DE60307061T2

DE60307061T2 - Verfahren zum nachweis von liganden des leptinrezeptors

Info

Publication number: DE60307061T2
Application number: DE60307061T
Authority: DE
Inventors: Ralph Jockers; Cyril Couturier
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Aventis Pharma SA
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Aventis Pharma SA
Priority date: 2002-02-26
Filing date: 2003-02-25
Publication date: 2007-04-26
Anticipated expiration: 2023-02-26
Also published as: JP4463562B2; US7618818B2; MXPA04006491A; AU2003224223B2; IL163682A0; ATE334210T1; FR2836475A1; US7211399B2; WO2003072787A3; NO20043503L; ZA200406134B; KR101053425B1; JP2005525111A; BR0307956A; ES2270011T3; CA2476846A1; EP1481065B1; KR20040096620A; HK1075274A1; US20070178560A1

Description

Die vorliegende Erfindung ist ein Verfahren zur Ermittlung von Liganden an den Leptinrezeptor anhand der Durchführung eines Energietransfers zwischen den Fusionsproteinen, die aus Leptinrezeptoren und Energiedonor- oder Energieakzeptorproteinen aufgebaut sind.
Ebenso werden Fusionsproteine, die für die Durchführung dieses Verfahrens nützlich sind, beschrieben.
Das Leptin ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von 16kDa, welches durch Fettzellen sekretiert wird. Dieses Protein hängt mit der Erscheinung der Sättigung zusammen und spielt eine erhebliche Rolle bei der Kontrolle der Gewichtsabnahme, dem Energieverbrauch, der Knochenbildung, der Angiogenese, jedoch auch bei anderen physiologischen Abläufen wie beim Auslösen der Pubertät und der Steuerung des Fortpflanzung oder der Regulierung von Immunreaktionen, die durch die T-Lymphozyten gesteuert werden.
Der Leptinrezeptor (OBR) gehört zur Familie der Cytokin-Rezeptoren. Er besteht aus einer einzigen Polypeptidkette, die, wie in 1 veranschaulicht wird, eine Transmembran-Domäne aufweist (Tartaglia et al., J. Biol. Chem., 272, 6093-6096, 1995). Die Patentanmeldung WO 97/19952 nimmt auf diesen Rezeptor Bezug.
Sechs verschiedene Isoformen des OBR, die Domänen mit C-Enden unterschiedlicher Längen aufweisen, wurden beschrieben. Diese Isoformen entstammen alle mittels alternativer Verbindungen einem einzigen Gen. Ebenso existiert eine lösliche Form des OBR, die die Stelle der Bindung des Leptins umfasst, die der extrazellulären Domäne der Membranformen entspricht. Diese lösliche Form, die nach der Übersetzung durch eine Proteolyse der plasmischen Membran, ausgehend von Membranformen, erzeugt wird, findet man im Blut. Eine andere lösliche Form des OBR, die aus einer Mutation hervorgeht, welche ein Stopcodon vor der Transmembrandomäne erzeugt, findet man ebenso in einigen sehr seltenen Fällen.
Ein Fusionsprotein, das aus der langen Form des Leptinrezeptors aufgebaut ist (OBRl) und das mit dem EGFP (Enhanced Green Fluorescence Protein) fusioniert ist, wurde durch Lundin et al. verwendet (Biochemica et Biophysics Acta, 1499, 130-138, 2000), um die Ortung des Rezeptors zu studieren.
Die Aktivierung des OBR geschieht mit Hilfe eines tetramerischen Komplexes, der sich aus zwei Janus-Kinasen 2 (JAK2) und zwei OBR zusammensetzt. Die Aktivierung des Rezeptors, die durch das Leptin hervorgerufen wird, führt zu einer Veränderung im Aufbau des OBR, der selbst wiederum eine JAK2 aktiviert, welche wiederum eine andere JAK2 und dann den OBR-Rezeptor transphosphoryliert.
Die Aktivierung des OBR scheint für alle bekannten Wirkungen des Leptins verantwortlich zu sein, wie zum Beispiel den Gewichtsverlust sowie für alle Erscheinungen, die bei außergewöhnlichen Gewichtsveränderungen eine Rolle spielen.
Die hemmenden Eigenschaften des Leptins gegenüber der Knochensynthese wurden kürzlich erst erwiesen. Das Leptin ist tätig, indem es die Tätigkeit der Osteoblasten hemmt, welche eine Zellpopulation aufweisen, die verantwortlich ist für die Knochenbildung.
Die Modifizierung der Leptinemie könnte es gestatten, Krankheiten zu behandeln, die mit einer Verringerung der Knochendichte wie zum Beispiel Osteoporose einhergehen oder umgekehrt solche, die mit einer hohen Kalziumanreicherung verbunden sind.
1999 haben Xu et al. (Proc Natl Acad Sci USA 96, 151-156) ein Verfahren zur Ermittlung der Protein-Protein-Interaktionen in Lebendzellen beschrieben. Dieses Verfahren war desübrigen der Gegenstand der Patentschrift WO 99/66324.
Dieses Verfahren, welches BRET genannt wird (für Bioluminescent Resonance Energy Transfer oder Biolumineszenz-Resonanz-Energietransfer) basiert auf einem natürlichen Phänomen, nämlich der Emission von Fluoreszenz durch Meeresorganismen. Die enzymatische Transformation durch die Renilla-Luziferase (Luc) aus einem Substrat, das die Membran passieren kann, erzeugt eine Biolumineszenz, die wiederum einen Energieakzeptor erfordert wie das gelb fluoreszierende Protein (auf Englisch YFP oder yellow fluorescent protein). Dieses Verfahren entspricht dem LRET (für Luminescent Resonance Energy Transfer), der von Wang et al. (Mol Gen Genet 264: 578-587 (2001)) beschrieben wurde.
Die Effizienz des Energietransfers hängt ab von der physischen Nähe und den entsprechenden Ausrichtungen des Akzeptors und des Donors. Insofern ist die Co-Expression der Luziferase und des YFP nicht ausreichend, um einen Energietransfer einzuleiten, da der Abstand zwischen den beiden Parteien niedriger als 100 Å sein muss. Um die Interaktion zwischen zwei potenziellen Interaktionspartnern zu untersuchen, wurde das erste Protein an die Luziferase fusioniert und das zweite Protein an das YFP. Wenn die zwei Proteine miteinander reagieren, kann ein Energietransfer beobachtet werden.
Seitdem wurde das BRET-Verfahren bei einer begrenzten Anzahl von Rezeptoren durchgeführt, welche eine ganz andere Struktur aufwiesen als die des Leptinrezeptors. In diesem Sinne beschreiben einige Autoren die Durchführung des Verfahrens bei Rezeptoren der Familie der Rezeptoren, die an G-Proteine (GPCR) gebunden sind, wie zum Beispiel die β-2-Adrenergie-Rezeptoren (Angers et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 10.1073)), die Cholesystokine des A-Typus (CCK; Cheng et al., 2001. Biol. Chem. 276: 48040 – 48047), und das Thyrotropin-Releasing-Horm (Kroeger et al., 2001, J. Biol. Chem. 276: 12736 – 12743).
Diese Rezeptoren großer Größe weisen eine komplexe Struktur auf und umfassen sieben Transmembran-Domänen. Schließlich haben Boute et al. (2001, Mol. Pharmacol. 60: 640-645) den weiteren Ablauf nach der Aktivierung des Insulinrezeptors unter Anwendung des BRET-Verfahrens beschrieben.
Der Insulinrezeptor besteht aus kovalenten Dimeren und nicht aus non-kovalenten Komplexen wie der Leptinrezeptor. Außerdem umfasst er einen recht langen intrazellulären Teil. Schließlich haben die Autoren aufzeigen können, dass die Veränderung des BRET, die durch das Insulin hervorgerufen wird, nur mittels gelöster Rezeptoren durchgeführt werden kann.
In den letzten zehn Jahren ist die Fettleibigkeit ein Hauptgesundheitsproblem geworden, das in den Industrieländern derzeit 20 bis 30 % der Bevölkerung betrifft. Diese Zahlen werden in den kommenden Jahren noch auf alarmierende Weise ansteigen. Aufgrund ihrer vielfältigen Ursachen, die auf Faktoren mit einem mehr oder weniger hohen Bedeutungsgrad zurückgehen, darunter Umweltfaktoren auf der einen Seite (Ernährungsgewohnheiten, Zugang zu Nahrungsmitteln, Kalorienverbrauch..) und auf der anderen Seite vielfältige genetische Ursachen, stellt die Fettleibigkeit eine wahre Herausforderung für die Medizin dar.
Auch Knochenkrankheiten wie die Osteoporose betreffen eine immer größer werdende Bevölkerungsgruppe.
Die Entdeckung von neuartigen Molekülen, die die Behandlung der diversen Krankheiten ermöglichen, die mit dem Leptinrezeptor im Zusammenhang stehen, wie die Fettleibigkeit und die Osteoporose, ist insofern ein bedeutsamer Beitrag zur öffentlichen Gesundheit.
Es existiert jedoch kein spezifisches Detektionsverfahren für Agonisten oder Antagonisten des Leptinrezeptors, das in einem größeren Umfang eingesetzt werden könnte.
Die Patentanmelder haben sich insofern darum bemüht, einen schnellen, spezifischen und wirksamen Detektionstest für Agonisten und Antagonisten des Leptinrezeptors zu entwickeln.
Sie haben auf überraschende Weise aufzeigen können, dass die Veränderung des BRET, die durch das Leptin induziert wird, auf einer der Isoformen des Leptinrezeptors durchgeführt werden kann, jedoch nicht mit allen Isoformen.
Sie haben außerdem aufgezeigt, dass die Durchführung des BRET auf dem Leptinrezeptor unter gewissen Durchführungsbedingungen optimal ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft insofern ein Verfahren zur Ermittlung der Liganden an den Leptinrezeptor anhand der Durchführung eines Resonanz-Energietransfers von einem ersten Fusionsprotein, das aus einem Leptinrezeptor besteht oder aus einem wesentlichen Teil eines Leptinrezeptors und einem Energiedonor-Protein oder einem wesentlichen und aktiven Teils eines Energiedonor-Proteins, sowie aus einem zweiten Fusionsprotein, das aus einem Leptinrezeptor besteht oder einem wesentlichen Teil eines Leptinrezeptors und einem Energieakzeptor-Protein oder aus einem wesentlichen und aktiven Teil eines Energieakzeptor-Proteins.
Die Erfindung betrifft außerdem Fusionsproteine für die Durchführung dieses Verfahrens sowie Nukleinsäuren, die diese Proteine kodieren.
Die Erfindung betrifft ebenso ein Verfahren zur kurativen oder präventiven Behandlung von Krankheiten, die im Zusammenhang stehen mit dem Leptin, wobei dieses Verfahren darin besteht, einen durch das oben definierte Verfahren ausgewählten Liganden an einen Patienten zu verabreichen, der von der besagten Krankheit betroffen ist.
Ein erster Gegenstand, der in der Anmeldung beschrieben wird, ist insofern ein Fusionsprotein, das dadurch gekennzeichnet ist, das es sich aus einem Leptinrezeptor oder aus einem wesentlichen Teil eines Leptinrezeptors zusammensetzt sowie aus einem Energieakzeptor- oder aus einem Energiedonor-Protein oder aus einem wesentlichen und aktiven Teil eines Energieakzeptor- oder Energiedonor-Proteins.
Die Fusionsproteine gemäß der vorliegenden Erfindung bestehen in ihrer Substanz aus einem Teil, der einem Teil oder der Gesamtheit der Sequenz eines Leptinrezeptors entspricht und bei einem entsprechenden Teil einem Energiedonor- oder Energieakzeptor-Protein. Diese können jedoch auch andere Aminosäurensequenzen umfassen, die anderen Proteinen entstammen, wie zum Beispiel Signalsequenzen. So besteht die Sequenz SEQ ID No. 4 aus einem Teil der Sequenz SEQ ID No. 2 und anderen Sequenzen und insbesondere aus der Signalsequenz des 3-Interleukins der Maus.
Auf vorteilhafte Weise ist das Energiedonor-Protein die Renilla-Luziferase. Diese kann jedoch auch jedes andere Energiedonor-Protein, entsprechend einer ausreichenden Überschneidung des Emissionsspektrums des Donors mit dem Reizspektrum des Akzeptors, um einen wirksamen Energietransfer zwischen den beiden Parteien zu ermöglichen, sein. Das Protein kann GFP sein, wenn der Energietransfer FRET ist oder auch Aequorin, wenn der Energietransfer CRET ist. Das Aequorin kann gewonnen werden und wird auf eine Weise verwendet, wie es in der Patentanmeldung EPO 187 519 oder im Artikel von Inouye et al. (PNAS USA 82: 3154-3158 (1985)) beschrieben wird.
Das fluoreszierende Energieakzeptor-Protein ist dies betreffend vorzugsweise DsRed, GFP oder ein Mutant dieses Proteins wie YFP, EYFP, der Wildtyp des GFP, GFPS65T oder Topaz.
Es kann jedoch auch jedes andere fluoreszierende Energieakzeptor-Protein sein, insofern sich das Reizspektrum des Akzeptors und das Emissionsspektrum des Donors genügend überschneiden, um einen wirksamen Energietransfer zwischen den beiden Parteien zu gestatten.
Diese Proteine sind dem Fachmann bekannt, der ihre Sequenzen in der Literatur finden kann, insbesondere in der Zeitschrift von Blinks et al. (Pharmacol. Rev. 28: 1-93 (1976)). Insbesondere wird das GFP durch Tsien (Annu. Rev. Biochem. 67: 509-544 (1998)) beschrieben und dessen Klonierung durch Prasher et al. (Gene 111: 229-233 (1992)). Die Klonierung von DsRed wird, was dies betrifft, durch Matz et al. (Nat. Biotechnol. 17: 969-973 (1999)) beschrieben. Für das Rluc kann sich der Fachmann auf Blinks et al. beziehen (Pharmacol. Rev. 28: 1-93 (1976)) oder auch auf Lorenz et al. (PNAS 88: 4438-4442 (1991)).
Die Isoform des Leptinrezeptors, die im Fusionsprotein vollständig oder zu Teilen enthalten ist, ist eine kurze Isoform oder eine solche, die eine kurze intrazelluläre Domäne aufweist.
Eine solche Isoform umfasst vorteilhaft eine intrazelluläre Domäne Box 1, aber keine intrazelluläre Box 3.
Auf vorteilhafte Weise ist diese Isoform die OBRs-Isoform und vorzugsweise die humane OBRs-Isoform. Diese Isoform kann gleichwohl jeder anderen Spezies entstammen.
Diese kann auch jede andere kurze Isoform sein, wobei sie vorzugsweise wenigstens die extrazelluläre Domäne des OBR umfasst, wie die lösliche Form des OBR, die die Stelle der Bindung an das Leptin umfasst, die durch Lee et al. (Nature 379, 632-635 (1996)), Gavrilova et al.
(JBC 272: 30546-30551 (1997)), Maamr. et al. (Endocrinology 142: 4389-4393 (2001)) oder durch Clement et al. (Nature 392: 398-401 (1998)) beschrieben wurde.
Gemäß einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform ist die Isoform die humane OBRs-Isoform der Sequenz SEQ ID No. 2. Sie kann auch eine Variante dieses Proteins sein, die zu wenigstens 65 % mit der Sequenz SEQ ID No. 2 identisch ist, vorzugsweise zu wenigstens 75 % und insbesondere zu 85 % oder 95 %.
Das Fusionsprotein kann lediglich einen Teil der humanen OBRs-Isoform umfassen. Vorteilhaft umfasst es den Teil zwischen den Aminosäuren 46 und 866 der Sequenz SEQ ID No. 2.
Der Teil, der dem Leptinrezeptor entspricht, kann somit die Sequenz SEQ ID No. 4 umfassen sowie eine Variante dieser Sequenz, die eine Identität von mindestens 65 %, vorzugsweise von mindestens 75 % und insbesondere von mindestens 85 bis 95 % aufweist.
Auf insbesondere vorteilhafte Weise weist das Donor-Fusionsprotein die Sequenz SEQ ID No. 6 oder eine Variante dieser Sequenz auf, die zu wenigstens 65 identisch ist.
Auf insbesondere vorteilhafte Weise weist das Akzeptor-Fusionsprotein die Sequenz SEQ ID No. 8 oder eine Variante dieser Sequenz auf, die zu wenigstens 65 identisch ist.
Andere Gegenstände, die in der Patentschrift beschrieben werden, sind Nukleinsäuren, die diese Proteine kodieren. Solche Nukleinsäuren können die komplementäre DNA oder die Genom-DNA oder die RNA sein. Diese Nukleinsäuren oder Polynukleotide können in einzelsträngiger oder doppelsträngiger Kettenform vorliegen.
Auf besonders bevorzugte Weise sind dies Komplementäre der DNA.
Auf bevorzugte Weise weist die Nukleinsäure eine Identität von mindestens 65 %, vorzugsweise von mindestens 75 % und insbesondere noch von mindestens 85 bis 95 % an Nukleotiden mit einer Nukleinsäure der Sequenz SEQ ID No. 5 oder der Sequenz SEQ ID No. 7 auf.
Entsprechend einem noch anderen Aspekt ist dies eine Hybrid-Nukleinsäure unter hoch stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Nukleinsäure, wie sie oben definiert wurde und insbesondere mit einer Nukleinsäure der Nukleotidsequenzen SEQ ID No. 5 und SEQ ID No. 7 oder mit einer Nukleinsäure der Komplementärsequenz.
Der „Prozentuale Anteil an Identität" von zwei Nukleotidsequenzen oder Aminosäuren kann im Sinne der vorliegenden Erfindung bestimmt werden durch den Vergleich von zwei Sequenzen mit optimalem Alignment und mittels eines Vergleichsfensters.
Der Teil der Nukleotid- oder Polypeptidsequenz im Vergleichsfenster kann in diesem Sinne aufgefasst werden als Addition oder Deletion (zum Beispiel der „Leerstellen") in Bezug auf die entsprechende Sequenz (die nicht diese Addition oder Deletion umfasst), um so ein optimales Alignment der zwei Sequenzen zu erhalten. Der Prozentsatz wird festgelegt durch die Bestimmung der Anzahl der Positionen, an denen eine Nukleinbase oder ein Reststoff einer Aminosäure im Hinblick auf die zwei verglichenen Sequenzen (Nuklein- oder Peptidsequenzen) für identisch befunden wird, und dann durch Dividieren der Anzahl der Positionen, an denen eine Identität der beiden Basen oder Reststoffe der Aminosäuren vorhanden ist durch die Gesamtzahl der Positionen im Vergleichsfenster, und danach durch Multiplizieren des Resultates mit 100, um den Prozentsatz bezüglich der Identität der Sequenz zu erhalten.
Das optimale Alignment der Sequenzen zum Zweck des Vergleichs kann über ein computergesteuertes Verfahren mit Hilfe von bekannten Algorithmen, die im Package des WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor, Madinson, WISCONSIN, enthalten sind, erreicht werden.
Zum Zweck der Veranschaulichung kann der Prozentsatz der Identität der Sequenz mit Hilfe der BLAST-Software (BLAST-Versionen 1.4.9 vom März 1996, BLAST 2.0.4 vom Februar 1998 und BLAST 2.0.6 vom September 1998) durchgeführt werden, indem lediglich die Standardparameter (S. F. Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990, 215: 403-410, S.F. Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997, 25: 3389-3402) angewendet werden. BLAST untersucht ähnliche/homologe Sequenzen in Bezug auf eine „gesuchte" Sequenz mit Hilfe des Algorithmus von Altschul et al. Die gesuchte Sequenz und die gegebenen Basen, die verwendet werden, können in Form eines Peptids oder Nukleids vorliegen, wobei jede Kombination möglich ist.
Unter „Hybridisierungsbedingungen unter hoher Stringenz" versteht man im Sinne der vorliegenden Erfindung die folgenden Bedingungen:

1- Kompetition der Membrane und PRE-HYBRIDISIERUNG: – Mischen: 40 μl DNA aus dem Sperma des Lachses (10 mg/ml) + 40 μl DNA aus der humanen Plazenta (10 mg/ml) – Denaturieren während 5 Minuten bei 96 °C und dann Eintauchen der Mischung in Eis. – Herausnehmen des SSC 2X und Hinzugabe von 4 ml Formamid-Mischung in das Hybridiserungsröhrchen, das die Membrane enthält. – Hinzugabe der Mischung der zwei denaturierten DNAs. – Inkubieren bei 42 °C während 5 bis 6 Stunden unter Schütteln.
2- Kompetition der Markersonde: – Hinzugabe von 10 bis 50 μl DNA Cot I zur markierten und gereinigten Sonde entsprechend der Zahl der Wiederholungen. – Denaturieren während 7 bis 10 Minuten bei 95 °C. – Inkubieren bei 65 °C während 2 bis 5 Stunden.
3- Hybridisierung: – Entfernen der Mischung der Pre-Hybridisierung. – Mischen von 40 μl DNA aus dem Sperma des Lachses mit 40 μl DNA aus der humanen Plazenta; Denaturieren während 5 Minuten bei 96 °C, dann Eintauchen in Eis. – Hinzugabe von 4 ml Formamid-Mischung in das Hybridisierungsröhrchen sowie der Mischung der zwei DNAs und der Markersonde/der denaturierten DNA Cot I. – Inkubieren während 15 bis 20 Stunden bei 42 °C unter Schütteln.
4- Waschen: – Einmal Waschen bei Raumtemperatur in SSC 2X, danach spülen. – Zweimal 5 Minuten lang bei Raumtemperatur in SSC 2X und in SDS 0,1 % bei 65 °C. – Zweimal 15 Minuten lang bei 65 °C in SSC 1X und in SDS 0,1 % bei 65 °C.

Einpacken der Membrane in Saran und belichten.
Die weiter oben beschriebenen Hybridisierungsbedingungen sind an die Hybridisierungsbedingungen eines Moleküls einer Nukleinsäure mit einer variablen Länge von 20 Nukleotiden bis zu mehreren Hundert Nukleotiden unter hoher Stringenz angepasst.
Es versteht sich, dass die Hybridisierungsbedingungen, die oben beschrieben wurden, im Hinblick auf die Länge der Nukleinsäure, deren Hybridisierung durchgeführt werden soll, oder im Hinblick auf den Typus der ausgewählten Markierung, gemäß der durch den Fachmann bekannten Techniken angepasst werden können.
Die geeigneten Hybridisierungsbedingungen können zum Beispiel entsprechend der bekannten Anweisungen aus dem Werk von HAMES und HIGGINS (1985, „Nucleic acid hybridization: a practical approach", Hames and Higgins Ed., IRL Press, Oxford) oder auch aus dem Werk von F. AUSUBEL et al. (1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.) angepasst werden.
Die für die Durchführung der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteine können durch sämtliche dem Fachmann bekannten Mittel erhalten werden. Sie werden nichtsdestotrotz vorteilhaft erzeugt durch die Expression von Nukleinsäuren, wie sie oben beschrieben wurden, welche diese Proteine kodieren und die gegebenenfalls in Expressionvektoren in vorteilhaft ausgewählten Zellen eingefügt sind, was gegebenenfalls einen Schritt der Extraktion und der Reinigung nach sich zieht, wobei diese vollständig oder partiell sein kann.
Die Erfindung betrifft auch einen rekombinanten Vektor, der eine Nukleinsäure gemäß der Erfindung umfasst. Vorteilhaft umfasst ein solcher rekombinanter Vektor eine Nukleinsäure, die aus den folgenden Nukleinsäuren ausgewählt ist:

a) eine Nukleinsäure, die ein Protein mit mindestens 65 Identität an Aminosäuren im Hinblick auf eine Sequenz SEQ ID No. 6 oder SEQ ID No. 8 oder im Hinblick auf ein Peptidfragment oder auf eine Variante dieses Letzteren aufweist;
b) eine Nukleinsäure, die ein Polynukleotid mit einer Sequenz SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 7 oder ein Fragment oder eine Variante dieses Letzteren aufweist;
c) eine Nukleinsäure, die eine Identität an Nukleotiden von mindestens 65 % in Bezug auf eine Nukleinsäure aufweist, welche eine Sequenz SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 7 oder ein Fragment oder eine Variante dieses Letzteren aufweist;
d) eine Hybrid-Nukleinsäure unter Hybridisierungsbedingungen mit hoher Stringenz mit einer Nukleinsäure der Sequenzen SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 7 oder mit einem Fragment oder einer Variante dieses Letzteren.

Unter „Vektor" im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man ein DNA- oder RNA-Molekül, das zirkulär oder linear ist und das ebenso einzelsträngig wie doppelsträngig aufgebaut sein kann.
Gemäß einer Ausführungsform umfasst der Expressionsvektor außerdem eine Nukleinsäure entsprechend der Erfindung und regulatorische Sequenzen, die die Transkription und/oder die Übersetzung gestatten.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform umfasst ein rekombinanter Vektor, der bei einem Verfahren nützlich ist, gemäß der Erfindung insbesondere die folgenden Elemente:

(1) Regulatorische Elemente für die Expression der einzufügenden Nukleinsäure, wie Promotoren oder Enhancer;
(2) die kodierende Sequenz, die sich in der Nukleinsäure gemäß der Erfindung befindet und die in einen solchen Vektor eingefügt werden soll, wobei sich besagte kodierende Sequenz in einer Phase mit den Signalen der Regulation, die bei (1) beschrieben wird, befindet; und
(3) geeignete Sequenzen für die Initiation und Terminierung der Transkription.

Außerdem können die rekombinanten Vektoren einen oder mehrere Replikationsursprünge bei den Wirtszellen mit einschließen, in denen ihre Amplifizierung oder ihre Expression gewünscht ist, sowie Marker oder Selektionsmarker.
Als Beispiel umfassen die Promotoren der eukaryotischen Zellen den Promotor der Thymidin-Kinase des HSV-Virus oder auch den Promotor des L-Metallothionein der Maus. Auf allgemeine Weise kann sich der Fachmann bei der Auswahl eines geeigneten Promotors vorzugsweise auf das Werk von SAMBROOK et al. (1989, „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) oder auf die durch FULLER et al. (1996, Immunology in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al.) beschriebenen Verfahren beziehen.
Die gemäß der Erfindung bevorzugten Vektoren sind Plasmide wie zum Beispiel die Vektoren pCDNA3 (Invitrogen), pQE70, pQE60, pQE9 (Qiagen), psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI, pSG (Stratagene).
Es kann sich ebenso um Vektoren des Typus des Baculovirus wie den pVL1392/1393 (Pharmingen) handeln, der verwendet wird, um die Zellen der Sf9-Linie (ATCC No. CRL 1711), die aus Spodoptera frugiperda abgeleitet sind, zu transfizieren.
Es kann sich auch um Vektoren von Adenoviren handeln, wie den humanen Adenovirus des Typus 2 oder 5.
Ein rekombinanter Vektor kann auch ein retroviraler Vektor sein oder ein Adeno-assoziierter Vektor (AAV). Solche Adeno-assoziierten Vektoren werden zum Beispiel durch FLOTTE et al. (1992, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 7: 349-356) beschrieben.
Die Patentschrift beschreibt außerdem Zellen, die ein Protein, eine Nukleinsäure oder einen Vektor umfassen, wie sie oben beschrieben wurden, oder Fragmente dieser Zellen, Lysate dieser Zellen oder auch Membrane dieser Zellen.
Solche Zellen können Zellen sein, die aus einem Organismus isoliert wurden und in einem adäquaten Wachstumsmedium angezüchtet wurden. Sie sind nichtsdestotrotz vorzugsweise Zelllinien. Insofern sind solche Linien auf insbesondere vorteilhafte Weise die Zelllinien HEK 293, COS (ATCC No. CRL 1650), COS-M6 und HeLa (ATCC No. CCL2) oder auch CV 1 (ATCC No. CCL70), Sf-9 (ATCC No. CRL 1711) und CHO (ATCC No. CCL-61) oder 3T3 (ATCC No. CRL-6361).
Die Membrane dieser Zellen können durch jedes dem Fachmann bekannte Verfahren aufbereitet werden. Vorzugsweise werden sie durch mechanische Zerkleinerung der Zellen und dann Zentrifugieren der erhaltenen Suspensionen aufbereitet, wie es in den folgenden Beispielen veranschaulicht wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Zusammensetzungen, die solche Zellen umfassen, wie sie oben beschrieben wurden, sowie Saponin.
Die vorliegende Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung der Bindung der Bestandteile an den Leptinrezeptor, wobei dieses die folgenden Schritte umfasst

– in Kontakt bringen von besagtem Bestandteil mit einem Energiedonor-Fusionsprotein, wie es oben beschrieben wurde, und mit einem Energieakzeptor-Fusionsprotein, wie es oben beschrieben wurde, oder mit Zellen oder Fragmenten oder Lysaten oder Zellmembranen, die ein solches Protein umfassen sowie ein adäquates enzymatisches Substrat, und
– Messen des Energietransfers.

Vorzugsweise wird besagtes Verfahren mit Zellen durchgeführt, die mit Saponin behandelt wurden.
Die Energiedonor-Fusionsproteine und die Energieakzeptor-Fusionsproteine werden so ausgewählt, dass die aus der Aktivierung des Donors resultierende Energie auf wirksame Weise zum Akzeptor übertragen werden kann.
Bei einer vorteilhaften Durchführungsform des besagten Verfahrens ist das Energiedonor-Fusionsprotein ein Fusionsprotein zwischen dem Leptinrezeptor oder einem wesentlichen Teil des Leptinrezeptors und der Luziferase oder einem wesentlichen Teil der Luziferase, wobei in dem Fall das Substrat vorteilhaft das Coelenterazin ist.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des besagten Verfahrens ist das Energieakzeptor-Fusionsprotein ein Fusionsprotein zwischen dem Leptinrezeptor oder ein wesentlicher Teil des Leptinrezeptors und des YFP oder ein wesentlicher Teil des YFP.
Bei einer vorteilhaften Durchführung des besagten Verfahrens wird der gemessene Energietransfer in Gegenwart des zu testenden Bestandteiles mit demjenigen verglichen, der während der Abwesenheit des zu testenden Bestandteiles gemessen wurde.
Vorzugsweise wird das Verfahren auf solchen Zellmembranen durchgeführt, wie sie oben beschrieben wurden.
Auf bevorzugte Weise werden die Donor- und Akzeptorproteine der vorliegenden Erfindung so ausgewählt, dass sich der Energietransfer mit Hilfe der BRET- oder LRET-Resonanz vollzieht. Nichtsdestotrotz kann ein solcher Energietransfer auch anhand des FRET (für Fluorescent Resonance Energy Transfer oder Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer) oder auch anhand des CRET (für Chemioluminescent Resonance Energy Transfer oder Chemischer Lumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer) durchgeführt werden.
Unabhängig von der Art des Energietransfers werden die Paare der Donor-/Akzeptor-Fusionsproteine so ausgewählt, dass sie einen solchen Transfer ermöglichen.
Das CRET-Verfahren besteht aus einem Energietransfer zwischen dem Aequorin, das eine Luziferase darstellt, und dem GFP.
Der FRET besteht aus einem Energietransfer zwischen zwei Proteinen aus der Familie von GFP, die verschiedene Spektren aufweisen.
Für die Durchführung dieser Transfers kann sich der Fachmann auf Baubet et al. (PNAS USA 97: 7260-7265 (2000)), für das CRET auf Matyus (J. Photochem. Photobiol. B 12: 323-337 (1992)) und für das FRET auf Pollet et Heim (Trends Cell Biol 9: 57-60 (1999)) beziehen.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Detektion oder zur Ermittlung der Bestandteile, die der Prävention und/oder der Behandlung von Krankheiten dienen sollen, die im Zusammenhang mit dem Leptin stehen, wobei dies die folgenden Schritte umfasst:

– In Kontakt bringen von besagtem Bestandteil mit einem Energiedonor-Fusionsprotein, wie es oben beschrieben wurde und einem Energieakzeptor-Fusionsprotein, wie es oben beschrieben wurde, oder mit Zellen in Abwesenheit oder in Gegenwart von Saponin oder mit Fragmenten oder Lysaten oder Zellmembranen, die solche Proteine enthalten und gegebenenfalls ein adäquates enzymatisches Substrat, und
– Messen des Energietransfers.

Ein solches Verfahren kann verwendet werden für die Detektion von Agonisten oder Antagonisten des Leptinrezeptors.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist mit 96- oder 384-Well Platten, die im Allgemeinen verwendet werden, kompatibel. Es erfordert nicht die Verwendung von radioaktiven Molekülen, ist empfindlich, reproduzierbar, schnell und das Resultat ist einfach abzulesen. Tatsächlich zeigt das Verfahren ein gutes Verhältnis von Signal : Hintergrundgeräusch und eine schwache Reaktivität, die sich mit anderen Liganden überschneidet als mit dem Leptin. Dies erklärt sich zumindest teilweise aufgrund der Tatsache, dass die Ermittlung der Aktivierung des OBR direkt am Rezeptor stattfindet, was die Eliminierung möglicher Quellen von Reaktivität, welche sich mit anderen Ebenen der Signalwege überschneiden, gestattet, wie man im Fall der Dosierungen, die auf den Reporter-Genen oder dem Wachstum der Zellen beruhen, beobachten kann.
Außerdem beschränkt sich dieses Verfahren nicht auf einen Transduktionsweg mit einem spezifischen Signal, sondern ist im Gegensatz dazu geeignet, alle Moleküle festzustellen, die mit den OBR-Proteinen zusammenwirken.
Dieses Merkmal ist insbesondere von Bedeutung für die Durchführung einer Durchsuchung im großen Umfang, da sich bei mehr und mehr membrangebundenen Rezeptorliganden herausstellt, dass sie einige Wege aktivieren, andere jedoch nicht.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Verwendung von ausgewählten Bestandteilen durch ein Verfahren, das folgende Schritte umfasst:

– In Kontakt bringen des besagten Bestandteiles mit einem Energiedonor-Fusionsprotein und mit einem Energieakzeptor-Fusionsprotein, wie sie oben beschrieben wurden, oder mit Zellen, Fragmenten, Lysaten oder Zellmembranen, die ein solches Protein und gegebenenfalls ein geeignetes enzymatisches Substrat umfassen, und
– Messen des Energietransfers für die Herstellung eines Medikamentes für die kurative oder präventive Behandlung von Krankheiten, die mit dem Leptin oder seinem Rezeptor zusammenhängen.

Sie steht schließlich im Zusammenhang mit einem Verfahren zur kurativen oder präventiven Behandlung von Krankheiten, die mit dem Leptin oder seinem Rezeptor zusammenhängen, wobei dies die Schritte umfasst:
– Auswahl des besagten Bestandteiles durch ein Verfahren, bestehend aus:
+ In Kontakt bringen von besagtem Bestandteil mit einem Energiedonor-Fusionsprotein und einem Energieakzeptor-Fusionsprotein oder mit Zellen, Fragmenten, Lysaten oder Zellmembranen, die ein solches Protein und ein adäquates enzymatisches Substrat umfassen, und
+ Messen des Energietransfers, sowie
– Verabreichen des besagten Bestandteiles an einen Patienten, der von der besagten Krankheit betroffen ist.
Solche Krankheiten können Krankheiten sein, die im Zusammenhang stehen mit einer Verringerung der Knochendichte, wie zum Beispiel Osteoporose, oder umgekehrt mit solchen, die verbunden sind mit einer deutlich erkennbaren Kalziumanreicherung.
Diese können auch Krankheiten sein, die eine Auswirkung auf das Gewicht haben, als solche die Fettleibigkeit, Diabetes oder Anorexie.
Die Elemente der Erfindung, die durch eines der Verfahren identifiziert wurden, können in pharmazeutischen Zusammensetzungen im Hinblick auf die topische, orale, parenterale, intranasale, intravenöse, intramuskuläre, subkutane, intraokulare etc. Verabreichung formuliert sein. Vorzugsweise enthalten die pharmazeutischen Zusammensetzungen Vehikel, die durch eine injizierbare Formel pharmazeutisch zugelassen sind. Dabei kann es sich insbesondere um Salinelösungen (Monosodium-, Disodium-, Trisodium-Phosphat, Sodiumchlorid, Potassium, Kalzium oder Magnesium etc. oder Mischungen aus solchen Salzen), sterile Lösungen, isotonische Lösungen oder Trockenzusammensetzungen handeln, insbesondere um lyophilisierte Zusammensetzungen, die, je nach Fall, durch Hinzugabe von sterilisiertem Wasser eines physiologischen Serums die Herstellung von injizierbaren Soluten gestatten.
Schließlich gestattet das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung auch die Durchsuchung des Serums von fettleibigen Patienten im Hinblick auf die Gegenwart oder die Abwesenheit des nicht funktionellen Leptins oder auch die Suche nach Molekülen, die an der Dimerisierung des OBR beteiligt sind.
1 stellt auf schematische Weise die Fusionsproteine dar. Box 1 stellt die Stelle der Bindung von JAK2 dar; Box 3 stellt die Stelle der Bindung der STAT-Proteine dar; TM stellt die Transmembran-Domäne dar.
Die 2a und 2b veranschaulichen die Expression der OBR-Konstruktionen in COS-Zellen, die anhand von Experimenten durch Radiomarkierung unter Verwendung des ¹²⁵I-Leptins als Radioligand berechnet werden. In den 2a und 2b wird die Gesamtzahl an Zellen im OBR bzw. der Prozentsatz der Stellen der Bindung an der Oberfläche der Zellen berechnet. 2c veranschaulicht die Lokalisierung der Zellen aus der Expression der OBRl-YFP- und der OBRs-YFP-Konstruktionen in der Gegenwart und der Abwesenheit des Leptins.
2d veranschaulicht die Aktivierung von JAK2 durch verschiedene OBR-Konstruktionen.
2e veranschaulicht die Wirkung der Stimulierung durch das Leptin auf Zellen, die das Reporter-Gen für STAT3 und verschiedene Konstruktionen von OBR co-exprimieren.
3 veranschaulicht die konstitutive Dimerisierung des OBR. Die bezeichneten HEK293-Zellen, die verschiedene Konstruktionen von OBR exprimieren, werden in der Gegenwart von Coelenterazin inkubiert. Der Energietransfer wird mit Hilfe eines Luminometers gemessen.
4a und 4b veranschaulichen die Wirkung der Bindung des Leptins auf dem konstitutiven BRET des OBR.
4a Die dargestellten HeLa-Zellen, die verschiedene Konstruktionen des OBR exprimieren, werden in Gegenwart von Leptin vor der Initiierung der Luziferase-Reaktion inkubiert. Der Energietransfer wird mit Hilfe eines Luminometers gemessen.
4b Die Wirkungen des Leptins werden in Gegenwart oder Abwesenheit von Saponin in vollständigen Zellen, die OBRs-Luc und OBR-YFP co-exprimieren, in Gesamtlysaten und in Membranaufbereitungen miteinander verglichen.
Die 5a bis 5e veranschaulichen die Optimierung und die Charakteristika der Veränderung des BRET, das durch das Leptin auf den OBRs induziert wird. Ausgehend von HeLa- oder COS-Zellen, die OBRs-Luc und OBRs-YFP co-exprimieren, wurden Membrane aufbereitet, die mit oder ohne Leptin vor dem Beginn der Luziferase-Reaktion pre-inkubiert wurden.
5a Optimierung des Expressionsniveaus von OBRs-Luc und von OBRs-YFP, relativ und absolut.
5b Variation des BRET-Signals, das durch das Leptin in Relation zur Zeit induziert wird.
5c Dosis-Wirkungskurven von BRET: Konzentration von Leptin auf Membranen und intakten Zellen in der Gegenwart von Saponin (0,05 %).
5d Kompetition der Bindung des ¹²⁵I-Leptins durch zunehmende Erhöhung der Konzentration des Leptins.
5e Besonderheiten der Veränderungen des durch Leptin induzierten BRET. Die Membrane wurden mit gesättigten Konzentrationen aus Erythropoietin (EPO, 10 U/ml), Trombopoietin (TPO, 10 nM), Granulozyten-Makrophagen-'colony stimulating factor' (GM-CSFm 250 ng/ml, Interleukin 3 (IL3, 280 ng/ml), Interleukin 6 (IL6, 100 ng/ml), Prolactin (PRL, 200 ng/ml, dem Stammzellfaktor α (SCF α, 250 ng/ml), dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF, 100 ng/ml), Insulin (Ins, 100 nM), Lipopolysaccharid (LPS, 100 ng/ml) und dem Tumor-Nekrose-Faktor α (TNFa, 50 ng/ml) pre-inkubiert.
6 Co-Transfektion von COS-Zellen bei einer konstanten Menge an OB-Rs-Luc (50 ng) und einer wachsenden Menge an OB-Rs-YFP: o, 200 ng; •, 400 ng; Δ, 800; ⧫, 1600; ♢, 3200. Die Messungen des BRET wurden anhand von Zellen in Gegenwart von Saponin (0,015 %) durchgeführt, wobei diese mit oder ohne wachsende Gaben von Leptin inkubiert wurden und in mBRET exprimiert wurden.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, ohne durch diese beschränkt zu werden.
Materialien und Methoden in den Beispielen
Plasmidkonstruktionen, Transfektionen und Zellkultur
Die Proteine der Fusion OB-R-YFP und OB-R-Luc wurden durch Ligation von YFP und Luc am Ende des C-Terminals der Rezeptoren durch klassische Verfahren der Molekularbiologie konstruiert. Die Bereiche, die YFP kodieren und die ausgehend vom Vektor pGFPtpz-Nl Cytogem^®-Topaze (Packard, Meriden, CT) erhalten wurden, wurden in die Stelle EcoRV des pcDNA3/CMV (Invitrogen, Groningen, Niederlande) injiziert, welche eine modifizierte Polylinker-Site enthielt. Der Bereich, der die Renilla-Luziferase kodierte, wurde ausgehend von pRL-CMV (Promega, Madison, WI) erhalten und in die Stelle EcoRV des modifizierten pcDNA3 injiziert. Die Regionen, die OBRl und OBRs kodierten (gestiftet von Dr. Gainsford, Royal Melbourne Hospital, Victoria, Australien) wurden in zwei Vektoren injiziert, die oben beschrieben wurden bzw. in die Sites, die durch die Klonierung von EcoR1/BamHl und Nhe1 erhalten wurden. Die Stopcodone wurden mittels kontrollierter Mutagenese deletiert und die Phase der Fusionsproteine wurde angepasst.
Die Zelllinien HEK 293, COS-M6 und HeLa wurden in DMEM kultiviert und mit den folgenden Bestandteilen vervollständigt: 10 % (v/v) FBS, 4,5 g/l Glucose, 100 U/ml Penizillin, 0,1 mg/ml Streptomycin, 1 mM Glutamin (Life Technolgies, Gaithersburg, MD).
Die transitorischen Transfektionen wurden unter Verwendung der Reagenz der FuGene6-Transfektion (Roche, Basel, Schweiz) durchgeführt.
Fluorenszenzmikroskopie
Zwei Tage nach der Transfektion mit den YFP-Konstruktionen wurden die Zellen mit 100 nM Leptin während 60 Minuten und mit 0,01 mM Bis-Benzamidin während 15 Minuten inkubiert, bevor diese in PBS gewaschen und während 20 Minuten bei Raumtemperatur in einer Kaltlösung aus 4 % Paraformaldehyd in PBS fixiert wurden. Die Schnitte wurden mittels eines Fluoreszenzmikroskops unter Verwendung von FITC- und DAPI-Filtern beobachtet.
Aufbereitung der Membrane und Solubilisierung
Die Zellen wurden auf Eis positioniert, zweimal in PBS unter Eiskühlung gewaschen und auf mechanische Weise in einem 1-Puffer (5 mM Tris, 2 mM EDTA, pH-Wert 7,4, 5 mg/l Inhibitor aus Trypsin-Soja, 5 mg/l Leupeptin und 10 mg/l Benzamidin) unter Eiskühlung herausgelöst.
Die Zellsuspensionen wurden mit einem Polytron-Homogenisator (Janke & Kunkel Ultra-Turrax T25) dreimal 5 Sekunden lang homogenisiert. Das Lysat wurde bei 450 X g während 5 Minuten bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand wurde bei 48.000 X g während 30 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Das schließliche Pellet wurde zweimal in einem 1-Puffer gewaschen und erneut in einer Lösung (75 mM Tris (pH-Wert 7,4), 12,5 mM MgCl₂, 5 mM EDTA mit den Protease-Inhibitoren, wie oben beschrieben) suspendiert und sofort in den Experimenten zur Bindung der radioaktiven Liganden oder in den BRET-Experimenten verwendet.
Immunopräzipitation von JAK2
Die HeLa-Zellen wurden mit den Plasmiden, die JAK2 exprimieren und die durch HA2 markiert waren, co-transfiziert (Stiftung von Dr. Wojchowski, Pennsylvania State University, Pennsylvania, USA) sowie mit Plasmiden, die unterschiedliche Konstruktionen von OBR aufwiesen. Die Zellen wurden in einem Lyse-Puffer lysiert (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 Glycerol, 0,02 % NaN3, NP40 0,1 %, Orthovanadat 1 mM, 5 mg/l Trypsin-Soja-Inhibitor und 10 mg/l Benzamidin) und während 15 Minuten bei 13.000 rpm zentrifugiert. Die lösliche Fraktion wurde während zwei Stunden mit einem polyklonalen Antikörper Anti-JAK2 (HR-758) immunopräzipitiert (1 μg/ml) (Santa-Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).
Immunoabsorption SDS-Page
Die Immunopräzipitate JAK2 wurden in der Lösung (62,5 mM Tris/HCl (pH-Wert 6,8), 5 % SDS, 10 % Glycerol und 0,05 % Bromophenol Blau) bei 100 °C während 10 Minuten denaturiert. Die Proteine wurden durch SDS-PAGE in 7 Polyacrylamid getrennt und auf Nitrozellulose übertragen. Die Immunodetektion wurde mit einem Anti-Phosphotyrosin-Antikörper 4G10 (2 μg/ml) durchgeführt (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY). Die Immunoreaktivität wurde festgestellt durch Verwendung eines zweiten geeigneten Antikörpers, der an die Meerrettich-Peroxydase gebunden ist, sowie durch die Chemilumineszenz-Reagenz ECL (Amersham, Aylesbury, UK).
Bindungstest des ¹²⁵I-Leptins
Transfizierte Zellen wurde in DMEM (1 % BSA) 24 Stunden vor den Experimenten zur Bindung Serum entnommen. Um die Bindung des Leptins an die Oberfläche der Zellen zu messen, wurden die Zellen zweimal mit PBS bei Gefriertemperatur gewaschen und in einem Bindungspuffer 4 Stunden lang bei 4 °C inkubiert (DMEM, 25 mM Hepes, pH-Wert 7,4, 1 % BSA), welcher 100.000 cpm/Well aus ¹²⁵I-Leptin (PerkinElmer life sciences, Paris, Frankreich) in Abwesenheit oder in der Gegenwart von 200 nM nicht-radioaktivem Leptin (humanes rekombinantes Leptin (PeproTech Inc., USA)) enthielt. Die Zellen wurden zweimal mit PBS bei Gefriertemperatur gewaschen, in 1N NaOH lysiert und die Radioaktivität wurde in einem Zähler für Gramma-Strahlen bestimmt. Um die Gesamtmenge an Leptin, das sich in dem Extrakt gebunden hatte, zu messen, wurden die Zellen 2 Stunden lang bei 4 °C in eine Suspension aus 1,5 ml Bindungspuffer, der 0,15 % Digitonin enthielt, eingebracht. Die Extrakte wurden 30 Minuten lang in einer Eppendorf-Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand (0,2 ml) wurde mit 100.000 cpm ¹²⁵I-Leptin in der Gegenwart oder der Abwesenheit von 200 nM Leptin in einem Gesamtvolumen von 0,25 ml unter Schütteln die ganze Nacht bei 4 °C inkubiert.
0,5 ml γ-Globulin (1,25 mg/ml) und 0,5 ml Polyethylen-Glycol 6000 (25 % p/v) wurden hinzugegeben, um die Rezeptor-Liganden-Komplexe, welche man durch Zentrifugieren (17.000 x g während 3 Minuten) erhalten hatte, zu präzipitieren. Das Pellet wurde mit 1 ml Polyethylen-Glycol 6000 12 % (p/v) gewaschen und dann ausgezählt.
Aktivierung des Reporter-Gens
HeLa-Zellen wurden mit 2,6 μg eines Plasmids, das das Reporter-Gen STAT3 umfasste (Stiftung von Dr. Levy, New York University, New York, USA), 200 pg des pcDNA3, das die Region umfasste, die die Renilla-Luziferase kodiert (verwendet als interner Vergleich) und mit 1,4 μg verschiedener OBR-Konstruktionen oder mit dem Vehikel allein co-transfiziert. 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen über Nacht in DMEM (1 BSA) noch vor der Stimulation mit 1nM Leptin während 6 bis 8 Stunden stehen gelassen. Die Zellen wurden dann gewaschen und in einem passiven Lyse-Puffer (Promega Corporation, Madison, WI) 15 Minuten lang bei Raumtemperatur gewaschen. Die Gesamtlysate wurden 2 Minuten lang bei 15.000 rpm zentrifugiert und die Überstände wurden in einem Luziferase-Assay (Promega Corporation, Madison, WI) verwendet, indem ein Berthold-Luminometer (Lumat LB 9507) verwendet wurde. Die Ergebnisse werden durch das Verhältnis der Aktivitäten der Firefly-Luziferase zur Renilla-Luziferase ausgedrückt.
Messung von BRET
48 Stunden nach der Transfektion der HeLa-Zellen wurden COS und HEK 293, die OBR exprimieren, herausgelöst und mit PBS gewaschen. 1-2x10⁵ Zellen wurden in optischen 96-Well-Platten (Packard Instrument Company, Meriden, CT) in Abwesenheit oder in der Gegenwart von Liganden bei 25 °C verteilt. Membrane, die ausgehend von Zellen, die OBR exprimieren, aufbereitet worden waren, wurden für die Messungen des BRET verwendet. Das Substrat, das Coelenterazin h (Molecular Probes, Eugene, OR), wurde zu einer Endkonzentration von 5 μM hinzugegeben und die Ablesung wurde mit einem Fluoro/Luminometer Fusion (Packard Instrument Company, Meriden, CT) durchgeführt, welcher die sequenzielle Einfügung der Signale der Lumineszenz, die mittels der zwei Filter festgestellt wurde (Luc-Filter: 485 ± 10 nm, YFP-Filter: 530 ± 12,5 nm), gestattet. Das Verhältnis von BRET wird definiert als die Differenz der Emission bei 530 nm/ 485 nm der co-transfizierten Fusionsproteine Luc und YFP zur Emission bei 530 nm/ 485 nm des Luc-Fusionsproteins allein. Die Resultate werden in milliBRET-Einheiten ausgedrückt (mBU), dabei entspricht eine mBRET-Einheit dem Wert des Verhältnisses von BRET, multipliziert mit 1000. Die folgenden Liganden wurden verwendet, um die spezielle Dosierung festzulegen: Humanes Rekombinantes Erythropoietin (EPO), Insulin (Ins), Lipopolysaccharid (LPS, Sigma Aldrich, St. Louis, USA), Humanes Rekombinantes Trombopoietin (TPO), GM-CSF, Interleukin 3 (IL3), Interleukin 6 (IL6), Prolaktin (PRL), SCF, EGF und TNFa.
Beispiel 1: Funktionelle Expression der OBR-Fusionsproteine
Die lange Form (OBRl) und die kurze Form (OBRs) des OBR wurden an ihren Enden der C-Terminals mit YFP oder Luc (1) fusioniert. Die Expression dieser Fusionsproteine wurde in COS-Zellen bestätigt, die in Experimenten zur Bindung an das ¹²⁵I-Leptin (2a) transfiziert wurden. Bei transfizierten HeLa-Zellen erhielt man ähnliche Ergebnisse.
Die Expression an der Oberfläche der Zellen der Fusionsproteine und der Rezeptoren des Wildtyps, die in COS-Zellen exprimiert wurden, bewegte sich zwischen 5 und 10 %, was den schon beschriebenen Werten entspricht. Ähnliche Werte wurden für HEK293-Zellen erhalten, die endogene OBR-Proteine (14 ± 3 %) exprimieren.
Die Lokalisierung der OBR-Fusionsproteine in HeLa-Zellen wurde mittels Fluoreszenz-Mikroskopie unter Verwendung von Fusionsproteinen mit YFP untersucht. Die Fluoreszenz aufgrund von OBRl-YFP war punktuell in den Zellen vorhanden, während jene mit OBRs-YFP in den Platten vorzufinden war. Die Stimulation durch Leptin lokalisiert OBRl-YFP in großen intrazellulären Platten, die wahrscheinlich dem endosomalen Kompartiment entsprechen. Die Lokalisierung von OBRs-YFP veränderte sich nicht auf signifikante Weise. Die durch die Fluoreszenz-Mikroskopie erhaltenen Ergebnisse bestätigen die vorwiegende Lokalisierung des OBR im intrazellulären Kompartiment und stimmen mit der schon beschriebenen Lokalisierung des Fusionsproteins OBRl-GFP in COS-Zellen überein.
Die funktionelle Expression der Fusionsproteine wurde durch die Messung der Aktivierung des JAK-STAT-Weges untersucht. Die JAK2-Kinasen sind mit den intrazellulären Domänen von OBRs und OBRl verbunden. Die Bindung der Liganden leitet die Transphosphorylierung von JAK2 und die Phosphorylierung von OBRl ein, nicht jedoch von OBRs. Das phosphorylierte OBRl liefert für die STAT-Proteine, die durch die Phosphorylierung von Tyrosin infolge der Bindung an den Rezeptor aktiviert werden, sofort eine Bindungssstelle. Die aktivierten STAT-Proteine dimerisieren dann und werden im Zellkern, wo sie die Transkription der Gene mit Hilfe von Elementen, die auf STAT reagieren, stimulieren, translokalisiert, wie es Tartaglia (1997, J. Biol. Chem. 272, 6093-6096) beschrieben hat.
Wie 2c zeigt, veranlassen alle OBRs- Konstruktionen die Phosphorylierung von JAK2, was auf eine Aktivierung von JAK2 hinweist. Die Aktivität des Reporter-Gens STAT3 wird mit einem Faktor von 2 bis 4 durch OBRl-wt und die Fusionsproteine OBRl aktiviert, wohingegen die kurzen Isoformen keinen Einfluss auf die Aktivierung des Reporter-Gens haben. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die OBR-Fusionsproteine in den HeLa-Zellen funktionell exprimiert werden.
Beispiel 2: Konstitutive Dimerisierung von OBR in Lebendzellen.
Die Dimerisierung von OBR-Luc und OBR-YFP wurde in Lebendzellen untersucht.
Signifikante Energietransfers wurden zwischen OBRs-Luc und OBRs-YFP beobachtet sowie auch zwischen OBRl-Luc und OBRl-YFP, die in äquimolaren Mengen exprimiert wurden, was darauf hinweist, das die konstitutiven Homodimere bei beiden Rezeptoren existieren (3a, b). Das Vorhandensein von OBRs/OBRl-Heterodimeren in Lebendzellen wurde anhand der Feststellung durch BRET zwischen OBRs-Luc und OBRl-YFP aufgezeigt sowie auch zwischen OBRl-Luc und OBRs-YFP. Die Besonderheit dieser Interaktionen wird veranschaulicht durch das Fehlen eines signifikanten Transfers zwischen OBRs-Luc und OBRl-Luc und durch ein Fusionsprotein zwischen YFP und dem beschriebenen Insulin-Rezeptor (Boute et al., 2001, oben zitiert).
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die kurzen und langen Isoformen an heterologischen und homologischen Komplexen in Lebendzellen beteiligt sind.
Beispiel 3: Wirkung der Leptinbindung auf das für OBR-Proteine konstitutive BRET
Um die agonistischen Wirkungen auf das konstitutive BRET zu bewerten, wurden Zellen mit Leptin vorinkubiert, bevor die Luziferase-Reaktion mit ihrem Substrat initiiert wurde.
Bei dem konstitutiven BRET wurde überhaupt keine Veränderung der Homodimere OBRl und der zwei Kombinationen der Heterodimere OBRs/OBRl festgestellt, wohingegen das BRET mit den OBRs-Homodimeren anstieg (4a).
Die Veränderungen des BRET der OBRs-Homodimere, die durch das Leptin hervorgerufen wurden, wurden sofort in verschiedenen Zellaufbereitungen gemessen.
Der mechanische Bruch von Zellen in einem hypotonischen Puffer verbesserte auf signifikante Weise die Erhöhung des BRET durch das Leptin, wohingegen das basale BRET unverändert blieb.
Ähnliche Ergebnisse erhielt man bei der Membranfraktion nach der Trennung von Cytosol. Während alle OBRs-Luc/OBRs-YFP-Paare zum basalen BRET beitragen, können nur die Rezeptoren, die sich an der Oberfläche der Zelle (5 bis 10 %) befinden, durch das Leptin, welches für die Membrane in intakten Zellen undurchlässig ist, stimuliert werden. Die Disruption der Zellmembrane erhöht die OBR-Fraktion, die für das Leptin zugänglich ist und die für die Erhöhung des BRET, welche auf das Leptin zurück geht, verantwortlich ist.
Ähnliche Ergebnisse erhielt man bei Zellen, die mit Saponin behandelt worden waren. Dieser Bestandteil durchlöchert die Membrane und gestattet den Durchlass von Proteinen wie dem Leptin in intrazelluläre Kompartimente, wo sich die Mehrzahl der OBRs befindet. Es konnte keine einzige Veränderung bei dem BRET, das durch das Leptin induziert wird, bei analogen Experimenten, die mit Aufbereitungen ausgehend von Zellen, die die Homodimere OBRl oder die Heterodimere OBRs/OBRl exprimieren, durchgeführt wurden, beobachtet werden.
Die Mengen und das Verhältnis von OBRs-Luc und OBRs-YFP wurden sofort moduliert, um das BRET, das durch das Leptin induziert wurde, zu optimieren (5a). Die besten Resultate erhielt man, wenn 500 ng der DNA, die OBRs-Luc kodiert und 250 ng der DNA, die OBRs-YFP kodiert, verwendet wurden.
Unter optimierten Bedingungen induzierte eine gesättigte Lösung aus Leptin eine Erhöhung des basalen BRET-Signals in mit Saponin inkubierten Zellen oder bei Membranen, die ausgehend von Zellen, die die Homodimere OBRs exprimieren, um den Faktor 2 bis 2,5 erhöht wurden. Diese Erhöhung ist relativ zur Zeit. Die Maximalwerte wurden nach 20 Minuten Inkubation mit 1 nM Leptin bei Raumtemperatur (5b) erreicht. Für höhere Leptin-Konzentrationen werden die Maximalwerte nach 5 Minuten Inkubationszeit bei Raumtemperatur erhalten.
Die Wirkung des Leptins ist dosisabhängig mit einem EC50 von etwa 100 pM (5c), was den Ki-Werten entspricht, die bei den OBRs-Luc-Fusionsproteinen (116 pM) und OBRsYFP (35 pM) (5d) erhalten wurden. Das Spezifikum des Tests wird durch die Abwesenheit von BRET, das durch den Liganden durch eine sättigende Konzentration aus mehreren Cytokinen und anderen Membran-Rezeptorliganden wie Erythropoietin, Trombopoietin, GM-CSF, IL3, IL6, PRL, SCFα, EGF, Insulin, LPS und TNFa induziert wird, dargelegt.
Die Verteilung der Rezeptoren in den Dimeren geschieht entsprechend der statistischen Verteilung, wobei man bei einem Verhältnis von 1:1 in Bezug auf die Anzahl der Rezeptoren die folgende Verteilung erwartet, sofern alle Rezeptoren eine dimerische Form eingenommen haben: 1/4 Luc/Luc, 1/4 YFP/YFP und 1/2 der Rezeptoren, die in der Lage sind, ein BRET-Signal (1/4 Luc/YFP, 1/4 YFP/Luc) zu erzeugen. Bei der Messung des BRET weisen die gesamten Moleküle, die mit Luc fusioniert haben, jedoch ein Lumineszenz-Signal auf und man beobachtet entsprechend bei einem Verhältnis von 1:1, dass die Hälfte der Rezeptoren bei einer gegebenen Gesamtpopulation durchführungsfähig sind für das BRET. Ebenso wurden zur Erhöhung des BRET-Signals Experimente zur Sättigung der Luc-Moleküle durch YFP-Moleküle auf eine Weise durchgeführt, dass alle Luc-Moleküle in Form von Dimeren mit den YFP-Molekülen erscheinen (durchführungsfähig für BRET). Die Ergebnisse in 6 belegen, dass das basale BRET infolge der Sättigung ansteigt und dass die Induzierung durch das Leptin mit einer 2 bis 2,5 fachen Stimulation des basalen BRET proportional zum basalen Signal ist. Durch die Sättigung erhält man eine Besserung Auflösung des basalen und induzierten BRET, wodurch bei der Suche nach Molekülen eine bequemere Durchsuchung ermöglicht wird.
Schlüssel zu den Figuren

Claims

Verfahren zur Ermittlung der Bindung von Verbindungen an den Leptinrezeptor, das die Schritte umfasst, die daraus bestehen: a) besagte Verbindungen in Kontakt zu bringen mit einem Fusionsprotein, das aus einem Leptinrezeptor, der eine kurze intrazelluläre Domäne aufweist, oder aus einer löslichen Form eines solchen Rezeptors, die die Stelle der Bindung an das Leptin enthält, und aus einem Energiedonor-Protein zusammengesetzt ist, und einem Fusionsprotein, das aus einem Leptinrezeptor, der eine kurze intrazelluläre Domäne aufweist, oder aus einer löslichen Form eines solchen Rezeptors, die die Stelle der Bindung an das Leptin enthält, und aus einem Energieakzeptor-Protein zusammengesetzt ist, oder besagte Verbindungen mit Zellen oder Fragmenten oder Lysaten oder Zellmembranen, die solche Fusionsproteine umfassen, und gegebenenfalls einem geeigneten Enzymsubstrat in Kontakt zu bringen und b) den Energietransfer zu messen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der in Gegenwart der zu untersuchenden Verbindung gemessene Energietransfer mit dem in Abwesenheit der zu untersuchenden Verbindung gemessenen verglichen wird.
Verfahren zum Screening oder zum Nachweis von Verbindungen, die für die Prophylaxe und/oder die Behandlung von Erkrankungen bestimmt sind, das die Schritte umfasst, die daraus bestehen: a) besagte Verbindungen in Kontakt zu bringen mit einem Fusionsprotein, das aus einem Leptinrezeptor, der eine kurze intrazelluläre Domäne aufweist, oder aus einer löslichen Form eines solchen Rezeptors, die die Stelle der Bindung an das Leptin enthält, und aus einem Energiedonor-Protein zusammengesetzt ist, und einem Fusionsprotein, das aus einem Leptinrezeptor, der eine kurze intrazelluläre Domäne aufweist, oder aus einer löslichen Form eines solchen Rezeptors, die die Stelle der Bindung an das Leptin enthält, und aus einem Energieakzeptor-Protein zusammengesetzt ist, oder mit Zellen oder Fragmenten oder Lysaten oder Zellmembranen, die solche Proteine umfassen, und gegebenenfalls einem geeigneten Enzymsubstrat und b) den Energietransfer zu messen.
Verfahren zum Screening von Agonisten oder Antagonisten des Leptinrezeptors, das die Schritte umfasst, die daraus bestehen: a) die möglichen Agonisten oder Antagonisten in Kontakt zu bringen mit einem Fusionsprotein, das aus einem Leptinrezeptor, der eine kurze intrazelluläre Domäne aufweist, oder aus einer löslichen Form eines solchen Rezeptors, die die Stelle der Bindung an das Leptin enthält, und aus einem Energiedonor-Protein zusammengesetzt ist, und einem Fusionsprotein, das aus einem Leptinrezeptor, der eine kurze intrazelluläre Domäne aufweist, oder aus einer löslichen Form eines solchen Rezeptors, die die Stelle der Bindung an das Leptin enthält, und aus einem Energieakzeptor-Protein zusammengesetzt ist, oder besagte Verbindungen mit Zellen oder Fragmenten oder Lysaten oder Zellmembranen, die solche Fusionsproteine umfassen, und gegebenenfalls einem geeigneten Enzymsubstrat in Kontakt zu bringen und b) den Energietransfer zu messen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Leptinrezeptor eine kurze Isoform ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Leptinrezeptor eine Isoform ist, die eine intrazelluläre Domäne Box 1 umfasst, aber keine intrazelluläre Domäne Box 3 umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Leptinrezeptor die Isoform OBRs ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Leptinrezeptor die humane Isoform OBRs mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 oder eine Variante dieses Rezeptors ist, die zu wenigstens 65 % mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 identisch ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz des Leptinrezeptors die Sequenz der Aminosäuren 48 bis 866 der humanen Isoform OBRs mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 oder eine Variante dieser Sequenz ist, die zu wenigstens 65 % identisch ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Leptinrezeptor die Sequenz SEQ ID NO: 4 oder eine Variante dieser Sequenz, die zu wenigstens 65 % identisch ist, aufweist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Energiedonor-Fusionsprotein ein Fusionsprotein zwischen dem Leptinrezeptor und Luziferase ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Energieakzeptor-Fusionsprotein ein Fusionsprotein zwischen dem Leptinrezeptor und GFP oder einer Mutante dieses Proteins oder DsRed ist.
Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutante des GFP YFP, EYFP, GFPS65T oder Topaz ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Energiedonor-Fusionsprotein die Sequenz SEQ ID NO: 6 oder eine Variante dieser Sequenz, die zu wenigstens 65 identisch ist, aufweist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Energieakzeptor-Fusionsprotein die Sequenz SEQ ID NO: 8 oder eine Variante dieser Sequenz, die zu wenigstens 65 identisch ist, aufweist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass es mit Zellen, die mit Saponin behandelt sind, durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat Coelenterazin ist.