DE60319817T2 - Genetisch-enkodierte Bioindikatoren von Kalziumionen - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Verwendung von genetisch kodierten fluoreszierenden Indikatoren zum Sichtbarmachen von zellulären Calciumspiegeln verspricht viele Vorteile gegenüber fluoreszierenden Ca-anzeigenden Farbstoffen, die extern angewendet werden müssen. Genetisch kodierte Indikatoren werden nach der Transfektion in situ im Inneren von Zellen erzeugt, brauchen keine Cofaktoren, können theoretisch spezifisch an Zellorganellen und zelluläre Mikroumgebungen zielgerichtet werden, und entweichen nicht aus Zellen während längerer Aufnahmesitzungen. Weiterhin sollten sie innerhalb intakter Gewebe transgener Organismen exprimierbar sein, und sollten damit das Problem lösen, einen Indikatorfarbstoff in Gewebe zu laden, während es ermöglicht wird, spezifische Untergruppen von interessierenden Zellen zu markieren (für einen Übersichtsartikel siehe Zhang J., et al. "Creating new fluorescent grobes for cell biology." Nat. Rev. Mol. Biol. 3, 906-918 (2002)).
  • Zwei Klassen von auf GFP basierenden Calciumindikatoren wurden bisher beschrieben: Erstens, ratiometrische Indikatoren, die „Cameleons" genannt werden, welche aus einem Paar fluoreszierender Proteine bestehen, die für Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FREI) gestaltet wurden, welche das Calcium bindende Protein Calmodulin sowie ein Calmodulin-Zielpeptid tragen, das zwischen die GFPs eingeschoben ist (siehe z. B. Miyawaki, A. et al. "Fluorescent indicators for Ca2+ based an green fluorescent Proteins and calmodulin." Nature 388, 882-887 (1997); Miyawaki, A. et al. "Dynamic and quantitative calcium measurements using improved cameleons." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 2135-2140 (1999) und Truong et al. "FRET-based in vivo Ca2+ imaging by a new calmodulin-GFP fusion molecule." Nat. Struct. Biol. 8, 1069-1073 (2001)). Zweitens, verschiedene nicht-ratiometrische Indikatoren, bei denen Calmodulin direkt in ein einzelnes fluoreszierendes Protein insertiert ist (siehe Baird, G. S. et al. "Circular Permutation and receptor insertion within green fluorescent Proteins." Proc. Natl. Acad. USA 96, 11241-11246 (1999); Nagai, T. et al. "Circularly permuted green fluorescent Proteins engineered to sense Ca2+." Proc. Natl. Acad Sci. USA 98, 3197-3202 (2001); Nakai, J. et al. "A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent Protein." Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001); und Griesbeck, O. et al. "Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent Protein: mechanism and applications." J. Biol. Chem. 276, 29188-29194 (2001)).
  • Jedoch zeigen auf Calmodulin basierende Indikatoren Mängel bei bestimmten Anwendungen, z. B. zeigen sie nur einen verminderten dynamischen Bereich in transgenen Invertebraten verglichen mit in vitro-Daten der gereinigten Indikatorproteine und akuten Transfektionen (siehe Reiff, D. F. et al. "Differential regulation of active zone density during longterm strengthening of Drosophila neuromuscular junctions." J. Neurosci. 22, 9399-9409; Kerr R. et al. "Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans." Neuron 26, 583-594; und Fiala et al. "Genetically expressed cameleon in Drosophila melanogaster is used to visualize olfactory information in projection neurons." Curr. Biol. 12, 1877-1884 (2002)).
  • Weiterhin schaffen sie es nicht, Calciumantworten zu zeigen, wenn sie an bestimmte Stellen innerhalb von Zellen zielgerichtet werden. Keine verwendbare transgene Expression wurde bisher in Säugern berichtet. Calmodulin ist ein ubiquitäres Signalprotein im Zellstoffwechsel, und damit unter strenger Regulierung, die eine Fülle von Calmodulin bindenden Proteinen miteinbezieht (für einen Übersichtsartikel siehe Jurado, L. A. et al. "Apocalmodulin." Physiol. Rev. 79, 661-682 (1999)). Es aktiviert zahlreiche Kinasen und Phosphatasen, moduliert Ionenkanäle (Saimi, Y. & Kung, C. "Calmodulin as an ion channel subunit." Ann. Rev. Physiol. 64, 289-311 (2002) und wird selbst umfangreich durch vielfache Protein-Serin/Threoninkinasen und Protein-Tyrosinkinasen phosphoryliert (Benaim, G. & Villalobo, A. "Phosphorylation of calmodulin." Eur. J. Biochem. 269, 3619-3725 (2002).
  • Die derzeitigen Erfinder haben daher Wege erforscht, neue Arten von Calciumsonden mit spezialisierteren Calcium bindenden Proteinen zu konstruieren, die minimal durch das zelluläre regulatorische Proteinnetzwerk beeinflusst werden.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Troponin C (TnC oder TNC) ist ein hantelförmiges Calcium bindendes Protein mit zwei globulären Domänen, die durch einen zentralen Linker verbunden sind. Es wurde gefunden, dass neue Arten von Calciumsonden, die auf Troponin C basieren, für dynamische bildgebende Verfahren innerhalb lebender Zellen gegenüber vorbekannten genetischen Calciumsensoren überlegen sind. Insbesondere funktionieren die Calciumsensoren, die auf Troponin C basieren, in subzellulären Umgebungen, in denen vorbekannte Calciumsensoren nur ein mangelhaftes Verhalten zeigten, z. B. wenn sie an eine Zellmembran gebunden wurden. Darüber hinaus können die neuen, auf Troponin C basierenden Calciumsensoren in einer Vielzahl von Zelltypen und sogar in transgenen Tieren verwendet werden, was ein weiterer Vorteil verglichen mit vorbekannten Calciumsensoren ist. Darüber hinaus beeinträchtigen die erfindungsgemäßen, auf Troponin C basierenden Calciumsensoren nicht die intrazelluläre Ca-Signalwirkung, insbesondere beeinträchtigen sie nicht den wichtigen Calmodulinweg. Die auf Troponin C basierenden Calciumsensoren zeigen kein Zeichen von unvorteilhafter Aggregation und besitzen den weiteren Vorteil, dass sie nicht in einer unvorteilhaften Weise mit cytosolischen Bestandteilen Wechselwirken.
  • Diese Erfindung betrifft daher veränderte Polypeptide umfassend drei funktionelle Bestandteile: ein erstes Chromophor eines Donor-Akzeptor-Paares zum FREI, ein Calcium bindendes Polypeptid mit einer Identität von mindestens 80% zu einer 30 Aminosäuren langen Polypeptidsequenz von menschlichem Troponin C oder Skelettmuskel-Troponin C aus Huhn, und ein zweites Chromophor eines Donor-Akzeptor-Paares zum FREI. Solche veränderten Calcium bindenden Polypeptide wirken als überlegene intrazelluläre Calciumsensoren, weil auf die Calciumbindung hin das Calcium bindende Polypeptid seine Konformation ändert, was zu einer räumlichen Umverteilung der zwei Chromophoren des erfindungsgemäßen Polypeptids führt. Diese räumliche Umverteilung kann dann durch eine Veränderung der Fluoreszenzeigenschaften des gesamten Polypeptids nachgewiesen werden. Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Fusionspolypeptid kodiert, wo sowohl das erste Chromophor als auch das zweite Chromophor des Donor-Akzeptor-Paares zum FREI des veränderten erfindungsgemäßen Calcium bindenden Polypeptids selbst Polypeptide sind. Die Funktionalität der vorstehend erwähnten veränderten Polypeptide und Fusionsproteine kann leicht durch Testen des jeweiligen Moleküls auf seine Fähigkeit zum Calciumbinden bestimmt werden, wie nachstehend weiter beschrieben. Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft rekombinante Expressionsvektoren und Wirtszellen umfassend die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle. In noch einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Veränderungen in lokalen Calciumkonzentrationen bereit. In noch einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen des Bindens einer kleinen chemischen Substanz oder eines Polypeptids an ein Calcium bindendes Polypeptid mit einer Homologie von mindestens 80% über einen Abschnitt von 30 Aminosäuren zu menschlichem Troponin C oder Skelettmuskel-Troponin C aus Huhn bereit. Die veränderten erfindungsgemäßen Polypeptide sind nützlich zum Nachweis von lokalen Calciumkonzentrationen, insbesondere lokalen Calciumkonzentrationsänderungen, die nahe einer Zellmembran auftreten.
  • DEFINITIONEN
  • Ein „Polypeptid", wie hierin verwendet, ist ein Molekül, welches mehr als 30, und insbesondere mehr als 35, 40, 45 oder sogar mehr als 50 Aminosäuren umfasst, aber weniger als 10.000, insbesondere weniger als 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000 oder 2000, am meisten bevorzugt weniger als 1500 Aminosäuren. Polypeptide sind gewöhnlich lineare Aminosäurepolymere, wobei die einzelnen Aminosäuren untereinander über Peptidbindungen verknüpft sind. Es sind auch Polypeptide eingeschlossen, welche eine geringe Prozentzahl, z. B. weniger als 5%, 3% oder sogar nur bis 1% veränderte oder nicht natürliche Aminosäuren enthalten. Polypeptide können weiterhin durch chemische Modifikation verändert werden, z. B. durch Phosphorylierung von Serin-, Threonin- oder Tyrosinresten, oder durch Glycosylierung, z. B. von Asparaginen oder Serinresten.
  • „Peptid", wie hierin verwendet, ist ein Molekül, das weniger als 30 Aminosäuren, aber bevorzugt mehr als 4, 5, 6, 7, 8 oder sogar mehr als 9 Aminosäuren umfasst.
  • Ein „verändertes Polypeptid" ist ein Polypeptid, das als solches nicht vom Genom einer natürlicherweise vorkommenden Art kodiert wird, insbesondere ein Polypeptid, das nicht identisch mit einem der Polypeptide der Genbank-Datenbank am 28. Juli 2003 ist, wobei eine natürlicherweise vorkommende Art als seine Quelle angegeben ist. Das bedeutet, dass ein „verändertes" Polypeptid nicht als solches in der Natur vorkommt, aber es kann, und wurde insbesondere, durch Labor-Manipulationen hergestellt, wie Techniken zum gentechnischen Verändern oder dem chemischen Verbinden von anderen Molekülen zu einem Polypeptid. Beispiele für veränderte Polypeptide sind mutierte Polypeptide, insbesondere Deletionen, Trunkierungen, mehrfache Substitutionen und Fusionspolypeptide, die in einer Phase durch gentechnische Techniken hergestellt wurden.
  • Ein Polypeptid ist ein ein bindendes Polypeptid", wenn es einen Kd für Ca2+ von weniger als 800 μM, bevorzugt weniger als 600 μM und am meisten bevorzugt von 50 nM bis 400 μM besitzt. Ein Verfahren zum Bestimmen des Kd wird nachstehend beschrieben werden.
  • Ein Polypeptid besitzt „mindestens X% Identität zu" menschlichem Troponin C, SEQ ID NR. 20 oder 24, oder Skelettmuskel-Troponin C aus Huhn, SEQ ID NR. 26, wenn, wenn ein Abschnitt von 30 Aminosäuren seiner Polypeptidsequenz mit der am besten übereinstimmenden Sequenz von menschlichem Troponin C oder Skelettmuskel-Troponin C aus Huhn in einem Alignment angeordnet wird, die Aminosäuresequenz zwischen diesen zwei durch Alignment angeordneten Sequenzen X% ist. X kann 80 oder mehr sein. Zum Beispiel stellen die entsprechenden Polypeptidsequenzen in Troponin-C-Molekülen von anderen Metazoen-Arten, bevorzugt anderen Chordatierarten, und am meisten bevorzugt anderen Säugerarten, eine Quelle für solche hoch homologe Polypeptide bereit, welche als Ersatz in den veränderten erfindungsgemäßen Polypeptiden für die entsprechenden Sequenzen von menschlichem Troponin C oder Skelettmuskel-Troponin-C aus Huhn dienen können. Bevorzugt ist X 85 oder mehr, weiter bevorzugt 90 oder mehr, oder am meisten bevorzugt 95 oder mehr. Es soll verstanden werden, dass der Fall von Sequenzidentität, das bedeutet 100% Identität, eingeschlossen ist.
  • Bevorzugt ist die Natur der Aminosäurerestveränderung, durch welche das Polypeptid mit mindestens X% Identität zu einer der Referenzsequenzen sich von der Referenzsequenz unterscheidet, ein semikonservativer und weiter bevorzugt ein konservativer Austausch eines Aminosäurerests.
    Aminosäure Konservative Substitution Semikonservative Substitution
    A G; S; T N; V; C
    C A; V; L M; I; F; G
    D E; N; Q A; S; T; K; R; H
    E D; Q; N A; S; T; K; R; H
    F W; Y; L; M; H I; V; A
    G A S; N; T; D; E; N; Q;
    H Y; F; K; R L; M; A
    I V; L; M; A F; Y; W; G
    K R; H D; E; N; Q; S; T; A
    L M; I; V; A F; Y; W; H; C
    M L; I; V; A F; Y; W; C;
    N Q D; E; S; T; A; G; K; R
    P V; I L; A; M; W; Y; S; T; C; F
    Q N D; E; A; S; T; L; M; K; R
    R K; H N; Q; S; T; D; E; A
    S A; T; G; N D; E; R; K
    T A; S; G; N; V D; E; R; K; I
    V A; L; I M; T; C; N
    W F; Y; H L; M; I; V; C
    Y F; W; H L; M; I; V; C
  • Ein Ändern von A, F, H, I, L, M, P, V, W oder Y zu C ist semikonservativ, wenn das neue Cystein als freies Thiol verbleibt. Ein Ändern von M zu E, R oder K ist semikonservativ, wenn die ionische Spitze der neuen Seitengruppe die Proteinoberfläche erreichen kann, während die Methylengruppen hydrophobe Kontakte machen. Ein Ändern von P zu einem von K, R, E oder D ist semikonservativ, wenn die Seitengruppe auf der Oberfläche des Proteins ist. Weiterhin wird der Fachmann verstehen, dass Glycine an sterisch anspruchsvollen Positionen nicht substituiert werden sollten, und dass P nicht in Teile des Proteins eingeführt werden sollte, welche eine alpha-helikale oder eine beta-Faltblatt-Struktur besitzen. Bevorzugt umfasst der vorstehend erwähnte 30 Aminosäuren-Abschnitt eine Region mit der vorstehend erwähnten Sequenzidentität zu Polypeptidsequenzen entsprechend den Aminosäuren 3 bis 28, Aminosäuren 28 bis 40, 65 bis 76, 105 bis 116, oder 141 bis 152 von hTNNC1, welche Regionen Schleifen mit Ca-Bindungsfähigkeiten enthalten.
  • Wie hierin verwendet, betrifft „FREI" das Phänomen, das als „Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer" bekannt ist. Das Prinzip des FREI wurde z. B. in R. Lakowicz, "Principles of Fluorescence Spectroscopy", 2. Ausgabe, Plenum Press, New York, 1999 beschrieben. Kurz gesagt kann FREI auftreten, wenn das Emissionsspektrum eines ersten Chromophors (Donor-Chromophor oder FREI-Donor) mit dem Absorptionsspektrum eines zweiten Chromophors (Akzeptor-Chromophor oder FREI-Akzeptor) überlappt, so dass die Anregung durch Licht geringerer Wellenlänge des Donor-Chromophors vom Transfer eines Teils der Anregungsenergie auf das Akzeptor-Chromophor gefolgt wird. Eine Voraussetzung für dieses Phänomen ist die sehr dichte Nähe beider Chromphoren. Ein Ergebnis des FREI ist der Abfall/Verlust von Emission durch das Donor-Chromophor, während zur selben Zeit eine Emission durch das Akzeptor-Chromophor beobachtet wird. Ein Paar von zwei Chromophoren, die in der vorstehend beschriebenen Weise Wechselwirken können, wird ein „Donor-Akzeptor-Paar" zum FREI genannt.
  • Ein „Chromophor", wie hierin verwendet, ist der Teil eines Moleküls, der für seine Licht absorbierenden und Licht emittierenden Eigenschaften verantwortlich ist. Ein Chromophor kann eine unabhängige chemische Einheit sein. Chromophore können niedermolekulare Substanzen sein, z. B. die Indocyanin-Chromophore CY3, CY3.5, Cy5, Cy7 (erhältlich von Amersham International plc, GB), Fluorescein und Cumarin (z. B. von Molecular Probes). Aber Chromophore können auch fluoreszierende Proteine sein, wie P4-3, EGFP, S65T, BFP, CFP, YFP, um nur einige wenige zu nennen. Letztere sind auch in einer Vielzahl von Formen im Handel erhältlich, z. B. im Zusammenhang mit Expressionskonstrukten. „Menschliches Troponin C" (hTnC oder hTNC) erscheint in zwei Formen: Troponin C aus dem Skelettmuskel, welches ein 160 Aminosäuren langes Polypeptid mit der Swissprot-Zugangsnummer P02585 ist, und Troponin C aus Herzmuskel, welches ein 161 Aminosäuren langes Polypeptid mit der Swissprot-Zugangsnummer P02590 ist. Troponin C aus Huhn erscheint auch in zwei Formen, eine Form aus Herzmuskel und eine Form aus Skelettmuskel. Troponin C aus dem Skelettmuskel von Huhn wird hierin auch manchmal verwendet, und ist ein 163 Aminosäuren langes Polypeptid mit der Swissprot-Zugangsnummer P02588, und wird hierin manchmal als „cs-Troponin C" oder „csTnC" bezeichnet. Troponin C aus dem Skelettmuskel von Huhn ist wie in SEQ ID NR. 30 definiert. Wie hierin verwendet, wird das menschliche Troponin C aus Herzmuskel manchmal „hTNNC1" oder „hcardTnC" genannt, während menschliches Troponin C aus dem Skelettmuskel manchmal „hTNNC2" oder „hsTnC" genannt wird. Die Struktur von hTNNC1 ist wie folgt: Eine helikale Region, die sich von Aminosäure 3 bis Aminosäure 11 erstreckt, wird von einer zweiten helikalen Region von Aminosäure 14 bis Aminosäure 28 gefolgt. Die Region von Aminosäure 28 bis Aminosäure 40 ist eine urtümliche Calciumstelle, welche in ihrer gegenwärtigen Form keine Calciumionen mehr bindet. Die drei Calcium bindenden Regionen in hTNNC1 sind die EF-Hand-Schleife 2, die sich von Aminosäure 65 bis Aminosäure 76 erstreckt, EF-Hand-Schleife 3 von Aminosäure 105 bis Ami nosäure 116, und EF-Hand-Schleife 4, die sich von Aminosäure 141 bis Aminosäure 152 erstreckt.
  • Den zwei leistungsfähigsten Indikatorkonstrukten, die auf Troponin-C-Varianten basieren, wurden die Namen TN-humTnC für einen Indikator, der das menschliche Herz-Troponin C (hcardTnC, SEQ ID NR. 3 und 4) als Calcium bindenden Teil verwendet, und TN-L15 für einen Indikator, der eine trunkierte Version (Aminosäuren 15–163) des Skelettmuskel-Troponin C aus Huhn (csTnC, SEQ ID NR. 1 und 2) als Calcium bindenden Teil verwendet, gegeben.
  • EF-Hände sind eine Art von Calcium bindender Domäne, die vielen Calcium bindenden Proteinen gemein ist. Diese Art von Domäne besteht aus einer Schleife aus 12 Resten, flankiert an beiden Seiten durch eine alpha-helikale Domäne von 12 Resten. In einer EF-Hand ist das Calciumion in einer pentagonal-bipyramidalen Konfiguration koordiniert. Die 6 Reste, die in der Calciumbindung einbezogen sind, sind in den Positionen 1, 3, 5, 7, 9 und 12 der Schleife von 12 Resten. Die unveränderlichen Glu- oder Asp-Reste an Position 12 stellen zwei Sauerstoffe für die Ligandenbindung von Ca2+-Ionen bereit, und arbeiten als ein zweizähniger Ligand in der Koordination von Ca2+.
  • Wie hierin verwendet, umfasst ein „glycinreicher Linker" eine Peptidsequenz mit zwei oder mehr Glycinresten oder eine Peptidsequenz mit alternierenden Glycin- und Serinresten, insbesondere die Aminosäuresequenzen Gly-Gly, Gly-Ser-Gly, und Gly-Gly-Ser-Gly-Gly. Was glycinreiche Linker betrifft, wird Bezug genommen auf Witchlow M. et al., "An improved linker for single-chain Fv with reduced aggregation and enhanced proteolytic stability", (1993) Prof. Engineering, 6: 989-995.
  • Wie hierin verwendet, ist ein „Lokalisationssignal" ein Signal, insbesondere ein Peptidsignal, welches zur Kompartimentierung des Polypeptids, welches es trägt, zu einem bestimmten Teil der Zelle führt, z. B. einer Organelle oder einer bestimmten topographischen Lokalisierung wie die innere oder äußere Seite der Zellmembran. Solch ein Lokalisationssignal kann ein Kern-Lokalisationssignal sein, ein Kern-Exportsignal, ein Signal, das zum Zielrichten an das endoplasmatische Retikulum, das Mitochondrium, den Golgi, das Peroxisom, die Zellmembran führt, oder sogar zum Lokalisieren an Unteranteile davon, wie prä- und/oder post-synaptische Strukturen.
  • Eine „Verhältnisänderung" (ratio change), wie hierin verwendet, wird durch die folgende Formel definiert
    Figure 00090001
  • Um die Verhältnisänderung in % eines veränderten erfindungsgemäßen Polypeptids zu erhalten, werden die Fluoreszenz-Emissionsintensitäten des FREI-Donors und des FRET-Akzeptors bei ihren jeweiligen Emissionsmaxima unter geeigneten Bedingungen gemessen. Zuerst werden die Werte in einer calciumfreien Pufferlösung bestimmt. Zum Beispiel enthält die calciumfreie Pufferlösung ein Aliquot des veränderten erfindungsgemäßen Polypeptids, das getestet werden soll, in 10 mM MOPS pH 7,5, 100 mM KCl und 20 μM EGTA. Nach der ersten Messung wird eine Lösung von 1 M CaCl2 zur Mischung auf eine Endkonzentration von 10 mM CaCl2 zugefügt. Dann werden wiederum die jeweiligen Emissionsmaxima des FREI-Donors und des FREI-Akzeptors gemessen. Die Konzentration des veränderten erfindungsgemäßen Polypeptids, das auf diese Weise getestet werden soll, sollte so sein, dass die Änderung des FREI leicht nachgewiesen wird. Als Richtlinie bewegen sich geeignete Konzentrationen im Bereich von 500 nM bis 5 μM. Es wird Bezug genommen auf Miyawaki, A. et al., "Fluorescent indicators for Ca2+ based an green fluorescent Proteins and calmodulin." (1997) Nature 388: 882-887.
  • Kd-Werte der Calcium bindenden Polypeptide für Ca2+-Ionen können wie folgt bestimmt werden. Fusionspolypeptide von CFP mit dem Calcium bindenden Polypeptid, gefolgt durch Citrine, werden durch im Stand der Technik gut bekannte Verfahren exprimiert, z. B. durch Befolgen der Verfahrensweise von Beispiel 2. Die Fusionspolypeptide werden gemäß der Verfahrensweise von Beispiel 2 gereinigt, und in 300 mM NaCl, 20 mM NaPO4-Puffer pH 7,4 gelagert. Kd-Werte werden dann durch Titrationsassays bestimmt, in denen die Proteine definierten Calciumkonzentrationen in einem wässrigen Puffer ausgesetzt werden. Um solche definierten Calciumkonzentrationen herzustellen, wird ein Puffersystem verwendet, das Ca2+ und seinen Chelator K2 EGTA enthält. Aliquots des Proteins wer den mit verschiedenen Verhältnissen von zwei Pufferlösungen gemischt, die entweder 10 mM K2 EGTA, 100 mM KCl und 30 mM MOPS pH 7,2 oder 10 mM Ca EGTA, 100 mM KCl und 30 mM MOPS pH 7,2 enthalten. Die Fluoreszenz-Emissions-Intensitäten des FREI-Donors und des FREI-Akzeptors werden dann bei verschiedenen Konzentrationen an freiem Calcium aufgenommen. Calcium-Kd-Werte können durch Auftragen des Verhältnisses der Emissionsmaximum-Wellenlänge des Donor- und Akzeptorproteins gegen die Konzentration an freiem Calcium auf einer doppelt logarithmischen Skala berechnet werden. Damit ergibt ein Auftragen von log[Ca2+]frei auf der x-Achse gegen log
    Figure 00100001
    auf der y-Achse einen x-Achsen-Schnittpunkt, der der log des Kd des Proteins in Mol/Liter ist.
  • In der vorstehenden Formel ist R die Fluoreszenzintensität des Emissionsmaximums bei niederer Wellenlänge (527 nm für YFP/Citrine), geteilt durch die Fluoreszenzintensität des Emissionsmaximums bei kürzerer Wellenlänge (432 nm für CFP) bei den verschiedenen getesteten Calciumkonzentrationen. Rmin ist das Verhältnis R in einer calciumfreien Probe, d. h. nur in Puffer 1. Rmax ist das Verhältnis R in Gegenwart der höchsten gewählten Calciumkonzentration, z. B. bei 1 mM Ca2+, wenn das Verhältnis von Puffer 1 zu Puffer 2 1:1 ist. F527min ist die Fluoreszenzintensität des Emissionsmaximums bei geringer Wellenlänge (527 nm für Citrine) in einer calciumfreien Probe. F527max ist die Fluoreszenzintensität des Emissionsmaximums bei längerer Wellenlänge (527 nm für Citrine) in Gegenwart der höchsten gewählten Calciumkonzentration. Weitere Details zum Messverfahren werden in POZZAN T und TSIEN RY (1989) Methods Enzymol., 172: 230-244 offenbart.
  • Die „lokale Ca2 +-Konzentration", wie hierin verwendet, ist eine Veränderung in der Calciumkonzentration, insbesondere ein Anstieg, welche sich entweder auf durch eine Membran verbundene zelluläre Organellen oder auf zelluläre Strukturen beschränkt, die Calcium relativ unabhängig vom Rest des Cytosols handhaben können, wie dendritische Spines oder Schäfte oder präsynpatische Boutons. Mit „lokal" meinen wir auch Veränderungen in der freien Calciumkonzentration, die auf submikroskopische Mikroumgebungen im Cytosol nahe einer Zellmembran beschränkt sind. Mit „submikroskopisch" meinen wir Flächen mit einem Ausmaß kleiner als 350 nm.
  • Wie hierin verwendet, ist der Begriff „Hervorrufen einer Veränderung in der lokalen Calciumkonzentration" jede beliebige experimentelle Anordnung, die zu einer zeitlichen oder räumlichen Veränderung der Calciumverteilung innerhalb einer Zelle führt. Im Fall von Studien in Zelllinien können Zelloberflächenrezeptoren, die an die Herstellung eines intrazellulären Botenstoffs wie IP3 gekoppelt sind, zu einem Anstieg an cytosolischem oder mitochondrialem Calcium in der Zelle führen, wenn sie aktiviert werden. Ein Beispiel solcher Oberflächenrezeptoren sind Mitglieder der Familie von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, einschließlich olfaktorischer und Geschmacksrezeptoren, weiterhin Rezeptor-Tyrosinkinasen, Chemokinrezeptoren, T-Zell-Rezeptoren, metabotrope Aminosäurerezeptoren wie metabotrope Glutamatrezeptoren oder GABAb-Rezeptoren, GPI-verknüpfte Rezeptoren der TGF-beta/GDNF-(Glia-abgeleiteter neurotrophischer Faktor)-Rezeptorfamilie. Andere Rezeptoren können auch direkt den Calciumeinfluss in Zellen regulieren, wie NMDA-Rezeptoren oder calciumdurchlässige AMPA-Rezeptoren. Im Fall von Studien mit Indikatororganismen wie transgene C-elegans oder Drosophila, kann die Verabreichung eines geeigneten Reizes an den Organismus zu einer solchen Calciumumverteilung in bestimmten Zellen führen, was dann eine beobachtbare Anzeige ergibt. Dies kann z. B. die Verabreichung eines Wirkstoffs an den Organismus sein, aber auch ein Reiz mit einer geeigneten Ausführungsart wie einer von visueller, akustischer, mechanischer, nocizeptiver oder hormoneller Natur. Der Reiz kann z. B. Kälteschock, mechanischer Stress, osmotischer Schock, oxidativer Stress, Parasiten oder auch Veränderungen in der Nährstoffzusammensetzung im Fall von transgenen Pflanzen sein.
  • Eine „kleine chemische Substanz", wie hierin verwendet, ist ein Molekül mit einem Molekulargewicht von 30 D–5 kD, bevorzugt von 100 D–2 kD. Ein „kleines organisches chemisches Molekül", wie hierin verwendet, umfasst weiterhin mindestens ein Kohlenstoffatom, ein Wasserstoffatom und ein Sauerstoffatom. Solche kleinen chemischen Verbindungen können z. B. durch Verwenden von erhältlichen kombinatorischen Bibliotheken bereitgestellt werden.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass das Calcium bindende Protein Troponin C die Basis für besonders starke Calciumsensoren bilden kann. Das veränderte erfindungsgemäße Polypeptid erlaubt die Messung von Calciumfluktuationen in zellulären Mikroumgebungen, wo Calciumsensoren des Standes der Technik wie die auf Calmodulin basierenden „Cameleons" versagt haben oder nur eine schlechte Leistung gezeigt haben. Weiterhin zeigen die auf Troponin C basierenden erfindungsgemäßen Calciumsensoren eine minimale Beeinflussung der intrazellulären Signalwege, die auf Calcium basieren, und sind daher im Gegensatz zu vorbekannten „Cameleons" sogar für die Verwendung in transgenen Vertebraten und sogar Säugern geeignet.
  • Damit betrifft die vorliegende Erfindung ein verändertes Calcium (Ca2+) bindendes Polypeptid umfassend (a) ein erstes Chromophor eines Donor-akzeptierbaren Paares zum FREI, (b) ein Calcium bindendes Polypeptid mit einer Identität von mindestens 80%, bevorzugt 85%, weiter bevorzugt 90%, noch weiter bevorzugt 95%, und am meisten bevorzugt mit 100% Identität zu einer 30 Aminosäuren langen Polypeptidsequenz von menschlichem Troponin C oder Skelettmuskel-Troponin C aus Huhn, und (c) ein zweites Chromophor eines Donor-akzeptierbaren Paares zum FREI, weiter bevorzugt wobei der Abschnitt des Calcium bindenden Polypeptids mit diesem hohen Grad an Identität zum menschlichen Troponin C oder Skelettmuskel-Troponin C aus Huhn eine 35 Aminosäuren, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 oder sogar 75 Aminosäuren lange Polypeptidsequenz ist. Diese Polypeptide besitzen die Fähigkeit, Ca2+-Ionen zu binden, was eine Konformationsänderung induziert. Diese Funktionalität kann leicht wie vorstehend beschrieben bestimmt werden. Geeignete Chromophore sind sowohl kleine fluoreszierende Moleküle wie z. B. die Indocyaninfarbstoffe Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy7, Cumarin, Fluorescein oder Rhodamin, aber auch fluoreszierende Polypeptide wie bestimmte Derivate von GFP, dem „grünen fluoreszierenden Protein", insbesondere Mutanten von GFP mit erhöhter Stabilität oder veränderten spektralen Eigenschaften wie EGFP, CFP, BFP oder YFP. Andere geeignete fluoreszierende Polypeptide sind cFP 484 aus Clavularia und zFP 538, das gelbe fluoreszierende Protein aus Zoanthus. Wie vorstehend erklärt, müssen das Donor-Chromophor und das Akzeptor-Chromophor eines Donor-Akzeptor-Paares zum FREI im Hinblick auf ihre spektralen Eigenschaften gewählt werden. Als eine allgemeine Regel hat das Donor-Chromophor ein Absorptionsmaximum bei niederer Wellenlänge, d. h. es absorbiert Strahlung höherer Energie als ein Akzeptor-Chromophor. Aus diesem Grund können CFP, EGFP und YFP (Citrine), alle abgeleitet aus Aequoria victoria, DsFP 483 aus Discosoma striata, cFP 484 aus Clavularia sp., AmCyan aus Anemonia majano, Azami-Green aus Galaxeidae sp. und As499 aus Anemonia sulcata gewöhnlich als Donor-Chromophore verwendet werden (siehe Tsien R. Y. "The green fluorescent Protein". Ann. Rev. Biochem. 67: 509-544 (1998); Matz M. V. et al. "Fluorescent Proteins from nonbioluminescent Anthozoa species." Nat. Biotechnol. 17: 969-973 (1999); Wiedenmann J. et al. "Cracks in the β-can: Fluorescent Proteins from Anemonia Sulcata (Anthozoa, Actinaria)" Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 14091-14096 (2000); Labas Y. A. et al. "Diversity and evolution of the green fluo rescent Protein family". Proc. Natl. Acad Sci. 99: 4256-4261 (2002). Karasawa S. et al. "A green emitting fluorescent Protein from Galaxeidae coral and its monomeric version for use in fluorescent labelling. J. Biol. Chem. [elektronische Publikation vor dem Druck] (2003)). Beispiele für gewöhnlich verwendete Akzeptor-Chromophore sind YFP (Citrine), DsRed aus Discosoma sp., zFP 538 aus Zoanthus sp., HcRed aus Heteractis crispa, EqFP 611 aus Entacmaea quadricolor und AsFP 595 aus Anemonia sulcata (siehe Matz M. V. et al. "Fluorescent Proteins from nonbioluminescent Anthozoa species." Nat. Biotechnol. 17: 969-973 (1999); Wiedenmann J. et al. "Cracks in the β-can: Fluorescent Proteins from Anemonia Sulcata (Anthozoa, Actinaria)" Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 14091-14096 (2000);. Gurskaya N. G. et al. "GFP-like chromoproteins as source of far-red fluorescent Proteins" FERS lett. 507: 16-20 (2001); Wiedenmann J. et al. A far red fluorescent Protein with fast maturation and reduced oligomerization tendency from Entacmaea quadricolor (Anthozoa, Actinaria)" Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 11646-11651 (2002)). Das Beispiel von YFP macht klar, dass abhängig von seinem Partner in einem Donor-Akzeptor-Paar zum FREI, ein jeweiliges Chromophor entweder als ein Donor oder als ein Akzeptor dienen kann. Zum Beispiel kann YFP als ein Akzeptor-Chromophor dienen, wenn es in Kombination mit BFP, CFP, cFP 484, AmCyan oder DsFP483 ist, und es kann als ein Donor-Chromophor funktionieren, wenn es in Kombination mit DsRed, EqFP 611 oder HcRed ist. Durch Analysieren der spektralen Eigenschaften zweier Chromophore kann ein Fachmann geeignete Donor-Akzeptor-Paare zum FREI identifizieren.
  • Die drei Bestandteile des erfindungsgemäßen veränderten Calcium bindenden Polypeptids sind durch kovalente Bindungen verknüpft. Diese kovalenten Bindungen zwischen den Bestandteilen (a) und (b) und den Bestandteilen (b) und (c) können durch chemische Vernetzung bewirkt werden. Das bedeutet, dass die drei Bestandteile anfänglich unabhängig voneinander sein können, und dass sie dann chemisch vernetzt werden können, z. B. durch einen Spacer, der ausgewählt werden kann aus der Gruppe bestehend aus bifunktionellen Crosslinkern, flexiblen Aminosäurelinkern, wie die Scharnierregion von Immunglobulinen, und homo- und heterobifunktionellen Crosslinkern. Bevorzugte Linker für die vorliegende Erfindung sind heterobifunktionelle Crosslinker, z. B. SMPH (Pierce), sulfo-MBS, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMPB, sulfo-SMCC, SVSB, SIA und andere erhältliche Crosslinker, zum Beispiel von der Pierce Chemical Company (Rockford, IL, USA). Solch ein bevorzugter chemischer Crosslinker hat eine funktionelle Gruppe, die gegenüber Aminogruppen reaktiv ist, und eine funktionelle Gruppe, die gegenüber Cystinresten reaktiv ist. Die vorstehend erwähnten Crosslinker führen zu einer Bildung von Thi oetherbindungen, aber andere Klassen von Crosslinkern, die in der Ausführung der Erfindung geeignet sind, sind gekennzeichnet durch das Einführen einer Disulfidbrücke zwischen den Polypeptiden von (b) und dem Bestandteil (a) und/oder zwischen dem Polypeptid von (b) und dem Bestandteil von (c). Es ist ersichtlich, dass aktivierte Konjugate von kleinen chemischen Fluorophoren wie FITC oder wie Rodaminsuccinimidylester, direkt mit Nukleophilen wie den Sulfhydrylgruppen von Cysteinen oder den Aminogruppen von Lysinen im Calcium bindenden Polypeptid des Bestandteils (b) reagieren können, und damit eine kovalente Bindung zwischen (a) und (b) und/oder (b) und (c) bilden. Aminreaktive Farbstoffe und thiolreaktive Farbstoffe können z. B. von Molecular Probes Europe BV, Leyden, Niederlande, erhalten werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das veränderte Calcium bindende Polypeptid ein erstes Chromophor (a), welches ein fluoreszierendes Polypeptid ist, das die Fähigkeit besitzt, als ein Donor-Chromophor in einem Donor-Akzeptor-Paar zum FREI zu dienen, und ein zweites Chromophor (c), welches ein fluoreszierendes Polypeptid ist, das die Fähigkeit besitzt, als ein Akzeptor-Chromophor in einem Donor-Akzeptor-Paar zum FREI zu dienen. Bevorzugt sind die drei Polypeptide Teil eines Fusionspolypeptids, und die Anordnung der drei verbundenen Polypeptide beginnend vom N-Terminus des Fusionspolypeptids kann (a)-(b)-(c) oder (c)-(b)-(a) sein. Es soll verstanden werden, dass weitere Aminosäuren im Fusionspolypeptid am N- oder am C-Terminus sowie zwischen den Polypeptiden (a) und (b) und/oder (b) und (c) sein können. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erste Chromphor (a) ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CFP, EGFP und YFP (Citrine), alle abgeleitet aus Aequoria victoria, DsFP 483 aus Discosoma striata, AmCyan aus Anemonia majano, cFP 484 aus Clavularia sp., Azami-Green aus Galaxeidae sp. und As499 aus Anemonia sulcata.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das zweite Chromophor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus kleinen fluoreszierenden Molekülen wie z. B. den Indocyaninfarbstoffen Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy7, Fluorescein oder Rhodamin, aber auch fluoreszierende Polypeptide wie bestimmte Derivate von GFP, dem „grünen fluoreszierenden Protein", insbesondere Mutanten von GFP mit erhöhter Stabilität oder veränderten Spektraleigenschaften wie EGFP, CFP, BFP oder YFP. Andere geeignete fluoreszierende Polypeptide sind cFP 484 aus Clavularia und zFP 538, das gelbe fluoreszierende Protein aus Zoanthus.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Calcium bindende Polypeptid des Bestandteils (b) mindestens eine Calcium bindende EF-Hand, und umfasst insbesondere zwei oder sogar drei Calcium bindende EF-Hände. Am meisten bevorzugt enthält das erfindungsgemäße veränderte Calcium bindende Polypeptid 4, 3, 2 oder sogar nur 1 EF-Hand. Der Fachmann wird verstehen, dass die urtümlliche Calciumbindungsstelle von menschlichem Troponin C oder Skelettmuskel-Troponin C aus Huhn genetisch verändert werden kann, so dass seine Calcium bindenden Eigenschaften wiederhergestellt sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Calcium bindende Polypeptid eine Polypeptidsequenz mit mindestens 60% Identität, weiter bevorzugt mindestens 70%, noch weiter bevorzugt mindestens 80%, sogar noch weiter bevorzugt mindestens 90% oder am meisten bevorzugt 100% Identität zu den Aminosäuren 15–163 von Skelettmuskel-Troponin C aus Huhn oder den Aminosäuren 1–161 von humanem Herz-Troponin C. In diesem Fall bedeutet 100% Identität eine 100% Identität über den vollständigen Abschnitt von jeweils 148 oder 161 Aminosäuren.
  • Wie vorher erwähnt, können Linker-Sequenzen zwischen Bestandteil (a) und (b) und Bestandteil (b) und (c) des erfindungsgemäßen veränderten Calcium bindenden Polypeptids sein. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Polypeptid daher weiterhin glycinreiche Linkerpeptide N-terminal oder C-terminal zum Polypeptid (b), insbesondere in direkter Nachbarschaft zum Polypeptid (b) an seinem N-Terminus oder C-Terminus.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße veränderte Calcium bindende Polypeptid weiterhin ein Lokalisationssignal, insbesondere eine Kern-Lokalisationssequenz, eine Kern-Exportsequenz, eine Lokalisationssequenz für das endoplasmatische Retikulum, eine Peroxisomen-Lokalisationssequenz, eine mitochondriale Eingangssequenz, eine mitochondriale Lokalisationssequenz, eine Sequenz zum Zielrichten an die Zellmembran, und am meisten bevorzugt eine Sequenz zum Zielrichten an die Zellmembran, die eine Lokalisation an prä- und/oder post-synaptische Strukturen vermittelt. Es wurde gefunden, dass es ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen veränderten Calcium bindenden Polypeptide ist, dass sie im Zusammenhang von subzellulären Umgebungen funktionieren, wo vorbekannte Calciumsensoren nicht funktionierten oder schlechte Leistung gezeigt haben. Die Calciumsensoren der vorliegenden Erfindung sind daher besonders stark, wenn sie an spezielle subzelluläre Strukturen zielgerichtet sind, wie Organellen oder funktionell unterschiedliche Bereiche der Zelle – wie Lamellipodien oder Filopodien oder Axonen oder Dendriten im Fall von neuronalen Zellen. Solch subzelluläres Zielrichten kann mithilfe von speziellen Sequenzen zum Zielrichten erreicht werden. Eine Lokalisation an das endoplasmatische Retikulum kann erreicht werden durch Fusionieren des Signalpeptids von Calreticulin, MLLSVPLLLGLLGLAAAD an den N-Terminus eines Fusionspolypeptids, und die Sequenz KDEL als ein ER-Retentionsmotiv an den C-Terminus eines Fusionspolypeptids (diskutiert in Kendal et al. "Targeting aequorin to the endoplasmic reticulum of living cells." Biochem. Biophys. Res. Commun. 189: 1008-1016, (1992)). Eine Kernlokalisation kann z. B. erreicht werden durch Einbeziehen der zweiteiligen NLS von Nucleoplasmin in einen zugänglichen Bereich des Fusionspolypeptids oder alternativ, der NLS vom großen SV-40-T-Antigen. Am günstigsten werden diese Sequenzen entweder am N- oder am C-Terminus des Fusionspolypeptids platziert.
  • Ein Kernausschluss und eine strenge zytoplasmatische Lokalisation kann durch Einbeziehen eines Kern-Exportsignals in das erfindungsgemäße veränderte Calcium bindende Polypeptid vermittelt werden. Solche Signale sind nützlich, wenn das erfindungsgemäße veränderte Calcium bindende Polypeptid kleiner als 60 kDa ist. Ein Kernausschluss könnte nicht für erfindungsgemäße veränderte Calcium bindende Polypeptide nötig sein, die größer als 60 kDa sind, weil solche Polypeptide gewöhnlich nicht in den Zellkern eintreten, und daher im stationären Zustand cytosolisch sind. Geeignete Kernexportsignale sind das NES von HIV Rev, das NES von PKI, AN3, MAPKK oder andere Signalsequenzen, die aus der NES-Base erhältlich sind (http://www.cbs.dtu.dk/databases/NESbase/). Für einen Übersichtsartikel über Kernlokalisationssignale und Kernexportsignale siehe Mattaj & Englmeier, "Nuclear cytoplasmic transport: the soluble Phase" (1998), Annu. Rev. Biochem. 67: 265-306.
  • Mitochondriales Zielrichten kann durch Fusionieren der N-terminalen 12 Aminosäuren Präsequenz von Untereinheit 4 der humanen Cytochrom-C-Oxidase an den N-Terminus eines Fusionspolypeptids erreicht werden (als Referenz siehe Livgo, T. "Targeting of Proteins to mitochondria" (2000) FERS Letters, 476: 22-26; und Hurt, E. C. et al. (1985) Embo J., 4: 2061-2068). Ein Zielrichten an den Golgi-Apparat kann durch Fusionieren der N-terminalen 81 Aminosäuren von humaner Galactosyltransferase an den N-Terminus eines Fusionspolypeptids erreicht werden und führt zu einem Zielrichten an die Trans-Cisterne des Golgi-Apparats (als Referenz siehe Llopis J. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(12): 6803-8.)
  • Geeignete Sequenzen zum Zielrichten für peroxysomales Zielrichten sind PTS1 und PTS2 (als Referenz siehe Gould S. G. et al. (1987) J. Cell Biol. 105: 2923-2931; und Ozumi T. et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun., 181: 947-954.)
  • Zum Zielrichten an die innere Oberfläche der Zellmembran sind die ersten 20 aminoterminalen Aminosäuren von GAP-43 (Wachstums-assoziiertes Protein, „growth associated Protein") nützlich, d. h. die Sequenz MLCCMRRTKQVEKNDEDQKI. Alternativ kann ein Zielrichten an die Membran durch Fusionieren der 20 am weitesten C-terminal gelegenen Aminosäuren von C-Ha-Ras an den C-Terminus eines Fusionspolypeptids erreicht werden. Diese Aminosäuren sind KLNPPDESGTGCMSCKCVLS. (Als Referenz siehe Moryoshi K. et al. (1996) Neuron, 16: 255-260.)
  • Ein Zielrichten an postsynaptische Stellen kann durch Fusionieren der C-terminalen PDZ-Bindedomäne der 2B-Untereinheit des NMDA-Rezeptors an den C-Terminus eines Fusionspolypeptids erreicht werden. Die Sequenz ist VYEKLSSIESDV. Alternativ kann die PDZ-Bindedomäne des einwärts gleichrichtenden Kaliumkanals KIR 2.3 als eine Lokalisation verwendet werden, wenn sie an den C-Terminus angefügt wird. Die Sequenz ist MQAATLPLDNISYRRESAI. (Als Referenz siehe Liedhammer M. et al. (1996) J. Neurosci., 16: 2157-63, und Lemaout S. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 10475-10480.) Andere PDZ-Bindedomänen, die als Lokalisationsindikatoren nützlich sind, können in Hung und Sheng (2001) J. Biol. Chem., 277: 5699-5702 gefunden werden.
  • Präsynaptisches Zielrichten kann durch Fusionieren von präsynaptischen Proteinen wie Syntaxin oder Synaptobrevin (VAMP-2) an die erfindungsgemäßen Fusionspolypeptide erreicht werden. (Als Referenz siehe Gennett et al. (1992) Science, 257: 255-259, und Elferink et al. (1989) J. Biol. Chem., 264: 11061-4.)
  • Eine weitere bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßes verändertes Calcium bindendes Polypeptid, das eine Verhältnisänderung (ratio change) auf Calciumzugabe hin von mehr als 30%, bevorzugt von 50% bis 200%, weiter bevorzugt von 80% bis 180%, noch weiter bevorzugt von 90% bis 160%, und am meisten bevorzugt von 100% bis 150% aufweist. Eine Verhältnisänderung ist wie vorstehend definiert und Calcium wird auf eine Endkonzentration von 10 mM CaCl2 zugefügt (d. h. ein angemessenes Volumen einer 1 M wässrigen Lösung von CaCl2 wird zu einem Puffer zugefügt, der das erfindungsgemäße Polypeptid, 10 mM MOPS, pH 7,5, 100 mM KCl und 20 μM EGTA enthält, so dass die Endkonzentration 10 mM CaCl2 ist. Die Polypeptide, die solche Verhältnisänderungen aufweisen, sind besonders bevorzugt, weil sie die Messung von Calciumkonzentrationsänderungen innerhalb einer lebenden Zelle aufgrund ihres geringen Signal-Stör-Verhältnisses ermöglichen.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform hat das erfindungsgemäße veränderte Calcium bindende Polypeptid einen Kd für Ca2+ von unter 800 μM, bevorzugt von 50 nM bis 400 μM, weiter bevorzugt von 100 nM bis 100 μM, und am meisten bevorzugt von 250 nM bis 35 μM. Wie in den Beispielen gezeigt, kann der Kd des erfindungsgemäßen veränderten Calcium bindenden Polypeptids für Ca2+-Ionen durch zielgerichtete Mutation der Calcium bindenden EF-Hände des von Troponin C abgeleiteten Polypeptids manipuliert werden (als Referenz siehe Szczesna et al., (1996) J. Biol. Chem. 271: 8381-8386, und Sorensen et al., (1995) J. Biol. Chem. 270: 9770-9777). In diesen Referenzen werden die Wirkungen von Mutationen innerhalb der 12 Aminosäuren langen Schleife der EF-Hand auf den Kd eines Calcium bindenden Polypeptids für Calcium erklärt. Damit können, innerhalb gewisser Grenzen, Calcium bindende Biosensoren entworfen werden, die die gewünschte Affinität für Calciumionen besitzen.
  • In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße veränderte Calcium bindende Polypeptid ein Fusionspolypeptid ausgewählt aus einer beliebigen der Polypeptide von SEQ ID NR. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 oder 18, bevorzugt 2 oder 4.
  • In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Nukleinsäuremolekül bereit, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, welche eine beliebige der vorstehend erwähnten Fusionspolypeptide kodiert. Insbesondere, ein Fusionspolypeptid, wobei die Anordnung der drei verbundenen Polypeptide beginnend vom N-Terminus des Fusionspolypeptids (a)-(b)-(c) oder (c)-(b)-(a) ist. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Nukleinsäure (i) eine Nukleinsäuresequenz wie definiert in SEQ ID NR. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 oder 17, bevorzugt 1 oder 3, (ii) eine Nukleinsäuresequenz, welche als ein Ergebnis des genetischen Codes degeneriert zur Nukleinsäure wie in (i) definiert ist, und welche ein Polypeptid wie definiert in SEQ ID NR. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 oder 18 kodiert, bevorzugt 2 oder 4, oder ein Polypeptid mit mindestens 80% Identität zu diesen Polypeptiden innerhalb eines 30 Aminosäuren langen Abschnitts, bevorzugt innerhalb eines Abschnitts von 45, 60 oder sogar 75 Aminosäuren.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist eine rekombinante Expressionskassette, insbesondere ein Vektor, umfassend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, welche funktionell mit mindestens einer regulatorischen Sequenz verbunden ist, was die Expression des erfindungsgemäßen veränderten Proteins erlaubt. Zum Beispiel kann eine Nukleinsäuresequenz, die ein erfindungsgemäßes verändertes Polypeptid kodiert, isoliert und in einen Expressionsvektor kloniert werden, und der Vektor kann dann in eine geeignete Wirtszelle zur Expression eines erfindungsgemäßen veränderten Polypeptids transformiert werden. Solch ein Vektor kann ein Plasmid, ein Phagemid oder ein Cosmid sein. Zum Beispiel kann ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül in einer geeigneten Weise in prokaryotische oder eukaryotische Expressionsvektoren kloniert werden (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. Ausgabe, Hrsg. Sambrook et al., CSHL Press 2001). Diese Expressionsvektoren umfassen mindestens einen Promotor und können auch ein Signal für die Translationsinitiation umfassen, und – im Fall von prokaryotischen Expressionsvektoren – ein Signal für die Translationstermination, während im Fall von eukaryotischen Expressionsvektoren vorzugsweise Expressionssignale für eine transkriptionelle Termination und Polyadenlyierung beschrieben sind. Beispiele für prokaryotische Expressionsvektoren sind, für eine Expression in Escherichia coli, z. B. Expressionsvektoren basierend auf Promotoren, die durch die T7-RNA-Polymerase wie in US 4,952,496 beschrieben, erkannt werden, für eukaryotische Expressionsvektoren, für eine Expression in Saccharomyces cerevisiae, z. B. die Vektoren G426/MET25 oder P526/GAL1 (Mumberg et al. (1994), Nucl. Acids Res., 22: 5767-5768), für die Expression in Insektenzellen, z. B. über Bacculovirus-Vektoren, die durch Ziccarone et al. beschriebenen ("Generation of recombinant bacculovirus DNA in E. coli using bacculovirus shuttle vector" (1997) Band 13, U. Reischt et. (Totoba, N. J.: Humana Press Inc.) und für eine Expression in Säugerzellen, z. B. SW40-Vektoren, die gemeinhin bekannt und im Handel erhältlich sind, oder das Sindbis-Virus-Expressionssystem (Schlesinger (1993) Trans Bio Technol. 11(1): 18-22) oder ein Adenovirus-Expressionssystem (Heh et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2509-2514). Die molekularbiologischen Verfahren zur Herstellung dieser Expressionsvektoren sowie die Verfahren zum Transfizieren von Wirtszellen und zum Kultivieren solcher transfizierender Wirtszellen sowie die Bedingungen zum Herstellen und Erhalten der erfindungsgemäßen Polypeptide aus solchen transfomierten Wirtszellen sind dem Fachmann gut bekannt.
  • In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung eine Wirtszelle umfassend ein Polypeptid, insbesondere ein erfindungsgemäßes Fusionspolypeptid und/oder eine erfindungsgemäße Nukleinsäure. Solch eine Wirtszelle kann eine nicht-humane Zelle innerhalb oder außerhalb des tierischen Körpers oder eine humane Zelle außerhalb des menschlichen Körpers sein. Besonders bevorzugt sind Säugerzellen wie HEK-Zellen, HELA-Zellen, PC12-Zellen, CHO-Zellen, NG108-15-Zellen, Jurkat-Zellen, Maus-3T3-Fibroblasten, Maus-Hepatom (Hepa-1C1C7-Zellen), Maus-Hepatom (H1G1-Zellen), humane Neuroblastom-Zelllinien, aber auch etablierte neuronale und Krebszelllinien aus humanem und tierischem Ursprung, erhältlich von ATCC (www.atcc.org). Wirtszellen können aber auch von Nicht-Säuger-Ursprung oder sogar von Nicht-Vertebraten-Ursprung sein, wie Drosophila-Schneiderzellen, Hefezellen, andere Pilzzellen, oder sogar grampositive oder gramnegative Bakterien. Besonders bevorzugt sind Zellen innerhalb eines transgenen Indikatororganismus und auch die transgenen Indikatororganismen umfassend die erfindungsgemäße Wirtszelle. Das Erzeugen von transgenen Fliegen, Nematoden, Zebrafischen, Mäusen und Pflanzen, z. B. Arabidopsis thaliana, sind gut etabliert. Zum Erzeugen von transgenen Mäusen mit geeigneten zell- oder gewebespezifischen Promotoren wird Bezug genommen auf Hogan D. et al. (1994) „Production of transgenic mice" in Manipulating the Mouse Em bryo: A Laboratory Manual – Hogan D., Constantini, F., Lacey E. Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, S. 217-252. Als eine Alternative können Indikatoren als transgene Mäuse mit einem induzierbaren System exprimiert werden; es wird Bezug genommen auf Albanese C. et al., "Recent advances in inducible expression in transgenic mice" (2002) Semin. Cell. Dev. Biol., 13: 129-41. Verfahren für die Erzeugung von transgenen Fliegen, Nematoden, Zebrafischen und transgenen Pflanzen sind auch gut etabliert, und beispielhafter Bezug wird auf die folgenden Dokumente genommen: Rubin & Spreadling (1982) Science 218: 348-53, zum Erzeugen von transgenen Fliegen; Mellow & Fire (1995) in: Methods in Cell Biology, Band 48, H. F. Epstein & T. C. Shakes, Hrsg. (San Diego, CA: Academic Press), S. 451-482, Higashiyima et al. (1997), Dev. Biol. 192: 289-99 für die Transformation von Zebrafischen, und Bechtold et al. (1993) C. R. Acad. Sci. [III] 316: 1194-1199 für die Transformation von Arabidopsis taliana-Pflanzen.
  • In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen von Veränderungen der lokalen Calciumkonzentration, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellen einer Zelle oder einer subzellulären Membran als eine Fraktion einer Zelle, welche Zelle oder subzelluläre membranhaltige Fraktion ein erfindungsgemäßes Calcium bindendes verändertes Polypeptid umfassen, (b) Hervorrufen einer Veränderung in der lokalen Calciumkonzentration, und (c) Messen von FREI zwischen dem Donor- und dem Akzeptor-Chromophor des Donor-Akzeptor-Paares des erfindungsgemäßen veränderten Calcium bindenden Polypeptids, wobei eine Veränderung im FREI als eine Antwort auf Schritt (b) eine Veränderung in der lokalen Calciumkonzentration anzeigt. Diese Schritte werden alle unter geeigneten Bedingungen durchgeführt. Ein Bereitstellen der Zelle in Schritt (a) kann durch Bereitstellen einer erfindungsgemäßen Wirtszelle erreicht werden, z. B. einer Wirtszelle, die mit einem Expressionskonstrukt transfiziert ist, welches ein erfindungsgemäßes Fusionspolypeptid kodiert, in der als ein Beispiel ein erfindungsgemäßes Polypeptid exprimiert wird, z. B. wie in den Beispielen 3 oder 4. Eine subzelluläre membranhaltige Fraktion umfassend ein erfindungsgemäßes Calcium bindendes Polypeptid kann durch biochemische Fraktionierung der zellulären Bestandteile von z. B. der vorstehend erwähnten Wirtszelle erhalten werden. Eine subzelluläre membranhaltige Fraktion können z. B. aus dem Golgi- oder dem ER abgeleitete Vesikel aus der Wirtszelle sein, oder isolierte Organellen aus der Wirtszelle sein, wie pelletierte Kerne oder Mitochondrien. Die Verfahren, um subzelluläre membranhaltige Fraktionen aus z. B. Zellen aus einer Zellkultur zu erhalten, sind im Stand der Technik gut bekannt (als Referenz siehe z. B. McNamee, MG (1989) Isolation and characterization of cell membranes, Biotechnique 7: 466-475 und Joost HG und Schurmann, A. (2001), Subcellular fractionation of adipocytes and 3T3 L1 cells, Meth. Mol. Biol. 155: 77-82).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die subzelluläre membranhaltige Fraktion eine Organelle, insbesondere ein Mitochondrium, ein Peroxisom oder ein Kern, oder eine Membranfraktion abgeleitet aus einer membrangebundenen Organelle. Besonders interessant sind Membranfraktionen abgeleitet aus der Zellmembran. Jedoch wird in einer bevorzugten Ausführungsform eine Zelle, z. B. eine Zelle im Zusammenhang mit einer Zellkulturschale oder eine Zelle im Zusammenhang mit einem transgenen Organismus, wenn die Zelle eine nicht-humane Zelle ist, in Schritt (a) bereitgestellt. Und bevorzugt wird das erfindungsgemäße Calcium bindende Polypeptid an eine spezielle subzelluläre Lokalisierung innerhalb der Zelle zielgerichtet, und am meisten bevorzugt wird sie an die innere Oberfläche der Zellmembran zielgerichtet. Wie vorstehend beschrieben kann eine Veränderung in der lokalen Calciumkonzentration durch verschiedene Reize hervorgerufen werden, wie die Verabreichung von extrazellulären Reizen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Schritt (b) durch Verabreichen eines extrazellulären Reizes bewirkt, und insbesondere durch die Zugabe einer kleinen chemischen Substanz oder eines Polypeptids an die extrazelluläre Seite der Wirtszelle. Wenn Veränderungen der lokalen Calciumkonzentration in einer Zelle im Zusammenhang mit einer Zellkulturschale gemessen werden sollen, dann ist es bevorzugt, dass das erfindungsgemäße Fusionspolypeptid zusammen mit einem Rezeptorprotein oder Ionenkanalprotein von Interesse coexprimiert wird, deren Aktivierung in Form eines Calciumsignals abgelesen werden kann. Solche Rezeptoren können Rezeptoren sein, die an die Herstellung eines intrazellulären Botenstoffs wie IP3 gekoppelt sind, welches zu einem Anstieg an cytosolischem oder mitochondrialem Calcium in der Zelle führt, wenn der Rezeptor oder Ionenkanal stimuliert wird, z. B. Mitglieder der Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, einschließlich Geruchs- und Geschmacksrezeptoren, Rezeptor-Tyrosinkinasen, Chemokin-Rezeptoren, T-Zell-Rezeptoren, metabotrope Amino säurerezeptoren wie metabotrope Glutamatrezeptoren oder Gabab-Rezeptoren, GPI-verknüpfte Rezeptoren der TGFbeta/GDNF-(Glia-abgeleiteter neurotrophischer Faktor) – Rezeptorfamilie. Rezeptoren können auch direkt den Calciumeinfluss in Transfektorzellen regulieren, wie NMDA-Rezeptoren oder calciumdurchlässige AMPA-Rezeptoren. Auch interessant sind Calciumkanäle, die durch Membranpotential unter physiologischen Bedingungen reguliert werden, wie Calciumkanäle vom L-Typ, P/Q-Typ und N-Typ. Nachdem eine Coexpression der erfindungsgemäßen Calciumsensoren und solche eines Rezeptors oder Kanals erreicht wurde, wird im nächsten Schritt (b) ein Agonist oder Antagonist des Rezeptors oder Kanals der cotransfizierten Wirtszelle bereitgestellt, und dann kann in Schritt (c) die Veränderung in der lokalen Calciumkonzentration auf mikroskopischer Ebene abgelesen werden durch Anregen des Donor-Chromophors bei einer geeigneten Wellenlänge unter Verwendung einer geeigneten Lichtquelle wie einer Xenon-Bogenlampe, einem Monochromator oder einer Laserlichtquelle, geeigneten dichroischen Spiegeln und Anregungsfiltern und Emissionsfiltern einer geeigneten Bandbreite, um Informationen über die Donor- und Akzeptoremission zu entnehmen, schließlich durch Aufnehmen der Signale auf einer CCD-(ladungsgekoppeltes Bauelement, charge-coupled device) Kamera oder einer Fotovervielfacherröhre.
  • Wenn die Zelle im Zusammenhang mit einem Indikatororganismus bereitgestellt wird, dann wird das Verfahren durch Exprimieren des erfindungsgemäßen Fusionspolypeptids in einem transgenen Organismus in einer Zelle oder interessierenden Gewebetyp mit Hilfe von geeigneten spezifischen, konstitutiven oder induzierbaren Promotoren durchgeführt. Als nächster Schritt (b) wird ein geeigneter Reiz an den Organismus gebracht, z. B. wird ein Wirkstoff dem Organismus verabreicht, oder alternativ wird ein Reiz von geeigneter Ausführungsart an den Organismus gebracht, wie ein visueller, akustischer, mechanischer, nocizeptiver oder hormoneller Reiz. Dieser Reiz ruft ein Calciumsignal hervor, das nachgewiesen werden kann, wenn das erfindungsgemäße Fusionspolypeptid in interessierenden Geweben innerhalb des transgenen Tieres exprimiert wird, wie das Nervensystem oder in Darmorganen. Der Reiz kann z. B. ein Kälteschock, mechanischer Stress, ein osmotischer Schock oder oxidativer Stress, Parasiten oder Veränderungen in der Nährstoffzusammensetzung sein. Die Veränderung der lokalen Calciumkonzentration kann dann durch Mikro skopie der Zelle oder des interessierenden Gewebes, wie vorstehend aufgezeigt, abgelesen werden.
  • In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis der Bindung einer kleinen chemischen Substanz oder eines Polypeptids an ein Calcium bindendes Polypeptid mit einer Identität von mindestens 80% zu einer 30 Aminosäuren langen Polypeptidsequenz von humanem Troponin C oder Skelettmuskel-Troponin C aus Huhn bereit. Dieses Verfahren umfasst die Schritte von (a) Bereitstellen eines erfindungsgemäßen Calcium bindenden Polypeptids, (b) Zufügen einer kleinen chemischen Substanz, die auf Binden getestet werden soll, oder ein Polypetid, das auf Binden getestet werden soll, und (c) Bestimmen des Grades des Bindens durch Messen von FREI zwischen dem Donor- und dem Akzeptor-Chromophor des Donor-Akzeptorpaares des Polypeptids unter geeigneten Bedingungen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Calcium bindende Polypeptid, das in Schritt (a) bereitgestellt wird, humanes Herzmuskel-Troponin C oder ein Polypeptid abgeleitet aus humanem Herzmuskel-Troponin C, und insbesondere ist es SEQ ID NR. 4. Dieses Verfahren ist nützlich, um kleine chemische Substanzen oder Polypeptide von klinischem Interesse zu identifizieren, insbesondere die in bestimmten klinischen Situationen wie angeborenem Herzfehler, Kardiomyopathie, oder anderen Myokardkrankheiten wie solche induziert durch Diabetes, welche zu einer verringerten Leistung des menschlichen Herzens führen. Das Verfahren ist auch nützlich zum Identifizieren von Substanzen, die die Kontrahierungskraft von Skelettmuskel stärken oder schwachen. Solche Substanzen, die die Skelettmuskelfunktion verstärken, können vorteilhaft Therapeutika gegen Krankheiten sein, die zu Muskeldegeneration führen, wie muskuläre Dystrophien, wie z. B. Duchenne-Muskeldystrophie, oder spinale muskuläre Atrophie. Substanzen, die die Skelettmuskelkontraktion schwachen, könnten ihre Verwendung finden in Zuständen, die zu übermäßigen Muskelkrämpfen führen, wie z. B. in Tetanus. Kleine chemische Moleküle oder Polypeptide, die helfen, die Calcium bindenden Eigenschaften von menschlichem Herzmuskel-Troponin C oder menschlichem Skelettmuskel-Troponin C zu verbessern, besitzen das Potenzial, geeignete Pharmazeutika zur Behandlung der vorstehend genannten Krankheiten zu sein. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die kleinen chemischen Substanzen oder Polypeptide, die durch die vorstehend erwähnten Screening verfahren identifiziert werden, in eine pharmazeutische Zusammensetzung formuliert, die zur Behandlung der vorstehend genannten Krankheit verwendet werden kann.
  • In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen veränderten Calcium bindenden Polypeptids zum Nachweis von Änderungen in der lokalen Calciumkonzentration innerhalb einer Zelle, und insbesondere für den Nachweis von Calciumveränderungen, die nahe einer zellulären Membran vorkommen. In einem Aspekt kann dies für diagnostische Zwecke in einer Person sein, z. B. einem menschlichen Patienten. Auch kann das veränderte erfindungsgemäße Calcium bindende Polypeptid zum Nachweis von Veränderungen in der lokalen Calciumkonzentration innerhalb einer Zelle eines erfindungsgemäßen transgenen Tieres verwendet werden, wie einer transgenen Maus, oder bevorzugt eines transgenen Nicht-Säugetieres, wie transgener Bäckerhefe, C. elegans, D. melanogaster oder Zebrafisch. In einem anderen Aspekt wird diese Verwendung nicht in Betracht gezogen, am menschlichen oder tierischen Körper ausgeführt zu werden, sondern sie betrifft eine Ex-vivo-Verwendung, insbesondere eine In-vitro-Verwendung, z. B. in Zelllinien oder in primären Zellen in Zellkultur.
  • In einer bevorzugte Ausführungsform werden solche veränderten Calcium bindenden Polypeptide verwendet, die ein Lokalisationssignal umfassen, insbesondere ein Kernlokalisationssignal, ein Kernexportsignal, ein Lokalisationssignal für das endoplasmatische Retikulum, ein Peroxisomenlokalisationssignal, ein Signal für mitochondrialen Eingang, ein Signal zum Zielrichten an die Zellmembran, oder ein Signal zum Zielrichten an die Zellmembran, das eine Lokalisation an prä- oder postsynaptische Strukturen vermittelt. Am meisten bevorzugt werden solche veränderten Calcium bindenden Polypeptide verwendet, welche ein Signal zum Zielrichten an die Zellmembran umfassen, und insbesondere ein Signal zum Zielrichten an die Zelle, das eine Lokalisation an die Zellmembran von prä- oder postsynaptischen Strukturen vermittelt. Es ist wünschenswert, dass das veränderte Calcium bindende Polypeptid ein erfindungsgemäßes genetisch kodiertes Fusionspolypeptid ist.
  • BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1: Schematische Darstellung des FREI, der in ratiometrischen Indikatoren, die auf Troponin C-Varianten basieren, auftritt.
  • 2: Zusammenfassung der Basiskonstrukte und Auswertung ihrer Funktion. csTnC, Skelettmuskel-Troponin C aus Huhn csTN-N90, der N-terminale Lappen von Skelett-Troponin C aus Huhn (Aminosäuren 1–90). csTnC-EFn, die einzelnen EF-Hände 1–4 von Skelettmuskel-Troponin C aus Huhn. csTnI, Skelettmuskel-Troponin I aus Huhn. csTnI 1–48, csTnI 95–133, csTnI 116–135, verschiedene kurze Peptide abgeleitet aus Skelettmuskel-Troponin I aus Huhn, bestehend aus den angezeigten Aminosäureresten. csTnC-L15, trunkiertes Skelettmuskel-Troponin C aus Huhn, in dem die N-terminalen Aminosäurereste 1–14 deletiert sind, was das Protein am Leucin 15 starten lässt. Das gesamte Indikatorkonstrukt wurde TN-L15 (SEQ ID NR. 1 und 2) genannt. csTnC-L15 D107A, csTnC-L15, das die Mutation D107A trägt. Das gesamte Indikatorkonstrukt wurde TN-L15 D107A genannt (SEQ ID NR. 5, 6). csTnC-L15-N90, N-terminaler Lappen des Skelettmuskel-Troponin C aus Huhn, bestehend aus Aminosäureresten 15–90. hcardTnC, humanes Herzmuskel-Troponin C. Das gesamte Indikatorkonstrukt wird als TN-humTnC bezeichnet (SEQ ID NR. 3, 4). hcardTnC1-135, humanes Herzmuskel-Troponin C, dem die letzte EF-Hand-Domäne fehlt. hcard-TnC-L12, humanes Herzmuskel-Troponin C, in dem die N-terminalen Aminosäurereste 1–11 deletiert sind, analog zu csTnC-L15. L, Linker: Entweder GG, GSG oder GGSGG.
  • 3: Wirkung von Calciumbindung auf das Emissionsspektrum zweier Indikatorkonstrukte; A: TN-L15. B: TN-humTnC. Die Emissionsspektren dieser zwei Konstrukte werden bei null (gestrichelte Linie, -Ca2+) und gesättigten (durchgehende Linie, +Ca2+) Calciumspiegeln dargestellt.
  • 4: Affinitäten für Calcium (A) und pH-Sensitivitäten (B) von ausgewählten Indikatorproteinen. A: TN-humTnC (offenen Rauten), TN-L15 (gefüllte Quadrate), TN-L15 D107A (offene Kreise), TN-L15 E42Q/E78Q (gefüllte Kreise). B: Emissionsverhältnis von TN-L15 in der Gegenwart (Kreise) und in Abwesenheit (Quadrate) von Calcium bei verschiedenen pH-Werten.
  • 5: Calciumdissozation von ausgewählten aufgereinigten Indikatorproteinen.
  • 6: Funktion von TN-L15 innerhalb lebender Zellen. A: HEK 293-Zellen, die eine cytosolische Lokalisierung und verschieden Expressionsspiegel (Zelle 1 und 2) von TN-L15 zeigen. B: Der Verhältnisverlauf der zwei Zellen, die in A gezeigt werden. Antworten auf eine Stimulation mit 100 μM Carbachol und eine Behandlung mit 1 μM Ionomycin bei hohem Calcium, um Rmax zu erhalten, und bei 100 μM EGTA, um Rmin zu erhalten, sind gezeigt. C: Entsprechende Intensitätsverläufe von CFP- und Citrine-Emission für die Verhältnisse in B, die einzeln die Verläufe der stärker exprimierenden Zelle 1 und der schwacher exprimierenden Zelle 2 zeigen.
  • 7: Funktion von TN-humTnC in lebenden Zellen. A: Cytosolische Expression von TN-humTnC in HEK293-Zellen. B: Verlauf der bildgebenden Messung, die das 527/476-nm-Emissionsverhältnis nach Stimulierung mit 100 μM Carbachol zeigt.
  • 8: Funktion von TN-L15 in lebenden primären hippocampalen Neuronen. A. Primäres hippocampales Neuron, transfiziert mit TN-L15: B: Verlauf der bildgebenden Messung des Neurons, das in A gezeigt ist.
  • 9: Zielrichten von TN-L15 an die Plasmamembran von lebenden Zellen. Ein Schema des Konstrukts ist dargestellt. A: 293-Zellen, die TN-L15-Ras exprimieren. Der Pfeil zeigt an die Zelle, deren Verlauf in B gezeigt ist. B: TN-L15-Ras zeigt leicht durch einen Agonisten induzierte Calciumoszillationen in 293-Zellen. Der Indikator besitzt denselben dynamischen Bereich, wie wenn er im Cytosol exprimiert ist. C: Primäres hippocampales Neuron, das TN-L15-Ras exprimiert, und dem bildgebenden Verlauf (D) entspricht.
  • 10: Vergleich von Fusionen von TN-L15 und Yellow Cameleon 2.3 (YC2.3) an das präsynaptische Protein Synaptobrevin. A: Bildgebender Verlauf von TN-L15- Synaptobrevin, exprimiert in 293-Zellen. B: Bildgebender Verlauf von YC2.3-Synaptobrevin.
  • 11: Vergleich des Membran-Zielrichtens von TnL-15 und Yellow Cameleon 2.1 (YC2.1) unter Verwendung der Membran-Zielrichtungssequenz von GAP43. A: Verlauf des bildgebenden Messung mit GAP43-TN-L15 in 293-Zellen. B: Verlauf des bildgebenden Messung mit GAP43-YC2.1 in 293-Zellen. Man bemerke die schlechte Leistung von GAP43-YC2.1.
  • BESCHREIBUNG DER SEQUENZEN:
    • SEQ ID NR: 1 ist die DNA-Sequenz von TN-L15; einem Fusionskonstrukt aus CFP, Skelettmuskel-Troponin C aus Huhn Aminosäuren 15–163, und Citrine
    • SEQ ID NR: 2 ist die Proteinsequenz des Konstrukts von SEQ ID NR: 1
    • SEQ ID NR: 3 ist die DNA-Sequenz von TN-humTnC; einem Fusionskonstrukt aus CFP, humanem Herzmuskel-Troponin C, und Citrine
    • SEQ ID NR: 4 ist die Proteinsequenz des Konstrukts von SEQ ID NR: 3
    • SEQ ID NR: 5 ist die DNA-Sequenz von TN-L15 D107A; einem Fusionskonstrukt von CFP, Skelettmuskel-Troponin C aus Huhn Aminosäuren 15–163 und Citrine. Die dritte EF-Hand des Troponin C ist durch den einzelnen Aminosäureaustausch D107A inaktiviert
    • SEQ ID NR: 6 ist die Proteinsequenz des Konstrukts von SEQ ID NR: 5
    • SEQ ID NR: 7 ist die DNA-Sequenz eines Fusionskonstrukts aus CFP, Skelettmuskel-Troponin C aus Huhn und Citrine
    • SEQ ID NR: 8 ist die Proteinsequenz des Konstrukts von SEQ ID NR: 7
    • SEQ ID NR: 9 ist die DNA-Sequenz eines Fusionskonstrukts aus CFP, der zweiten EF-Hand von Skelettmuskel-Troponin C aus Huhn (Aminosäuren 51–91) und Citrine
    • SEQ ID NR: 10 ist die Proteinsequenz des Konstrukts von SEQ ID NR: 9
    • SEQ ID NR: 11 ist die DNA-Sequenz eines Fusionskonstrukts aus CFP, Skelettmuskel-Troponin C, einem Gly-Gly-Linker, Skelettmuskel-Troponin I aus Huhn und Citrine
    • SEQ ID NR: 12 ist die Proteinsequenz des Konstrukts von SEQ ID NR: 11
    • SEQ ID NR: 13 ist die DNA-Sequenz eines Fusionskonstrukts aus CFP, Skelettmuskel-Troponin I aus Huhn Aminosäuren 116–135, einem Gly-Gly-Linker, Skelettmuskel-Troponin C aus Huhn, und Citrine
    • SEQ ID NR: 14 ist die Proteinsequenz des Konstrukts von SEQ ID NR: 13
    • SEQ ID NR: 15 ist die DNA-Sequenz eines Fusionskonstrukts aus CFP, Skelettmuskel-Troponin I aus Huhn Aminosäuren 95–131, einem Gly-Ser-Gly-Linker, Skelettmuskel-Troponin C aus Huhn Aminosäuren 1–91, und Citrine
    • SEQ ID NR: 16 ist die Proteinsequenz des Konstrukts von SEQ ID NR: 15
    • SEQ ID NR: 17 ist die DNA-Sequenz von TN-L12; einem Fusionskonstrukt aus CFP, humanem Herzmuskel-Troponin C Aminosäuren 12–161, und Citrine
    • SEQ ID NR: 18 ist die Proteinsequenz des Konstrukts von SEQ ID NR: 17
    • SEQ ID NR: 19 ist die DNA-Sequenz von humanem Herzmuskel-Troponin C
    • SEQ ID NR: 20 ist die Proteinsequenz von SEQ ID NR: 19
    • SEQ ID NR: 21 ist die DNA-Sequenz von humanem Herzmuskel-Troponin I
    • SEQ ID NR: 22 ist die Proteinsequenz von SEQ ID NR: 21
    • SEQ ID NR: 23 ist die DNA-Sequenz von humanem Skelettmuskel Troponin C
    • SEQ ID NR: 24 ist die Proteinsequenz von SEQ ID NR: 23
    • SEQ ID NR: 25 ist die DNA-Sequenz von Skelettmuskel-Troponin C aus Huhn
    • SEQ ID NR: 26 ist die Proteinsequenz von SEQ ID NR: 25
    • SEQ ID NR: 27 ist die DNA-Sequenz von schnellem Skelettmuskel-Troponin I aus Huhn
    • SEQ ID NR: 28 ist die Proteinsequenz von SEQ ID NR: 27
    • SEQ ID NR: 29 ist die DNA-Sequenz von Herzmuskel-Troponin C aus Huhn
    • SEQ ID NR: 30 ist die Proteinsequenz von SEQ ID NR: 29
  • ABSCHNITT DER BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter veranschaulichen, aber nicht beschränken. Die Beispiele umfassen technische Merkmale, und es wird verstanden werden, dass die Erfindung auch Kombinationen der technischen Merkmale betrifft, die in diesem Abschnitt der Beispiele gezeigt werden.
  • BEISPIEL 1: GENHERSTELLUNG:
  • Troponin C-Domänen in voller Länge und trunkiert wurden durch PCR aus der cDNA von Skelettmuskel-Troponin C aus Huhn (csTnC) erhalten unter Verwendung eines Sense-Primers, der eine SphI-Schnittstelle am 5'-Ende enthält, und einem Reverse-Primer, der eine SacI-Schnittstelle am 3'-Ende enthält. Genauso wurden Domänen mit voller Länge und trunkiert von humanem Herzmuskel-Troponin C (hcardTnC) aus einer cDNA-Sequenz erhalten, aus der die intrinsische SacI-Schnittstelle erst durch Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese entfernt werden musste, was eine stille Mutation des Glu135-Codons (GAG zu GAA) zur Folge hatte. Alle Troponin C-DNA-Fragmente wurden zwischen CFP und Citrine in den bakteriellen Expressionsvektor pRSETB (Invitrogen) insertiert, der ein CFP mit einer SphI-Schnittstelle am 3'-Ende und ein Citrine mit einer SacI-Schnittstelle am 5'-Ende trägt. Eine schematische Darstellung des FREI, der in ratiometrischen Indikatoren, die auf Troponin C-Varianten basieren, auftritt, wird in 1 gezeigt. Das Binden von Calcium an die Troponin C-Domäne führt zu einer Konformationsänderung im Protein, was dadurch den Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FREI) vom Donor- auf das Akzeptor- fluoreszierende Protein erhöht (1). Erste Konstrukte mit einfacher Insertion des Gens voller Länge brachte einen Indikator von mäßiger Leistung hervor. Wir testeten dann eine Reihe von Mutationen und Deletionen an den Linkerregionen. Wir durchliefen eine Reihe von Optimierungen, in denen einzelne Aminosäuren an den verbindenden Sequenzen nahe den GFPs ausgetauscht oder deletiert wurden. Insgesamt wurden mehr als 70 verschiedene Konstrukte hergestellt, die Proteine gereinigt, und einzeln auf ihre Calciumsensitivität getestet. Zusätzlich zu den Sequenzen voller Länge von hcardTnC und csTnC, und Versionen davon mit Trunkierungen und veränderten Linker, wurden kürzere csTnC-Domänen konstruiert, in denen nur spezielle strukturelle Elemente des Proteins einzeln verwendet wurden, wie der N-terminale regulatorische Lappen (Aminosäuren 1–90, genannt TnC-N90) von csTnC alleine, oder einzelnen EF-Händen von csTnC.
  • Eine Zusammenfassung der Basiskonstrukte und eine Auswertung ihrer Funktion kann in 2 gesehen werden. Nur Konstrukte mit mäßiger bis guter Leistung sind aufgeführt. Die Leistung wurde bewertet als die maximale % Veränderung im 527/476 nm Emissionsverhältnis von null Calciumspiegeln bis Calciumsättigung. Die am besten funktionierenden Konstrukte, die mehr als 100% maximale Verhältnisänderung ergeben, wurden für weitere Analyse ausgewählt. Diese Konstrukte wurden TN-humTnC genannt für einen Indikator, der humanes Herz-Skelettmuskel-Troponin C (hcardTnC) als Calcium bindenden Teil verwendet (SEQ ID NR: 3, 4), und TN-L15 genannt für einen Indikator, der Skelettmuskel-Troponin C aus Huhn (csTnC-L15), Aminosäuren 15–163 als Calcium bindenden Teil verwendet (SEQ ID NR: 1, 2).
  • Da von TnI, wie TnI aus Huhn, zum Beispiel die schnelle Skelettmuskel-TnI-Isoform aus Huhn (csTnI) mit der Swissprot Zugangsnummer P02644, bekannt ist, dass einen Komplex mit csTnC in vivo bildet, und einige dieser Wechselwirkungen durch Calcium modifiziert werden, wurden Peptidsequenzen von csTnI, von denen geglaubt wird, dass sie für das Binden an die N- und C-terminalen csTnC-Domänen verantwortlich sind, gemäß der Literatur ausgewählt. csTnI-Fusionen mit csTnC wurden durch Vervielfältigen von Domänen von cDNA von Skelettmuskel-TnI aus Huhn mit Sense und Reverse-Primern, die beide entweder eine SphI-Schnittstelle oder eine SacI-Schnittstelle enthalten, erschaffen. Die sich ergebenden csTnI-DNA-Fragmente, die entweder eine SphI-Schnittstelle oder eine SacI-Schnittstelle an beiden Enden tragen, konnten dann in die schon bestehenden SphI oder SacI-Schnittstellen in den Troponin C-Indikatorfusionskonstrukten kloniert werden.
  • Um Calciumaffinitäten von einzelnen EF-Händen von Skelettmuskel-Troponin C aus Huhn zu verändern, wurden Punktmutationen in die Gensequenz durch ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung des Primer-Extension-Verfahrens (QuickChange, Stratagene) eingeführt. Für eine Proteinexpression in Säugerzellen wurde eine optimierte Kozak-Konsensussequenz (GCC GCC ACC ATG G) durch PCR am 5'-Ende vom CFP eingeführt; die gesamten Indikatorfragmente, die durch Restriktion mit BamHI/EcoRI der pRSETB-Konstrukte erhalten wurden, wurden dann in den Säuger-Expressionsvektor pcDNA3 (Invitrogen) subkloniert. Ein Zielrichten an die Membran von Indikatorproteinen wurde erreicht durch Erweitern der Indikator-DNA-Sequenzen durch PCR mit einer Sequenz, die ein Membranlokalisationssignal kodiert. Insbesondere wurde die 20 Aminosäurensequenz KLNPPDESGPGCMSCKCVLS des c-Ha-Ras-Membranankersignals an das 3'-Ende der Indikatorsequenzen fusioniert, und die 20 Aminosäure Sequenz MGCCMRRTKQVEKNDEDQKI des GAP43-Membranankersignals wurde an das 5'-Ende fusioniert. Siehe Moriyoshi K., et al., „Labeling Neural Cells Using Adenoviral Gene Transfer of Membrane-Targeted GFP." Neuron 16, 255-269 (1996).
  • Fusionen von TN-L15 (SEQ ID NR: 1) oder YC3.1 an Synaptobrevin wurden hergestellt durch Vervielfältigen von Synaptobrevin durch PCR, wobei damit eine Kpn1-Schnittstelle innerhalb eines GGTGGS-Linkers an sein 5'-Ende eingeführt wurde. Gleichzeitig wurde eine Kpn1-Schnittstelle am 3'-Ende von jeweils csTnL-15 oder YC3.1 eingeführt. Das Stoppkodon wurde dadurch deletiert. DNA-Fragmente, die für solchermaßen modifiziertes Synaptobrevin und TN-L15 oder YC3.1 kodieren, wurden in ein Expressionsplasmid zusammen ligiert.
  • BEISPIEL 2: PROTEINEXPRESSION, IN VITRO-SPEKTROSKOPIE UND TITRATIONEN
  • Proteine wurden in Bakterien unter Verwendung des T7-Expressionssystems in Kombination mit dem pRSETB-Plasmid exprimiert, welches das Fusionsprotein trägt. Da das pRSETB-Plasmid auch das Fusionsprotein mit einem N-terminalen Polyhistidin-Tag versieht, konnten Proteine aus geklärten Zelllysaten auf Nickelchelat-Säulen gereinigt werden. Gereinigte Proteine wurden dann in vitro-Fluoreszenzmessungen in einem Cary Eclipse-Fluorometer (Varian), das mit einer Stopped-Flow RX2000 schnellen Kinetik-Zusatzeinheit für kinetische Messungen (Applied Photophysics) ausgestattet war. Um die Prozent Verhältnisänderung eines Proteins zu erhalten, wurden die Fluoreszenz-Emissionsintensitäten des FREI-Donors und des -Akzeptors bei ihren jeweiligen Emissionsmaxima gemessen. Die Werte wurden bei null Calciumspiegeln und bei Calciumsättigung für jeden Indikator bestimmt. Der Ca-freie Puffer enthielt ein Aliquot des Proteins in 10 mM MOPS pH 7,5, 100 mM KCl und 20 μM EGTA. Im zweiten Schritt wurde eine Lösung von 1 M CaCl2 zur Mischung auf eine Endkonzentration von 10 mM CaCl2 zugefügt. Die Wirkung des Calciumbindens auf das Emissionsspektrum von zwei Indikatorkonstrukten wird in 3 gezeigt. 3A zeigt das Emissionsspektrum von TN-L15, einem Fusionsprotein aus Aminosäuren 15–163 von Skelettmuskel-Troponin C aus Huhn (csTnC) als Calcium bindender Teil, eingefügt zwischen CFP und Citrine. Gleichermaßen zeigt 3B das Emissionsspektrum von TN-humTnC, einem Fusionsprotein von Aminosäuren 1–161 von humanem Herzmuskel-Troponin C (hcardTnC) als Calcium bindendes Polypeptid, eingefügt zwischen CFP und Citrine. Die Emissionsspektren der zwei Konstrukte werden bei null (gestrichelte Linie, -Ca2+) und gesättigten (durchgezogene Linie, +Ca2+) Calciumspiegeln dargestellt. Die Veränderung des Emissionsverhältnisses auf das Ca2+-Binden hin ist 140% für TN-L15 und 120% für TN-humTnC. Um die Prozent Verhältnisänderung eines Proteins zu erhalten, wurden die Fluoreszenz-Emissionsintensitäten des FRET-Donors und des -Akzeptors bei ihren jeweiligen Emissionsmaxima gemessen. Die Werte wurden bei null Calciumspiegeln oder bei Calciumsättigung für jeden Indikator bestimmt. Der Ca-freie Puffer enthielt ein Aliquot des Proteins in 10 mM MOPS pH 7,5, 100 mM KCl und 20 μM EGTA. Im zweiten Schritt wurde eine Lösung von 1 M CaCl2 zur Mischung auf eine Endkonzentration von 10 mM CaCl2 zugefügt. Von der C-terminalen Domäne von TnC ist bekannt, dass sie zwei hochaffine Calciumbindungsstellen besitzt, die auch Magnesium binden. Der N-terminale Lappen bindet Calcium spezifisch mit einer etwas geringeren Affinität. In Übereinstimmung damit verringerte das Zufügen von 1 mM Magnesium den maximalen dynamischen Bereich von TN-L15 und TN-humTnC, der durch Zufügen von Calcium erhältlich war, jeweils von 140% auf 100% und 120% auf 70%.
  • Calciumtitrationen wurden in einem Puffersystem durchgeführt, das Ca2+ und K2EGTA in verschiedenen Verhältnissen enthielt, um definierte Konzentrationen von freiem Ca2+ zu erhalten. Damit konnten durch Mischen von Aliquots des Indikatorproteins mit verschiedenen Verhältnissen von zwei Pufferlösungen, die entweder 10 mM K2EGTA, 100 mM KCl und 30 mM MOPS pH 7,2, oder 10 mM CaEGTA, 100 mM KCl und 30 mM MOPS pH 7,2 enthielten, die Fluoreszenz-Emissionsintensitäten des FREI-Donors und des -Akzeptors bei verschiedenen Konzentrationen an freiem Calcium aufgenommen werden. Magnesium wurde zu den Puffer wenn nötig zugefügt. Calcium-Kd-Werte wurden durch Auftragen des Verhältnisses der Emissionsmaximum-Wellenlängen des Donor- und des Akzeptorproteins gegen die Konzentration an freiem Calcium auf einer doppelt logarithmischen Skala berechnet. Siehe Grynkiewicz G., et al. „A New Generation of Ca2+ Indica tors with Greatly Improved Fluorescence Properties". J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985). Magnesiumtitrationen wurden in 10 mM MOPS pH 7.0, 100 mM KCl und verschiedenen Mengen von MgCl2 durchgeführt. Calciumaffinitäten und pH-Empfindlichkeiten von ausgewählten Indikatorproteinen sind in 4 dargestellt. 4A zeigt die Bestimmung von Calcium Kd-Werten von ausgewählten Konstrukten durch Ca2+-Titrationen in der Gegenwart von 1 mM freiem Mg2+. Emissionsverhältnisänderungen wurden auf die Werte bei voller Calciumsättigung normalisiert, und die Kurvenanpassungen entsprechen den scheinbaren Calcium Kd-Werten, die im Text gegeben sind. Calciumtitrationen hatten Reaktionskurven zum Ergebnis mit scheinbaren Dissoziationskonstanten von 470 nM für TN-humcTnC (offene Rauten) und 1,2 μM für TN-L15 (gefüllte Rechtecke). Kds für Magnesiumbindung waren 2,2 mM und 0,5 mM jeweils für TN-L15 und TN-humTnC. Ortsgerichtete Mutagenese wurde ausgiebig verwendet, um Eigenschaften des Ligandenbindens und der Konformationsänderung innerhalb von Troponin C zu untersuchen. Wir haben daher einzelne EF-Hände systematisch durch Austauschen von entscheidenden Aspartat- oder Glutamat-Resten innerhalb der bindenden Schleifen mit entweder Alanin oder Glutamin inaktiviert. Die Mutation D107A, durch die die dritte, C-terminale EF-Hand innerhalb von TN-L15 inaktiviert wurde, hatte einen Indikator mit verringerter Calciumaffinität zum Ergebnis. Der scheinbare Calcium-Kd dieses Konstruktes wurde als 29 μM bestimmt (offene Kreise). Als Folge davon war die Reaktionskurve in den Calciumtitrationen signifikant nach rechts verschoben, die in 4A zu sehen ist. Daher erscheint diese Mutante geeigneter zum Messen von größeren Veränderungen an Calcium, die zum Beispiel angetroffen werden, wenn Indikatoren an synaptische Stellen oder in enge Nachbarschaft zu Kanälen zielgerichet werden. Im Vergleich jedoch brachte das Inaktivieren beider N-terminaler Stellen durch die Doppelmutation E42Q/E78Q ein Protein hervor, das nur die C-terminalen hochaffinen Bestandteile intakt ließ, was einen Kd für Calcium von 300 nM zum Ergebnis hatte (4A, gefüllte Kreise). In 4B untersuchten wir, in welchem Ausmaß pH-Veränderungen die Verhältnisse von TN-L15 beeinflussten, die bei null Calcium (50 μM BAPTA, gefüllte Rechtecke, -Ca2+) oder Calciumsättigung (10 mM Ca2+, gefüllte Kreise, +Ca2+) erhalten wurden. Wie erwartet hingen die Verhältnisse vom pH ab. Die Verhältnisse begannen beginnend unterhalb von pH 6,8 abzufallen, was die pH-Eigenschaften von Citrine und CFP widerspiegelt. Im physiologischen Bereich von cytosolischen pH-Fluktuationen zwischen pH 6,8–7,3 waren die Verhältnisse jedoch bemerkenswert stabil. Die pH-Beständigkeit unserer Sonden ist ein klarer Vorteil gegenüber neueren nicht-ratiometrischen Sonden, die auf Calmodulin und einem einzelnen GFP als Fluorophor basieren, da diese Proben intrinsisch sensitiv gegenüber pH-Veränderungen sind, und daher zu Artefakten neigen, selbst wenn sie im Cytosol exprimiert werden.
  • Für Messungen von Dissoziationskinetik wurden 6 μM gereinigtes Protein in 10 mM MOPS pH 7, 200 mM KCl, 1 mM BAPTA, 1 mM freiem Mg2+ und 1 oder 50 μM freiem Ca2+ (TN-L15 D107A: 50 μM oder 300 μM freiem Ca2+) mit 20 mM BAPTA (TN-L15 D107A: 35 mM BAPTA) in 10 mM MOPS pH 7, 200 mM KCl und 1 mM freiem Mg2+ gemischt; die Mischungs-Totzeit war 8 ms. Unserer Erfahrung nach erschienen die Assoziationsgeschwindigkeiten (on-rates) von genetisch kodierten Calciumsonden nie als ein Problem in Experimenten. Jedoch sind langsame Dissoziationsgeschwindigkeiten das Haupthindernis, um schnell sich verändernde Signale zu verfolgen. Daher konzentrierten wir uns auf das Messen der Dissoziationsgeschwindigkeiten von Calcium, das an unsere Indikatorproteine gebunden war. Proben wurden bei 432 nm angeregt, und die Emission bei 528 nm verfolgt. Datensammlungen von mindestens fünf Experimenten wurden gemittelt, und Geschwindigkeitskonstanten durch monoexponentielle Kurvenanpassungen abgeleitet. Verläufe von einzelnen Dissoziationsexperimenten sind in 5 gezeigt. Wie für eine Reaktionskinetik erster Ordnung erwartet, waren diese Geschwindigkeiten unabhängig von der gewählten Calciumkonzentration (Daten nicht gezeigt). Die τ-Werte, die von drei ausgewählten Konstrukten erhalten wurden, waren 860 ms für TN-L15 (5, oben), 580 ms für TN-L15 D107A und 560 ms für TN-humTnC. Im Vergleich zu unseren Proteinen zeigte Yellow Cameleon 2.3 (YC2.3) eine Calciumdissoziationsgeschwindigkeit von 870 ms (5, unten).
  • BEISPIEL 3: FUNKTIONALITÄT VON TNC-BASIERTEN INDIKATOREN IN LEBENDEN ZELLEN
  • HEK-293-Zellen wurden mit Lipofectinreagenz (Invitrogen) transfiziert, und zwei bis vier Tage später auf einem Zeiss Axiovert 35M-Mikroskop mit einer CCD-Kamera (CoolSnap, Roper Scientific) einem bildgebenden Verfahren unterzogen. Hippocampale Neuronen wurden aus 17 Tage alten Rattenembryonen hergestellt, durch Calciumphosphatfällung 1 Woche nach der Herstellung transfiziert, und zwei Tage nach der Transfektion dem bildgebenden Verfahren unterzogen. Der bildgebende Aufbau wurde durch Metafluor 4.6-Software gesteuert (Universal Imaging). Für ein bildgebendes Messen eines Verhältnisses wurde ein 440/20 Anregungsfilter, ein 455 DCLP dichroischer Spiegel und zwei Emissiosnfilter (485/35 für CFP, 535/25 für Citrine), betrieben in einem Filterrad (Sutter Instruments), verwendet. Konstrukte der Indikatoren mit optimierten Kozak-Consensussequenzen für die Initiation der Translation wurden exprimiert. Troponin C ist ein Teil des Troponin-Komplexes, und wird gewöhnlich nicht als isoliertes Protein innerhalb des Cytosols exprimiert. Es war daher interessant und befriedigend, zu sehen, dass unsere Indikatoren gute cytosolische Expression zeigten. Die Fluoreszenz war gleichmäßig und homogen innerhalb des Cytosols verteilt, ohne Zeichen von Aggregation (6A, 7A). Der Kern war ausgeschlossen, wie erwartet für Proteine mit Molekulargewichten von 69,7 und 72,5 kD, jeweils für TN-L15 und TN-humTnC. Um die Funktion des Indikators innerhalb von Zellen zu untersuchen, verwendeten wir die Carbachol-Antwort von 293-Zellen, die über Muscarin-Rezeptoren stimuliert werden kann. Antworten der 293-Zellen, die TN-L15 exprimieren, nach Stimulationen mit 100 μM Carbachol können in 6 gesehen werden. Verhältnisse (6B) und Intensitätveränderungen der einzelnen Wellenlängen (6C) sind für zwei Zellen dargestellt, die verschiedene Spiegel der Sonde exprimieren. In guter Übereinstimmung mit den in vitro-Eigenschaften des Indikators wurden Carbachol-induzierte Oszillationen von freiem zellulären Calcium leicht durch das bildgebende Verfahren gemessen, mit wiederholten Zyklen von reziproken Intensitätsveränderungen von CFP und Citrine. Das bildgebende Messen zeigte sich dynamisch und reproduzierbar, und es war kein Problem, Rmax und Rmin zu erhalten. TN-L15 war auch in Primärkulturen von hippocampalen Neuronen aus Ratte funktionell (8). Antworten auf Glutamatstimulation und Depolarisierung mit 100 mM KCl werden in 8b gesehen. Eine Antwort von HEK293-Zellen, die TN-humTnC exprimieren, wird in 7B gezeigt. Maximale Verhältnisänderungen innerhalb der Zellen waren 100% für TN-L15 und 70% für TN-humTnC, in Übereinstimmung mit den in vitro-Werten der Indikatoren. Als Vergleich war die maximale Verhältnisänderung, die mit Yellow Cameleon 2.1 auf unserem Messaufbau erhältlich war, 70% (Daten nicht gezeigt).
  • BEISPIEL 4: SUBZELLULÄRES ZIELRICHTEN VON TNC-BASIERENDEN INDIKATOREN UND FUNKTIONALITÄT SOLCHER KONSTRUKTE
  • Als nächstes wollten wir die Zielrichtungseigenschaften unserer neuen Indikatoren innerhalb von Zellen auswerten. Im Prinzip ist es ein großes Leistungsvermögen von genetischen Sonden, das sie an zelluläre Organellen und Mikroumgebungen mit der Präzision der Molekularbiologie zielgerichtet werden können. Obwohl sie sehr attraktiv sind, wurden vorher keine funktionellen Markierungen von Membranen, prä- oder postsynaptischen Strukturen oder Calciumkanälen berichtet. Unserer Erfahrung nach waren diese Arten von Zielrichtungen nicht funktionell, wenn sie mit Calmodulin-basierenden Indikatoren durchgeführt wurden (O. Griesbeck, unveröffentlichte Beobachtungen und 10, 11). Wir verwendeten daher die Membranankersequenz von c-Ha-Ras, um TN-L 15 an die Membran zielzurichten (9). Das Zielrichten wurde durch Zufügen der Membran-Ankersequenz von c-Ha-Ras an den C-Terminus von TN-L15 erreicht. Ein Schema des Konstrukts ist in 9 dargestellt. Wenn es in 293-Zellen exprimiert wurde, war ein ringförmiges Markieren der Plasmamembran offensichtlich (9A). Für das bildgebende Verfahren definierten wir kleine Regionen, die den Umrissen der Membran folgten. Membrangebundenes TN-L15 antwortete leicht auf Agonisten-induzierte Anstiege in cytosolischem Calcium, und besaß den selben dynamischen Bereich wie in der cytosolischen Expression (9B). Wenn es in hippocampalen Neuronen exprimiert wurde, war TN-L15-Ras nach Stimulationen mit hohem Kalium gesättigt, vermutlich auf Grund seiner nahen Nachbarschaft zu Calciumkanälen in der Plasmamembran (9C, D). 11 zeigt einen Vergleich von Membran-Zielrichten von TN-L15 und Yellow Cameleon 2.1 (YC2.1), unter Verwendung der Membran-Zielrichtungssequenz von GAP43. Die 20 N-terminalen Aminosäurereste von GAP43 wurden auf identische Weise an den N-Terminus von TN-L15 oder YC2.1 zugefügt, um ein Zielrichten an die Plasmamembran zu erreichen. Die Funktionalität dieser Konstrukte wurde in 293-Zellen getestet. A. Verlauf des bildgebenden Verfahrens mit GAP43-TN-L15. Lang andauernde Calciumoszillationen nach Stimulation mit Carbachol sind sichtbar. Am Schluss bestätigte eine Kalibrierung mit Ionomycin/10 mM CaCl2 und Ionomycin/20 μM EGTA, um Rmax und Rmin zu erhalten, dass der Indikator seinen vollen dynamischen Bereich und volle Funktionalität besaß, wenn er an die Plasmamembran zielgerichtet wurde. Im Kontrast dazu arbeitete GAP43-YC2.1 schlecht unter identischen Bedingungen, wie in 11B gesehen. Keine Oszillationen waren nachweisbar, und auch eine Kalibrierung mit Ionomycin zeigte einen verminderten dynamischen Bereich, was andeutet, dass der Indikator signifikante Merkmale seiner Calcium bindenden Eigenschaften auf dem Weg zur Membraninsertion verloren hatte. In einem anderen Vergleich der Eigenschaften zum Zielrichten verwendeten wir eine Fusion von TN-L15 und Yellow Cameleon 2.3 (YC2.3) an das präsynaptische Protein Synaptobrevin (10). Fusionen wurden auf identische Weise bei beiden Konstrukten durchgeführt. Fusionskonstrukte wurden auf ihre Funktionalität in 293-Zellen getestet. A. Verlauf des bildgebenden Verfahrens von TN-L15-Synaptobrevin. Gute Antworten auf Stimulation mit Carbachol und Ionomycin waren leicht nachweisbar. B. Verlauf des bildgebenden Verfahrens von YC2.3-Synaptobrevin. Innerhalb des Fusionskonstrukts hatte der Indikator YC2.3 weitgehend seine Calciumsensitivität und Bindungseigenschaften verloren. Keine Antworten auf Carbachol-Stimulation waren zu sehen. Ionomycin rief einen schleppenden Anstieg des Verhältnisses über mehrere Minuten hin hervor, der nicht den wirklichen cytosolischen Anstieg an Calciumspiegeln nach einer Ionomycin-Behandlung widerspiegelt. Der Verlauf, der in B gezeigt wird, ist ein Beispiel ausgewählt aus 9 verschiedenen bildgebenden Experimenten, von denen keines eine Antwort dieser Probe hervorrief. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse klar die Überlegenheit von auf Troponin basierenden Indikatoren, insbesondere unter den experimentellen Bedingungen des Zielrichtens an die Membran.
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Claims (26)

  1. Verändertes Ca2+-bindendes Polypeptid umfassend a) ein erstes Chromophor eines Donor-Akzeptor-Paares zum FREI (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer), b) ein Ca2+-bindendes Polypeptid mit einer Identität von mindestens 80% zu einer 30 Aminosäuren langen Polypeptidsequenz von menschlichem Troponin C oder Skelettmuskel-Troponin C aus Huhn, und c) ein zweites Chromophor eines Donor-Akzeptor-Paares zum FREI.
  2. Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das erste Chromophor ein fluoreszierendes Polypeptid ist, das die Fähigkeit besitzt, als ein Donor-Chromophor in einem Donor-Akzeptor-Paar zum FREI zu dienen, und das zweite Chromophor ein fluoreszierendes Polypeptid ist, das die Fähigkeit besitzt, als ein Akzeptor-Chromophor in einem Donor-Akzeptor-Paar zum FREI zu dienen.
  3. Polypeptid nach Anspruch 2, wobei das veränderte Polypeptid ein Fusions-Polypeptid ist, wobei die Anordnung der drei verbundenen Polypeptide beginnend vom N-Terminus des Fusionspolypeptids a)-b)-c) oder c)-b)-a) ist.
  4. Polypeptid nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3, wobei das erste Chromophor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CFP, EGFP, YFP, DsFP 483, AmCyan, Azami-Green und As499, insbesondere wobei das erste Chromophor CFP ist.
  5. Polypeptid nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4, wobei das zweite Chromophor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus YFP, DsRed, zFP 538, HcRed, EqFP 611 und AsFP 595, insbesondere wobei das zweite Chromophor YFP ist.
  6. Polypeptid nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Ca2+-bindende Polypeptid mindestens eine Ca2+-bindende EF-Hand umfasst.
  7. Polypeptid nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Ca2+-bindende Polypeptid eine Polypeptidsequenz umfasst, die mindestens 60% Identität zu den Aminosäuren 15 bis 163 von Skelettmuskel Troponin C aus Huhn oder Aminosäuren 1 bis 161 von humanem Herz-Troponin C besitzt.
  8. Polypeptid nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 7, weiterhin umfassend Glycin-reiche Linkerpeptide N-terminal oder C-terminal zum Polypeptid b).
  9. Polypeptid nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 8, weiterhin umfassend ein Lokalisationssignal, insbesondere eine Kern-Lokalisationssequenz, eine Kern-Exportsequenz, eine Lokalisationssequenz für das endoplasmatische Reticulum, eine Peroxisomen-Lokalisationssequenz, eine mitochondriale Importsequenz, eine mitochondriale Lokalisationssequenz, eine Sequenz zum Zielrichten an die Zellmembran, am meisten bevorzugt eine Sequenz zum Zielrichten an die Zellmembran, die eine Lokalisation an prä- oder postsynaptische Strukturen vermittelt.
  10. Polypeptid nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 9, das eine Verhältnisänderung (ratio change) bei Zugabe von Ca2+ von mehr als 30%, bevorzugt von 50% bis 200%, weiter bevorzugt von 80% bis 180%, und am meisten bevorzugt von 100% bis 150% aufweist.
  11. Polypeptid nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 10, das einen Kd für Ca2+ von 50 nM bis 400 μM, bevorzugt von 100 nM bis 100 μM und am meisten bevorzugt von 250 nM bis 35 μM besitzt.
  12. Polypeptid nach Anspruch 3, ausgewählt aus einem beliebigen der Polypeptide von SEQ ID Nr. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 oder 18, bevorzugt 2 oder 4.
  13. Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid nach Ansprüchen 3 bis 12 kodiert, bevorzugt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 oder 3.
  14. Expressionsvektor enthaltend das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 13, bevorzugt weiterhin umfassend Expressions-Kontrollsequenzen, die mit einer Nukleinsäure funktionell verbunden sind, die ein Polypeptid nach Ansprüchen 3 bis 12 kodiert.
  15. Wirtszelle, insbesondere eine Säuger-, nicht-humane Zelle, innerhalb oder außerhalb des tierischen Körpers oder eine humane Zelle außerhalb des menschlichen Körpers, umfassend ein Polypeptid nach Ansprüchen 3 bis 12 und/oder eine Nukleinsäure nach Anspruch 13 und/oder einen Expressionsvektor nach Anspruch 14.
  16. Transgenes Tier umfassend ein Polypeptid nach Ansprüchen 3 bis 12 und/oder eine Nukleinsäure nach Anspruch 13 und/oder einen Expressionsvektor nach Anspruch 14 und/oder eine Wirtszelle nach Anspruch 15.
  17. Verfahren zum Nachweis von Veränderungen der lokalen Ca2+-Konzentration, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellen einer Zelle oder einer subzellulären membranhaltigen Fraktion einer Zelle, umfassend ein Ca2+-bindendes Polypeptid nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 12; und b) Hervorrufen einer Veränderung der lokalen Ca2+-Konzentration; und c) Messen von FREI zwischen dem Donor- und dem Akzeptor-Chromophor des Donor-Akzeptor-Paares des Polypeptids nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 12, was eine Veränderung der lokalen Ca2+-Konzentration anzeigt.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Zelle von Schritt a) eine Wirtszelle nach Anspruch 15 ist.
  19. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die subzelluläre membranhaltige Fraktion eine Organelle, insbesondere ein Mitochondrium, ein Peroxisom oder ein Kern, oder eine Membranfraktion abgeleitet aus einer membrangebundenen Organelle, insbesondere abgeleitet aus der Zellmembran, ist.
  20. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Ca2+-bindende Polypeptid an die innere Oberfläche der Zellmembran zielgerichtet wird.
  21. Verfahren nach Anspruch 17, wobei Schritt b) durch Verabreichen eines extrazellulären Stimulus ausgeführt wird, insbesondere durch Zufügen einer kleinen chemischen Substanz oder eines Polypeptids an die extrazelluläre Seite der Wirtszelle.
  22. Verfahren zum Nachweis des Bindens einer kleinen chemischen Substanz oder eines Polypeptids an ein Ca2+-bindendes Polypeptid mit einer Identität von mindestens 80% zu einer 30 Aminosäuren langen Polypeptidsequenz von humanem Troponin C oder Skelettmuskel-Troponin aus Huhn, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellen eines Ca2+-bindenden Polypeptids nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 12; und b) Zufügen einer kleinen chemischen Substanz, die auf Binden getestet werden soll, oder eines Polypeptids, das auf Binden getestet werden soll; und c) Bestimmen des Grades des Bindens durch Messen von FREI zwischen dem Donor- und dem Akzeptor-Chromophor des Donor-Akzeptor-Paares des Polypeptids nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 12.
  23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Ca2+-bindende Polypeptid von humanem Troponin C abgeleitet ist, und insbesondere SEQ ID Nr. 4 ist.
  24. Ex vivo-Verwendung eines Polypeptids nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 12 zum Nachweis von Veränderungen der lokalen Ca2+-Konzentration nahe einer Zellmembran.
  25. Verwendung nach Anspruch 24, wobei das Polypeptid ein Polypeptid gemäß Anspruch 9 ist und insbesondere eine Sequenz zum Zielrichten an die Zellmembran umfasst, am meisten bevorzugt eine Sequenz zum Zielrichten an die Zellmembran, die eine Lokalisation an die Zellmembran von prä- oder postsynaptischen Strukturen vermittelt.
  26. Verwendung eines Polypeptids nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 12 zur Zubereitung einer diagnostischen Zusammensetzung zum Nachweis von Veränderungen der lokalen Ca2+-Konzentration nahe einer Zellmembran.
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US8232451B1 (en) 2011-02-15 2012-07-31 Yorktown Technologies, L.P. Blue transgenic fluorescent ornamental fish
US8232450B1 (en) 2011-02-15 2012-07-31 Yorktown Technologies, L.P. Purple transgenic fluorescent ornamental fish
US8975467B2 (en) 2012-06-12 2015-03-10 Yorktown Technologies, L.P. Green transgenic fluorescent ornamental fish
US9392776B2 (en) 2012-07-26 2016-07-19 Yorktown Technologies, L.P. Green transgenic fluorescent ornamental fish
US8987546B2 (en) 2012-11-06 2015-03-24 Yorktown Technologies, L.P. Orange transgenic fluorescent ornamental fish
US9587230B2 (en) 2013-09-05 2017-03-07 Tempo Bioscience, Inc. Human calcium binding domain biosensors
US9282729B2 (en) 2014-01-31 2016-03-15 Yorktown Technologies, L.P. Purple transgenic fluorescent ornamental fish
US9380768B2 (en) 2014-01-31 2016-07-05 Yorktown Technologies, L.P. Red transgenic fluorescent ornamental fish
US9363986B2 (en) 2014-01-31 2016-06-14 Yorktown Technologies, L.P. Orange transgenic fluorescent ornamental fish
US9295238B2 (en) 2014-01-31 2016-03-29 Yorktown Technologies, L.P. Pink transgenic fluorescent ornamental fish
WO2016011399A1 (en) * 2014-07-17 2016-01-21 Robinson John M Artificial troponin complex
US9968077B2 (en) 2014-11-07 2018-05-15 Glofish Llc Blue transgenic fluorescent ornamental fish
AU2018265070B2 (en) * 2017-05-11 2021-06-24 Medizinische Universität Graz Genetically encoded potassium ion indicators
EP3882632A1 (de) * 2020-03-18 2021-09-22 Universite De Bordeaux Neuartige ionenleitende kanalfusionuntereinheiten und verfahren zur verwendung davon

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002253261A (ja) * 2001-03-05 2002-09-10 Inst Of Physical & Chemical Res 蛍光タンパク質
JP3829252B2 (ja) * 2001-06-08 2006-10-04 独立行政法人理化学研究所 蛍光蛋白質

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