WO2011152662A2 - Ptd-uqcrb 융합 폴리펩타이드 및 그를 포함하는 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

Ptd-uqcrb 융합 폴리펩타이드 및 그를 포함하는 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2011152662A2
WO2011152662A2 PCT/KR2011/004015 KR2011004015W WO2011152662A2 WO 2011152662 A2 WO2011152662 A2 WO 2011152662A2 KR 2011004015 W KR2011004015 W KR 2011004015W WO 2011152662 A2 WO2011152662 A2 WO 2011152662A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
ptd
uqcrb
ischemic
fusion polypeptide
protein
Prior art date
Application number
PCT/KR2011/004015
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2011152662A3 (ko
WO2011152662A9 (ko
Inventor
권호정
장정화
Original Assignee
연세대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 연세대학교 산학협력단 filed Critical 연세대학교 산학협력단
Priority to US13/701,492 priority Critical patent/US8729021B2/en
Publication of WO2011152662A2 publication Critical patent/WO2011152662A2/ko
Publication of WO2011152662A9 publication Critical patent/WO2011152662A9/ko
Publication of WO2011152662A3 publication Critical patent/WO2011152662A3/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y110/00—Oxidoreductases acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C12Y110/02—Oxidoreductases acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with a cytochrome as acceptor (1.10.2)
    • C12Y110/02002—Ubiquinol-cytochrome-c reductase (1.10.2.2), i.e. electron-transport-complex-III
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22

Definitions

  • the present invention relates to a PTD-UQCRB fusion polypeptide and a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of ischemic diseases comprising the same.
  • Ischemia is a partial blood deficiency that causes blood vessels to become narrowed or contracted, or that normal blood vessels are not produced enough to stop blood supply, resulting in cell damage.
  • chronic ischemic heart disease one of the most common ischemic diseases, myocardium is not receiving enough oxygen and nutrients due to abnormalities of the coronary circulation that supplies blood to the myocardium, chest pain, dyspnea due to heart failure, weakness and fainting.
  • the frequency of occurrence is increasing rapidly in recent years.
  • the formation of hair follicles that is, hair formation, may cause hair loss gray hair.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • VEGF-121 and 165 are secreted proteins
  • VEGF-189 and 206 are growth factors by binding to heparin including proteoglycans on the cell surface or extracellular matrix.
  • VEGF vascular endothelial growth factor receptors
  • Flt-1 Flt-1
  • KDR kinase domain ⁇
  • VEGF causes angiogenesis, such as proliferation and migration of endothelial cells and the formation of capillaries through signaling by binding to receptors, which is essential for the regeneration of wounds as well as organ development and differentiation during embryonic development.
  • angiogenesis such as proliferation and migration of endothelial cells and the formation of capillaries through signaling by binding to receptors, which is essential for the regeneration of wounds as well as organ development and differentiation during embryonic development.
  • the fact that VEGF induces angiogenesis is well known to those skilled in the art and has been described in Bruce I.
  • Vascular permeability factor vascular endothelial growth factor gene is expressed differentially in normal tissues, macrophages, and tumors, Mol Biol Cell., 3 (2): 211-20 (1992)). Therefore, even when directly administered VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), angiogenesis can be induced to treat ischemic disease.
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • UQCRB a component of mitochondrial complex m
  • UQCRB is a target protein of terpestacin, a low molecular compound that inhibits angiogenesis (1, 15).
  • UQCRB is encoded in the nucleus (2) and plays an important role in assembling and maintaining the complex III structure (3).
  • UQCRB is also overexpressed in liver and gastric cancers and is associated with a number of diseases, such as hypoglycemia, lactic acidosis and myopathy (4).
  • complex III of the mitochondrial respiratory chain can detect reactive oxygen species (R0S) through intracellular oxygen sensing. And play an important role in regulating hypoxic-induced angiogenesis (5--8).
  • R0S reactive oxygen species
  • the R0S produced by mitochondrial complex III in the hypoxic state stabilizes the hypoxic-inducible factor la (HIF-la; hypoxi-inducible factor l- ⁇ ) protein, the major regulator of angiogenesis (9) (FIG. 1).
  • Hypoxia-inducible factor (HIF) has been noted in that it plays an important role in cell survival and angiogenesis initiation in hypoxia (10-11).
  • HIF vascular endothelial cell growth factor
  • the present inventors earnestly researched for the development of a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of ischemic diseases.
  • the present invention was completed by designing a novel PTD-UQCRB fusion polypeptide capable of transporting UQCRB into cells and confirming that the PTIHJQCRB fusion polypeptide caused angiogenesis effectively and safely.
  • Another object of the present invention is to provide an expression vector of a PTD-UQCRB fusion polypeptide.
  • Another object of the present invention to provide a method for producing PTD-UQCRB fusion polypeptide.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of ischemic diseases, including PTD-UQCRB fusion polypeptide. Still other objects and advantages of the present invention are as follows. The claims and drawings are more apparent.
  • the present invention provides a PTD—UQCRB fusion polypeptide comprising an amino acid sequence of a protein delivery domain (PTD) and an amino acid sequence of human Ubiquino® cytochrome c reductase binding protein (UQCRB).
  • PTD protein delivery domain
  • UQCRB human Ubiquino® cytochrome c reductase binding protein
  • the fusion polypeptide of the present invention is a PTD-UQCRB fusion polypeptide comprising Ubiquinol—cytochrome c reductase binding protein (UQCRB) fused to a protein transduction domain (PTD).
  • UQCRB Ubiquinol—cytochrome c reductase binding protein
  • PTD protein transduction domain
  • PTD JQCRB fusion polypeptide refers to a fusion polypeptide in which UQCRB is fused at the C-terminus or N-terminus of a protein carrier (PTD).
  • UQCRB one of the components of the PTD-UQCRB fusion polypeptide of the present invention, is a target protein of terpestacin, a low molecular compound that inhibits angiogenesis (15).
  • UQCRB is encoded in the nucleus and plays an important role in assembling and maintaining complex m structures. We have found that the introduction of UQCRB into cells induces the generation of reactive oxygen species (R0S) in mitochondria and stabilizes HIF-la.
  • R0S reactive oxygen species
  • the amino acid sequence of the human UQCRB is characterized in that represented by the first sequence sequence.
  • the protein transduction domain (PTD) used in the fusion polypeptide of the present invention more effectively prevents the introduction of UQCRB into cells. It is added to.
  • UQCRB crosses the cell membrane in a receptor and transporter dependent manner to dendritic cells. That is, they are introduced through cell membrane permeation mechanisms rather than pinocytosis, phagocytosis and receptor-mediated endocytosis. Thus, the influx of UQCRB into cells can be made more efficiently compared to other mechanisms.
  • Protein carriers of the invention are Hphl, Tat, Penetratin, Transportan, VP- 22, Amphipathic peptides, MPG, Pep-1, MAP, SAP, PPTG1, Cationic Peptides (Cat ionic peptides), ligo arginine (01 igoarginine), hCT (9-32), SyrB and Pvec peptides.
  • the protein carrier is Hphl having the amino acid sequence of the second sequence of the sequence listing.
  • the invention provides a kit comprising: (a) a nucleotide sequence encoding a protein transfer domain (PTD); And (b) an expression vector of a PTD-UQCRB fusion polypeptide comprising a nucleotide sequence encoding human UQCRB (Ubi qui no 1—cytochrome c reductase binding protein).
  • nucleotide has the meaning of encompassing DNA and RNA molecules inclusive, and includes not only natural nucleotides, but also analogs in which sugar or base sites are modified (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley). , New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90: 543—584 (1990)).
  • the nucleotide sequence encoding the human UQCRB is characterized in that represented by the sequence 3rd sequence.
  • the nucleotide sequence encoding the human Ubiquinol® cytochrome c reductase binding protein (UQCRB) in the expression vector of the PTD-UQCRB fusion polypeptide of the present invention is a nucleotide sequence showing substantial identity to the nucleotide sequence represented by the sequence listing third sequence. Also includes.
  • nucleotide of the present invention At least 8OT homology, more preferably at least 90% phase, when the sequence is aligned with the maximal correspondence of any other sequence and the aligned sequence is analyzed using algorithms commonly used in the art.
  • nucleotide sequence showing homology, most preferably at least 95% homology.
  • nucleotide sequence encoding the protein delivery domain is characterized in that represented by SEQ ID NO: 4 sequence.
  • the PTD encoding nucleotide sequence and the UQCRB encoding nucleotide sequence are preferably present in a suitable expression construct.
  • the PTD encoding nucleotide sequence and the UQCRB encoding nucleotide sequence are preferably operably linked to a promoter.
  • Vectors of the invention can typically be constructed as vectors for expression.
  • the vector of the present invention may be preferably constructed using prokaryotic cells as a host.
  • a strong promoter capable of promoting transcription e.g., tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL x promoter, pR x promoter, rac5) Promoters, amp promoters, recA promoters, SP6 promoters, trp promoters and T7 promoters, etc.), ribosomal binding sites for initiation of translation, and transcription / detox termination sequences.
  • E. coli is used as the host cell, the promoter and operator site of the E. coli tryptophan biosynthetic pathway (Yanofsky, C., J.
  • vectors that can be used in the present invention are plasmids often used in the art (eg pSClOl, ColEl, pBR322, pUC8 / 9, pHC79, pUC19, pET, etc.), phages (eg Xg XB, ⁇ -Charon, ⁇ ⁇ and M13, etc.) or viruses (eg SV40, etc.).
  • the vector of the invention may be fused with other sequences as needed to facilitate purification of the fusion proteins of the invention expressed therefrom, and the sequences to be fused are, for example, glutathione S-transferase (Pharmacia, USA), Toss binding protein (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) and 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) and the like can be used, but are not limited thereto.
  • the fusion protein expressed by the vector of the present invention is purified by affinity chromatography, preferably HisPur cobalt resin affinity chromatography or Ni-affinity column.
  • the expression vector of the present invention as an optional marker, and may include antibiotic resistance genes commonly used in the art, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, strapomycin, kanamycin, geneeti There are genes resistant to leucine, neomycin and tetracycline.
  • the present invention comprises the steps of (a) transforming the host cell with the expression vector of the PTD-UQCRB fusion polypeptide; And (b) culturing the transformed host cell to collect a PTD JQCRB fusion polypeptide.
  • a host cell capable of continuously cloning and expressing the vector of the present invention in a stable manner may be any host cell known in the art, for example, E. coli JM109, E. coli BL2KDE3), E. coli RRl, E strains of the genus Bacillus, such as coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, and Salmonella typhimurium, Serratia marsonsons and various Pseudomonas species The same enterobacteria and strains, preferably starpLysS E. coli.
  • the method of carrying the vector of the present invention into a host cell is performed by the CaCl 2 method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973)), one method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973); and Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166: 557-580 (1983)) and electroporation methods (Dower, WJ et al., Nucleic. Acids Res., 16: 6127-6145 (1988)) and the like.
  • the invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of ischemic diseases comprising (a) a pharmaceutically effective amount of a PTD-UQCRB fusion polypeptide; and (b) a pharmaceutically acceptable carrier. to provide.
  • the PTD-UQCRB fusion polypeptide is characterized in that it comprises an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 sequence and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 sequence.
  • the PTD-UQCRB fusion polypeptide of the present invention passes through the cell, mitochondrial complex III-derived R0S generation is induced.
  • Mitochondrial R0S stabilizes HIF-la by inhibiting PHD, a HIF hydroxylase. Stabilized HIF-la can lead to dimers with HIF- ⁇ , which heterodimer complexes migrate into the nucleus and bind to the HRE promoter.
  • a target gene such as VEGF can be transcribed to induce angiogenesis.
  • the PTD-UQCRB fusion polypeptide of the present invention was found to induce angiogenesis by inducing expression of vascular endothelial proliferation factor (VEGF) even under normal oxygen conditions.
  • VEGF vascular endothelial proliferation factor
  • the ischemic disease to which the composition of the present invention is applied ischemic heart disease, ischemic myocardial infarction, ischemic heart failure, ischemic enteritis, ischemic vascular disease, ischemic eye disease, ischemic retinopathy, ischemic glaucoma, ischemic Renal failure, ischemic baldness, ischemic stroke and ischemic leg disease.
  • compositions Of The Invention Carriers are commonly used in the preparation, lactose, dextrose, sucrose, sorbbi, manny, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline salose, polyvinylpi Lollidon, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methyl hydroxy benzozoate, propyl hydroxybenzoate, talc, stearic acid magnesium and mineral oil, and the like, but are not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • a lubricant e.g., talc, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, a kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mann
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered parenterally, and in the case of parenteral administration, it may be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, or the like.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may vary depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and reaction in response to the patient. It may be prescribed. On the other hand, the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably 0.001- 100 mg / kg (body weight) per day.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporating into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of axles, powders, granules, tablets or capsules, and may further include a dispersant or stabilizer.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of ischemic diseases comprising the PTIHJQCRB fusion polypeptide and the same.
  • the PTEHJQCRB fusion polypeptide of the present invention is very effective to cross the cell membrane to induce angiogenesis and to induce cytotoxicity. Therefore, it can be usefully used for the prevention and treatment of ischemic diseases.
  • a series of PTD-UQCRB fusion proteins was expressed in BL21 cell line (B: BL21, S: BL21 starpLysS, P: BL21 pLysS)-The molecular weight of PTD-UQCRB fusion protein was 43 kDa.
  • Cell growth was determined using HeLa cells, HepG2 cells, and ⁇ chromatographic methods.
  • HIF-1 ⁇ protein levels were measured using Western blot analysis in HeLa cells treated with PTD-UQCRB (2 and 4 yM) for 4 or 12 hours (NT: non-treated).
  • the lower graph shows quantitative data for Western blot analysis as measured by density meter. Data are presented as mean values SD for three independent experiments.
  • HIF-la protein levels were PTD-UQCRB (2 and 4 ⁇ ) and PTD- as a control EGFP (2 and 4 ⁇ ) was measured using Western blot analysis in HeLa cells treated for 24 hours (NT: non-treated).
  • the lower graph shows quantitative data for Western blot analysis as measured by density meter. Data are presented as mean values SD for three independent experiments. 8. Quantitative analysis of HRE receptor gene expression activity by PITHJQCRB
  • HepG2 cells were transiently transformed with HRE-luciferase DNA vector.
  • Cells were treated with PTD-UQCRB (1 and 2.5 ⁇ ) for 4 hours (NT: non-treated). Luciferase luminescence was tested to compare biological activity. Data are presented as mean values SD for three independent experiments. 9. Effect of FTO JOCRB on VEGF Expression
  • VEGF protein levels in HeLa cells treated for 24 hours were analyzed by Western blot (NT: non-treated).
  • Lower panel shows quantitative data for Western blot analysis as measured by density meter. The data represents the mean ⁇ SD of three independent experimental values.
  • H-E hamaroxylin and eosin staining
  • M-T Masontrichrome staining
  • SMA smooth muscle ⁇ -actin
  • Mitochondrial R0S stabilizes HIF-la by inhibiting PHD, a HIF hydroxylase. Stabilized HIF-la can lead to a dimer with HIF_113, which heterodimer complex migrates into the nucleus and binds to the HRE promoter. As a result, a target gene such as VEGF can be transcribed to induce angiogenesis.
  • the EcoRI / XhoI site of the cell-permeable protein transduction domain containing pRSET-B (PCR-amplified full-length cDNA of UQCRB) (pHSET-B) was provided.
  • pHSET-B PCR-amplified full-length cDNA of UQCRB
  • Ni-NTA agarose beads (Qiagen, Hi lden, Germany) was added to the supernatant and incubated for 2 hours at 4 ° C. After incubation with the beads, the supernatant was hung on a poly-prep column (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). The binding protein is washed off with wash buffer (50 mM NaH 2 P0 4 , 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH 8.0) and eluted buffer (50 mM NaH 2 P0 4 , 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH). 8.0). The eluted protein was desalted using PD-10 Sephadex G-25 (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) and divided into equal portions supplemented with 10% glycerine and then frozen at -20 ° C instantaneously.
  • wash buffer 50 mM NaH 2 P0 4 , 300 mM NaCl, 20 mM
  • HeLa cells were treated with 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco-BRL, Grand Island, NY, FBS, Gibco-BRL, Grand Island, NY, FBS, Gibco-BRL, Grand Island, NY, FBS, Gibco-BRL, Grand Island, NY, FBS, Gibco-BRL, Grand Island, NY, FBS, Gibco-BRL, Grand Island, NY, FBS, Gibco-BRL, Grand Island, NY,
  • DMEM Human Umbilical Vein Endothelial Cells
  • EBM-2 Endothelial cell basal medium
  • FBS FBS
  • Inoculation HepG2 cells were supplemented with RPM KRoswel l Park Memorial Inst itute 1640 medium (RPMI, Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA).
  • HT1080 cells were cultured in MEM medium supplemented with 10% FBS (Minimum essential medium, Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA). The cells were maintained in a humid incubator fed with 5% CO 2 .
  • HeLa cells were incubated with 4 ⁇ of PTD - UQCRB for 1 hour and cells were fixed with 4% formaldehyde (Sigma, St. Louis, M0). After washing with PBS, cells were co-stained for 30 minutes with 1 / ⁇ g / m £ Hoechst solution and 0.5 s / nd Mitotracker solution. Finally, the cells were washed with distilled water and observed by confocal microscopy (Carl Zeiss LSM 510 META, Germany).
  • HUVECs were cultured in EBM-2 supplemented with 10% FBS in a humid atmosphere at 37 ° C and 53 ⁇ 4 C0 2 .
  • HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with FBS under the same conditions as HUVEC.
  • Cell growth was measured using 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay.
  • MTT 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay.
  • MTT 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide
  • Cells (3 ⁇ 10 3 cells / well) were seeded in 96-well culture plates and incubated for 24 hours for stabilization.
  • Various concentrations of PTD-UQCRB were added to each well and incubated for 2 days, followed by
  • Mitochondrial R0S levels were measured using the MitoS0X TM (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA), a red mitochondrial superoxide indicator. HeLa cells were microscopically covered glass (Decklaser, Lauda-
  • HeLa cells cultured in 6-well plates were lysed and the eluate was separated by 10% SDS-PAGE and then transferred to PVDF membranes (Milipore, Bedford, Mass.) Following standard electroblot procedures. Block the blot and add anti-HIF-la (BD,
  • HepG2 cells were cultured under 37 ° C. and 5% CO 2 conditions in DMEM supplemented with 10% FBS.
  • the transfection reagent Lipofectamine LTXUnvitrogen, NY, USA was used to seed the cells in 6-well plates 24 hours prior to transformation of the cells according to the manufacturer's instructions. Normal oxygen conditions were set to 5% C0 2 conditions, while hypoxic conditions were performed for 4 hours at 37 ° C with 2% 0 2 and 5% C0 2 conditions in an N 2 "02-C0 2 incubator.
  • Luciferase The reporter plasmid construct for the reporter assay (HRE-luciferase) was provided by Dr.
  • HUVECs The penetration of HUVECs was tested in vitro using a Transwell chamber system with Cambridge, Mass.).
  • the bottom of the filter was coated with 10 ⁇ gelatin (1 mg / mL, Sigma, MO, USA), while the top was coated with 10 ⁇ Matrigel (3 mg / mL, BD, Bedford, MA, USA).
  • HUVEC cells (lxlO 5 cells) were placed on the top side of the filter and a CM medium (conditioned medium) was applied on the bottom side.
  • the chamber was then incubated for 16 hours at 37 ° C., fixed with methanol and stained with hemaroxylin and eosin (Sigma, M0, USA). Cells invading on the bottom of the filter were observed by an optical microscope at x100 magnification.
  • the wounds were made by removing the skin in a rectangular shape with a width of 1.5 x 1.5 cm 2 on the back of 5 week old rats (BALB / c nude female, Orient bio, Korea). During the procedure, rats were anesthetized by intraperitoneal administration of tribromoethane (Avertin®, 250 mg / kg) and injected with ketoprofen (Ketoprofen, 0.1 mg / kg) subcutaneously to give an analgesic effect. In addition, painkillers continued to be administered at 24 hour intervals for 4 days after surgery to relieve pain.
  • Avertin® tribromoethane
  • ketoprofen Ketoprofen
  • mice were euthanized two weeks after surgery and tissues from regenerated sites were obtained for histological or immunohistochemical analysis.
  • samples were fixed in 1 (v / v) formaldehyde and embedded with paraffin. After that Samples were thinly sliced to 4 ym thick and stained by two histological methods: hemaroxylin, eosin (HE) and Masson's trichrome (MT).
  • Samples were also prepared using anti-involukrin (Abeam, Cambridge, UK) and anti-smooth muscle ⁇ -actin (Abeam) antibodies as primary antibodies and using a diaminobenzidine kit (DAB substrate kit, Vector laboratories, USA). Staining was performed by immunohistochemical method.
  • DAB substrate kit diaminobenzidine kit
  • Epidermal thickness was measured by measuring the thickness of the three wound sites per photograph taken in the immunohistostained sample of the epidermal marker Involukrin and the histologically stained samples of both H-E and M-T. The results of all quantitative analyzes are expressed as mean ⁇ standard deviation.
  • UQCRB terpestacin-binding mitochondrial protein
  • FIG. 2A The full-length gene of UQCRB was subcloned into the pRSET-B expression vector containing the gene of protein delivery domain (PTD).
  • the gene of the protein delivery domain encodes a cell permeable peptide (Hphl) to deliver its fusion partner into the cell.
  • the 6x His tag was also inserted for protein purification using Ni-NTA and enhanced green fluorescent protein (EGFP) was also detected to detect intracellular delivery of PTEKJQCRB fusion protein.
  • EGFP enhanced green fluorescent protein
  • PTD-UQCRB fusion protein In order to obtain PTD-UQCRB fusion protein, six bacterial strains for protein expression were tested. Of the six strains, the strains were chosen because BL21 starpLysS showed excellent ability in expression of PTD-UQCRB fusion protein compared to other strains (FIG. 3A). PTD-UQCRB fusion proteins are difficult to establish expression conditions because of their hydrophobic nature. Despite the difficulty of expressing this PTD-UQCRB fusion protein, BL21 starpLysS expressed the protein in a dissolved form at a low temperature of 18 ° C. by IPTG induction. After induction with IPTG, the cultured E. coli showed green fluorescence due to the expression protein tagged with EGFP (FIG. 3B).
  • Hphl PTD is originally known to pass its fusion partner through all cell membranes including the blood-brain barrier (BBB).
  • BBB blood-brain barrier
  • UQCRB is encoded in the nucleus and is a component of mitochondrial complex III (2). This means that UQCRB can have a mitochondrial-target sequence, and 1-35 amino acids predicted from these sequences out of a total of 111 amino acids constituting UQCRB by the actual MitoProt II 1.0a4 software serve as mitochondrial target signals. It is likely to play a role.
  • the PTD-UQCRB fusion protein is directed toward the mitochondria, and co-staining with mitochondria using the mitotracker of the present invention confirmed this possibility.
  • Terfestacin a small molecule targeted to UQCRB, is known to inhibit mitochondrial R0S generation and low HIF-la stability at low oxygen conditions (15).
  • Intracellular R0S development under hypoxic conditions is primarily due to complex III of the mitochondrial respiratory chain. Since UQCRB is not only a target of terfestasin but also a subunit of complex III of the mitochondrial respiratory chain, the inventors hypothesized that the introduction of PTD-UQCRB would generate R0S and affect HIF-la stability. I checked it
  • PTD-UQCRB lacking UQCRB was used as a control (FIG. 7B).
  • PTD-UQCRB significantly reduced HIF-la protein. While stabilized, PTD-EGFP did not show any effect on HIF-la stability.
  • HIF-1 activation process is multistep, the binding of the HIF-1 complex to the HIF-1 reactive promoter should be considered along with the HIF-la protein stability.
  • hypoxic-reactive element (HRE) reporter gene analysis was performed using HepG2 cells (FIG. 8).
  • HRE- hypoxic-reactive element
  • HIF-1 a is a critical regulatory step of the HIF-1 a target gene.
  • VEGF is a major target of HIF-la and plays an important role in hypoxic-induced angiogenesis. Therefore, the effect of PTEKJQCRB on VEGF expression was analyzed for HeLa cells (FIG. 9A) and HepG2 cells (FIG. 9B). Delivery of PTD-UQCRB for both cell lines increased the amount of VEGF protein dependently, which is in contrast to the control (FIG. 9C).
  • PTD-UQCRB lacking UQCRB was used as a control (FIG. 9D).
  • PTD-UQCRB significantly induced VEGF
  • PTD-EGFP did not show any significant effect on VEGF expression.
  • CM condit ioned medium
  • CM in all-free medium was concentrated by filtration to prepare in distilled water.
  • CM from HeLa cells incubated with PTD-UQCRB strongly activated the invasion of HUVECs.
  • the data clearly indicate that PTD-UQCRB is an efficient tool for exploring the biological function of UQCRB.
  • Rats were euthanized 14 days after surgery and subjected to histological or immunohistochemical analysis (FIG. 10B).
  • the epidermal thickness of the regenerated site can be measured by HE, MT staining and staining with involukrin antibody.
  • the epidermal thickness is about twice that of PTD-EGFP or PBS.
  • Thickly regenerated FIG. 10C.
  • the results of immunohistochemical staining using SMA showed that the number of small arteries was generated in the PTD-UQCRB treated group.
  • the mitochondrial complex III-derived ROS as the PTD-UQCRB fusion protein passes through the cell
  • the mitochondrial R0S thus induced stabilizes HIF-la by inhibiting HHD hydroxylase PHD, and stabilized HIF-la can lead to dimers with HIF- ⁇ .
  • a target gene such as VEGF is transcribed to induce angiogenesis (FIG. 11). This finding may extend to therapeutic applications such as wound healing due to angiogenesis enhancement or limb formation in diabetic mouse models.
  • PTEHJQCRB further studies will be available to detect changes in HIF-la stability and VEGF expression after treatment of PTD-UQCRB with terfestas in cells.
  • T.Mit ochondr i a 1 comp lex III is requ ired for hypox i a ⁇ i nduced R0S production and cellular oxygen sensing.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드 및 그를 포함하는 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드는 매우 효과적으로 세포막을 통과하여 혈관신생을 유도할 뿐만 아니라 세포 독성을 일으키지도 아니하므로 허혈성 질환의 예방 및 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드 및 그를 포함하는 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물
【기술 분야】
본 발명은 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드 및 그를 포함하는 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
【배경 기술】
허혈이란, 혈관이 협착 또는 수축하거나, 정상적인 혈관 생성이 충분히 이루어지지 않아 혈류의 공급이 중단되어 세포 손상이 일어나는 부분적 혈액 부족 증상을 말한다. 대표적인 허혈성 질환의 하나인 만성적 허혈성 심장질환의 경우， 심근에 혈액을 공급하는 관상 순환계의 이상으로 심근이 층분한 양의 산소와 영양분을 받지 못해서 흉통， 심부전으로 인한 호흡곤란， 허약감， 실신 등의 증상을 수반하는데, 최근 발생빈도가 급격히 증가하고 있다. 또한， 모근 및 모낭에 혈액의 공급이 원활하지 못하게 되면 모낭의 형성 즉 모발 형성이 되지 않아 탈모자 백발증을 유발할 수 있다. 그 밖에도, 허혈로 인한 혈핵 공급의 중단은 허혈성 심부전， 허혈성 장염， 안질환, 허혈성 하지질환 등의 각종 허혈성 질환을 유발하게 된다. 따라서， 혈관신생을 유도하여 이러한 허혈성 질환을 치료하고자 하는 시도들이 있다. VEGF( vascular Endothelial Growth Factor:혈관내피세포 성장인자)는 내피세포에 특이적인 유사분열 촉진제로서， 호모 다이머 구조를 가진 당단백질이다. 사람에는 발현된 단백질의 아미노산 길이에 따라 4가지 유사체가 존재하며, VEGF-121, 165는 분비 단백질이고， VEGF-189, 206은 세포 표면이나 세포 외 기질에서 프로테오글리칸을 포함한 헤파린에 결합하여 성장인자로 작용한다. VEGF와 결합하는 대표적인 수용체에는 Flt- l(Fmlᅳ like tyrosine kinaseᅳ 1)과 KDR(kinase domainᅳ containing receptor)이 있다. 이들은 모두 내피세포에서 발현하며， Flt-1은 주로 세포의 이동， 세포와 세포간의 상호작용에 관여하고， KDR은 세포증식과 생존에 관여한다. VEGF는 수용체와의 결합에 의한 신호전달을 통해서 내피세포의 증식과 이동， 모세혈관의 형성과 같은 혈관신생 (angiogenesis)을 일으키고， 이는 배아 발생 동안에 기관의 발생과 분화뿐만 아니라 상처의 재생에 필수적이다. VEGF가 혈관신생을 유도한다는 사실은 당업자에게 있어 널리 알려진 사실이며 여러 문헌 (Bruce I. et al , VEGF and Tumor Angiogenesis , Einstein Quart . J . Biol . and Med. 18:59ᅳ 66(2001)； Oettgen P, The role of ets factors in tumor angiogenesis, J Oncol., 2010:767384. Epub 2010 May 4; Berse B. et al , Vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) gene is expressed differentially in normal tissues, macrophages , and tumors , Mol Biol Cell., 3(2) :211-20(1992))에 의해 명백히 뒷받침되고 있다. 따라서， VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)를 직접 투여하여도， 혈관신생을 유도하여 허혈성 질환을 치료할 수 있다. 그러나， VEGF만을 단독으로 투여하는 것만으로는 기저막 분열， 상피세포의 증식, 이동 및 분화를 포함하는 혈관신생의 모든 단계를 효과적으로 유도할 수 없으므로 자연적인 혈관신생보다 덜 조직적으로 혈관신생이 일어나게 된다. 자연적으로는 저산소증이 혈관 신생을 유도한다고 알려져 있으므로, 저산소증의 조절자를 사용한다면 하나 또는 그 이상의 혈관신생인자의 생성을 동시에 자극할 수 있으며 그 결과 개별인자가 유도하는 것보다 더 조직적이고 건강하게 혈관신생을 유도할 수 있으리라 기대되고 있다. 한편， 미토콘드리아 복합체 m의 구성요소 중 하나인 UQCRB은 혈관신생을 저해하는 저분자 화합물인 터페스타신 (terpestacin)의 표적 단백질이다 (1, 15). 구체적으로， UQCRB은 핵 내에 인코딩되어 있으며 (2)， 복합체 III 구조를 조립하고 이를 유지하는데 중요한 역할을 한다 (3). 또한， UQCRB는 간암 및 위암에서 과발현되며, 저혈당증, 락트산 산성증 및 근질환과 같은 여러 질병과 관련이 있다 (4).
여러 보고에 의하면, 미토콘드리아 호흡 체인의 복합체 III는 세포 내 산소 감지를 통해 활성산소종 (R0S: reactive oxygen species)을 생성하여， 저산소-유도성 혈관신생 조절에 있어 중요한 역할을 수행한다 (5- 8). 저산소 상태에서 미토콘드리아 복합체 III에 의해 생성된 R0S는 혈관신생의 주 조절자인 저산소-유도인자 l-a(HIF-la; hypoxi -inducible factor l-α) 단백질올 안정화시킨다 (9) (도 1). 저산소-유도인자 (HIF)는 저산소 상태에서 세포 생존 및 혈관신생 개시에 중요한 역할을 하는 점에서 주목 되어왔다 (10-11). HIF는 HIF-la 및 HIF-Ιβ의 헤테로 다이머 복합체로 구성되는데， 특히 HIF-la 단백질은 혈관 내피세포 증식인자 (VEGF)와 같은 호-혈관신생 인자 발현의 개시를 일으킨다 (13-14). 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다. 【발명의 내용】
【해결하려는 과제】
본 발명자들은 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물의 개발을 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 UQCRB를 세포 내로 운반할 수 있는 신규한 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드를 설계하고， 상기 PTIHJQCRB 융합 폴리펩타이드가 혈관신생을 효과적이면서도 안전하게 일으킴을 확인함으로써， 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 PTEHJQCRB 융합 폴리펩타이드를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드의 발현 백터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드 생산 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드를 포함하는 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다. 본 발명의 또 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
【과제의 해결수단】
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 단백질 전달 도메인 (PTD)의 아미노산 서열 및 인간 UQCRB(Ubiquino卜 cytochrome c reductase binding protein)의 아미노산 서열을 포함하는 PTD—UQCRB 융합 폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명자들은 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물의 개발을 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 UQCRB를 세포 내로 운반할 수 있는 신규한 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드를 설계하고， 상기 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드가 혈관신생을 효과적이면서도 안전하게 일으킴을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 융합 폴리펩타이드는 단백질 전달체 (protein transduction domain: PTD)에 융합된 UQCRB(Ubiquinol— cytochrome c reductase binding protein)를 포함하는 PTD-UQCRB융합 폴리펩타이드이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "PTD JQCRB 융합 폴리펩타이드" 는 단백질 전달체 (PTD)의 C-말단 또는 N-말단에 UQCRB가 융합된 융합 폴리펩타이드를 의미한다.
본 발명의 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드의 구성요소 중 하나인 UQCRB은 혈관신생을 저해하는 저분자 화합물인 터페스타신 (terpestacin)의 표적 단백질이다 (15). 구체적으로， UQCRB은 핵 내에 인코딩되어 있으며， 복합체 m 구조를 조립하고 이를 유지하는데 중요한 역할을 한다. 본 발명자들은 UQCRB의 세포 내 도입이 미토콘드리아 내 활성산소종 (R0S) 발생을 유도하고 HIF-la를 안정화시킴을 밝혀내었다.
본 발명의 바람직한 구현 예에서， 상기 인간 UQCRB의 아미노산 서열은서열목록 제 1서열로 표시되는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 융합 폴리펩타이드에 이용되는 단백질 전달체 (protein transduction domain: PTD)는 UQCRB의 세포 내로의 유입을 보다 효과적으로 하기 위하여 부가된 것이다. 상기 단백질 전달체에 의하여， 본 발명의
UQCRB는 수지상 세포에 수용체 (receptor) 및 수송체 (transporter) 의존적 방식으로 세포막을 통과한다. 즉， 세포 흡수 작용 (pinocytosis), 식세포 작용 (phagocytosis) 및 수용체 -매개 세포내 취입 작용 (endocytosis)이 아닌 세포막 투과 기작을 통해 유입된다. 따라서， UQCRB의 세포 내로의 유입이 다른 기전과 비교하여 보다 효율적으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 단백질 전달체는 Hphl, Tat, 페네트라틴 (Penetratin), 트랜스포탄 (Transportan), VP— 22， 양쪽 친매성 펩타이드 (Amphipathic peptides), MPG, Pep-1, MAP, SAP, PPTG1, 양이온성 펩타이드 (Cat ionic peptides), 을리고알기닌 (01 igoarginine)， hCT(9-32) , SyrB 및 Pvec를 포함하는 펩타이드이다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 상기 단백질 전달체는 서열목록 제 2 서열의 아미노산서열을 가지는 Hphl이다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 (a) 단백질 전달 도메인 (PTD)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (b) 인간 UQCRB ( Ubi qui no 1—cytochrome c reductase binding protein)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드의 발현 백터를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "뉴클레오타이드" 는 DNA 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라， 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980)； Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543—584(1990)).
본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 상기 인간 UQCRB를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 3 서열로 표시되는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드의 발현 백터에서 상기 인간 UQCRB(Ubiquinolᅳ cytochrome c reductase binding protein)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 서열목록 제 3 서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함한다. 실질적인 동일성은， 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고， 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에， 최소 8OT의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성， 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
본 발명의 바람직한 다른 구현예에서, 상기 단백질 전달 도메인 (PTD)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 4 서열로 표시되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드를 효율적으로 발현하게 하기 위하여 PTD 인코딩 뉴클레오타이드 서열과 UQCRB 인코딩 뉴클레오타이드 서열은 적합한 발현 컨스트럭트 (expression construct) 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 컨스트력트에서， 상기 PTD 인코딩 뉴클레오타이드 서열과 UQCRB 인코딩 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다.
본 발명의 발현 컨스트럭트는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며， 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 본 발명의 백터는 전형적으로 발현을 위한 백터로서 구축될 수 있다. 또한， 본 발명의 백터는 바람직하게는 원핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.
본 발명의 백터가 발현 백터이고, 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는， 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터， lac 프로모터, lacUV5 프로모터， lpp 프로모터， pLx프로모터, pRx프로모터， rac5 프로모터 , amp 프로모터， recA 프로모터 , SP6 프로머터， trp 프로모터 및 T7 프로모터 등)， 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사 /해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우， E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C. , J. Bacteriol. , 158： 1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pi/프로모터 , Herskowitz, I. and Hagen, D. , Ann. Rev. Genet., 14 :399-445(1980))가조절 부위로서 이용될 수 있다. 한편, 본 발명에 이용될 수 있는 백터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSClOl, ColEl, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등)， 파지 (예: Xg XB, λ -Charon, λ Δζΐ 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
본 발명의 백터는 그로부터 발현되는 본 발명의 융합 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여， 필요에 따라 다른 서열과 융합될 수도 있으며， 융합되는 서열은 예컨대， 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 백터에 의해 발현된 융합 단백질은 친화성 크로마토 그래피， 바람직하게는 HisPur 코발트 수지 친화성 크로마토그래피 또는 Ni-친화성 컬럼에 의해 정제된다.
한편， 본 발명의 발현 백터는 선택표지로서， 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며， 예를 들어 암피실린, 겐타마이신， 카베니실린， 클로람페니콜, 스트랩토마이신， 카나마이신， 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 숙주세포를 상기 PTD-UQCRB융합 폴리펩타이드의 발현 백터로 형질전환 시키는 단계; 및 (b) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 PTD JQCRB 융합 폴리펩타이드를 수집하는 단계를 포함하는 PTD-UQCRB융합 폴리펩타이드를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 백터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대， E. coli JM109, E. coli BL2KDE3), E. coli RRl, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주， 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 바람직하게는 starpLysS E. coli이다.
본 발명의 백터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은， CaCl2 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973))， 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al . , Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110- 2114(1973)； 및 Hanahan, D. , J. Mol. Biol., 166：557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16 :6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.
숙주 세포 내로 주입된 백터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며， 이러한 경우에는 다량의 본 발명의 융합 단백질을 얻게 된다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 (a) PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드의 약제학적 유효량 ； 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드는 서열목록 제 1 서열로 표시되는 아미노산 서열 및 서열목록 제 2서열로 표시되는 아미노산서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 유효성분인 상기 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드가 세포 속을 통과할 때， 미토콘드리아 복합체 III-유래 R0S 발생이 유도된다. 미토콘드리아 R0S는 HIF 하이드록실라제인 PHD를 억제하여 HIF-la를 안정화시킨다. 안정화된 HIF-la는 HIF-Ιβ와 다이머를 이를 수 있고， 이러한 헤테로 다이머 복합체는 핵 내로 이동하여 HRE 프로모터에 결합한다. 결과적으로， VEGF와 같은 타겟 유전자가 전사되어 혈관신생을 유도할 수 있다. 실제 실험결과, 본 발명의 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드는 정상 산소 조건에서도 혈관 내피세포 증식인자 (VEGF)의 발현을 유도하여 혈관신생을 유도하는 것으로 확인되었다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물이 적용되는 질환인 허혈성 질환은 허혈성 심장질환， 허혈성 심근경색， 허혈성 심부전， 허혈성 장염， 허혈성 혈관질환, 허혈성 안질환, 허혈성 망막증， 허혈성 녹내장， 허혈성 신부전， 허혈성 대머리， 허혈성 뇌졸중 및 허혈성 하지질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
용어， "약제학적 유효량 " 은 혈관 신생을 적절히 유도하여 상기 허혈성 질환 치료제의 약리학적 효과를 나타내는 데 필요한 양을 의미한다 . 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서， 락토스 , 덱스트로스 , 수크로스, 솔비를， 만니를， 전분， 아카시아 고무， 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴， 규산 칼슘， 미세결정성 샐를로스, 폴리비닐피를리돈， 셀를로스， 물， 시럽， 메틸 셀를로스， 메틸히드록시밴조에이트, 프로필히드록시벤조에이트， 활석, 스테아르산 마그네슴 및 미네랄 오일 등을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제， 습윤제， 감미제， 향미제， 유화제， 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed. , 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있고， 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입， 근육 주입， 복강 주입， 경피 투여 등으로 투여할수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법， 투여 방식， 환자의 연령， 체중, 성, 병적 상태, 음식， 투여 시간， 투여 경로， 배설 속도 및 반웅 감웅성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001- 100 mg/kg (체중)이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라， 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 액스제， 분말제, 과립제, 정제 또는 캅샐제 형태일 수도 있으며， 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
( i ) 본 발명은 PTIHJQCRB 융합 폴리펩타이드 및 그를 포함하는 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
(H) 본 발명의 PTEHJQCRB 융합 폴리펩타이드는 매우 효과적으로 세포막을 통과하여 혈관신생을 유도할 뿐만 아니라 세포 독성을 일으키지도 아니하므로 허혈성 질환의 예방 및 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1. 저산소 및 정상산소 상태에서 HIF의 조절에 대한 개략적 도식
미토콘드리아 전자 전달 체인에서 발생된 R0S는 저산소 상태에서
HIF-la를 안정화시킨다. PHD: 프를릴 하이드록시라제, FIH: HIF 억제 인자， VHL: 폰 히펠 린다우. 도 2. PTD-UQCRB융합 단백질의 유전자클로닝
(A) 좌: PTD-UQCRB의 DNA 컨스트럭트， 우: 제한효소 절단 후 DNA 젤 전기영동 이미지
(B) 서브클로닝 된 DNA 컨스트럭트의 서열. 보라색: PTD 서열, 청색: 제한효소부위 (첫번째: EcoRI를 위한 GAATTC, 두번째: Xh이를 위한 CTCGAG), 적색: UQCRB 전장 유전자. 도 3. PTD-UQCRB융합 단백질의 발현 및 정제
(A) PTD-UQCRB 융합 단백질 시리즈를 BL21 세포주에서 발현하였다 (B: BL21, S: BL21 starpLysS, P: BL21 pLysS) - PTD-UQCRB 융합 단백질의 분자량은 43 kDa이었다.
(B) IPTG유도에 의해 녹색 형광을 발하는 배양된 BL21 starpLysS.
(C) IPTG 유도 후 EGFP로 태그된 발현된 PTD-UQCRB 융합 단백질과 결합한 Ni-NTA 아가로스 비드.
(D) 정제된 PTD-UQCRB융합 단백질 (43 kDa). 도 4. PTD-UQCRB융합 단백질의 세포 내 위치
(A) 1시간 동안 0.5 μΜ의 PTD-UQCRB 융합 단백질을 ΗΊΊ080 세포 내로 도입한 후에 , PTD-UQCRB 포함 상등액을 제거하였다. 세포를 그 즉시 고정시키고， 공초점 현미경을 사용하여 PTD-UQCRB 융합 단백질의 위치를 확인하였다 (NT: non-treated, PC: phase contrast). 스케일 바, 20 .
(B) 1시간 동안 2 μΜ의 PTD-UQCRB 융합 단백질을 HT1080 세포 내로 도입한 후에， PTD-UQCRB 포함 상등액을 제거하였다. 세포를 고정하고 Hoechst 및 미토트랙커로 염색하고 공초점 현미경을 사용하여 PTD-UQCRB 융합 단백질의 위치를 관찰하였다 (NT: non-treated). 스케일 바， 20 μαι. 도 5. FIIKJQCRB의 세포 성장에 대한 생물학적 영향
세포 성장은 ΜΤΤ 색도 분석법을 사용하여 HeLa 세포, HepG2 세포 및
HUVEC 세포에서 관찰하였다. 데이터는 3개의 독립적인 실험값의 평균士 SD을 나타낸다. 도 6. 미토콘드리아 R0S발생에 대한 PTIHJQCRB의 효과
MitoSOXTM으로 20분간 선-처리하고 2시간 후 PTD-UQCRB 또는 안티마이신 A로 처리한 HeLa 세포 내 미토콘드리아 R0S 레벨을 MitoSOXTM 형광을 사용하여 측정하였다. 두시간 배양 후， 세포를 고정하고 Hoechst로 염색하였다. 이미지를 HCS 시스템 소프트웨어로 정량화하였다.
(A) 4 μΜ의 PTD-UQCRB로 처리한 후 미토콘드리아 R0S 탐지를 위한 형광 이미지 (NT: non-treated),
(B) 한 세포의 평균 강도에 대한 막대 그래프.
(C) HCS 시스템에 의해 얻은 이미지의 정량화. 청색 원: 핵， 녹색 원: 세포질 (HCS 시스템 시스템 소프트웨어는 세포의 핵을 인식하고 핵으로부터 고정된 면적을 설정하여 세포질 면적을 결정한다).
(D) 양성적 대조군으로서 10 //g/ ^의 안티마이신 A를 HeLa 세포에 처리하였다 (NT: non-treated, Ant: antimycin A). 막대 그래프는 형광의 총 강도를 나타낸다. 데이터는 3개의 독립적 실험의 평균값士 SD으로 나타내었다. 도 7. HIF-1 α 안정성에 대한 PHHJQCRB의 영향
(A) HIF-1 α 단백질 레벨은 PTD-UQCRB(2 및 4 yM)으로 4시간 또는 12시간 동안 처리한 HeLa 세포 내 웨스턴 블롯 분석법을 사용하여 측정하였다 (NT: non-treated). 하부 그래프는 밀도측정기로 측정한 웨스턴 블롯 분석에 대한 정량적 데이터를 나타낸다. 데이터는 3개의 독립적 실험에 대한 평균값土 SD으로 나타내었다.
(B) HIF-la 단백질 레벨은 PTD-UQCRB(2 및 4 μΜ) 및 대조군으로서 PTD- EGFP(2 및 4 μΜ)을 24시간 동안 처리한 HeLa 세포 내 웨스턴 블롯 분석법을 사용하여 측정하였다 (NT: non-treated). 하부 그래프는 밀도측정기로 측정한 웨스턴 블롯 분석에 대한 정량적 데이터를 나타낸다. 데이터는 3개의 독립적 실험에 대한 평균값土 SD으로 나타내었다. 도 8. PITHJQCRB에 의한 HRE수용체 유전자 발현 활성의 정량적 분석
HepG2 세포는 일시적으로 HRE-루시페라제 DNA 백터로 형질전환하였다. 세포를 PTD-UQCRB (1 및 2.5 μΜ)로 4시간 동안 처리하였다 (NT: non- treated). 생물학적 활성을 비교하기 위하여 루시페라제 발광을 시험하였다. 데이터는 3개의 독립적 실험에 대한 평균값土 SD으로 나타내었다. 도 9. VEGF 발현에 있어 FTO JOCRB의 영향
PTD-UQCRB(2 및 4 μΜ)으로 12 또는 24시간 동안 처리한 세포 내 VEGF 단백질 레벨을 웨스턴 블롯으로 분석하였다 (NT: non-treated).
(A) HeLa 세포 내 VEGF 유도
(B) HepG2 세포 내 VEGF유도
(C) 막대 그래프는 밀도측정기로 측정한 웨스턴 블롯 분석에 대한 정량적 데이터를 나타낸다. 데이터는 3개의 독립적인 실험값의 평균士 SD을 나타낸다.
(D) PTD-UQCRB(2 및 4 μΜ) 및 대조군으로서 PTD-EGFP(2 및 4 μΜ)으로
24시간 동안 처리한 HeLa 세포 내 VEGF 단백질 레벨을 웨스턴 블롯으로 분석하였다 (NT: non-treated). 낮은 패널은 밀도측정기로 측정한 웨스턴 블롯 분석에 대한 정량적 데이터를 나타낸다. 데이터는 3개의 독립적인 실험값의 평균土 SD을 나타낸다.
(E) HUVEC 내 PTD-UQCRB의 혈관신생에 대한 영향. HeLa 세포는 CM을 수집하기에 앞서 올 프리 배지에서 12시간 또는 24시간 동안 PTEHJQCRB(2 및 4 μΜ)로 처리하였다 (NT: non-treated). HUVEC는 CM에서 16시간 배양하였고, 세포 형태를 사진 그래프화 하였다. 수집된 CM은 HUVEC의 침입을 유도하였다. 대조군 및 VEGF를 양성적 대조군으로 사용하였다.
(F) 밀도분석기를 이용한 침습 분석. 데이터는 3개의 독립적인 실험값의 평균士 SD을 나타낸다. 도 10. 도식 FTO-UQCRB의 생체 내 상처 치유 효과
BALB/c nude(n=7) 마우스에서의 상처 봉합 효과를 한 가지 실험군 (PTD-UQCRB)과 두 가지 대조군 (PTD-EGFP, PBS)으로 나누어 분석하였다.
(A) 상처 형성 수술 후 9일이 지난 뒤의 사진과 수술 후 3일 간격으로 확인한 상처 크기의 정량적 분석 결과.
(B) 상처 형성 수술 후 14일 째의 상처 치유 부위의 조직학 또는 면역조직학적 염색 결과 (H-E: 해마록실린 및 에오신 염색, M-T: 마손트리크롬 염색， SMA: 평활근 α-액틴). 각 그림 상의 화살표들은 표피의 두께 (H-E, Μ-Τ, 인볼루크린) 또는 소동맥 (SMA)을 가리킨다.
(C) 재생된 표피 두께의 정량적 분석.
(D) 상처가 치유된 부위의 소동맥 수의 정량적 분석 . 도 11. PTD-UQCRB기능에 대한 개략적 도식
PTD-UQCRB융합 단백질이 세포 속을 통과할 때, 미토콘드리아 복합체 III-유래 R0S 발생이 유도된다. 미토콘드리아 R0S는 HIF 하이드록실라제인 PHD를 억제하여 HIF-la를 안정화시킨다. 안정화된 HIF-la는 HIF_113와 다이머를 이를 수 있고， 이러한 헤테로 다이머 복합체는 핵 내로 이동하여 HRE 프로모터에 결합한다. 결과적으로， VEGF와 같은 타겟 유전자가 전사되어 혈관신생을 유도할 수 있다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서， 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 실시예 실험재료 및 방법
1. Fn>-UQCRB 융합 단백질의 분자적 클로닝 , 발현 및 정제
박테리아로부터 PTD-UQCRB를 얻기 위하여 , UQCRB의 PCR-증폭 전장 cDNA( access ion no. NM_006294)를 pRSET—B를 포함하는 세포 투과성 단백질 도입 도메인 (Hphl domain, 연세대학교 이상규 교수 제공)의 EcoRI/XhoI 부위에 삽입하였다. PTD-UQCRB 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드로 형 질전환시킨 BL2KDE3) starpLysS E. col i 균주 ( Invitrogen, NY, USA)를 앰피실린 (50 ug/mL) 및 클로앰페니콜 (34 pg/mL)을 포함하는 37°C의 LB(Luria-Bertani ) 배지에서 600 nm에서의 흡광도가 0.6이 될 때까지 배양하였다. 0.1 M의 IPTGGsopropy卜 β-D—thiogalactopyranoside)로 단백질 발현을 유도하고 세포를 16시간 동안 추가적으로 배양하였다. 세포를 원심분리로 수집하고 라이시스 완층액 (50 mM Na¾P04, 300 mM NaCl , 10 mM 이미다졸 , 프로테아제 억제제 칵테일 정 제 , pH 8.0)에 재현탁시키고， 초음파로 분쇄하였다. 그 다음 13,000 rpm, 4°C에서 15분간 원심분리하고， 상층액에 Ni-NTA 아가로스 비드 (Qiagen, Hi lden, Germany)를 첨가하고 4°C에서 2시간 동안 배양하였다. 비드와 배양한 후， 상층액을 폴리 -프렙 컬럼 (Bio-Rad, Hercules , CA, USA)에 걸었다. 결합단백질을 세척 완층액 (50 mM NaH2P04, 300 mM NaCl , 20 mM 이미다졸 , pH 8.0)으로 씻어내고 용리 완층액 (50 mM NaH2P04, 300 mM NaCl , 250 mM 이미다졸， pH 8.0)으로 용리하였다. 용리된 단백질을 PD-10 세파덱스 G-25(GE Healthcare, Buckinghamshire , UK)를 사용하여 탈염하고 10% 글리세를을 보충하여 등분으로 분배한 후 -20°C에서 순간적으로 동결시켰다 .
2. 세포 배양
HeLa 세포를 10% 우태아혈청 (FBS, Gibco-BRL, Grand Island, NY,
USA)올 보층한 DMEM(Dulbecco' s modi f ied eagle medium, Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)에서 배양하였다. 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC: Human umbi l ical vein endothel ial cel l )를 10% FBS을 보층한 내피 세포 기저 배지 (EBM-2, Cambrex Walker svi 1 le, MD, USA)로 코팅 된 젤라틴 플레이트에 접종하였다. HepG2 세포는 10% FBS을 보층한 RPMKRoswel l Park Memorial Inst itute) 1640 배지 (RPMI , Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)에서 배양하였다. HT1080 세포는 10% FBS을 보층한 MEM 배지 (Minimum essential medium, Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)에서 배양하였다. 상기 세포들은 5% C02가 공급되는 습한 배양기에서 유지배양되었다.
3. 형광 이미지화
PTD-UQCRB 위치를 모니터하기 위하여, HeLa 세포를 4 μΜ 의 PTD~ UQCRB와 함께 1시간 동안 배양하고 세포를 4% 포름알데하이드 (Sigma, St. Louis, M0)로 고정하였다. PBS로 세정한 후， 세포를 1 /^g/m£ Hoechst 용액 및 0.5 s/nd 미토트랙커 (Mitotracker) 용액으로 30분 동안 공동 염색하였다. 마지막으로 세포를 증류수로 세척하고 공초점 현미경 (Carl Zeiss LSM 510 META, Germany)으로 관찰하였다.
4. 세포성장분석
HUVEC는 10% FBS으로 보층한 EBM-2에서 37 °C 및 5¾ C02의 습한 대기환경에서 배양하였다. HeLa세포는 HUVEC와 동일한 조건에서 FBS으로 보층한 DMEM에서 배양하였다. 세포성장은 3-(4，5-디메틸티아졸- 2-일) -2 ,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 (MTT) 분석법을 사용하여 측정하였다. 세포 (3 X 103 세포 /웰)를 96-웰 배양 플레이트에 접종하고 안정화를 위해 24시간 동안 배양하였다. 다양한 농도의 PTD-UQCRB를 각 웰에 첨가하고 2일간 배양한 후 ΜΊΤ 분석을 수행하였다. 50 ^의 MTT(2 mg/mi 저장액， Sigma)를 첨가하고 플레이트를 추가적인 4시간 동안 배양하였다。 배지를 제거한 후 100 의 DMS0를 첨가하였다. 플레이트를 유니버설 마이크로플레이트 리더 (Bio-Tek Instruments, Inc. , Winooski , VT, USA)를 사용하여 540 nm에서 읽었다.
5. 미토콘드리아 R0S의 측정
미토콘드리아 R0S 레벨을 적 미토콘드리아 수퍼옥사이드 인디케이터인 MitoS0X™(Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 측정하였다. HeLa 세포는 현미경 커버 유리 (Decklaser , Lauda-
Konlgshofen, Germany) 상에서 배양하였고 1 μΜ의 MitoSOX™로 처리하였다. 37°C에서 20분간 배양한 후 세포를 PBS로 세척하고 PTD-UQCRB 처리하고 다시 37°C에서 2시간 동안 배양하였다. PBS로 세척한 후 샘플을 1 /zg/ 의 Hoechst 용액으로 염색하여 핵을 시각화하였다. 세포를 PBS로 세척하고 4¾ 포름알데하이드로 37°C에서 15분간 고정하였다. PBS 세척 3시간 후， 샘플을 마지막으로 증류수로 세척하고, 형광 현미경 (Olympus America, Inc., Melville, NY, USA)에 탑재하여 관찰하였다.
6. SDS-PAGE및 웨스턴 블롯 분석법
6-웰 플레이트에서 배양한 HeLa 세포를 용해하고， 용출액을 10% SDS-PAGE로 분리한 후 표준 전기블롯 절차에 따라 PVDF 막 (Milipore, Bedford, MA)으로 이전시켰다. 블롯을 블록시키고 항 -HIF-la(BD,
Bedford, MA, USA), 항_\ 17(331 3 Cruz, Santa Cruz, CA, USA,) 및 항- 튜블린 (Upstate, Lake Placid, NY) 항체를 포함하는 일차 항체를 사용하여 4°C에서 밤새 면역 표지하였다. 항체 표지는 ECUenhanced chemi luminescence) 키트 (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)를 사용하여 제조사 지시에 따라 탐지하였다.
7. HRE수용체 유전자 분석
HepG2 세포는 10% FBS로 보층한 DMEM에서 37 °C 및 5% C02 조건 하에서 배양하였다. 형질전환 시약인 리포펙타민 LTXUnvitrogen, NY, USA)를 사용하여 제조사 지시에 따라 세포를 형질전환시키기 24시간 전에 세포를 6-웰 플레이트에 접종하였다. 정상 산소 조건은 5% C02 조건으로 설정된 반면, 저산소 조건은 N2"02-C02 배양기 내에서 2% 02 및 5% C02 조건으로 37°C에서 4시간 동안 수행되었다. 루시페라제 리포터 분석 (HRE- luciferase)올 위한 리포터 플라스미드 컨스트럭트는 후토시 시바사키 박사 (Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science, Japan)가 제공해주었다. HepG2 세포는 배양 24시간 후 0.5 ug 컨스트럭트로 형질전환시키고 수집한 후 라이시스 완층액 (50 mM Tris, 150 mM NaCl , 10% glycerol, 0.5% Triton X-100, pH 8.0)으로 용출시키고 원심분리하였다. 세포 용출액에 대하여 Steady-Glo®루시페라제 분석 시스템 (Promega, Madison, WI , USA)을 사용하여 루시페라제 활성을 측정하고 상기 활성을 FL600 마이크로플레이트 형광 리더 (Bio— Tek Instrument, Inc. , Winooski , VT, USA)를 사용하여 읽었다.
8. 침습 분석
8.0 im 공극 크기 폴리카보네이트 필터 삽입물 (Corning Costar,
Cambridge, MA)을 구비한 트랜스웰 챔버 시스템을 사용하여 HUVEC의 침입능력을 인 비트로에서 시험하였다. 필터의 저면은 10 ^의 젤라틴 (1 mg/mL, Sigma, MO, USA)으로 코팅한 반면， 상층면은 10 ^의 매트리젤 (3 mg/mL, BD, Bedford, MA, USA)으로 코팅하였다. HUVEC 세포 (lxlO5 세포)를 필터의 상층면에 위치시키고 CM 배지 (conditioned medium)를 저면에 적용하였다. 그 다음 챔버를 37°C에서 16시간 동안 배양하고 메탄올로 고정시킨 후 헤마록실린 및 에오신 (Sigma, M0, USA)으로 염색하였다. 필터의 저면 상에 침습한 세포를 xlOO 배율의 광학 현미경으로 관찰하였다. 9. 상처 형성 및 치료
5주령 쥐 (BALB/c nude female, Orient bio, Korea)의 등에 1.5 x 1.5 cm2 너비를 갖는 사각형 모양으로 피부를 제거하여 상처를 만들었다. 수술 과정 동안， 트리브로모에탄을 (Avertin®, 250 mg/kg)의 복강 내 투여를 통해 쥐들을 마취하고， 케토프로펜 (Ketoprofen, 0.1 mg/kg)을 피하에 주사하여 진통 효과를 주었다. 또한， 진통제는 수술 후 4일 동안 24시간 간격으로 계속 투여하여 고통을 경감시켰다. PTD-UQCRB, PTD-EGFP 및 PBS (n=7)의 세 군을 설정하여 실험을 진행하였고， 200 의 PTD가 태그된 융합 단백질들 또는 PBS를 피브린 메트릭스 (Greenplast, Greencross PD Co. , Korea)와 섞어 상처 부위에 발라주었다. 단백질 처리 후， 상처 부위를 Tegaderm(3M Health Care, USA)으로 드레싱하였다. 모든 동물실험은 연세대학교 실험동물 연구센터의 승인을 받아 진행되었다.
10. 조직학또는 면역조직학적 분석
쥐들은 수술 뒤 2주 후에 안락사시키고， 재생된 부위의 조직을 얻어 조직학 또는 면역조직학적 분석을 수행하였다, 이를 위해, 샘플들을 1 (v/v) 포름알데히드에 고정시키고, 파라핀으로 임베딩하였다. 그 후 샘플들은 4 ym 두께로 얇게 잘라 헤마록실린 및 에오신 (H-E), 마손트리크롬 (Masson's trichrome, M-T)의 두가지 조직학적 방법으로 염색하였다. 또한 샘플들은 항 -인볼루크린 (Abeam, Cambridge, UK) 및 항- 평활근 α-액틴 (Abeam) 항체를 1차 항체로 쓰고， 디아미노벤지딘 키트 (DAB substrate kit, Vector laboratories, USA)를 이용하는 방법으로 가시화하는 면역조직학적 방법으로 염색하였다.
11. 표피 두께의 측정
표피 두께의 측정은 표피 마커인 인볼루크린의 면역조직학 염색을 거친 샘플과 H-E 및 M-T 두 종의 조직학 염색을 거친 샘플에서 촬영된 사진 당 상처 부위 세 지점의 두께를 측정함으로써 이루어졌다. 모든 정량적 분석의 결과는 평균 ± 표준편차로 표현하였다.
실험결과
1 FTO-UQCRB융합단백질의 생성 .
1.1 FTO-UQCRB DNA컨스트릭트의 유전자클로닝
터페스타신 -결합 미토콘드리아 단백질 (UQCRB)의 생물학적 기능을 연구하기 위하여， 세포 투과성 UQCRB을 발현하는 DNA 컨스트럭트를 디자인하였다 (도 2A). UQCRB의 전장 유전자를 단백질 전달 도메인 (PTD)의 유전자를 포함하는 pRSET-B 발현 백터에 서브클로닝하였다. 상기 단백질 전달 도메인의 유전자는 그의 융합 파트너를 세포 속으로 전달할 수 있도록 세포 투과성 펩타이드 (Hphl)를 인코딩한다. 또한 Ni-NTA를 이용한 단백질 정제를 위해 6x His 태그를 삽입하였고， PTEKJQCRB 융합 단백질의 세포 내 전달을 탐지하기 위하여 증진된 녹색 형광 단백질 (EGFP)도 포함시켰다. PTD-UQCRB DNA 컨스트럭트가 적절하게 구성되었는지를 확인하기 위하여 이를 제한 효소인 ccRI 및 으로 절단하였다. 그 다음 DNA 젤 전기영동을 수행하여 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2A를 보면， 그 제한 효소 부위에 따라 UQCRB가 올바르게 PTD-포함 백터 내로 삽입되었음을 확인할 수 있다. 또한 도 2B를 보면， PTD-UQCRB DNA 컨스트럭트를 시뭔싱한 결과 PTD 및 UQCRB가 완벽하게 삽입되었음을 확인할 수 있다. 1.2 PTD-UQCRB융합단백질의 발현 및 정제
PTD-UQCRB 융합단백질을 얻기 위하여， 단백질 발현을 위한 6개의 박테리아 균주를 시험하였다. 6개의 균주 중， 다른 균주와 비교하여 BL21 starpLysS가 PTD-UQCRB 융합 단백질의 발현에 있어 탁월한 능력을 나타냈기 때문에 상기 균주를 선택하였다 (도 3A). PTD-UQCRB 융합 단백질은 그의 하이드로포빅한 성질 때문에 발현 조건을 설정하기가 까다로운 단백질이다. 이러한 PTD-UQCRB 융합 단백질 발현의 어려움에도 불구하고， BL21 starpLysS는 IPTG 유도에 의해 18 °C의 낮은 온도에서 용해된 형태로 상기 단백질을 잘 발현해냈다. IPTG로 유도 후， 상기 배양된 E. coli 는 EGFP로 태그된 발현 단백질로 인하여 녹색 형광을 나타내었다 (도 3B). 또한 세포 용출액의 상등액을 비드와 함께 2시간 배양시키자， Ni-NTA 아가로스 비드에서도 녹색 형광이 탐지되었다 (도 3C). PTD-UQCRB 융합 단백질은 완층액을 포함하는 이미다졸을 사용하는 일련의 표준 정제 과정을 통하여 정제되었고 그 다음 탈염 과정을 거치었다. 이미다졸은 탈염과정을 통해 제거되었고 정제된 PTD-UQCRB 융합 단백질을 SDS-PAGE를 사용하여 확인한 결과 잘 발현되고 정제된 PTEKJQCRB 융합 단백질을 43 kD 밴드에서 확인할 수 있었다 (도 3D). 2. PTD-UQCRB융합 단백질의 세포내 전달
PTD-UQCRB 융합 단백질의 세포 내 기능을 분석하기 전, 그 단백질의 세포 내 이동 능력올 시험하였다. 세포 내 PTD~UQCRB 융합 단백질 위치를 결정하기 위하여, 공초점 현미경 분석법을 수행하였다. 미토콘드리아 디텍터인 Hoechst 및 미토트래커와 공동 염색한 EGFP를 사용하여， ΗΊ080 세포 내 PTD-UQCRB 융합 단백질의 막투과 능력을 관찰하였다. 도 4에서 볼 수 있듯이, PTD-UQCRB 융합 단백질로 처리한 샘플에서 1시간 이내에 녹색 형광이 탐지되었는데, 이는 대조군과 비교되는 것이다. 상기 결과는 PTD-UQCRB 융합 단백질이 세포 속으로 전달될 수 있음을 의미한다.
놀랍게도， 녹색 형광은 핵보다는 세포질 내에서 주로 탐지되었다. Hphl PTD은 본래 그의 융합 파트너를 BBB(blood-brain barrier)를 포함하는 모든 세포막을 통과시키는 것으로 알려져 있다. 그러나， 상기와 같은 현상은 UQCRB의 특성에서 비롯된 것이다. 앞서 언급한 바와 같이， UQCRB는 핵에 인코딩되어 있으며 미토콘드리아 복합체 III의 한 구성요소이다 (2). 이는 UQCRB가 미토콘드리아 -타겟 서열을 가질 수 있음을 의미하며， 실제 MitoProt Π土 1.0a4 소프트웨어에 의할 때 UQCRB를 구성하는 총 111개의 아미노산 중 이들 서열로 예측되는 1-35개의 아미노산이 미토콘드리아 타겟 시그날로서의 역할을 할 가능성이 크다. 이러한 점에서 PTD-UQCRB 융합 단백질은 미토콘드리아를 향하는 것이며， 본 발명의 미토트래커를 사용한 미토콘드리아와의 공동 염색 결과는 이러한 가능성을 확인해 주었다.
3. 세포 성장에 대한 FTO-UQCRB융합 단백질의 영향
PTD-UQCRB 융합 단백질의 세포 내 활성을 조사하기 앞서， PTEHJQCRB 융합 단백질이 세포 성장에 미치는 영향을 체크하는 것이 중요한데， 만일 상기 융합 단백질이 세포에 독성을 나타낸다면 이를 실제 세포에 적용하기 곤란하기 때문이다ᅳ PTD-UQCRB 융합 단백질의 세포 성장에 대한 영향을 시험하기 위하여， 다양한 포유류 세포주에 대하여 MTT 색도 분석을 수행하였다. 3가지 다른. 농도의 PTEHJQCRB 융합 단백질을 세포에 처리하고 2일간 배양한 다음 MTT 분석을 수행하고 그 결과를 도 5에 나타내었다. 그 결과 PTD-UQCRB 융합 단백질의 도입은 세포 성장에 그 어떠한 중대한 영향도 나타내지 않았다.
4ᅳ 미토콘드리아 R0S 발생에 대한 PTIHJQCRB의 영향
UQCRB을 타겟으로 하는 작은 분자인 터페스타신은 저 산소 조건에서 미토콘드리아 R0S 발생을 억제하고 및 HIF-la 안정성을 저해하는 것으로 알려져 있다 (15). 저 산소 조건하 세포 내 R0S 발생은 일차적으로 미토콘드리아 호흡 체인의 복합체 III에 의한 것이다. UQCRB가 터페스타신의 타겟일 뿐만 아니라 미토콘드리아 호흡 체인의 복합체 III의 서브유닛이기도 하기 때문에, 본 발명자들은 PTD-UQCRB의 도입이 R0S 발생시키고 HIF-la 안정성에 영향을 줄 것이라는 가설을 세우고 이를 실험을 통해 확인해 보았다ᅳ
본 발명자들은 PTD-UQCRB가 복합체 III-유래 R0S 발생을 변경시키는지 여부를 시험하기 위하여， HeLa 세포의 미토콘드리아 R0S을 적 미토콘드리아 수퍼옥사이드 지시자인 MitoSOX™를 사용하여 결정하였다. 미토콘드리아 내에서 MitoSOX™시약은 미토콘드리아 수퍼옥사이드에 의해 산화되어 붉은 형광색을 나타낼 수 있다. 실험 결과， 태그된 EGFP에 의한 녹색 형광에 의해， PTD-UQCRB가 세포 내로 운반된 것을 확인 할 수 있었다 (도 6A). PTD-UQCRB 전달은 증가된 적색 형광에 의해 표시되는 것과 같이 미토콘드리아 R0S 레벨의 증가를 유발하였다. 게다가， PTD- UQCRB 농도가 증가함에 따라 미토콘드리아 R0S 레벨도 증가하는 것이 관찰되었다 (도 6B). 또한, 산화적 스트레스를 유발하는 소분자인 안티마이신 A도 대조군과 비교하여 세포 내 R0S 레벨을 증대시켰다. 결국, PTD-UQCRB가 복합체 III-유래 R0S 발생을 유도한다는 사실을 확인할 수 있었다.
5. HIF-1 α 안정성에 대한 PTIHJQCRB의 영향
세포 내 R0S가 증가하면 HIF-la의 안정도가 증진되고 VEGF의 발현이 유도된다. 또한， 미토콘드리아에서의 저 산소 -유도 R0S 생성은 저 산소- 의존성 HIF-l a 축적을 위해 필요충분하다 (6 및 24-28). 따라서， 본 발명자들은 HeLa 세포 내 HIF-la 안정성에 대한 PTD-UQCRB의 영향을 조사하였다. 정상 산소 조건 하 HIF-la 단백질은 자연적으로 분해되지만， HeLa 세포 내로 PTD-UQCRB을 4시간 동안 도입한 결과 양 의존적으로 HIF- la 단백질이 축적되었다 (도 7A). 그러나， PTD-UQCRB 처리 12시간 후에는 4시간후와 비교하여 HIF-la 단백질이 덜 유도되는 것으로 관찰되었다.
HIF-la 안정성에 대한 PTD-UQCRB의 신규한 생물학적 활성을 밝히기 위하여， UQCRB를 결여한 PTD~EGFP를 대조군으로서 사용하였다 (도 7B) · 기대한 바와 같이 PTD-UQCRB가 HIF-la 단백질을 현저하게 안정화 시킨 반면， PTD-EGFP는 HIF-la 안정성에 대한 그 어떠한 영향도 나타내지 않았다.
HIF-1 활성화 과정은 다단계로 이루어지기 때문에, HIF-1 복합체의 HIF-1 반응성 프로모터에 대한 결합은 HIF-la 단백질 안정성과 함께 고찰되어야 한다. 이를 시험하기 위하여, 저산소-반응성 요소 (HRE) 리포터 유전자 분석법을 HepG2 세포를 사용하여 수행하였다 (도 8). HRE- 루시페라제 DNA 백터로 일시 적으로 형 질전환시 킨 세포로의 PTD-UQCRB 도입은 저산소 조건과 동일한 정도의 높은 활성을 유도하였다. 이 러한 결과는 정상 산소 조건 하에서 미토콘드리아 R0S에 의한 HIF-l a 안정화로 인해 HIF-Ιβ 와의 다이 머 형성 이 촉진되고， 활성화된 전사 복합체를 형성시켜 이들이 핵 내로 전달되어 HIF-1 반웅성 프로모터에 결합함으로써 VEGF와 같은 다운스트림 유전자를 발현하게 할 수 있음을 암시한다 . 아래에서는 이를 실험을 통해 확인해보았다.
6. 정상 산소 조건 하 VEGF 발현에 대한 FIIHJQCRB 융합 단백질의 영향
이 전에 언급한 바와 같이 HIF-l a 의 안정 화는 HIF-l a 타겟 유전자의 중대한 조절 단계이다. VEGF는 HIF-l a 의 주요 타겟이고 저산소-유도성 혈관신생에 있어서 중요한 역할을 수행한다 . 그러므로 , VEGF 발현에 대한 PTEKJQCRB의 영 향을 HeLa 세포 (도 9A) 및 HepG2 세포 (도 9B)에 대하여 분석하였다. 두 세포주 모두에 대하여 PTD-UQCRB의 전달은 양 -의존적으로 VEGF 단백질 레벨을 증가시켰으며 , 이는 대조군과 대비되는 것 이다 (도 9C) .
VEGF 유도에 대한 PTD-UQCRB의 신규한 생물학적 활성을 확인하기 위하여， UQCRB를 결여한 PTD-EGFP을 대조군으로서 사용하였다 (도 9D) . 그 결과 PTD-UQCRB는 현저하게 VEGF를 유도한 반면 , PTD-EGFP는 VEGF 발현에 그 어떠한 중요한 영향도 나타내지 않았다 .
그 다음， PTEKJQCRB의 혈관 신생 활성을 조사하기 위하여， 각각의 배양 조건에서 배양된 HeLa 세포로부터의 CM (condit ioned medium)을 수집하여 인 비트로 혈관신생 분석을 수행하였다 (도 9E) . 올 프리 배지 내 CM을 여과로 농축하여 증류수에 준비하였다. PTD-UQCRB와 함께 배양된 HeLa 세포로부터의 CM는 HUVEC의 침습을 강하게 활성화시 켰다. 결국 상기 데이터들은 PTD-UQCRB가 UQCRB의 생물학적 기능을 탐구하는데 있어 효율적 인 도구임을 명 백히 나타내고 있다.
7. PTD-UQCRB 융합 단백질의 생체 내 상처 치유에 대한 효과
앞서 세포 내에서 확인된 효과적 인 혈관 신생 활성을 기반으로， PTD- UQCRB 융합 단백질이 생체 내에서도 작용할 수 있는지 평가하기 위하여， 혈관 신생 효과를 생체 내에서 확인하는데 주로 이용하는 상처 치유 모델에 적용하여 실험하였다. 5주령의 BALB/c 누드 마우스의 등에 상처를 만들고， 피브린 메트릭스와 흔합한 PTD- 융합 단백질들을 처리하는 방식으로 상처를 치료하였다. PTEKJQCRB의 음성적 대조군인 PTD-EGFP와 PBS 처리군은 상대적으로 상처 봉합의 속도가 느림을 알 수 있다 (도 10A). 또한 PTEh UQCRB의 처리는 수술 후 6일에서 9일 사이에 매우 효율적인 상처 봉합 활성을 나타내었다. - 수술 후 14일째에 쥐들을 안락사 시키고 조직학적 또는 면역조직학적 분석을 실시하였다 (도 10B). H-E, M-T 염색과 인볼루크린 항체를 통한 염색을 통해 재생된 부위의 표피 두께를 측정할 수 있는데， PTD-UQCRB를 처리하였을 때 표피 두께가 PTD-EGFP 또는 PBS를 처리한 경우보다 약 2배 정도 두껍게 재생되었다 (도 10C). 또한 SMA를 이용한 면역조직학적 염색 결과를 살펴보면， PTD-UQCRB의 처리군에서 소동맥의 수가 더 많이 생성되어 있었다. 이를 정량적으로 나타내었을 때， 다른 두 음성적 대조군에 비해 PTD-UQCRB의 처리는 隱 2 당 약 3-4배 정도 소동맥 수가 많이 생성된 것이 확인되었으며 (도 10D), 이는 곧 PTD-UQCRB가 생체 내에서 혈관신생을 효과적으로 촉진하였음을 의미한다. 이상의 결과들은 PTD-UQCRB의 처리가 생체 모델 동물 실험계에서도 혈관신생 및 상처치유에 효과적인 활성을 발휘함을 제시하며 새로운 혈관신생유도제로 적용될 수 있음을 시사한다.
추가논의
본 발명자들은， 세포 내 UQCRB 전달을 달성하기 위하여 신규한 PTD- UQCRB 융합 단백질올 구성하였다ᅳ 그리고， 미토콘드리아 복합체 III에 대한 세포 내 활성을 측정하기 위하여, 정제된 PTD-UQCRB를 세포에 처리하였다. 항-혈관신생 인자 터페스타신의 타겟 단백질인 UQCRB는 미토콘드리아 복합체 III의 구성요소이기 때문에， PTD-UQCRB의 도입은 혈관신생을 유도할 것으로 기대되었다. 실제로, PTD-UQCRB 처리는 미토콘드리아 수퍼옥사이드의 발생을 유도하고, HIF-la의 안정성 또한 증진시켰다. 게다가， PTD-UQCRB 도입은 인 비트로에서 VEGF의 발현 및 HUVEC의 침습을 유도하였다. 상기 실험결과들을 종합해보면， PTD-UQCRB 융합 단백질이 세포 속을 통과할 때 미토콘드리아 복합체 III-유래 ROS 발생이 유도되며, 이렇게 발생된 미토콘드리아 R0S는 HIF 하이드록실라제인 PHD를 억제하여 HIF-la를 안정화시키고， 안정화된 HIF-la는 HIF-Ιβ와 다이머를 이를 수 있고, 이러한 해테로 다이머 복합체는 핵 내로 이동하여 HRE 프로모터에 결합하여 결과적으로， VEGF와 같은 타겟 유전자가 전사되어 혈관신생을 유도한다는 사실을 확인할 수 있었다 (도 11). 이러한 발견은 혈관신생 증진으로 인한 상처 치료 또는 당뇨병 마우스 모델에서의 사지 형성과 같은 치료적 적용에까지 확장될 수 있다. 또한 PTEHJQCRB의 특이적인 생물학적 활성을 더욱 깊이 확인하기 위해， 터페스타신과 함께 PTD-UQCRB를 세포에 처리한 후 HIF-la 안정성 및 VEGF 발현의 변화를 탐지하는 추가 연구가 가능할 것이다.
결론적으로， 본 발명의 모든 연구 결과는 PTD-UQCRB가 UQCRB의 세포 내 활성을 시험 할 수 있는 의미 있는 수단일 수 있음을 제시한다. 게다가， 상기 결과들은 혈관신생과 관련 있는 R0S 발생을 매개하는 PTD~ UQCRB의 미토콘드리아에 대한 작용에 대한 통찰을 제공할 것이며 생물학적으로 활성 있는 단백질 개발을 위한 PTD 적용에 대해 새로운 기초를 열 것이다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서， 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 참고문헌
1. Jung, H. J. , Lee, H. B. , Kim, C. J. , Rho, J. R. , Shin, J.
& Kwon, H. J. Ant i -angiogenic activity of terpestacin, a bicyclo sesterterpene from Embellisia chlamydospora. J Antibiot (Tokyo) 56， 492-496 (2003).
2. Suzuki , H. , Hosokawa , Y. , Toda, H. , Nishikimi , M. & Ozawa, T. Cloning and sequencing of a cDNA for human mitochondrial ubi qui noneᅳ binding protein of com lex III . Biochem Biophys Res Commun 156， 987-994 (1988),
3. Hemrika, W.， De Jong, M., Berden, J. A. & Grivell, L. A. The C-t erm i nus of the 14-kDa subun it of ubiquinolᅳ cy t ochrome~c oxidoreductase of the yeast Saccharomyces cerevisiae is involved in the assembly of a functional enzyme . Eur J Biochem 220, 569-576 (1994).
4. Haut , S. , Br i vet , M.， Touat i , G.， Rustin, P., Lebon , S. , Garcia-Cazor la, A. , Saudubray, J. M. , Bout r on, A. , Legrand, A. & Slama, A. A deletion in the human QP-C gene causes a complex III deficiency resulting in hypoglycaemia and lactic acidosis. Hum Genet 113， 118-122 (2003).
5. Guzy， R . D . & Schumacker， P. T. Oxygen sens i ng by mitochondria at com lex III: the paradox of increased reactive oxygen species during hypoxia. Exp Physiol 91， 807-819 (2006).
6. Guzy, R. D. , Hoyos , B. , Robin, E. , Chen, H. , Liu, L. , Mansfield, K. D.， Simon, M. C.， Hammer 1 ing, U. & Schumacker， P.
T.Mit ochondr i a 1 comp lex III is requ ired for hypox i aᅳ i nduced R0S production and cellular oxygen sensing. Cell Metab 1， 401-408 (2005).
7. Drose, S. & Brandt， U. The mechanism of mitochondrial superoxide production by the cytochrome bcl complex. J Biol Chem 283， 21649-21654 (2008).
8. Schumacker， P. T. Current paradigms in eel hilar oxygen sensing. Adv Exp Med Biol 543， 57-71 (2003),
9. Chandel , N. S. , McCl intock, D. S. , Fel iciano, C.E., Wood, T. M. , Melendez, J. A., Rodriguez, A. M. & Schumacker, P. T. Reactive oxygen spec i es generat ed at mit ochondr i a 1 com lex III stabi 1 ize hypox i aᅳ i nduc ible factor-lal ha dur i ng hypox i a : a mechan ism of 02 sensing. J Biol Chem 275, 25130-25138 (2000).
10. Semenza， G. L . H I Fᅳ 1 : med i at or of phys iological and pathophysiological responses to hypoxia. J Appl Physiol 88, 1474-1480 (2000).
11. Iyer, N. V. , Kotch, L. E., Agani , F. , Leung, S. W., othe
30
2 tran
20hm
-
15
Figure imgf000027_0001
0rou S..oos 1 Ln W K D. <¾ SSZW G..I1 L
.oste3 Frh A. Ja. 1in OT H ceua 0 ts rllllreno.ocat2in Pr Nl
Hdinucillrt fac:s a bws cre 1 iihl i3il-ll>
,,.a G. Wn L Jia..ue 12n B H R ypysrtost:wss ho hni> hxi
p.do M G. uua a ckvrttwcellrnlmll o 0lf2- TOW,:, ,,,,,aushn E W1a.. L H. Gassmnn M D. Law.l A--" 20. Patel, L. N. , Zaro, J. L. & Shen, W. C. Cell penetrating peptides: intracellular pathways and pharmaceutical perspectives. Pharm Res 24, 1977-1992 (2007).
21. Frankel, A. D. & Pabo, C. 0. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus . Cell 55, 1189-1193 (1988) .
22. Morris, M. C. , Depollier, J., Mery, J. , Heitz, F. & Divita, G. A peptide carrier for the delivery of biological ly active proteins into mammalian cells. Nat Biotechnol 19， 1173-1176 (2001) .
23. Choi, J. M., Ahn, M. H. , Chae, W. J., Jung, Y. G. , Park, J. C. , Song, H. M. , Kim, Y. E.， Shin, J. A., Park, C. S. , Park, J. W.,
Park, T. K. , Lee, J. H., Seo, B. F., Kim, K. D., Kim, E. S. , Lee, D. H. , Lee, S. K. & Lee, S. K. Intranasal delivery of the cytoplasmic domain of CTLA-4 using a novel protein transduction domain prevents allergic inflammation. Nat Med 12, 574-579 (2006).
24. Chandel , N. S. , Maltepe, E. , Goldwasser , E. , Mathieu, C.
E. , Simon, M. C. & Schumacker, P. T. Mitochondrial reactive oxygen species trigger hypoxia— induced transcription. Proc Nat 1 Acad Sci U S A 95, 11715-11720 (1998).
25. Kl imova, T. & Chandel, N. S. Mitochondrial complex III regulates hypoxic activation of HIF. Cell Death Differ 15， 660-666
(2008).
26. Brunei le, J. Kᅳ， Bell, E. L. , Quesada, N. M. , Vercauteren, K. , Tiranti , V. , Zeviani , M. , Scarpul la, R. C. & Chandel, N. S. Oxygen sensing requires mitochondrial R0S but not oxidative phosphorylation. Cell Metab 1， 409-414 (2005) .
27. Mansfield, K. D., Guzy, R. D., Pan, Y. , Young, R. M., Cash, T. P. , Schumacker , P. T. & Simon, M. C. Mitochondrial dysfunction resulting from loss of cytochrome c impairs cellular oxygen sensing and hypoxic HIFᅳ alpha activation. Cell Metab 1, 393-399 (2005).
28. Lin, X. , David, C. A., Donnelly, J. B., Michael ides, M. , Chandel , N. S. , Huang, X. , Warrior , U. , Weinberg, F. , Tormos , K. V. , Fesik, S. W. & Shen, Y. A chemical genomics screen highlights the essential role of mitochondria in HIF-1 regulation. Proc Nat 1 Acad Sci U S A 105, 174-179 (2008).

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
단백질 전달 도메인 (PTD)의 아미노산 서열 및 인간 UQCRB Jbiquinol- cytochrome c reductase binding protein)의 아미노산 서열을 포함하는 PTD-UQCRB융합 폴리펩타이드.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서, 상기 인간 UQCRB의 아미노산 서열은 서열목록 제 1 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
【청구항 3]
제 1 항에 있어서， 상기 단백질 전달 도메인은 Hphl, Tat, 페네트라틴 (Penetratin), 트랜스포탄 (Transportan)， VP-22, 양쪽 친매성 펩타이드 (Amphipathic peptides), MPG, Pep-1, MAP, SAP, PPTG1, 양이온성 펩타이드 (Cationic peptides), 올리고알기닌 (Oligoarginine), hCT(9-32), SyrB 및 Pvec으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
【청구항 4】
제 1 항에 있어서, 상기 단백질 전달 도메인은 서열목록 제 2 서열의 아미노산서열을 가지는 Hphl인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
【청구항 5】
(a) 단백질 전달 도메인 (PTD)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (b) 인간 UQCRB (Ubi qui no 1一 cytochrome c reductase binding protein)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드의 발현 백터.
【청구항 6]
제 5 항에 있어서, 상기 인간 UQCRB를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목톡 제 3서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 발현 백터.
【청구항 7】
제 5 항에 있어서， 상기 단백질 전달 도메인 (PTD)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 4 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 발현 백터.
【청구항 8]
다음의 단계를 포함하는 PTE JQCRB 융합 폴리펩타이드를 생산하는 방법:
(a) 숙주세포를 제 5 항의 발현 백터로 형질전환 시키는 단계; 및
(b) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드를 수집하는 단계.
【청구항 9】 .
(a) PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드의 약제학적 유효량 ； 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
【청구항 10]
제 9 항에 있어서， 상기 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드는 서열목록 제 1 서열로 표시되는 아미노산 서열 및 서열목록 제 2 서열로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 111
제 9 항에 있어서, 상기 허혈성 질환은 허혈성 심장질환， 허혈성 심근경색， 허혈성 심부전, 허혈성 장염, 허혈성 혈관질환, 허혈성 안질환， 허혈성 망막증， 허혈성 녹내장， 허혈성 신부전， 허혈성 대머리， 허혈성 뇌졸중 및 허혈성 하지질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물. 【청구항 12】
제 9 항에 있어서， 상기 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드는 혈관신생을 유도하는 것을 특징으로 하는 조성물.
PCT/KR2011/004015 2010-06-01 2011-06-01 Ptd-uqcrb 융합 폴리펩타이드 및 그를 포함하는 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물 WO2011152662A2 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13/701,492 US8729021B2 (en) 2010-06-01 2011-06-01 PTD-UQCRB fusion polypeptide, and pharmaceutical composition for preventing and treating ischemic diseases, containing same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100051892A KR101278221B1 (ko) 2010-06-01 2010-06-01 Ρｔｄ－ｕｑｃｒｂ 융합 폴리펩타이드 및 그를 포함하는 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물
KR10-2010-0051892 2010-06-01

Publications (3)

Publication Number Publication Date
WO2011152662A2 true WO2011152662A2 (ko) 2011-12-08
WO2011152662A9 WO2011152662A9 (ko) 2012-04-19
WO2011152662A3 WO2011152662A3 (ko) 2012-06-07

Family

ID=45067192

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2011/004015 WO2011152662A2 (ko) 2010-06-01 2011-06-01 Ptd-uqcrb 융합 폴리펩타이드 및 그를 포함하는 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물

Country Status (3)

Country Link
US (1) US8729021B2 (ko)
KR (1) KR101278221B1 (ko)
WO (1) WO2011152662A2 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10287331B2 (en) 2013-04-15 2019-05-14 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Mitochondrial proteins constructs and uses thereof
KR101644599B1 (ko) * 2014-10-14 2016-08-16 연세대학교 산학협력단 미토콘드리아 단백질 uqcrb 관련 질환 유전자발현 세포 구축 및 이를 활용한 uqcrb 기능조절 활성평가계 구축

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090033878A (ko) * 2006-07-24 2009-04-06 포휴먼텍(주) 허혈성 질환의 완화 및 치료를 위한 약학 조성물 및 그를 전달하기 위한 방법
KR20090121724A (ko) * 2008-05-22 2009-11-26 한양대학교 산학협력단 아폽토시스 저해용 조성물
EP2184292A1 (en) * 2008-11-10 2010-05-12 Ulrich Kunzendorf Anti-Apoptotic Fusion Proteins

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030062788A (ko) * 2002-01-19 2003-07-28 포휴먼텍(주) 생체분자 전달 펩타이드 ｍｐｈ1-ｂｔｍ 및 이것을포함하는 생명공학제품
KR100653726B1 (ko) * 2004-11-01 2006-12-04 이미옥 Ｎｕｒ77 유전자의 활성자를 포함하는 신규한 혈관신생제

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090033878A (ko) * 2006-07-24 2009-04-06 포휴먼텍(주) 허혈성 질환의 완화 및 치료를 위한 약학 조성물 및 그를 전달하기 위한 방법
KR20090121724A (ko) * 2008-05-22 2009-11-26 한양대학교 산학협력단 아폽토시스 저해용 조성물
EP2184292A1 (en) * 2008-11-10 2010-05-12 Ulrich Kunzendorf Anti-Apoptotic Fusion Proteins

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JUNG, H. ET AL. J BIOL CHEM. vol. 285, no. 15, 09 February 2010, pages 11584 - 11595 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20130072432A1 (en) 2013-03-21
KR20110132077A (ko) 2011-12-07
US8729021B2 (en) 2014-05-20
KR101278221B1 (ko) 2013-06-24
WO2011152662A3 (ko) 2012-06-07
WO2011152662A9 (ko) 2012-04-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Di Natale et al. Nucleophosmin contains amyloidogenic regions that are able to form toxic aggregates under physiological conditions
CA2638913A1 (en) Phosphatase inhibitor protein-1 as a regulator of cardiac function
Rothe et al. Characterization of the cell-penetrating properties of the Epstein-Barr virus ZEBRA trans-activator
KR102060411B1 (ko) 세포 침투성 펩타이드, 이를 포함하는 융합 화합물 및 이 융합 화합물을 포함하는 약학 조성물
JP7072508B2 (ja) 変異型ｐ５３と関連している疾患、障害または病状の処置におけるペプチドおよびその使用
Chang et al. Cell-permeable mitochondrial ubiquinol–cytochrome c reductase binding protein induces angiogenesis in vitro and in vivo
Kono et al. Nucleoplasmic lamin C rapidly accumulates at sites of nuclear envelope rupture with BAF and cGAS
Zhang et al. Stearylated antimicrobial peptide [D]-K6L9 with cell penetrating property for efficient gene transfer
JP2015536658A (ja) 標的化イズロン酸−２−スルファターゼ化合物
EP2056868B1 (en) Inhibition of angiogenesis, tumorigenesis and cathepsin activity using insulin-like growth factor binding protein
Yepuri et al. DIAPH1-MFN2 interaction regulates mitochondria-SR/ER contact and modulates ischemic/hypoxic stress
Mirski et al. Identification of functional nuclear export sequences in human topoisomerase IIα and β
JP4130955B2 (ja) 有酸素条件下の細胞内でタンパク質を不安定化させるポリペプチドとそれをコードするｄｎａ
WO2011152662A2 (ko) Ptd-uqcrb 융합 폴리펩타이드 및 그를 포함하는 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물
Lim et al. ATP6V0C competes with von Hippel-Lindau protein in hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) binding and mediates HIF-1α expression by bafilomycin A1
WO2001093897A2 (en) Angiostatin and endostatin binding proteins and methods of use
JP2008530029A (ja) 神経保護剤およびそれらの使用方法
CN112088163A (zh) 微肽及其用途
US20140303093A1 (en) Micro-utrophin polypeptides and methods
JP4869685B2 (ja) Ｒａｂ２７Ａ不活性化剤
WO2018073409A1 (en) Specific ac5 inhibitor
JP2006515168A (ja) 細胞におけるペルオキシソームカタラーゼ機能の促進
JP2006515168A5 (ko)
CN113195704A (zh) 用于治疗癌症的肽治疗剂及其用途
KR20150055246A (ko) 빌리버딘 환원효소 ａ 융합단백질을 함유하는 피부염증 치료용 약학 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11790020

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13701492

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 11790020

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2