff-Screenen verwendet werden könnte und dass das Hinzufügen bestimmter Verbindungen (z. B. sehr saure oder basische Peptide) den pH-Wert ausreichend verändern könnte, um das BRET-Nachweisen zu modifizieren.
5- Wirkung von HEPES
Da pH-Stabilität wichtig ist, um ein aussagekräftiges Verhältnis zu erreichen (siehe oben), wurde eine Analyse durchgeführt, um zu bestimmen, ob HEPES bei einer BRET-Untersuchung verwendet werden kann, ohne den Energietransfer zu unterbrechen. Zellen, die Rluc oder Rluc·EYFP stabil exprimierten, wurden während des BRET-Nachweises in Anwesenheit oder Abwesenheit von HEPES, 10 mM, pH 7,2, inkubiert. Die Wirkung von HEPES in Anwesenheit von DTT wurde ebenfalls untersucht. Die 28 und 29 zeigen die Wirkung von HEPES auf Rluc- bzw. Rluc·EYFP-Fusionskonstrukte. HEPES modifizierte das Verhältnis ohne es zu stören. Die Verhältnisse wurden in Anwesenheit von HEPES sowohl für das Rluc- als auch für das Rluc·EYFP-Konstrukt erhöht, aber der dynamische Bereich änderte sich nicht. Weiters gab es eine zusätzliche Wirkung auf das Verhältnis, wenn die Untersuchung in Anwesenheit von DTT und HEPES durchgeführt wurde, jedoch ebenfalls ohne Änderung des dynamischen Bereichs.
6- Wirkung von DMSO
DMSO wird häufig als Solvens zum Auflösen der Verbindungen verwendet und könnte folglich seinen Weg in eine vorgegebene Untersuchungsmischung finden. Verschiedene Mengen an reinem DMSO wurden direkt in die Kammern der Mikrotiterplatte hinzugefügt. Das Gesamtvolumen wurde bei 200 μl für jede Bedingung gehalten. 30 zeigt die Wirkung auf den Energietransfer in Anwesenheit von HEPES. Es wurde beobachtet, dass aus der Anwesenheit von DMSO nur eine kleine Wirkung mit Rluc-Emissionen resultierte (Daten nicht gezeigt).
BEISPIEL XII: IN VIVO APOPTOSE-SENSOR
Apoptose oder PCD (programmierter Zelltod) ist ein normaler zellulärer Prozess, der bei den meisten Zelltypen zu finden ist. Sie ist an vielen Aspekten von Zellhomöostase und Organismusentwicklung beteiligt (z. B. ist PCD für die Modellierung (Form) eines Organs bei der Morphogenese verantwortlich) (Nicholson, D. W. und Thornberry, N. A., 1997, TIBS, 22:299-306; Kinloch, R. A. et.al., 1999, TIPS, 20:35-42). Sehr häufig wird unangemessener PCD bei vielen Krankheiten wie Krebs, neurodegenerativen Krankheiten usw. festgestellt. PCD ist eine regulierte Möglichkeit für Zellen, zu einer spezifischen Zeit zu sterben, ohne die Schutzreaktion des Organismus (z. B. Entzündung) zu stimulieren, und unterscheidet sich daher von der anderen Art des Zelltods, der Nekrose, die im Allgemeinen aus einem zellulären Zufall resultiert.
Viele Proteine und Lipide sind am PCD beteiligt. Zu ihnen gehören die Caspasen, die Teil einer großen Familie von Cysteinproteasen sind (Nicholson, D. W. und Thornberry, N. A., 1997, TIBS, 22:299-306). Caspasen erkennen und spalten spezifische Aminosäuresequenzen (normalerweise eine Sequenz von 4 bis 5 Aminosäuren) und sind Teil einer Proteinkaskade, die durch Aktivierung von Effektoren endet, die am Abbau von Protein (durch Aktivieren allgemeiner Proteasen) und DNA beteiligt sind. Spezifische Rezeptoren an der Plasmamembran (z. B. fas-R, TNF-R) und deren Adapterproteine lösen das Apoptose-Signal durch die Aktivierung einer ersten Linie von Caspasen (Caspase-2, 8, -10) in Abhängigkeit vom Zelltyp aus. Diese aktivierten Caspasen aktivieren dann durch Spalten einer spezifischen Aminosäuresequenz andere Caspasen (-3, -7, -9, -4). Diese könnten wiederum andere Caspasen aktivieren und wirken außerdem auf Zell-Targets, um Zellzerstörung zu erzeugen. Apoptose kann bei manchen Zelltypen außerdem durch chemische Agenzien (z. B. Thapsigargin bei HL-60-Zelllinie oder Staurosporin bei der HeLa-Zelllinie).
Ein BRET-Apoptose-Sensor wurde konstruiert, indem eine Caspase-3-Erkennungsstelle in die Linker-Region des Rluc-EYFP-Fusionskonstrukts eingeführt wurde. Bei Induktion von Apoptose sollte Caspase-3 erkennen und die Linker-Region spalten, wodurch Rluc von EYFP getrennt werden sollte, um dadurch das BRET-Verhältnis im Verlauf der Zeit zu senken.
Die Caspase-3-Stelle wurde eingeführt unter Verwendung von komplementären Oligonucleotiden, die durch Annealing verbunden waren. Die beiden komplementären Oligonucleoti de codieren die Caspase-3-Stelle Gly-Asp-Glu-Val-Asp-Gly. Es wurde nur Asp-Glu-Val-Asp verwendet, und es waren: Oligonucleotid Sense: 5' GATCCGGCCGACGAGGTGGACGGCGAATCCGCGGTAC (SEQ ID NO:23) und Oligonucleotid Antisense: 5' CGCGGATTCGCCGTCCACCTCGTCGGCCG (SEQ ID NO:25).
Nach dem Annealing bilden die Oligonucleotide eine Doppelstrang-DNA mit zwei kohäsiven Restriktionsstellen an beiden Enden: 5' BamHI und bei 3' KpnI. pT7/Rluc-EYFP wurde unter Verwendung von BamHI und KpnI verdaut und das durch Annealing verbundene Doppel-Oligonucleotid wurde in den pT7/Rluc-EYFP-Vektor subkloniert. Die Rluc-EYFP- und das Rluc-Caspase-EYFP-Fusionsgene von dem pT7-Vektor wurden dann unter Verwendung von NheI und NotI-Restriktionsenzymen in den Säuger-Expressionsvektor pCEP4 (Invitrogen) subkloniert.
Die DNA-Sequenzen für die beiden Konstrukte, die für dieses Beispiel benötigt wurden, sind in den 57 und 59 dargestellt.
Die pCEP4/Rluc-EYFP- und pCEP4/Rluc-Caspase-EYFP-DNAs wurden unter Verwendung von LipofectAMINE (BRL/Gibco-Life technologies) in 100mm-Schalen, wie im Herstellerprotokoll beschrieben, in die HeLa-Zelle transfiziert. 24 Stunden nach Transfektion wurden transfizierte Zellen geerntet und mit einer Dichte von 30.000 Zellen pro Kammer in 96-Kammer-Mikrotiterplatten (weiße Optiplate von Packard) geimpft. Am folgenden Tag werden die Zellen zum Durchlaufen von Apoptose unter Verwendung von Staurosporin 1 mM, das in ISCOVE-Medien (BRL/Gibco-Life technologies) aufgelöst wurde, ohne. Serum und Phenolrot bei 37 °C (hier beträgt das Gesamtvolumen 100 ml) 5 Stunden induziert. 50 ml BRET-Puffer (PBS Ca²⁺/Mg²⁺ + Glucose ohne Aprotinin) und 50 ml Coelenterazin h (20 mM) werden hinzugefügt, um die Biolumineszenzreaktion zu starten. Lichtemissionen werden unter Verwendung des BRET-Zähler ermittelt (Leselänge Sek. pro Filter, Temperatur 25 °C). Die Daten wurden 10 Minuten nach dem Hinzufügen von Coelenterazin h erfasst. Die Untersuchung erfolgte vierfach.
31 zeigt repräsentative BRET-Verhältnisänderungen in HeLa-Zellen nach 5 Stunden Apoptoseinduktion durch Staurosporin. Eine signifikante Verhältnisänderung tritt auf, wenn mit dem Apoptosesensor transfizierte Zellen durch Staurosporin induziert wurden. Die Verhältnisse sanken.
BEISPIEL XIII: MINI-SCREEN-UNTERSUCHUNG
Eine Hauptanwendung von BRET ist Wirkstoffprüfung an lebenden Zellen. Ein Target (bei diesem Beispiel β2-Rezeptor) wurde stabil in Säugerzellen (bei diesem Beispiel CHW) transfiziert und in Kombination mit einem vorübergehend transfizierten Sensor oder einem Reportergen (bei diesem Beispiel der cAMP-Sensor CBP:CREB) koexprimiert. Die Zellen wurden dann in eine 96-Kammer-Mikrotiterplatte in einen geeigneten Puffer geimpft. Die Mini-Screens wurden entweder mit angehafteten Zellen (am Boden der Kammer) oder unter Verwendung von Zellsuspensionen durchgeführt. Bei Verwendung angehafteter Zellen wurde eine Wartezeit von wenigstens einigen Stunden bei 37 °C gewährt, so dass sich die Zellen an den Boden der Kammern anhaften konnten. Sobald sie anhafteten, wurden Prüfverbindungen zu den Zellen hinzugefügt und bei einer für die Untersuchung geeigneten Temperatur (im Allgemeinen zwischen 15 und 42 °C) inkubiert. Im Allgemeinen, jedoch nicht notwendigerweise, wurden die Verbindungen in einem organischen Solvens (z. B. DMSO) aufgelöst. Die Verbindungen können in einem Pool gesammelt werden, bevor sie den Kammern hinzugefügt werden. Es wurde dann Coelenterazin hinzugefügt, um die Biolumineszenzreaktion zu starten, worauf der Emissionsnachweis erfolgte.
Während bei diesem Beispiel die Zellen mit dem Sensor in einer stabilen Zelllinie, die den Rezeptor exprimierte, vorübergehend transfiziert wurden, können bei alternativen Ausführungen Zellen verwendet werden, die mit Target in einer stabilen Zelllinie, die Sensor exprimiert, oder einer Zelllinie, die sowohl den Rezeptor (Target) als auch den Sensor stabil exprimiert, vorübergehend transfiziert wurden.
48 Stunden nach Transfektion wurden transfizierte CHW-b2 mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro Kammer in eine weiße Optiplate (Packard) geimpft. 10 ml verschiedener Verbindungen, die in DMSO mit verschiedenen Konzentrationen aufgelöst waren, wurden in jede Kammer zu einem Gesamtvolumen von 150 ml (Zelle + Puffer + Verbindung) hinzugefügt. Die erste Reihe auf der Mikrotiterplatte war der positiven Kontrolle (Isoproterenol) und der negativen Kontrolle (DMSO) vorbehalten. Die Untersuchung kann als „blinder Test" durchgeführt werden, so dass der Prüfer die Identität der Verbindungen, die geprüft werden, kennt und eine zweite Person eine „Mutterplatte" präpariert, die jede der Verbindungen mit zwei unterschiedlichen Konzentrationen enthält. Der „blinde" Prüfer nimmt 10 ml aus der Kammer aus der Mutterplatte und überträgt die Proben auf die Untersuchungs-Platte, die die Zellen enthält. 50 ml Coelenterazin h (20 mM) wurden dann jeder Kammer hinzugefügt, um die Biolumineszenzreaktion zu starten. Die Mikrotiterplatte wurde dann, wie oben beschrieben, zur Lichtmessung bei 25 °C in den BRET-Count geladen. Die Daten wurden 68 Minuten nach Hinzufügen von Coelenterazin erfasst. Falsche Positive können erkannt werden, indem die Untersuchung mit der Mutterzelllinie CHW wiederholt wird, die mit dem Sensor transfiziert ist, aber b2 nicht exprimiert.
Für einen Fachmann auf dem Gebiet dürfte offensichtlich sein, dass alternative Ausführungen, die in den Umfang der Erfindung fallen und andere Wirkstoffprüfprotokolle einsetzen, zum Einsatz des BRET-Assays angepasst werden können.
32 stellt die Ergebnisse eines Mini-Screen-Assay-Verhältnisses 550/470 nm im Vergleich zur Verbindungsposition in der Kammer dar. Die ersten vier Kammern von Reihe 1 sind die negative Kontrolle (DMSO allein) (N). Die vier folgenden Kammern sind die positive Kontrolle (P). Die Medianlinie wurde mit der folgenden Formel berechnet: Verhältnis Positiv (ermittelt mit dem Kontrollpositiv) minus Verhältnis Negativ (ermittelt mit der negativen Kontrolle) geteilt durch 60 mal 100. Bei dieser besonderen Untersuchung wurde die Medianlinie auf 2,029 festgelegt. Alle Verhältniswerte der anderen Kammern, die höher als die Medianlinie sind, gelten als Treffer (1 bis 5). Die Identität aller reaktiven Verbindungen, die mit b2-Rezeptor interagierten lautet: 1: Forskolin 2 mM; 2: Epinephrin 20 nM; 4: Forskolin 2 mM.
BEISPIEL XIV: EIN ALGORITHMUS FÜR DIE BRET-UNTERSUCHUNG
Es wurde ein Algorithmus entwickelt, um das Grundniveau während der BRET-Untersuchung mathematisch zu senken. Obwohl es andere Algorithmen gibt, die ebenfalls verwendet werden könnten, besteht ein simpler Ansatz darin, den Teil der Rluc-Emission in der EYFP-Spitze zu entfernen. Zum Beispiel könnte dies unter Verwendung der folgenden einfachen Formel berechnet werden:
wobei Em550 der Emissionswert (CPS) ist, der mit dem 550nm-Filter (Filter für EYFP-Emission erzielt wurde, und Ex470 der Emissionswert (CPS) ist, der mit dem 470nm-Filter (Filter für Rluc-Emission) erzielt wurde. Der Korrekturfaktor wurde experimentell berechnet, wobei allein transfiziertes Rluc-Konstrukt (ohne das EYFP-Konstrukt) verwendet wurde. Der Korrek turfaktor ist das Verhältnis (550/470 nm) des Rluc-Konstrukts zu einem gegebenen Zeitpunkt nach Zusatz von Coelenterazin. Bei dem folgenden Beispiel stellen die 33 und 34 die unkorrigierten bzw. die korrigierten Daten dar. Bei beiden Figuren wurden dieselben unverarbeiteten Daten (Lichtemissionen unter Verwendung beider Filter) verwendet. Der einzige Unterschied besteht darin, dass bei 34 das Verhältnis unter Verwendung der vorgenannten Formel korrigiert wurde. Bei diesem Beispiel wird die Bereichsdynamik der Untersuchung, die in beiden Figuren immer noch ungefähr 0,1 beträgt (Differenz zwischen maximalem und minimalem Verhältnis) durch den vorgenannten Algorithmus nicht verändert. Aber das SNR (Signal-Rausch-Verhältnis) ändert sich. SNR ist das Verhältnis zwischen maximalen und minimalen BRET-Verhältniswerten. In 33 beträgt das SNR 1,07 im Vergleich zu 4,77 für 34. Das Einführen des Algorithmus in die Berechnung von BRET-Verhältnissen könnte beim Hochdurchsatz-Screening-Prozess sehr nützlich sein, da es den Hintergrund verringert und das SNR erhöht und dadurch die Ergebnisauswertung erleichtert.
BEISPIEL XV: VERSCHIEDENE PARAMETER, DIE DIE UNTERSUCHUNG BEEINFLUSSEN (LUMICOUNT)
Dieses Beispiel fasst verschiedene Experimente Zusammen, die zum Analysieren von BRET an Säugerzellen durchgeführt wurden. Die Experimente wurde in zwei Teile geteilt: 1) Bestimmung der Coelenterazin-Permeabilität; 2) BRET-Machbarkeit unter Verwendung des LumiCount.
Bestimmung der Coelenterazin-Permeabilität
i) Coelenterazin-Derivate.
Unter Verwendung des Plasmids pRluc-CMV (Promega) und des LumiCount wurde bestimmt, welches der Coelenterazin-Derivate das höchste Signal liefert. Die Zellen (HeLa) wurden im T-75-Kolben mit pRluc-CMV oder Kontrollvektor unter Verwendung von LipofectAMINE vorübergehend transfiziert. 48 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen geerntet und in eine weiße 96-Kammer-ViewPlate (im Duplikat) geimpft. Dann wurden in jeder Kammer Coelenterazin-Derivate (1 mM) hinzugefügt. Die Lumineszenz von transfizierten Zellen wurde unter Verwendung des LumiCount 4 Minuten nach Zusatz von Coelenterazin-Derivaten gemessen. Der LumiCount wurde auf 1100 V PMT und 1 Sek. Leselänge eingestellt. Tabelle IV: Assay von Coelenterazin-Derivaten

* Dieser Wert ist auf Grund von Kreuzkopplung zwischen Kammern erhöht.

Der elektronische Hintergrund beträgt ungefähr 20 bis 40 RLU. Eine Bewertung der Kreuzkopplung wurde in dem LumiCount bei 1,3 % in der Kammer direkt neben dem Emitter und bei 0,2 % in der zweiten Kammer neben dem Emitter vorgenommen. Die Kreuzkopplung erhöhte sich bei Verwendung von Filtern auf 3 % (siehe unten).
ii) Zelllinearitätsexperiment.
Die Zellen (HeLa und CHO) wurden in T-75-Kolben mit pRluc-CMV unter Verwendung von LipofectAMINE vorübergehend transfiziert. 48 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen geerntet und (vierfach) mit unterschiedlichen Zelldichten (im Bereich von 0 bis 150.000 Zellen pro Kammer) in eine weiße 96-Kammer-ViewPlate geimpft. Dann wurde in jeder Kammer Coelenterazin h in PBS (1 mM) hinzugefügt. Die Lumineszenz von transfizierten Zellen wurde unter Verwendung des LumiCount 10 Minuten nach Zusatz von Coelenterazin gemessen. Der LumiCount wurde auf 1100 V PMT und 0,1 Sek. Leselänge eingestellt.
35 stellt die beobachteten Ergebnisse dar. Wie nachgewiesen wird, ist die Rluc-Lumineszenz über den analysierten Bereich der Zelldichte linear. Sehr hohe Signal-Rausch-Verhältnisse (SNR) (über 200) konnten unter Verwendung einer moderaten Menge an Zellen (50.000 Zellen pro Kammer) erzielt werden. Noch höhere RLU und SNR konnten erzielt werden, wenn die Analyse während des Rluc-Lumineszenz-Blitzes erfolgte. Die Kurvenanstiege für HeLa- und CHO-Zellen sind unterschiedlich, was wahrscheinlich die Unterschiede bei den Transfektionseffizienzen zwischen den beiden Zelllinien und/oder Unterschiede bei der CMV-Promotor-Aktivität zwischen den beiden Zelllinien widerspiegelt.
iii) Zeitverlaufsexperiment.
Die Zellen (HeLa und CHO) wurden in T-75-Kolben mit pRluc-CMV unter Verwendung von LipofectAMINE vorübergehend transfiziert. 48 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen geerntet und mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro Kammer (als Quadruplikat) in eine weiße 96-Kammer-ViewPlate geimpft. Dann wurde in jeder Kammer Coelenterazin f (1 mM) hinzugefügt. Die Lumineszenz von transfizierten Zellen wurde unter Verwendung des LumiCount zu verschiedenen Zeiten nach Zusatz von Coelenterazin gemessen. Der LumiCount wurde auf 1100 V PMT und 0,1 Sek. Leselänge eingestellt.
36 zeigt die Ergebnisse dieser Zeitverlaufsstudien zu Rluc-Lumineszenz. Bei beiden Zelllinien erfolgt der Abbau der Rluc-Lumineszenz nach Zusatz von Coelenterazin f rasch. Dieses Experiment wurde mit nativem Coelenterazin wiederholt und es wurden ähnliche Ergebnisse erzielt. Die Halbwertszeit der Reaktion beträgt bei CHO-Zellen 11 Minuten und bei HeLa-Zellen 13 Minuten. Diese Werte ähneln dem, was in der Literatur zu in vitro (Zellextrakt-)Experimenten zu finden ist.
iv) Dosis-abhängige Wirkung von Coelenterazin-Derivaten.
HeLa-Zellen wurden in T-75-Kolben mit pRluc-CMV unter Verwendung von LipofectAMINE vorübergehend transfiziert. 48 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen geerntet und mit einer Dichte von 25.000 Zellen pro Kammer (vierfach) in eine weiße 96-Kammer-ViewPlate geimpft. Dann wurde in jeder Kammer Coelenterazin f oder h in unterschiedlichen Konzentrationen hinzugefügt. Die Lumineszenz von transfizierten Zellen wurde unter Verwendung des LumiCount 3 Minuten nach Zusatz von Coelenterazin gemessen. Der LumiCount wurde auf 1100 V PMT und 0,1 Sek. Leselänge eingestellt.
37 zeigt die Ergebnisse der Experimente zu einer dosis-abhängigen Wirkung von Coelenterazin-Derivaten. Sättigungen wurden für beide Coelenterazin-Derivate erzielt. Anhand dieser Kurven wurde das Km von Rluc für beide Coelenterazine berechnet. Sie lauten 1,2 und 0,8 mM für Coelenterazin f bzw. h. Auch diese Werte ähneln dem, was in der Literatur zu in vitro (Zellextrakt-)Experimenten zu finden ist.
v) Dosis-abhängige Wirkung unter Verwendung von lysierten und kompletten Zellen.
HeLa-Zellen wurden in T-75-Kolben mit pRluc-CMV unter Verwendung von LipofectAMINE vorübergehend transfiziert. 48 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen geerntet, gewaschen und in zwei Teile geteilt. Ein Teil der Zellen wurde mit einer Dichte von 25.000 Zel len pro Kammer (vierfach) direkt in eine weiße 96-Kammer-ViewPlate geimpft. Die Zellen des anderen Teils wurden unter Verwendung eines Dounce-Homogenisators und von lysierendem Puffer (hypotonische Lösung) lysiert. Nach dem Potten wurden unlysierte Zellen und Kerne durch Zentrifugierung entfernt. Der lysierte Extrakt wurde in der weißen 96-Kammer-Platte verteilt. In jeder Kammer wurde Coelenterazin h in unterschiedlichen Konzentrationen hinzugefügt. Die Lumineszenz von transfizierten Zellen wurde unter Verwendung des LumiCount 2 bis 3 Minuten nach Zusatz von Coelenterazin gemessen. Der LumiCount wurde auf 900 V PMT und 1 Sek. Leselänge eingestellt.
38 zeigt die Ergebnisse eines Vergleichs von lysierten und unlysierten Zellen. Beide Assays ergaben ungefähr denselben Km (um 1 mM) und ähnliche absolute RLU, was bedeutet, dass Coelenterazin schnell und massiv die Zellmembran passiert.
Die folgenden Studien beziehen sich auf die BRET-Untersuchung.
i) Fusionstyp-Untersuchung
Bei Verwendung der vorgenannten Parameter für Rluc-Lumineszenz und mit der Kenntnis, dass die Zellmembran für Coelenterazin permeabel ist, wurde bestimmt, dass man damit beginnen sollte, BRET bei Säugerzellen zu prüfen. Die Konstrukte der Vanderbilt University wurden in Säuger-Expressionsvektoren (pCDNA3.1) subkloniert. BRET wurde untersucht, indem zu Beginn der Fusionstypvektor verwendet wurde, bei dem das Rluc-Protein mit EYFP fusioniert war (drittes Konstrukt in Anhang 1). Zu diesem Zweck wurde der LumiCount modifiziert, indem die Länge zwischen dem PMT und der Mikrotiterplatte vergrößert wurde. Dies erfolgte, um einen Filter auf der Mikrotiterplatte zu platzieren. Zum Messen von BRET wird die Lumineszenz bei zwei Wellenlängen erfasst: 480 nm und 530 nm (unter Verwendung von zwei 50 × 50mm-Filter von Ealing). Daher wurde nach Hinzufügen von Coelenterazin zu den Zellen der 530nm-Filter unter Verwendung von Fun-Tak (von Lepage) an der Mikrotiterplatte befestigt und die Lumineszenz von der Mikrotiterplatte wurde gelesen. Dann wurde der 530nm-Filter durch die 480-Filter ersetzt und die Lumineszenz wurde erneut gemessen. Die Emissionsverhältnisse bei 530 nm und 480 nm wurden berechnet, um BRET zu quantifizieren.
Die Zellen wurden im T-75-Kolben mit pcDNA3.1-Rluc+pcDNA3.1-EYSP oder pcDNA3.1-Rluc+pcDNA3.1-Rluc·EYSP (Fusion) unter Verwendung von LipofectAMINE vo rübergehend transfiziert (41). 48 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen geerntet und mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro Kammer (vierfach) in 50 ml PBS in eine weiße 96-Kammer-ViewPlate geimpft. Dann wurde der modifizierte LucLite-Puffer (100 ml) hinzugefügt, bevor 50 ml Coelenterazin f (Endkonzentration: 1 oder 5 mM) hinzugefügt wurde. Die Lumineszenz von transfizierten Zellen wurde unter Verwendung des LumiCount zu verschiedenen Zeiten nach Zusatz von Coelenterazin gemessen. Der LumiCount wurde auf 1100 V PMT und 1 Sek. Leselänge eingestellt. Tabelle V zeigt eine Zusammenfassung der Ergebnisse unterschiedlicher Transfektionen.
Tabelle V: BRET-Assay unter Verwendung von LumiCount (*N>10 unterschiedliche Transfektionen)
BRET kann unter Verwendung von LumiCount ermittelt werden. Die Verhältnisse aus der Fusion Rluc::EYFP sind im Vergleich zu beiden negativen Kontrollen stets höher. Es ist zu beachten, dass die Verhältnisse im Verlauf der Zeit nicht stabil zu sein scheinen (siehe 39 und 40) und die Verhältnisse von negativen Kontrollen vor allem bei Verwendung höherer Coelenterazin-Konzentrationen höher als erwartet waren.
1) Verhältnisstabilität.
BRET oder die Verhältnisse waren stabil, wenn die Rluc-Emission stabil war. Die Ergebnisse schwankten jedoch, wenn die Rluc-Emission nicht stabil war. Bei Verwendung von Coelenterazin h steigen die Verhältnisse von negativer Kontrolle im Verlauf der Zeit und die Verhältnisse aus der Fusion sanken auf einen Punkt, an dem beide Kurven einander kreuzten (39). Dieser Punkt trat zeitlich später ein, wenn niedrigere Konzentration von Coelenterazin verwendet wurde. Bei Verwendung von nativem Coelenterazin waren die Verhältnisse stabiler (siehe 40).
2) Hohe Verhältnisse für negative Kontrolle.
Nach der Fluoreszenzabtastung bei Bakterien (Ergebnisse von Vanderbilt) sollte die negative Kontrolle ein Verhältnis von 0,5 bis 0,6 aufweisen. Dies ist geringer als das bei Säugerzellen Erzielte.
39 zeigt die Ergebnisse von Studien zur Verhältnisstabilität bei Verwendung von Coelenterazin h in LucLite. Beide Probleme sind miteinender verbunden. Sie hängen von Coelenterazin (Typ und Konzentration) und wahrscheinlich von der Anzahl von Sensormolekülen pro Zelle ab. Zur Verifizierung wurden neue Untersuchungen durchgeführt, wobei weniger DNA bei den Transfektionen verwendet wurde (41 und 42) oder die Zellen lysiert wurden, um die Entropie der Reaktion zu senken: Sensormolekülverdünnung in höherem Volumen (43). Das Volumen der Zellen ist sehr klein (hohe Entropie). Wenn zuviel Rluc emittiert (auf Grund seiner hohen Expression oder der Verwendung der starken Coelenterazin-Derivate), wird nahegelegenes EYFP in der negativen Kontrolle aktiviert, was einen Anstieg des Verhältnisses zur Folge hat. Folglich steigt der Lichtausstoß bei 530 nm und auch das Verhältnis. Wenn hohe Niveaus an Rluc- oder EYFP-Molekülen und/oder Coelenterazin, Aktivierung von (nahegelegenem) EYFP von Rluc bestehen, ist die Emission stärker. In der Tat waren beim Vergleich der negativen Kontrolle von Rluc und der negativen Kontrolle von Rluc+EYFP (siehe Tabelle 2) die Verhältnisse von Letzterem normalerweise höher, was darauf hindeutet, dass mancher unspezifische BRET (übertragene Strahlungsenergie) auftrat. 40 zeigt Ergebnisse der Verhältnisstabilität bei Verwendung von nativem Coelenterazin in LucLite.
41 zeigt BRET-Nachweis bei Zellen, die mit 10 Mal weniger DNA transfiziert wurden. 42 zeigt BRET-Nachweis bei Zellen, die mit 20 Mal weniger DNA transfiziert wurden. Durch Verwendung von weniger DNA bei den Transfektionen wurde das Verhältnis der negativen Kontrolle von Rluc+EYFP auf das Niveau von Rluc allein verringert, was darauf hindeutet, dass geringerer unspezifischer BRET in der negativen Kontrolle von Rluc+EYFP auftritt. Weiters waren die Verhältnisse im Verlauf der Zeit stabiler, wenn eine geringere Menge an Molekülen exprimiert wurde. Die Differenz zwischen Fusion und negativer Kontrolle war größer, wenn weniger DNA verwendet wurde, weshalb der dynamische Bereich der Untersuchungen vergrößert wurde. Zuletzt ist das Exprimieren einer geringeren Menge an Sensormolekülen in den Zellen aus einem biologischen Gesichtspunkt besser: Es verursacht weniger Störung des „normalen" Metabolismus der Zelle.
Die besten Bedingungen in Bezug auf die Stabilität des Verhältnisses und des produzierten unspezifischen BRET wurden bei lysierten Zellen festgestellt (43). Bei diesen Bedingungen sind sämtliche Verhältnisse stabil und alle negativen Kontrollen waren äquivalent. 43 zeigt die Ergebnisse des BRET-Nachweises bei lysierten Zellen. Die Transfektionen erfolgten unter Verwendung der „normalen" DNA-Menge.
ii) Protein-Protein-Typ-Untersuchung
Es wurde außerdem eine Protein-Protein-Untersuchung unter Verwendung von kai-Domänen durchgeführt (siehe Tabelle 2). Nur Rluc-kaiB/EYFP-kaiB-Interaktion führte zu einem höheren Verhältnis als Rluc-kaiB/EYFP-kaiA-Kontrolle.
iii) Formatieren der Untersuchung
Untersuchungs-Medien. Es wurde ermittelt, ob die Untersuchungs-Medien eine Wirkung auf die Rluc-Emission hatten (44). Die vorgenannten Experimente wurden unter Verwendung der Medien PBS oder DMEM/F12 (ohne Phenolrot) und LucLite wiederholt. Sowohl bei der Fusion als auch bei der negativen Kontrolle ergab PBS die höchste Rluc-Emission. 44 zeigt die Ergebnisse des Vergleichs zwischen PBS und DMEM/F12 (ohne Phenolrot) für die Prüfung von BRET.
Sonstige getestete Bedingungen.
Es wurden unterschiedliche Typen von Mikrotiterplatten und Untersuchungs-Volumina darauf getestet, ob sie eine Wirkung auf BRET hatten. Das für die Untersuchung verwendete Volumen beeinflusste das Verhältnis nicht. Der Mikrotiterplattentyp (schwarz oder weiß) beeinflusste das Verhältnis: Im Vergleich zur weißen Platte senkte die schwarze Mikrotiterplatte die Verhältnisse. Aber dies erfolgte sowohl bei der negativen Kontrolle als auch bei der Fusion. Tabelle VI: Wirkung von Mikrotiterplatte und Volumen auf BRET

5 uM Coelenterazin 50.000 Zellen pro Kammer.

Der dynamische Bereich (Anzahl von Vielfachen über negative Kontrolle) beträgt ungefähr zwei und ist etwas klein, was jedoch von der Literatur nicht stark abwich. Normalerweise lag der dynamische Bereich beim FRET-Assay zwischen dem 2- bis 3-fachen.
BEISPIEL XVI: VERSCHIEDENE PARAMETER, DIE DIE UNTERSUCHUNG (BRETCOUNT) BEEINFLUSSEN
Die folgenden Experimente beziehen sich auf Faktoren, die die Stabilität der Untersuchung beeinflussen. Im Verlauf der BRET-Studie wurde bestimmt, dass Rluc-Emission bei lebenden Zellen im Verlauf der Zeit nicht stabil war und eine Halbwertszeit von ungefähr 5 bis 8 Minuten aufwies. Rluc-Emissionsstabilität ist für die BRET-Untersuchung wichtig, um höhere Reproduzierbarkeit (engere CV, SD) und einfachere Anpassung an Hochdurchsatz-Screening zu erreichen. Anfänglich wurde der modifizierte LucLite-Puffer verwendet, um die Rluc-Emission zu stabilisieren, jedoch mit geringem Erfolg. Dieser Puffer, der das Triton N-Detergens nicht enthielt, jedoch immer noch DTT enthält, hatte eine Stabilisierungswirkung, indem er die Halbwertszeit der Rluc-Emission verdoppelte (12 bis 16 min). Aber die Verwendung dieses modifizierten LucLite wird für die Untersuchung an lebenden Zellen nicht empfohlen, da langfristige Einwirkung die Zellen zerstörte: Die Lösungen sind nicht isotonisch. Neben oder in Verbindung mit dem LucLite-Puffer wurden unterschiedliche Untersuchungs-Bedingungen probiert, um die bessere Stabilität zu erreichen. Dazu gehörten Ca²⁺/Mg²⁺-Abhängigkeit, Menge an transfizierter DNA, Zellkonzentration, Coelenterazin-Konzentration, Medientyp (PBS vs. DMEM), Dauer der Inkubation des modifizierten LucLite mit den Zellen. Neben DTT ergaben sich aus dieser vorhergehenden Studie zur Stabilisierung von Rluc zwei Beobachtungen: 1- Die Coelenterazin-Konzentration war die einzige Bedingung, die eine Wirkung (wenn auch nur eine kleine) auf die Halbwertszeit bei der Reaktion hatte. 2- Echtes Leuchten (Halbwertszeit von mehr als 1 Stunde) wurde nur bei lysierten Zellen erreicht. Die Stabilität (Halbwertszeit) von Rluc ist im Vergleich zu FFluc selbst bei lysierten Zellen unterschiedlich. Die FFluc-Halbwertszeit beträgt im Vergleich zu 1 Stunde für Rluc mehr als 3 Stunden, wenn sie unter Verwendung des LumiCount und des DuoLite (DuoLite wurde später in FireLite umbenannt) geprüft werden. Das Hauptziel besteht hier darin, Untersuchungs-Bedingungen zu finden, die stabile Rluc-Emission ermöglichen und die nicht den Energietransfer von BRET beeinträchtigen. Im Folgenden werden die Bedingungen genannt, die geprüft wurden:
3) Zeitaufgelöste Emissionsanalyse.
Die Rluc-Emission ist in zwei Phasen unterteilt. In den ersten 20 bis 30 Minuten baut sich die Emission rasch ab, ohne auf Null zu gehen. Nach 30 Minuten ist die Rluc-Emission stabiler. Es musste ermittelt werden, ob dieser „stabile" Zustand für Hochdurchsatz-Screening verwendet werden kann: Er wird durch Eigenlumineszenz des Coelenterazin verursacht und wenn nicht, ist die Höhe der Kurven linear zum Rluc-Gehalt der Zelle.
4) Temperaturwirkungen.
Die Wirkung der Temperatur auf die Rluc-Emission und auf das BRET-Verhältnis muss untersucht werden.
5) Analogwirkung.
Soweit verfügbar, wird die Verwendung von inaktiven Coelenterazin-Analogen und/oder Coelenteramid (Coelenteramid ist ein Nebenprodukt der Reaktion) zur Stabilisierung von Rluc getestet.
6) Radikalfängerwirkung.
Zuletzt die Wirkung des zellpermeablen Radikalfängers: DTT.
Zwei Verbindungen, die in LucLite-Lösungen zu finden sind, sind für die Stabilität von FFluc-Emission wichtig: DTT und AMP. DTT mit hoher Konzentration scheint als Radikalfänger zu wirken und funktioniert durch Beschränken der Verfügbarkeit von O₂. Bei sehr hoher Konzentration erhöht DTT sogar die Emission von Photonen durch einen unbekannten Me chanismus. O₂ ist wie ATP, Mg2+ und das FFluc-Substrat, Luciferin, für die FFluc-Reaktion von wesentlicher Bedeutung. 45 zeigt DTT-Wirkungen auf die Rluc-Emissionsstabilität.
FFluc-Oxidation ist in zwei Schritte unterteilt. Zuerst erfolgt die Bildung eines „aktivierten Intermediats", wenn Luciferin und ATP das Enzym binden und wenn ATP zu AMP abgebaut wird, was wiederum ein reaktives Anhydrid bildet. Das Hinzufügen von AMP zu der Reaktion verlangsamt die Bildung des aktivierten Enzyms und somit den Umsatz der Reaktion, wodurch sie noch langsamer gemacht wird. Im zweiten Schritt reagiert das aktivierte Intermediat mit 0₂ und zerfällt zu CO₂, Oxyluciferin und grüngelbes Licht bei 560 nm. Andere Komponenten des LucLite-Kits sind ebenfalls wichtig (jedoch zu einem geringeren Grad) für die Emissionsstabilität von FFluc: Oxalsäure und Phenylessigsäure als Proteaseinhibitoren, EDTA für die Kontrolle der Mg²⁺-Konzentration und HEPES-Puffer für eine enge Kontrolle des pH-Werts (unabhängig vom CO₂-Gehalt der Medien). Promega (Madison, WI) fügt bei dem FFluc-Kit außerdem D-Analog-Substrat und CoA hinzu (siehe unten).
Der enzymatische Mechanismus von Rluc ist im Vergleich zu FFluc unterschiedlich. Erstens verwendet Rluc das Coelenterazin als Substrat und produziert blaues Licht bei 470 bis 480 nm. Es ist kein Zweischrittprozess: Es gibt kein Erfordernis für ATP und Mg2+. Der Umsatz der Reaktion erfolgt schneller als bei FFluc. Da sie kein Zweischrittprozess ist, leidet die Rluc-Reaktion unter Eigenlumineszenz seines Substrats. Daher ist die Rluc-Reaktion weniger empfindlich als die FFluc-Reaktion. Die Niveaus der Eigenlumineszenz wird in großem Maße durch die Verfügbarkeit von hydrophoben Mikroumgebungen beeinflusst, um den lumineszenzangeregten Zustand vor Wasser zu schützen. Daher kann die Anwesenheit von hydrophoben Proteinen, Zellbruchstücken (Membran), reinigenden Mizellen die Empfindlichkeit herabsetzen. Andererseits ist das Coelenterazin membranpermeabel, was Rluc für zellbasierte Assays attraktiv macht. Schließlich scheint es, dass DTT ebenfalls wirksam ist, um Rluc zu stabilisieren und wahrscheinlich als Radikalfänger agiert. Es ist zu beachten, dass DTT bei einer Konzentration von mehr als 1 mM ebenfalls membranpermeabel ist.
Aus struktureller Sicht sind beide Enzyme sehr unterschiedlich. Rluc kommt von einem Coelenterat und besitzt ein MW (Molekulargewicht) von 36 kDa. FFluc kommt vom Insekt und besitzt ein MW von 61 kDa. Es besteht keine offensichtliche Aminosäuresequenzidentität zwischen ihnen. Die Aminosäuresequenz von FFluc ist stärker mit einer unterschiedlichen Familie von Acyl-CoA-Synthetase verwandt. Das unterstreicht die Bedeutung der Anwesenheit von CoA in der Ausrüstung von Promega, um FFluc zu stabilisieren. Somit sind beide Enzyme sowohl strukturell als auch enzymatisch (Substrat, Erfordernisse für die Reaktion usw.) völlig unterschiedlich.
Verfahren:
Transfektionen: CHO-K1-Zellen wurden unter Verwendung von LipofectAMINE (BRL/Gibco) in 100mm-Schalen nach dem Herstellerprotokoll (0,2 ug für jedes Konstrukt + X Träger-DNA für eine Gesamtmenge von 8 ug) vorübergehend transfiziert. Bei Verwendung dieser Technik wurden Transfektionseffizienzen zwischen 40 und 60 % erzielt (wenn die Analyse unter Verwendung eines GFP-Reportervektors und eines Fluoreszenzmikroskops erfolgte). 48 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen unter Verwendung von niedrig konzentriertem Trypsin geerntet, gezählt und in D-PBS (das Ca/Mg enthielt) verdünnt. Bei den meisten Experimenten wurden 50.000 Zellen pro Kammer in weißer Optiplate verwendet. Die Untersuchungen wurden vierfach durchgeführt. Der modifizierte LucLite-Puffer wurde anfänglich zur Stabilisierung der Rluc-Emission verwendet. Die Lichtemission wurde durch den Zusatz von Coelenterazin h 5 uM (5 ul von einem Stamm von 20 uM) ausgelöst.
Die Experimente wurden durchgeführt, indem der BRETCount zu verschiedenen Zeiten nach dem Zusatz des Coelenterazins verwendet wurde. Die für den BRETCount verwendeten Parameter lauteten: Lumineszenz-SPC-Modus, eine Leselänge von 1 Sek. für jede Wellenlänge bei 25 °C, Filter: 470DF60 550DF80. Bei manchen Experimenten wurden die Ergebnisse mit dem LumiCount ermittelt. Die Parameter für den LumiCount lauteten: Leselänge von 0,5 Sek. PMT 1100 V.
1- Zeitaufgelöste Rluc-Emission
Die Zellen wurden nur mit dem Rluc-Konstrukt transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und mit unterschiedlichen Konzentrationen in den modifizierten LucLite-Puffer geimpft. Vor dem Nachweis in dem BRETCount wurde Coelenterazin h hinzugefügt. 46 zeigt die Rluc-Emissionsstabilität im Verlauf der Zeit.
46 zeigt, dass die Rluc-Emission, 10 Minuten nach Zusatz von Coelenterazin beginnend, dazu neigt, sich im Verlauf der Zeit zu stabilisieren. Weiters wurde, selbst nach 10 Mi nuten, festgestellt, dass die RFU-Niveaus immer noch von der Zellenzahl abhingen. Um sicher zu sein, wurde der Graph unter Verwendung von RFU vs Zelldichte bei unterschiedlich vorgegebenen Zeiten neu gepottet (siehe 47).
47 zeigt Rluc-Emissionsniveaus im Vergleich zu Zellenzahl zu einem vorgegebenen Zeitpunkt. 47 zeigt, dass die Rluc-Emissionen selbst nach 58 Minuten nach Induktion (t = 58) zu der Zellenzahl linear waren. Dies ist eine Überraschung, da das Enzym zu diesem Zeitpunkt nicht mehr in dem optimalen Zustand ist, um korrekt zu arbeiten (d. h. die Substratkonzentration ist begrenzt, große Menge an Nebenprodukt bei der Reaktion anwesend). Weiters bedeuteten die Anstiege bei t = 30 und t = 58 auf ähnliche Weise, dass sich die Rluc-Emissions-Halbwertszeit in diesem Zeitraum nicht wesentlich verändert. Das Experiment wurde wiederholt, wobei unterschiedliche relative Mengen transfizierter Zellen verwendet wurden, jedoch mit derselben Gesamtmenge an Zellen. Die transfizierten Zellen wurden mit untransfizierten Zellen gemischt, um eine Gesamtzelldichte von 100.000 Zellen pro Kammer zu erhalten. Der Grundgedanke besteht darin, dass Coelenterazin-Eigenlumineszenz zellabhängig (eigentlich lipidabhängig) ist. Daher tragen erhöhte Zellenzahlen pro Kammer zu der Linearität bei, die in 47 zu sehen ist. Um diese Annahme zu verifizieren, wurde das Experiment unter Verwendung derselben Gesamtzellenzahl pro Kammer wiederholt. 48 zeigt die Rluc-Lichtemissionen unter Verwendung einer unterschiedlichen Menge an transfizierten Zellen, die mit untransfizierten Zellen gemischt wurden, um eine Gesamtzellenzahl von 100.000 Zellen herzustellen. Diese gemischten Populationen wurden dann unmittelbar, bevor die Reaktion mit Coelenterazin gestartet wurde, in die Mikrotiterplatte geimpft.
48 zeigt die Rluc-Emissionsstabilität in Anwesenheit einer festgelegten Zahl von Zellen. 49 zeigt Rluc-Emissionsniveaus im Vergleich zur Zellenzahl zu einem vorgegebenen Zeitpunkt.
Die 47 und 49 zeigen, dass Rluc-Emissionsniveaus selbst 40 Minuten nach dem Zusatz von Coelenterazin linear zur Zellenzahl sind. Daher resultieren Rluc-Lichtausstöße, die bei 30 Minuten und darüber hinaus beobachtet wurden, nicht aus der Eigenlumineszenz des Coelenterazins, sondern aus echten enzymatischen Aktivitäten von Rluc, wobei letztere von dem Rluc-Gehalt der Zellen linear abhängig sind.
2- Temperaturwirkungen.
Unter Verwendung des LumiCount wurde bestimmt, dass bei niedriger Temperatur die Rluc-Emission im Verlauf der Zeit reduziert und stabilisiert wurde. Diese Ergebnisse werden in 50 und 51 zusammengefasst. 50 zeigt, dass bei 15 °C die Rluc-Emission über den analysierten Zeitraum stabilisiert wird. Das BRET-Verhältnis (51) scheint sich mit der Untersuchungs-Temperatur zu ändern: Es sinkt, wenn die Temperatur sinkt. Bei 10 °C ist die Rluc-Emission zu stark reduziert, um unter Verwendung des Lumi-Count verarbeitet werden zu können (Daten nicht gezeigt).
50 zeigt die Wirkung der Temperatur auf die Rluc-Emission. Der LumiCount und die für die Untersuchung benötigten Reagenzien wurden vor Beginn des Experiments 2 bis 3 Stunden in dem begehbaren Kühlraum gelagert und die LumiCount-Innentemperatur wurde entweder auf 15 oder auf 10 °C eingerichtet. 51 zeigt die Wirkung der Temperatur auf das BRET-Verhältnis (LumiCount).
Weitere Charakterisierung der Temperaturwirkung unter Verwendung des BRETCounts, bei dem die Innentemperatur im Vergleich zum LumiCount stabiler und steuerbarer ist (52). Die Experimente wurden unter Verwendung des BRETCount bei unterschiedlichen Temperaturen wiederholt. Die höchsten Signal-Rausch-Verhältnisse wurden bei 19 °C Untersuchungs-Temperatur erzielt. Das Verhältnis neigt bei steigender Temperatur zum Steigen, wodurch die mit dem LumiCount erzielten Ergebnisse bestätigt werden. Oberhalb von 19 °C steigen selbst die Verhältnisse der negativen Kontrollen (Rluc+EYFP) mit der Temperatur. 52 zeigt die Wirkung der Temperatur auf das BRET-Verhältnis (BRETCount).
3- Radikalfängerwirkung.
Der BRETCount (der im Vergleich zum LumiCount einen höheren Durchsatz aufweist) wurde verwendet, um die Radikalfängerwirkung, im Besonderen von DTT, sowohl auf die Rluc-Emission als auch. auf das BRET-Verhältnis zu analysieren. Es wurde zuvor nachgewiesen, dass DTT hilft, die Rluc-Emission zu stabilisieren (siehe 53).
53 zeigt die Wirkung des DTT auf die Rluc-Emission. Geerntete Zellen wurden in PBS (+Ca2⁺/Mg2⁺), das unterschiedliche DTT-Konzentration enthielt, verdünnt. 53 zeigt die Wirkung des DTT (in PBS Ca2⁺/Mg2⁺) auf die Rluc-Emission bei lebenden Zellen. Eine erhöhte DTT-Konzentration stabilisiert die Rluc-Emission durch Senken des Anfangsemissionsblitzes des Enzyms. Die höchste Stabilität wurde bei 100 mM DTT erzielt. Bei dieser Konzentra tion setzt DTT die Lebensfähigkeit der Zellen herab. Die Lebensfähigkeitsanalyse wurde durchgeführt, indem der Trypanblaufarbstoff zu verschiedenen Zeiten, nachdem die Zellen in dem Puffer, der das DTT enthielt, verdünnt wurden, verwendet wurde. Es wurden 10 mM DTT gewählt, was etwas (jedoch nicht besonders hohe) Rluc-Stabilität und gute Langfristlebensfähigkeit (unter 15 % Verlust über 2 Stunden) verleiht.
54 zeigt die Wirkung des DTT auf die Rluc-Emission und das BRET-Verhältnis (BRETCount). Diese Ergebnisse wurden mit den stabilen Zelllinien, die nur Rluc exprimieren (negative Kontrolle), erzielt. PBS = PBS+Ca²⁺/Mg²⁺+Glucose. DTT 10 mM. 55 zeigt die Wirkung des DTT auf die Rluc-Emission und das BRET-Verhältnis (BRETCount). Diese Ergebnisse wurden mit den stabilen Zelllinien, die die Fusion Rluc::EYFP exprimieren (positive Kontrolle), erzielt. PBS = PBS+Ca²⁺/Mg²⁺+Glucose DTT 10 mM.
Die 54 und 55 zeigen, dass DTT das BRET-Verhältnis beeinflusst. In PBS (Ca²⁺/Mg²⁺+Glucose) allein sind die BRET-Verhältnisse niedriger als in Anwesenheit von DTT. Bei Hinzufügen von DTT steigen die Verhältnisse um fast 0,1 BRET-Einheiten. Das Verhältnis der negativen Kontrolle stieg ebenfalls. Folglich beeinflusst DTT den Energietransfer nicht (oder hat eine kleine Wirkung).
Es wurde ermittelt, dass die Untersuchungs-Temperatur eine Wirkung auf das BRET-Verhältnis hat. Diese Beobachtung ist in dem Zusammenhang wichtig, dass die meisten biologischen Prozesse, die unter Verwendung von BRET geprüft werden, bei 37 °C durchgeführt werden.
Zu einem gewissen Grad hilft DTT, die Rluc-Emission zu stabilisieren. Gute Stabilisierung tritt bei der Emission bei 100 mM DTT auf, wobei bei dieser Konzentration die Zellen zerstsört wurden, was diese Konzentration für zellbasierte Untersuchung ungeeignet werden lässt. Bei 10 mM wird festgestellt, dass DTT außerdem eine kleine Wirkung auf das BRET-Verhältnis hat und nicht nur auf den Ertrag und die Dauer der Rluc-Emission. In der Tat scheint es, dass DTT die Spektralcharakteristik der Rluc-Emission zu einem kleinen Grad ändert. Die Emission wäre bei der Emissionsabtastung rechtsverschoben.
Zeitaufgelöste Emissionsanalyse ergab, dass die Rluc-Emission 30 Minuten nach Zusatz von Coelenterazin in eine relativ stabile Phase eintrat. Diese Phase dauerte mehr als 60 Minuten an (Daten nicht gezeigt).
Deutsche Übersetzung der Figuren Figuren 1 und 2
Figur 3
Figuren 4 und 5
Figur 7
Figuren 8, 9, 11, 27
Figuren 10, 12, 14, 15
Figur 13
Figur 16
Figur 17
Figur 18
Figur 19
Figur 20
Figur 21
Figur 22
Figur 23
Figuren 24, 25, 26
Figuren 28 und 29
Figur 30
Figur 31
Figur 32
Figur 33
Figur 34
Figur 35
Figur 36
Figur 37
Figur 38
Figur 39
Figur 40
Figur 41, 44
Figur 42
Figur 43
Figuren 45, 46
Figur 47
Figuren 48 und 50
Figur 49
Figur 51
Figur 52
Figur 53
Figur 54
Figuren 55 und 56

Claims

Bioluminiszentes Resonanz-Energie-Transfersystem (BRET), das aufweist: 1) ein bioluminiszentes Protein, das Luciferaseaktivität aufweist; 2) ein Akzeptor-Fluorophor, das die Energie von dem bioluminiszenten Protein annehmen kann, wenn sie in Anwesenheit des geeigneten Substrats zusammengebracht werden; 3) einen Modulator, der die Nähe oder die Ausrichtung des bioluminiszenten Proteins und des Fluorophors in Reaktion auf Interaktion mit einem anderen Molekül beeinflusst; und 4) ein geeignetes Substrat zum Aktivieren der Luciferaseaktivität des bioluminiszenten Proteins.
System nach Anspruch 1, wobei die Luciferase und das Fluorophor an denselben Modulator angeheftet sind.
System nach Anspruch 1, wobei die Luciferase und das Fluorophor an separate Modulatoreinheiten angeheftet sind.
System nach Anspruch 1, wobei Konformationsänderung am Modulator eine Abnahme der Nähe einer Luciferase und eines Fluorophors verursacht.
System nach Anspruch 1, wobei Konformationsänderung am Modulator eine Zunahme der Nähe einer Luciferase und eines Fluorophors verursacht.
System nach Anspruch 1, wobei Konformationsänderung am Modulator eine Änderung bei der Ausrichtung einer Luciferase und eines Fluorophors verursacht.
System nach Anspruch 2, wobei das System ein Fusionsproteinkonstrukt ist, das eine Luciferase aufweist, die an den Modulator angeheftet ist, der an ein Fluorophor angeheftet ist.
System nach Anspruch 3, das aufweist: (a) ein Fusionsproteinkonstrukt, das eine Luciferase enthält, die an eine Modulatoreinheit, die ein Protein oder eine Proteindomäne ist, angeheftet ist; und (b) ein Fusionsproteinkonstrukt, das ein Fluorophor enthält, das an eine Modulatoreinheit, die ein Protein oder eine Proteindomäne ist, angeheftet ist; und wobei (c) das Protein oder die Proteindomäne in (a) zur Interaktion mit dem Protein oder der Proteindomäne in (b) fähig ist.
System nach Anspruch 3, wobei die Luciferase an ein bekanntes Protein angeheftet ist, ein Fluorophor an die Produkte einer Genbibliothek angeheftet ist und eine Assoziation zwischen einem bekannten Protein und einem Produkt der Genbibliothek durch Messen des Resonanzenergietransfers zwischen der Luciferase und dem Fluorophor ermittelt wird.
Fusionsproteinkonstrukt nach Anspruch 7, wobei das Fluorophor ein grün fluoreszierendes Protein ist, das in seiner Erregung und/oder seinen Emissionsspektren im Vergleich zu grün fluoreszierendem Protein des Wildtyps rotverschoben ist.
Fusionsproteinkonstrukt nach Anspruch 7, wobei eine Zielsequenz in die Aminosäure-Linkersequenz eingefügt ist.
Fusionsproteinkonstrukt nach Anspruch 11, wobei die Zielsequenz aus der Liste gewählt ist, die eine Proteasestelle, eine Phosphorylierungsstelle, eine Ca⁺²-Bindungsstelle, eine cAMP-Bindungsstelle, einen IP3-Bindungsstelle und eine cGMP-Bindungsstelle aufweist.
Fusionsproteinkonstrukt nach Anspruch 12, wobei das Fluorophor ein grün fluoreszierendes Protein ist, das in seiner Anregung und/oder seinen Emissionsspektren im Vergleich zu grün fluoreszierendem Protein des Wildtyps rotverschoben ist.
Fusionsproteinkonstrukt nach Anspruch 8 oder 13, wobei das Fluorophor ein grün fluoreszierendes Protein ist, das aus der Liste gewählt wird, die EYFP-Varianten, EGFP, Wildtyp-GFP, GFPS65T, YFP, Topaz enthält.
Rekombinante DNA, die das Fusionsproteinkonstrukt nach Anspruch 7 oder Anspruch 11 codiert.
Fusionsgen, das die rekombinante DNA nach Anspruch 15 aufweist.
DNA-Kassette, die einen Promotor aufweist, der mit einem oder mehr Fusionsproteingenen nach Anspruch 16 wirkungsmäßig gekoppelt ist.
Vektor, der ein Fusionsgen nach Anspruch 17 aufweist.
Wirtszelle, die durch den Vektor nach Anspruch 18 transformiert oder transfiziert ist.
Wirtszelle nach Anspruch 19, wobei die Zelle eine Human-, Säugetier-, Bakterien- oder Hefezelle ist.
Vektor nach Anspruch 18, wobei sich das Genkonstrukt unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors befindet.
Vektor nach Anspruch 21, wobei der konstitutive Promotor aus der Liste gewählt ist, die die folgenden Promotoren und deren Varianten und Derivate aufweist: CMV, SV40, RSV, EF-1a, Tk, AdML, wenn die zu transformierende oder zu transfizierende Zelle eine Säugetierzelle ist.
Vektor nach Anspruch 21, wobei der konstitutive Promotor aus der Liste gewählt ist, die die folgenden Promotoren und deren Varianten und Derivate aufweist: T7, AraBAD, trc, pL, tac und lac, wenn die zu transformierende oder zu transfizierende Zelle eine Bakterienzelle ist.
Vektor nach Anspruch 22, wobei das Fluorophor ein grün fluoreszierendes Protein ist, das in seiner Erregung und/oder seinen Emissionsspektren im Vergleich zu grün fluoreszierendem Protein des Wildtyps rotverschoben ist.
Vektor nach Anspruch 21, wobei der konstitutive Promotor aus der Liste gewählt ist, die die folgenden Promotoren und deren Varianten und Derivate aufweist: nmt1, gal1, gal10, TEF1, AOX1, GAP und ADH1, wenn die zu transformierende oder zu transfizierende Zelle eine Hefezelle ist.
Vektor nach Anspruch 24, wobei das Fluorophor ein grün fluoreszierendes Protein ist, das aus der Liste gewählt wird, die EYFP-Varianten, EGFP, Wildtyp-GFP, GFPS65T, YFP, Topaz enthält.
Virus, der ein Fusionsgen nach Anspruch 17 aufweist.
Wirtszelle, die durch den viralen Vektor nach Anspruch 27 infiziert ist.
Virus nach Anspruch 27, der aus der Liste gewählt ist, die Retrovirus, Adenovirus, Semliki und Sindbis und deren Varianten und Derivate enthält.
Wirtszelle nach Anspruch 28, wobei die Wirtszelle eine Insektenzelle ist.
Vektor nach Anspruch 21, wobei der konstitutive Promotor Baculovirus ist, wenn die zu transformierende oder zu transfizierende Zelle eine Insektenzelle ist.
Vektor nach Anspruch 18, wobei sich der Vektor unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors befindet.
Vektor nach Anspruch 21, wobei der induzierbare Promotor aus der Liste gewählt wird, die GRE, Tet-off, Tet-on, HSF, MMTV-basierten Promotor und Metallothionein enthält.
Rekombinante DNA, die eines der Fusionsproteinkonstrukte nach Anspruch 24 codiert.
Fusionsgen, das die rekombinante DNA nach Anspruch 34 codiert.
Vektor, der ein Fusionsgen nach Anspruch 35 aufweist.
Wirtszelle, die durch einen Vektor nach Anspruch 35 transformiert oder transfiziert ist.
Wirtszelle nach Anspruch 37, wobei die Zelle eine Human-, Säugetier-, Bakterien- oder Hefezelle ist.
Verwendung des Systems nach Anspruch 1 zum Second-Messenger-Screening.
Verwendung des Systems nach Anspruch 1, wobei der Second Messenger aus der Liste gewählt ist, die cAMP, cGMP, Ca²⁺, IP3, NO, DAG, Ceramid und Derivate davon und Arachidonsäure und Derivate davon enthält.
Verwendung des Systems nach Anspruch 1 zum Analyt-Screening.
Verwendung des Systems nach Anspruch 41, wobei der Analyt aus der Liste gewählt ist, die K⁺, H⁺, Ca²⁺, CO₂, Na⁺, Cl^–, Mg²⁺, O₂, HCO₂, NO und ATP umfasst.
Verwendung des Systems nach Anspruch 41 zur Wirkstoffentdeckung.
Verwendung des Systems nach Anspruch 41 zum Wirkstoffscreening.
Verwendung des Systems nach Anspruch 1 zum Nachweisen von Änderungen bei Protein-Protein-Interaktion.
Verwendung des Systems nach Anspruch 1 in der funktionellen Genomforschung zum Bestimmen der zellulären Funktion eines Gens durch Bestimmen seines Bindungspartners.
Verwendung des Systems nach Anspruch 1 in der Toxikologie zum Messen der Anwesenheit und Konzentration toxischer Verbindungen.
Verwendung des Systems nach Anspruch 1 bei Gentoxizität zum Messen der Wirkung einer toxischen Verbindung auf die Genomstabilität.
Verwendung des Systems nach Anspruch 1 für In-vitro-Assays.