DE602004013361T2

DE602004013361T2 - Mittel und verfahren zur in-vitro-bestimmung von camp

Info

Publication number: DE602004013361T2
Application number: DE602004013361T
Authority: DE
Inventors: Viacheslav Nikolaev; Moritz BÜNEMANN; Martin J. Lohse
Original assignee: BAYERISCHE JULIUS MAXIMILIANS; Julius Maximilians Universitaet Wuerzburg
Current assignee: BAYERISCHE JULIUS MAXIMILIANS; Julius Maximilians Universitaet Wuerzburg
Priority date: 2003-11-26
Filing date: 2004-11-26
Publication date: 2009-05-20
Anticipated expiration: 2024-11-27
Also published as: DE602004013361D1; US20080286760A1; CA2547456A1; EP1687441A1; JP2007515160A; US8889425B2; ATE393237T1; ES2305906T3; CA2547456C; EP1687441B1; JP5296986B2; EP1536020A1; WO2005052186A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein chimäres Peptid, umfassend eine cAMP-Bindeeinheit, die nur eine cAMP-Bindestelle und mindestens zwei nachweisbare Markierungen aufweist, wobei die erste der zwei nachweisbaren Markierungen am Carboxy-Terminus und die zweite der zwei nachweisbaren Markierungen am Amino-Terminus der cAMP-Bindeeinheit lokalisiert ist. Das chimäre Peptid der Erfindung ist besonders nützlich bei/für der/die direkte/n Bestimmung von cAMP-Konzentration(en) in vitro und/oder in vivo. Des Weiteren sind Nucleinsäuremoleküle beschrieben, die diese chimären Proteine codieren, ebenso wie Vektoren und Wirtszellen, welche diese umfassen. Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Herstellung des chimären Proteins der Erfindung bereit sowie Verfahren zur Identifizierung und zum Screenen von Molekülen oder Verbindungen, die in der Lage sind, die Bindung von cAMP an das chimäre Peptid der Erfindung oder die biologische und/oder pharmakologische Funktion von Adenylcyclasen oder Phosphodiesterasen zu modifizieren. Außerdem wird ein Verfahren zur Bestimmung von cAMP in einer Probe und ein Verfahren zum Nachweis von cAMP in der lebenden Zelle oder in lebendem Gewebe beschrieben. Schließlich wird ein Kit offenbart, der die Verbindungen der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die Bereitstellung eines Signals über die Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) kann viele zelluläre Reaktionen auslösen, die von der Regulation intrazellulärer Spiegel von cAMP zur Stimulierung der Gentranskription reichen. Die Mitglieder dieser Rezeptorfamilie sind in Abhängigkeit von den jeweiligen G-Protein-Subtypen, mit denen sie vorwiegend interagieren, in verschiedene Kategorien eingruppiert worden. So stimulieren Rezeptoren, die an Gs-Proteine koppeln, in vielen Zellen Adenylatcyclase, wohingegen an G_q/11 gekoppelte Rezeptoren über die Aktivierung von Phospholipase C intrazelluläres Ca²⁺ mobilisieren können. Eine Vielzahl von physiologischen Signalen wie z. B. Neurotransmitter, Hormone und Licht wird von Mitgliedern der Familie der Sieben-Transmembrandomänen-Rezeptoren erfasst. Diese G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) aktivieren G-Proteine, indem sie die Bindung von GTP im Austausch für GDP fördern. Sowohl Gα- als auch Gβγ-Untereinheiten aktivierter G-Proteine regulieren stromabwärts gelegene Effektoren wie z. B. Adenylylcyclasen, Phospholipasen oder Ionenkanäle.
Genzerstörungs-Studien haben gezeigt, dass die durch Ca²⁺ stimulierten Adenylylcyclasen AC1 und AC8 für bestimmte Formen der synaptischen Plastizität wichtig sind, wozu die Langzeit-Potenzierung ebenso wie die Bildung des Langzeitgedächtnisses (LTM) gehören. Man hat die Hypothese aufgestellt, dass diese Enzyme für LTM erforderlich sind, um die erhöhte Expression einer Familie von Genen zu fördern, die durch den transkriptionellen Reaktionsweg des cAMP/Ca²⁺-Response Element bindenden Proteins/des cAMP-Response-Elements reguliert werden. Im Gegensatz zu AC1 und AC8 handelt es sich bei AC3 um eine durch Ca²⁺ inhibierte Adenylylcyclase, die eine entscheidende Rolle bei der olfaktorischen Signalübertragung spielt. Eine Kopplung der Geruchsrezeptoren an AC3 stimuliert vorübergehende cAMP-Pulse, die als hauptsächliche sekundäre Botenstoffe für die Bereitstellung olfaktorischer Signale fungieren. Diese vorübergehenden cAMP-Pulse werden mindestens zum Teil durch Ca²⁺-Inhibition von AC3 ausgelöst, welche durch die Calmodulin-abhängige Proteinkinase II vermittelt wird. Die einzigartige Struktur und die besonderen regulatorischen Eigenschaften dieser Adenylylcyclasen machen diese zu attraktiven Arzneistoff-Zielstellen für die Modulierung einer Reihe von physiologischen Prozessen, wozu die Gedächtnisbildung und der Geruchssinn gehören. (Hongbing Wang und Daniel R. Storm. Calmodulin-Regulated Adenylyl Cyclases: Cross-Talk and Plasticity in the Central Nervous System. Mol. Pharmacol. Band 63, Heft 3, 463–468, März 2003; Miles D. Houslay und David R. Adams. PKA-mediated activation of PDE4, ERK mediated phosphorylation inhibits PDE4. Biochem. J. 370: 1–18 (2003); Donald H. Maurice, Daniel Palmer, Douglas G. Tilley, Heather A. Dunkerley, Stuart J. Netherton, Daniel R. Raymond, Hisham S. Elbatamy und Sandra L. Jimmo. Cyclic Nucleotide Phosphodiesterase Activity, Expression, and Targeting in Cells of the Cardiovascular System. Mol. Pharmacol. 64: 533–546 (2003).
Cyclisches AMP ist ein ubiquitärer intrazellulärer sekundärer Botenstoff, der Information auf mehrere Proteine überträgt, wozu durch cyclische Nucleotide gesteuerte Ionenkanäle, Proteinkinase A (PKA) und EPAC gehören. Diese Effektoren regulieren wiederum so unterschiedliche zelluläre Funktionen wie den Einstrom von Ca²⁺, die Erregbarkeit und Genexpression, ebenso wie Zell-spezifische Prozesse wie z. B. Glycogenolyse und Lipolyse. Die Enzyme, von denen man weiß, dass sie cAMP-Spiegel regulieren, Adenylylcyclase und Phosphodiesterase, sind eingehend untersucht worden (Hepler, J. R., Gilman, A. G. G proteins. Trends Biochem. Sci. 17 (10): 383–7 (Okt 1992); Exton, J. H. Regulation of phosphoinositide phospholipases by hormones, neurotransmitters, and other agonists linked to G proteins. Annu Rev Pharmacol. Toxicol. 36: 481–509 (1996); Beavo, J. A., Brunton, L. L. Cyclic nucleotide research-still expanding alter half a century. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3 (9): 710–8 (Sep 2002); Ishikawa, Y. Isoform-targeted regulation of cardiac adenylyl cyclase. Cardiovasc. Pharmacol. 41: 1–4 (2003)).
Abgesehen von Calcium gilt cAMP als ein universeller Mediator (sekundärer Botenstoff) für intracelluläre Signale einer Vielfalt von G-gekoppelten Rezeptoren, von denen man weiß, dass sie eine wichtige Rolle für biologische Prozesse spielen, wie Stoffwechsel, Zellwachstum und -migration, Immunabwehr oder Kontraktion von Myokardzellen (McKnight GS, Cummings DE, Amieux PS, Sikorski MA, Brandon EP, Planas JV, Motamed K, Idzerda RL. Recent Prog Horm Res. 1998; 53: 139–59; 160–1; Prasad KN, Cole WC, Yan XD, Nahreini P, Kumar B, Hanson A, Prasad JE. Defects in cAMP-pathway may initiate carcinogenesis in dividing nerve cells: A review. Apoptosis. 2003 Dec; 8 (6): 579–86; Torgersen KM, Vang T, Abrahamsen H, Yaqub S, Taksen K. Molecular mechanisms for protein kinase A-mediated modulation of immune function. Cell Signal. 2002 Jan; 14 (1): 1–9; Bailey CH, Bartsch D, Kandel ER Toward a molecular definition of long-term memory storage. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Nov 26; 93 (24): 13445–52; Wang H and Storm DR Calmodulin-Regulated Adenylyl Cyclases: Cross-Talk and Plasticity in the Central Nervous System Mol. Pharmacol. Vol. 63, Issue 3, 463–368, March 2003 Evans DB. Modulation of cAMP: mechanism for positive inotropic action. J Cardiovasc Pharmacol. 1986; 8 Suppl 9: S22–9).
Bis vor fünf Jahren glaubte man, dass Proteinkinase A (PKA) der einzige Effektor von cAMP sei. 1998 wurde die EPAC (direkt durch cAMP aktivierter Austauschfaktor)-Familie entdeckt, deren cAMP-Bindungsdomänen ein hohes Maß an Homologie zur Domäne B der regulatorischen Untereinheit von PKA zeigen (de Rooij, J. et al., EPAC is a RAP1 guanine-nucleotide-exchange factor directly activated by cyclic AMP. Nature 396: 474–477 (1998)). In den letzten Jahren konnten viele der Wirkungen von cAMP, die man früher als PKA-abhängig betrachtet hatte, der Aktivierung von EPAC zugeschrieben werden, was dieses Protein als ein weiteres wichtiges Ziel von cAMP in der Zelle charakterisierte (Bos, J. L., EPAC: a new cAMP target and new avenues in cAMP research. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 4 (9): 733–738 (2003)). Im Januar 2003 wurde die Struktur der cAMP-Bindungsdomäne von EPAC2 veröffentlicht (Rehmann, H. et al., Structure and regulation of the cAMP binding domains of EPAC2. Nat. Struct. Biol. 10 (1): 26–32 (2003)). Die kristallographischen Daten deuteten auf eine starke cAMP-abhängige Konformationsänderung hin, die wie man sagt zu einer Veränderung des Abstands zwischen der α-Helix-4 und 6:B führen soll.
EAC-Proteine werden in verschiedenen Geweben exprimiert, wozu Gehirn, Nebenniere, Niere, Herz, Eierstock, Schilddrüse, Milz, Rückenmark, Lunge, Leber und Bauchspeicheldrüse gehören (Kawasaki, H., Springett, G. M., Mochizuki, N., Toki, S. Nakaya, M., Matsuda, M., Housman, D. E., Graybiel, A. M. A family of cAMP-binding proteins that directly activate Rap1. Science 282 (5397): 2275–9 (18. Dez. 1998); Ueno, H., Shibasaki, T., Iwanaga, T., Takahashi, K., Yokoyama, Y., Liu, L. M., Yokoi, N., Ozaki, N., Matsukura, S., Yano, H., Seino, S. Characterisation of the gene EPAC2: structure, chromosomal localization, tissue expression, and identification of the liver-specific isoform. Genomics 78 (1–2): 91–8 (Nov. 2001)).
Man hat festgestellt, dass EPAC Integrin-Proteine reguliert, die eine wichtige Rolle bei der Zelladhäsion spielen, z. B. von einigen Tumorzellen, B-Zellen und bei der Migration von Lymphocyten (Kinbara, K. et al., Ras GTPase integrins: friends or foes? Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 4 (10): 767–776 (2003)). Des Weiteren wird die Sekretion von Insulin in den β-Zellen der Bauchspeicheldrüse durch EPAC2 und Nyanodin-empfindliche Kanäle gesteuert (Ozaki, N., Shibasaki, T., Kashima, Y., Miki, T., Takahashi, K., Ueno, H., Sunaga, Y., Yano, H., Matsuura, Y., Iwanaga, T., Takai, Y., Seino, S. cAMP-GEFII is a direct target of cAMP in regulated exocytosis. Nat. Cell. Biol. 2 (11): 805–11 (Nov 2000); Kang, G., Joseph, J. W., Chepurny, O. G., Monaco, M., Wheeler, M. B., Bos, J. L., Schwede, F., Genieser, H. G., Holz, G. G. EPAC-selective cAMP analog 8-pCPT-2'-O-Me-cAMP as a stimulus for Ca²⁺-induced Ca²⁺ release and exocytosis in pancreatic beta-cells. J. Biol. Chem. 278 (10): 8279–85 (7. März 2003)). Darüber hinaus reguliert EPAC die ERK (extrazelluläre Signal-regulierte Kinase)-Kaskade, die für die Proliferation von Zellen von besonderer Bedeutung ist (Fujita, T., Meguro, T., Fukuyama, R., Nakamuta, H., Koida, M. New signaling pathway for parathyroid hormone and cyclic AMP action an extracellular-regulated kinase and cell Proliferation in bone cells. Checkpoint of modulation by cyclic AMP. J. Biol. Chem. 277 (25): 22191–22200 (21. Jun. 2002); Lin, S. L., Johnson-Farley, N. N., Lubinsky, D. R., Cowen, D. S. Coupling of neuronal 5-HT7 receptors to activation of extracellular-regulated kinase through a protein kinase A-independent pathway that can utilize EPAC. J. Neurochem. 87 (5): 1076–85 (Dez. 2003)). Außerdem spielt EPAC1 möglicherweise eine Rolle bei der Mitose (Qiao, J, Mei, F. C., Popov, V. L., Vergana, L. A., Cheng, X. Cell-cycle-dependent subcellular localization of exchange factor directly activated by cAMP. J. Biol. Chem. 277 (29): 26581–6 (19. Jul. 2002)). Schließlich stellt die Regulation der Kalium-Kanäle in Nierenzellen ebenfalls eine wichtige Funktion von EPAC dar (Laroche-Joubert, N., Marsy, S., Michelet, S., Imbert-Teboul, M., Doucet, A. Protein kinase A-independent activation of ERK and H,K-ATPase by cAMP in native kidney cells: role of EPAC I. J. Biol. Chem. 277 (21): 18598–604 (24. Mai 2002)).
Im Hinblick auf die Bedeutung des sekundären Botenstoff-Systems von cAMP hat man mehrere in vitro-Ansätze entwickelt, um die cAMP-Spiegel zu bestimmen. Einige dieser Assays sind auf (Anti-cAMP-)Antikörpern beruhende Techniken wie z. B. der Radioimmunassay (RIA), bei dem es sich um ein Verfahren zum indirekten Nachweis von cAMP handelt (Kariv, I. I., Stevens, M. E., Behrens, D. L., Oldenburg, K. R. High Throughput Quantitation of cAMP Production Mediated by Actviation of Seven Transmembrane Domain Receptors. J. Biomol. Screen. 4 (1): 27–32 (1999)). Ein RIA ist jedoch zeitaufwändig und erfordert teure radioaktive Materialien. Darüber hinaus lässt sich ein RIA nicht für Anwendungen in lebenden Zellen und Geweben einsetzen. Man hat auch kompetitive in vitro-Immunoassays mit hoch-affinen Anti-cAMP-Antikörpern angewandt, um cAMP nachzuweisen oder zu bestimmen (Golla, R., Seethala, R. A homogeneous enzyme fragment complementation cyclic AMP screen for GPCR agonists. J. Biomol. Screen. 7 (6): 515–25 (Dez. 2002); Gabriel, D., Vernier, M., Pfeifer, M. J. et al. High throughput Screening technologies for Direct cyclic AMP Measurements. ASSAY and Drug Development Technologies 1 (2): 291–303 (2003); Sportsman, J. R., Daijo, J., Gaudet, E. A. Fluorescence polarization assays in signal transduction discovery. Comb. Chem. High Throughput Screen. 6 (3): 195–200 (Mai 2003)). Dieses Verfahren umfasst die Zugabe von Anti-cAMP-Antikörpern zu Zelllysaten, die cAMP enthalten. Die Bindung von Anti-cAMP-Antikörper an cAMP führt entweder zu einer Aktivierung eines Enzyms, das eine fluoreszierende/chemilumineszierende Verbindung aktiviert (z. B. der cAMP-screen^TM-Assay, der Hit Hunter^TM Enzyme Fragment Complementation Assay, das cyclic AMP EIA-Kit), zum Abbau eines fluoreszierenden Komplexes (der Alpha Screen^TM Assay) oder zu einer Veränderung der Polarisierung der Fluoreszenz von Fluoreszenz-markierten Indikatorsubstanzen (Fluorescent Polarization cAMP Assay) (Golla, R., Seethala, R. A homogeneous enzyme fragment complementation cyclic AMP screen for GPCR agonists. J. Biomol. Screen. 7 (6): 515–25 (Dez. 2002); Gabriel, D., Vernier, M., Pfeifer, M. J. et al. High throughput Screening technologies for Direct cyclic AMP Measurements. ASSAY and Drug Development Technologies 1 (2): 291–303 (2003); Sportsman, J. R., Daijo, J., Gaudet, E. A. Fluorescence polarization assays in signal transduction discovery. Comb. Chem. High Throughput Screen. 6 (3): 195–200 (Mai 2003)). Wie erwähnt sind die vorstehenden Verfahren jedoch nur für den in vitro-Nachweis von cAMP geeignet.
Um zu versuchen, Verfahren zu entwickeln, die das Verfolgen von cAMP in vivo ermöglichen, hat man einige begrenzte Ansätze verfolgt, um auf Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET)-basierende Testsysteme einzusetzen, die cAMP-bindende Proteine wie z. B. das bakterielle cAMP-Rezeptor-Protein oder PKA benutzen. In diesen Systemen verwendet man Fluoreszenzresonanz-Energietransfer zwischen fluoreszierenden Proteinen (blaugrün fluoreszierendes Protein (CFP) und gelb fluoreszierendes Protein (YFP)), die in ein DNA-Fragment eingesetzt sind, das an bakterielle cAMP-Rezeptorproteine (in vitro Bridge IT Assay; http://www.biocompare.com/itemdetails. asp?List=2263,173277) oder an Proteinkinase A (PKA) bindet (Zaccolo et al., Nat. Cell. Biol. 2(1): 25–29 (Jan 2000)).
Bis heute ist allerdings nur das vorstehend beschriebene PKA-Verfahren in der Lage, die Aktivierung der Signalkaskade von cAMP in einer lebenden Zelle nachzuweisen. Kurz gesagt hat man diesen Sensor für cAMP hergestellt, indem man die katalytischen (C) Untereinheiten von PKA an GFP genetisch gekoppelt hat und die regulatorische (R) Untereinheit von PKA an die blaue Variante von GFP (EBFP). GFP und EBFP zeigen spektrale Eigenschaften, die sie zu einem geeigneten Paar für FRET machten. Durch Messen der FRET-Veränderungen war es möglich, die cAMP-Veränderungen in Einzelzellen zu verfolgen. Obgleich diese neue Methodik für die zeitliche und räumliche Auflösung der cAMP/PKA-Signalgebung geeignet ist, weist dieser Ansatz einige wesentliche Nachteile auf. Zum Beispiel besitzt der Sensor, der für den PKA-Prozess verwendet wird, aufgrund der katalytischen Untereinheiten von PKA katalytische Aktivität und greift daher in verschiedene intrazelluläre Prozesse ein. Zum Beispiel hat man die Induktion von Apoptose beobachtet (Myklebust, J. H., Josefsen, D., Blomhoff, H. K., Levy, F. O., Naderi, S., Reed, J. C., Smeland, E. B. Activation of the cAMP signalling pathway increases apoptosis in human B-precursor cells and is associated with downregulation of Mcl-1 expression. J. Cell Physiol. 180 (1): 71–80 (Jul. 1999)). Demnach können viele Zellen erhöhte PKA-Aktivität nicht tolerieren und sterben sogar, wenn PKA überexprimiert wird. Darüber hinaus ist es auf dem Fachgebiet gut beschrieben, dass die katalytische Aktivität von PKA eine PKA-vermittelte Desensibilisierung auslöst, die zu einer raschen Abnahme der cAMP-Konzentration führt (Houslay, M. D., Adams, D. R. PDE4 cAMP phosphodiesterases: modular enzymes that orchestrate signalling cross-talk, desensitization and compartmentalization. Biochem. J. 370 (Pt 1): 1–18 (15. Feb. 2003); Conti, M., Richter, W., Mehats, C., Livera, G., Park, J. Y., Jin, C. Cyclic AMP specific PDE4 phosphodiesterases as critical components of cyclic AMP signalling. J. Biol. Chem. 278 (8): 5493–6 (21. Feb. 2003); Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. Regulation of G protein receptor kinases and arrestins during receptor desensitization. Mol. Pharmacol. 63 (1): 9–18 (Jan. 2003)). Des Weiteren besteht der PKA-Sensor aus zwei relativ großen Proteinen, die einzeln markiert werden müssen. Diese Proteine müssen in gleichen Konzentrationen exprimiert werden, um cAMP- Konzentrationen zu quantifizieren. Schließlich enthält PKA vier Bindestellen für cAMP mit verschiedenen Affinitätsstufen, wobei die Bindung von cAMP auf eine komplexe kooperative Weise erfolgt. Somit ist die genaue Quantifizierung der cAMP-Spiegel aufgrund der kooperativen Bindung von cAMP kompliziert. Darüber hinaus müssen alle der vier Bindestellen von cAMP gebunden sein um den PKA-Sensor zu aktivieren, was eine Verzögerung des Signals zur Folge hat.
Wegen dieser Nachteile der cAMP-Assays, die auf dem Fachgebiet beschrieben sind, besteht ein Bedarf für Mittel und Verfahren um eine neue Generation von cAMP-Sensoren bereitzustellen, die verbesserte Eigenschaften aufweisen, wie z. B. Sensitivität, Affinität und Nachweisbarkeit, und die eine optische cAMP-Bestimmung in vitro in Echtzeit ermöglichen. Solche Messungen sind durch Verfahren aus dem Stand der Technik nicht bereitgestellt worden oder sind noch nicht zugänglich.
Das technische Problem wird durch die Bereitstellung der Ausführungsformen gelöst wie sie in den Ansprüchen charakterisiert sind.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein chimäres Peptid, umfassend eine cAMP-Bindeeinheit mit nur einer cAMP-Bindestelle und mindestens zwei nachweisbaren Markierungen, wobei eine erste der zwei nachweisbaren Markierungen am Carboxyterminus lokalisiert ist und eine zweite der zwei nachweisbaren Markierungen am Amino-terminus der cAMP-Bindeeinheit lokalisiert ist. Der Begriff „chimäres Peptid" bezieht sich gemäß dieser Erfindung auf ein proteinhaltiges Fusionskonstrukt, umfassend eine cAMP-Bindeeinheit mit einer einzelnen cAMP-Bindestelle und zwei nachweisbaren Markierungen wie hierin beschrieben. Das erfindungsgemäße chimäre Peptid/Konstrukt ist besonders nützlich bei der direkten Bestimmung von cAMP-Konzentrationen in vitro.
Die Bindung von cAMP induziert eine Konformationsänderung in den cAMP-Bindungsdomänen von EPAC2 (Rehmann, H. et al., Structure and regulation of the cAMP binding domains of EPAC2. Nat. Struct. Biol. 10 (1): 26–32 (2003)). Basierend auf diesem Hinweis haben die Erfinder untersucht, ob diese Konformationsänderung in den cAMP-Bindungsdomänen dazu verwendet werden kann, eine neue Generation von cAMP-Sensoren herzustellen, die eine verbesserte Sensitivität, Affinität und Nachweisbarkeit aufweisen, und die eine optische cAMP-Bestimmung in Echtzeit in vitro und/oder in vivo ermöglichen. Hierzu ist ein neuer monomolekularer cAMP-Sensor entwickelt worden, indem man die cAMP-Bindungsdomänen mit Fluorophoren flankierte. Man vermutete, dass diese Konformationsänderung der cAMP-Bindeeinheit auf die Bindung von cAMP hin eine Veränderung des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers (FRET) zwischen den Fluorophoren hervorrufen sollte, d. h. einen intramolekularen FRET. In einer ersten Serie von Experimenten hat man chimäre Peptide untersucht, in denen sowohl die cAMP-bindende Domäne A als auch B von Proteinkinase A oder EPAC2 zwischen zwei Varianten des grün fluoreszierenden Proteins (EYFP und ECFP) eingesetzt waren. Auf Aktivierung der cAMP-Signalgebung hin oder durch Zugabe von cAMP schafften es diese Konstrukte in Zellen, die diese exprimierten, jedoch nicht, eine FRET-Veränderung zu bewirken. Überraschenderweise und im Gegensatz zur Lehre des Stands der Technik zeigten chimäre Peptide, die nur eine cAMP-Bindeeinheit enthielten, die von zwei Fluorophoren am C- und N-Terminus flankiert war, einen raschen FRET-Verlust nach Stimulierung des cAMP-Reaktionswegs oder auf Zugabe von cAMP hin, wie mittels Fluoro metrie in vitro gemessen wurde. Demzufolge hat man, nachdem man die Länge der cAMP-reaktiven Sequenz und die Position der Fluorophore optimiert hatte, mehrere hochempfindliche cAMP-Sensorproteine sowohl für in vitro- als auch für in vivo-Anwendungen erzeugt, wie in den folgenden Beispielen und Figuren gezeigt wird. Die hierin bereitgestellten Fusionskonstrukte (die nur eine einzige cAMP-Bindungsdomäne mit einer cAMP-Bindestelle umfassen) sind hochempfindliche cAMP-Sensoren, die besonders nützlich bei der Bestimmung des Raum-Zeit- und/oder regulatorischer Muster von Rezeptor-vermittelten Reaktionen von cAMP sind. Wie nachstehend und insbesondere in 1 dokumentiert ist, kann diese „einzelne cAMP-Bindungsdomäne" auch durch eine der mindestens zwei nachweisbaren Markierungen unterbrochen/getrennt sein; siehe auch die angefügten SEQ ID NO: 14, 15 oder 20 etc. Die hierin bereitgestellten Konstrukte, „die Einzeldomän-Sensoren" zeigen eine besonders hohe zeitliche Auflösung. Die erfindungsgemäßen Konstrukte basieren auf einer einzelnen cAMP-Bindungsdomäne (die nur eine einzige cAMP-Bindestelle umfasst) und legen eine schnelle Aktivierungsgeschwindigkeit an den Tag, und eignen sich daher für die Messung von cAMP mit dieser hohen zeitlichen und räumlichen Auflösung. Wie nachstehend dokumentiert ist, sind die erfindungsgemäßen Konstrukte nützlich bei der Untersuchung zellulärer Regulationsprozesse und der biologischen Funktion von cAMP in lebenden Zellen. Eine besonders bevorzugte Verwendung der erfindungsgemäßen chimären Konstrukte liegt in der pharmakologischen Forschung und/oder Screening-Ansätzen.
Wie hierin und insbesondere in den Beispielen und Figuren dargestellt, bezieht sich der Begriff „cAMP-Bindeeinheit mit nur einer cAMP-Bindestelle" auf eine cAMP-Bindeeinheit, die ziemlich klein ist (ungefähr 100 bis 200 Aminosäuren, bevorzugt etwa 120 bis 200, am meisten bevorzugt etwa 130 bis 180 Aminosäuren) und die nur eine cAMP-Bindestelle umfasst (umfassend ungefähr 10 bis 20 Aminosäurereste, bevorzugt 12 bis 18 Aminosäurereste und besonders bevorzugt 13 bis 15 Aminosäurereste). Es ist auch vorgesehen, dass die in den erfindungsgemäßen Konstrukten enthaltene cAMP-Bindeeinheit nur eine begrenzte und geringe Zahl zusätzlicher Aminosäurereste neben der darin enthaltenen cAMP-Bindestelle umfasst. Dementsprechend ist es gemäß dieser Erfindung auch vorgesehen, dass eine „cAMP-Einheit" von etwa 20 Aminosäureresten, bevorzugt von etwa 40 Aminosäureresten und am meisten bevorzugt von etwa 50 Aminosäureresten in den hierin bereitgestellten Konstrukten enthalten ist. Die in den Beispielen bereitgestellten, der Veranschaulichung dienenden Konstrukte umfassen eine „cAMP-Bindeeinheit/Bindungsdomäne" von etwa 130 bis 180 Aminosäureresten. Was am wichtigsten ist, das chimäre Konstrukt muss die einzelne „cAMP-Bindestelle" umfassen. Der Veranschaulichung halber zeigt 14 entsprechende cAMP-Bindungsdomänen der der Veranschaulichung dienenden Beispiele, die nur eine cAMP-Bindestelle umfassen.
Demzufolge umfasst die cAMP-Bindungsdomäne, wie sie in einem chimären Peptid/Konstrukt der vorliegenden Erfindung verwendet wird, nur eine cAMP-Bindestelle, was auch vom Fachmann leicht zu erkennen ist. Wie vorstehend angeführt worden ist, umfasst eine bevorzugte cAMP-Bindestelle 10 bis 20 Aminosäuren, stärker bevorzugt 13 bis 15 Aminosäuren. Ein der Veranschaulichung dienendes Beispiel ist auch in 14 gezeigt. Wie nachstehend ausführlich beschrieben wird, kann der Fachmann auch Techniken zur Herleitung von cAMP-Bindeeinheiten und/oder cAMP-Bindestellen einsetzen, welche die Verwendung von Computerprogrammen (wie TBLASTN) und biochemische/biologische Assays wie die Analyse von Restriktionsverdaus, Bindungsassays, Kompetitionsassays und dergleichen beinhalten.
Speziell sind neue monomolekulare cAMP-Sensoren hergestellt worden, die nur eine cAMP-Bindestelle enthalten, in denen an bestimmten Positionen der cDNA der cAMP-Bindungsdomänen von menschlichem EPAC1, Maus-EPAC2 oder der regulatorischen Untereinheit II der Maus-PKA Fluorophore (GFP-Varianten) eingesetzt wurden. Um die Aktivierungskinetik dieser neuen cAMP-Sensorproteine zu untersuchen, wurden Zellen, die stabil Adenosinrezeptor A2B exprimierten, der an das Gs-Protein bindet und die cAMP-Produktion über Adenylylcyclase aktiviert, transient mit Plasmiden transfiziert, welche diese Sensorproteine codierten (Volpini, R., Costanzi, S., Vittori, S., Cristalli, G., Klotz, K. N. Medicinal chemistry and pharmacology of A2B adenosine receptors. Curr. Top. Med. Chem. 3 (4): 427–43 (2003)). Nach Transfektion wurde FRET in einzelnen lebenden Zellen gemessen wie es nachstehend ausführlicher beschrieben ist. Zugabe von Adenosin zu den Zellen führte zu einer Abnahme von FRET zwischen den Fluorophoren, was auf eine cAMP-induzierte Konformationsänderung hindeutete, die zu einer Vergrößerung der Distanz zwischen den Fluorophoren führte.
Fluorophore wie GFP-Varianten zeigen eine zylindrische oder stäbchenförmige Struktur mit einem Durchmesser von 30 Ångström und gelten somit als relativ große Proteine. Man erwartete daher, dass eine Flankierung der einzelnen cAMP-Bindeeinheit durch zwei Fluorophore die Oberfläche diese cAMP-Bindeeinheit abdecken und dadurch eine Interaktion mit cAMP verhindern würde. Hier fand man überraschenderweise, dass die Verwendung zweier GFP-Analoga oder Fluorophore die cAMP-Bindeeinheit nicht einschränkte oder veränderte. Unerwarteterweise war die Einheit immer noch funktionell und ermöglichte sogar ein Testsystem, in dem intramolekulare Bewegungen im Millisekundenbereich verfolgt werden können. Daher stellte man überraschenderweise fest, dass trotz der Tatsache, dass die Größe von selbst einer GFP-Variante (Durchmesser 30 Ångström; Tsien, Ann. Rev. Biochem. 67: 509–544 (1998)) die cAMP-Bindeeinheit abdecken kann, die an zwei GFP-Varianten fusionierte cAMP-Bindeeinheit immer noch in der Lage ist, cAMP zu binden. Demzufolge hat man nicht erwarten können, dass die Herstellung des chimären Peptids wie hierin beschrieben ein durch eine schnelle Kinetik charakterisiertes, funktionelles und zuverlässiges Werkzeug für die direkte Messung von cAMP in vitro gewährleistet.
In Übereinstimmung mit dem Vorstehenden erleichtern die nachweisbaren Markierungen, die in dem chimären Peptid vorhanden sind, den Nachweis einer Konformationsänderung innerhalb des chimären Peptids der Erfindung auf die Bindung von cAMP hin, was wiederum zu einer Veränderung der Energie führt, die von den nachweisbaren Markierungen ausgesendet wird. Somit stellen die chimären Peptide der Erfindung ein monomolekulares Werkzeug bereit, das besonders geeignet ist, um die cAMP-Spiegel in vitro, z. B. in einem Zelllysat direkt zu bestimmen. Zum Beispiel kann das wie vorstehend definierte chimäre Peptid zu einem Zelllysat hinzugegeben werden und man kann die cAMP-Konzentration in dieser Probe durch Aufzeichnen von FRET oder BRET (Biolumineszenz-Resonanz-Energietransfer) messen indem man die Werte der Fluoreszenzemission mit einer Standardkurve vergleicht, die mit definierten Konzentrationen von cAMP erhalten wurde, wie nachstehend ausführlicher dargelegt ist. Die vorliegende Erfindung stellt auch eine allgemein anwendbare auf Fluoreszenz basierende Technik zur Verfolgung von cAMP in einzelnen lebenden Zellen oder sogar in Geweben in Echtzeit zur Verfügung. Wie nachstehend dargelegt ist, stellt die vorliegende Erfindung darüber hinaus Verfahren zur Identifizierung und zum Screenen von Molekülen oder Verbindungen bereit, die in der Lage sind, die Bindung von cAMP an das chimäre Peptid der Erfindung oder die biologische und/oder pharmakologische Funktion von Adenylylcyclasen oder Phosphodiesterasen zu modifizieren.
Speziell entwickelten die Erfinder ein chimäres Protein für die optische Bestimmung von cAMP, welches die Nachteile der cAMP-Assays und Nachweissysteme überwindet, die im Stand der Technik beschrieben sind.
Erstens und wie vorstehend diskutiert ist das chimäre Peptid der Erfindung relativ kurz und enthält keine katalytische Aktivität oder Bindungsstelle(n) für andere Moleküle außer für cAMP. Daher stört das Protein keine anderen intrazellulären Prozesse wie die Desensibilisierung oder Phosphorylierung anderer Proteine. Wie in den Beispielen und Figuren dargestellt, umfassen die Konstrukte der vorliegenden Erfindung eine cAMP-Bindungsdomäne, die ungefähr 100 bis 200 Aminosäurereste umfasst und nur eine cAMP-Bindestelle aufweist, die zwischen 10 und 20, bevorzugt 13 bis 15 und am meisten bevorzugt 14 Aminosäuren umfasst.
Zweitens, ist das chimäre Protein der Erfindung im Gegensatz zu dem PKA-System (Zaccolo et al., a. a. O.) ein monomolekulares System, das leicht in lebenden Zellen exprimiert werden kann.
Drittens enthält das chimäre Peptid der vorliegenden Erfindung nur eine cAMP-Bindestelle mit einer hohen Affinität, was die direkte Bestimmung von cAMP in vitro ermöglicht. Eine weitere Folge der einzelnen cAMP-Bindestelle ist, dass die Kinetik des cAMP-Nachweises viel schneller ist als in den früher verfügbaren cAMP-Nachweissystemen, die im Stand der Technik beschrieben sind. Wie in den folgenden Beispielen gezeigt ist, zeigt die Aktivierungskinetik von cAMP-Sensorproteinen, die auf einer einzelnen Bindungsdomäne von EPAC2 basieren, im Vergleich zu dem früher beschriebenen PKA-Sensor (Zaccolo et al., Nat. Cell. Biol. 2 (1): 25–29 (Jan 2000)), dass der neue EPAC2-Sensor ein viel schnelleres Aktivierungssignal zeigt. Dies liegt am wahrscheinlichsten an der Anwesenheit von nur einer hoch affinen cAMP-Bindungsdomäne und der Abwesenheit einer katalytischen Aktivität (Induktion von Desensibilisierung über die Aktivierung von Phosphodiesterase) des chimären Peptids der Erfindung. Im Vergleich dazu hat PKA vier kooperativ agierende Bindungsstellen und zeigt Phosphodiesterase-Aktivierungseigenschaften.
Viertens ermöglicht das chimäre Protein der Erfindung einen Nachweis von cAMP in vitro in Echtzeit ohne radioaktive Verbindungen zu verwenden.
Der „Resonanzenergietransfer (RET)" wie hierin verwendet bezieht sich auf einen nicht-strahlenden Transfer von Anregungsenergie von einem Donor (erster dem Nachweis dienender Teil) auf einen Akzeptor (zweiter dem Nachweis dienender Teil). Die Konformationsänderung der cAMP-Bindeeinheit auf die Bindung von cAMP hin führt zu einer nachweisbaren Veränderung des RET zwischen den dem Nachweis dienenden Teilen. Falls RET zum Beispiel erhöht ist, nimmt der Emission-Peak des Akzeptors zu und der Emissions-Peak des Donors ist verringert. Demnach ist das Verhältnis der Emissionsintensität des Akzeptors zu der des Donors ein Hinweis auf die Höhe des RET zwischen den dem Nachweis dienenden Teilen. Die Konformationsänderung des chimären Peptids der Erfindung auf die Bindung von cAMP hin kann entweder zu einer Abnahme oder zu einer Zunahme der Distanz zwischen den dem Nachweis dienenden Teilen führen.
Der Begriff „chimär" wie hierin verwendet bezieht sich auf ein Molekül, das Sequenzen enthält, die von zwei, drei oder mehr verschiedenen Genen abgeleitet worden sind, die von einer, zwei, drei oder mehr verschiedenen Spezies abgeleitet sein können.
Der Begriff „Peptid" wie hierin verwendet bezieht sich auf ein Polypeptid oder ein Protein, das aus Aminosäuren zusammengesetzt sein kann, die durch Peptidbindungen oder modifizierte Peptidbindungen, d. h. Peptidisostere miteinander verbunden sind und die andere als die 20 Gen-codierten Aminosäuren enthalten können. Die Polypeptide können entweder durch natürliche Prozesse wie z. B. durch posttranslationelle Prozessierung modifiziert werden oder durch chemische Modifikationsmethoden, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind. Solche Modifikationen sind in Grundlagentexten und in ausführlicheren Monographien gut beschrieben, ebenso wie in einer umfangreichen Forschungsliteratur. Modifikationen können an beliebigen Stellen in einem Polypeptid vorkommen, wozu das Peptidgerüst, die Aminosäureseitenketten und die Amino- oder Carboxy-Termini gehören. Es ist ersichtlich, dass dieselbe Art von Modifikationen in gleichen oder unterschiedlichen Maßen an mehreren Stellen in einem vorgegebenen Polypeptid vorliegen kann. Ein vorgegebenes Polypeptid kann auch viele Arten von Modifikationen enthalten. Polypeptide können verzweigt sein, zum Beispiel infolge von Ubiquitinierung, und sie können zyklisch sein, mit oder ohne Verzweigung. Zyklische, verzweigte und zyklische verzweigte Polypeptide können aus natürlichen posttranslationalen Prozessen herrühren oder durch synthetische Verfahren hergestellt werden. Modifikationen umfassen Acetylierung, Acylierung, ADP-Ribosylierung, Amidierung, kovalente Bindung von Flavin, kovalente Bindung einer Häm-Gruppe, kovalente Bindung eines Nucleotids oder eines Nucleotidderivats, kovalente Bindung eines Lipids oder eines Lipidderivats, kovalente Bindung von Phosphatidylinosit, Vernetzung, Zyklisierung, Bildung von Disulfidbindungen, Demethylierung, Bildung von kovalenten Vernetzungen, Bildung von Cystein, Bildung von Pyroglutamat, Formylierung, Gammacarboxylierung, Glycosylierung, Bildung von GPI-Ankern, Hydroxylierung, Jodierung, Methylierung, Myristylierung, Oxidation, Pegylierung, proteolytische Prozessierung, Phosphorylierung, Prenylierung, Racemisierung, Selenoylierung, Sulfatierung, Transfer-RNA-vermittelte Hinzufügung von Aminosäuren zu Proteinen wie z. B. Arginylierung und Ubiquitinierung. (siehe z. B. PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2. Ausg., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993); POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Hrsg., Academic Press, New York, Seiten 1–12 (1983); Seiter et al., Meth. Enzymol. 182: 626–646 (1990); Rattan et al., Ann NY Acad Sci 663: 48–62 (1992)).
Der Begriff „chimäres Peptid" wie hierin verwendet bezieht sich auf Polypeptid- oder Protein-Konstrukte, die das Ergebnis der Kombination mehrerer Proteine, Proteindomänen und/oder Linkersequenzen zum Zweck des Erreichens der kombinierten Funktionen der Domänen und/oder Linkersequenzen sind, wie nachstehend ausführlicher dargelegt ist. Dies kann durch molekulare Clonierung der Nucleotidsequenzen erreicht werden, die solche Domänen codieren, um eine neue Polynucleotidsequenz zu erzeugen, die das gewünschte chimäre Peptid wie hierin verwendet codiert. Alternativ lässt sich die Erzeugung eines chimären Peptids durch chemisches Verbinden von zwei oder mehr Proteinen bewerkstelligen.
Speziell kann der Begriff „chimäres Peptid" wie hierin verwendet die Struktur A-B-C umfassen, wobei A eine erste nachweisbare Markierung darstellt, B eine cAMP-Bindeeinheit mit nur einer cAMP-Bindestelle darstellt und C eine zweite nachweisbare Markierung darstellt. Zum Beispiel kann die cAMP-Bindeeinheit von der regulatorischen Untereinheit (R) einer cAMP-abhängigen Proteinkinase (wie z. B. PKA) sein, von einem Guanin-Nucleotidaustauschfaktor (z. B. EPAC), einem Katabolit-Genaktivator-Protein aus E. coli, einem durch cAMP gesteuerten Ionenkanal, einem durch ein cyclisches Nucleotid gesteuerten Kanal (z. B. HCN), der Neuropathie-Ziel-Esterase (NTE) oder dem cAMP-Rezeptor von Dictyostelium. Bevorzugt ist die cAMP-abhängige Proteinkinase PKA, der Guanin-Nucleotidaustauschfaktor EPAC1 oder EPAC2, der von einem cyclischen Nucleotid gesteuerte Kanal HCN2 (durch Hyperpolarisierung aktivierter durch cyclische Nucleotide gesteuerter K⁺-Kanal), das katabole Genaktivator-Protein ist von E. coli abgeleitet, der durch cAMP gesteuerte Ionenkanal ist vom Menschen abgeleitet, die Neuropathie-Ziel-Esterase (NTE) ist vom Menschen abgeleitet und der cAMP-Rezeptor ist von Dictyostelium. Was PKA anbelangt, können die regulatorischen Untereinheiten von PKA I apha-A oder B; PKA I beta A oder B; PKA II alpha A oder B oder PKA II beta A oder B verwendet werden. Noch stärker bevorzugt sind PKA, EPAC1 oder EPAC2 von menschlichem Ursprung, von Maus oder von Ratte.
Eine cAMP-Bindeeinheit oder -domäne wie hierin verwendet bezieht sich auf eine cAMP-Bindungsdomäne/Einheit, die entweder die einzelne cAMP-Bindestelle (Kassette) enthält oder die einzelne cAMP-Bindestelle (Kassette) und zusätzliche angrenzende Sequenzen wie z. B. Alpha-Helices, wie in den folgenden Figuren beispielhaft dargestellt. Die cAMP-Bindeeinheit wie hierin verwendet entspricht bevorzugt den Aminosäuresequenzen, die in den folgenden Sequenzen des Sequenzprotokolls gezeigt sind; die Aminosäurereste 281–445 oder bevorzugt 284 bis 443 von EPAC2 (Domäne B) (SEQ ID NO: 3), die Aminosäurereste 203–323 oder bevorzugt 157 bis 316 von EPAC1 (SEQ ID NO: 2), die Aminosäurereste 274–416 oder bevorzugt 255 bis 416 oder bevorzugt 264 bis 416 der regulatorischen Untereinheit beta II von PKA (SEQ ID NO: 1), die Aminosäurereste 544–661 des durch cyclische Nucleotide gesteuerten Kaliumkanals 2 (SEQ ID NO: 4), die Aminosäurereste 12–98 des Katabolit-Genaktivator-Proteins (SEQ ID NO: 6), die Aminosäurereste 473–568 der Neuropathie-Ziel-Esterase (SEQ ID NO: 7), die Aminosäurereste 628–767 des durch cyclische Nucleotide gesteuerten Kationenkanals 4 (CNG) (SEQ ID NO: 5) oder die Aminosäurereste 467 bis 638 oder 497 bis 638 oder 523 bis 638 oder 517 bis 625 des durch Hyperpolarisierung aktivierten durch cyclische Nucleotide gesteuerten K⁺-Kanals 2 (HCN2; SEQ ID NO: 72).
Die cAMP-Bindestelle wie hierin verwendet kann leicht von einem Fachmann auf dem Gebiet abgeleitet werden und entspricht bevorzugt den Aminosäureresten 403–417 von EPAC2 (NP 062662), den Aminosäureresten 258–285, bevorzugt 268 bis 281 von EPAC1 (O95398), den Aminosäureresten 348–362 der regulatorischen Untereinheit beta II von PKA (P12369), den Aminosäureresten 607–621 des durch cyclische Nucleotide gesteuerten Kaliumkanals 2 (Q9UL51), den Aminosäureresten 71–86 des Katabolit-Genaktivator-Proteins (AAN82570), den Aminosäureresten 649–663 der Neuropathie-Ziel-Esterase (AAH50553) oder den Aminosäureresten 580 bis 593 von HCN2 (NP_032252). Entsprechende bevorzugte Konstrukte/chimäre Peptide der Erfindung sind als der Veranschaulichung dienende Beispiele in der beigefügten 1 oder 11 bereitgestellt. Die in 1 gezeigten Konstrukte sind auch in den SEQ ID NOs: 8 bis 20 bereitgestellt. Die in 11 bereitgestellten Konstrukte (die sich auf die der Veranschaulichung dienenden Beispiele beziehen, die die cAMP-Bindeeinheit/Domäne von HCN2 umfassen) sind auch in den codierenden Sequenzen (SEQ ID NOs: 66, 68 und 70) und deren entsprechenden Aminosäuresequenzen bereitgestellt, die in den SEQ ID NOs: 67. 69 und 71 gezeigt sind. Ein HCN2-Polypeptid (der Maus) ist in der SEQ ID NO: 74 definiert. Der Fachmann auf dem Gebiet ist leicht dazu in der Lage, aus der hierin bereitgestellten Information die cAMP-Bindungsdomäne abzuleiten (welche nur eine cAMP-Bindestelle aufweist). Demzufolge können die cAMP-Bindungsdomänen im Sinne dieser Erfindung den Aminosäureabschnitt L219 bis F300 von EPAC1 umfassen (wie in SEQ ID NO: 27 gezeigt, codiert unter anderem von SEQ ID NO: 26); den Aminosäureabschnitt L354 bis F435 von EPAC2 (wie in SEQ ID NO: 29 gezeigt, codiert unter anderem von SEQ ID NO: 28); den Aminosäureabschnitt I290 bis F379 von PKA (wie in SEQ ID NO: 31 gezeigt, codiert unter anderem von SEQ ID NO: 30); oder den Aminosäureabschnitt L533 bis I636 von HCN2 (wie in SEQ ID NO: 33 gezeigt, codiert unter anderem von SEQ ID NO: 32). Die entsprechenden cAMP-Bindeeinheiten sind ebenfalls und zusätzlich in den beigefügten 1 und 14 graphisch dargestellt.
Des Weiteren sind auch cAMP-Bindungsdomänen gemäß dieser Erfindung, die in den beigefügten 1 und 11 schematisch dargestellt sind, in den hierin beigefügten Sequenzen enthalten, wie etwa SEQ ID NOs: 8 bis 20 oder in den Aminosäuresequenzen, die in den SEQ ID NOs: 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 und 73 gezeigt sind.
Besonders bevorzugte chimäre Konstrukte der vorliegenden Erfindung sind Konstrukte, in denen die cAMP-Bindeeinheit aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus:

(a) einer cAMP-Bindeeinheit eines Polypeptids wie in SEQ ID NOs: 1 bis 7 und 74 gezeigt (und enthalten);
(b) einer cAMP-Bindeeinheit wie in einer beliebigen der SEQ ID NOs: 27, 29, 31, 33, 34, 35, 36 und 37 gezeigt oder in diesen enthalten;
(c) einer cAMP-Bindeeinheit wie in einer beliebigen der SEQ ID NOs: 8 bis 20 enthalten;
(d) einer cAMP-Bindeeinheit wie in einer beliebigen der SEQ ID NOs: 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 und 73 enthalten und
(e) einer cAMP-Bindeeinheit, die mindestens 70%, 80%, 90% oder 95% Sequenzidentität mit einer hierin definierten cAMP-Bindeeinheit oder mit der cAMP-Bindeeinheit von (a) bis (d) aufweist.

Das erfindungsgemäße chimäre Peptid ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) einem chimären Peptid, das von einem Nucleinsäuremolekül codiert ist, wie es in einer beliebigen der SEQ ID NOs: 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 70 und 72 gezeigt ist;
(b) einem chimären Peptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die in einer beliebigen der SEQ ID NOs: 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65 (entsprechend der SEQ ID NO: 73), 67, 68, 71 und 73 gezeigt ist;
(c) einem chimären Peptid, das von einem Nucleinsäuremolekül codiert ist, das ein Polypeptid codiert, das mindestens 70% Sequenzidentität zu einem Polypeptid aufweist, das in (a) oder (b) definiert ist, und das für die direkte Bestimmung der cAMP-Konzentration in vitro und/oder in vivo verwendet werden kann; und
(d) einem chimären Peptid, das von einem Nucleinsäuremolekül codiert ist, das degeneriert zu einer DNA-Sequenz ist, die in (a) und (c) definiert ist.

Die der Veranschaulichung dienenden, beispielhaften chimären Peptide/Konstrukte der Erfindung, die in den 1 und 11 gezeigt sind, sind auch in dem beigefügten Sequenzprotokoll dokumentiert. Demzufolge bezieht sich SEQ ID NO: 8 auf ein chimäres Konstrukt gemäß dieser Erfindung, das eine cAMP-Bindeeinheit umfasst, die nur eine cAMP-Bindestelle umfasst und von EPAC2 abgeleitet ist (Aminosäuren E285 bis E443). SEQ ID NO: 9 bezieht sich auf ein chimäres Konstrukt gemäß dieser Erfindung, das eine cAMP-Bindeeinheit umfasst, die nur eine cAMP-Bindestelle umfasst und von EPAC2 abgeleitet ist (Aminosäuren E292 bis E443). SEQ ID NO: 10 bezieht sich auf ein chimäres Konstrukt gemäß dieser Erfindung, das eine cAMP-Bindeeinheit umfasst, die nur eine cAMP-Bindestelle umfasst und von EPAC2 abgeleitet ist (Aminosäuren M304 bis E443). SEQ ID NO: 11 bezieht sich auf ein chimäres Konstrukt gemäß dieser Erfindung, das eine cAMP Bindeeinheit umfasst, die nur eine cAMP-Bindestelle umfasst und von EPAC2 abgeleitet ist (Aminosäuren M310 bis E443). SEQ ID NO: 12 bezieht sich auf ein chimäres Konstrukt gemäß dieser Erfindung, das eine cAMP-Bindeeinheit umfasst, die nur eine cAMP-Bindestelle umfasst und von EPAC2 abgeleitet ist (Aminosäuren E285 bis Q454). SEQ ID NO: 13 bezieht sich auf ein chimäres Konstrukt gemäß dieser Erfindung, das eine cAMP-Bindeeinheit umfasst, die nur eine cAMP-Bindestelle umfasst und von EPAC2 abgeleitet ist (Aminosäuren E285 bis E460). SEQ ID NO: 16 bezieht sich auf ein chimäres Konstrukt gemäß dieser Erfindung, das eine cAMP-Bindeeinheit umfasst, die nur eine cAMP-Bindestelle umfasst und von EPAC2 abgeleitet ist (das auch den Membrananker enthält, Aminosäuren E285 bis E443; siehe auch SEQ ID NO: 57). SEQ ID NO: 17 bezieht sich auf ein chimäres Konstrukt gemäß dieser Erfindung, das eine cAMP-Bindeeinheit umfasst, die nur eine cAMP-Bindestelle umfasst und von EPAC1 abgeleitet ist (Aminosäuren E157 bis E316). SEQ ID NO: 18 bezieht sich auf ein chimäres Konstrukt gemäß dieser Erfindung, das eine cAMP-Bindeeinheit umfasst, die nur eine cAMP-Bindestelle umfasst und von PKA (RII beta) abgeleitet ist (Aminosäuren M264 bis A416, HA; siehe auch SEQ ID NO: 63). SEQ ID NO: 19 bezieht sich auf ein chimäres Konstrukt gemäß dieser Erfindung, das eine cAMP-Bindeeinheit umfasst, die nur eine cAMP-Bindestelle umfasst und von PKA (RII beta) abgeleitet ist (Aminosäuren M264 bis A403; ohne HA; siehe auch SEQ ID NO: 59). SEQ ID NO: 39 bezieht sich auf ein chimäres Konstrukt gemäß dieser Erfindung, das eine cAMP-Bindeeinheit umfasst, die nur eine cAMP-Bindestelle umfasst und von EPAC1 abgeleitet ist (Aminosäuren E157 bis E316). SEQ ID NO: 41 bezieht sich auf ein chimäres Konstrukt gemäß dieser Erfindung, das eine cAMP-Bindeeinheit umfasst, die nur eine cAMP-Bindestelle umfasst und von EPAC2 abgeleitet ist (Aminosäuren E285 bis E443; siehe auch SEQ ID NO: 8). SEQ ID NO: 43 bezieht sich auf ein chimäres Konstrukt gemäß dieser Erfindung, das eine cAMP-Bindeeinheit umfasst, die nur eine cAMP-Bindestelle umfasst und von EPAC2 abgeleitet ist (Aminosäuren E292 bis E443; siehe auch SEQ ID NO: 9). SEQ ID NO: 45 bezieht sich auf ein chimäres Konstrukt gemäß dieser Erfindung, das eine cAMP-Bindeeinheit umfasst, die nur eine cAMP-Bindestelle umfasst und von EPAC2 abgeleitet ist (Aminosäuren E304 bis E443; siehe auch SEQ ID NO: 10). SEQ ID NO: 47 bezieht sich auf ein chimäres Konstrukt gemäß dieser Erfindung, das eine cAMP-Bindeeinheit umfasst, die nur eine cAMP-Bindestelle umfasst und von EPAC2 abgeleitet ist (Aminosäuren M310 bis E443; siehe auch SEQ ID NO: 11). SEQ ID NO: 49 bezieht sich auf ein chimäres Konstrukt gemäß dieser Erfindung, das eine cAMP-Bindeeinheit umfasst, die nur eine cAMP-Bindestelle umfasst und von EPAC2 abgeleitet ist (Aminosäuren E285 bis Q454; siehe auch SEQ ID NO: 12). SEQ ID NO: 51 bezieht sich auf ein chimäres Konstrukt gemäß dieser Erfindung, das eine cAMP-Bindeeinheit umfasst, die nur eine cAMP-Bindestelle umfasst und von EPAC2 abgeleitet ist (Aminosäuren E285 bis E460; siehe auch SEQ ID NO: 13). SEQ ID NO: 61 bezieht sich auf ein chimäres Konstrukt gemäß dieser Erfindung, das eine cAMP-Bindeeinheit umfasst, die nur eine cAMP-Bindestelle umfasst und von PKA abgeleitet ist (Aminosäuren V255 bis A416 und das Hämagglutinin-Antigen (HA)).
Die SEQ ID NOs: 14, 15, 20, 53, 55, 65 (was dasselbe wie 73 ist) sind Konstrukte gemäß dieser Erfindung, in denen eine der nachweisbaren Markierungen zwischen dem Carboxyterminus und dem Aminoterminus der cAMP-Bindeeinheit/Domäne liegt, die nur eine cAMP-Bindestelle hat. Diese Konstrukte umfassen ferner Aminosäurereste der cAMP-Bindeeinheit/Domäne ohne eine cAMP-Bindestelle an dem Carboxy-terminalen Ende (siehe auch 1). Demzufolge umfasst das chimäre Konstrukt der vorliegenden Erfindung auch Konstrukte, in denen eine der mindestens zwei nachweisbaren Markierungen in dieser cAMP-Bindeeinheit/Domäne eingelagert/eingesetzt ist. Nicht beschränkende Beispiele sind die vorstehend aufgeführten Konstrukte, die in den SEQ ID NOs: 14, 15, 20, 53, 55 und 65 (was dasselbe wie 73 ist). Demzufolge beschreiben SEQ ID NOs: 14 und 53 ein Konstrukt, das eine EPAC2-cAMP-Bindeeinheit/Domäne mit nur einer cAMP-Bindestelle in dem Format E285 bis 1388 (nachweisbare Markierung; EYFP) – G390 bis E443 – (nachweisbare Markierung; ECFP) umfasst. SEQ ID NOs: 15 und 55 beschreiben ein Konstrukt, das eine EPAC2-cAMP-Bindeeinheit/Domäne mit nur einer cAMP-Bindestelle in dem Format E285 bis I388 (nachweisbare Markierung; EYFP) – G390 bis E460 – (nachweisbare Markierung; ECFP) umfasst. SEQ ID NO: 20 beschreibt ein Konstrukt, das eine PKA-cAMP-Bindeeinheit/Domäne mit nur einer cAMP-Bindestelle in dem Format M264 bis I331 (nachweisbare Markierung; EYFP) – A403 bis E443 – (nachweisbare Markierung; ECFP) umfasst. SEQ ID NOs: 65 und 73 beschreiben ein Konstrukt, das eine PKA-cAMP-Bindeeinheit/Domäne mit nur einer cAMP-Bindestelle in dem Format V255 bis I331 (nachweisbare Markierung; EYFP) – A403 bis E443 – (nachweisbare Markierung; ECFP) umfasst.
Die Fusion zwischen den vorstehend aufgeführten Teilen/Kassetten A, B und C muss nicht notwendigerweise direkt sein, sondern kann über Linker-Sequenzen erfolgen. Demzufolge kann das chimäre Peptid auch die Struktur A-D-B-C, A-B-E-C oder A-D-B-E-C haben, wobei D und E einen Linker repräsentieren, der zwischen der nachweisbaren Markierung und der cAMP-Bindeeinheit positioniert ist. Der Begriff „Linker" oder „Linkersequenz" wie hierin verwendet bezieht sich auf ein Polynucleotid oder eine Polypeptidsequenz, die bei der Konstruktion des chimären Peptids der Erfindung verwendet werden. Funktionen einer Linkerregion können die Einführung von Clonierungsstellen in die Nucleotidsequenz beinhalten, die Einführung einer flexiblen Komponente oder einer Raum schaffenden Region zwischen zwei Proteindomänen oder die Erzeugung eines Affinitäts-Tags für die spezifische Interaktion von Molekülen. Eine Linkerregion kann in das chimäre Peptid als Folge von Auswahlentscheidungen eingeführt werden, die im Lauf der Konstruktion des Polypeptids oder der Nucleotidsequenz getroffen wurden. Der wie hierin verwendete Linker kann 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 30 oder sogar 50 Aminosäurereste lang sein, wobei die Linkersequenzen D und E dieselbe Länge aufweisen können oder nicht. Bevorzugt bestehen kurze Linker aus 1, 2, 3, 4 oder 5 Aminosäureresten. Das wie hierin verwendete chimäre Peptid kann auch technisch bearbeitet werden um Eigenschaften des Polypeptids der vorliegenden Erfindung zu verbessern. Zum Beispiel kann eine Region zusätzlicher Aminosäuren, insbesondere geladener Aminosäuren, an den N-Terminus oder den C-Terminus des chimären Peptids hinzugefügt werden um die Stabilität und die Widerstandsfähigkeit während der Aufreinigung aus der Wirtszelle oder der nachfolgenden Handhabung und Lagerung zu verbessern. Man kann auch Peptideinheiten zu dem chimären Peptid hinzufügen um die Aufreinigung zu erleichtern. Solche Regionen können vor der endgültigen Präparation des Polypeptids entfernt werden. Das Hinzufügen von Peptideinheiten, die auch „Tags" genannt werden, um die Handhabung von Polypeptiden zu erleichtern, ist eine auf dem Fachgebiet bekannte und routinemäßig durchgeführte Technik. Der Begriff „Tag" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine Aminosäuresequenz oder eine Nucleotidsequenz, die eine Aminosäuresequenz codiert, welche die Isolierung, Aufreinigung und/oder den Nachweis des wie hierin verwendeten chimären Peptids erleichtert, das das Tag enthält. Fachleuten auf dem Gebiet ist eine Vielzahl solcher Tags bekannt, und diese eignen sich für das chimäre Peptid, die Verfahren und Anwendungen der vorliegenden Erfindung. Geeignete Tags umfassen sind aber nicht beschränkt auf das HA-Peptid, Polyhistidin-Peptide, Biotin/Avidin, Flag-Tag oder andere Antikörperepitopbindungsstellen. Zum Beispiel kann es sich bei der Marker-Aminosäuresequenz um ein Hexahistidin-Peptid handeln wie z. B. das Tag, das in einem pQE-Vektor (QIAGEN Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311) bereitgestellt ist, der, neben anderen, im Handel erhältlich ist. Wie in Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 821–824 (1989) beschrieben, gewährleistet zum Beispiel Hexahistidin eine einfache Aufreinigung des Fusionsproteins. Ein anderes für die Aufreinigung nützliches Peptid-Tag, das „HA"-Tag, entspricht einem Epitop, das von dem Influenza-Hämagglutininprotein abgeleitet ist (Wilson et al., Cell 37: 767 (1984)). Alternativ kann das chimäre Peptid der Erfindung mit der konstanten Domäne von Immunoglobulinen (IgA, IgE, IgG, IgM) oder Teilen davon (CH1, CH2, CH3 oder eine beliebige Kombination davon) fusioniert werden. Des Weiteren kann das wie hierin verwendete chimäre Peptid basierend auf Transportsignalen auf spezifische zelluläre Orte abgerichtet werden, d. h. spezielle Kompartimente der Zellen. Das chimäre Peptid kann als lösliches Protein im Cytoplasma der Zelle exprimiert werden oder kann in eine biologische Membran einer Zelle und/oder eine künstliche Membran, wie z. B. eine Zellmembran, eine Membran-Rohpräparation, Liposomen ebenso wie künstliche Membranen, die Micellen, Lipideinzelschichten oder Lipiddoppelschichten umfassen, eingesetzt werden. Zum Beispiel kann das wie hierin definierte chimäre Peptid in Zellmembranen lokalisiert sein, z. B. in Membranen von gezüchteten Zellen oder in Membranen von Eizellen. Das chimäre Peptid kann auch auf andere spezielle Kompartimente der Zelle gerichtet sein, wie z. B. den Kern. Die Mitochondrien, das endoplasmasmatische Reticulum, Chloroplasten oder dergleichen indem man z. B. Signalsequenzen oder Lokalisierungssignale verwendet wie z. B. Kernlokalisierungssequenzen oder Lokalisierungssequenzen, die auf den Golgi-Apparat, Mitochondrien, das endoplasmatische Reticulum oder das Cytoskelett gerichtet sind. Diese sind auf dem Fachgebiet gut beschrieben.
Wie hierin nachfolgend ausführlich beschrieben, ist es auch vorgesehen, dass das chimäre Peptid der Erfindung in transgenen nicht-menschlichen Tieren exprimiert wird. Demzufolge können auch Zellen, Gewebe und Organe dieses nicht-menschlichen Tiers das chimäre Peptid der vorliegenden Erfindung exprimieren und können besonders nützlich bei Arzneistoff-Screenings sein, wie nachstehend ausführlich erklärt ist.
Das wie hierin verwendete chimäre Peptid kann mittels auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren rekombinant hergestellt werden; siehe unter anderem Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001. Außerdem kann das chimäre Peptid der Erfindung mittels auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren chemisch synthetisiert werden.
Der Begriff „und/oder" wie er hierin verwendet wird, umfasst die Bedeutung von „und", „oder" insgesamt oder jede andere Kombination der Elemente, die durch diesen Begriff verknüpft sind.
Der Begriff „Membran" wie hierin verwendet bezieht sich auf natürlich vorkommende Membranen ebenso wie auf künstliche Membranen. Bevorzugt bestehen die Membranen aus Lipiddoppelschichten. Wie vorstehend hervorgehoben, sind spezielle Beispiele Zellmembranen und Bio-Membranen wie z. B. die Plasmamembran von Zellen, das endoplasmatische Reticulum, die mitochondriale Membran, Golgi-Vesikel, Lysosomen, Peroxisomen aber auch zelluläre Membranen von Pflanzenzellen, wie Membranen der Chloroplasten oder anderer Organellen ebenso wie Vakuolen. Bei der zellulären oder der Bio-Membran, in welche das chimäre Peptid der Erfindung eingesetzt wird, handelt es sich um die Plasmamembran einer tierischen Zelle, am meisten bevorzugt einer Säugerzelle, aber auch von Amphibienzellen wie Frosch-Oocyten. Dennoch werden, wie hierin ebenfalls diskutiert ist, Membranpräparationen wie Membranrohpräparationen oder Liposomen als „Membranen" angesehen, in die das chimäre Peptid der Erfindung eingesetzt wird.
Der Begriff „mindestens zwei nachweisbare Markierungen" wie hierin verwendet bedeutet, dass das chimäre Peptid der Erfindung zwei, drei, vier, fünf oder mehr nachweisbare Markierungen umfassen kann, am meisten bevorzugt sind jedoch Konstrukte, die zwei nachweisbare Markierungen enthalten. Die nachweisbaren Markierungen werden hierin nachfolgend ausführlich beschrieben und können insbesondere Fluorophore ebenso wie bio-lumineszente Substanzen umfassen. Gemäß den beigefügten Beispielen sind jedoch zwei nachweisbare Markierungen auf einem chimären Peptid der Erfindung am meisten bevorzugt.
Der Begriff „diese Markierung ist lokalisiert bei" wie hierin verwendet bedeutet, dass die Markierung entweder am Carboxy- oder am Aminoterminus der cAMP-Bindeeinheit positioniert ist. Wie bereits vorstehend angegeben kann die Fusion direkt sein oder über einen dazwischen liegenden Linker und es ist auch vorgesehen und hierin dokumentiert, dass mindestens eine der mindestens zwei nachweisbaren Markierungen zwischen den cAMP-Bindeeinheiten lokalisiert ist (eingelagert oder eingesetzt in die cAMP-Bindeeinheit). Entsprechende Beispiele werden unter anderem in den SEQ ID NOs: 14 (auch 53), 15 (auch 55), 20 und 65 (auch 73) gegeben und sind in 1 bildlich dargestellt.
Was die Insertion von nachweisbaren Markierungen anbelangt, ist es dem Fach mann auf dem Gebiet offenkundig, dass solche Insertionen variabel sein können. Dennoch soll angemerkt werden, dass Insertionen der nachweisbaren Markierung zu einer Deletion/einem Austausch von natürlich vorkommenden Aminosäuren in der cAMP-Bindeeinheit führen kann, allerdings ohne die Bindung von cAMP an die cAMP-Bindestelle zu beeinträchtigen.
Die Begriffe „Amino-Terminus" oder „C-Terminus" wie hierin verwendet beziehen sich auf den Amino-Terminus und den Carboxy-Terminus der cAMP-Bindeeinheit des chimären Peptids der Erfindung oder (wo es explizit angegeben ist) auf das chimäre Peptid der Erfindung.
Bei den in das chimäre Peptid der vorliegenden Erfindung einzuführenden nachweisbaren Markierungen handelt es sich bevorzugt um fluoreszente Markierungen oder um biolumineszente Markierungen. Die nachweisbaren Markierungen umfassen auch genetisch codierte Fluorophore ebenso wie synthetische Fluorophore, die spezifisch an eine genetisch codierte und technisch bearbeitete Stelle binden (Flash-Technologie; siehe unter anderem Adams, J. Am. Chem. Soc. 124: 6063–6076 (2002) oder Griffin, Meth. Enzymol. 327: 565–578 (2000).
Wie hierin diskutiert sind die erfindungsgemäßen Konstrukte besonders nützlich bei der direkten Bestimmung der cAMP-Konzentration in vitro und/oder in vivo. Demzufolge erleichtern die dem Nachweis dienenden Teile/Markierungen, die in dem chimären Peptid der Erfindung vorhanden sind, den Nachweis einer Konformationsänderung innerhalb des chimären Peptids der Erfindung auf Bindung von cAMP hin, was wiederum ein Hinweis auf eine Veränderung der Energie ist, die von den dem Nachweis dienenden Teilen/nachweisbaren Markierungen emittiert wird. Demzufolge bezieht sich der Begriff „direkte Bestimmung der cAMP-Konzentration" auf die Tatsache, dass das chimäre Peptid der Erfindung ein monomolekulares Werkzeug bereitstellt, das besonders geeignet ist, um die cAMP-Spiegel in einer Probe direkt zu bestimmen. Zum Beispiel kann man das wie vorstehend definierte Peptid zu einer Probe hinzufügen und die cAMP-Konzentration in der Probe durch Messen und/oder Erfassen von FRET oder BRET messen, indem man die Werte der Fluoreszenzemission mit einer Standardkurve vergleicht, die man mit definierten Konzentrationen von cAMP erhalten hat. Die „chimären Indikatoren", die in dieser Erfindung bereit gestellt werden, können universell eingesetzt werden um z. B. cAMP, dessen physiologische Rolle ebenso wie räumlich-zeitliche Regulation zu untersuchen.
Der Begriff „direkte Bestimmung" wie hierin verwendet gibt an, dass cAMP direkt an eine cAMP-Bindestelle des chimären Proteins der Erfindung bindet, was dann ein nachweisbares Signal erzeugt. Demnach, und im Gegensatz zum Stand der Technik, wird nur ein Protein benötigt, um cAMP in vivo nachzuweisen oder die cAMP-Konzentration in vitro zu bestimmen, ohne dass irgendwelche weiteren Werkzeuge wie Hilfsproteine, Antikörper, Markierungen, Indikatoren oder dergleichen erforderlich sind. In diesem Kontext ist es erwähnenswert, dass cAMP-Sensoren des Stands der Technik auf cAMP-abhängigen Interaktionen zwischen/von zwei Proteinen beruhen.
Bei der Probe, wie sie hierin definiert ist, kann es sich zum Beispiel um eine Zelle handeln, um ein Zelllysat, einen Rohextrakt von Zellen, eine Membranpräparation, ein Gewebe oder Bioflüssigkeiten. Bioflüssigkeiten wie hierin verwendet beziehen sich bevorzugt auf Körperflüssigkeiten wie z. B. Samen, Lymphe, Seren, Plasma, Urin, Gelenkflüssigkeit oder Liquor.
Darüber hinaus kann das chimäre Peptid der Erfindung dazu verwendet werden, über Raum und Zeit die Menge, Verteilung, Lokalisierung oder Schwankung von cAMP in einer lebenden Zelle oder einem lebenden Gewebe zu verfolgen. Man kann zum Beispiel eine Zelle oder ein Gewebe mit der Nucleinsäure oder dem Vektor der Erfindung transfizieren oder transformieren und kann FRET oder BRET in der lebenden Zelle oder dem lebenden Gewebe messen/erfassen.
In einer Ausführungsform des chimären Peptids der Erfindung sind diese Nachweismarkierungen Teile eines geteilten fluoreszierenden Proteins. Bevorzugt handelt es sich bei diesem geteilten fluoreszierenden Protein um ein geteiltes grün fluoreszierendes Protein (geteiltes GFP). Der Begriff „grün fluoreszierendes Protein" oder „GFP", wie überall in der vorliegenden Anmeldung verwendet, bezieht sich auf das GFP, das ursprünglich von Prasher (Gene 111: 229–233 (1992)) aus Aequorea victoria cloniert worden ist, und Mutanten davon, die GFP-Aktivität zeigen. Der Begriff „GFP-Aktivität" bezieht sich auf die bekannten Eigenschaften eines GFP, d. h. Fluoreszenzemission auf Anregung mit einem geeigneten Licht hin, die Fähigkeit zu autokatalytischer Reifung, was Faltung in Tertiärstruktur und die Bildung des Chromophors beinhaltet sowie die Unabhängigkeit von irgendwelchen Cofaktoren oder der Versorgung mit metabolischer Energie um die Fluoreszenz ebenso wie die autokatalytische Reifung durchzuführen. Diese Eigenschaften sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und sind zum Beispiel in einem Übersichtsartikel von Tsien (Ann. Rev. Biochem. 67: 509–544 (1998)) dargestellt. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann, sofern nichts Anderweitiges angegeben ist, jede nachweisbare Emissionwellenlänge einer GFP-Mutante nützlich sein, um das chimäre Peptid der Erfindung anzuwenden. Im Stand der Technik sind viele GFP-Mutanten beschrieben, in denen spezifische Aminosäurereste substituiert sind, was sich in einer verbesserten Fluoreszenzeffizienz und/oder einer verschobenen Anregungs- und/oder Emissionswellenlänge auswirkt (siehe z. B. Heim, Meth. Enzymol. 302: 408–423 (1999); Heikal et al., PNAS 97: 11996–12001 (2000)). So kann insbesondere die Mutation von Glutamin an Position 69 zu Methionin die inhärente pH- und Halogenid-Sensitivität von eYFP verringern (Griesbeck et al., J. Biol. Chem. 276: 29188–29194 (2001)). Demnach ist es, falls eYFP oder ein Derivat davon, das im Wesentlichen dasselbe Anregungs- und Emissionsspektrum aufweist, als ein dem Nachweis dienender Teil des Fusionsproteins der Erfindung verwendet wird, bevorzugt, dass das eYFP oder das Derivat davon diese Mutation aufweist. Dennoch ist, wie es in den beigefügten Beispielen gezeigt ist, YFP gemäß dieser Erfindung ebenfalls nützlich. Beispiele für GFP-Mutanten, die für die Anwendung der Erfindung nützlich sind, schließen (verstärktes) gelb fluoreszierendes Protein ((e)YFP), (verstärktes) blaugrün fluoreszierendes Protein ((e)CFP), (verstärktes) blau fluoreszierendes Protein ((e)BFP), (verstärktes) grün fluoreszierendes Protein ((e)GFP), dsRed, Citrin und Saphir ein. Innerhalb des Gültigkeitsbereichs der vorliegenden Erfindung kann jede beliebige GFP-Mutante oder funktionelles Analog von GFP verwendet werden, solange es Fluoreszenzaktivität zeigt. Bevorzugt sind solche GFP-Varianten/Mutanten von einem Nucleinsäuremolekül codiert, das, bevorzugt unter stringenten Bedingungen, mit der Nucleotidsequenz hybridisiert, die das Wildtyp-GFP codiert, oder mit Polynucleotiden, die Varianten/Mutanten codieren wie die unter den SEQ ID NOs: 23 und 24 dargestellte Sequenz. Diese GFP-Mutanten/Varianten, welche die Polypeptidsequenz wie in SEQ ID NOs: 21 und 22 dargestellt aufweisen, beziehen sich auf die am meisten bevorzugten in dieser Erfindung zu verwendenden GFP-Varianten, nämlich verstärktes blaugrün fluoreszierendes Protein (eCFP) und gelb fluoreszierendes Protein (YFP). Geeignete bevorzugte Hybridisierungbedingungen und Sequenzidentitäts-Werte für bevorzugte hybridisierende Nucleotidsequenzen, die ein mutantes GFP codieren, sind nachstehend erwähnt.
In diesem Kontext bedeutet der Begriff „Hybridisierung" Hybridisierung unter üblichen Hybridisierungsbedingungen. Diese können niedrig stringente, bevorzugt stringente (d. h. hoch stringente) Hybridisierungsbedingungen sein, wie z. B. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, a. a. O. beschrieben. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „Hybridisierung", dass die Hybridisierung unter „stringenten Hybridisierungsbedingungen" stattfindet, was sich auf eine Übernachtinkubation bei 42 Grad Celsius bezieht, in einer Lösung, die 50% Formamid, 5 × SSC (750 mM NaCl, 75 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10% Dextransulfat und 20 μg/ml denaturierte, einem Scherprozess unterzogene Lachsrogen-DNA enthält, gefolgt von Waschen der Filter in 0,1 × SSC bei etwa 65 Grad Celsius.
Der Begriff „geteiltes fluoreszierendes Protein" bezieht sich auf ein fluoreszierendes Protein, dessen Aminosäuresequenz in zwei Teile geteilt ist, wobei das geteilte fluoreszierende Protein auf Grund einer sekundären räumlichen Verbindung dieser Teile eine dreidimensionale Struktur annimmt, die es ihm ermöglicht, Fluoreszenz zu emittieren, wenn es durch Licht einer geeigneten Wellenlänge angeregt wird. Es wird zum Beispiel in Erwägung gezogen, dass es sich bei dem geteilten fluoreszierenden Protein um ein geteiltes GFP handelt, wie es von Baird (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 11241–11246 (1999)) beschrieben worden ist. Gemäß den Lehren des Stands der Technik ist es für einen Fachmann auf dem Gebiet möglich, ein GFP in zwei geteilte GFP-Teile zu teilen um diese zu dem chimären Peptid der Erfindung zu fusionieren. Es ist des Weiteren vorstellbar, dass andere fluoreszierende Proteine als GFP, z. B. diejenigen, die nachstehend erwähnt sind, geteilt werden können, so dass sie auf dieselbe Weise wie das hierin beschriebene geteilte GFP zwei dem Nachweis dienende Teile darstellen.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der ersten Nachweismarkierung um einen Energie emittierenden Proteinteil und bei der zweiten Nachweismarkierung um eine fluoreszierende Protein-Markierung oder anders herum. In Verbindung mit dieser Ausführungsform ist es nicht wichtig, auf welchem Teil des chimären Peptids der erste dem Nachweis dienende Teil in Bezug auf den anderen hierin definierten Teil lokalisiert ist, d. h. ob die Nachweismarkierung am N- oder am C-Terminus der cAMP-Bindeeinheit des chimären Peptids der Erfindung lokalisiert ist, ob sie direkt fusioniert ist oder über einen Linker wie vorstehend ausgeführt. Wie vorstehend diskutiert kann eine der Nachweismarkierungen auch innerhalb der cAMP-Bindeeinheit/Domäne platziert sein, wie hierin beschrieben ist; siehe z. B. die in 1 aufgeführten Beispiele oder die Sequenzen, die unter anderem in SEQ ID NOs: 14, 15 oder 20 bereitgestellt sind. Der Begriff „Energie emittierender Proteinteil" bezieht sich auf Proteine, die zur Emission von Strahlungsenergie fähig sind, die (i) Energie in einer geeigneten Form aufnehmen können und (ii) zumindest einen Teil dieser Energie durch Resonanz-Energietransfer (RET) auf die zweite Nachweismarkierung übertragen können, die ein Teil eines fluoreszierenden Proteins ist, welches dadurch zur Emission von Energie angeregt wird. Die Form der Energieaufnahme kann auf eine beliebige Art und Weise vor sich gehen, die für den Fachmann auf dem Gebiet vorstellbar ist, und kann z. B. eine chemische Reaktion (Chemilumineszenz oder Biolumineszenz) oder die Absorption von Strahlung (Fluoreszenz oder Phosphoreszenz) beinhalten.
Der Begriff „Teil eines fluoreszieremden Proteins" bezieht sich auf Proteine, die in der Lage sind, zu fluoreszieren, d. h. Energie von Strahlung einer bestimmten Wellenlänge zu absorbieren, z. B. ultraviolettes oder sichtbares Licht, und diese Energie oder einen Teil davon durch Strahlung zu emittieren, wobei die emittierte Strahlung eine längere Wellenlänge hat als die anregende Strahlung. Es gibt viele Beispiele von fluoreszierenden Proteinen, die in der Literatur beschrieben sind, die in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung nützlich sein können, wie z. B. die vorstehend erwähnten GFPs, fluoreszierende Proteine aus nicht-biolumineszenten Organismen der Klasse Anthozoa ( WO 00/34318 , WO 00/34319 , WO 00/34320 , WO 00/34321 , WO 00/34322 , WO 00/34323 , WO 00/34324 , WO 00/34325 , WO 00/34326 , WO 00/34526 ) oder das fluoreszierende Protein bmFP aus Photobacterium phosphoreum (Karatani, Photochem. Photobiol. 71: 230 (2000)). Bevorzugt sind jedoch fluoreszierende Proteine, die ein YFP und eCFP sind, wie sie in den beigefügten Beispielen verwendet werden.
Der Begriff „Resonanz-Energietransfer" (RET) bezieht sich wie vorstehend angegeben auf einen nicht durch Strahlung ablaufenden Transfer von Anregungsenergie von einem Donor-(erster dem Nachweis dienender Teil) auf ein Akzeptor-Molekül (zweiter dem Nachweis dienender Teil) (Heyduk, T. Measuring protein conformational changes by FRET/LRET. Curr. Opin. Biotechnol. 13 (4): 292–6 (Aug. 2002). Übersichtsartikel; Truong, K., Ikura, M. The use of FRET imaging microscopy to detect protein-protein interactions and protein conformational changes in vivo. Curr. Opin. Struct. Biol. 11 (5): 573–8 (Okt. 2001). Übersichtsartikel; Issad, T., Boute, N., Boubekaur, S., Lacasa, D., Pernet, K. Looking for an insulin pill? Use the BRET methodology! Diabetes Metab. 29 (2 Pt 1): 111–7 (Apr. 2003); Boute, N., Jockers, R., Issad, T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening: BRET versus FRET. Trends Pharmacol. Sci. 23 (8): 351–4 (Aug. 2002). Übersichtsartikel).
Darüber hinaus können FRET oder BRET wie in den folgenden Figuren und Beispielen gezeigt bestimmt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des chimären Peptids der Erfindung bindet die cAMP-Bindestelle der cAMP-Bindeeinheit cAMP mit hoher Affinität. Bevorzugt bindet die cAMP-Bindestelle der cAMP-Bindeeinheit cAMP mit einem K_d im Bereich von 1 nM bis 50 μM, stärker bevorzugt im Bereich von 1 nM bis 50 μM, stärker bevorzugt im Bereich von 5 nM bis 40 μM, stärker bevorzugt im Bereich von 100 nM bis 30 μM, stärker bevorzugt im Bereich von 200 nM bis 20 μM. Wie in den Beispielen gezeigt ist, ist ein bevorzugter Bereich in diesem Kontext z. B. 5 nM bis 5 μM, aber auch 100 nM bis 25 μM. Ein besonders bevorzugter Bereich in diesem Kontext ist zwischen 100 nM und 50 μM. Wie in 13 gezeigt ist ein am meisten bevorzugter Bereich zwischen 10 nM und 50 μM, am allermeisten bevorzugt zwischen 10 nM und 3 μM.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des chimären Peptids der Erfindung ist die cAMP-Bindeeinheit ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der regulatorischen Untereinheit (R) einer cAMP-abhängigen Proteinkinase, einem Guaninnucleotidaustauschfaktor, einem Katabolit-Genaktivatorprotein, einem cAMP-gesteuerten Ionenkanal, einem durch ein cyclisches Nucleotid gesteuerten Ionenkanal, der Neuropathie-Ziel-Esterase (NTE) und dem cAMP-Rezeptor von Dictyostelium.
Die Familie der cAMP-bindenden Proteine umfasst mehr als zehn Proteinsequenzen, die Proteine mit bekannten Funktionen codieren, ebenso wie mehrere Sequenzen, die von einer Suche in Datenbanken nach potenziellen Bindungsstellen für cyclische Nucleotide abgeleitet sind (Dremier, S., Kopperud, R., Doskeland, S. O., Dumont, J. E., Maenhaut, C. Search for new cyclic AMP binding proteins. FEBS Lett. 546 (1): 103–7 (3. Jul. 2003)). Bis 1998, als EPAC1 cloniert und charakterisiert wurde (de Rooij, J., Zwartkruis, F. J., Verheijen, M. H., Cool, R. H., Nijman, S. M., Wittinghofer, A., Bos, J. L. EPAC1 is a Rap1 guanine-nucleotide-exchange factor directly activated by cyclic AMP. Nature 396 (6710): 474–7 (3. Dez. 1998)), war Proteinkinase A (PKA) als ein einzigartiger cAMP-Effektor in der Zelle allgemein anerkannt. Nach heutigem Kenntnisstand binden mehrere Proteine cAMP und regulieren Zellfunktionen, z. B. EPAC1 und 2, durch cyclische Nucleotide gesteuerte Kanäle (CNGC), kataboles Genaktivatorprotein in E. coli (CAP), Neuropathie-Ziel-Esterase (NTE). Man hat eine Reihe von Sequenzen identifiziert, die Proteine mit potenzieller cAMP-Bindungsaktivität codieren, aber deren Funktion bleibt schwer fassbar: ein EST-Sequenz von Maus-Embryo (AI595216), die menschliche Sequenz KIAA0313 (AB002311), die Sequenz Im493605 (Dremier, S., Kopperud, R., Doskeland, S. O., Dumont, J. E., Maenhaut, C. Search for new cyclic AMP binding proteins. FEBS Lett. 546 (1): 103–7 (3. Jul. 2003)). Wie es einem Fachmann auf dem Gebiet ersichtlich ist, können auch diese Sequenzen für die Konstruktion des chimären Peptids der Erfindung verwendet werden.
Bevorzugt stammt die cAMP-Bindeeinheit von PKA, EPAC1, EPAC2, dem Katabolit-Genaktivatorprotein von E. coli, dem cAMP-gesteuerten Ionenkanal, sowie HCN2 (durch Hyperpolarisierung aktivierter durch cyclische Nucleotide gesteuerter K⁺-Kanal 2), Neuropathie-Ziel-Esterase (NTE) und dem cAMP-Rezeptor von Dictyo stelium. Die cAMP-Bindeeinheit von PKA, EPAC1 oder EPAC2 ist bevorzugt bakteriellen Ursprungs, von Maus, Ratte oder von Mensch.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des chimären Peptids der Erfindung sind die nachweisbaren Markierungen fluoreszierende Markierungen, biolumineszierende Markierungen oder Spin-Markierungen (Jahnke, W. Spin labels as a tool to identify and characterize protein-ligand interactions by NMR spectroscopy. Chembiochem. 3 (2–3): 167–173 (1. Mär. 2002). Übersichtsartikel). Bevorzugt sind diese fluoreszierende Markierungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus GFP, YFP, CFP, BFP, Cytrin, Saphir und dsRed. Die biolumineszierende Markierung ist bevorzugt Luciferase, wie z. B. Renilla-Luciferase oder Glühwürmchen-Luciferase.
Wie vorstehend diskutiert ist die cAMP-Bindeeinheit in einer am meisten bevorzugten Ausführungsform des chimären Peptids der Erfindung aus der folgenden Gruppe ausgewählt. Diese Konstrukte sind auch besonders nützlich in den hierin bereitgestellten Verfahren und können in den nachstehend beschriebenen Kits enthalten sein. Die bevorzugten Konstrukte umfassen cAMP-Bindeeinheiten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) einer cAMP-Bindeeinheit eines Polypeptids wie in den SEQ ID NOs: 1 bis 7 sowie 74 gezeigt;
(f) einer cAMP-Bindeeinheit wie in einer beliebigen der SEQ ID NOs: 27, 29, 31, 33, 34, 35, 36 und 37 gezeigt oder enthalten;
(g) einer cAMP-Bindeeinheit wie in einer beliebigen der SEQ ID NOs: 8 bis 20 enthalten;
(h) einer cAMP-Bindeeinheit wie in einer beliebigen der SEQ ID NOs: 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 und 73 enthalten; und
(i) einer cAMP-Bindeeinheit, die eine Sequenzidentität von mindestens 70%, 80%, 90% oder 95% zu einer cAMP-Bindeeinheit aufweist wie sie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 8 definiert ist oder zu der cAMP-Bindeeinheit von (a) bis (d).

Demzufolge können besonders bevorzugte chimäre Peptide der Erfindung ausgewählt werden aus

(a) einem chimären Peptid, das von einem Nucleinsäuremolekül codiert ist, wie es in einer beliebigen der SEQ ID NOs: 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 70 umd 72 gezeigt ist;
(b) einem chimären Peptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst wie sie in einer beliebigen der SEQ ID NOs: 39, 41, 43, 45, 57, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 und 73 gezeigt ist;
(c) einem chimären Peptid, das von einem Nucleinsäuremolekül codiert ist, das ein Polypeptid codiert, das mindestens 70% Sequenzidentität mit einem wie in (a) oder (b) definierten Polypeptid aufweist und das zur direkten Bestimmung der cAMP-Konzentration in vitro und/oder in vivo verwendet werden kann; und
(d) einem chimären Peptid, das von einem Nucleinsäuremolekül codiert ist, das degeneriert zu einer DNA-Sequenz wie in (a) und (c) definiert ist.

Die Erfindung betrifft ferner ein Nucleinsäuremolekül, das die vorstehend definierten chimären Peptide codiert. Solche Nucleinsäuremoleküle umfassen, sind aber nicht beschränkt auf DNA-Moleküle wie sie in den SEQ ID NOs: 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 umd 72 gezeigt sind.
Der Begriff „Nucleinsäuremolekül" wie hierin verwendet bedeutet DNA oder RNA oder beide in Kombination oder eine beliebige Modifikation davon, die im Stand der Technik bekannt ist (siehe z. B. US 5,525,711 , US 4,711,955 , US 5,792,608 oder EP 302175 für Beispiele für Modifikationen). Ein solches (solche) Nucleinsäuremolekül(e) ist (sind) einzel- oder doppelsträngig, linear oder ringförmig und ohne jede Größenlimitierung. Die Nucleinsäuremoleküle der Erfindung können zum Beispiel aus natürlichen Quellen gewonnen werden oder können synthetisch oder mittels rekombinanter Methoden hergestellt werden, wie z. B. durch PCR. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Nucleinsäuremoleküle der Erfindung DNA-Moleküle, speziell genomische DNA oder cDNA, oder RNA-Moleküle. Bevorzugt ist das Nucleinsäuremolekül doppelsträngige DNA. Spezielle erfindungsgemäße Nucleinsäuremoleküle sind Nucleinsäuremoleküle, die die Polypeptidsequenzen codieren, die in den SEQ ID NOs: 8 bis 20 dargestellt sind ebenso wie Polypeptidsequenzen, die in den SEQ ID NOs: 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 und 73 gezeigt und in den 1 und 11 abgebildet sind.
Das Nucleinsäuremolekül, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die es codiert, ist ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül, d. h. ein Nucleinsäuremolekül, das mittels einer Technik hergestellt worden ist, die nützlich ist, um Nucleinsäuremoleküle oder Teile davon künstlich zu kombinieren, die vorher nicht wie in dem so erhaltenen chimären Peptid verknüpft waren. Geeignete Methoden sind zum Beispiel im Stand der Technik verfügbar, wie durch Sambrook und Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press und Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. (1989) ebenso wie Vilardaga, Biotechniques 18: 605–606 (1995) dargestellt. Darüber hinaus sind die entsprechenden Methoden in den beigefügten Beispielen erläutert. Diese Methoden umfassen insbesondere Orts-spezifische Mutagenese.
Für die Konstruktion des chimären Peptids der Erfindung kann eine Polynucleotidsequenz verwendet werden, die eine cAMP-Bindeeinheit codiert, wobei die Polynucleotidsequenz eine Sequenzidentität von mindestens 70%, 80%, 90% oder 95% mit einer Nucleotidsequenz aufweist, welche die cAMP-Bindeeinheit einer Polypeptidsequenz codiert wie sie in den SEQ ID NOs: 1 bis 7 oder 74 oder wie vorstehend aufgeführt enthalten ist. Mit einer Nucleinsäure, die eine Nucleotidsequenz aufweist, die eine Sequenzidentität von zum Beispiel mindestens 95% zu einer in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Nucleotidsequenz hat, ist es beabsichtigt, dass die Nucleinsäure identisch mit der Referenzsequenz ist, außer dass die Nucleotidsequenz bis zu fünf Punktmutationen pro jeweils 100 Nucleotide der Referenznucleotidsequenz enthalten kann, die das Polypeptid codiert. In anderen Worten, um eine Nucleinsäure zu erhalten, die eine Nucleotidsequenz hat, die eine Sequenzidentität von mindestens 95% zu einer Referenznucleotidsequenz aufweist, dürfen bis zu 5% der Nucleotide in der Referenzsequenz deletiert oder mit einem anderen Nucleotid ausgetauscht sein, oder es kann eine Zahl von Nucleotiden von bis zu 5% der Gesamtnucleotide in der Referenzsequenz in die Referenzsequenz eingefügt werden.
Wie vorstehend dargelegt worden ist, ist der Fachmann auf dem Gebiet leicht dazu in der Lage, aus einer vorgegebenen Aminosäuresequenz oder einer vorgegebenen Nucleotidsequenz eine „cAMP-Bindeeinheit/Domäne" und/oder die cAMP-Bindestelle abzuleiten. Entsprechende Verfahren umfassen unter anderem das Verfahren, das in Dremier, FEBS Letters 546: 103–107 (2003); Rehmann, Nat. Struct. Biol. 10: 25–32 (2003) oder Kawasaki, Science 282: 2275–2279 (1998) offenbart worden ist. Die entsprechenden Verfahren umfassen demzufolge Datenbank-Suchen, entweder allein oder in Kombination mit biologischen und/oder biochemischen Assays, z. B. Restriktionsenzymverdau-Assays (und folgende Bindungsstudien von exprimierten Proteinabschnitten/fragmenten an cAMP in vitro und in vivo), Bindungsassays, Kompetitionsassays (zum Beispiel mit markiertem, z. B. radioaktivem cAMP) und dergleichen. Man sollte beachten, dass eine „cAMP-Bindestelle" in der Literatur auch als „PBC" oder „Phosphatbindungskassette" bekannt ist. Eine entsprechende „cAMP-Bindestelle" kann mit Hilfe von analogen Verfahren abgeleitet werden und umfasst normalerweise einen relativ kurzen Abschnitt von Aminosäureresten (bevorzugt zwischen 13 und 15 Aminosäuren, meistens 14) und beginnt normalerweise mit „F" (Phenylalanin) und endet mit einem „A" (Alanin); siehe auch 14 oder Rehmann (2003), a. a. O.). Ein bevorzugtes Computerprogramm im Zusammenhang mit der Bestimmung von funktionellen Teilen einer gegebenen Aminosäuresequenz ist TBLASTN; siehe auch den Algorithmus, der von Dremier (2003), a. a. O. bekannt ist).
Wie die Bestimmung von „cAMP-bindenden Domänen/Einheiten" und/oder „cAMP-Bindestellen" kann auch die Identifizierung von Nucleinsäuremolekülen und/oder Polypeptiden, die eine Sequenzidentität von mindestens 70%, 80%, 90% oder 95% mit einer Nucleotidsequenz oder einer Aminosäuresequenz aufweisen, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben ist, eine herkömmliche Bestimmung mit bekannten Computerprogrammen umfassen. Eine bevorzugte Methode zur Bestimmung der besten Gesamtübereinstimmung zwischen einer Suchsequenz (einer Sequenz der vorliegenden Erfindung) und einer Zielsequenz, die man auch als globale Sequenzanordnung bezeichnet, kann mit dem FASTDB-Computerprogramm bestimmt werden, das auf dem Algorithmus von Brutlag et al. (Comp. App. Biosc. 6: 237–245 (1990)) beruht. In einer Sequenzanordnung sind die Suchsequenz und die Ziel sequenz beide DNA-Sequenzen. Eine RNA-Sequenz kann man vergleichen, wenn man U's zu T's umwandelt. Das Ergebnis dieser globalen Sequenzanordnung wird in Prozent Identität angegeben. Bevorzugte Parameter, die in einer FASTDB-Anordnung von DNA-Sequenzen verwendet werden um den Prozentsatz der Identität zu berechnen, sind: Matrix = einheitlich, k-Tupel = 4, Mismatch-Strafwert = 1, Verbindungs-Strafwert = 30, Länge der Randomisierungsgruppe = 0, Randwert = 1, Lückenstrafwert = 5, Strafwert für Lückengröße = 0,05, Fenstergröße = 500 oder die Länge der zu testenden Nucleotidsequenz, was immer kürzer ist.
In Übereinstimmung mit dem Vorstehenden kann für die Erzeugung des chimären Peptids der Erfindung eine cAMP-Bindeeinheit verwendet werden, die eine Sequenzidentität von mindestens 70%, 80%, 90% oder 95% zu einer cAMP-Bindeeinheit eines Polypeptids aufweist wie es in den SEQ ID NOs: 1 bis 7 oder 74 gezeigt oder wie vorstehend aufgeführt ist. Besonders bevorzugte sind hierin vorstehend angegeben und umfassen unter anderem die Aminosäurereste 281–445 von EPAC2 (Domäne B), die Aminosäurereste 203–323 von EPAC1, die Aminosäurereste 274–416 der regulatorischen Untereinheit II beta von PKA, die Aminosäurereste 544–661 des durch cyclische Nucleotide gesteuerten Kaliumkanals 2, die Aminosäurereste 12–98 des Katabolit-Genaktivatorproteins, die Aminosäurereste 473–568 der Neuropathie-Ziel-Esterase oder die Aminosäurereste 628–767 des durch cyclische Nucleotide gesteuerten Kanals 4 (CNG-4).
Der Begriff „mindestens 70%" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine Sequenzidentität von 70% oder mehr.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung einen Vektor, der das wie vorstehend definierte Nucleinsäuremolekül umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Vektors der Erfindung ist dieser Vektor ein Expressionsvektor.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Clonierungsvektoren und Expressionsvektoren, insbesondere Plasmide, Cosmide, Viren (wie z. B. Adenoviren oder Retro viren) und Bakteriophagen, die üblicherweise in der Gentechnik eingesetzt werden, die ein Nucleinsäuremolekül oder eine Expressionskassette der Erfindung umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Vektoren der Erfindung geeignet für die Transformation von Pilzzellen, Pflanzenzellen, Zellen von Mikroorganismen (d. h. Bakterien, Protisten, Hefen, Algen etc.) oder Tierzellen, insbesondere Säugerzellen. Bevorzugt eignen sich sie Vektoren für die Transformation menschlicher Zellen. Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt sind, können dazu verwendet werden, rekombinante Vektoren zu konstruieren; siehe z. B. die in Sambrook und Russell (2001), a. a. O. beschriebenen Verfahren. Alternativ kann es sich bei den Vektoren um Liposomen handeln, in welche die Nucleinsäuremoleküle oder Expressionskassetten der Erfindung zur Abgabe an die Zielzellen rekonstituiert werden können. Ebenso bezieht sich der Begriff „Vektor" auf Komplexe, die solche Nucleinsäuremoleküle oder Expressionskassetten enthalten, welche darüber hinaus Verbindungen umfassen, die dafür bekannt sind, dass sie Gentransfer in Zellen erleichtern, wie z. B. Polykationen, kationische Peptide und dergleichen.
Außer dem Nucleinsäuremolekül oder der Expressionskassette der Erfindung kann der Vektor weitere Gene enthalten, wie z. B. Markergene, die eine Selektion dieses Vektors in einer geeigneten Wirtszelle und unter geeigneten Bedingungen erlauben. Im Allgemeinen enthält der Vektor auch einen oder mehrere Replikationsursprünge. Vorteilhafterweise sind die Nucleinsäuremoleküle, die in den Vektoren enthalten sind, funktionell mit Expressionskontrollsequenzen verknüpft, die Expression ermöglichen, d. h. Transkription und Synthese einer translatierbaren RNA in prokaryontischen und eukaryontischen Zellen sicherstellen.
In einer Ausführungsform ist die Expression der Nucleinsäuremoleküle der Erfindung in prokaryontischen und eukaryontischen Zellen interessant, weil sie die Herstellung des chimären Peptids der Erfindung ermöglicht. Darüber hinaus ist es möglich, mit Hilfe von in der Molekularbiologie üblichen Verfahren verschiedene zusätzliche Mutationen in die Nucleinsäuremoleküle einzuführen (siehe z. B. Sambrook und Russell (2001), a. a. O.), was zur Synthese von Proteinen führt, die möglicherweise modifizierte Eigenschaften aufweisen, z. B. was die Bindungsaffinität oder die Effizienz der Energieemission (z. B. RET) anbelangt. In dieser Hinsicht ist es möglich, die in dem Vektor vorhandenen Nucleinsäuremoleküle durch Einführen oder Deletieren von codierenden Sequenzen zu mutieren oder Aminosäuresubstitutionen einzuführen indem man die entsprechenden Codon-Tripletts austauscht.
Zur gentechnischen Veränderung, z. B. in prokaryontischen Zellen, kann man die Nucleinsäuremoleküle der Erfindung oder Teile dieser Moleküle in Plasmide einführen, die Mutagenese oder Sequenzmodifikation durch Rekombination von DNA-Sequenzen erlauben. Standardmethoden (siehe Sambrook und Russell (2001), a. a. O.) ermöglichen die Durchführung von Basenaustauschreaktionen oder das Hinzufügen von natürlichen oder synthetischen Sequenzen. Auf ähnliche Weise kann man zur Expression in eukaryontischen Zellen entsprechende Expressionsvektoren wie z. B. pcDNA3 verwenden. DNA-Fragmente lassen sich miteinander verbinden indem man Adaptoren und Linker an die Fragmente anbringt. Darüber hinaus können gentechnische Maßnahmen verwendet werden, die geeignete Restriktionsstellen zur Verfügung stellen oder überflüssige DNA oder Restriktionsstellen entfernen. In jenen Fällen, in denen Insertionen, Deletionen oder Substitutionen möglich sind, kann man in vitro-Mutagenese, „Primerreparatur", Restriktion oder Ligierung einsetzen. Im Allgemeinen führt man Sequenzanalyse, Restriktionsanalyse und andere Verfahren der Biochemie und Molekularbiologie als Analyseverfahren durch. Die Expression des Nucleinsäuremoleküls der vorliegenden Erfindung erfolgt bevorzugt in einer stabilen Zelllinie. Prozeduren zur Selektion von stabil transfizierten Zelllinien sind auf dem Fachgebiet bekannt; siehe unter anderem Vilardaga, J. Biol. Chem. 276: 33435–33443 (2001). Bevorzugte Wirtszellen sind CHO-Zellen, HEK 293-, Cos 7-, HeLa-, PC12- oder NIH 3T3-Zellen oder sogar primäre Zellen wie primäre Cardiomyocyten, Fibroblasten, Endothel- oder embryonale Stammzellen, wobei es sich bei diesen primären Zellen nicht um menschliche Embryonalzellen handelt.
Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung Expressionskassetten, welche das vorstehend beschriebene Nucleinsäuremolekül der Erfindung umfassen und funktionell damit verknüpfte Kontrollsequenzen, die eine Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen ermöglichen.
Geeignete Expressionskontrollsequenzen umfassen Promotoren, die in dem Zielwirtsorganismus oder der Wirtszelle einsetzbar sind. Solche Promotoren sind dem Fachmann auf dem Gebiet für diverse Wirte aus prokaryontischen und eukaryon tischen Organismen wohlbekannt und sind in der Literatur beschrieben. Solche Promotoren können zum Beispiel aus natürlich vorkommenden Genen isoliert werden oder es kann sich um synthetische oder chimäre Promotoren handeln. Ebenso kann der Promotor bereits in dem Zielgenom vorhanden sein und mittels einer geeigneten auf dem Fachgebiet bekannten Methode mit dem Nucleinsäuremolekül verknüpft werden, wie z. B. durch homologe Rekombination. Spezielle Beispiele von Expressionskontrollsequenzen und Quellen, aus denen diese abgeleitet werden können, sind weiter nachstehend und in den beigefügten Beispielen angegeben.
Expressionskassetten gemäß der Erfindung sind insbesondere für eine leicht verwendbare Insertion in Zielnucleinsäuremoleküle wie z. B. Vektoren oder genomische DNA gedacht. Zu diesem Zweck wird die Expressionskassette bevorzugt mit Nucleotidsequenzen an ihren 5'- und 3'-flankierenden Regionen bereitgestellt, was deren Entfernung aus und Insertion in spezifische Sequenzpositionen wie z. B. Restriktionsenzymerkennungsstellen oder Zielsequenzen für homologe Rekombination erleichtert, wie beispielsweise durch Rekombinasen katalysiert.
Die Erfindung betrifft auch einen Wirt, der mit dem vorstehend dargelegten Vektor oder dem Nucleinsäuremolekül transformiert ist.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft Wirtszellen, insbesondere prokaryontische oder eukaryontische Zellen, die mit einem vorstehend beschriebenen Nucleinsäuremolekül, einer vorstehend beschriebenen Expressionskassette oder einem vorstehend beschriebenen Vektor der Erfindung genetisch verändert worden sind, und auf Zellen, die von solchen transformierten Zellen abstammen und ein Nucleinsäuremolekül, eine Expressionskassette oder einen Vektor der Erfindung enthalten sowie auf Zellen, die sich durch das vorstehend erwähnte Verfahren zur Herstellung derselben erhältlich sind. Wie nachstehend dargelegt ist, betrifft die Erfindung auch nicht-menschliche transgene Tiere, die Nucleinsäuresequenzen umfassen, welche die chimären Peptide der Erfindung codieren.
Bevorzugt handelt es sich bei den Wirtszellen um bakterielle, Pilz-, Insekten-, Pflanzen- oder tierische Wirtszellen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle genetisch auf eine solche Weise verändert, dass sie das eingeführte Nucleinsäuremolekül stabil in das Genom integriert enthält. Stärker bevorzugt kann das Nucleinsäuremolekül exprimiert werden, so dass es zur Produktion des chimären Peptids der Erfindung führt.
Eine klassische Übersicht über verschiedene Expressionssysteme ist zum Beispiel in Methods in Enzymology 153: 385–516 (1987); in Bitter et al., Methods in Enzymology 153: 516–544 (1987) und in Sawers et al., Applied Microbiology and Biotechnology 46: 1–9 (1996), Billman-Jacobe (Curr. Opin. Biotechnol. 7: 500–504 (1996)), Hockney (Trends in Biotechnology 12: 456–463 (1994)), Griffiths et al., (Methods in Molecular Biology 75: 427–440 (1997)) enthalten. Ein Überblick über Hefe-Expressionssysteme wird zum Beispiel von Hensing et al. (Antoine van Leuwenhoek 67: 261–279 (1995), Bussineau (Developments in Biological Standardization 83: 13–19 (1994)), Gellissen et al., (Antoine van Leuwenhoek 62: 79–93 (1992)), Fleer (Curr. Opin. Biotechnol. 3: 486–496 (1992)), Vedvick (Curr. Opin. Biotechnol. 2: 742–745 (1991)) und Guckholz (Bio/Technology 9: 1067–1072 (1991)) gegeben. Besonders bevorzugte Expressionssysteme umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Sf9-Zellen, E. coli-Zellen oder Säugerzellen wie z. B. CHO-Zellen, HEK 293-, Cos 7-, HeLa-, PC12- oder NIH 3T3-Zellen.
Expressionsvektoren sind in der Literatur umfassend beschrieben worden. In der Regel enthalten sie nicht nur ein Selektionsmarkergen und einen Replikationsursprung, welcher Replikation in dem ausgewählten Wirt gewährleistet, sondern auch einen bakteriellen oder viralen Promotor und, in den meisten Fällen, ein Transkriptionsterminationssignal. Zwischen dem Promotor und dem Terminationssignal gibt es im Allgemeinen mindestens eine Restriktionsstelle oder einen Polylinker, die (der) die Insertion einer codierenden Nucleotidsequenz ermöglicht. Es ist möglich, Promotoren zu verwenden, die eine konstitutive Expression des Gens gewährleisten, und induzierbare Promotoren, die eine freie Kontrolle der Expression des Gens erlauben. Bakterielle und virale Promotorsequenzen, die diese Eigenschaften besitzen, sind in der Literatur ausführlich beschrieben. Regulatorische Sequenzen zur Expression in Mikroorganismen (zum Beispiel E. coli, S. cerevisiae) sind in der Literatur in ausreichendem Maße beschrieben. Promotoren, die eine besonders hohe Expression einer stromabwärts gelegenen Sequenz ermöglichen, sind zum Beispiel der T7 Promotor (Studier et al., Methods in Enzymology 185: 60–89 (1990), lacUV5, trp, trp-lacUV5 (De Boer et al. in Rodriguez und Chamberlin (Hrsg.), Promoters, Structure and Function; Praeger, New York (1982), 462–481; De Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 21–25 (1983); Ip1, rac (Boros et al., Gene 42, 97–100 (1986)). Induzierbare Promotoren werden vorzugsweise für die Synthese von Proteinen verwendet. Diese Promotoren führen oft zu höheren Proteinausbeuten als konstitutive Promotoren. Um eine optimale Menge an Protein zu erhalten, wird oft ein Zweischritt-Verfahren verwendet. Zunächst werden die Wirtszellen unter optimalen Bedingungen gezüchtet, bis sie eine relativ hohe Zelldichte erreichen. Im zweiten Schritt wird abhängig von der Art des verwendeten Promotors Transkription induziert. In dieser Hinsicht ist ein tac-Promoter besonders geeignet, der durch Lactose oder IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) induziert werden kann (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21–25 (1983). Terminationssignale für die Transkription wie z. B. die SV40-polyA-Stelle oder die tk-polyA-Stelle, die für Anwendungen in Säugerzellen nützlich sind, sind ebenfalls in der Literatur beschrieben. Geeignete Expressionsvektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt, wie z. B. der Okayama-Berg cDNA-Expressionsvektor pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/RSV/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen; siehe auch beigefügte Beispiele), pSPORT1 (Gibco-BRL) oder pCI (Promega).
Die Transformation der Wirtszelle mit einem Nucleinsäuremolekül oder Vektor gemäß der Erfindung kann mittels Standardmethoden durchgeführt werden, wie sie zum Beispiel in Sambrook und Russell (2001), a. a. O. beschrieben sind. Die Wirtszelle wird in Nährmedium gezüchtet, das die Erfordernisse der jeweils verwendeten Wirtszelle erfüllt, insbesondere im Hinblick auf den pH-Wert, Temperatur, Salzkonzentration, Belüftung, Antibiotika, Vitamine, Spurenelemente etc. Das chimäre Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung kann mit Hilfe von Verfahren aus rekombinanten Zellkulturen wiedergewonnen und aufgereinigt werden, die Ammoniumsulfat- oder Ethanol-Präzipitation, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie, Phosphocellulose-Chromatographie, hydrophobe Interaktions-Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie, Hydroxylapatit-Chromatographie und Lectin-Chromatographie umfassen. Sofern das chimäre Peptid der Erfindung als ein Membranprotein exprimiert wird, kann man das Protein aufreinigen, indem man Detergenzien wie Triton X-100 oder SDS einsetzt. Gegebenenfalls kann man bei der Vervollständigung der Konfiguration des Proteins Schritte zur Rückfaltung des Proteins verwenden. Ein solches aufgereinigtes chimäres Peptid kann unter anderem wieder zusammengesetzt und/oder in eine künstliche biologische Membran wie Liposomen, Rohpräparationen von Membranen oder Lipid-Doppelschichten eingeführt werden.
Bevorzugt handelt es sich bei dem Wirt um eine Säugerzelle, eine Amphibienzelle, eine Fischzelle, eine Insektenzelle, eine Pilzzelle, eine Pflanzenzelle oder eine bakterielle Zelle oder um ein transgenes nicht-menschliches Tier.
Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus nicht-menschliche transgene Organismen, d. h. multizelluläre Organismen, die ein Nucleinsäuremolekül umfassen, das ein chimäres Peptid der Erfindung oder eine Expressionskassette oder einen Vektor wie vorstehend beschrieben codiert, bevorzugt stabil in dessen Genom integriert, mindestens in einem Teil der Zellen dieses Organismus, oder in Teilen davon wie z. B. Geweben oder Organen. Am meisten bevorzugt handelt es sich bei einem solchen nicht-menschlichen Ursprung des Transgens um ein Säugetier wie eine Maus, eine Ratte, ein Schaf, eine Ziege, ein Schwein, einen Hund, eine Ratte oder ein Pferd.
Das transgene Tier, das das chimäre Peptid der vorliegenden Erfindung exprimiert, ist besonders nützlich in pharmakologischen Studien, bei Screeningverfahren und bei Verfahren zur Identifizierung wie hierin bereitgestellt. Es ist zu beachten, dass gerade für diese Studien nicht nur Zellen, sondern auch Organe oder Teile von Organen dieser nicht-menschlichen transgenen Tiere besonders nützlich sind. Es ist vorgesehen, dass zum Beispiel Herz, Blutgefäße, Muskel, Drüse, Knochen, Niere oder Leber oder Gehirn oder Kulturen von Hirngewebeschnitten des hierin beschriebenen nicht-menschlichen transgenen Tiers bei dem hierin bereitgestellten Screeningverfahren und Verfahren zur Identifizierung verwendet werden. Neben den nicht-menschlichen transgenen Tieren, die Säugetiere sind, ist es auch vorgesehen, dass es sich bei diesen nicht-menschlichen transgenen Organismen auch um ein Amphibium, ein Insekt, ein Pilz oder sogar eine Pflanze handeln kann. Besonders bevorzugte nicht-menschliche transgene Tiere in diesem Kontext sind Drosophila, C. elegans, Xenopus ebenso wie Hefen wie S. pombe oder S. cerevisiae oder die Aspergillus-Spezies. Transgene Pflanzen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Weizen, Tabak, Petersilie oder Arabidopsis.
Wie hierin vorstehend erwähnt und insbesondere in den beigefügten Beispielen bildlich dargestellt, sind die hierin definierten chimären Peptide besonders nützlich bei Screening-Verfahren und Verfahren zur Identifizierung von Molekülen oder Verbindungen, die in der Lage sind, die Bindung von cAMP an das chimäre Peptid oder die biologische und/oder pharmakologische Aktivität von Adenylylcyclasen und/oder Phosphodiesterasen zu modifizieren. Wie die Beispiele zeigen kann Adenosin als ein Agonist von Gs-Protein-gekoppelten Rezeptoren eine Erhöhung von cAMP in der Zelle induzieren. Direkte Aktivatoren von Adenylylcyclase wie z. B. Forskolin erzeugen ebenfalls ein nachweisbares FRET-Signal.
Stärker bevorzugt handelt es sich bei dieser Säugerzelle um eine CHO-Zelle, eine HEK 293-, HeLa-, Cos 7-, PC12- oder NIH 3T3-Zelle ebenso wie um primäre Zellkulturen wie neuronale Kulturen. Wie es einem Fachmann auf dem Gebiet ersichtlich ist, können auch primäre Zellen oder transgene Tiere, die das chimäre Peptid exprimieren für diese Screening-Verfahren und Verfahren zur Identifizierung eingesetzt werden.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Wirts der Erfindung ist die Amphibienzelle eine Oocyte, bevorzugt eine Xenopus-Oocyte.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Zellen oder von Wirten, die in der Lage sind, das chimäre Peptid der Erfindung zu exprimieren, was die gentechnische Veränderung von Zellen oder Wirten mit einem vorstehend beschriebenen Nucleinsäuremolekül, einer vorstehend beschriebenen Expressionskassette oder einem vorstehend beschriebenen Vektor der Erfindung umfasst.
Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Produktion des chimären Peptids wie vorstehend definiert, umfassend Züchten/Aufziehen des vorstehend erwähnten Wirts und gegebenenfalls Isolieren und/oder Aufreinigen des produzierten chimären Peptids.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung chimäre Peptide, die mit Hilfe eines Verfahrens zu deren Herstellung wie vorstehend beschrieben erhältlich sind. Demzufolge betrifft eine weitere Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren zur Produktion des chimären Peptids der Erfindung, umfassend das Züchten der vorstehend beschriebenen Wirtszellen unter Bedingungen, welche die Expression des chimären Peptids erlauben, und das Wiedergewinnen des chimären Peptids aus den Membranen der Wirtszelle oder des Wirtsorganismus. Sofern das chimäre Peptid in den Membranen der Wirtszellen lokalisiert ist, kann das Protein durch eine Behandlung mit Detergens aus den gezüchteten Zellen wiedergewonnen werden.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein in vitro-Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von cAMP in einer Probe, umfassend das Zugeben des chimären Peptids wie vorstehend definiert oder wie mit Hilfe des erwähnten Verfahrens erhältlich zu der Probe und Messen/Erfassen von FRET oder BRET und Bestimmen der cAMP-Konzentration in der Probe durch Vergleichen der Werte der Fluoreszenzemission mit einer Standardkurve, die mit definierten Konzentrationen von cAMP erhalten wurde.
Wie bereits hierin vorstehend erklärt, erleichtern die dem Nachweis dienenden Teile/Markierungen, die in dem chimären Peptid der Erfindung vorhanden sind, den Nachweis einer Konformationsänderung innerhalb des chimären Peptids der Erfindung auf eine Bindung von cAMP hin, was wiederum zu einer Änderung der Energie führt, die von den dem Nachweis dienenden Teilen/Markierungen emittiert wird, was mittels FRET oder BRET verfolgt werden kann. Die Konformationsänderung der cAMP-Bindeeinheit auf die Bindung von cAMP hin führt zu einer nachweisbaren Veränderung von RET zwischen den dem Nachweis dienenden Teilen/Markierungen. Eine solche Veränderung kann zum Beispiel aus einem Vergleich der Emissionsspektren einer cAMP-Bindeeinheit in Abwesenheit einer geeigneten bindenden Verbindung, d. h. cAMP, mit derselben cAMP-Bindeeinheit in Anwesenheit einer solchen Verbindung entnommen werden. Wenn zum Beispiel RET zunimmt, ist der Emissions-Peak des Akzeptors erhöht und der Emissions-Peak des Donors ist verringert. Somit ist das Verhältnis der Stärke der Emission des Akzeptors zu der des Donors ein Hinweis auf das Maß von RET zwischen den dem Nachweis dienenden Teilen. Die Konformationsänderung des chimären Peptids auf die Bindung von cAMP hin kann entweder zu einer Abnahme oder zu einer Zunahme der Distanz zwischen den dem Nachweis dienenden Teilen führen. Somit stellt das chimäre Peptid der Erfindung ein monomolekulares Werkzeug bereit, das besonders geeignet ist, die cAMP-Spiegel in einer Probe direkt zu bestimmen. Zum Beispiel kann man das wie vorstehend definierte chimäre Peptid zu einer Probe hinzugeben und man kann, indem man FRET oder BRET misst und/oder erfasst, die cAMP-Konzentration in der Probe, z. B. einer Zelle, einem Zelllysat, einem Rohzellextrakt, einer Membranpräparation oder einem Gewebe messen, indem man die Werte der Fluoreszenzemission mit einer Standardkurve vergleicht, die man mit definierten Konzentrationen von cAMP erhalten hat. Um ein Beispiel für einen möglichen Assay zur Messung von cAMP in vitro zu geben, können Zellen transient mit einem Plasmid transfiziert werden, das z. B. ein auf EPAC2 basierendes chimäres Peptid codiert, das wie vorstehend beschrieben CFP und YFP beinhaltet. 24 Std. nach Transfektion kann man Zelllysate präparieren und Emissionsspektren nach Zugabe von verschiedenen cAMP-Konzentrationen wie in den Beispielen angegeben aufnehmen. Eine Abnahme der Intensität bei 525 nm mit einer Zunahme bei 475 nm stellt einen Verlust an FRET-Signal zwischen CFP und YFP dar. Das Verhältnis der Signal-Intensität 475 nm/Intensität 525 nm zur cAMP-Konzentration kann für anschließende genaue Messungen der cAMP-Konzentration bei verschiedenen unbekannten Proben in einer Sättigungskurve aufgetragen werden.
In einem alternativen in vitro-Assay, der zur Bestimmung der cAMP-Konzentration in einer Probe verwendet werden kann, wird zum Beispiel ein mit einem His-Tag versehener EPAC-cAMP-FRET-Sensor der Erfindung in Sf9- oder E. coli-Zellen exprimiert. Anschließend wird das Protein mittels geeigneter Aufreinigungsverfahren isoliert, z. B. indem man eine Nickelsäule einsetzt. Im Folgenden wird ein definiertes Volumen einer Pufferlösung, die eine bestimmte Konzentration des chimären Peptids der Erfindung enthält, zu einem definierten Volumen der Probe hinzugegeben. Die Veränderung beim FRET der Probe wird mit Hilfe eines Photometers nachgewiesen, das für den Nachweis von FRET geeignet ist, zum Beispiel einem Plattenlesegerät für Platten mit 96 Vertiefungen. Gleichzeitig wird eine Kalibrierungskurve aufgenommen indem man Aliquots der Probe verwendet, zu denen definierte Mengen von cAMP zugegeben werden. Es werden Veränderungen beim FRET verfolgt, die durch die Bindung von cAMP an das chimäre Peptid der Erfindung hervorgerufen werden, was FRET verringert.
In Übereinstimmung mit dem Vorhergehenden kann es sich bei der Probe wie sie hierin definiert ist, zum Beispiel um eine Zelle, um ein Zelllysat, einen Rohzellextrakt, eine Membranpräparation, ein Gewebe oder um Bioflüssigkeiten handeln. Bioflüssigkeiten wie hierin verwendet beziehen sich bevorzugt auf Körperflüssigkeiten wie z. B. Samen, Lymphe, Seren, Plasma, Urin, Gelenkflüssigkeit oder Liquor.
Der vorstehend beschriebene Assay, bei dem das chimäre Peptid der Erfindung verwendet wird, zeigt verschiedene Vorteile. Zum Beispiel sind diese Assays empfindlich für Proben, die von verschiedenen Quellen abgeleitet sind. Fluoreszenz wird gemäß dem Industrie-Standard nachgewiesen. Des Weiteren ist die Geschwindigkeit des Nachweises sehr hoch, d. h. < 10 Min. im Vergleich zu > 1 Std. mit üblichen Radioimmunassays (RIA). Des Weiteren zeigt der vorstehende Assay eine hohe Selektivität für cAMP im Vergleich zu ATP, was bei vielen RIA-Assays nicht der Fall ist. Darüber hinaus ist er kostengünstig und der FRET-Sensor kann in großen Mengen hergestellt werden, indem man ihn in Sf9/E. coli exprimiert, was für Antikörper nicht der Fall ist. Außerdem ist der vorstehend beschriebene Assay für HTS anwendbar. Schließlich kann der Assay, wenn die Fluorophore in dem vorstehenden Assay durch Luciferase ersetzt werden, für BRET angepasst werden.
Wie es Fachleuten auf dem Gebiet ersichtlich ist, können die chimären Peptide der Erfindung auch in vitro markiert werden, indem man chemische Fluoreszenz-Markierungen verwendet.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Überwachen über Raum und Zeit der Menge, der Verteilung, der Lokalisierung oder der Schwankung von cAMP in einer lebenden Zelle oder einem lebenden Gewebe, umfassend das Transformieren einer Zelle oder eines Gewebes mit der Nucleinsäure oder dem Vektor der Erfindung und das Messen/Erfassen von FRET oder BRET in der lebenden Zelle oder dem lebenden Gewebe ebenso wie in lebenden (nicht-menschlichen) transgenen Tieren.
Durch Messen der FRET-Veränderungen mit Hilfe des chimären Peptids der Erfindung ist es möglich, Veränderungen der Konzentration von cAMP in Einzelzellen mit einer hohen räumlichen und zeitlichen (d. h. zeitlich im ms-Bereich) Auflösung zu verfolgen. Die neue Methodik ist auf einzigartige Weise dazu geeignet, die cAMP-Signalgebung zeitlich und topographisch zu kartieren und besitzt das Potenzial, neue Aspekte dieses Übertragungssystems aufzudecken ebenso wie die genauen Einzelheiten der Biochemie von cAMP in vivo darzustellen.
Darüber hinaus kann das chimäre Peptid der Erfindung dazu verwendet werden zu untersuchen, wie der cAMP-Signalweg innerhalb der dreidimensionalen Matrix von Zellen organisiert und reguliert ist, um dessen zeitliche Dynamik zu analysieren und um Anpassungs-/Veränderungs-Mechanismen genau zu beschreiben, die bei physiopathologischen Zuständen in verschiedenen Zelltypen in Gang gesetzt werden. Zum Beispiel ist es möglich, Zelltypen zu untersuchen, in denen cAMP eine Schlüsselrolle spielt, wie z. B. kardiäre Myocyten. Es ist kürzlich gezeigt worden, dass in kardiären Myocyten von Neugeborenen eine Stimulation des β-adrenergen Rezeptors lokale Mikrodomänen von hohem cAMP erzeugt, welche durch die Aktivität von Phosphodiesterasen aufrechterhalten werden (Zaccolo, M., Pozzan, T. Discrete microdomains with high concentration of cAMP in stimulated rat neonatal cardiac myocytes. Science 295 (5560): 1711–5 (1. Mär. 2002)). Das chimäre Peptid der Erfindung kann dazu verwendet werden, solche Untersuchungen auszuweiten um detaillierte Informationen über die Kinetik von cAMP, die räumlich-zeitliche Dynamik der Aktivierung von 7-Transmembran-Rezeptoren, Adenylylcyclasen oder Phosphodiesterasen und den damit zusammenhängenden regulatorischen Mechanismen zu gewinnen. Anschließend kann man pathologische Zustände untersuchen, bei denen man eine mögliche Rolle für die cAMP-Signalgebung vorgeschlagen hat. Solche Krankheitszustände umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Diabetes mellitus, kardiäre Hypertrophie, Herzinsuffizienz oder Bluthochdruck. Darüber hinaus ist es gut beschrieben, dass die cAMP-Signalgebung beim Lernen, beim Gedächtnis und bei Immunreaktionen beteiligt ist, wie bereits vorstehend dargelegt worden ist. Außerdem ist es breit akzeptiert, dass der cAMP-Signalweg eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle der Proliferation spielt, die molekularen Details der cAMP-abhängigen Regulation des Zellzyklus sind jedoch wegen der Schwierigkeit in vivo das spezifische molekulare Ereignis, das durch cAMP beeinflusst wird, zu verfolgen, noch kaum verstanden. Somit kann das chimäre Peptid der Erfindung für eine auf FRET/BRET basierende Überwachung von cAMP in prokaryontischen oder eukaryontischen, bevorzugt in Säugerzellen eingesetzt werden, um die Rolle des cAMP-Signalwegs bei der Kontrolle des Zellzyklus und bei der Proliferation der Zelle zu untersuchen. Zum Beispiel können Clone von stabilen Säugerzelllinien etabliert werden, die das chimäre Peptid der Erfindung exprimieren, und man kann die cAMP-Veränderungen messen indem man die Dynamik von cAMP während des Zellzyklusses von synchronisierten Zellen verfolgt. Anschließend kann man dieselbe Art von Untersuchungen auf ungestörte Einzelzellen ausdehnen.
Das chimäre Peptid der Erfindung kann auch zur Überwachung über Raum und Zeit der Menge, der Verteilung, der Lokalisierung oder der Schwankung von cAMP in Geweben, zum Beispiel in Organen eines transgenen Tiers verwendet werden, welches das chimäre Peptid der Erfindung exprimiert. Indem man Gewebe-spezifische Promotoren verwendet, kann man das chimäre Peptid zum Beispiel in einem bestimmten Gewebe oder Organ von transgenen Tieren exprimieren, um die cAMP-Signalgebung bei der Entstehung von Organen oder bei der Pathogenese von Krankheiten dieses Organs zu studieren. Natürlich sind diese nur nicht beschränkende Beispiele ohne die Ausführungsformen der Erfindung zu beschränken.
Demnach stellt das chimäre Peptid der Erfindung einen cAMP-Sensor bereit, der sich besonders für den Nachweis der intrazellulären cAMP-Konzentration in lebenden Zellen, Geweben und transgenen Tieren mittels eines Photometers mit einer Zeitauflösung im ms-Bereich eignet. Solche Assays zeigen verschiedene Vorteile im Vergleich zu dem auf dem Fachgebiet beschriebenen PKA-FRET-Assay (Zaccolo et al., a. a. O.). Bis heute ist der PKA-FRET-Assay der einzige, der für eine Anwendung in lebenden Zellen geeignet ist. Der PKA-FRET-Assay beruht auf dem Nachweis von FRET zwischen zwei Untereinheiten von Proteinkinase A, die über die Bindung von 4 cAMP-Molekülen aktiviert wird. Der Mechanismus der Bindung ist sehr kompliziert, da alle der vier Bindungsstellen kooperativ reguliert sind. Aus diesem Grund verwenden die Erfinder ein chimäres Peptid als ein intramolekulares FRET-System, das nur eine cAMP-Bindungsstelle enthält. Grundsätzlich gibt es Unterschiede bei der Hand habung und der Anwendung der zwei vorstehend erwähnten Assay-Typen, die zu den Vorteilen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung führen. Das chimäre Peptid der vorliegenden Erfindung ist biologisch inaktiv, da regulatorische Domänen des Proteins mit Ausnahme der cAMP-Bindungsdomäne deletiert worden sind. Daher kann der Sensor der Erfindung in jeder Zelle exprimiert werden, ohne Problem zu verursachen, zum Beispiel stört er nicht die Biologie oder Physiologie der Zelle. Somit ist es möglich, stabile Zelllinien und transgene Organismen zu erzeugen. Darüber hinaus werden Rückkopplungsmechanismen, die sich auf die Produktion von cAMP auswirken, nicht aktiv modifiziert, im Gegensatz zu dem PKA-FRET-Verfahren, das auf dem Fachgebiet beschrieben ist. Darüber hinaus ist die Stöchiometrie der Fluorophore in dem intramolekularen FRET-System stets 1:1. Im Gegensatz dazu ist die Stöchiometrie der Fluorophore in dem PKA-FRET-System variabel und kann nicht reguliert werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Identifizierung von Molekülen oder von Verbindungen, die in der Lage sind, die Bindung von cAMP an das chimäre Peptid der Erfindung zu aktivieren oder zu hemmen, umfassend die Schritte:

(a) Transfizieren der Nucleinsäure oder des Vektors der Erfindung in eine Zelle, wodurch das chimäre Peptid der Erfindung exprimiert wird;
(b) Inkontaktbringen dieser Zelle mit (einem) zu testenden Molekül(en) oder (einer) zu testenden Verbindung(en); und
(c) Messen, inwieweit diese(s) zu testende(n) Molekül(e) oder diese zu testende(n) Verbindung(en) zu einer Veränderung in der Energie führen, die von den nachweisbaren Markierungen emittiert wird, die in dem wie vorstehend definierten chimären Peptid enthalten sind.

Wie hierin vorstehend erwähnt und insbesondere in den beigefügten Beispielen erläutert, sind die hierin definierten chimären Peptide besonders nützlich bei Screeningverfahren und bei Verfahren zur Identifizierung von Molekülen oder Verbindungen, die in der Lage sind, die Bindung von cAMP an die cAMP-Bindestelle des chimären Peptids der Erfindung zu modifizieren, d. h. zu aktivieren oder zu hemmen. Zum Beispiel kann man Zellen wie vorstehend dargelegt mit der Nucleinsäure oder dem Vektor der Erfindung transfizieren, was eine Expression des chimären Peptids der Erfindung zur Folge hat. In einem folgenden Schritt bringt man diese Zellen mit (einem) zu testenden Molekül(en) oder (einer) zu testenden Verbindung(en) in Kontakt. Durch Messen, ob diese(s) zu testende(n) Molekü(e) oder diese zu testende(n) Verbindung(en) zu einer Veränderung der Energie führen, die von den zwei nachweisbaren Markierungen emittiert wird, die in dem chimären Peptid enthalten sind, ist es möglich, Moleküle oder Verbindungen zu identifizieren, die in der Lage sind, die Bindung von cAMP an das chimäre Peptid der Erfindung zu aktivieren oder zu hemmen. Wie die Beispiele zeigen, basiert die vorliegende Erfindung auf dem überraschenden Befund, dass man auf dem chimären Peptid der Erfindung eine intramolekulare RET-Analyse durchführen kann, basierend auf einer Konformationsänderung auf die Bindung von cAMP hin, die eine Veränderung der Energie zur Folge hat (messbar mittels FRET oder BRET). Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung zum ersten Mal Mittel und Verfahren bereit, mit denen die Aktivierung (ebenso wie Deaktivierung) oder Hemmung der Bindung von cAMP an das chimäre Peptid der Erfindung mit einer hohen Auflösung und innerhalb einer physiologischen Kinetik beobachtet werden kann. Insbesondere werden hoch auflösende Assays für Konformationsänderungen/Aktivierungs- oder Inhibitions-Schalter des chimären Peptids der Erfindung in lebenden Zellen bereitgestellt. Daher gewährleistet die vorliegende Erfindung eindeutiges Screening ebenso wie Verfahren zur Identifizierung von Agonisten, partiellen Agonisten, inversen Agonisten ebenso wie von Antagonisten des chimären Peptids der Erfindung. Im Kontext dieser Erfindung ebenso wie in Übereinstimmung mit den pharmakologischen Wissenschaften kann der Begriff „Agonist" auf ein Molekül oder eine Verbindung eingegrenzt werden, das (die) Bindung von cAMP an das chimäre Peptid der Erfindung aktiviert. Als „partielle Agonisten" werden im Fachgebiet Moleküle/Verbindungen definiert, die sich wie Agonisten verhalten, aber die, sogar bei hohen Konzentrationen, die Bindung von cAMP an das chimäre Peptid der Erfindung nicht bis zum gleichen maximalen Ausmaß aktivieren können wie volle Agonisten. Der Begriff „Antagonist" bezieht sich auf Moleküle/Verbindungen, welche die Bindung von cAMP an das chimäre Peptid der Erfindung hemmen.
Die Identifizierung und/oder Charakterisierung von Molekülen, die in der Lage sind, die Bindung von cAMP an das chimäre Peptid der Erfindung zu aktivieren oder zu hemmen, kann unter anderem durch Transfizieren einer geeigneten Wirtszelle mit einem Nucleinsäuremolekül erreicht werden, das das chimäre Peptid der Erfindung codiert. Solche Wirte umfassen, sind aber nicht beschränkt auf CHO-Zellen, HEK 293-, HeLa-, Cos 7-, PC12- oder NIH 3T3-Zellen, (primäre) Cardiomyocyten, Fibroblasten, Endothel- oder embryonale Stammzellen, (primäre) in Kultur gehaltene Nervenzellen, Muskelzellen oder Frosch-Oocyten, wobei es sich bei diesen Zellen nicht um menschliche embryonale Zellen handelt. Die Transfektion kann in Form einer transienten Transfektion erfolgen. Alternativ können stabile Zelllinien verwendet werden, die das chimäre Peptid der Erfindung exprimieren. Die Zellen werden dann mit (einem) zu testenden Molekül(en) oder (einer) zu testenden Verbindung(en) in Kontakt gebracht und man misst, ob diese(s) Molekül(e) oder diese Verbindung(en) zu einer Veränderung in der Energie führen, die von den zwei nachweisbaren Markierungen emittiert wird, die in dem wie vorstehend definierten chimären Peptid enthalten sind. Wie die beigefügten Beispiele veranschaulichen, umfassen die besonders bevorzugten Messverfahren die FRET- oder BRET-Messungen.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Identifizierung von Molekülen oder Verbindungen, die in der Lage sind, die biologische/pharmakologische Funktion einer Adenylylcyclase oder einer Phosphodiesterase zu aktivieren, zu desaktivieren oder zu inaktivieren, umfassend die Schritte:

(a) Transfizieren der Nucleinsäure oder des Vektors der Erfindung in eine Zelle, die eine Adenylylcyclase oder eine Phosphodiesterase exprimiert;
(b) Inkontaktbringen dieser Zelle mit (einem) zu testenden Molekül(en) oder (einer) zu testenden Verbindung(en); und
(c) Messen, ob diese(s) zu testende(n) Molekül(e) oder diese zu testende(n) Verbindung(en) zu einer Veränderung in der Energie führen, die von den zwei nachweisbaren Markierungen emittiert wird, die in dem wie vorstehend definierten chimären Peptid enthalten sind.

Das hierin definierte chimäre Peptid ist besonders nützlich bei Screening-Verfahren und Verfahren zur Identifizierung von Molekülen oder Verbindungen, die in der Lage sind, die biologische und/oder pharmakologische Aktivität von Adenylylcyclasen oder Phosphodiesterasen zu modifizieren. Kurz erläutert, die Bindung eines Liganden an eine Reihe von Gs-Protein-gekoppelten Rezeptoren (z. B. der adrenerge β1 und β2, der Adenosin A2, der Prostaglandin E2) aktiviert Adenylylcyclase, ein cAMP produzierendes Enzym, das ein ubiquitärer sekundärer Botenstoff ist, der in der Lage ist, verschiedene Zellprozesse durch Aktivierung seiner Ziele Proteinkinase A, EPAC und durch cyclische Nucleotide gesteuerte Kanäle zu regulieren. Intrazelluläre Spiegel von cAMP werden durch spezifische Phosphodiesterasen negativ reguliert, welche die Stärke und die räumliche Organisation des Signals bestimmen. Pathologische und Therapie-induzierte Veränderungen in der cAMP-Signalgebung könnten verschiedene chronische Krankheiten oder Nebenwirkungen zur Folge haben (Herzversagen, Bronchialasthma, entzündliche Erkrankungen, Krebs) (Cooper, D. M. Regulation and organization of adenylyl cyclases and cAMP. Biochem. J. 375 (Pt 3): 517–29 (1. Nov. 2003); Conti, M., Richter, W., Mehats, C., Livera, G., Park, J. Y., Jin, C. Cyclic AMP-specific PDE4 phosphodiesterases as critical components of cyclic AMP signaling: J. Biol. Chem. 278 (8): 5493–6 (21. Feb. 2003)).
Wie die Beispiele zeigen, basiert die vorliegende Erfindung auf dem überraschenden Befund, dass man auf dem chimären Peptid der Erfindung eine intramolekulare RET-Analyse durchführen kann, basierend auf einer Konformationsänderung auf die Bindung von cAMP hin, die eine Veränderung der Energie zur Folge hat (messbar mittels FRET oder BRET). Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung zum ersten Mal Mittel und Verfahren bereit, mit denen die Aktivierung (ebenso wie Desaktivierung) des chimären Peptids der Erfindung mit einer hohen Auflösung und innerhalb einer physiologischen Kinetik beobachtet werden kann. Insbesondere werden hoch auflösende Assays für die Regulation von Adenylylcyclasen oder Phosphodiesterasen in lebenden Zellen bereitgestellt.
Gemäß den hierin bereitgestellten Verfahren gewährleistet die Erfindung die Identifizierung, die Charakterisierung und das Screenen von Verbindungen oder Molekülen, die in der Lage sind, Adenylylcyclasen oder Phosphodiesterasen zu aktivieren, zu desaktivieren oder zu inaktivieren, wobei diese Interaktion zu einer Aktivierung, einer partiellen Aktivierung, einer Hemmung oder einer partiellen Hemmung der biologischen und/oder pharmakologischen Funktion dieser Adenylylcyclasen oder Phospho diesterasen führen kann. Daher gewährleistet die vorliegende Erfindung eindeutiges Screening ebenso wie Verfahren zur Identifizierung von Agonisten, partiellen Agonisten, inversen Agonisten ebenso wie von Antagonisten von Adenylylcyclasen oder Phosphodiesterasen. Im Kontext dieser Erfindung ebenso wie in Übereinstimmung mit den pharmakologischen Wissenschaften kann der Begriff „Agonist" auf ein Molekül oder eine Verbindung eingegrenzt werden, das an Adenylylcyclasen oder Phosphodiesterasen bindet und diese aktiviert. Als „partielle Agonisten" werden im Fachgebiet Moleküle/Verbindungen definiert, die sich wie Agonisten verhalten, aber die, sogar bei hohen Konzentrationen, die Adenylylcyclasen oder Phosphodiesterasen nicht bis zum gleichen maximalen Ausmaß aktivieren können wie volle Agonisten. Der Begriff „inverser Agonist" bezieht sich auf Moleküle/Verbindungen, welche an die entsprechenden Adenylylcyclasen oder Phosphodiesterasen binden und deren Aktivität hemmen. Diese inversen Agonisten sind von besonderer Bedeutung und sichtbar, wenn die Adenylylcyclasen oder Phosphodiesterasen intrinsische von Agonisten. unabhängige Aktivität zeigen. Der Begriff „Antagonist" bezieht sich auf Moleküle/Verbindungen, die an die Adenylylcyclasen oder Phosphodiesterasen binden, aber die intrinsische Aktivität dieser Enzyme nicht verändern. Diese können auch die Bindung des entsprechenden Liganden der Adenylylcyclasen oder der Phosphodiesterasen verhindern und sie können die Bindung und Aktivierung der Adenylylcyclasen oder Phosphodiesterasen durch deren Agonisten oder partielle Agonisten verhindern.
Gemäß der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff „Antagonist" Moleküle/Substanzen, die in der Lage sind, einen agonistischen Effekt zu inhibieren und/oder zu verringern. Der Begriff „Antagonist" umfasst kompetitive, nicht-kompetitive, funktionelle und chemische Antagonisten wie sie unter anderem in Mutschler, „Arzneimittelwirkungen" (1986), Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart, Deutschland beschrieben worden sind. Der Begriff „partieller Antagonist" gemäß der vorliegenden Erfindung bedeutet ein Molekül/eine Substanz, das/die in der Lage ist, die Aktivität von Agonisten durch unter anderem einen nicht-kompetitiven Mechanismus unvollständig zu blockieren. Als „Agonisten" werden gemäß dieser Erfindung Moleküle/Substanzen bezeichnet, die eine Affinität ebenso wie eine intrinsische Aktivität aufweisen. In den meisten Fällen ist diese intrinsische Aktivität (α) als pro portional zu dem Quotienten aus der Wirkung, die durch diesen Agonisten ausgelöst wird (E_A), und der Wirkung, die in einem gegebenen biologischen System maximal erreicht werden kann (E_max), definiert: daher kann die intrinsische Aktivität definiert werden als:
Die höchste relative intrinsische Aktivität ergibt sich aus E_A/E_max = 1. Agonisten mit einer intrinsischen Aktivität von 1 sind volle Agonisten, wohingegen Substanzen/Moleküle mit einer intrinsischen Aktivität von > 0 und < 1 partielle Agonisten sind. Partielle Agonisten zeigen einen dualistischen Effekt, d. h. sie umfassen agonistische ebenso wie antagonistische Wirkungen.
Der Fachmann auf dem Gebiet kann daher leicht die Verbindungen und die Verfahren der Erfindung verwenden, um die agonistischen und/oder antagonistischen Wirkungen und/oder Eigenschaften einer Verbindung/eines Moleküls/einer Substanz aufzuklären, die/das/die gemäß einem beliebigen der vorstehend beschriebenen Verfahren zu identifizieren oder zu charakterisieren ist.
Die Identifizierung und/oder Charakterisierung von Molekülen, die in der Lage sind, das chimäre Peptid zu aktivieren, zu desaktivieren oder zu inaktivieren, kann unter anderem dadurch erreicht werden, dass man einen geeigneten Wirt, der Adenylylcyclasen oder Phosphodiesterasen stabil oder transient exprimiert, mit einem Nucleinsäuremolekül transfiziert, das das chimäre Peptid der Erfindung codiert. Solche Wirte umfassen, sind aber nicht beschränkt auf CHO-Zellen, HEK 293-, HeLa-, Cos 7-, PC12- oder NIH 3T3-Zellen, Frosch-Oocyten oder primäre Zellen wie primäre Cardiomyocyten, Fibroblasten, endothele oder embryonale Stammzellen, wobei es sich bei diesen Zellen nicht um menschliche Embryonalzellen handelt. Natürlich ist es auch möglich, Zelllinien zu verwenden, die stabil mit der Nucleinsäure transfiziert sind, die das chimäre Peptid codiert, in die Nucleinsäuren transfiziert werden, die Adenylylcyclasen oder Phosphodiesterasen codieren. Die Zellen werden dann mit (einem) zu testenden Molekül(en) oder (einer) zu testenden Verbindung(en) in Kontakt gebracht und es wird gemessen, ob das (die) Molekül(e) oder (die) Verbindung(en) zu einer Veränderung in der Energie führen, die von den zwei nachweisbaren Markierungen emittiert wird, die in dem wie vorstehend definierten chimären Peptid enthalten sind. Wie vorstehend dargelegt worden ist, umfassen die besonders bevorzugten Verfahren die FRET- oder BRET-Messungen.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Screenen von Molekülen oder Verbindungen, die Aktiviatoren/Agonisten, inverse Agonisten oder Inhibitoren/Antagonisten der biologischen/pharmakologischen Funktion einer Adenylylcyclase oder einer Phosphodiesterase sind, umfassend die Schritte:

(a) Transfizieren der Nucleinsäure oder des Vektors der Erfindung in eine Zelle, die eine Adenylylcyclase oder eine Phosphodiesterase exprimiert;
(b) Inkontaktbringen dieser Zelle mit (dem) zu testenden Molekül(en) oder (der) zu testenden Verbindung(en); und
(c) Messen und/oder Nachweisen einer Veränderung in der Energie, die von den zwei nachweisbaren Markierungen emittiert wird, die in dem wie vorstehend definierten chimären Peptid enthalten sind; und
(d) Vergleichen der Veränderung in der Energie mit einer Standardantwort wie sie in Abwesenheit des (der) Kandidaten-Moleküls(e)/der Kandidaten-Verbindung(en) gemessen wurde.

Der Begriff „Standardantwort" wie hierin verwendet bezieht sich auf ein Signal, d. h. eine Veränderung im FRET, welche durch routinemäßig verwendete Aktivatoren/Inhibitoren von Adenylylcyclase oder Phosphodiesterase oder von Agonisten/partiellen Agonisten/inversen Agonisten/Antagonisten G-Protein-gekoppelter Rezeptoren induziert wird, die als sogenannte Referenzverbindungen eingesetzt werden. Für in vitro-Messungen bezieht sich die „Standardantwort" wie hierin definiert auf ein Signal, d. h. eine Veränderung im FRET, welches durch die Zugabe einer bekannten cAMP-Konzentration induziert wird, was auch als Standardkonzentration oder Referenzkonzentration bezeichnet wird.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Molekülen oder Verbindungen, die in der Lage sind, eine biologische/pharmakologische Reaktion einer Adenylylcyclase oder einer Phosphodiesterase auszulösen, umfassend die Schritte:

(a) Transfizieren der Nucleinsäure oder des Vektors der Erfindung in eine Zelle, die eine Adenylylcyclase oder eine Phosphodiesterase exprimiert;
(b) Inkontaktbringen dieser Zelle mit dem(n) zu testetenden Molekül(en) oder der (den) zu testenden Verbindung(en); und
(c) Identifizieren unter diesen Molekülen/Verbindungen die Moleküle/Verbindungen, die in der Lage sind, eine Veränderung in der Energie auszulösen, die von den zwei nachweisbaren Markierungen emittiert wird, die in dem chimären Peptid der Erfindung enthalten sind.

Bei potenziellen Kandidatenmolekülen oder Gemischen von Kandidatenmolekülen kann es sich unter anderem um Substanzen, Verbindungen oder Zusammensetzungen handeln, die chemischen oder biologischen Ursprungs sind, die in der Natur vorkommen oder die synthetisch, rekombinant und/oder chemisch hergestellt worden sind. Demnach kann es sich bei Kandidatenmolekülen um Antikörper handeln, um Proteine, Proteinfragmente, Peptide, Aminosäuren und/oder Derivate davon oder um andere Verbindungen wie z. B. Ionen, die unter anderem an das chimäre Peptid der Erfindung, an Adenylylcyclasen oder Phosphodiesterasen binden und/oder mit diesen interagieren.
Ein Fachmann auf dem Gebiet wird sofort erkennen, dass die Verfahren der Erfindung einen wichtigen Beitrag zur pharmakologischen Forschung darstellen können, insbesondere auf dem Gebiet des Arzneistoffscreenings. So umfassen entsprechende Methoden zum Arzneistoffscreening, die in der Literatur beschrieben worden sind, zum Beispiel Kyranos (Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 4: 719–728 (2001); Pochapsky (Curr. Top. Med. Chem. 1: 427–441 (2001) und Bochats (Curr. Top. Med. Chem. 1: 367–383 (2001).
Gemäß der vorliegenden Ausführungsform kann im Prinzip jede beliebige Art von Zellen, Membranen, Membranpräparationen oder Liposomen für das vorliegende Verfahren verwendet werden, das einem optischen Nachweis zugänglich ist. Die zu verwendende Zelle kann transformiert werden, so dass sie das chimäre Peptid der vorliegenden Erfindung exprimiert. So kann es sich bei den Zellen um Einzelzellen wie z. B. Bakterien, Hefen, Protozoen oder in Kultur gehaltene Zellen halten, z. B. von Vertebraten, bevorzugt von Säuger-, stärker bevorzugt menschlichen Ursprungs. Für bestimmte Anwendungen kann es nützlich sein, pathogenetisch betroffene Zellen zu verwenden, wie z. B. Tumorzellen oder Zellen, die von einem infetiösen Agens infiziert sind, z. B. einem Virus, wobei bevorzugt Messungen im Vergleich mit entsprechenden gesunden Zellen durchgeführt werden. Ebenso können die Zellen Teil eines Gewebes, eines Organs oder eines Organismus sein, insbesondere von einem nicht-menschlichen transgenen Tier, das vorstehend definiert worden ist.
Die Kandidatenverbindungen oder Testverbindungen können im Prinzip von jeder Quelle genommen werden. Es kann sich dabei um natürlich vorkommende Substanzen handeln, um modifizierte natürlich vorkommende Substanzen, um chemisch synthetisierte Substanzen oder um Substanzen, die von einem transgenen Organismus hergestellt und gegebenenfalls bis zu einem gewissen Grad aufgereinigt und/oder weiter modifiziert worden sind. Praktischerweise kann die Kandidatenverbindung aus einer Bank von Verbindungen stammen, wie sie routinemäßig für Screening-Prozesse eingesetzt werden.
Der Begriff „Inkontaktbringen" bezieht sich auf die Zugabe einer Kandidaten-Verbindung/von Testverbindungen zu der untersuchten Zelle auf eine Weise, so dass die Verbindung an der Zelloberfläche oder nach Aufnahme in die Zelle auf die Zelle einwirken kann. Üblicherweise kann die Kandidatenverbindung oder eine Lösung, die diese enthält, zu dem Assay-Gemisch hinzugegeben werden. Schritt (a) der Verfahren der vorliegenden Erfindung, d. h. der „Schritt des Inkontaktbringens" läst sich ebenso erreichen, indem man zu dem Assay-Gemisch eine Probe hinzugibt, die diese Kandidatenverbindung oder eine Vielzahl von Kandidatenverbindungen enthält. Sofern man mit Hilfe des vorliegenden Verfahrens herausfindet, dass eine solche Probe oder eine Vielzahl von Verbindungen eine Verbindung von Interesse enthält, dann ist es entweder möglich, die Verbindung aus der Originalprobe zu isolieren oder die Originalprobe weiter zu unterteilen, wenn sie zum Beispiel aus einer Vielzahl von verschiedenen Verbindungen besteht, um so die Zahl der verschiedenen Substanzen pro Probe zu verringern, und das Verfahren mit den Teilmengen der Originalprobe zu wiederholen. Je nach Komplexität der Probe kann man die hierin beschriebenen Schritte mehrmals durchführen, bevorzugt bis die nach dem Verfahren der Erfindung identifizierte Probe nur eine begrenzte Zahl von Substanzen oder nur eine Substanz umfasst. Bevorzugt umfasst diese Probe Substanzen mit ähnlichen chemischen und/oder physikalischen Eigenschaften und am meisten bevorzugt sind diese Substanzen identisch.
Schritt (b), d. h. der „Mess- oder Identifizierungsschritt" kann gemäß den Erklärungen ausgeführt werden, welche das Messen einer Veränderung in der Energieemission der Fusionsproteine betreffen, d. h. der chimären Peptide der Erfindung wie sie hierin vorstehend angegeben sind. Besonders bevorzugt sind optische Messverfahren, die eine Auflösung der Fluoreszenz auf der Ebene von Einzelzellen erlauben, bevorzugt auf der subzellulären Ebene. Geeignete Bildgebungsverfahren sind in der Literatur beschrieben wie z. B. in Periasamy, A., Methods in Cellular Imaging, 2001, Oxford University Press oder in Fluorescence Imaging Spectroscopy and Microscopy, 1996, hrsg. von X. F. Wang, Brian Harman, John Wiley and Sons. Sie können Fluoreszenz umfassen, bevorzugt konfokale Mikroskopie, digitale Bildaufnahme, z. B. mit Hilfe einer CCD-Kamera und einer geeigneten Bildauswertungs-Software. Die beigefügten Beispiele stellen auch nützliche Einstellungen bereit, um Kandidatenverbindungen zu messen. Bevorzugt wird Schritt (b) ausgeführt, indem man parallele Kontrollexperimente durchführt. Zum Beispiel kann man eine entsprechende Zelle, die dasselbe chimäre Peptid exprimiert, unter entsprechenden Bedingungen beobachten wie in Schritt (a) und (b), jedoch ohne diese mit einer Kandidatenverbindung in Kontakt zu bringen.
Demzufolge können potenzielle Kandidatenmoleküle mit einer wie vorstehend genannten Zelle, die ein chimäres Peptid der Erfindung exprimiert, oder mit einem Membranstück, einer Membranpräparation, die ein chimäres Peptid der Erfindung umfasst, in Kontakt gebracht werden und man kann eine entsprechende Reaktion messen (unter anderem eine Dosis-Reaktion, eine Strom-Reaktion oder eine Konzentrationsreaktion) um eine beliebige Wirkung aufzuklären, welche von dem Kandidatenmolekül verursacht wird. Eine solche Reaktion wird am meisten bevorzugt durch Verfahren gemessen, die hierin bereitgestellt sind, und speziell mittels FRET- oder BRET-Technologie.
Innerhalb des Gültigkeitsbereichs der vorliegenden Erfindung liegen auch Verfahren zur Identifizierung, Charakterisierung und zum Screenen von Molekülen, die in der Lage sind, mit Adenylylcyclasen oder Phosphodiesterasen zu interagieren, welche sogenannte Hochdurchsatz-Screeningverfahren und ähnliche Ansätze umfassen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind (Spencer, Biotechnol. Bioeng. 61: 61–67 (1998); Oldenburg, Annu. Rep. Med. Chem. 33: 301–311 (1998); Milligan, Trends Pharmacol. Sci. 20: 118–124 (1999)), die man mit Platten mit 96 Vertiefungen, 384 Vertiefungen, 1536 Vertiefungen und mit anderen im Handel erhältlichen Platten durchführt. Weitere gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendende Verfahren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf homogene Fluoreszenzverfahren bei Hochdurchsatz-Screeningansätzen (wie unter anderem in Pope, Drug Discovery Today 4: 350–362 (1999) beschrieben). Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Identifizierung, Charakterisierung und/oder zum Screenen von Molekülen, die in der Lage sind, mit Adenylylcyclasen oder Phosphodiesterasen zu interagieren, können unter anderem wie hierin definierte Wirte eingesetzt werden, welche das chimäre Peptid der vorliegenden Erfindung exprimieren. Auf Zellen basierende Assays, Geräte für diese Assays und/oder Messungen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und sind unter anderem in Gonzalez, Drug Discovery Today 4: 431–439 (1999) oder Ramm, Drug Discovery Today 4: 401–410 (1999) beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Screeningverfahren der Erfindung handelt es sich bei der Energieveränderung um eine Zunahme oder eine Abnahme des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers (FRET) oder Biolumineszenz-Resonanz-Energietransfer (BRET).
In einer bevorzugten Ausführungsform entsprechen die in den hierin bereitgestellten Verfahren zu messenden Veränderungen der Reaktion oder der Energie einer Zunahme oder einer Abnahme des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers (FRET). Beim FRET sind sowohl Donor als auch Akzeptor, d. h. beide dem Nachweis dienenden Teile, Teile von fluoreszierenden Proteinen, und zur Messung von FRET wird das Fusionsprotein mit Energie versorgt, z. B. mit Strahlung, die für die Emission der Anregungsenergie durch den ersten dem Nachweis dienenden Teil geeignet ist. Demzufolge ist es eine bevorzugte Ausführungsform des chimären Peptids der vorliegenden Erfindung, dass die erste Nachweismarkierung ein Teil eines fluoreszierenden Proteins ist.
Die Effizienz von FRET hängt von der Distanz zwischen den zwei fluoreszierenden Partnern ab. Die mathematische Formel, die FRET beschreibt, ist die folgende: E = R₀ ^b/(R₀ ⁶ + r⁶), wobei E die Effizienz von FRET ist, r die tatsächliche Distanz zwischen den fluoreszierenden Partnern ist und R₀ die Förster-Distanz ist, bei der der FRET 50% des maximalen FRET-Werts beträgt, der für ein vorgegebenes Paar von FRET-Partnern möglich ist: R₀, die experimentell bestimmt werden kann, hängt von der relativen Orientierung zwischen den Fluoreszenz-Partnern (κ), dem Refraktionsindex des Mediums (n), dem Integral der Überlappung der Emission des Donor- mit der Anregung des Akzeptor-Partners (J(λ)) und der Quantenausbeute des Fluoreszenz-Donor-Partners (Q_D) ab (R₀ ⁶ = 8,79 × 10^–25 [κ²n^–4Q_DJ(λ)] (in cm⁶). Bei klassischen auf FRET basierenden Anwendungen nimmt man an, dass der Orientierungsfaktor κ² gleich 2/3 ist, was der Wert für Donoren und Akzeptoren ist, die vor dem Energietransfer durch Rotationsdiffusion zufallsmäßig verteilt werden (Lakovicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2. Ausg., S. 370). Demnach nimmt man bei einer zufallsmäßigen Rotationsdiffusion an, dass die Veränderung des Verhältnisses nur auf eine Veränderung der Distanz zwischen den Chromophoren zurückzuführen ist. Für senkrechte Dipole ist κ² 0.
Gemäß den beigefügten Beispielen kann eine Abnahme des FRET-Signals mit Hilfe der folgenden Gleichung bestimmt werden: r(t) = A × (1 – e^–t/τ), wobei τ die Zeitkonstante (s) ist und A die Signalstärke. Sofern es für die Berechnung von t erforderlich war, wurden Agonisten-unabhängige Veränderungen beim FRET subtrahiert, die auf Photobleichung zurückzuführen waren.
Um FRET für den Nachweis von Agonisten, Antagonisten, partiellen Agonisten und partiellen Antagonisten ebenso wie von inversen Agonisten anzuwenden, ist der Fachmann auf dem Gebiet in der Lage, geeignete Nachweismarkierungen (die vorstehend definiert sind) für das chimäre Protein der Erfindung auszuwählen, die einen nachweisbaren FRET zeigen sowie eine nachweisbare Veränderung des FRET auf eine Konformationsänderung in ihrer Struktur. Bevorzugt ist die maximale FRET-Effizienz mindestens 5%, stärker bevorzugt mindestens 50% und am meisten bevorzugt 80% der Energie, die von der ersten Markierung auf die Anregung hin frei gesetzt wird. Außerdem ist es notwendig, dass die zwei Nachweismarkierungen eine spektrale Überlappung aufweisen. Je größer die Überlappung des Emissionsspektrums des Donors mit dem Absorptionsspektrum des Akzeptors ist, desto höher ist der Wert von R₀. Akzeptoren mit höheren Extinktionskoeffizienten führen zu höheren R₀-Werten. Im Gegensatz dazu sollte die Überlappung in den Anregungsspektren der beiden dem Nachweis dienenden Teile klein genug sein um eine gleichzeitige Anregung des Akzeptor-Chromophors zu verhindern. Ebenso sollten die Spektren der beiden dem Nachweis dienenden Teile nur in einem Maß überlappen, dass eine Unterscheidung zwischen den zwei Emissionssignalen noch möglich ist.
Wie es in den beigefügten Beispielen ausführlich dargestellt ist, handelt es sich in einer besonders bevorzugten Ausführungsform bei dem ersten dem Nachweis dienenden Teil um blaugrün fluoreszierendes Protein (CFP) und bei dem zweiten dem Nachweis dienenden Teil um verstärktes gelb fluoreszierendes Protein (eYFP). Es ist gezeigt worden, dass CFP und YFP besonders gut für das chimäre Peptid der vorliegenden Erfindung geeignet sind, da sie eine brauchbare Veränderung im FRET zeigen. CFP und eYFP sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und Nucleinsäuremoleküle, die die entsprechenden codierenden Sequenzen enthalten, sind im Handel erhältlich, z. B. von Clontech. Diese Nucleinsäuresequenzen sind auch in den beigefügten SEQ ID NOs: 23 und 24 gezeigt, während die zugehörigen Aminosäuresequenzen in den SEQ ID NOs: 21 bzw. 22 gezeigt sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beruhen die hierin bereitgestellten Verfahren auf dem Nachweis von Veränderungen der Reaktion oder der Energie, die eine Zunahme oder eine Abnahme des biolumineszenten Resonanz-Energie-Transfers (BRET) umfassen. Die BRET-Technologie ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt und unter anderem in Angars, PNAS 97: 3684–3689 (2000); in Mercier, JBC 277: 44925–44931 (2002); in Barcock, JBC 278: 3378–3385 (2003) oder in WO 99/66324 beschrieben. Wie hierin vorstehend dargelegt ist, ist ein bevorzugtes biolumineszierendes Protein Renilla-Luciferase, es kann aber auch Glühwürmchen-Luciferase verwendet werden. Als ein bevorzugter fluoreszierendes Proteinteil in dem chimären Peptid der vorliegenden Erfindung, das Renilla-Luciferase als ein erstes Nachweissystem umfasst, kann verstärktes gelb fluoreszierendes Protein oder ein gelb fluoreszierendes Protein verwendet werden.
Gemäß den hierin bereitgestellten Verfahren ist das chimäre Peptid der vorliegenden Erfindung in einer am meisten bevorzugten Ausführungsform in einer biologischen Membran lokalisiert bzw. darin eingefügt. Am meisten bevorzugt handelt es sich bei der biologischen Membran um eine Plasmamembran einer gezüchteten Zeile oder um eine Membran in (einer) Zelle(n) eines Organs oder Gewebes eines nichtmenschlichen transgenen Tiers, das das chimäre Peptid der vorliegenden Erfindung exprimiert. Weitere Ausführungsformen der übrigen und/oder der Methoden zur Identifizierung der vorliegenden Erfindung sind in den beigefügten Beispielen angegeben und anschaulich dargestellt. Es ist zu beachten, dass im Kontext der vorliegenden Erfindung mehrere Kontrollen verwendet werden können, wie hierin vorstehend bereits kurz erörtert worden ist. Man kann zum Beispiel chimäre Peptide als Kontrollen verwenden, die nur eine nachweisbare Markierung umfassen. Solche chimären Peptide stellen sicher, dass keine Veränderung der emittierten Energie oder einer nachweisbaren Reaktion auftritt, die gemessen werden kann. Demzufolge kann man die Testmoleküle oder Testverbindungen oder Proben, die entweder allein oder in Kombination mit solchen Molekülen oder Verbindungen vorliegen, in Parallelexperimenten auf chimären Peptiden der vorliegenden Erfindung testen, die in der Lage sind, eine unterschiedliche Reaktion auf eine Konformationsänderung hin auszulösen, sowie auf chimären Peptiden, die nur eine der vorstehend aufgezeigten nachweisbaren Markierungen umfassen und demzufolge nicht in der Lage sind, ein entsprechendes Signal auszulösen, insbesondere einen Resonanz-Energie-Transfer auszulösen. Ein anderes gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zu verwendendes Kontrollprotein ist das chimäre Peptid, das beide nachweisbaren Markierungen am C-Terminus enthält.
Die Erfindung stellt auch eine diagnostische Zusammensetzung bereit, umfassend das chimäre Peptid, das Nucleinsäuremolekül, den Vektor, die Wirtszelle oder die Organe oder Zellen des nicht-menschlichen transgenen Tiers der Erfindung. Eine solche diagnostische Zusammensetzung ist bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung besonders nützlich.
Die Erfindung betrifft auch ein Kit, umfassend das chimäre Peptid, das Nucleinsäuremolekül, den Vektor oder die Wirtszelle der Erfindung oder Organe oder Zellen des nicht-menschlichen transgenen Tiers wie es vorstehend charakterisiert worden ist.
Die Ausführungsformen, die in Zusammenhang mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung offenbart worden sind, gelten mutatis mutandis auch für das Kit der vorliegenden Erfindung.
Vorteilhafterweise umfasst das Kit der vorliegenden Erfindung ferner wahlweise (a) Reaktionspuffer, Aufbewahrungslösungen, Waschlösungen und/oder übrige Reagenzien oder Materialien, die für die Durchführung von wissenschaftlichen, pharmakologischen und Arzneimittel-Screening-Assays oder dergleichen wie hierin beschrieben erforderlich sind. Darüber hinaus können Teile des Kits der Erfindung einzeln in Röhrchen oder Flaschen oder in Kombination in Behälter oder Einheiten mit mehreren Behältern verpackt werden.
Das Kit der vorliegenden Erfindung kann vorteilhafterweise unter anderem dazu verwendet werden, das wie hierin beschriebene Verfahren zum Nachweis von cAMP-Konzentrationen, der räumlich-zeitlichen Verteilung von cAMP durchzuführen und/oder es könnte in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden, auf die hierin Bezug genommen wurde, z. B. zum Screenen von Reagenzien auf Verbindungen, die in der Lage sind, die Bindung von cAMP zu aktivieren oder zu hemmen, ebenso wie Screeningverfahren auf Verbindungen, die in der Lage sind, biologische Moleküle wie z. B. Adenylylcyclasen oder Phosphodiesterasen zu beeinflussen. Außerdem kann das Kit der Erfindung Nachweismittel enthalten, die für wissenschaftliche, medizinische und/oder diagnostische Zwecke geeignet sind. Die Herstellung der Kits folgt bevorzugt Standardprozeduren, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind. Das Kit der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt nützlich in einem wie hierin bereitgestellten Nachweis-Assay.
Auf ähnliche Weise werden Kits bereitgestellt, die die Verbindungen der Erfindung umfassen, insbesondere das chimäre Peptid, das Nucleinsäuremolekül, den Vektor, die Wirtszelle oder die Organe oder Zellen des nicht-menschlichen transgenen Tiers der Erfindung. Diese Kits wie sie hierein bereitgestellt sind sind besonders nützlich bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung und insbesondere bei der Bestimmung von cAMP-Konzentrationen in vivo oder in vitro. Diese Kits ebenso wie die hierin bereitgestellten Verfahren sind auch nützlich bei pharmazeutischen Screenings, was auch „Hochdurchsatz"-Screening umfasst. Der technische Vorteil des chimären Peptids, des Nucleinsäuremoleküls, des Vektors, der Wirtszelle oder der Organe oder Zellen des nicht-menschlichen transgenen Tiers, der Kits und der Verfahren der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der chimären Konstrukte/Peptide der Erfindung als funktionelle Biosensoren. Demzufolge sind die Verbindungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung auch in der Grundlagenforschung nützlich, bevorzugt in der biomedizinischen und/oder biochemischen Forschung sowie bei Arzneimittel-Screenings. Die Erfindung ermöglicht auch die Verwendung spezieller Vorrichtungen, die man einsetzen kann um die cAMP-Konzentration in lebenden Zellen und/oder Organismen zu verfolgen. Diese Vorrichtungen sind nützlich bei der Messung von cAMP mit Hilfe der chimären Peptide/Konstrukte der Erfindung. Die Vorrichtungen umfassen unter anderem Lichtquellen, Filtersysteme, Systeme zum Nachweis von Licht, insbesondere Emissionsdetektoren.
Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung des chimären Peptids, des Nucleinsäuremoleküls, des Vektors, der Wirtszelle der Erfindung oder der Organe oder Zellen des wie vorstehend definierten nicht-menschlichen transgenen Tiers zum Nachweis eines Modifikators (von Modifikatoren) der biologischen Aktivität einer Adenylylcyclase oder einer Phosphodiesterase in vitro.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des chimären Peptids oder des Nucleinsäuremoleküls, des Vektors, der Wirtszelle oder der Organe oder Zellen des nichtmenschlichen transgenen Tiers der Erfindung zum Nachweis eines Modifikators (von Modifikatoren) der Bindung von cAMP an das chimäre Peptid der Erfindung oder der biologischen Aktivität von Adenylylcyclasen oder Phosphodiesterasen in vitro.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, das die Schritte des Verfahrens der Erfindung zur Identifizierung, Charakterisierung und/oder zum Screenen von Molekülen umfasst, die in der Lage sind, mit dem chimären Peptid der Erfindung, mit Adenylylcyclasen oder mit Phosphodiesterasen zu interagieren, und das ferner einen Schritt umfasst, in dem ein Derivat des identifizierten, charakterisierten und/oder durch Screening gewonnenen Moleküls erzeugt wird. Ein solches Derivat kann unter anderem mittels Peptidmimetik erzeugt werden.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend die Schritte des Verfahrens zur Identifizierung, Charakterisierung, zum Screenen und/oder der Derivatisierung von Molekülen, die in der Lage sind, mit dem chimären Peptid der Erfindung, mit Adenylylcyclasen oder Phosphodiesterasen zu interagieren und die identifizierten, charakterisierten, durch Screenen erhaltenen und/oder derivatisierten Moleküle in einer pharmazeutisch verträglichen Form zu formulieren.
Die Figuren zeigen:
1: Konstruktion von mit einem GFP-Tag versehenen cAMP bindenden Proteinen. Sequenzen, die 1 oder 2 Bindungsdomänen von PKA oder EPAC codieren, wurden mittels PCR amplifiziert und mit denen von EYFP und ECFP fusioniert mit anschließender Subclonierung und Expression in pcDNA3 (Expression in Säugern) oder in pVL1393 (Expression in Sf9-Insektenzellen), wie in Beispiel 1 beschrieben. Ein relatives FRET-Signal für jedes chimäre Protein ist angegeben. Chimären, die beide cAMP-Bindungsdomänen von PKA und EPAC2 oder eine Domäne A von EPAC2 mit niedriger Affinität enthielten, waren inaktiv, wohingegen man mit Konstrukten mit einer einzelnen cAMP-Bindungsdomäne mit hoher Affinität leistungsfähige Sensorproteine erhielt.
2: Kristallstruktur der cAMP-Bindungsdomäne B der regulatorischen Untereinheit von Proteinkinase A (PKA) und von EPAC2. cAMP-Bindungskassetten sind in gelb gezeigt. Fluorophore (GFP-Varianten) wurden an den markierten Positionen angrenzender Alpha-Helices eingesetzt um funktionelle cAMP-Sensorproteine zu erzeugen. Man nimmt an, dass auf Bindung des Agonisten hin eine Konformationsänderung erfolgt, die zu einer Veränderung der Distanz zwischen den GFPs und des FRET-Signals führt.
3: Kristallstruktur von EPAC2, das beide cAMP-Bindungsdomänen enthält. Die Domäne A (Aminosäuren 12–151) bindet den Liganden mit sehr geringer Affinität, die es einem Sensorprotein, in das GFPs an den blau markierten Positionen eingefügt sind, nicht ermöglicht, seine Konformation in Gegenwart von physiologisch relevanten Mengen von cAMP zu verändern, was ein FRET-Signal erzeugt. Unterschiedliche grün markierte Positionen der Domäne B mit hoher Affinität sind jedoch geeignet, einen hochempfindlichen cAMP-Sensor zu erhalten, der auf die Bindung des Liganden hin eine stabile Veränderung im FRET-Signal zeigt.
4: Aktivierungskinetik verschiedener cAMP-Sensorproteine, die eine einzelne Bindungsdomäne von EPAC2 enthielten. CHO-Zellen, die den Adenosin-Rezeptor A2B stabil exprimieren, der an Gs-Proteine koppelt und die cAMP-Produktion über Adenylylcyclase aktiviert, wurden transient mit Plasmiden transfiziert, die verschiedene Sensorproteine codieren, die GFP-Varianten an den markierten Positionen der cAMP-Bindungsdomäne B von EPAC2 tragen. 24 Stunden nach Transfektion wurde FRET wie im Abschnitt Material und Methoden beschrieben in lebenden Einzelzellen gemessen und der Einfluss des Agonisten (Adenosin) wurde in Echtzeit getestet. Die Zugabe von Adenosin zu den Zellen führte zu einer Abnahme von FRET zwischen YFP und CFP, was auf eine cAMP-induzierte Konformationsänderung hindeutet, die zu einer Vergrößerung der Distanz zwischen CFP und YFP führte. Je nach Struktur des Proteins waren die Amplitude und die Geschwindigkeit des Signals unterschiedlich, was es uns ermöglichte, den Sensor zu optimieren, indem wir die Aminosäurepositionen fanden, die das markanteste Signal erzeugten.
5: A. Aktivierungskinetik von cAMP-Sensorproteinen, die auf einer einzelnen Bindungsdomäne von EPAC2 basieren (EYFP-E285-E443-ECFP) in CHOA2B-Zellen im Vergleich zu der des früher beschriebenen PKA-Sensors (Zaccolo et al., Nat. Cell. Biol. 2 (1): 25–29 (Jan 2000)). Der. neuartige EPAC2-Sensor zeigt ein schnelleres Aktivierungssignal, das auf die Anwesenheit von nur 1 cAMP-Bindungsdomäne mit hoher Affinität und der Abwesenheit von katalytischer Aktivität (Induktion von Desensibilisierung über die Aktivierung von Phosphodiesterase) zurückzuführen sein könnte, im Gegensatz zu PKA, das 4 kooperativ agierende Bindungsstellen aufweist und Phosphodiesterase aktivierende Eigenschaften besitzt. B. Aufnahmen von CHO-Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach Zugabe von Agonist. Eine Abnahme des aufgezeichneten Verhältnisses (Verlust an roter Farbe) stellt eine Zunahme der intrazellulären cAMP-Konzentration dar. Experimente sind wie in Material und Methoden und in der Legende zu 3 beschrieben durchgeführt worden.
6: cAMP-Messungen in vitro. A. Fluoreszenzemissionspektren eines Zelllysats von TSA-HEK293-Zellen. Zellen wurden transient mit einem Plasmid transfiziert, das einen EPAC2-basierten Sensor codierte (EYFP-E285-E443-ECFP). 24 Stunden nach Transfektion wurden Zelllysate hergestellt und Emissionsspektren wurden wie in Material und Methoden beschrieben nach Zugabe verschiedener Konzentrationen von Agonist aufgenommen. Eine Abnahme der Intensität bei 525 nm mit deren Zunahme bei 475 nm stellt einen Verlust beim FRET-Signal zwischen CFP und YFP dar. B. Das Verhältnis des Quotienten der Signalintensität 475 nm und der Signalintensität 525 nm zur cAMP-Konzentration konnte in eine Sättigungskurve für anschließende genaue Messungen der cAMP-Konzentration in verschiedenen unbekannten Proben aufgetragen werden.
7: Entwicklung eines in der Plasmamembran verankerten cAMP-Sensors, der auf dem EPAC2 (E285-E443)-Konstrukt basiert. A. Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von CHOA2B-Zellen, die mit verschiedenen Konstrukten transfiziert worden waren, die cAMP-Sensorproteine codierten. Dargestellt ist die Fiuoreszenzemission bei 583 ± 15 nm (YFP) und 480 ± 20 nm (CFP). Die Einführung einer kurzen N-terminalen Sequenz der Lyn-Kinase, die in 7C gezeigt ist, führt zu einer Zielführung des fluoreszierenden Sensorproteins auf genau umschriebene Stellen auf der Plasmamembran wie durch konfokale Mikroskopie deutlich gemacht wird (7B).
8: A. Aktivierungskinetik von cAMP-Sensorproteinen, die auf einer einzelnen Bindungsdomäne von EPAC1 (EYFP-E157-E316-ECFP) und PKA (EYFP-M264-A403-ECFP) basieren in CHOA2B-Zellen im Vergleich zu der des EPAC2-Konstrukts (EYFP-E285-E443-ECFP). Homologe Sequenzen von EPAC1 und PKA zeigen ähnliche kinetische Eigenschaften wie die EPAC2-Bindungsdomäne, was es ermöglicht, diese zu verwenden um ein cAMP-Sensorprotein zu erzeugen. B. Durch Positionierung von EYFP an der Position G390 der EPAC2-Bindungsdomäne erhält man ein Sensorprotein mit einer größeren Amplitude als der der vorstehend beschriebenen Mutanten. Experimente sind wie in Material und Methoden und in der Legende zu 3 beschrieben durchgeführt worden.
9: Keine Agonisten-abhängige Veränderungen wurden in CHOA2B-Zellen beobachtet, die ein Fusionsprotein exprimierten, das zwei cAMP-Bindungsstellen der PKA-Untereinheiten RII (PKA-Konstrukt-1: EYFP-E103-RII-A+B-A416-HAtag-ECFP) enthielten, wie mittels photometrischem Einzelzell-FRET-Nachweis bestimmt wurde.
10: Nachweisbare Agonisten-abhängige FRET-Veränderungen wurden in CHOA2B-Zellen beobachtet, die ein Fusionsprotein exprimierten, das nur eine cAMP-Bindungsstelle enthielt (Stelle B; PKA-Konstrukt 2, EYFP-M264-RII B-A416- HAtag-ECFP) der PKA-Untereinheiten RII, wie mittels photometrischem Einzelzell-FRET-Nachweis bestimmt wurde.
11: Konstruktion von cAMP-Sensoren, die auf einer einzelnen Bindungsdomäne des durch cAMP gesteuerten Ionenkanals HCN2 basieren. Die Clonierungen wurden wie in der Legende zu 1 beschrieben durchgeführt. Angegeben ist die relative Veränderung des FRET auf Agonisten-Stimulierung hin.
12: cAMP-Messungen mit dem Konstrukt, das auf Maus-HCN2 (A467-K638) basiert. A. Kristallstruktur der Bindungsdomäne von HCN2 mit gebundenem cAMP (Zagotta, Nature 425: 200–205 (2003)). Für die in blau gezeigte Position von GFP-Insertionen erhielt man funktionelle Konstrukte (11). B. FRET-Messungen in lebenden HEK293-Zellen, die mit 10 μM Isoproterenol über endogene beta2-adrenerge Rezeptoren stimuliert worden waren. Zellen wurden mit HCN2-basiertem (A467-K638) Sensor transfiziert. Es ist eine cAMP-abhängige Abnahme des FRET gezeigt.
13: Abhängigkeiten der Reaktion von der Konzentration (gemessen wie in der Legende zu 6 beschrieben) für die Sensoren, die auf verschiedenen cAMP-Bindungsdomänen basieren. Unterschiedliche Konstrukte zeigen unterschiedliche Affinitäten für cAMP, wodurch Messungen dieses sekundären Botenstoffs in einem weiten Bereich physiologisch relevanter Konzentrationen von 20 nM bis 100 μM möglich waren.
14: Anordnung mehrerer cAMP bindender Aminosäuresequenzen von EPAC1, EPAC2, der regulatorischen Untereinheit IIβ von PKA und dem Ionenkanal HCN2. Hoch konservierte Reste einschließlich Glycin (G) und Arginin (R), die an der Bindung von cAMP beteiligt sind, sind fett dargestellt. Wie dokumentiert, handelt es sich bei einer „cAMP-Bindungsdomäne" (ein Minimalgerüst für einen erfindungsgemäßen Sensor, unterstrichen) um einen Teil einer Sequenz, die Reste umfasst, die direkt an einer Interaktion mit cAMP beteiligt sind und die die Architektur der Bindungsstelle stabilisieren. Ohne durch eine Theorie gebunden zu sein beinhalten diese alle β-Faltblätter, die mit einem konservierten L für EPAC1, 2 und HCN2 (unter β1) oder mit einem IGT-Motiv für PKA und einem Teil der C-terminalen α-Helix B einschließlich des hoch konservierten Rests F beginnen, von dem man annimmt, dass er mit dem hoch konservierten L (durch eine Klammer gezeigt) interagiert, um die Architektur der Domäne zu stabilisieren (wie in Rehmann et al., Nat. Struct. Biol. 10: 26–32 (2003) beschrieben). Im Fall von HCN2 ist die cAMP-Bindungsdomäne bis zum Rest I 636 ausgedehnt, da dieser Rest an der Bindung des Liganden beteiligt ist (Zagotta, Nature 425: 200–205 (2003)). Außerdem zeigt 14 cAMP-Bindungsstellen wie sie gemäß dieser Erfindung definiert sind. Diese sind kursiv dargestellt (14 Aminosäuren von „FG" bis „A") und umfassen bevorzugt 14 Aminosäuren.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden nicht beschränkenden Beispiele veranschaulicht.
Beispiele
Beispiel 1: Konstruktion und Expression fluoreszierender Indikatoren
Die DNA-Konstrukte, die cAMP-Sensorproteine codieren, wurden mittels PCR hergestellt, wobei man die cDNA von menschlichem EPAC1, Maus-EPAC2 oder der regulatorischen Untereinheit II von Maus-PKA als eine Matrize verwendete. GFP-Varianten (EYFP und ECFP) wurden mit Standardprimern aus den Plasmiden pEYFP-Tub und pECFP (Clontech) amplifiziert. Sequenzen für cAMP-Bindungsdomänen wurden für transiente Expression in Sängerzellen zusammen mit denen von EYFP und ECFP in den Vektor pcDNA3 (Invitrogen) cloniert (siehe 1 für Details der Struktur). Für eine zielgerichtete Adressierung der Plasmamembran des EPAC-Konstrukts fügte man die zusätzliche N-terminale Sequenz MBCINSKRKD ein, die Myristylierungs- und Palmitylierungs-Stellen codiert, wobei man die Oligonucleotide
verwendete.
Beispiel 2: Zellkultur
Man hielt CHO-Zellen, die stabil den Adenosin-Rezeptor exprimierten und TSA-HEK293-Zellen in DMEM/F12 (37%, 5% CO₂) bzw. DMEM (37%, 7% Co₂)-Medium, plattierte sie für Bildgebungsexperimente auf 24 mm große Glasdeckgläser oder für fluorimetrischen Messungen in der Küvette auf 90 mm großen Petrischalen aus und transfizierte sie mit 3 μg oder mit 30 μg DNA für jedes Konstrukt, wobei man die Calciumphosphat-Methode verwendete. Transfizierte Zellen wurden 24 Std. später analysiert.
Beispiel 3: FRET-Messungen und Bildgebung von Zellen
Für die Fluoreszenzmikroskopie transferierte man Deckgläser mit adhärenten Zellen in einem Puffer, der 144 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 20 mM HEPES, pH 7,3 enthielt, bei Raumtemperatur in die Testkammer und stellte sie auf ein Zeiss Axiovert 200 Umkehrmikroskop, das mit einem 63 × Plan-Neofluoran-Ölimmersionsobjektiv, einem photometrischen System mit zweifacher Emission (Till Photonics) und einer „CoolSNAP Photometrics"-CCD-Kamera ausgestattet war. Die Proben wurden mit Licht von einem Polychrom IV (Till Photonics) angeregt, FRET wurde mit Hilfe der Software MetaFluor 5.0r6 (Universal Imaging Corp.) als das Verhältnis der Emission bei 535 ± 15 nm und 480 ± 20 nm auf Anregung bei 436 ± 10 nm hin verfolgt. Die Bilddaten wurden mit der Software MetaMorph 5.0r6 (Universal Imaging Corp.) analysiert und für Überstrahlung von CFP in den 535 nm – Kanal ebenso wie für Photobleichung des Akzeptors korrigiert um ein korrigiertes Verhältnis F 535 nm/F 480 nm zu ergeben. Um durch Agonisten induzierte Veränderungen des FRET zu untersuchen, wurden Zellen dauernd mit Messpuffer und Adenosinlösung (Sigma) überspült.
Beispiel 4: Fluoreszenzmessungen in vitro
TSA-HEK293-Zellen wurden 24 Stunden nach Transfektion mit gekühltem PBS gewaschen, von der Platte gekratzt und in einem Puffer von 5 mM Tris, 2 mM EDTA, pH 7,3 resuspendiert. Nach einer 40-sekündigen Behandlung mit einem Turrax auf Eis und einer 20-minütigen Zentrifugation bei 80.000 UpM wurden die Fluoreszenzemissionsspektren des Überstands (Anregung bei 436 nm, Emissionsbereich 460–550 nm) vor und nach Zugabe unterschiedlicher cAMP-, cGMP- und ATP (Sigma)-Konzentrationen mit einem Lumineszenzspektrometer LS50B (Perkin Elmer) gemessen. cAMP-Sättigungskurven wurden mit Hilfe der Software KaleidaGraph 3.0.5 (Abelback) aufgetragen und in die Gleichung 100*m0/MMP-3+m0 (m3 = 50, EC₅₀-Mittelwert) eingesetzt.
Beispiel 5: Messung der cAMP-Konzentrationen
Messungen von cAMP können mit Hilfe eines optischen Verfahrens durchgeführt werden, das auf FRET zwischen zwei Fluorophoren (z. B. ECFP und EYFP) basiert, die direkt an eine einzelne cAMP-Bindungsdomäne cAMP-gesteuerter Proteine fusioniert ist. Wie in 1 und 11 gezeigt ist, konnte man aus EPAC1, EPAC2, der regulatorischen Untereinheit von PKA oder dem Ionenkanal HCN2 funktionelle Sensoren konstruieren. Diese Proteine weisen eine cAMP-Bindungssequenz auf, die durch mehrere hoch konservierte Aminosäuren charakterisiert ist, die an der Bindung von cAMP beteiligt sind (14, fett dargestellte Reste). Auf FRET beruhende Messungen von cAMP unter Verwendung dieser erfindungsgemäßen Konstrukte sind aufgrund einer Konformationsänderung in der cAMP-Bindungsdomäne möglich, die zu einer Verringerung der Distanz zwischen den Fluorophoren führt, was eine Abnahme von FRET zur Folge hat, der in einzelnen lebenden Zellen (5, 8, 12B) oder in vitro (6) visualisiert werden konnte. Eine Abnahme von FRET wird als eine Verringerung des Verhältnisses der Intensität von YFP/CFP gemessen, die Bindung von cAMP an den Sensor führt zu einer Verringerung der Intensität von YFP mit einer gleichzeitigen Zunahme von CFP, was eine Verringerung des Verhältnisses YFP/CFP ergibt. Unter Verwendung von Konstrukten, die auf einzelnen cAMP-Bindungsdomänen basieren (die nur eine cAMP-Bindestelle umfassen), lässt sich die Konzentration von cAMP in einem weiten physiologischen Bereich von 1 nM bis 100 μM messen, insbesondere von 200 nM bis 50 μM; siehe z. B. 13. Sequenzprotokoll

Claims

Chimäres Peptid, umfassend: (a) eine cAMP-Bindeeinheit mit nur einer cAMP-Bindestelle; und (b) mindestens zwei nachweisbare Markierungen, wobei eine erste der zwei nachweisbaren Markierungen am Carboxy-Terminus und eine zweite der zwei nachweisbaren Markierungen am Amino-Terminus der cAMP-Bindeeinheit von (a) lokalisiert ist.
Chimäres Peptid gemäß Anspruch 1, wobei die cAMP-Bindestelle der cAMP-Bindeeinheit cAMP mit hoher Affinität bindet.
Chimäres Peptid gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die cAMP-Bindestelle der cAMP-Bindeeinheit cAMP mit einem Kd-Wert im Bereich von 1 nM bis 50 mM bindet.
Chimäres Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die cAMP-Bindeeinheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der regulatorischen Untereinheit (R) einer cAMP-abhängigen Proteinkinase, dem Guanin-Nucleotidaustauschfaktor, dem katabolischen Gen-Aktivatorprotein, dem cAMP-vermittelten Innenkanal, der Neuropathie-Ziel-Esterase (NTE) und dem cAMP-Rezeptor.
Chimäres Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die cAMP-Bindeeinheit aus PKA, EPAC1, EPAC2, HCN2-Innenkanal, katabolischem Gen-Aktivatorprotein von E. coli, cAMP-vermitteltem Ionenkanal, der Neuropathie-Ziel-Esterase (NTE) oder dem cAMP-Rezeptor von Dictyostelium ist.
Chimäres Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei PKA, EPAC1, EPAC2 oder der HCN2-Ionenkanal von Mensch-, Maus- oder Ratten-Ursprung ist.
Chimäres Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die nachweisbaren Markierungen fluoreszierende Markierungen oder biolumineszierende Markierungen sind.
Chimäres Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die fluoreszierenden Markierungen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus GFP, YFP, CFP, BFP, Citrin, Saphir und dsRed, oder wobei die biolumineszierenden Markierungen Luciferase (wie z. B. Renilla-Luciferase oder Glühwürmchen-Luciferase) ist.
Chimäres Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die cAMP-Bindeeinheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer cAMP-Bindeeinheit einer Polypeptids wie dargestellt in SEQ ID Nos: 1–7 und 74; (b) einer cAMP-Bindeeinheit wie dargestellt in oder umfasst von einer der SEQ ID Nos: 27, 29, 31, 33, 34, 35, 36 und 37; (c) einer cAMP-Bindeeinheit, wie umfasst von einer der SEQ ID Nos: 8 bis 20; (d) einer cAMP-Bindeeinheit, wie umfasst von einer der SED ID Nos: 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 und 73; und (e) einer cAMP-Bindeeinheit, der zumindest zu 70%, 80%, 90% oder 95% mit einer cAMP-Bindeeinheit wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 8 oder mit der cAMP-Bindeeinheit von (a) bis (d) identisch ist.
Chimäres Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das chimäre Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem chimären Peptid, das von einem Nucleinsäuremolekül wie dargestellt in einer der SEQ ID Nos: 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 70 und 72 codiert wird; (b) einem chimären Peptid, das eine Aminosäuresequenz wie dargestellt in einer der SEQ ID Nos: 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 und 73 codiert wird; (c) einem chimären Peptid, das von einem Nucleinsäuremolekül codiert wird, das ein Polypeptid codiert, das zumindest zu 70% identisch ist mit einem Polypeptid wie definiert in (a) oder (b) und das zur direkten Bestimmung der cAMP-Konzentration in vitro und/oder in vivo verwendet werden kann; und (d) einem chimären Peptid, das durch ein Nucleinsäuremolekül codiert wird, das zu einer DNA-Sequenz, wie definiert in (a) und (c) degeneriert ist.
Chimäres Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, zur direkten Bestimmung der cAMP-Konzentration in vitro und/oder in vivo.
Nucleinsäuremolekül, dass das chimäre Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 codiert.
Vektor, der ein Nucleinsäuremolekül wie definiert in einem der Ansprüche 9 bis 12 umfasst.
Vektor gemäß Anspruch 13, der ein Expressionsvektor ist.
Nicht-menschlicher Wirt, der mit dem Vektor gemäß Anspruch 13 oder 14 transformiert oder mit dem Nucleinsäuremolekül wie definiert in einem der Ansprüche 9 bis 12 transfiziert wurde.
Wirt gemäß Anspruch 15, der eine Säugetierzelle, eine Amphibienzelle, eine Fischzelle, eine Insektenzelle, eine Pilzzelle, eine Pflanzenzelle oder eine Bakterienzelle oder ein transgenes nicht-menschliches Tier ist, wobei die Säugetierzelle keine menschliche Embryonalzelle ist.
Wirt gemäß Anspruch 16, wobei die Säugetierzelle eine CHO-Zelle, HEK 293-, HeLa, Cos 7-, PC12- or NIH3T3-Zelle ist.
Wirt gemäß Anspruch 16, wobei die Amphibienzelle eine Oozyte, vorzugsweise eine Xenopus-Oozyte ist.
Verfahren zur Herstellung eines chimären Peptids wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 12, das das Züchten/Aufziehen des Wirts gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18 und, gegebenenfalls, das Isolieren und/oder Aufreinigen des produzierten chimären Peptids umfasst.
Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von cAMP in einer Probe, das umfasst: (a) das Hinzufügen des chimären Pepids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 oder erhältlich durch das Verfahren gemäß Anspruch 19 oder einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18 zu der Probe; und (b) das Messen/Erfassen des FRET oder BRET und das Bestimmen der cAMP-Konzentration in der Probe, durch Vergleichen der Werte der Fluoreszenzemission mit einer Standardkurve, die mit definierten Konzentrationen von cAMP erhalten wurde.
Verfahren zum Überwachen über Raum und Zeit der Menge/der Verteilung/des Orts/der Fluktuation von cAMP in einer lebenden Zelle oder einem Gewebe, das umfasst: (a) das Transformieren einer Zelle oder eines Gewebes mit der Nucleinsäure wie definiert in einem der Ansprüche 9 bis 12 oder dem Vektor gemäß Anspruch 13 oder 14; und (b) das Messen/Erfassen des FRET oder BRET in der/dem lebenden Zelle oder Gewebe.
Verfahren zum Identifizieren von Molekülen oder Substanzen, die fähig sind das Binden von cAMP an das chimäre Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 zu aktivieren oder zu hemmen, umfassend die Schritte: (a) das Transfizieren der Nucleinsäure wie definiert in einem der Ansprüche 9 bis 12 oder des Vektors gemäß Anspruch 13 oder 14 in eine Zelle; (b) das Inkontaktbringen der Zelle mit (einem/einer) zu testenden Molekül(en) oder Verbindung(en); und (c) das Messen inwieweit das (die) zu testende(n) Molekül(e) oder Verbindung(en) zu einer Änderung der Energie führt (führen), die von den zwei nachweisbaren Markierungen, die von dem chimären Peptid wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 12 umfasst sind, emittiert wird.
Verfahren zum Identifizieren von Molekülen oder Verbindungen, die fähig sind, die (biologische/pharmakologische) Funktion einer Adenylylcyclase oder Phosphodiesterase zu aktivieren, desaktivieren oder inaktivieren, das die Schritte umfasst: (a) das Transfizieren der Nucleinsäure wie definiert in einem der Ansprüche 9 bis 12 oder des Vektors gemäß Anspruch 13 oder 14 in eine Zelle, die eine Adenylylcyclase oder eine Phosphodiesterase exprimiert; (b) das Inkontaktbringen der Zelle mit (einem/einer) zu testenden Molekül(en) oder Verbindung(en); und (c) das Messen inwieweit das (die) zu testende(n) Molekül(e) oder Verbindung(en) zu einer Änderung der Energie führt (führen), die durch die zwei nachweisbaren Markierungen emittiert wird, die von dem chimären Peptid wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 9 umfasst sind.
Verfahren zum Screenen von Molekülen oder Verbindung, die Aktivatoren (Agonisten) oder Inhibitoren (Antagonisten) der (biologischen/pharmakologischen) Funktion einer Adenylylcyclase oder Phosphodiesterase sind, das die Schritte umfasst: (a) das Transfizieren der Nucleinsäure wie definiert in einem der Ansprüche 9 bis 12 oder des Vektors gemäß Anspruch 13 oder 14 in eine Zelle, die eine Adenylylcyclase oder eine Phosphodiesterase exprimiert; (b) das Inkontaktbringen der Zelle mit (einem/einer) zu testenden Molekül(en) oder Verbindung(en); und (c) das Messen und/oder Nachweisen einer Änderung der Energie, die durch die zwei nachweisbaren Markierungen emittiert wird, die von dem chimären Peptid wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 12 umfasst sind; und (d) das Vergleichen der Änderung der Energie mit einer Standard-Antwort wie sie in Abwesenheit des/der Kandidaten-Moleküls(Moleküle)/Verbindung(en) gemessen wurde.
Verfahren zur Identifizierung von Molekülen oder Verbindungen, die fähig sind, eine (biologische/pharmakologische) Antwort einer Adenylylcyclase oder einer Phosphodiesterase auszulösen, das die Schritte umfasst: (a) das Transfizieren der Nucleinsäure wie definiert in einem der Ansprüche 9 bis 12 oder des Vektors gemäß Anspruch 13 oder 14 in eine Zelle, die eine Adenylylcyclase oder eine Phosphodiesterase exprimiert; (b) das Inkontaktbringen der Zelle mit (einem/einer) zu testenden Molekül(en) oder Verbindung(en); und (c) das Identifizieren der Moleküle/Verbindungen unter diesen Molekülen/Verbindungen, die fähig sind, eine Änderung der Energie auszulösen, die durch die zwei nachweisbaren Markierungen emittiert wurde, die von dem chimären Peptid wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 12 umfasst sind.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 25, wobei das/die zu testende(n) Molekül(e) oder Verbindung(en) ausgewählt ist (sind) aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Proteinen, Proteinfragmenten, Peptiden, Aminosäuren und/oder Derivaten davon oder Ionen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 26, wobei das/die zu testende(n) Molekül(e) oder Verbindung(en) ein Antikörper ist (sind).
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 27, wobei die Energieänderung eine Erhöhung oder Erniedrigung des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers (FRET) ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 27, wobei die Energieänderung eine Erhöhung oder Erniedrigung des Biolumineszenz-Resonanz-Energietransfers (BRET) ist.
Kit, der das chimäre Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, das Nucleinsäuremolekül wie definiert in einem der Ansprüche 9 bis 12, den Vektor gemäß Anspruch 13 oder 14, die Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18 oder Organe oder Zellen des nicht-menschlichen transgenen Tiers gemäß Anspruch 16 umfasst.
Verwendung des chimären Peptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, des Nucleinsäuremoleküls wie definiert in einem der Ansprüche 9 bis 12, des Vektors gemäß Anspruch 13 oder 14, der Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18 oder von Organen oder Zellen des nicht-menschlichen transgenen Tiers gemäß Anspruch 16 zum Nachweis von (einem) Modifikator(en) der biologischen Aktivität einer Adenylylcyclase oder einer Phosphodiesterase in vitro.
Verwendung des chimären Peptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, des Nucleinsäuremoleküls wie definiert in einem der Ansprüche 9 bis 12, des Vektors gemäß Anspruch 13 oder 14, der Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18 für die Herstellung eines Kits zur Verwendung in biologischen, pharmakologischen und/oder Arzneistoff-Screeningverfahren.