ES2270011T3 - Procedimiento de deteccion de ligandos del receptor de la leptina. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la determinación de la unión de compuestos al receptor de la leptina que comprende las etapas que consisten en: a) poner en contacto dichos compuestos con una proteína de fusión compuesta por un receptor de la leptina que presenta un dominio intracelular corto o por una forma soluble de dicho receptor que contiene el sitio de unión con la leptina y una proteína donante de energía y una proteína de fusión compuesta por un receptor de la leptina que presenta un dominio intracelular corto o por una forma soluble de dicho receptor que contiene el sitio de unión con la leptina y una proteína aceptora de energía o poner en contacto dichos compuestos con células o fragmentos, o lisados, o membranas de células que comprenden dichas proteínas de fusión y, opcionalmente, un sustrato enzimático adecuado, y b) medir la transferencia de energía.
Description
Procedimiento de detección de ligandos del
receptor de la leptina.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de detección de ligandos del receptor de la leptina
mediante la transferencia de energía entre proteínas de fusión
compuestas por receptores de la leptina y proteínas donantes o
aceptoras de energía.
También se describen proteínas de fusión útiles
para la realización de este procedimiento.
La leptina es una proteína que presenta un peso
molecular de 16 kDa, que es secretada por los adipocitos. Esta
proteína está asociada con la sensación de saciedad, y desempeña un
papel importante en el control de la ganancia de peso, el consumo de
energía, la formación ósea, la angiogénesis, pero también en otras
funciones fisiológicas tales como el inicio de la pubertad y el
control de la reproducción o la regulación de la respuesta
inmunitaria regulada por los linfocitos T.
El receptor de la leptina (OBR) pertenece a la
familia de los receptores de las citoquinas. Éste se compone, tal
como lo ilustra la figura 1, de una cadena polipeptídica única que
comprende un dominio transmembrana (Tartaglia et al., J.
Biol. Chem., 272, 6093-6096, 1995). La solicitud de
patente internacional WO 97/19952 se refiere a este receptor.
Se han descrito seis isoformas diferentes del
OBR que tienen dominios C-terminales con longitudes
diferentes. Estas isoformas se derivan todas ellas, por empalmes
alternativos, de un único género. Existe igualmente una forma
soluble de los OBR que contiene el sitio de unión con la leptina que
corresponde al dominio extracelular de las formas de membrana. Esta
forma soluble, generada de manera posterior a la traducción mediante
proteolisis con la membrana plasmática a partir de las formas de
membrana, se encuentra en la sangre. Otra forma soluble del OBR, que
resulta de una mutación que genera un codón de parada delante del
dominio transmembrana, también se encuentra en ciertos casos, muy
raros.
Una proteína de fusión constituida por la forma
larga del receptor de la leptina (OBR1) fusionada con la EGFP (de
Enhanced Green Fluorescence Protein = proteína de
fluorescencia verde intensificada) ha sido utilizada por Lundin
et al (Biochemica et Biophysica Acta, 1499,
130-138, 2000) para estudiar la localización del
receptor.
La activación del OBR se haría por intermedio de
un complejo tetramérico, compuesto por dos quinasas Janus 2 (JAK2) y
dos OBR. La activación del receptor, inducida por la leptina,
induciría un cambio en la conformación del OBR, que por su parte
activaría una JAK2, que a su vez transfosforilaría a otra JAK2 y
después al receptor OBR.
La activación del OBR parece ser responsable de
todos los efectos conocidos de la leptina, tales como la pérdida de
peso y todos los fenómenos implicados en los trastornos de peso.
Así, las propiedades inhibidoras de la leptina
frente a la síntesis ósea se han puesto de manifiesto recientemente.
La leptina actúa inhibiendo la actividad de los osteoblastos, que
son una población de células responsables de la formación del
hueso.
El hecho de modificar la leptinemía podría
permitir el tratamiento de las enfermedades vinculadas con una
disminución de la densidad ósea, tal como, por ejemplo, la
osteoporosis o, a la inversa, las vinculadas con una calcificación
importante.
En 1999, Xu et al (Proc Natl Acad Sci USA
96, 151-156) describieron un método para la
detección de las interacciones proteína-proteína en
células vivas. Este método ha constituido además el objeto de la
solicitud de patente internacional WO 99/66324.
Este método, denominado BRET (por Bioluminescent
Resonance Energy Transfer o transferencia de energía de
bioluminiscencia por resonancia), está basado en un fenómeno
natural, a saber la emisión de fluorescencia por organismos marinos.
La transformación enzimática, por la luciferasa de Renilla
(Luc), de un substrato que puede atravesar la membrana genera una
bioluminiscencia, que a su vez excita a un aceptor de energía, tal
como la proteína fluorescente amarilla (YFP o Yellow Fluorescent
Protein en inglés). Este método corresponde a LRET (por Luminescent
Resonance Energy Transfer, transferencia de energía luminiscente por
resonancia) descrita por Wang et al (Mol Gen Genet 264 :
578-587 (2001)).
La eficacia de la transferencia de energía
depende de la proximidad física y de las respectivas orientaciones
del aceptor y del donante. Así, la expresión conjunta de la
luciferasa y de la YFP no es suficiente para inducir una
transferencia de energía puesto que la distancia entre los dos
partícipes debe ser inferior a 100 \ring{A}. Con el fin de
estudiar la interacción entre dos partícipes potenciales en la
interacción, se ha fusionado la primera proteína con la luciferasa y
la segunda proteína con la YFP. Si las dos proteínas interactúan, se
puede observar una transferencia de energía.
Desde entonces, el método de BRET ha sido puesto
en práctica en un número limitado de receptores que presentan una
estructura muy diferente con respecto a la del receptor de la
leptina.
Así, algunos autores describen la realización
del método en receptores de la familia de los receptores acoplados
con las proteínas G (GPCR), tales como los receptores \beta 2
adrenérgicos (Angers et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 10.1073), colesistoquinas del tipo A (CCK; Cheng et
al., Biol. Chem. 276: 48040-48047), y la hormona
liberadora de tirotropina (Kroeger et al., 2001, J. Biol.
Chem. 276: 12736-12743).
Estos receptores de tamaño considerable
presentan una estructura compleja que comprende 7 dominios
transmembrana.
Finalmente, Boute et al (2001, Mol
Pharmacol 60: 640-645) han descrito el
seguimiento de la activación del receptor de la insulina utilizando
BRET.
El receptor de la insulina está constituido por
dímeros covalentes, y no por complejos no covalentes como el
receptor de la leptina. Además, comprende una parte intracelular
bastante larga. Finalmente, los autores muestran que el cambio de
BRET inducido por la insulina no se puede realizar más que en el
receptor solubilizado.
En el transcurso de algunas decenas de años, la
obesidad se ha convertido en un problema de salud pública importante
en los países industrializados, en donde ésta afecta actualmente al
20 a 30% de la población. Estas cifras deberían crecer todavía más
de manera alarmante en los años venideros. Debido a sus orígenes
multifactoriales, que tienen su origen con unos grados más o menos
importantes entre los factores ambientales, por una parte
(comportamientos alimentarios, acceso a la nutrición, gasto
energético,...) y orígenes genéticos múltiples, por otra parte, la
obesidad constituye un verdadero desafío para la medicina.
Igualmente, las enfermedades óseas, tales como
la osteoporosis, afectan a una parte cada vez más importante de la
población.
El descubrimiento de nuevas moléculas, que
permitan tratar las diversas enfermedades vinculadas con el receptor
de la leptina, tales como la obesidad y la osteoporosis, es por lo
tanto un envite importante de la salud pública.
No existe, sin embargo, ningún procedimiento de
cribado específico de agonistas o de antagonistas del receptor de la
leptina que pueda emplearse con elevado flujo.
Los solicitantes se han dedicado por lo tanto a
la realización de un ensayo de cribado rápido, específico y eficaz
de agonistas o de antagonistas del receptor de la leptina.
Han mostrado, de una manera sorprendente, que el
cambio de BRET inducido por la leptina podía realizarse en una de
las isoformas del receptor de la leptina, pero no se podía realizar
con todas las isoformas.
Han mostrado, además, que la realización de BRET
en el receptor de la leptina es óptima en ciertas condiciones de
trabajo.
La presente invención se refiere, por lo tanto,
a un procedimiento de detección de ligandos del receptor de la
leptina mediante la transferencia de energía de resonancia entre una
primera proteína de fusión compuesta por un receptor de la leptina,
o por una parte sustancial de un receptor de la leptina, y una
proteína donante de energía, o una parte sustancial y activa de una
proteína donante de energía, y una segunda proteína de fusión,
compuesta por un receptor de la leptina, o una parte sustancial de
un receptor de la leptina, y una proteína aceptora de energía, o una
parte sustancial y activa de una proteína aceptora de energía.
Ésta se refiere además a las proteínas de fusión
para la realización de este procedimiento, así como a los ácidos
nucleicos que codifican estas proteínas.
Ésta tiene, además, como objeto un procedimiento
de tratamiento curativo o preventivo de enfermedades vinculadas con
la leptina, que consiste en administrar un ligando, seleccionado por
el procedimiento definido aquí anteriormente, a un paciente afectado
por dicha enfermedad.
Un primer objeto descrito en la patente es, por
lo tanto, una proteína de fusión caracterizada porque está compuesta
por un receptor de la leptina, o por una parte sustancial de un
receptor de la leptina, y por una proteína aceptora o donante de
energía, o por una parte sustancial y activa de una proteína
aceptora o donante de energía.
Las proteínas de fusión según la presente
invención están compuestas, en sustancia, por una parte
correspondiente a una parte o a la totalidad de la secuencia de un
receptor de la leptina, y por una parte correspondiente a una
proteína donante o aceptora de energía. Pueden comprender, no
obstante, otras secuencias de aminoácidos, procedentes de otras
proteínas, tales como secuencias señal. Así, la secuencia SEQ ID Nº
4 está constituida por una parte de la secuencia SEQ ID Nº 2 y por
otras secuencias, y en particular por la secuencia señal de la
interleuquina 3 de ratón.
De manera ventajosa, la proteína donante de
energía es la luciferasa de Renilla. No obstante, puede ser
cualquier otra proteína donante de energía de manera que el espectro
de emisión de la donante se superponga de manera suficiente al
espectro de excitación de la aceptora, para permitir una eficaz
transferencia de energía entre los dos partícipes. Así, puede ser
también la GFP, si la transferencia de energía es FRET, o también la
aequorina, si la transferencia de energía es CRET. La aequorina
puede obtenerse y utilizarse tal como se describe en la solicitud de
patente europea EP 0.187.519, o en el artículo de Inouye et
al (PNAS USA 82: 3154-3158 (1985)).
La proteína fluorescente aceptora de energía es,
por lo que se refiere a ella, preferentemente DsRed, GFP o una
mutante de esta proteína, tal como YFP, EYFP, GFP salvaje, GFPS65T o
Topaz.
No obstante, puede ser cualquier otra proteína
fluorescente aceptora de energía de manera que el espectro de
excitación de la aceptora y el espectro de emisión de la donante se
superpongan de manera suficiente para permitir una transferencia de
energía eficaz entre los dos partícipes.
Estas proteínas son conocidas por el experto en
la técnica, que puede encontrar sus secuencias en la bibliografía,
principalmente en la revisión de Blinks et al (Pharmacol.
Rev. 28 : 1-93 (1976)). En particular, la GFP está
descrita por Tsien (Annu. Rev. Biochem. 67 : 509-544
(1998)) y su clonación por Prasher et al (Gene 111 :
229-233 (1992)). La clonación de DsRed, por lo que
se refiere a ella, ha sido descrita por Matz et al (Nat.
Biotechnol. 17 : 969-973 (1999)). Para la Rluc, el
experto en la técnica puede referirse a Blinks et al
(Pharmacol. Rev. 28 : 1-93 (1976)) o también a
Lorenz et al (PNAS 88: 4438-4442 (1991)).
La isoforma del receptor de la leptina,
comprendida en totalidad o en parte en la proteína de fusión, es una
isoforma corta, o que presenta un dominio intracelular corto.
Dicha isoforma comprende ventajosamente un
dominio intracelular Box1, pero no comprende ningún dominio
intracelular Box 3.
De manera preferente, esta isoforma es la
isoforma OBRs y, todavía más preferentemente, la isoforma OBRs
humana. Esta isoforma, no obstante, puede ser originaria de
cualquier otra especie.
Ésta puede ser también cualquier otra isoforma
corta que comprende preferentemente al menos el dominio extracelular
del OBR, tal como la forma soluble del OBR que contiene el sitio de
unión con la leptina, descrita por Lee et al (Nature 379,
632-635 (1996)), Gavrilova et al (JBC 272 :
30546-30551 (1997)), Maamr. et al
(Endocrinology 142: 4389-4393 (2001)) o Clement
et al (Nature 392 : 398-401 (1998)).
Según un modo de realización particularmente
preferente, la isoforma es la isoforma OBRs humana que tiene la
secuencia SEQ ID Nº 2. Puede ser también una variante de esta
proteína, que presenta una identidad de al menos 65%,
preferentemente de al menos 75%, y aún más preferentemente de al
menos 85% ó 95% con la secuencia
SEQ ID Nº 2.
SEQ ID Nº 2.
La proteína de fusión puede comprender sólo una
parte de la isoforma OBRs humana. Ventajosamente, comprende la parte
que está comprendida entre los aminoácidos 46 y 866 de la secuencia
SEQ ID Nº 2.
La parte que corresponde al receptor de la
leptina puede presentar también la secuencia SEQ ID Nº 4 o una
variante de esta secuencia que presenta una identidad de al menos
65%, preferentemente de al menos 75% y aún más preferentemente de al
menos 85% ó 95%.
De manera particularmente ventajosa, la proteína
de fusión donante presenta la secuencia SEQ ID Nº 6 o una variante
de esta secuencia que presenta una identidad de al menos 65%.
De manera particularmente ventajosa, la proteína
de fusión aceptora presenta la secuencia SEQ ID Nº 8 o una variante
de esta secuencia que presenta una identidad de al menos 65%.
Otros objetos descritos en la patente son los
ácidos nucleicos que codifican estas proteínas. Dichos ácidos
nucleicos pueden ser ADN complementarios o genómicos, o ARN. Estos
ácidos nucleicos o polinucleótidos pueden estar en forma
monocatenaria o en forma bicatenaria.
Son, de manera particularmente ventajosa, ADN
complementarios.
De manera preferente, el ácido nucleico tiene
una identidad de al menos 65%, preferentemente de al menos 75%, y
aún más preferentemente de al menos 85% ó 95% de identidad en cuanto
a nucleótidos con un ácido nucleico de secuencia SEQ ID Nº 5 o SEQ
ID Nº 7.
Según otro aspecto, el ácido nucleico hibrida,
en condiciones de hibridación de gran astringencia, con un ácido
nucleico tal como el que se ha definido aquí anteriormente, y más
particularmente un ácido nucleico con las secuencias de nucleótidos
SEQ ID Nº 5 y SEQ ID Nº 7, o un ácido nucleico con una secuencia
complementaria.
El "porcentaje de identidad" entre dos
secuencias de nucleótidos o de aminoácidos, en el sentido de la
presente invención, puede determinarse comparando dos secuencias
alineadas de una manera óptima, a través de una ventana de
comparación.
La parte de la secuencia nucleotídica o
polipeptídica en la ventana de comparación puede comprender también
adiciones o deleciones (por ejemplo "intersticios") con
relación a la secuencia de referencia (que no comprende estas
adiciones ni estas deleciones) de manera tal que se obtenga una
alineación óptima de las dos secuencias.
El porcentaje se calcula determinando el número
de posiciones en las que se observa una base nucleica o un resto de
aminoácido idéntico para las dos secuencias (nucleica o peptídica)
comparadas, dividiendo el número de posiciones en las que existe
identidad entre las dos bases o los dos restos de aminoácidos por el
número total de posiciones en la ventana de comparación y
multiplicando el resultado por 100, con el fin de obtener el
porcentaje de identidad de secuencia.
La alineación óptima de las secuencias para la
comparación puede realizarse de manera informática mediante
algoritmos conocidos contenidos en el paquete de la empresa
WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG),
575 Science Doctor, Madison, WISCONSIN.
A modo de ilustración, el porcentaje de
identidad de secuencia podrá efectuarse mediante el programa
informático BLAST (versiones BLAST 1.4.9 de marzo de 1996, BLAST
2.0.4 de febrero de 1998, y BLAST 2.0.6 de septiembre de 1998)
utilizando exclusivamente los parámetros por defecto (S. F Altschul
et al., J. Mol. Biol. 1990 215 : 403-410, S.
F Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997 25 :
3389-3402). Blast investiga las secuencias similares
u homólogas a una secuencia "demandada" de referencia, mediante
el algoritmo de Altschul et al. La secuencia demandada y las
bases de datos utilizadas pueden ser peptídicas o nucleicas, siendo
posible cualquiera de las combina-
ciones.
ciones.
Por "condiciones de hibridación de gran
astringencia" en el sentido de la presente invención, se
entenderán las condiciones siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
1 - Competencia entre las membranas y PRE
HIBRIDACION:
- Mezclar: 40 \mul de ADN de esperma de salmón
(10 mg/ml) + 40 \mul de ADN placentario humano (10 mg/ml).
- Desnaturalizar durante 5 min a 96ºC y sumergir
la mezcla en hielo.
- Quitar el SSC 2X y verter 4 ml de una mezcla
de formamida en el tubo de hibridación que contiene las
membranas.
- Añadir la mezcla de los dos ADN
desnaturalizados.
- Incubar a 42ºC durante 5 a 6 horas, con
rotación.
\vskip1.000000\baselineskip
2 - Competencia de la sonda marcada:
- Añadir a la sonda marcada y purificada de 10 a
50 \mul de ADN Cot I, según la cantidad de repeticiones.
- Desnaturalizar durante 7 a 10 min a 95ºC.
- Incubar a 65ºC durante 2 a 5 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
3 - Hibridación:
- Quitar la mezcla de pre hibridación.
- Mezclar 40 \mul de ADN de esperma de salmón
+ 40 \mul de ADN placentario humano; desnaturalizar durante 5 min
a 96ºC y verter en hielo.
- Añadir al tubo de hibridación 4 ml de una
mezcla de formamida, la mezcla de los dos ADN y la sonda marcada/ADN
Cot I desnaturalizado.
- Incubar durante 15 a 20 horas a 42ºC, con
rotación.
\newpage
4 - Lavados:
- Un lavado a temperatura ambiente en SSC 2X,
para enjuagar.
- 2 veces durante 5 minutos a temperatura
ambiente SSC 2X y SDS al 0,1% a 65ºC.
- 2 veces durante 15 minutos a 65ºC SSC 1X y SDS
al 0,1% a 65ºC.
Envolver las membranas en Saran y
exponerlas.
Las condiciones de hibridación que se han
descrito más arriba están adaptadas a la hibridación en condiciones
de gran astringencia de una molécula de ácido nucleico con una
longitud variable desde 20 nucleótidos hasta varias centenas de
nucleótidos.
No es necesario decir que las condiciones de
hibridación descritas aquí anteriormente pueden adaptarse en función
de la longitud del ácido nucleico cuya hibridación se busca o del
tipo de marcaje elegido, según las técnicas conocidas por el experto
en la técnica.
Las condiciones convenientes de hibridación
pueden adaptarse, por ejemplo, a las enseñanzas contenidas en la
obra de HAMES y HIGGINS (1985, "Nucleic acid hybridization : a
practical approach", Hames y Higgins Ed., IRL Press, Oxford) o
también en la obra de F. AUSUBEL et al (1989), Current
Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates y Wiley
Interscience, N.Y.).
Las proteínas útiles para realizar la presente
invención pueden obtenerse mediante cualesquiera de los medios
conocidos por el experto en la técnica. No obstante, se obtienen
ventajosamente por expresión de los ácidos nucleicos como se han
descrito anteriormente, que codifican estas proteínas, introducidos
opcionalmente en vectores de expresión, dentro de células
ventajosamente elegidas, seguida opcionalmente de una extracción y
una purificación que puede ser total o parcial.
La invención también se refiere a un vector
recombinante que comprende un ácido nucleico según la invención.
Ventajosamente, dicho vector recombinante
comprenderá un ácido nucleico elegido entre los ácidos nucleicos
siguientes:
a) un ácido nucleico que codifica una proteína
que tiene al menos una identidad de 65% en cuanto a aminoácidos con
una secuencia SEQ ID Nº 6 o SEQ ID Nº 8 o un fragmento peptídico o
una variante de este último;
b) un ácido nucleico que comprende un
polinucleótido que tiene una secuencia SEQ ID Nº 5 o SEQ ID Nº 7, o
un fragmento o una variante de este último;
c) un ácido nucleico que tiene al menos una
identidad de 65% en cuanto a nucleótidos con un ácido nucleico que
tiene una secuencia SEQ ID Nº 5 o SEQ ID Nº 7 o un fragmento o una
variante de este último;
d) un ácido nucleico que se hibrida, en
condiciones de hibridación de gran astringencia, con un ácido
nucleico de secuencia SEQ ID Nº 5 o SEQ ID Nº 7, o un fragmento o
una variante de este último.
Por "vector", en el sentido de la presente
invención, se entenderá una molécula de ADN o de ARN circular o
lineal, que está indistintamente en forma de una hebra simple o de
una hebra doble.
Según un modo de realización, el vector de
expresión comprende, además de un ácido nucleico conforme a la
invención, secuencias reguladoras que permiten dirigir la
transcripción y/o la traducción de éste.
Según un modo de realización ventajoso, un
vector recombinante útil en un método según la invención comprenderá
principalmente los elementos siguientes:
(1) unos elementos de regulación de la expresión
del ácido nucleico que se ha de insertar, tales como promotores y
amplificadores;
(2) la secuencia codificadora que está
comprendida en el ácido nucleico conforme a la invención que se ha
de insertar en dicho vector, estando dicha secuencia codificadora
situada en fase con las señales de regulación descritas en (1);
y
(3) unas secuencias apropiadas de iniciación y
de parada de la transcripción.
Además, los vectores recombinantes podrán
incluir uno o varios orígenes de replicación en los anfitriones
celulares en los que se busca su amplificación o expresión, unos
marcadores o unos marcadores de selección.
\newpage
A modo de ejemplos, los promotores para las
células eucariotas comprenderán el promotor de la timidina quinasa
del virus HSV o también el promotor de la
metalotioneína-L de ratón.
De manera general, para la elección de un
promotor adaptado, el experto en la técnica podrá referirse
ventajosamente a la obra de SAMBROOK et al (1989,
"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª edición, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) o también
a las técnicas descritas por FULLER et al (1996,
Immunology in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel
et al).
Los vectores preferidos según la invención son
plásmidos, tales como por ejemplo los vectores pCDNA3 (Invitrogen),
pQE70, pQE60, pQE9 (Qiagen), psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pNH16A,
pNH18A, pNH46A. pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI, pSG (Stratagene).
Se puede tratar igualmente de vectores del tipo
de baculovirus, tales como el vector pVL1392/1393
(Pharmingen) utilizado para transfectar las células de la línea Sf9
(ATCC NºCRL 1711) obtenidas de Spodoptera frugiperda.
Se puede tratar también de vectores
adenovirales, tales como el adenovirus humano del tipo 2 ó 5.
Un vector recombinante también puede ser un
vector retroviral o también un vector adeno-asociado
(AAV). Dichos vectores adeno-asociados han sido
descritos por ejemplo por FLOTTE et al (1992, Am. J.
Respir. Cell Mol. Biol., 7 : 349-356).
La patente describe además células que
comprenden una proteína, un ácido nucleico o un vector, tales como
los que se han descrito aquí anteriormente, o fragmentos de estas
células, lisados de estas células o también membranas de estas
células.
Dichas células pueden ser células aisladas de un
organismo y cultivadas en un medio de crecimiento adecuado. No
obstante, son preferentemente líneas celulares. Así, dichas líneas
son de manera particularmente ventajosa las líneas celulares HEK
293, COS (ATCC NºCRL 1650), COS-M6 y HeLa (ATCC
NºCCL2), o también Cv 1 (ATCC NºCCL70, Sf-9 (ATCC
NºCRL 1711), CHO (ATCC NºCCL-61) ó 3T3 (ATCC
NºCRL-6361).
Las membranas de estas células pueden prepararse
por cualquier método conocido por el experto en la técnica.
Preferentemente, éstas se prepararán por
trituración mecánica de las células y por centrifugación de las
suspensiones obtenidas, tal como se ilustra en los ejemplos
siguientes.
La presente invención se refiere además a
composiciones que comprenden las células, tales como se describen
aquí anteriormente y saponina.
La presente invención es un procedimiento para
la determinación de la unión de compuestos al receptor de la
leptina, que comprende las etapas que consisten en:
- poner en contacto dicho compuesto con una
proteína de fusión donante de energía, tal como se describe aquí
anteriormente, y una proteína de fusión aceptora de energía, tal
como se describe aquí anteriormente, o células, o fragmentos, o
lisados, o membranas de células que comprenden dicha proteína, y un
substrato enzimático adecuado, y
- medir la transferencia de energía.
Preferentemente, dicho procedimiento se realiza
con células tratadas con saponina.
Las proteínas de fusión donantes de energía y
las proteínas de fusión aceptoras de energía se eligen de tal manera
que la energía que resulta de la activación de la donante puede
transferirse de una manera eficaz a la aceptora.
En un modo de realización ventajoso de dicho
procedimiento, la proteína de fusión donante de energía es una
proteína de fusión entre el receptor de la leptina, o una parte
sustancial del receptor de la leptina, y la luciferasa, o una parte
sustancial de la luciferasa, en cuyo caso el substrato es
ventajosamente la coelenterazina.
En un modo preferente de realización de dicho
procedimiento, la proteína de fusión aceptora de energía es una
proteína de fusión entre el receptor de la leptina, o una parte
sustancial del receptor de la leptina, y la YFP o una parte
sustancial de la YFP.
En un modo de realización ventajoso de dicho
procedimiento, la transferencia de energía, medida en presencia del
compuesto que se ha de ensayar, se compara con la medida en ausencia
del compuesto que se ha de ensayar.
Preferentemente, el procedimiento se realiza en
membranas de las células, tal como se describen aquí
anteriormente.
De manera preferente, las proteínas donante y
aceptora según la presente invención se eligen de una manera tal que
la transferencia de energía se haga por resonancia BRET o LRET. No
obstante, dicha transferencia de energía puede efectuarse mediante
FRET (por Fluorescent Resonance Energy Transfer o transferencia de
energía de fluorescencia por resonancia) o también por CRET (por
Chemioluminescent Resonance Energy Transfer o transferencia de
energía de quimioluminiscencia por resonancia).
Cualquiera que sea el tipo de la transferencia
de energía, los pares de proteína de fusión donante y proteína de
fusión aceptora de energía se eligen de tal manera que se permita
dicha transferencia.
La CRET consiste en una transferencia de energía
entre la aequorina, que es una luciferasa, y la GFP.
La FRET consiste en una transferencia de energía
entre dos proteínas de la familia de las GFP que tienen espectros
diferentes.
Para la realización de estas transferencias, el
experto en la técnica puede referirse a Baubet et al (PNAS
USA 97 : 7260-7265 (2000)) para la CRET, a Matyus (J
Photochem Photobiol B 12:323-337 (1992)) y a Pollok
y Heim (Trends Cell Biol 9:57-60 (1999)) para la
FRET.
Otro objeto de la presente invención es un
procedimiento de cribado o de detección de compuestos destinados a
la prevención y/o al tratamiento de patologías vinculadas con la
leptina, que comprende las etapas que consisten en:
- poner en contacto dicho compuesto con una
proteína de fusión donante de energía tal como se describe aquí
anteriormente y una proteína de fusión aceptora de energía tal como
se describe aquí anteriormente, o células en ausencia o presencia de
saponina, o fragmentos, o lisados, o membranas de células que
comprenden dichas proteínas, y opcionalmente un substrato enzimático
adecuado, y
- medir la transferencia de energía.
Dicho procedimiento puede utilizarse para el
cribado de agonistas o de antagonistas del receptor de la
leptina.
El procedimiento según la presente invención es
compatible con las placas de 96 ó 384 pocillos utilizadas
generalmente. No necesita la utilización de moléculas radiactivas,
es sensible, reproducible, rápido, y el resultado es fácil de
interpretar. En efecto, este procedimiento presenta una buena
relación entre la señal y el ruido de fondo y una débil reactividad
cruzada con otros ligandos distintos de la leptina. Esto se explica
al menos en parte por el hecho de que la detección de la activación
del OBR se efectúa directamente al nivel del receptor, lo que
permite eliminar las posibles fuentes de reactividad cruzada con
otros niveles de las vías de señalización, como se pueden observar
en el caso de valoraciones basadas en genes reporteros o en el
crecimiento de células.
Además, este procedimiento no está limitado a
una vía de transducción que tiene una señal específica, sino que,
por el contrario, es susceptible de detectar todas las moléculas que
interactúan con los OBR.
Esta característica es particularmente
interesante para la realización del cribado a gran escala, puesto
que se ha comprobado que cada vez más ligandos de receptores de
membrana activan ciertas vías pero no otras vías.
La presente invención se refiere además a la
utilización de compuestos seleccionados mediante un procedimiento
que consiste en:
- poner en contacto dicho compuesto con una
proteína de fusión donante de energía, y una proteína de fusión
aceptora de energía, tal como se describe aquí anteriormente, o
células, o fragmentos, o lisados, o membranas de células que
comprenden dicha proteína, y opcionalmente un substrato enzimático
adecuado, y
- medir la transferencia de energía, para la
fabricación de un medicamento para el tratamiento curativo o
preventivo de enfermedades vinculadas con la leptina o con su
receptor.
Finalmente, ésta tiene como objeto un
procedimiento de tratamiento curativo o preventivo de enfermedades
vinculadas con la leptina o con su receptor, que comprende las
etapas de:
- seleccionar dicho compuesto por un
procedimiento que consiste en:
+ poner en contacto dicho compuesto con una
proteína de fusión donante de energía, y una proteína de fusión
aceptora de energía, o células, o fragmentos, lisados, o membranas
de células que comprenden dicha proteína, y un substrato enzimático
adecuado, y
+ medir la transferencia de energía, y
- administrar dicho compuesto a un paciente
afectado por dicha enfermedad.
Dichas enfermedades pueden ser enfermedades
vinculadas con una disminución de la densidad ósea, tales como por
ejemplo la osteoporosis o, a la inversa, las vinculadas con una
importante calcificación.
Pueden ser también enfermedades que tengan un
efecto sobre el peso, tales como la obesidad, la diabetes o la
anorexia.
Los compuestos identificados por uno de los
métodos de la invención pueden formularse en composiciones
farmacéuticas con vistas a una administración por vía tópica, oral,
parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea,
intraocular, etc. Preferentemente, las composiciones farmacéuticas
contienen unos vehículos aceptables desde un punto de vista
farmacéutico para una formulación inyectable. Puede tratarse en
particular de disoluciones salinas (fosfato monosódico, disódico,
cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio, etc, o mezclas de
dichas sales), estériles, isotónicas, o de composiciones secas,
principalmente liofilizadas, las cuales, por adición según el caso
de agua esterilizada o de un suero fisiológico, permiten la
constitución de solutos inyectables.
Finalmente, el procedimiento según la presente
invención también permite el cribado de los sueros de pacientes
obesos, en lo que se refiere a la presencia o a la ausencia de una
leptina no funcional, o también el cribado de moléculas que
interfieren con la dimerización del OBR.
La Figura 1 representa esquemáticamente las
proteínas de fusión. Box1 representa el sitio de unión de JAK2; Box3
representa el sitio de unión de las proteínas STAT; TM representa el
dominio trans-membrana.
Las Figuras 2a y 2b ilustran la expresión de las
construcciones OBR en células COS, estimada por experimentos de
marcaje radiactivo que utilizan ^{125}I-leptina
como ligando radiactivo. En las Figuras 2a y 2b, se mide el
contenido celular total en OBR y el porcentaje de sitios de unión en
la superficie de las células, respectivamente.
La Figura 2c ilustra la localización celular de
la expresión de las construcciones OBR1-YFP y
OBRs-YFP en presencia y en ausencia de la
leptina.
La Figura 2d ilustra la activación de JAK2 por
diferentes construcciones OBR.
La Figura 2e ilustra el efecto de la
estimulación por la leptina de células que expresan conjuntamente el
gen reportero para STAT3 y diferentes construcciones OBR.
La Figura 3 ilustra la dimerización constitutiva
de OBR. Células HEK 293, que expresan las diferentes construcciones
OBR indicadas se incuban en presencia de la coelenterazina. La
transferencia de energía se mide mediante un luminómetro.
Las Figuras 4a y 4b ilustran el efecto de la
unión de la leptina sobre la BRET constitutiva de los OBR.
Figura 4a: células HeLa que expresan las
diferentes construcciones OBR indicadas, se incuban en presencia de
leptina, antes de iniciar la reacción de la luciferasa. La
transferencia de energía se mide mediante un luminómetro.
Figura 4b: El efecto de la leptina se compara en
células enteras que expresan conjuntamente OBRs-Luc
y OBR-YFP, en ausencia o presencia de saponina, en
lisados totales y en preparaciones de membrana.
Las Figuras 5a a 5e ilustran la optimización y
la caracterización del cambio de la BRET inducido por la leptina en
los OBRs. Unas membranas preparadas a partir de células HeLa o COS
que expresan conjuntamente OBRs-Luc y
OBR-YFP, se incubaron previamente con o sin leptina
antes de iniciar la reacción de la luciferasa.
Figura 5a: Optimización de los niveles relativos
y absolutos de expresión de OBRs-Luc y de
OBRs-YFP.
Figura 5b: Variación de la señal de BRET
inducida por la leptina en función del tiempo.
Figura 5c: Curvas de dosis y respuesta de
BRET/concentración de leptina en membrana y células intactas en
presencia de saponina (0,05%).
Figura 5d: Competencia de la unión de la
^{125}I-leptina por aumento de las concentraciones
crecientes de la leptina.
Figura 5e: Especificidad de los cambios de BRET
inducidos por la leptina. Las membranas se incubaron previamente con
unas concentraciones saturantes de eritropoyetina (EPO, 10 U/ml), de
trombopoyetina (TPO, 10 nM), del factor estimulante de colonias de
granulocitos macrófagos (GM-CSF, 250 ng/ml), de
interleuquina 3 (IL3, 280 ng/ml), de interleuquina 6 (IL6, 100
ng/ml), de prolactina (PRL, 200 ng/ml), del factor \alpha de
células pluripotenciales (SCF\alpha, 250 ng/ml), del factor de
crecimiento epidérmico (EGF, 100 ng/ml), de insulina (Ins, 100 nM),
de lipopolisacárido (LPS, 100 ng/ml) y del factor \alpha de
necrosis de tumores (TNF\alpha, 50 ng/ml).
Figura 6: Co-transfectados de
células COS con una cantidad constante de OBRs-Luc
(50 ng) y una cantidad creciente de OBRs-YFP:
\medcirc, 200 ng; \medbullet, 400 ng; \Delta, 800
\ding{117}, 1.600; 0, 3.200. Las mediciones de BRET se realizaron
en las células en presencia de saponina (al 0,015%), incubadas o no
con dosis crecientes de leptina, y se expresan en mBRET.
La presente invención se ilustra, sin quedar
limitada no obstante, por los ejemplos que siguen.
Las proteínas de fusión
OB-R-YFP y
OB-R-Luc se construyeron por
ligación de la YFP y de Luc en el extremo C-terminal
de los receptores mediante técnicas clásicas de biología molecular.
Las regiones codificadoras de YFP, obtenidas a partir del vector
pGFPtpz-N1 Cytogem®-Topaze (Packard, Meriden, CT) se
insertaron en el sitio EcoRV de pcDNA3/CMV (Invitrogen, Groningen,
Holanda) que contienen un sitio de polienlazador modificado. La
región codificadora de luciferasa de Renilla se obtuvo a
partir de pRL-CMV (Promega, Madison, WI) y se
insertó en el sitio EcoRV de pcDNA3 modificado. Las regiones
codificadoras de OBRl y OBRs (regalo del Dr. Gainsford, Royal
Melbourne Hospital, Victoria, Australia) se insertaron en los dos
vectores descritos aquí anteriormente, respectivamente en los sitios
de clonación EcoR1/BamH1 y Nhe1. Los codones Stop se suprimieron por
mutagénesis dirigida y se ajustó la fase de la proteína de
fusión.
Las líneas celulares HEK 293,
COS-M6 y HeLa se cultivaron en DMEM completado con
los componentes siguientes: 10% (v/v) de FBS, 4,5 g/litro de
glucosa, 100 U/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina, 1 mM
de glutamina (Life Technologies, Gaithersburg, MD).
Las transfecciones transitorias se efectuaron
utilizando el reactivo de transfección FuGene 6 (Roche, Basilea,
Suiza).
Dos días después de la transfección con las
construcciones YFP, las células se incubaron con 100 nM de leptina
durante 60 min y con 0,01 mM de bis-benzamidina
durante 15 min, antes de lavarse con PBS y fijarse durante 20 min a
temperatura ambiente en una disolución fría de 4% de
paraformaldehído en PBS. Los cortes se observan por microscopía
fluorescente utilizando filtros FITC y DAPI.
Las células se colocaron en hielo, se lavaron
dos veces en PBS a la temperatura del hielo y se desprendieron de
manera mecánica en un tampón 1 (5 mM de Tris, 2 mM de EDTA, pH 7,4,
5 mg/litro de inhibidor de la tripsina de soja, 5 mg/litro de
leupeptina y 10 mg/litro de benzamidina) a la temperatura del
hielo.
Las suspensiones celulares se homogeneizan con
un homogeneizador Polytron (Janke & Kunkel
Ultra-Turrax T25) tres veces durante 5 s. El lisado
se centrifuga a 450 X g durante 5 min a 4ºC y el sobrenadante se
centrifuga a 48.000 X g durante 30 min a 4ºC. El sedimento final se
lava dos veces en tampón 1 y se resuspende en una disolución (75 mM
de Tris (de pH 7,4), 12,5 mM de MgCl_{2}, 5 mM de EDTA con
inhibidores de proteasas, tal como se describen aquí anteriormente)
y se utiliza inmediatamente en experimentos de unión de ligandos
radiactivos o en experimentos de BRET.
Se co-transfectaron células HeLa
con plásmidos que expresan JAK2 marcada con HA2 (regalo del Dr.
Wojchowski, Universidad Estatal de Pensilvania, Pensilvania, EEUU) y
con plásmidos que contienen diferentes construcciones de OBR. Las
células se lisaron en un tampón de lisis (10 mM de Tris, 150 mM de
NaCl, 5 mM de EDTA, 5% de glicerol, 0,02% de NaN_{3}, 0,1% de
NP40, 1 mM de ortovanadato, 5 mg/litro de inhibidor de la tripsina
de soja y 10 mg/litro de benzamidina) y se centrifugaron durante 15
min a 13.000 rpm. La fracción soluble se inmunoprecipitó durante 2 h
con un anticuerpo policlonal anti-JAK2
(HR-758) (1 \mug/ml) (Santa Cruz Biotechonology,
Santa Cruz, CA).
Los inmunoprecipitados de JAK2 se
desnaturalizaron en la disolución (62,5 mM de Tris/HCl (pH 6,8), 5%
de SDS, 10% de glicerol y 0,05% de azul de bromofenol), a 100ºC
durante 10 minutos. Las proteínas se separaron mediante
SDS-PAGE en 7% de poli-acrilamida y
se transfirieron sobre nitrocelulosa. La inmunodetección se efectuó
con un anticuerpo anti-fosfotirosina 4G10 (2
\mug/ml) (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY). La
inmunorreactividad se reveló utilizando un anticuerpo secundario
apropiado acoplado con la peroxidasa de rábano y el reactivo
quimioluminiscente ECL (Amersham, Aylesbury, Reino Unido).
Unas células transfectadas se privaron de suero
en DMEM (con 1% de BSA) 24 h antes de los experimentos de unión.
Para medir la unión de la leptina a la superficie de las células,
las células se lavaron dos veces con PBS a la temperatura del hielo
y se incubaron en un tampón de unión (DMEM, 25 mM de Hepes, pH 7,4,
1% de BSA) que contiene 100.000 cpm/pocillo de
^{125}I-leptina (PerkinElmer Life Sciences, París,
Francia) en ausencia o en presencia de 200 nM de leptina no
radiactiva (leptina humana recombinante (Pepro Tech Inc, EEUU)
durante 4 h a 4ºC. Las células se lavaron dos veces con PBS a la
temperatura del hielo, se lisaron en NaOH 1 N, y la radiactividad se
determinó en un contador de radiaciones gamma. Con el fin de medir
la cantidad total de leptina que se une en el extracto, las células
se pusieron en suspensión en 1,5 ml de tampón de unión que contiene
0,15% de digitonina durante 2 h a 4ºC. Los extractos se
centrifugaron durante 30 min en una centrífuga de Eppendorf a la
velocidad máxima a 4ºC. El sobrenadante (0,2 ml) se incubó con
100.000 cpm de ^{125}I-leptina en presencia o en
ausencia de 200 nM de leptina en un volumen total de 0,25 ml con
agitación durante toda la noche a 4ºC.
Se añadieron 0,5 ml de
\gamma-globulina (1,25 mg/ml) y 0,5 ml de
polietilenglicol 6000 (25% p/v) para precipitar los complejos de
receptor y ligando que se han obtenido por centrifugación (17.000 x
g durante 3 min). El sedimento se lava con 1 ml de polietilenglicol
6000 al 12% (p/v) y se cuenta.
Unas células HeLa se
co-transfectaron con 2,6 \mug de un plásmido que
contiene el gen reportero STAT3 (regalo del Dr. Levy, Universidad de
Nueva York, Nueva York, EEUU), 200 pg de pcDNA3 que comprende la
región codificadora de la luciferasa de Renilla (utilizada
como control interno) y con 1,4 \mug de las diferentes
construcciones de OBR o con el vehículo solo. 48 horas después de la
transfección, las células se privaron durante una noche en DMEM (con
1% de BSA) antes de la estimulación con 1 nM de leptina durante
6-8 horas. Las células se lavaron y lisaron en un
tampón de lisis pasiva (Promega Corporation, Madison, WI) durante 15
minutos a temperatura ambiente. Los lisados totales se centrifugaron
durante 2 minutos a 15.000 rpm y los sobrenadantes se utilizaron en
un ensayo de valoración de la luciferasa ((Promega Corporation,
Madison, WI) utilizando un luminómetro Berthold (Lumat LB 9507). Los
resultados se expresan por la relación entre las actividades de la
luciferasa de luciérnaga (firefly) y la luciferasa de Renilla.
48 horas después de la transfección, las células
HeLa, COS y HEK 293 que expresan OBR se desprendieron y lavaron con
PBS. Se distribuyeron 1-2x10^{5} células en placas
ópticas de 96 pocillos (Packard Instrument Company, Meriden, CT) en
ausencia o en presencia de ligandos, a 25ºC. Unas membranas
preparadas a partir de células que expresan OBR se utilizaron para
las mediciones de BRET. El substrato, la coelenterazina h (Molecular
Probes, Eugene, OR) se añade a una concentración final de 5 \muM y
la lectura se realiza con un fluoro/luminómetro Fusion® (Packard
Instrument Company, Meriden, CT) que permite la integración
secuencial de las señales de luminiscencia detectadas con dos
filtros (filtro Luc: 485 \pm 10 nm; filtro YFP: 530 \pm 12,5
nm). La relación BRET se define como la diferencia entre la emisión
a 530 nm/485 nm de las proteínas de fusión Luc e YFP
co-transfectadas y la emisión a 530 nm/485 nm de la
proteína de fusión Luc sola. Los resultados se expresan en unidades
miliBRET (mBU), correspondiendo 1 unidad mBRET al valor de la
relación BRET multiplicado por 1.000. Los ligandos siguientes se
utilizaron para determinar la especificidad de la valoración:
eritropoyetina humana recombinante (EPO), insulina (Ins),
lipopolisacárido (LPS, Sigma Aldrich, St Louis, EEUU),
trombopoyetina humana recombinante (TPO), GM-CSF,
interleuquina 3 (IL3), interleuquina 6 (IL6), prolactina (PRL), SCF,
EGF y TNF\alpha.
La forma larga (OBR1) y la forma corta (OBRs) de
los OBR se fusionaron en sus extremos C-terminales
con YFP o con Luc (Fig. 1). La expresión de estas proteínas de
fusión se confirmó en células COS transfectadas en experimentos de
unión con ^{125}I-leptina (Fig. 2a). Se obtuvieron
unos resultados similares en células HeLa transfectadas.
La expresión en la superficie de las células de
las proteínas de fusión y de los receptores de tipo salvaje que se
han expresado en las células COS varían entre 5 y 10%, lo cual está
en concordancia con los valores ya descritos. Se obtuvieron unos
valores similares en células HEK 293 que expresan OBR endógenos (14
\pm 3%).
La localización de las proteínas de fusión de
OBR en las células HeLa se estudió mediante microscopía de
fluorescencia utilizando las proteínas de fusión con YFP. La
fluorescencia debida a OBR1-YFP está repartida
puntualmente en las células mientras que la debida a
OBRs-YFP está localizada en las placas. La
estimulación por la leptina localiza a la OBR1-YFP
en grandes placas intracelulares que corresponden probablemente al
compartimento endosomal. La localización de la
OBRs-YFP no cambia de una manera significativa. Los
resultados obtenidos mediante microscopía de fluorescencia confirman
la localización predominante del OBR en el compartimento
intracelular y son coherentes con la localización ya descrita de la
proteína de fusión OBR1-GFP en células COS.
La expresión funcional de las proteínas de
fusión se evalúa mediante medición de la activación de la vía de
JAK-STAT. Las quinasas JAK2 están asociadas con los
dominios intracelulares de OBRs y OBR1. La unión de ligandos induce
la transfosforilación de JAK2 y la fosforilación de OBR1 pero no la
de OBRs. El OBR1 fosforilado proporciona un sitio de enganche para
las proteínas STAT que se activan por fosforilación de la tirosina
después de la unión con el receptor. Las proteínas STAT activadas se
dimerizan y son translocadas al núcleo donde estimulan la
transcripción de genes por intermedio de elementos de respuesta a
STAT, como se ha descrito por Tartaglia (1997, J Biol Chem 272,
6093-6096).
Como muestra la Figura 2c todas las
construcciones OBRs inducen la fosforilación de JAK2, lo que indica
una activación de JAK2. La actividad del gen reportero STAT3 se
activa en un factor de 2-4 por
OBRl-wt y las proteínas de fusión OBR1, mientras que
las isoformas cortas no tienen ningún efecto sobre la actividad del
gen reportero. Estos resultados indican que las proteínas de fusión
OBR se expresan funcionalmente en las células HeLa.
La dimerización de OBR-Luc y de
OBR-YFP se ha estudiado en células vivas.
Se observaron unas transferencias de energía
significativas entre OBRs-Luc y
OBRs-YFP así como entre OBRl-Luc y
OBRl-YFP, expresadas en cantidades equimolares, lo
que indica que existen unos homo-dímeros
constitutivos para los dos receptores (Fig. 3a, b). La existencia de
los hetero-dímeros OBRs/OBR1 en células vivas se
demuestra por la detección de BRET entre OBRs-Luc y
OBR1-YFP así como entre OBRl-Luc y
OBRl-YFP. La especificidad de estas interacciones se
ilustra por la ausencia de una transferencia significativa entre
OBRs-Luc y OBRl-Luc y una proteína
de fusión entre YFP y el receptor de la insulina, que se ha descrito
recientemente (Boute et al., 2001, citados anteriormente).
Estos resultados indican que las isoformas
cortas y largas están implicadas en unos hetero y
homo-complejos en las células vivas.
Con el fin de evaluar los efectos agonistas
sobre la BRET constitutiva, las células se incubaron previamente con
la leptina antes de iniciar la reacción de la luciferasa con su
substrato. No se observa ningún cambio en la BRET constitutiva con
los homo-dímeros OBR1 y las dos combinaciones de
hetero-dímeros OBRs/OBR1, mientras que se aumenta la
BRET con los homo-dímeros OBRs (Fig. 4a).
Los cambios de BRET de los
homo-dímeros OBRs inducidos por la leptina se
midieron en diferentes preparaciones celulares.
La ruptura mecánica de las células en un tampón
hipotónico mejora de una manera significativa el aumento de BRET por
la leptina, mientras que permanece inalterada la BRET basal.
Se obtuvieron resultados similares con la
fracción de membrana después de la separación del citosol. Mientras
que todos los pares de
OBRs-Luc/OBRs-YFP contribuyen a la
BRET basal, solamente los receptores expuestos en la superficie de
la célula (5-10%) pueden ser estimulados por la
leptina que es impermeable a las membranas en células intactas. La
rotura de las membranas celulares aumenta la fracción de OBR que es
accesible a la leptina y que es responsable del aumento de la BRET
inducido por la leptina.
Se obtuvieron resultados similares en células
tratadas con la saponina. Este componente hace unos agujeros en las
membranas y permite la penetración de las proteínas, tales como la
leptina, en los compartimentos intracelulares donde se encuentra la
mayoría de los OBRs.
No se observó ningún cambio de BRET inducido por
la leptina en experimentos análogos efectuados con preparaciones
obtenidas a partir de células que expresan unos
homo-dímeros OBR1 - o unos
hetero-dímeros OBRs/OBR1.
Las cantidades y las relaciones de
OBRs-Luc y OBRs-YFP se modularon con
el fin de optimizar la BRET inducida por la leptina (Fig. 5a). Los
mejores resultados se obtienen cuando se utilizan 500 ng de ADN que
codifica OBRs-Luc y 250 ng de ADN que codifica
OBRs-YFP.
En estas condiciones optimizadas, una
concentración saturada de leptina induce un aumento en un factor de
2-2,5 de la señal BRET basal en células incubadas
con la saponina o membranas preparadas a partir de células que
expresan homo-dímeros OBRs. Este aumento es función
del tiempo. Los valores máximos se alcanzan después de 20 minutos de
incubación con 1 nM de leptina a temperatura ambiente (Fig. 5b).
Para unas concentraciones superiores de leptina, los valores máximos
se obtienen después de 5 minutos de incubación a temperatura
ambiente.
El efecto de la leptina es dependiente de la
dosis con una EC50 de aproximadamente 100 pM (Fig. 5c), lo cual está
en concordancia con los valores de Ki obtenidos con las proteínas de
fusión OBRs-Luc (116 pM) y OBRs-YFP
(35 pM) (Fig. 5d). La especificidad del ensayo se demuestra por la
ausencia de BRET inducida por el ligando por una concentración
saturante de varias citoquinas y de otros ligandos de receptores de
membrana, tales como eritropoyetina, trombopoyetina,
GM-CSF, IL3, IL6, PRL, SCF\alpha, EGF, insulina,
LPS y TNF\alpha.
El reparto de los receptores en dímeros sigue
unas leyes estadísticas, y con una relación 1/1 en número de
receptores, se espera el reparto siguiente si todos los receptores
están en forma dimérica: 1/4 Luc/Luc, 1/4 YFP/YFP y 1/2 de
receptores capaces de engendrar una señal de BRET (1/4 Luc/YFP, 1/4
YFP/Luc). No obstante. durante unas mediciones de BRET, el conjunto
de las moléculas fusionadas con Luc proporcionan una señal de
luminiscencia y por lo tanto, con una relación 1/1, se observa la
mitad de los receptores capaces de BRET, en una población donante
total. También, para aumentar la señal de BRET, se realizaron
experimentos de saturación de las moléculas de Luc por las
moléculas de YFP, de manera tal que se tenga el conjunto de las
moléculas de Luc en forma de dímeros con las moléculas de YFP
(capaces de BRET). Los resultados de la Figura 6 muestran que la
señal de BRET basal aumenta durante la saturación y que la inducción
por la leptina es proporcional a la señal basal, con una
estimulación de 2-2,5 veces la BRET basal. Con
saturación, se obtiene una mejor resolución de la BRET basal e
inducida, permitiendo un cribado más fácil para la búsqueda de
moléculas.
<110> AVENTIS PHARMA S.A.
\hskip1cmINSERM
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento de escrutinio de
agonistas y de antagonistas de la leptina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> ReceptorLeptinaBRET
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2691
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2691)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 896
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2751
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2757)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Proteína de fusión que comprende una parte de OBRs
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 916
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artifical
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Proteína de fusión que comprende una parte de OBRs
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3705
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuancia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artifical:
fusión OBRluc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(3705)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1234
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artifical: fusión OBRluc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3486
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: fusión OBRyfp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(3486)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1161
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artifical: fusión OBRyfp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (17)
1. Procedimiento para la determinación de la
unión de compuestos al receptor de la leptina que comprende las
etapas que consisten en:
a) poner en contacto dichos compuestos con una
proteína de fusión compuesta por un receptor de la leptina que
presenta un dominio intracelular corto o por una forma soluble de
dicho receptor que contiene el sitio de unión con la leptina y una
proteína donante de energía y una proteína de fusión compuesta por
un receptor de la leptina que presenta un dominio intracelular corto
o por una forma soluble de dicho receptor que contiene el sitio de
unión con la leptina y una proteína aceptora de energía o poner en
contacto dichos compuestos con células o fragmentos, o lisados, o
membranas de células que comprenden dichas proteínas de fusión y,
opcionalmente, un sustrato enzimático adecuado, y
b) medir la transferencia de energía.
2. Procedimiento según la reivindicación 1
caracterizado porque la transferencia de energía medida en
presencia del compuesto que se ha de ensayar se compara con la
medida en ausencia del compuesto que se ha de ensayar.
3. Procedimiento de cribado o de detección de
compuestos destinados a la prevención y/o al tratamiento de
patologías que comprende las etapas que consisten en:
a) poner en contacto dichos compuestos con una
proteína de fusión compuesta por un receptor de la leptina que
presenta un dominio intracelular corto o por una forma soluble de
dicho receptor que contiene el sitio de unión con la leptina y una
proteína donante de energía y una proteína de fusión compuesta por
un receptor de la leptina que presenta un dominio intracelular corto
o por una forma soluble de dicho receptor que contiene el sitio de
unión con la leptina y una proteína aceptora de energía, o células,
o fragmentos, o lisados, o membranas de células que comprenden
dichas proteínas y, opcionalmente, un sustrato enzimático adecuado,
y
b) medir la transferencia de energía.
4. Procedimiento de cribado de agonistas o
antagonistas del receptor de la leptina que comprende las etapas que
consisten en:
a) poner en contacto los agonistas o
antagonistas potenciales con una proteína de fusión compuesta por un
receptor de la leptina que presenta un dominio intracelular corto o
por una forma soluble de dicho receptor que contiene el sitio de
unión con la leptina y una proteína donante de energía y una
proteína de fusión compuesta por un receptor de la leptina que
presenta un dominio intracelular corto o por una forma soluble de
dicho receptor que contiene el sitio de unión con la leptina y una
proteína aceptora de energía o poner en contacto dichos compuestos
con células, o fragmentos, o lisados, o membranas de células que
comprenden dichas proteínas de fusión y, opcionalmente, un sustrato
enzimático adecuado, y
b) medir la transferencia de energía.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 caracterizado porque el receptor de la
leptina es una isoforma corta.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 caracterizado porque el receptor de la
leptina es una isoforma que comprende un dominio intracelular Box1,
pero no comprende un dominio intracelular Box 3.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 caracterizado porque el receptor de la
leptina es la isoforma OBRs.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 caracterizado porque el receptor de la
leptina es la isoforma OBRs humana con la secuencia SEQ ID Nº2, o
una variante de este receptor que presenta una identidad de al menos
65% con la secuencia SEQ ID Nº2.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 caracterizado porque la secuencia del
receptor de la leptina es la secuencia de aminoácidos 46 a 866 de la
isoforma OBRs humana con la secuencia SEQ ID Nº2, o una variante de
esta secuencia que presenta una identidad de al menos 65%.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 caracterizado porque el receptor de la
leptina presenta la secuencia SEQ ID Nº4, o una variante de esta
secuencia que presenta una identidad de al menos 65%.
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10 caracterizado porque la proteína de
fusión donante de energía es una proteína de fusión entre el
receptor de la leptina y la luciferasa.
\newpage
12. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 caracterizado porque la proteína de
fusión aceptora de energía es una proteína de fusión entre el
receptor de la leptina y la GFP o un mutante de esta proteína o la
DsRed.
13. Procedimiento según la reivindicación 12
caracterizado porque el mutante de GFP es YFP, EYFP, GFPS65T
o Topaz.
14. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10 caracterizado porque la proteína de
fusión donante de energía presenta la secuencia SEQ ID Nº6 o una
variante de esta secuencia que presenta una identidad de al menos
65%.
15. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10 caracterizado porque la proteína de
fusión aceptora de energía presenta la secuencia SEQ ID Nº8 o una
variante de esta secuencia que presenta una identidad de al menos
65%.
16. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15 caracterizado porque se realiza en
células tratadas con saponina.
17. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16 caracterizado porque el sustrato es
la coelenterazina.
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