ES2318151T3 - Procedimiento de seleccion de agentes bio-activos por deteccion de una variacion inducida de la concentracion intracelular de ampc de una celula viviente sensible. - Google Patents
Procedimiento de seleccion de agentes bio-activos por deteccion de una variacion inducida de la concentracion intracelular de ampc de una celula viviente sensible. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento de selección de agentes, denominados agentes a probar, susceptibles de ser biológicamente activos frente a un sistema celular viviente induciendo o inhibiendo una síntesis intracelular de AMPc cuando están en presencia de al menos una célula sensible de un sistema celular viviente, en el que: - se prepara un sistema celular con excepción de un embrión humano, un cuerpo humano, un elemento no aislado del cuerpo humano o una célula de origen embrionario humano, que comprende al menos una célula viviente sensible que expresa al menos una proteína recombinada multimérica específica de la vía de transducción AMPc/PKA, * estando la citada proteína recombinada, en ausencia de síntesis inducida de AMPc, en un primer estado, denominado estado complejo, en el que forma un complejo, denominado complejo RC, que comprende al menos una sub-unidad reguladora recombinada de una PKA, denominada unidad R y que incluye al menos un sitio de enlace de la AMPc, y al menos una sub-unidad catalítica de una PKA, denominada unidad C, * estando la citada proteína recombinada, en presencia de síntesis inducida de AMPc, en un segundo estado, denominado estado disociado, en el que las unidades R y C están disociadas, y en el que al menos una unidad R fija la AMPc, - se pone el citado sistema celular en presencia de una cantidad de al menos un agente a probar, - se detecta el estado, complejo o disociado, de la citada proteína recombinada, caracterizado porque: - al menos una de las unidades R o C, denominada unidad de translocación, presenta una secuencia proteica que comprende una secuencia de direccionamiento membranar que presenta un motivo de modificación post-traduccional CAAX funcional; estando la posición de la citada secuencia de direccionamiento membranar en la citada secuencia proteica adaptada para conservar la idoneidad de la proteína recombinada para formar en la membrana un complejo RC en ausencia de síntesis inducida de AMPc, y para disociarse en presencia de síntesis inducida de AMPc; - al menos otra unidad R o C, denominada unidad marcada, distinta de la unidad de translocación, presenta un grupo, denominado grupo de detección, adaptado para: * conservar la idoneidad de la proteína recombinada para formar un complejo RC en ausencia de síntesis inducida de AMPc, y para disociarse en presencia de síntesis inducida de AMPc, y * permitir la detección del estado de la proteína con la ayuda de una señal de detección que, en la membrana, es diferente según la ausencia o la presencia de síntesis inducida de AMPc.
Description
Procedimiento de selección de agentes
bio-activos por detección de una variación inducida
de la concentración intracelular de AMPc de una célula viviente
sensible.
La invención se refiere a un procedimiento de
selección de agentes biológicamente activos cuya actividad se
traduce por medio de una modulación de la vía de transducción de la
señal AMPc/PKA. La invención se extiende a un sistema celular
viviente (especialmente con excepción de un embrión humano, de un
cuerpo humano y de un elemento no aislado de un cuerpo humano),
adaptado a la realización de tal procedimiento.
En la industria farmacéutica, el desarrollo de
un nuevo medicamento pasa por una etapa clave: la búsqueda de
agentes biológicamente activos. Estos agentes son buscados por su
capacidad de interactuar y de activar objetivos celulares
implicados en numerosas funciones fisiológicas del organismo.
Existen actualmente numerosos bancos de agentes
potencialmente bio-activos (moléculas generadas por
la química combinatoria o paralela, sustancias de origen natural,
...), privados o públicos, que comprenden un número muy grande de
agentes cuya actividad biológica, frente a las células sensibles,
debe poder ser comprobada.
A nivel celular, cuando un objetivo de tipo
receptor membranar está activado, se induce una cadena de reacciones
intracelulares, denominada transducción de la señal. La información
recibida por el receptor es entonces transferida desde la membrana
plásmica hacia el citoplasma siguiendo una vía de transducción de la
señal particular cuya naturaleza puede variar según la del
receptor, la de la célula y/o la del estímulo aplicado a la
célula.
Entre las diferentes vías de transducción de la
señal, la vía de transducción de la AMPc/PKA es una de las cascadas
de señalización intracelular más importante.
Típicamente, la transducción de la señal
AMPc/PKA se inicia cuando un ligando se asocia a un receptor
acoplado a las proteínas G (RCPG) y favorece su isomerización hacia
una conformación activa. En este estado activo, el receptor puede
interactuar y estimular una proteína G. Dos de estas proteínas,
denominadas Gs y Gi ("s" por estimuladora e "i" por
inhibidora), modulan el nivel de síntesis de la AMPc (AMP cíclica o
3',5'-adenosina monofosfato), estimulando o
inhibiendo la actividad de una enzima membranar, la adenilil
ciclasa. La concentración intracelular de AMPc es asimismo
dependiente de su índice de degradación regulado por enzimas
denominadas fosfodiesterasas. El aumento de la concentración
intracelular de la AMPc conduce a la activación de diferentes
objetivos, denominados efectores, que son, ya sea específicos de la
AMPc, tales como la proteína quinasa A (PKA), y el intercambiador
proteico activado directamente por la AMPc (Epac) o selectivo en el
caso del canal iónico cuya actividad depende de nucleótidos
cíclicos ("CNG cannel"). Al activar estos objetivos, la AMPc
modifica ciertas propiedades de respuestas celulares muy diversas
como el potencial de membrana y la proliferación o la
diferenciación celulares. La vía AMPc/PKA es una vía de transducción
intracelular importante, implicada en más del 30% de los objetivos
de los agentes bio-activos.
Al ser la detección o la dosificación de la
actividad de la vía de transducción AMPc/PKA, necesaria para el
cribado de agentes bio-activos, se han propuesto
varios métodos que descansan sobre las propiedades estructurales y
funcionales de la PKA, objetivo específico de la AMPc.
La PKA es una holoenzima tetramérica,
constituida por una sub-unidad reguladora dimérica y
por dos sub-unidades catalíticas monoméricas. En
condiciones de concentración intracelular básica de AMPc, la función
de la sub-unidad reguladora es la de enlazar la
sub-unidad catalítica con el fin de inactivarla. Por
el contrario, cuando la concentración intracelular de la AMPc
aumenta, la sub-unidad reguladora juega el papel de
receptor intracelular de la AMPc. El enlace de esta última sobre la
sub-unidad reguladora conlleva el cambio de
conformación de esta última, permitiendo la disociación de las
sub-unidades catalíticas.
Un método propuesto para detectar el cambio de
estado de la PKA, aprovecha el principio de "transferencia de
energía de fluorescencia por resonancia" o FRET. Este principio
se basa en un proceso físico, dependiente de la distancia, mediante
el que se transmite la energía de manera no radiativa desde un
cromoforo excitado, el donante, hasta otro cromoforo, el receptor,
por interacción dipolo-dipolo.
Un primer método propuesto que utiliza la FRET
(Adams S.R. et al., 1991, Nature, 349,
694-697) consiste en
micro-inyectar, en las células,
sub-unidades catalíticas de la PKA marcadas con
fluoresceína y sub-unidades reguladoras marcadas
con rodamina. La activación de la PKA conduce a la disociación de
las diferentes sub-unidades, eliminando así la
transferencia de energía, y por lo tanto el fenómeno de FRET.
La micro-inyección de
sub-unidades en las células, etapa altamente
invasiva para estas últimas, delicada, larga y costosa de realizar,
es un inconveniente importante de esta técnica.
Un segundo método, inspirado en el anterior
(Zaccolo M. et al., 2000, Nature Cell Biology, 2,
25-29), ha sido también propuesto para paliar los
problemas de purificación y de micro-inyección de
sub-unidades de la PKA. Este método consiste en
producir células transfectadas que expresan dos proteínas de fusión:
una sub-unidad reguladora acoplada a una proteína
fluorescente, y una sub-unidad catalítica acoplada a
una proteína fluorescente foto-complementaria de la
anterior.
Utilizando siempre la propiedad de FRET, los
documentos WO 00/49183 y WO 00/75332 proponen no hacer que se
exprese más que una proteína recombinada, la
sub-unidad reguladora de la PKA. Ésta se ha marcado
por medio de dos proteínas fluorescentes complementarias, presentes
a una y otra parte del dominio de fijación de la AMPc. La fijación
de la AMPc sobre la sub-unidad reguladora, modifica
la conformación de ésta y por tanto la distancia que separa las dos
proteínas fluorescentes complementarias, induciendo así una
variación de FRET.
Los ensayos anteriores que utilizan el fenómeno
FRET, basados en la propiedad funcional y estructural de la PKA, no
son realmente utilizables en la práctica, salvo en la puesta en
práctica de medios de análisis de imágenes pesadas y costosas, y
que proporcionan resultados de una fiabilidad imperfecta (o bien
asociados a una interpretación subjetiva). En efecto, la
modificación de intensidad de fluorescencia refleja modulaciones de
distancia entre grupos fluorescentes complementarios que pueden ser
débiles, y por ello muy difíciles de detectar y sobre todo
imposibles de analizar. Esto es incluso más cierto para los ensayos
propuestos por los documentos WO 00/49183 y WO 00/75332.
Otro método propuesto para detectar la actividad
de la PKA plantea aprovechar el fenómeno de redistribución
(redisposición espacial) de diversos componentes proteicos en el
seno de la célula en función del estímulo aplicado sobre ésta. De
ese modo resulta posible, siguiendo la distribución en el seno de la
célula de una proteína dada, conocer el estado de activación de
ésta. Así, el documento WO 98/45704 propone un método de cribado de
agentes bio-activos susceptibles de provocar la
activación de una proteína bien definida fabricando un sistema
celular en el que la citada proteína está fusionada con una proteína
fluorescente de tipo GFP. Los agentes bio-activos
capaces de inducir la actividad de estas proteínas, engendran por
contacto con tales células transfectadas una
re-distribución de la fluorescencia,
re-distribución observable con microscopio de
fluorescencia.
El documento WO 98/45704 propone igualmente
aplicar este método a la PKA. Para ello, se han propuesto células
que expresan una sub-unidad catalítica fluorescente
de la PKA. Con una concentración baja de AMPc intracelular, la
fluorescencia en el citoplasma de estas células estaría más o menos
organizada en agregados, mientras que con una concentración fuerte
de AMPc, estaría más dispersada en el seno del citoplasma.
La AMPc es producida por la adenilil ciclasa a
nivel de la membrana plásmica, y difundida después en el citoplasma
en el que se encuentra, ya sea con la PKA, su objetivo, o ya sea con
una fosfodiesterasa que la vuelve inactiva por degradación. Existe
por tanto un gradiente negativo de concentración de AMPc a partir de
su sitio de síntesis membranar. Sin embargo, el documento WO
98/45704 detecta las variaciones de fluorescencia de la PKA presente
en el citoplasma, y por tanto necesariamente una distancia
importante desde la fuente de síntesis de la AMPc. Se deduce que
este método de detección se revela poco sensible en la práctica, en
particular para el cribado de ligandos extracelulares. Este tipo de
ensayo se encuentra así muy limitado en cuanto a sus
aplicaciones.
La presente invención se ha propuesto
proporcionar un procedimiento de selección de agentes
bio-activos (en particular, aunque no
exclusivamente, agentes farmacológicamente activos para el hombre o
los animales), cuya actividad se manifieste frente a una célula
sensible mediante una variación intracelular de la AMPc. La
invención pretende también proponer un procedimiento de selección
adaptado a las necesidades de un cribado sensible y de alto
rendimiento, es decir, capaz de proporcionar rápidamente resultados
sensibles, objetivos, fiables, de análisis fácil y rápido.
La invención se extiende a un sistema celular
adaptado a la puesta en práctica de un procedimiento de selección
de ese tipo, así como a un procedimiento de obtención de tal sistema
celular.
La invención se extiende igualmente a las
diferentes "herramientas" genéticas, especialmente secuencias
de ADN y vectores nucleicos, que permitan la realización de tal
sistema celular.
La invención se refiere así a un procedimiento
de selección de agentes denominados agentes a ensayar, susceptibles
de ser biológicamente activos frente a un sistema celular viviente,
induciendo o inhibiendo una síntesis intracelular de AMPc cuando
están en presencia de al menos una célula sensible de un sistema
celular viviente. En un procedimiento conforme a la reivindicación
1:
- -
- se prepara un sistema celular que comprende al menos una célula viviente sensible que expresa al menos una proteína recombinada multimérica específica de la vía de transducción AMPc/PKA,
- \circ
- estando la citada proteína recombinada, en ausencia de una síntesis inducida de la AMPc, en un primer estado, denominado estado complejo, en el que forma un complejo, denominado complejo RC, que comprende al menos una unidad R que incluye al menos un sito de enlace de la AMPc, y una unidad C, distinta de la unidad R,
- \circ
- estando la citada proteína recombinada, en presencia de una síntesis inducida de AMPc, en un segundo estado, denominado estado disociado, en el que las unidades R y C están disociadas, y en el que al menos una unidad R está fijada a la AMPc,
- -
- se pone el citado sistema celular en presencia de una cantidad de al menos un agente a ensayar,
- -
- se detecta el estado, complejo o disociado de la citada proteína recombinada,
caracterizado porque:
- -
- al menos una de las unidades, denominada unidad de translocación, presenta una secuencia proteica que comprende una secuencia de direccionamiento membranar que presenta un motivo de modificación post-traduccional CAAX funcional, es decir, adaptado para inducir una translocación membranar de al menos una parte de la citada unidad de translocación, estando la posición de la citada secuencia de direccionamiento membranar en la citada secuencia proteica adaptada para conservar la aptitud de la proteína recombinada a formar en la membrana un complejo RC en ausencia de síntesis inducida de AMPc, y a disociarse en presencia de síntesis inducida de AMPc,
- -
- al menos otra unidad, denominada unidad marcada, distinta de la unidad de translocación, presenta un grupo, denominado grupo de detección, adaptado para:
- \circ
- conservar la aptitud de la proteína recombinada para formar un complejo RC en ausencia de síntesis inducida de AMPc, y a disociarse en presencia de síntesis inducida de AMPc, y
- \circ
- permitir la detección del estado de la proteína recombinada con la ayuda de una señal de detección que, en la membrana, es sensiblemente diferente según la ausencia o la presencia de síntesis inducida de AMPc.
La presente invención propone así forzar el
reclutamiento de la PKA en la membrana plásmica con el fin de:
- -
- aproximarse a la PKA desde la fuente de síntesis membranar de la AMPc y por consiguiente aumentar la sensibilidad de la detección de la AMPc,
- -
- localizar la PKA en un compartimento intracelular (la membrana plásmica) favorable para una observación fiable, simple, rápida.
La invención se refiere también a un sistema
celular viviente (especialmente con la excepción de un embrión
humano, un cuerpo humano o un elemento no aislado del cuerpo
humano), conforme a la reivindicación 15, que contiene al menos una
célula viviente que expresa al menos una proteína recombinada
multimérica específica de la vía de transducción AMPc/PKA, tal como
se ha mencionado en lo que antecede.
De acuerdo con la invención, para forzar la
localización de la citada proteína recombinada multimérica
específica de la vía de transducción AMPc/PKA en la membrana
plásmica, el marco de lectura del gen codificador, ya sea para una
unidad R o ya sea para una unidad C, ha sido fusionado con una
secuencia de direccionamiento membranar que contiene un motivo CAAX
(donde C designa un residuo cisteína, A un residuo de ácido aminado
alifático, y X un residuo de ácido aminado que no posea carga).
El término dedicado "secuencia de
direccionamiento membranar" designa convencionalmente una
secuencia proteica que comprende el citado motivo de modificación
post-traduccional CAAX y una secuencia de una
quincena de ácidos aminados.
Inicialmente, estas secuencias de
direccionamiento membranar han sido puestas de manifiesto por las
proteínas de la familia Ras. Las proteínas Ras son pequeñas
proteínas G monoméricas localizadas en la membrana plásmica. Éstas
juegan un papel clave en los sistemas de transducción de señal
intracelular, implicados en la regulación de la proliferación y de
la diferenciación celular.
En la célula, el motivo CAAX de una secuencia de
direccionamiento membranar es reconocido por una enzima, de la
familia de las isopreniltransferasas, que conduce a la farnesilación
o a la geranilgeranilación del residuo cisteína, y después a la
separación proteolítica de los residuos AAX terminales. El conjunto
de estas modificaciones es necesario para el anclaje de las
proteínas Ras en la membrana plásmica. También, se dice que un
motivo de modificación post-traduccional CAAX de una
secuencia proteica, es funcional cuando puede conducir al anclaje
en la membrana de al menos una parte de la citada secuencia proteica
cuando ésta está expresada en una célula.
A título de ejemplos no limitativos de
secuencias de direccionamiento membranar que contienen un motivo de
modificación post-traduccional CAAX, que pueden ser
utilizadas en el marco de la presente invención, se pueden citar,
en primer lugar, los tres géneros ras descubiertos por el
hombre (Lowy D.R. y Willumsen B.M., 1993, Ann. Rev. Bioch., 62.
851-891): H-Ras (Harvey),
K-Ras (Kirsten) y N-Ras
(neuroblastoma). La expresión del gen K-Ras
puede conducir por empalme alternativo de los exones 4A y 4B, a la
producción de dos proteínas denominadas K-Ras 4A y
K-Ras 4B. Todas las proteínas Ras poseen en su parte
carbonil-terminal, una secuencia de
direccionamiento a la membrana plásmica de una veintena de ácidos
aminados que incluyen un encadenamiento de cuatro ácidos aminados
C-A-A-X.
Ventajosamente, una secuencia de
direccionamiento membranar conforme a la invención puede
corresponder a los extremos carbonil-terminales de
la proteína H-Ras, tal como la secuencia
KLNPPDESGPGCMSCKCVLS (SEQ ID núm. 1); de la proteína
K-Ras 4A, tal como la secuencia KISKEEKTPGCVKIKKCIIM
(SEQ ID núm. 2); de la proteína K-Ras 4B, tal como
la secuencia MSKDGKKKKKKSKTKCVIM (SEQ ID núm. 3); de la proteína
N-Ras, tal como la secuencia KLNSSDDGTQGCMGLPCVVM
(SEQ ID núm. 4).
Se pueden utilizar otras secuencias de
direccionamiento membranar en el marco de la presente invención, por
ejemplo, secuencias que comprenden las secuencias anteriormente
citadas o secuencias que provienen del extremo
carbonil-terminal de proteínas Ras, distintas de las
proteínas Ras humanas, en especial de rata, de conejo, de pollo, de
xenopi, de cerdo, de drosófila, de nematodo, de neurospora, de
levadura, de champiñón, de pescado rojo (Lowy D.R. y Willumsen
B.M., 1993, Ann. Rev. Bioch., 62, 851-991).
Ventajosamente y según la invención, el grupo de
detección de la unidad marcada es un grupo luminóforo elegido
entre:
- -
- una proteína fluorescente natural o una proteína fluorescente mutada, por adición, eliminación o sustitución de uno o varios ácidos aminados de una proteína natural, conservando esta proteína fluorescente mutada la propiedad de fluorescencia,
- -
- un fragmento fluorescente procedente de una proteína fluorescente natural o de una proteína fluorescente mutada, adaptado para presentar la propiedad de fluorescencia de la proteína fluorescente de la que procede;
- -
- una proteína bioluminiscente natural, en particular de tipo luciferasa, o una proteína bioluminiscente mutada, por adición, eliminación o sustitución de uno o varios ácidos aminados de una proteína natural, conservando esta proteína bioluminiscente mutada la propiedad de bioluminiscencia,
- -
- la fluoresceína, la rodamina, el Bodipy®, la cianina, el Nile Red®, el Texas Red®, los quelatos de tierras raras, las indo- y carbo-cianinas, el difenilhexatrieno, los derivados aromáticos luminiscentes.
Ventajosamente y según la invención, el grupo
proteico luminóforo es la Cycle3-GFP, un mutante
termoestable de la proteína fluorescente verde (GFP) de la medusa
Aequorea victoria. Se trata de una proteína de 238 ácidos
aminados que puede ser expresada en células eucariotas conservando
todas sus propiedades de fluorescencia. La excitación de la
Cicle3-GFP se produce entre 350 nm y 490 nm con un
máximo de absorción a 389 nm, y su emisión de fluorescencia se
produce con un máximo a 508 nm. Una proteína recombinada multimérica
según la invención, en ausencia de síntesis inducida de AMPc, se
encuentra así en un estado complejo, localizado en la membrana
plásmica de forma constitutiva a través de una unidad de
translocación según la invención. La disociación de este complejo,
provocada durante una síntesis inducida de AMPc, puede ser seguida
sobre células vivientes gracias a la propiedad de fluorescencia de
la Cycle3-GFP de la unidad marcada. En términos de
fluorescencia, el aumento del índice intracelular de AMPc se
traduce mediante un desplazamiento de la fluorescencia de la
membrana plásmica hacia el citoplasma. De forma recíproca, este
procedimiento permite igualmente la observación de una disminución
del índice intracelular de AMPc que se traduce también mediante un
desplazamiento de la fluorescencia del citoplasma hacia la
membrana
plásmica.
plásmica.
La distinción entre el marcado por luminiscencia
de una membrana y el del citoplasma, es suficientemente pronunciada
como para permitir una detección objetiva y fiable del estado de la
proteína mediante una simple observación en microscopio de
fluorescencia.
Ventajosamente, y de acuerdo con la invención,
la unidad de translocación es la unidad R, y la unidad marcada es la
unidad C.
Según una variante preferida de la invención, la
detección del estado de la proteína recombinada multimérica
específica de la vía de transducción AMPc/PKA, se realiza por
detección de una emisión o de una extinción luminosa del
acoplamiento de luminiscencia entre dos grupos luminiscentes
complementarios, aprovechando el principio de la FRET. Según otra
variante, la citada detección puede hacerse igualmente aprovechando
el principio de la BRET (transferencia de bioluminiscencia por
resonancia).
Para hacer esto, se introduce en las células
sensibles a al menos un agente, dicho agente membranar de
acoplamiento, apto para asociarse a la membrana plásmica, y marcado
con al menos un grupo luminiscente, denominado segundo luminóforo,
distinto del grupo luminiscente portado por la unidad marcada,
denominado primer luminóforo. De acuerdo con esta variante de la
invención, estos dos luminóforos son
foto-complementarios de modo que la unidad marcada
y el agente membranar de acoplamiento crean entre ellos un fenómeno
de acoplamiento de luminis-
cencia.
cencia.
Para la puesta en práctica de esta variante de
realización, los inventores han determinado, por una parte, que es
posible incorporar en la membrana celular agentes membranares de
acoplamiento, marcados por medio de grupos luminiscentes, que
pueden beneficiarse de la dinámica lateral de la membrana celular
(siendo en sí mismos sometidos a esta dinámica) para repartirse de
forma homogénea en el seno de la misma, y en una cantidad que sea
simultáneamente bastante débil como para no afectar a las
propiedades funcionales de la membrana celular y de la célula
viviente, pero que sea bastante importante como para asegurar la
realización del acoplamiento de luminiscencia cuando la unidad
marcada es reclutada en cualquier lugar de la membrana celular. Los
inventores han constatado que, gracias a que la invención saca
provecho de la versatilidad de los componentes membranares
descritos en el modelo de membranas conocido como "mosaico
fluido" (Singer S.J. y Nicolson G.L., 1972, Science, 175,
720-731), estadísticamente, se encuentra siempre un
agente membranar de acoplamiento en las proximidades de la unidad
de translocación, y de ese modo también en las proximidades de la
unidad marcada cuando ésta es reclutada en la membrana, y a una
distancia de ésta que en la práctica corresponde a la obtención del
acoplamiento de luminiscencia tal como la FRET o la
BRET.
BRET.
Se sabe, en efecto, que una emisión de
luminiscencia específica por acoplamiento de luminiscencia se
produce o se modifica cuando:
- (a) dos grupos
foto-complementarios están próximos en el espacio
(en particular, de 1 a 10 nm), a una distancia inferior o igual a
un valor de umbral predeterminado (2 Ro, donde Ro es el radio de
Forster en el caso de la FRET),
- (b) el espectro de emisión de uno de los
grupos foto-complementarios, denominado donante, y
el espectro de absorción del otro grupo
foto-complementario, denominado receptor, se
superponen al menos en parte (Lakey et al., 1991, J. Mol.
Biol., 1218, 639-653).
Igualmente, los inventores han puesto de
manifiesto que existen pares de luminóforos compatibles con los
agentes membranares (fosfolípidos). En particular, se han
encontrado lípidos que pueden portar un compuesto fluorescente
compatible con las membranas celulares naturales (que pueden hacer
las veces de agentes membranares de acoplamiento) y que realizan un
acoplamiento de fluorescencia por FRET con una GFP y en particular
con la GFP
natural.
natural.
Ventajosamente y según la invención, el primer y
el segundo luminóforos se eligen de modo que realicen un
acoplamiento de luminiscencia mediante transferencia de energía por
resonancia, en particular por FRET.
Ventajosamente, y de acuerdo con la invención,
uno al menos de entre el primer y el segundo luminóforos se elige
entre:
- -
- una molécula susceptible de absorber la luz emitida por una proteína fluorescente,
- -
- una proteína fluorescente natural o una proteína fluorescente mutada, por adición, eliminación o sustitución de uno o varios ácidos aminados de una proteína fluorescente natural, conservando esta proteína fluorescente mutada la propiedad de fluorescencia,
- -
- un fragmento fluorescente emitido desde una proteína fluorescente natural o desde una proteína fluorescente mutada, adaptado para presentar la propiedad de fluorescencia de la proteína fluorescente de la que procede,
- -
- una proteína bioluminiscente natural (en particular, de tipo luciferasa), o una proteína bioluminiscente mutada, por adición, eliminación o sustitución de uno o varios ácidos aminados de una proteína natural, conservando esta proteína bioluminiscente mutada la propiedad de bioluminiscencia,
- -
- la fluoresceína, la rodamina, el Bodipy®, la cianina, el Nile Red®, el Texas Red®, los quelatos de tierras raras, las indo- y carbo-cianinas, el difenilhexatrieno, los derivados aromáticos luminiscentes.
Ventajosamente y de acuerdo con la invención,
uno al menos de entre el primer y el segundo luminóforos es una
proteína auto-fluorescente natural de gorgona, en
particular la proteína fluorescente verde GFP de la medusa
Aequorea victoria.
Ventajosamente y según la invención, se utiliza
un agente membranar de acoplamiento que comprende un ligando
lipófilo que puede estar marcado por el segundo luminóforo. A título
de ligandos lipófilos se pueden citar los fosfolípidos, los ácidos
grasos, los glicéridos, el colesterol, las ceramidas, las aminas
grasas, los agentes luminóforos lipófilos o los agentes derivados
de estos compuestos. Un agente luminóforo lipófilo puede
constituir, por sí solo, un agente membranar de acoplamiento.
Ventajosamente y de acuerdo con la invención, la
citada proteína recombinada multimérica específica de la vía de
transducción AMPc/PKA es una proteína de tipo PKA recombinada;
correspondiendo las unidades R y C respectivamente a las
sub-unidades reguladora y catalítica de la PKA,
recombinadas.
Se apreciará que las secuencias de las
sub-unidades reguladoras y catalíticas pueden ser
secuencias tanto homólogas como ortólogas de la PKA, es decir,
secuencias que provengan o no de una misma especie.
Ventajosamente y de acuerdo con la invención, la
unidad de translocación es una unidad reguladora recombinada
procedente de la fusión por vía genética:
- -
- de al menos una parte de la secuencia proteica de una sub-unidad reguladora elegida entre las isoformas: RI\alpha, RI\beta, RII\alpha, RII\beta,
- -
- y una secuencia de direccionamiento membranar.
Más en particular, la tabla 1 proporciona
algunos ejemplos, no limitativos, de isoformas de
sub-unidades reguladoras presentes en la especie
humana, pero también igualmente en otras numerosas especies, que
pueden ser utilizadas para la obtención de una unidad de
translocación según la invención.
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Ventajosamente, una unidad de translocación
conforme a la invención puede tener por secuencia proteica la SEQ
ID núm. 5, y estar codificada por una secuencia nucleica tal como
SEQ ID núm. 6.
Estas diferentes isoformas de la PKA forman una
familia estructural y funcionalmente homogénea de proteínas.
Aunque codificadas por genes distintos, las
sub-unidades reguladoras de la PKA son homólogas
para una especie dada. Las sub-unidades RI\alpha
y RI\beta como RII\alpha y RII\beta, presentan entre sí
fuertes similitudes de secuencia en ácidos aminados,
respectivamente con un 81% y un 68% de identidad. Desde un punto de
vista filogenético, las sub-unidades generadoras
ortólogas están muy conservadas y en consecuencia presentan,
respecto a los eucariotas superiores, fuertes similitudes de
secuencias en ácidos aminados del 87% al 98% de identidad (Tasken
K.K. et al., 1997, Advances in Second Messenger and
Phosphoprotein Research, 31, 191-204).
Las sub-unidades reguladoras
RI\alpha y RII\alpha están expresadas de forma ubicua en las
células animales. La proporción relativa de cada una puede variar,
sin embargo, de un tipo de célula a otro. La expresión de las
sub-unidades reguladoras RI\beta y RII\beta, en
sí misma, es mucho más específica del tipo tisular. Por ejemplo,
RII\beta está expresada en el tejido neuronal, en las células de
la granulosa y de los testículos, y en las células renales.
Las sub-unidades reguladoras de
la PKA (ya sean de humano, de rata, de conejo o de bovino),
comprenden un motivo de 17 residuos de ácido aminado:
GSFGELAL[IM]Y[GN]TPRAAT (equivalente a
las secuencias SEQ ID núm. 7, SEQ ID núm. 8, SEQ ID núm. 9, SEQ ID
núm. 10), significando los corchetes que se trata de uno u otro
ácido aminado.
Se aprecia por otra parte que las isoformas de
la PKA forman una familia funcionalmente homogénea y redundante. La
prueba de esta redundancia se basa en la puesta en evidencia, en la
mayor parte de los estudios, de la aptitud de las isoformas de la
PKA para compensarse funcionalmente unas con otras durante la
pérdida de una de ellas. Por ejemplo, estudios recientes han
demostrado que cuando un gen codificador para una de las
sub-unidades reguladoras era invalidado, el índice
de otras sub-unidades reguladoras aumentaba de forma
que se compensaba esta pérdida (Amieux P.S. et al., 1997,
The Journal Biological Chemistry, 272, 3993-3998).
Este aumento puede ser observado en el sistema nervioso de conejos
cuyo gen codificador para RI\beta ha sido invalidado, pero
también en el sistema nervioso y el tejido adiposo del ratón cuyo
RII\beta ha sido invalidado (Brandon E.P. et al., 1997,
Current Opinion in Neurobiology, 7, 397-403).
Al ser funcionalmente homogéneos los diferentes
informes homólogos (intra-especie), y ortólogos
(inter-especie) de la PKA, se pueden utilizar por
tanto indistintamente, para poner en práctica la invención.
La región amino-terminal
(residuos 1 a 40) de las sub-unidades reguladoras,
es rica en residuos hidrófobos y en ácidos aminados cargados. La
función principal de esta región consiste en asegurar la interacción
entre los dos fotómeros de la sub-unidad reguladora
dimérica. El dominio de dimerización está limitado a un pequeño
segmento de al menos 40 ácidos aminados. Las
sub-unidades reguladoras poseen, en su porción
amino-terminal, el dominio de enlace a la
sub-unidad catalítica que se califica normalmente de
"hinge region" (región bisagra). Esta región está constituida
por una secuencia de ácidos aminados similar a la de los substratos
de la sub-unidad catalítica. Además del dominio de
dimerización y del dominio de interacción con la
sub-unidad catalítica, las
sub-unidades reguladoras poseen en su parte
carboxil-terminal, dos dominios de enlace de la AMPc
en tándem. Estos dos dominios se distinguen por la cinética de
enlace de la AMPc. Se diferencia así el sitio A, o sitio de enlace
rápido, y el sitio B, o sitio de enlace lento.
Ventajosamente y de acuerdo con la invención, la
unidad marcada es una secuencia proteica que comprende al menos una
parte de la secuencia de una sub-unidad catalítica
elegida entre las isoformas C\alpha, C\beta y C\gamma,
marcada mediante un grupo de detección.
Más en particular, la tabla 2 proporciona
ejemplos de isoformas de sub-unidades catalíticas
presentes en la especie humana, pero también igualmente en otras
especies, que pueden ser utilizadas con vistas a obtener una unidad
marcada según la invención.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
La forma C\alpha está expresada de manera
constitutiva en la mayor parte de las células, mientras que C\beta
y C\gamma no están expresadas más que en algunos tipos de
tejidos. Trabajos recientes han revelado la existencia de variantes
de empalme para las formas C\alpha humana (C\alpha2), C\beta
bovina (C\beta2) y C\beta murina (D\beta2, C\beta3). Todas
las sub-unidades catalíticas poseen un núcleo
catalítico común a todas las proteínas quinasas. La mayor parte de
los sitios funcionales necesarios para la catálisis están situados
en este núcleo. Se encuentra en la parte
amino-terminal un sitio de enlace a la ATP y en la
parte carboxil-terminal un sitio de enlace
peptídico. Todas las sub-unidades catalíticas, con
excepción de las variantes de empalme, poseen en su extremidad
amino-terminal un sitio de miristoilación. Este
sitio de modificación post-traduccional parece
estar implicado en la estabilidad de la estructura secundaria de la
sub-unidad catalítica.
Ventajosamente, un sistema celular conforme a la
invención se obtiene por transfección de una célula sensible por
medio de secuencias de ADN codificantes para la unidad de
translocación y la unidad marcada según la invención. Sin embargo,
como variante, nada impide obtener un sistema de ese tipo
micro-inyectando las citadas unidades directamente
en al menos una célula sensible.
La invención se extiende así a un procedimiento
de obtención de una célula sensible transfectada que expresa al
menos una proteína recombinada multimérica específica de la vía de
transfección AMPc/PKA,
- -
- estando la citada proteína recombinada, en ausencia de síntesis inducida de AMPc, en un primer estado, denominado estado complejo, en el que forma un complejo, denominado complejo RC, que comprende al menos una unidad R que incluye al menos un sitio de enlace de la AMPc, y al menos una unidad C, distinta de la unidad R,
- -
- estando la citada proteína recombinada, en presencia de síntesis inducida de AMPc, en un segundo estado, denominado estado disociado, en el que las unidades R y C están disociadas y en el que R fija la AMPc,
caracterizado porque comprende las etapas
consistentes en:
- -
- transfectar una célula sensible con un vector denominado primer vector, que contiene un casete de expresión que comprende una secuencia nucleica codificante para una de las unidades, denominada unidad de translocación, cuya secuencia proteica comprende un motivo de direccionamiento membranar que presenta un motivo de modificación post-traduccional CAAX funcional; estando la posición de la citada secuencia de direccionamiento membranar en la citada secuencia proteica adaptada para preservar la aptitud de la proteína recombinada a formar en la membrana un complejo RC en ausencia de síntesis inducida de AMPc, y a disociarse en presencia de síntesis inducida de AMPc,
- -
- transfectar la citada célula con un vector, denominado segundo vector, que contiene un casete de expresión codificante para otra unidad, denominada unidad marcada, distinta de una unidad de translocación, y cuya secuencia proteica presenta un grupo, denominado grupo de detección, adaptado para:
- \circ
- preservar la aptitud de la proteína recombinada a formar un complejo RC en ausencia de síntesis inducida de AMPc, y a disociarse en presencia de síntesis inducida de AMPc, y
- \circ
- permitir la detección del estado de la proteína recombinada con la ayuda de una señal de detección que, en la membrana, es sensiblemente diferente según la ausencia o la presencia de síntesis inducida de AMPc.
Los métodos que permiten la expresión de un
transgén en una célula anfitrión son en la actualidad muy variados
y bien conocidos en sí mismos (Sambrook, J., Pritsh E.F. y Maniatis
T., Molecular Cloning - Cold Spring Harbor Laboratory Press -
1989).
De manera esquemática, según la invención, cada
secuencia nucleica, codificante para la unidad R o la unidad C, se
inserta en una construcción nucleica denominada casete de expresión,
en la que la citada secuencia nucleica está ligada de forma
operativa a elementos que permiten su expresión, en particular su
regulación. Entre estos elementos, se pueden citar en primer lugar
los promotores, los activadores y los terminadores de transcripción.
En la actualidad se conocen numerosas secuencias de expresión, en
particular de regulación. Su elección es apreciada especialmente
según el nivel de expresión deseado del transgén, y la naturaleza de
la célula a transfectar.
El casete de expresión se inserta en un vector
nucleótico, tal como un plásmido, que puede comprender además un
gen marcador que permita seccionar una célula transfectada de una
célula que no contiene el ADN extraño transfectado.
Los vectores así construidos son utilizables
para la transfección, o sobre todo la
co-transfección de células anfitriones, según
cualquier técnica en sí misma conocida.
Se pueden citar principalmente los métodos de
transferencia directa de gen por micro-inyección,
infiltración bajo vacío, electroporación, choque térmico, bombardeo
mediante cañón de partículas recubiertas con el ADN plasmídico de
interés.
Se pueden citar también procedimientos de
transferencia indirecta, en los que el primer y el segundo vectores
son transferidos, preferentemente por separado, en parásitos
celulares tales como bacterias y virus susceptibles de infectar las
células anfitrión, permitiendo la integración del ADN extraño en el
genoma de estas últimas.
La invención se extiende igualmente como
producto nuevo a una proteína recombinada de secuencia proteica SEQ
ID núm. 5; siendo la citada proteína recombinada susceptible de ser
expresada a nivel de la membrana plásmica de una célula, fijar la
AMPc, ligarse a una sub-unidad catalítica de la PKA
cuando no fija la AMPc, y disociarse de la citada
sub-unidad catalítica cuando fija la AMPc.
Ventajosamente y según la invención, una
proteína recombinada de ese tipo comprende la secuencia proteica
SEQ ID núm. 5 o la secuencia proteica SEQ ID núm. 5 separada de
estos residuos V-L-S
carboxil-terminales. Una proteína de ese tipo puede
ser codificada, de manera no limitativa teniendo en cuenta la
degenerescencia del código genético, por una secuencia nucleica que
comprende la secuencia SEQ ID núm. 6.
La invención se extiende, por último, a una
secuencia nucleica SEQ ED núm. 6, codificante para una proteína
recombinada según la invención.
La invención se refiere también a un
procedimiento de selección de agentes bio-activos, a
un sistema celular, a un procedimiento de obtención de una célula
sensible que expresa una proteína recombinada multimérica específica
de la vía de transducción AMPc/PKA, a una proteína recombinada y a
una secuencia nucleica codificante para esta última,
caracterizaron, en combinación, por todas o parte de las
características citadas en lo que antecede o las que se mencionan
en lo que sigue.
Otros objetos, características y ventajas de la
invención se pondrán de manifiesto con la lectura de los ejemplos
que siguen, que se refieren a las Figuras anexas, en las que:
La Figura 1 representa el mapa de restricción
del vector de expresión pet11d/RII\alpha que contiene una
secuencia codificante para la isoforma RII\alpha de conejo;
La Figura 2 representa el mapa de restricción
del vector de expresión pet11d/RII\alpha-CAAX que
contiene una secuencia codificante para la proteína de fusión
RII\alpha-CAAX;
La Figura 3 representa el mapa de restricción
del vector de expresión pcDNA3.1;
La Figura 4 representa el mapa de restricción
del vector de expresión pcDNA3.1/RII\alpha que permite la
expresión de la isoforma RII\alpha;
La Figura 5 representa el mapa de restricción
del vector de expresión pcDNA3.1/RII\alpha-CAAX
que permite la expresión de la proteína de fusión
RII\alpha-CAAX;
La Figura 6 representa el mapa de restricción
del vector de expresión pCMV-PKA que contiene una
secuencia codificante para una sub-unidad catalítica
de la PKA (isoforma C\alpha);
La Figura 7 representa el mapa de restricción
del vector de expresión pcDNA3.1/NTGFP-K;
La Figura 8 representa el mapa de restricción
del vector de expresión pcDNA3.1/GFP-C\alpha que
permite la expresión de la proteína de fusión
GFP-C\alpha;
Las Figuras 9a a 9c, 11a a 11d y 12a a 12 d, son
vistas fotográficas en microscopio de fluorescencia de células HEK
293 transfectadas;
Las Figuras 10a, 10b, 11e, 13a y 13b son vistas
fotográficas de membrana de nitrocelulosa resultante de la
detección proteica por Western Blotting;
Las Figuras 13a' y 13b' son representaciones
gráficas de la intensidad de las detecciones proteicas obtenidas
por Western Blotting;
Las Figuras 14a a 14d, 15a a 15d son vistas
fotográficas en microscopio de fluorescencia de las células
COS-7 transfectadas;
La Figura 16 es una representación gráfica del
espectro de emisión de fluorescencia de las células
COS-7 transfectadas;
La Figura 17a es una representación gráfica de
la variación de fluorescencia de la GFP-C\alpha y
de la sonda DiI, y
La Figura 17b es una representación gráfica de
la variación de FRET entre la GFP-C\alpha y la
sonda DiI, tras la inducción de la translocación de la
proteína.
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Ejemplo
1
- Construcción de los vectores de expresión
pcDNA3.1/RII\alpha (Figura 4) y
pcDNA3.1/RII\alpha-CAAX (Figura 5):
El fragmento de restricción
SmaI-EcoRI codificante para los dos últimos ácidos
aminados de la proteína RII\alpha y la secuencia de
direccionamiento a la membrana plásmica, han sido construidos por
hibridación de dos oligonucleótidos sentido y
anti-sentido (sintetizados y comercializados por la
sociedad MWG BIOTECH France). Este fragmento de restricción ha sido
clonado a continuación en el vector pet11d/RII\alpha (Yuhan Wang
et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88,
2446-2450) abierto mediante digestión por medio de
las enzimas de restricción SmaI y EcoRI para proporcionar el vector
de expresión pet11d/RII\alpha-CAAX.
Los fragmentos de restricción
NcoI-EcoRI que contienen las secuencias codificantes
para las proteínas RII\alpha y RII\alpha-CAAX,
se obtienen respectivamente a partir de los vectores de expresión
pet11d/RII\alpha (Figura 1) y
pet11d/RII\alpha-CAAX (Figura 2) mediante
digestión por parte de la enzima de restricción NoI y mediante
tratamiento por parte de la enzima de modificación (fragmento de
Klenow de la polimerasa I), seguido de una digestión por medio de
la enzima de restricción EcoRI. Estos fragmentos son
sub-clonados a continuación en el vector pcDNA3.1
(Figura 3) (comercializado bajo la referencia
V790-20 por la sociedad INVITROGEN LIFE
TECHNOLOGIES, Francia), previamente digerido por la enzima de
restricción BamHI y tratado por la enzima de modificación
(fragmento de Klenow de la polimerasa I), seguido de una digestión
por la enzima de restricción EcoRI para proporcionar los vectores
de expresión pcDNA3.1/RII\alpha (Figura 4) y
pcDNA3.1/RII\alpha-CAAX (Figura 5).
- Construcción del vector de expresión
pcDNA3.1/GFP-C\alpha (Figura 8):
El fragmento de restricción
XhoI-HindIII correspondiente al marco de lectura de
la sub-unidad catalítica de la PKA, se obtiene
mediante digestión por parte de las enzimas de restricción XhoI y
HindIII, y mediante tratamiento por medio de la enzima de
modificación (fragmento Klenow de la polimerasa I), a partir del
vector de expresión pCMV-PKA (Figura 6)
(comercializado bajo la referencia K6005-1 por la
sociedad CLONTECH LABORATORIES Inc., Francia). Este fragmento es
sub-clonado a continuación en el vector de
expresión pcDNA3.1/NTGFP-K (Figura 7) abierto por
digestión por la enzima de restricción EcoRV para proporcionar el
vector de expresión pcDNA3.1/GFP-C\alpha (Figura
8). El vector pcDNA3.1/NTGFP-K corresponde al
vector pcDNA3.1/NT-GFP (comercializado por la
sociedad INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES, Francia, bajo la referencia
K4810-01), en el que ha sido sustituido el sitio
múltiple de clonación.
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Ejemplo
2
- Cultivo celular y transfección:
La línea celular HEK 293 ("Human Embryonic
Kidney" 293) ha sido establecida a partir de células primarias
embrionarias de riñón humano transformadas por el adenovirus de tipo
5. Se trata de células adherentes de tipo fibroblástico. Las HEK
293 se mantienen en cultivo en un medio completo: el DMEM NUT MIX
F12 (comercializado bajo la referencia 31 331-028
por la sociedad INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES, Francia) complementado
con un 10% de suero fetal (SVF), con L-glutamina (2
mM), con penicilina (100 UI/ml) y con estreptomicina (100
\mug/ml).
Las células HEK 293 cultivadas a un 80% de
confluencia, son transferidas con las diferentes construcciones
descritas en lo que antecede utilizando Polyfect (QIAGEN, Francia,
Ref. 301107). El ADN plasmídico se diluye en el medio DMEM NUT MIX
F12 no complementado. Después de haber añadido la Polyfect, esta
mezcla de ADN/medio/Polyfect se incuba durante 10 minutos a la
temperatura ambiente. La proporción de los diferentes agentes en
función de la superficie de los recipientes de cultivo se presenta
en la Tabla 3. Durante este tiempo de incubación, el medio de
cultivo de las células sembradas la víspera, se reemplaza por el
medio completo. Después de los 10 minutos de incubación, el medio
completo se añade a la mezcla ADN/medio/Polyfect. Esta mezcla de
transfección se añade después a las células y se homogeneiza. Las
células son incubadas durante 24 horas
\hbox{a 37ºC en
presencia de un 5% de CO _{2} .}
- Verificación de la expresión de las proteínas
RII\alpha, RII\alpha-CAAX y
GFP-C\alpha:
Se verifica la expresión de las proteínas
RII\alpha, RII\alpha-CAAX y
GFP-C\alpha en el sistema celular HEK 293 por
medio de técnicas de epifluorescencia y de Western Blotting.
- Epifluorescencia:
Las células HEK 293 cultivadas sobre láminas en
recipientes de 10 cm^{2} son transfectadas por medio de
pcDNA3.1/
RII\alpha, de pcDNA3.1/RII\alpha-CAAX o de pcDNA3.1/GFP-C\alpha.
RII\alpha, de pcDNA3.1/RII\alpha-CAAX o de pcDNA3.1/GFP-C\alpha.
Después de 24 horas, las células transfectadas
con el pcDNA3.1/RII\alpha o con el
pcDNA3.1/RII\alpha-CAAX son fijadas 20 minutos a
4ºC mediante paraformaldehído 4%, y después permeabilizadas mediante
metanol durante 10 minutos a -20ºC y mediante tritón X100 0,5%
(comercializado por la sociedad EUROMEDEX, Francia) durante 5
minutos a temperatura ambiente. Las células son incubadas a
continuación durante 1 hora a temperatura ambiente con el
anticuerpo policlonal anti-RII\alpha de conejo
(comercializado por la sociedad TEBU, FRANCIA bajo la referencia
PKA2\alphareg(M-20):SC909) a una relación
de dilución de 1/1000 en PBS ("Tampón Fosfato salino"),
comercializado por la sociedad EUROMEDEX, Francia) complementado con
un 1% de SVF, y después incubadas durante 45 minutos a temperatura
ambiente con un anticuerpo acoplado a una molécula de fluorocromo y
dirigido contra Inmunoglobulinas G (IgG) de conejo a una relación
de dilución de 1/200 en PBS complementado con un 1% de SVF.
Después de 24 horas, las células transfectadas
por el pcDNA3.1/GFP-C\alpha son fijadas por el
formaldehido 4%.
Las células son observadas a continuación por
medio de un microscopio de fluorescencia recta Axioplan equipado
con un objetivo de inmersión Gx40 y con una cámara CCD. La longitud
de onda de excitación es de 400 nm, y la fluorescencia observada a
510 nm.
Las células transfectadas por el
pcDNA3.1/RII\alpha-CAAX presentan un marcado
membranar (Figura 9a), mientras que el marcado observado sobre las
células transfectadas con el pcDANA3.1/RII\alpha, desprovisto de
la secuencia de direccionamiento en la membrana plásmica, permanece
exclusivamente citoplásmico (Figura 9b). Las células transfectadas
por el pcDNA3.1/GFP-C\alpha muestran una
fluorescencia citoplásmica y nuclear (Figura 9c).
- Western Blotting (WB)
Células HEK 293 cultivadas en recipientes de
cultivo de 60 cm^{2} son transfectadas por el
pcDNA3.1/RII\alpha, el pcDNA3.1/RII\alpha-CAAX,
o el pcDNA3.1/GFP-C\alpha. 24 horas después, las
células son lavadas dos veces con 10 ml de PBS, después recuperadas
a 4ºC en un tampón de lisis complementado con inhibidores de
proteasas y de fosfatasas, conocido como LB+, que contiene 50 mM de
Tris HCl pH 7,4 (INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES), 150 mM de NaCl, 20
mM de EDTA, 0,5% tritón X100, 0,28 mM de CHFO_{2}S, 1 mM
NaVO_{4}, 10 \mug/ml de leupeptina, 10 \mug/ml de aprotinina
(EUROMEDEX, Francia). Después de una centrifugación (5 minutos a
17800 vueltas), se estimó la concentración en proteínas de la parte
sobrenadante por medio del método de Bradford (según el protocolo
propuesto por la sociedad BIO-RAD LABORATORIES,
Francia) con referencia una curva patrón de BSA ("Bovine Serum
Albumin"), descrita por la sociedad ROCHE DIGANOSTICS CORP,
Francia. Los extractos proteicos totales (100 \mug), recuperados
en LSB 1X (Laemmi Sample Buffer, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2ª edición, volumen 3, 1989), son desnaturalizados durante
5 minutos a 95ºC. Las muestras son depositadas sobre gel
SDS-PAGE ("Dodecilsulfato Sódico, electroforesis
en gel de poliacrilamida") a un 8% de acrilamida. Las proteínas
son transfectadas a continuación sobre una membrana de
nitrocelulosa, saturada por incubación a 4ºC, durante toda la
noche, en una solución de TBST (Tris Buffer Saline complementada con
un 0,25% de Tween, comercializado por la sociedad EUROMEDEX,
Francia), que contenía un 5% de leche (Regilait®, Francia). Las
membranas son lavadas a continuación 3 veces durante 5 minutos en
TBST, y después incubadas durante 2 horas a temperatura ambiente
con el anticuerpo primario (anticuerpo
anti-RII\alpha, dilución 1/500 o anticuerpo
policlonal anti-GFP, dilución 1/400). Después de 3
lavados de 5 minutos en TBST, las membranas son incubadas durante
45 minutos con anticuerpo secundario (anticuerpo
anti-IgG de conejo acoplado a la peroxidasa de
rábano silvestre, dilución 1/5000). La hidrólisis de substratos por
medio de la peroxidasa, va acompañada de la formación de compuestos
luminiscentes detectables sobre películas fotográficas según el
protocolo ECL^{TM} de la sociedad AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH,
Francia.
Se observa una banda de 51 kDa reconocida por el
anticuerpo anti-RII\alpha en los extractos
proteicos obtenidos a partir de las células transfectadas por el
pcDNA3.1/RII\alpha o por el
pcDNA3.1/RII\alpha-CAAX (Figura 10a). Esta banda,
que puede corresponder a la RII\alpha o la
RII\alpha-CAAX, no se detecta en los extractos
proteicos de células no transfectadas (NT). Además, en el caso de
RII\alpha-CAAX, se detecta un retardo de
movilidad electroforética que puede ser testigo de la presencia de
direccionamiento en la membrana plásmica (Figura 10a). El
anticuerpo anti-RII\alpha reconoce igualmente una
proteína con un peso molecular aparente de 49 kDa en los extractos
proteicos de células transfectadas o no. Esto puede explicarse por
la presencia en los extractos de la sub-unidad
reguladora RII\alpha endógena (Figura 10a).
Se observa una banda de 60 kDa que es reconocida
por el anticuerpo dirigido contra la GFP en los extractos proteicos
de células transfectadas con el vector
pcDNA3.1/GFP-C\alpha. Esta banda, que corresponde
a GFP-C\alpha, está ausente en los extractos
proteicos obtenidos a partir de células no transfectadas (Figura
10b).
- Co-localización
RII\alpha-CAAX y
GFP-C\alpha:
Se han realizado experimentos de
co-localización con el fin de aportar argumentos
sobre la formación de un complejo proteico entre las
sub-unidades reguladora y catalítica de la PKA en la
membrana plásmica.
Las células son co-transfectadas
con el pcDNA3.1/RII\alpha y el
pcDNA3.1/GFP-C\alpha, o con el
pcDNA3.1/RII\alpha-CAAX y el
pcDNA3.1/GFP-C\alpha, y observadas por medio de un
microscopio de fluorescencia recta.
Los resultados se presentan en la tabla 4.
Las proteínas RII\alpha,
RII\alpha-CAAX, detectadas con el anticuerpo
dirigido contra RII\alpha, se co-localizan bien
con la GFP-C\alpha (Figuras 11a, 11b. 11c y 11d).
La localización forzada en la membrana plásmica de la proteína
RII\alpha-CAAX entraña así la
re-localización de la GFP-C\alpha
a nivel de la membrana plásmica, sin que esta
re-localización sea observada en el caso en que las
células sean co-transfectadas con la RII\alpha
desprovista de la secuencia de direccionamiento en la membrana
plásmica.
- Interacción
RII\alpha-CAAX/GFP-C\alpha:
Con el fin de confirmar la interacción entre las
proteínas RII\alpha-CAAX y
GFP-C\alpha, se realizan experimentos de
inmunoprecipitación (IP). Para ello, se preparan extractos proteicos
totales a partir de células HEK 293 transfectadas con
pcDNA3.1/RII\alpha, pcDNA3.1/RII\alpha-CAAX o
pcDNA3.1/GFP-C\alpha, o a partir de células HEK
293 co-transfectadas con pcDNA3.1/RII\alpha y
pcDNA3.1/GFP-C\alpha, o con
pcDNA3.1/RII\alpha-CAAX y
pcDNA3.1/GFP-C\alpha. A continuación se incuba 1
mg de extracto proteico en 1 ml de LB+ en presencia de 20 \mul de
bolas A/G-Agarosa acopladas de forma covalente al
anticuerpo monoclonal de conejo dirigido contra la proteína GFP
(ROCHE DIAGNOSTICS Corp., Francia, ref. 1814460) durante 3 horas a
4ºC bajo agitación. Después de tres lavados mediante 1 ml de LB+,
las muestras son recuperadas en 50 \mul de LSB 1X y depositadas
sobre gel SDS-PAGE al 8% de acrilamida y sometidas
a Western Blotting (WB) anti-RII\alpha.
Tras inmunoprecipitación con el anticuerpo
dirigido contra la GFP, el anticuerpo
anti-RII\alpha reconoce una banda de 51 kDa en
los extractos proteicos obtenidos a partir de células que expresan
las proteínas RII\alpha y GFP-C\alpha, o a
partir de células que expresan las proteínas
RII\alpha-CAAX y GFP-C\alpha
(Figura 11e). Esta banda de 51 kDa, que puede corresponder a
RII\alpha o a RII\alpha-CAAX, está ausente en
los extractos proteicos de células no transfectadas o de células
que expresan únicamente una de las proteínas (RII\alpha,
RII\alpha-CAAX o
GFP-C\alpha).
Las proteínas RII\alpha y
RII\alpha-CAAX son por tanto capaces de
interactuar con la proteína GFP-C\alpha. Sin
embargo, este experimento no nos permite determinar si esta
interacción es directa o indirecta. Conociendo la estructura de la
PKA, es legítimo pensar que esta interacción es directa. La adición
de la secuencia de direccionamiento a la membrana plásmica en la
sub-unidad reguladora RII\alpha y la fusión de la
GFP en la sub-unidad catalítica C\alpha no parece
por tanto, en ningún caso, perturbar la formación de un complejo
proteico entre la sub-unidad reguladora y la
sub-unidad catalítica.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
- Observación de la activación de la vía
AMPc/PKA sobre estas células HEK 293 fijas que expresan las
proteínas RII\alpha-CAAX y
GFP-C\alpha:
Los resultados anteriores muestran que las
proteínas RII\alpha-CAAX y
GFP-C\alpha son susceptibles de asociarse para
formar una PKA localizada en la membrana plásmica. Con el fin de
determinar si esta PKA es funcional, se realizan experimentos de
inducción de la vía AMPc/PKA tratando las células mediante la
forscolina y la toxina del cólera. La forscolina actúa directamente
sobre la adenilil ciclasa y conlleva su activación. La toxina del
cólera cataliza la ADP-ribosilación de la proteína
Gs y conduce a su activación constitutiva. En los dos casos, el
tratamiento conduce al aumento del índice de síntesis de la AMPc y
por consiguiente al aumento del índice intracelular de la AMPc. La
AMPc se enlaza en las sub-unidades reguladoras, y
entraña de forma concomitante la disociación de las proteínas
GFP-C\alpha y su liberación en el citoplasma,
eventos que pueden ir seguidos, respectivamente, de detección en
Western Blotting de la sub-unidad
RII\alpha-CAAX tras inmunoprecipitación con el
anticuerpo anti-GFP, y de observación con el
microscopio de fluorescencia.
Las células HEK 293 son
co-transfectadas con los plásmidos
pcDNA3.1/RII\alpha-CAAX y
pcDNA3.1/GFP-C\alpha. Después de 24 horas de
incubación, el medio de transfección es aspirado y reemplazado por
DMEM NUT MIX F12 no complementado que contiene forscolina a una
concentración final de 10 \muM, o toxina del cólera a razón de 1
\mug/ml. Las células son incubadas a continuación a 37ºC en
presencia de un 5% de CO_{2} durante tiempos variables. Después
de 2 lavados en PBS, las células son, o bien fijadas mediante
paraformaldehído 4% y después observadas por medio de un
microscopio de fluorescencia, o bien lisadas para obtener extractos
proteicos con el fin de realizar una inmunoprecipitación con el
anticuerpo anti-GFP seguido de un Western Blotting
con el anticuerpo dirigido contra la proteína RII\alpha. A
continuación se calcula la relación
RII\alpha-CAAX/GFP-C\alpha con
respecto a la cantidad de proteínas RII\alpha-CAAX
detectadas con el anticuerpo anti-RII\alpha tras
inmunoprecipitación con el anticuerpo monoclonal
anti-GFP en la cantidad de proteínas
GFP-C\alpha inmunoprecipitadas en el extracto
proteico total (detectado con un anticuerpo policlonal
anti-GFP).
Las células que expresan
RII\alpha-CAAX y GFP-C\alpha
tratadas en la forscolina (Figura 12a) durante 15 minutos, o en la
toxina del cólera (Figura 12c) durante 1 hora, presentan un marcado
citoplásmico, mientras que las células no tratadas presentan un
marcado membranar (Figuras 12b y 12d). Por otra parte, la relación
RII\alpha-CAAX/GFP-C\alpha pone
de manifiesto una reducción en un factor de 3,5 de la cantidad de
proteínas RII\alpha-CAAX que
co-inmunoprecipitan con las proteínas
GFP-C\alpha para las células tratadas en la
forscolina durante 15 minutos (Figura 13a y 13a') con relación a
las células no tratadas (NT). De la misma manera, se observa una
reducción en un factor de 2,5 de la cantidad de proteínas
RII\alpha-CAAX que
co-inmunoprecipitan con las proteínas
GFP-C\alpha para las células tratadas con la
toxina del cólera durante 1 hora (Figuras 13b y 13b') con relación
a las células no tratadas. Esta disminución de la relación
RII\alpha-CAAX/GFP-C\alpha
refleja la disociación de las sub-unidades
RII\alpha-CAAX y GFP-C\alpha en
respuesta a un aumento del índice intracelular de AMPc. El aumento
del índice intracelular de AMPc inducido por los tratamientos en la
forscolina o en la toxina del cólera, entraña la activación de la
PKA localizada de manera constitutiva en la membrana, y por
consiguiente la disociación y la liberación en el citoplasma de las
subunidades catalíticas fusionadas en la GFP.
- Observación de la activación de la vía de la
AMPc/PKA en las células COS-7 en cultivo que
expresan las proteínas RII\alpha-CAAX y
GFP-C\alpha:
- Transfección:
Para este experimento, se siembra una
Lab-Tek I de 2 compartimentos (Nalge Nunc
International, Naperville, USA, ref.: 155380) con 200.000 células
COS-7 (ECACC núm. 87021302), cultivadas en la 6ª
pasada. El medio de cultivo (1,5 ml/compartimento) es DMEM
(Invitrogel Life Technologies, Cergy-Pontoise,
Francia, ref.: 41966-029) complementado con un 10%
(v/v) de suero fetal (SVF), penicilina a una concentración de 100
UI/ml y estreptomicina a una concentración de 100 \mug/ml. 24
horas después, las células son co-transfectadas con
los vectores de expresión pcDNA3.1/RII\alpha-CAAX
y pcDNA3.1/GFP-C\alpha utilizando la
pipofectAMINE® 2000 (Invitrogen Life Technologies, ref.:
11668-019). Se diluyen 1,6 \mug de
pcDNA3.1/RII\alpha-CAAX más 1,6 \mug de
pcDNA3.1/GFP-C\alpha en 200 \mul de DMEM no
complementado. Por otra parte, se diluyen 8 \mul de lipofectAMINE®
2000 en 200 \mul de DMEM no complementado y se incuba esta mezcla
durante 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación se
transfiere la solución de lipofectAMINE® 2000 a la mezcla de
ADN/medio, después se incuba esta mezcla durante 15 minutos a
temperatura ambiente. Durante este tiempo de incubación, las células
son lavadas dos veces con 1 ml de DMEM no complementado. Se
completa a continuación la mezcla de transfección con 1,6 ml de
DMEM no complementado. Después de ser homogeneizada, se añade la
mezcla de transfección completa, con el DMEM no completado (1
ml/compartimento), sobre las células, y se incuban las células
durante 4 horas a 37ºC en presencia de un 5% de CO_{2}. Se
elimina la mezcla de transfección por aspiración y se reemplaza por
1,5 ml de DMEM complementado con un 10% de SVF, penicilina y
estreptomicina. Las células son incubadas durante 20 horas a 37ºC
en presencia de un 5% de CO_{2}.
- Control por imaginería de la translocación de
la GFP-C\alpha de la membrana plásmica hacia el
citoplasma durante un tratamiento con la forscolina:
La observación de las células se realiza con el
Video Micro Espectro Fluorímetro: VSMF; se trata de un microscopio
inverso (Leica DMIRB, Leica Microsystems,
Rueil-Malmaison, Francia) acoplado a un sistema de
adquisición de imagen (Photometrics CoolSnapHQ^{TM} pilotado por
MetaViewTM Imaging System, Roper Scientific^{TM} Princeton
Instruments, Evry, Francia) y a un espectrofluorímetro
(Monochromateur: SpectraPro 150, detector:
Spec-10:250 B pilotado por WinSpec32, Roper
Scientific^{TM} Princeton Instruments). Este útil responde a las
exigencias de trabajo sobre células vivientes y permite visualizar,
registrar y analizar en el tiempo y en el espacio eventos celulares
dinámicos.
Para la visualización con el VMSF, el medio de
cultivo es aspirado y las células son lavadas 2 veces con PBS, y
después se añade el tampón Krebs Ringer, KRH (5 mM KCl, 1,25 mM
MgSO_{4}, 125 mM NaCl, 25 mM Hépes pH 7,4, 8 mM de glucosa, 1,5
mM de CaCl_{2}, 0,1% BSA). Las células son observadas con un
objetivo X20. La longitud de onda de la excitación es de 400 nm
(Filtro estrecho ref.: 99EFILT0265, filtro en la excitación ref.:
93/XF1008/N, Melles Griot Industrie, Francia), la luz excitadora se
elimina por reflexión por encima de 450 nm (filtro dicroico 450
DCLP, ref.: 93/XF2006/N, Melles Griot Industrie), la fluorescencia
se observa a partir de 435 nm (filtro pasa alto 435 ALP, ref.:
93/XF3088/25R, Melles Griot Industrie). En el instante t = 0, el
medio es reemplazado por KRH que contiene la forscolina a una
concentración final de 20 \muM, se adquiere a continuación una
imagen cada segundo durante 3 minutos. Algunos de los clichés han
sido representados en la Figura 14. En t = 0, las células
COS-7 presentan una fluorescencia intensa de tipo
membranar, caracterizada por la ausencia de contraste entre el
citoplasma y el núcleo de las células (Figura 14a). Rápidamente, se
observa una pérdida de fluorescencia a nivel de las membranas
plásmicas y una aparición concomitante de fluorescencia a nivel del
citoplasma caracterizada por un marcado difuso que excluye la
membrana y el núcleo (Figuras 14b, 14c y 14d, respectivamente, con
t = 13s, t = 23s y t = 63s). En los diferentes experimentos
realizados sobre células fijas, se está en condiciones de observar
el efecto de la forscolina después de los primeros segundos de
tratamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Este ejemplo tiene por objeto apoyar la
aplicación del procedimiento al cribado de agentes biológicamente
activos sobre un objetivo terapéutico dado. El isoproterenol,
conocido también como isoprenalina, es un \beta1- y
\beta2-mimético, comercializado bajo la
denominación Isuprel®. Éste tiene, además de su acción sobre los
músculos lisos, un efecto estimulante cardíaco y está indicado en el
caso de la bradicardia, del síndrome de
Strokes-Adams (bloqueo
aurículo-ventricular) y de choque a presión venosa
central elevada.
- Control por imaginería de la translocación de
la GFP-C\alpha de la membrana plásmica hacia el
citoplasma durante un tratamiento con isoproterenol:
Células COS-7 que expresan de
forma natural el receptor \beta2 adrenérgico, un receptor acoplado
a las proteínas G, son co-transfectadas con los
plásmidos pcDNA3.1/RII\alpha-CAAX y
pcDNA3.1/GFP-C\alpha. Después de 24 horas de
incubación, el medio de cultivo es aspirado y las células son
lavadas 2 veces con PBS, y a continuación se añade el tampón KRH.
En el instante t = 0, el medio se reemplaza por KRH que contiene el
isoproterenol a una concentración final de 50 nM, y a continuación
se adquiere una imagen cada segundo durante 3 minutos. Algunos de
los clichés han sido representados en la Figura 15. En t = 0, las
células que expresan RII\alpha-CAAX y
GFP-C\alpha presentan un marcado de tipo membranar
(Figura 15a). Después de 5 segundos de tratamiento, se observa una
disminución de la fluorescencia a nivel de la membrana plásmica y
una aparición concomitante de la fluorescencia a nivel del
citoplasma (Figura 15b). Después de 10 segundos de tratamiento, se
distinguen perfectamente, por contraste, los contornos del núcleo
de las células, característica de un marcado exclusivamente
citoplásmico (Figuras 15c y 15d, respectivamente, con t = 5s y t =
20s).
- Análisis por FRET de la translocación de la
membrana plásmica hacia el citoplasma de
GFP-C\alpha durante el tratamiento de las células
con isoproterenol:
El método elegido para detectar y cuantificar el
cambio de estado de la GFP-C\alpha (localización
membranar frente a localización citoplásmica) aprovecha el
principio de FRET. Este principio se basa en un proceso físico,
dependiente de la distancia, mediante el que la energía es
transmitida de manera no radiativa desde un cromóforo excitado, el
donante, hasta otro cromóforo, el receptor, por acoplamiento
dipolar. Los estudios previos realizados por los investigadores,
han permitido establecer un par donante/receptor adaptado a la
puesta en práctica del procedimiento, en el que la GFP constituye
el donante y la sonda DiI el aceptor (documento WO 03/005028). La
sonda DiI es una molécula lipofila que en virtud de su afinidad
natural por las membranas, permite el marcado membranar de células
vivientes.
- Marcado con la sonda DiI de membranas
plásmicas de células COS-7 en cultivo,
co-transfectadas con los plásmidos codificantes
para las proteínas RII\alpha-CAAX y
GFP-C\alpha:
Se siembra una Lab-Tek I de 2
compartimentos con 200.000 células COS-7 (ECACC núm.
87021302), cultivadas en la 5ª pasada. 24 horas después, las
células son co-transfectadas con los plásmidos
pcDNA3.1/RII\alpha-CAAX y
pcDNA3.1/GFP-C\alpha según se ha descrito en el
ejemplo 3. 24 horas después del final de la transfección, las
células son marcadas con la sonda membranar DiI. Para ello, se
prepara una solución de
dioctadecil-1,1'-tetrametil-3,3,3',3'-indocarbocianina
(DiI, Molecular Probes, Leiden, Países Bajos, ref.:
D-282) a una concentración de 10 \mug/\mul en
dimetilformamida. Se prepara después el medio de marcado que
comprende 1960 \mul de medio DMEM, 40 \mul de una solución PBS
5% BSA "fatty acid free", es decir, libre de ácidos grasos
(Sigma.Aldrich Chimie SARL,
Saint-Quintin-Fallavier, Francia,
ref.: A-8806) calentada a 37ºC, y en la que se
dispersan 10 \mul de la solución de DiI en 10 \mug/ml. Se
obtiene así un medio de marcado a una concentración final en DiI de
50 \mug/ml y que contiene 0,1% de BSA "fatty acid free". Se
aspira el medio de cultivo del compartimento de la
Lab-Tek I de 2 compartimentos, y se lavan 2 veces
las células con 1 ml de PBS. Se añaden a continuación 2 ml de medio
de marcado sobre las células y a continuación se incuban durante 10
minutos a 25ºC. Después de haber aspirado el medio de marcado, las
células son lavadas tres veces con PBS. Para acabar, se añade 1 ml
de tampón KRH sobre las células, las cuales son incubadas a
continuación durante 2 horas a 25ºC.
- Análisis por espectrofluorimetría de la
fluorescencia emitida por células COS-7 que expresan
las proteínas RII\alpha-CAAX y
GFP-C\alpha y en las que las membranas son
marcadas con la sonda DiI.
Después de 2 horas de incubación a 25ºC, la
Lab-Tek I de 2 compartimentos, que contiene las
células, se sitúa sobre la platina caliente del VMSF (temperatura
de trabajo 25ºC). Después de haber aspirado el tampón KRH contenido
en el compartimento, las células son observadas con el objetivo X10
con el mismo juego de filtro utilizado en el ejemplo 3. La luz
recogida por el objetivo es transmitida al espectrofluorímetro, con
lo que se puede adquirir así, entre 450 nm y 700 nm, el espectro de
emisión de fluorescencia de las células que expresan las proteínas
RII\alpha-CAAX y GFP-C\alpha y
marcadas con la sonda DiI. Las emisiones de fluorescencia de la GFP
y de la DiI se producen, respectivamente, con un máximo a 510 nm y
565 nm. En el instante t = 0, se añaden en el compartimento 500
\mul de tampón KRH que contiene isoproterenol a una concentración
final de 50 nM y un inhibidor de fosfodiesterasas, el
RO-20-1724, a una concentración
final de 100 \muM. Se registran después 220 espectros a
intervalos de 2 segundos. Se registra a continuación un espectro de
emisión de fluorescencia de una Lab-Tek I de 2
compartimentos que contiene un volumen idéntico de KRH (es decir, en
este caso 500 \mul) que se substrae de todos los espectros de
emisión de fluorescencia obtenidos. En la Figura 16 se representan
los espectros de emisión de fluorescencia (Intensidad de
fluorescencia, unidad arbitraria (u.a.) en función de la longitud
de onda, nanómetros (nm)) corregidos observados en t = 0 (espectro
C), 26 (espectro B) y 438 segundos (espectro A). El aumento del
índice intracelular de AMPc inducido por el isoproterenol entraña la
translocación de la GFP-C\alpha de la membrana
plásmica hacia el citoplasma, y con ello un aumento de la
fluorescencia de la GFP-C\alpha a 510 nm, y una
disminución simultánea de la fluorescencia de la sonda DiI a 565
nm.
- Cuantificación de la variación de eficacia de
la transferencia de fluorescencia entre la
GFP-C\alpha y la sonda DiI en el transcurso de la
translocación de la GFP-C\alpha en el citoplasma
inducida por el isoproterenol.
La eficacia de la transferencia no radiativa de
fluorescencia entre la GFP-C\alpha y la sonda DiI
se proporciona como el porcentaje de variación de fluorescencia en
comparación con la fluorescencia inicial: FRET % = 100 x (I0 -
It)/I0.
Donde I0 es la fluorescencia inicial medida
sobre las células no tratadas, e It es la fluorescencia medida
sobre las células en el instante t después del tratamiento con el
isoproterenol. En la práctica, I0 e It se calculan como la relación
de la fluorescencia de la GFP-C\alpha y la
fluorescencia de la DiI. La fluorescencia de la
GFP-C\alpha con anterioridad al tratamiento, o en
el instante t después del tratamiento se evalúa por integración de
su espectro de fluorescencia corregido entre 505 y 515 nm. La
fluorescencia de la DiI con anterioridad al tratamiento o en el
instante t después del tratamiento, se evalúa por integración de su
espectro corregido entre 560 y 570 nm. La Figura 17a representa las
variaciones de fluorescencia de la GFP-C\alpha y
de la DiI con el paso del tiempo a continuación del tratamiento con
el isoproterenol. Después de 100 segundos de tratamiento, se
observa un aumento del 27% de la fluorescencia de la
GFP-C\alpha y una disminución del 2,5% de la DiI.
Esto se traduce en una pérdida de eficacia de la transferencia de la
fluorescencia de la GFP-C\alpha hacia la DiI
(Figura 17b). La FRET varía desde 0% en el momento de la inducción
de la translocación de la proteína todavía membranar, hasta un -39%
después de 200 segundos de tratamiento mientras la proteína es
translocada en el citoplasma.
<110> NOVALEADS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento de selección de
agentes bio-activos por detección de una variación
inducida de la concentración intracelular de AMPc de una célula
viviente sensible.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> NO1550 - BE10426
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 421
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína híbrida sintetizada por la
fusión genética entre RIIa y la CAAX que contiene el dominio de
H-Ras
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1267
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ácido nucleico codificante para la
proteína híbrida RIIa-CAAX.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Especies variadas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Especies variadas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Especies variadas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Especies variadas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
Claims (30)
1. Procedimiento de selección de agentes,
denominados agentes a probar, susceptibles de ser biológicamente
activos frente a un sistema celular viviente induciendo o inhibiendo
una síntesis intracelular de AMPc cuando están en presencia de al
menos una célula sensible de un sistema celular viviente, en el
que:
- se prepara un sistema celular con excepción de
un embrión humano, un cuerpo humano, un elemento no aislado del
cuerpo humano o una célula de origen embrionario humano, que
comprende al menos una célula viviente sensible que expresa al
menos una proteína recombinada multimérica específica de la vía de
transducción AMPc/PKA,
- \text{*}
- estando la citada proteína recombinada, en ausencia de síntesis inducida de AMPc, en un primer estado, denominado estado complejo, en el que forma un complejo, denominado complejo RC, que comprende al menos una sub-unidad reguladora recombinada de una PKA, denominada unidad R y que incluye al menos un sitio de enlace de la AMPc, y al menos una sub-unidad catalítica de una PKA, denominada unidad C,
- \text{*}
- estando la citada proteína recombinada, en presencia de síntesis inducida de AMPc, en un segundo estado, denominado estado disociado, en el que las unidades R y C están disociadas, y en el que al menos una unidad R fija la AMPc,
- se pone el citado sistema celular en presencia
de una cantidad de al menos un agente a probar,
- se detecta el estado, complejo o disociado, de
la citada proteína recombinada,
caracterizado porque:
- al menos una de las unidades R o C, denominada
unidad de translocación, presenta una secuencia proteica que
comprende una secuencia de direccionamiento membranar que presenta
un motivo de modificación post-traduccional CAAX
funcional; estando la posición de la citada secuencia de
direccionamiento membranar en la citada secuencia proteica adaptada
para conservar la idoneidad de la proteína recombinada para formar
en la membrana un complejo RC en ausencia de síntesis inducida de
AMPc, y para disociarse en presencia de síntesis inducida de
AMPc;
- al menos otra unidad R o C, denominada unidad
marcada, distinta de la unidad de translocación, presenta un grupo,
denominado grupo de detección, adaptado para:
- \text{*}
- conservar la idoneidad de la proteína recombinada para formar un complejo RC en ausencia de síntesis inducida de AMPc, y para disociarse en presencia de síntesis inducida de AMPc, y
- \text{*}
- permitir la detección del estado de la proteína con la ayuda de una señal de detección que, en la membrana, es diferente según la ausencia o la presencia de síntesis inducida de AMPc.
2. Procedimiento de selección según la
reivindicación 1, caracterizado porque el motivo de
direccionamiento membranar de la unidad de translocación proviene
del extremo C-terminal de una proteína de tipo
Ras.
3. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el motivo de
direccionamiento comprende al menos parte de una secuencia de
aminoácidos elegida entre: SEQ ID núm. 1, SEQ ID núm. 2, SEQ ID
núm. 3 y SEQ ID núm. 4.
4. Procedimiento de selección según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el grupo de
detección de la unidad marcada es un grupo luminóforo elegido
entre:
- una proteína fluorescente natural o una
proteína fluorescente mutada, por adición, eliminación o sustitución
de uno o varios ácidos aminados de una proteína natural,
conservando esta proteína fluorescente mutada la propiedad de
fluorescencia,
- un fragmento fluorescente procedente de una
proteína fluorescente natural o de una proteína fluorescente
mutada, adaptado para presentar la propiedad de fluorescencia de la
proteína fluorescente de la que procede,
- una proteína bioluminiscente natural o mutada,
por adición, eliminación o sustitución de uno o varios ácidos
aminados de una proteína natural, conservando esta proteína
bioluminiscente mutada la propiedad de bioluminiscencia,
- la fluoresceína, la rodamina, la Bodipy®, la
cianina, el Nile Red®, el Texas Red®, los quelatos de tierras
raras, las indo- y carbo-cianinas, el
difenilhexatrieno, los derivados aromáticos luminiscentes.
5. Procedimiento de selección según las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la unidad de
translocación es la unidad R y la unidad marcada es la unidad
C.
6. Procedimiento de selección según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el estado,
complejo o disociado, de la proteína recombinada multimérica
específica de la vía de transducción AMPc/PKA se realiza mediante
la detección, respectivamente, de una emisión o de una extinción
luminosa del acoplamiento de luminiscencia entre dos grupos
luminiscentes complementarios, aprovechando el principio de FRET o
de BRET.
7. Procedimiento de selección según la
reivindicación 6, caracterizado porque se introduce en el
sistema celular una composición de al menos un compuesto,
denominado agente membranar de acoplamiento, apto para asociarse a
la membrana plásmica de una célula sensible y marcado al menos con
un grupo fotocomplementario, denominado segundo luminóforo,
distinto del grupo luminiscente portado por la unidad marcada,
denominado primer luminóforo complementario del segundo luminóforo,
y de tal modo que las propiedades del sistema celular viviente
frente a la señal celular se conserven al menos sensiblemente, y
que al menos una propiedad medible de la emisión luminosa entre el
primer y el segundo luminóforos sea sensiblemente modificada cuando
la señal celular cambia de
estado.
estado.
8. Procedimiento de selección según la
reivindicación 7, caracterizado porque al menos uno de entre
el primer y el segundo luminóforos se elige entre:
- una molécula susceptible de absorber la luz
emitida por una proteína fluorescente,
- una proteína fluorescente natural o una
proteína fluorescente mutada, por adición, eliminación o sustitución
de uno o varios ácidos aminados de una proteína fluorescente
natural, conservando esta proteína fluorescente la propiedad de
fluorescencia,
- un fragmento fluorescente procedente de una
proteína fluorescente natural o de una proteína fluorescente
mutada, adaptado para presentar la propiedad de fluorescencia de la
proteína fluorescente de la que procede,
- una proteína bioluminiscente natural, en
particular de tipo luciferasa, o una proteína bioluminiscente
mutada, por adición, eliminación o sustitución de uno o varios
ácidos aminados de una proteína natural, conservando esta proteína
bioluminiscente mutada la propiedad de bioluminiscencia,
- la fluoresceína, la rodamina, la Bodipy®, el
Nile Red®, el Texas Red®, los quelatos de tierras raras, las indo-
y carbo-cianinas, el difenilhexatrieno, los
derivados aromáticos luminiscentes.
9. Procedimiento de selección según una de las
reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque al menos uno de
entre el primer y el segundo luminóforos es una proteína
autofluorescente natural de gorgona.
10. Procedimiento de selección según una de las
reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque se utiliza un
agente membranar de acoplamiento que comprende un ligando lipofilo
elegido entre los fosfolípidos, los ácidos grasos, los glicéridos,
el colesterol, las ceramidas, las aminas grasas, los agentes
luminóforos lipofilos o los derivados lipofilos de estos
compuestos.
11. Procedimiento de selección según una de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la unidad de
translocación es una unidad R procedente de la fusión por vía
genética:
- de al menos una parte de la secuencia proteica
de una sub-unidad reguladora elegida entre las
isoformas: RI, RI\beta, RII\alpha, RII\beta,
- y de una secuencia de direccionamiento
membranar.
12. Procedimiento de selección según la
reivindicación 11, caracterizado porque la unidad de
translocación tiene por secuencia proteica la SEQ ID núm. 5.
13. Procedimiento de selección según las
reivindicaciones 11 ó 12, caracterizado porque la unidad de
translocación está codificada por la secuencia nucleica SEQ ID núm.
6.
14. Procedimiento de selección según una de las
reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque la unidad
marcada es una secuencia proteica que comprende al menos una parte
de la secuencia de una sub-unidad catalítica elegida
entre las isoformas: C\alpha, C\beta y C\gamma, marcada por
un grupo de detección.
15. Sistema celular viviente con excepción de un
embrión humano, un cuerpo humano, un elemento no aislado del cuerpo
humano, o una célula de origen embrionario humano, que contiene al
menos una célula viviente que expresa al menos una proteína
recombinada multimérica específica de la vía de transducción
AMPc/PKA,
- estando la citada proteína recombinada, en
ausencia de síntesis inducida de AMPc, en un primer estado,
denominado estado complejo, en el que forma un complejo, denominado
complejo RC, que comprende al menos una sub-unidad
reguladora recombinada de una PKA, denominada unidad R y que incluye
al menos un sitio de enlace de la AMPc, y al menos una
sub-unidad catalítica recombinada de una PKA,
denominada unidad C,
- estando la citada proteína recombinada, en
presencia de síntesis inducida de AMPc, en un segundo estado,
denominado estado asociado, en el que las unidades R y C están
disociadas y en el que al menos una unidad R fija la AMPc,
caracterizado porque:
- al menos una de las unidades R o C, denominada
unidad de translocación, presenta una secuencia proteica que
comprende una secuencia de direccionamiento membranar que presenta
un motivo de modificación post-traduccional CAAX
funcional; estando la posición de la citada secuencia de
direccionamiento membranar en la citada secuencia proteica adaptada
para conservar la idoneidad de la proteína recombinada para formar
en la membrana un complejo RC en ausencia de síntesis inducida de
AMPc, y para disociarse en presencia de síntesis inducida de
AMPc;
AMPc;
- al menos otra unidad R o C, denominada unidad
marcada, distinta de la unidad de translocación, presenta un grupo,
denominado grupo de detección, adaptado para:
- \text{*}
- conservar la idoneidad de la proteína recombinada para formar un complejo RC en ausencia de síntesis inducida de AMPc, y para disociarse en presencia de síntesis inducida de AMPc, y
- \text{*}
- permitir la detección del estado de la proteína con la ayuda de una señal de detección que, en la membrana, es diferente según la ausencia o la presencia de síntesis inducida de AMPc.
16. Sistema celular según la reivindicación 15,
caracterizado porque el motivo de direccionamiento membranar
de la unidad de translocación proviene del extremo
C-terminal de una proteína de tipo Ras.
17. Sistema celular según una de las
reivindicaciones 15 ó 16, caracterizado porque el motivo de
direccionamiento comprende al menos una parte de una secuencia de
aminoácidos elegida entre: SEQ ID núm. 1, SEQ ID núm. 2, SEQ ID
núm. 3 y SEQ ID núm. 4.
18. Sistema celular según una de las
reivindicaciones 15 a 17, caracterizado porque el grupo de
detección de la unidad marcada es un grupo luminóforo elegido
entre:
- una proteína fluorescente natural o una
proteína fluorescente mutada, por adición, eliminación o sustitución
de uno o varios ácidos aminados de una proteína natural,
conservando esta proteína fluorescente mutada la propiedad de
fluorescencia,
- un fragmento fluorescente procedente de una
proteína fluorescente natural o de una proteína fluorescente
mutada, adaptado para presentar la propiedad de fluorescencia de la
proteína fluorescente de la que procede,
- una proteína bioluminiscente natural, en
particular de tipo luciferasa, o una proteína bioluminiscente
mutada, por adición, eliminación o sustitución de uno o varios
ácidos aminados de una proteína natural, conservando esta proteína
bioluminiscente mutada la propiedad de bioluminiscencia,
- la fluoresceína, la rodamina, la Bodipy®, la
cianina, el Nile Red®, el Texas Red®, los quelatos de tierras
raras, las indo- y carbo-cianinas, el
difenilhexatrieno, los derivados aromáticos luminiscentes.
19. Sistema celular según las reivindicaciones
15 a 18, caracterizado porque la unidad de translocación es
la unidad R y la unidad marcada es la unidad C.
20. Sistema de selección según una de las
reivindicaciones 15 a 19, caracterizado porque el estado,
complejo o disociado, de la proteína recombinada multimérica
específica de la vía de transducción AMPc/PKA se realiza mediante
la detección, respectivamente, de una emisión o de una extinción
luminosa del acoplamiento de luminiscencia entre dos grupos
luminiscentes complementarios, aprovechando el principio de FRET o
de BRET.
21. Sistema celular según la reivindicación 20,
caracterizado porque comprende al menos un compuesto,
denominado agente membranar de acoplamiento, asociado a la membrana
plásmica y marcado con al menos un grupo fotocomplementario,
denominado segundo luminóforo, distinto del grupo luminiscente
portado por la unidad marcada, denominado primer luminóforo
complementario del segundo luminóforo, y de tal modo que las
propiedades del sistema celular viviente frente a la señal celular
sean al menos sensiblemente conservadas, y que al menos una
propiedad medible de la emisión luminosa entre el primer y el
segundo luminóforos sea sensiblemente modificada cuando la señal
celular cambia de estado.
22. Sistema celular según la reivindicación 21,
caracterizado porque al menos uno de entre el primer y el
segundo luminóforos se elige entre:
- una molécula susceptible de absorber la luz
emitida por una proteína fluorescente,
\newpage
- una proteína fluorescente natural o una
proteína luminiscente mutada, por adición, eliminación o sustitución
de uno o varios ácidos aminados de una proteína fluorescente
natural, conservando esta proteína fluorescente mutada la propiedad
de fluorescencia,
- un fragmento fluorescente procedente de una
proteína fluorescente natural o de una proteína fluorescente
mutada, adaptado para presentar la propiedad de fluorescencia de la
proteína fluorescente de la que procede,
- una proteína bioluminiscente natural o una
proteína bioluminiscente mutada, por adición, eliminación o
sustitución de uno o varios ácidos aminados de una proteína
natural, conservando esta proteína bioluminiscente mutada la
propiedad de bioluminiscencia,
- la fluoresceína, la rodamina, la Bodipy®, el
Nile Red®, el Texas Red®, los quelados de tierras raras, las indo-
y carbo-cianinas, el difenilhexatrieno, los
derivados aromáticos luminiscentes.
23. Sistema celular según una de las
reivindicaciones 21 ó 22, caracterizado porque al menos uno
de entre el primer y el segundo luminóforos es una proteína
autofluorescente natural de gorgona.
24. Sistema celular según una de las
reivindicaciones 20 a 23, caracterizado porque se utiliza un
agente membranar de acoplamiento que comprende un ligando lipofilo
elegido entre los fosfolípidos, los ácidos grasos, los glicéridos,
el colesterol, las ceramidas, las aminas grasas, los agentes
luminóforos lipofilos o los derivados lipofilos de estos
compuestos.
25. Sistema celular según una de las
reivindicaciones 15 a 24, caracterizado porque la unidad de
translocación es una sub-unidad reguladora
recombinada procedente de la fusión por vía genética:
- de al menos una parte de la secuencia proteica
de una sub-unidad reguladora elegida entre las
isoformas: RI\alpha, RI\beta, RII\alpha y RII\beta,
- y de una secuencia de direccionamiento
membranar.
26. Sistema celular según la reivindicación 25,
caracterizado porque la unidad de translocación tiene como
secuencia proteica la SEQ ID núm. 5.
27. Sistema celular según una de las
reivindicaciones 25 ó 26, caracterizado porque la unidad de
translocación está codificada por la secuencia nucleica SEQ ID núm.
6.
28. Sistema celular según una de las
reivindicaciones 15 a 27, caracterizado porque la unidad
marcada es una secuencia proteica que comprende al menos una parte
de la secuencia de una sub-unidad catalítica elegida
entre las isoformas: C\alpha, C\beta y C\gamma, marcada por
un grupo de detección.
29. Proteína recombinada susceptible de ser
expresada a nivel de la membrana plásmica de una célula, de fijar
la AMPc, de enlazarse a una sub-unidad catalítica de
la PKA cuando no fija la AMPc, y de disociarse de la citada
sub-unidad catalítica cuando fija la AMPc, que
comprende una secuencia proteica elegida entre la secuencia
proteica SEQ ID núm. 5, la secuencia proteica SEQ ID núm. 5 separada
de sus residuos V-L-S
carbonil-terminales.
30. Secuencia nucleica codificante para una
proteína recombinada según la reivindicación 29, que comprende una
secuencia nucleica SEQ ID núm. 6.
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