KR20090121724A

KR20090121724A - 아폽토시스 저해용 조성물

Info

Publication number: KR20090121724A
Application number: KR1020080047761A
Authority: KR
Inventors: 김용희; 탄조우이; 이상경; 황기철; 최동훈; 반홍석; 김장경
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2008-05-22
Filing date: 2008-05-22
Publication date: 2009-11-26
Also published as: KR101090209B1

Abstract

본 발명은 아폽토시스 저해용 조성물에 관한 것이며, 더 구체적으로는 단백질 전달 도메인과 Hsp27의 융합 단백질을 포함하는 세포 아폽토시스 저해용 조성물 및 단백질 전달 도메인과 Hsp27의 융합 단백질이 온도 가역성 겔과 혼합되어 구성된 아폽토시스 조절이상 질환의 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르는 조성물은 세포 내에서 효과적으로 내인적 및 외인적 아폽토시스 모두를 저해할 수 있을 뿐 아니라, 생체 내에서도 비정상적인 아폽토시스 기능에 의하여 유발되는 아폽토시스 조절이상으로 인한 질환의 치료에 큰 효과를 가진다.

아폽토시스, Hsp27, 온도 가역성 겔

Description

아폽토시스 저해용 조성물{COMPOSITION FOR INHIBITING APOPTOSIS}

본 발명은 아폽토시스 저해용 조성물에 관한 것이며, 더 구체적으로는 단백질 전달 도메인과 Hsp27의 융합 단백질을 포함하는 세포 아폽토시스 저해용 조성물 및 온도 가역성 겔로 구성된 복합 코아세르베이트를 더 포함하는 아폽토시스 조절이상 질환의 치료용 조성물에 관한 것이다.

아폽토시스는 유전적으로 조절되는 프로그램된 세포 사멸이다. 인간 질병의 절반 가량은 비정상적 아폽토시스와 밀접하게 관련되어 있는데(B. Fadeel 및 S. Orrenius, Journal of Internal Medicine 258 (2005) 479-517), 과도한 아폽토시스는 알츠하이머병 같은 신경퇴행성 질환, 허혈성 심장병, 자가면역 질환 및 AIDS를 포함하는 감염성 질환에 이르기도 한다(N. Singh, S. Anand, ndian J. Exp . Biol . 32 (1994) 843-847). 아폽토시스는 크게 두 가지 경로로 나누어질 수 있는데, 미토콘드리아 조절 내인성 경로와 외인성 경로가 그것이다. 외인성 경로에서는 리간드에 의하여 유도되는 사멸 리셉터(Daxx와 FADD)의 활성화로부터의 사멸 유도 신호전달 복합체(death inducing signaling complex: DISC)의 어셈블리 및 그로 인한 프로테아제인 캐스파제(caspase)-8 및 캐스파제-10의 활성화가 개입된다. 상기 프로 테아제들의 활성화는 캐스파제-3의 절단을 활성화하여 캐스파제 연쇄반응 경로의 하류로 진행시킨다(U. Sartorius et al., Chembiochem 2 (2001) 20-29). 다른 세포 타입에서는, 활성화된 리셉터로부터 오는 신호는 세포 사멸이 단행될 정도로 강한 캐스파제 신호전달 연쇄반응을 생성하지 않는다. 이 경우, 미토콘드리아 의존적 아폽토시스 경로를 통하여 신호가 증폭될 필요성이 있다. 이 경로에서 캐스파제-8은 Bid를 활성화하여 미토콘드리아로 전위시켜 시토크롬 c를 세포질 내로 배출한다. 시토크롬 c는 Apaf-1과 상호작용하고 Apaf-1은 캐스파제-9을 활성화하고, 순서대로 캐스파제 의존적 경로를 활성화한다(E. A. Slee et al, J. Cell Biol . 144 (1999) 281-292). 미토콘드리아는 내인성 아폽토시스 경로에서 조절자로서 핵심적인 역할을 하는데, 여기서는 세포 손상이 DNA 손상, 저산소증, 세포 스트레스 또는 화학치료제에 의하여 매개된 경우(A. Ashkenazi, Nature Reviews Cancer 2 (2002), 420-430) 미토콘드리아의 붕괴가 SMAC/DIABLO 및 시토크롬 c를 세포질 내로 배출할 것이다.

열 충격 단백질(heat shock protein) HSP27은 작은 Hsp(sHsp) 패밀리에 속하는 것으로서 다양한 스트레스에 반응하여 대부분 유도된다. 분자적 샤프론(chaperone)으로서, Hsp27은 변성된 단백질의 응집을 저해하고 재 폴딩(folding)을 촉진하는 (M. Ehrnsperger et al., Embo J. 16 (1997) 221-229) 한편, 아폽토시스 신호전달 경로의 여러 단계에서 강한 항-아폽토시스 성질 및 기능을 갖는다(C. Garrido, Cell Death Differ . 9 (2002) 483-485). 사이토졸 내의 시토크롬 c와 상호작용에 의하여 캐스파제-9 전구체의 활성화를 네거티브하게 조절하고(J. M. Bruey et al., Nat Cell Biol . 2 (2000) 645-652) 아폽토좀 (apoptosome)의 형성을 방해하는 것으로 보고되었다(C. G. Concannon et al., Gene Expr . 9 (2001) 195-201). 게다가, Hsp27은 캐스파제-3 전구체 분자와 상호작용함으로써 캐스파제-3 활성을 저해할 수 있는 것으로 나타났다. 외인성 경로에서는, Hsp27은 Daxx와 상호작용하여 Fas-매개 세포 사멸을 막는다(S. J. Charette et al., Mol Cell Biol . 20 (2000) 7602-12).

효율적 기능을 갖기 위하여, Hsp27은 아폽토시스 경로의 시토크롬 c, Daxx 및 캐스파제-3 전구체와 상호작용에서 효력을 나타내기 위하여 세포 내로 전달되어야 한다. 단백질 전달 도메인(PTD)은 다양한 분자를 세포로 운반하는데 유용한 도구이다(M. Zhao, R. Weissleder, Med . Res . Rev . 24 (2004) 1-12). 가장 일반적으로 사용되는 PTD는 HIV 유래 Tat(49-57)의 염기성 도메인인데, 이것에 의해 전달되는 물질은 효율적으로 전달되고 제 기능을 발휘한다는 것이 시험관 내 및 생체 내에서 잘 증명되어 있다. 한편, Vives 등은 Tat 단백질의 전위를 위한 핵심 성분은 아르기닌이 풍부한 단편 때문이라고 보고하였다(E.Vives, P. Brodin 및 B. Lebleu, J. Biol . Chem. 272 (1997) 16010-160017). Wender 등은 연속 9개의 아르기닌으로 이루어진 펩티드 (9R)의 흡수가 Tat보다 더 효율적임을 증명하였고(P. A. Wender et al., PNAS 97 (2000) 13003 - 13008) 최근 연구에서는 11개의 폴리아르기닌(11R)과 융합된 단백질이 효율적으로 세포막을 통과하는 것이 증명되었다.

본 발명에서 사용되는 염화 코발트(CoCl₂) 및 스토로스포린(staurosporine) 은 각각 두 가지 상이한 아폽토시스 경로를 유도하는데 통상적으로 사용되는 시약이다. CoCl₂는 저산소증/허혈-모방 약제로서 보고되어있는데, 미토콘드리아 의존성 기작을 통하여 활성 산소 종 (ROS) 생성을 촉진하며(J.Y. Jung 및 W.J. Kim, Neuroscience Letters 371 (2004) 85-90), 저산소증은 ROS 증가가 개입된 미토콘드리아 의존성 신호전달 과정을 통하여 전사를 활성화한다. 몇몇 연구에서 스토로스포린이 강한 아폽토시스 촉진성 약제인 것으로 증명되었는데, 스토로스포린은 세포에서 캐스파제 의존성 아폽토시스 경로을 유도한다(T. L. Yue et al., Journal of Molecular and Cellular Cardiology 30 (1998) 495-507).

수많은 인간 질병이 아폽토시스 및 그 이상과 밀접한 관련이 있으므로 아폽토시스의 연구를 위하여, 및 아폽토시스의 이상에 기인하는 질병의 치료를 위하여 아폽토시스를 저해하는 유효성분을 효과적으로 목적 부위에 전달할 수 있고, 지속적이고 취급이 용이한 수단이 필요하다.

그러므로, 본 발명자들은 아폽토시스 저해 작용이 알려진 재조합 Hsp27을 세포막을 통과하여 전달하기 위하여 Tat 및 11R (아르기닌 11개가 연결된 형태)과 같은 단백질 전달 도메인을 이용하여 Hsp27과 융합하여 과발현시켜 세포에 처리하는 경우 세포의 아폽토시스 저해 효과가 뛰어나고, 이를 취급이 용이하고 유효성분의 지속적 방출이 가능한 온도 가역성 셀룰로스 겔을 포함하는 복합 코아세르베이트를 이용하여 아폽토시스로 인한 질병 부위에 투여하는 경우 치유효과를 가지는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 단백질 전달 도메인(protein transduction domain: PTD)과 열 충격 단백질 27 (Heat shock Protein 27: Hsp27)의 융합 단백질을 포함하는 세포 아폽토시스 저해용 조성물을 제공한다. 본 양태에서 단백질 전달 도메인은 이와 같은 목적으로 융합 단백질 형성에 문제가 없이 일반적으로 사용되는 어떤 PTD도 사용될 수 있다. 바람직하게, PTD는 Tat 또는 11R 또는 9R이다.

다른 양태에서 본 발명의 아폽토시스 저해용 조성물은 미토콘드리아 의존성 또는 미토콘드리아 비의존성 아폽토시스를 저해한다.

또 다른 양태에서 본 발명은 단백질 전달 도메인과 Hsp27의 융합 단백질을 포함하는, 아폽토시스 조절이상으로 인한 질환 치료용 조성물을 제공한다. 상기 조성물에서 단백질 전달 도메인은 Tat 또는 11R 또는 9R이 바람직하다.

또 다른 양태에서 본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 아폽토시스 조절이상으로 인한 질환은 아폽토시스가 비정상적으로 나타나는 어떤 상태 또는 질병일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 아폽토시스 조절이상으로 인한 질환은 신경퇴행성 질환, 허혈성 심장병, 자가면역질환 및 감염질환으로 구성된 군으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 아폽토시스 조절이상으로 인한 질환은 심근 경색을 주증상으로 하는 허혈성 심장병을 포함한다.

한 양태에서 본 발명은 단백질 전달 도메인과 Hsp27의 융합 단백질 및 염석염을 포함하는 온도 가역적 셀룰로스 겔로 구성된 복합코아세르베이트를 포함하는, 아폽토시스 조절이상으로 인한 질환 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 복합코아세르베이트를 포함하는 조성물이 사용될 수 있는 아폽토시스 조절이상으로 인한 질환은 신경퇴행성 질환, 허혈성 심장병, 자가면역질환 및 감염질환으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 복합코아세르베이트를 포함하는 조성물은 바람직하게는 주사용이다. 상기 조성물은 주사 전후 생체 온도인 37 ℃에서 졸-겔 전환을 하여 주사 전에는 보관과 취급이 용이하고 생체 내에서는 급속도로 상변화를 일으켜 아폽토시스 이상으로 인한 질환 부위에 효과적으로 전달되어 약효를 지속적 으로 유지할 수 있다.

본 발명에 따르는 조성물은 세포 내에서 효과적으로 내인적 및 외인적 아폽토시스 모두를 저해할 수 있을 뿐 아니라, 생체 내에서도 비정상적인 아폽토시스 기능에 의하여 유발되는 아폽토시스 조절이상으로 인한 질환 부위를 표적으로 효과적인 온도 가역적 겔의 전달과 조절된 방출이 이루어져 치료에 큰 효과를 가진다.

이하의 실시예를 통하여 본 발명의 특정 구체예를 설명한다.

본 명세서에서 사용된 용어는 일반적, 사전적 의미로 한정하여 해석되어서는 안되며 본 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위하여 특정 용어의 개념을 적절한 범위 내에서 정의할 수 있다. 본 명세서 또는 당업계 종래 기술을 고려하면 여기에서 개시하는 본 발명의 범위 내에 있는 다양한 균등 또는 변형된 구체예들 또한 당업자에게 자명하다. 이하에 기재하는 구체예는 예시적인 목적으로 기술된 것일 뿐이며, 본 발명의 범위는 오직 특허청구범위에 의하여만 한정된다.

<실시예>

재료 및 방법

아래 실시예에서 사용된 재료 및 방법은 다음과 같다.

1. 재료

스토로스포린 (Sigma)를 100% 에탄올 중 1mM 스톡 용액으로 제조하고, 세포 내 인큐베이션 전에 무혈청 배지 중 최종 농도 10nM로 희석하였다. 염화 코발트 (Sigma)는 최종 농도 10mM로 물에 희석하여 0.22 ㎛ 필터를 통과시키고 사용 전에 무혈청 배지 중의 400 μM로 희석하였다. 일차 항체인 Hsp27(c-20) 염소 다클론 IgG와 이차 항체인 당나귀 항-염소 IgG-HRP를 Santa Cruz(각각sc-1048S 및 sc-2020)로부터 구입하였고 사용 전에 1/5000로 희석하였다. 메틸셀룰로스 (MC, Mn = 86,000, 점도 = 4,000 cps), 프로타민(Protamine) (P, pI = 13.32, 연어로부터, 등급 Ⅳ, 네거티브 밀론 시험), 알부민 (BSA, pI = 4.7, 분자량: 66.430 kDa, 우 혈청), 및 암모늄 설페이트 (AS)를 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 다른 모든 화학물질은 분석 등급의 것을 사용하였다.

2. 클로닝

Tat 및 11R 올리고뉴클레오티드 및 Hsp27 또는 GFP를 박테리아 발현 벡터인 pRSET-A 내로 서열의 프레임에 맞게 삽입하여 Tat-Hsp27/GFP 및 11R-Hsp27/GFP 융합 구성체를 제조하였다. 우선, pRSET-A와 PTD-Tat 또는 PTD-11R로 구성된 두 가지의 상이한 백터를 제작하였다. Tat/11R을 함유하는 발현 벡터를 제작하기 위하여 BamHI 와 NotI 및 EcoRI 올리고뉴클레오티드 (IDT) 사이에 있는 Tat/11R의 위쪽 및 아래쪽 올리고뉴클레오티드를 94 ℃에서 7 분 동안 어닐링한 후 37 ℃에서 40분 동안 처리하였다. 사용된 올리고뉴클레오티드는 아래와 같다.

(Tat 위쪽:

5'-GATCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGACGACTCGAGCAGCTGAGCGGCCGCTATCGAG-3'

Tat 아래쪽:

5'-AATTCTCGATAGCGGCCGCTCAGCTGCTCGAGTCGTCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCCTGCCATAG-3'

11R 위쪽:

5'-GATCCCGAAGGCGCCGGAGACGACGTAGGCGGAGACGCCTCGAGCAGCTGAGCGGCCGCTATCGAG-3'

11R 아래쪽:

5'-AATTCTCGATAGCGGCCGCTCAGCTGCTCGAGGCGTCTCCGACTACGTCGTCTCCGGCGCCTTCGG-3'.

정제된 단편을 pRSET-A (invitrogen)의 BamHI/EcoRI 위치에 클로닝하였다. 결과의 발현 카세트는 6 개 히스티딘 잔기를 암호화하는 서열 및 11-아미노산 전달 도메인 TAT (YGRKKRRQRRR) 또는 11 아르기닌 (11R)을 포함한다. 구성체를 DNA 서열 결정 분석에 의하여 확인하였다. 제 2 단계로, Hsp27 및 GFP를 pRSET-TAT/11R에 클로닝하기 위하여 Hsp27 암호화 서열을 PCR에 의하여 증폭하였다. PCR에서는 Hsp27 인간 cDNA 대응 영역을 함유하는 플라스미드를 사용하였고, 센스 프라이머로는 5'-AGCTCGAGATGACCGAGCGCCGCGC-3' 안티센스 프라이머로는 5'-TCGAATTCTTACTTGGCGGCAGTCT-3'을 사용하였다. 그 후, 정제된 단편을 pRSET-Tat 또는 pRSET-11R 벡터의 XhoI 및 EcoRI 위치에 클로닝하였다. pAcGFP1-N (invitrogen)로부터 얻은 GFP 유전자를 XhoI 및 NotI 위치에서 절단하여 제작된 pRSET-Tat 또는 pRSET-11R 벡터 내로 삽입하였다. 삽입 후, 구성체를 DNA 서열 분석에 의하여 확인하였다.

3. 융합 단백질의 발현 및 정제

Tat-Hsp27, Tat-GFP, 11R-Hsp27, 11R-GFP, 및 GFP 를 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 균주 BL21 (DE)pLysS (Novagen) 내로 형질전환시키고 50 ㎍/ml 암피실린을 함유한 LB 배지에서 37℃, 4 시간 동안 OD_600nm=0.4 내지 0.6까지 배양하였다. 단백질 유도를 위하여 1mM IPTG를 첨가하고 하룻밤 동안 25℃에서 배양하였다. 세포 잔해를 원심분리를 통하여 제거하고 세포 펠릿은 100mM PMSF를 함유하는 용해 완충액에 재현탁한 후 각 30초 씩 8 사이클 음파 처리한 후 다시 원심분리하였다. 상청액을 0.45 ㎛ 필터를 통과시켜 여과한 후 Ni-NTA 수지 컬럼을 사용한 Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) 및 FPLC (biorad)를 수행하였다. 12,000 내지 14,000 MWCO(Milipore) 멤브레인을 사용하여 20% glycerol, 1% triton-X, 100mM KCl, 20mM Hepes 및 1mM PMSF를 함유한 PBS에 대하여 투석하여 정제된 산물로부터 염을 제거하였다. Amicon Ultra 10,000 MWCO(Milipore)을 통과한 스핀 다운에 의하여 투석된 단백질을 농축하고 프로테아제 저해제 칵테일을 단백질에 첨가하여 -20 ℃에서 저장하였다.

4. SDS - PAGE 및 웨스턴 블롯

항-인간 Hsp27 항체 (Santa Cruz)를 사용한 웨스턴 블롯 분석에 의하여 단백질을 확인하였다. PTD-Hsp27 단백질을 2-메르캅토에탄올을 함유하는 로딩 완충액과 혼합하여 95 ℃에서 15분 동안 가열한 후 두 개의 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동시켰다. 두 겔 중 하나는 코마시 브릴리언트 블루 염색(Coomassie brilliant blue staining) (Bio-Rad)을 한 시간 동안 수행하여 Hsp27을 검출하였고, 다른 겔은 40mA로 하룻밤 동안 PVDF 멤브레인으로 이동시켰다. 멤브레인을 4 ℃에서 TBS 중 5 % 탈지유로 1시간 동안 차단한 후 4 ℃에서 일차 항체인 Hsp27 (c-20) 염소 다클론 IgG (1/5000 희석; Santa Cruz, sc-1048S)로 2 시간 동안 처리하였다. 그 후, TBS 중의 0.05% Tween 20 (TTBS)로 각 10분 동안 세 차례 세척하고 2차 항체인 당나귀 항-염소 IgG-HRP (1/5000 희석; Santa Cruz, sc-2020)로 2 시간 동안 4 ℃에서 처리하였다. 또다시 TTBS로 각 10분 동안 세 차례 세척한 후, 멤브레인을 Opti-4CN 기질 (Bio-Rad)로 20분 동안 현상하였다. 융합 단백질의 농도를 Bio-Rad 단백질 검정을 사용하여 검출하였다.

5. 세포 배양 ( H9c2 )

심장 유래 마우스 H9c2 근세포를 10% 우태아 혈청 (FBS) 및 항생제 (100㎍/mL 스트렙토마이신, 100 유니트/mL 페니실린)를 함유하는 Dulbecco's 변형된 Eagle's 배지 (DMEM) 에서 37 ℃ 습윤 환경 (95% 공기 및 5% CO₂)에서 배양하였다. 10μM 스토로스포린 (Sigma Aldrich)로 3 시간 동안 처리하거나 400μM 염화코발트 (CoCl₂) (Sigma Aldrich)로 24 시간 동안 처리하여 두 경우 모두 무혈청 배지 조건 하에서 아폽토시스를 유도하였다.

6. PTD - GFP 융합 단백질을 H9c2 세포 내로 형질도입

PTD-GFP 형질 도입에서는, H9c2 세포를 80% 컨플루언시에 이르도록 6-웰 플레이트에서 성장시켰다. 세포를 여러 농도의 PTD-GFP로 4 시간 동안 처리한 후, 세 포를 트립신처리하고 PBS로 두 차례 세척하였다. 세포를 FACS 고정 완충액으로 고정시키고 형광-활성화된 세포 분류기 (Fluorescence-activated Cell Sorter: FACS)를 사용하여 검출하였다.

7. 세포 배양물을 PTD - Hsp27 접합 단백질과 함께 인큐베이션

H9c2 세포를 세포농도 5 x 10³ 로 96-웰 플레이트에 접종하고, 스토로스포린 또는 CoCl₂ 투여 1 사간 전에 상이한 농도의 PTD-Hsp27를 H9c2 세포에 전처리하였고, 처리는 각각 3 시간 및 24 시간 처리되는 아폽토시스 시약과 연속적으로 적용되었다.

8. 세포독성 시험/ CCK 검정

형질도입된 PTD-Hsp27 융합단백질의 생물학적 활성을 H9c2 세포 및 일차 근세포의 생존률을 측정함으로써 평가하였다. 세포를 96-웰 플레이트에 접족하고 상이한 농도의 PTD-Hsp27를 H9c2 세포에 1 시간 동안 처리하였다. 세포 생존률을 CCK (세포 계수 키트)를 사용한 상대색도계 검정에 의하여 추산하였다. 10 ㎕의 CCK를 각 웰의 100 ㎕의 DMEM 배지에 가하였고 1 시간 동안 37 ℃인큐베이터에서 인큐베이션한 후 OD를 450nm에서 Elisa 플레이트 판독기를 사용하여 구하였다.

9. 아폽토시스 검정

10% FCS 보충된 DMEM 배지에서 배양된 H9c2 세포주를 96 웰 플레이트(5 X　10³ 세포/웰)에 접종하고 상이한 농도의 PTD-Hsp27 융합 단백질 (0.1μM, 0.5 μM 및 1.0 μM)로 1 시간 동안 전처리한 후 스토로스포린 (10nM) 및 CoCl₂ (400μM)를 각각 3 시간 및 24 시간 동안 처리하였다. 발광 플레이트 판독기를 사용하고 제조자의 지시에 따라 발광측정용 Caspase-Glo 3/7 assay (Promega)에 의하여 캐스파제 3 및 7 활성을 측정함으로써 세포성 아폽토시스를 측정하였다. 네거티브 대조구로서, 어떤 PTD-Hsp27 융합 단백질들이나 아폽토시스 시약을 처리하지 않은 세포를 사용하였고, 포지티브 대조구로서는 PTD-Hsp27 융합 단백질 전처리 없이 아폽토시스 시약만 처리한 세포를 사용하였다. 세포성 아폽토시스는 미처리 배지 대조구에 대한 백분율로 나타내었다. 데이터의 통계적 처리는 일방 ANOVA에 의하여 수행하였고 유의 수준은 P < 0.05에서 수용하였다.

10. 세포 배양 (일차 근육세포 )

갓난 래트 심근세포를 분리하여 효소적 방법으로 정제하였다. 요약하면, 하루 내지 이틀 나이의 Sprague-Dawley 래트 새끼의 심장을 절개하고 심실을 Ca² ⁺ 및 Mg²⁺가 결여된 Dulbecco's 포스페이트 완충된 식염수(pH 7.4, Gibco BRL)로 처리하였다. 미세절개 가위를 사용하여 조각이 약 1　mm³가 될 때까지 잘게 자른 다음 10 ml의 콜라게나제 I (0.8　mg/ml, 262 유니트/mg, Gibco BRL) 로 15 분 동안 37 ℃로 처리하였다. 상청액을 제거하고 조직을 신선한 콜라게나제 I 용액으로 다시 15 분 동안 처리하였다. 상청액에 있는 세포를 세포배양 배지(10% 우태아 혈청을 함유하는 α-MEM , Gibco BRL)를 함유하는 튜브로 옮겼다. 튜브를 1200 rpm에서 4분 동안 실온에서 원심분리하고 셀 펠릿을 5　ml의 세포 배양 배지에 재현탁하였다. 조직의 거의 남지 않을 때까지 위 과정을 7-9 차례 반복하였다. 세포 현탁액을 수집하고 섬유모세포 오염을 줄이기 위해 100-mm 조직배약 디쉬에서 1 시간 동안 인큐베이션했다. 비부착성 세포를 수집하여 5 X 0⁵　세포/ml 최종 농도가 되도록 접종하였다. 4 내지 6 시간 배양 후, 세포를 두 차례 세포 배양 배지로 세척한 후 0.1　mM BrdU를 가하였다. 그 후, 세포를 CO₂ 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양하였다.

11. 시뮬레이션된 허혈

일차 근세포를 6-웰 플레이트에서 무혈청 DMEM 배지에서 배양하고 허혈 1 시간 전에 PTD-Hsp27 융합 단백질로 처리하였다. 그 후, 세포를 12시간 동안 저산소 챔버에서 37 ℃, 95% N₂, 5% CO₂로 인큐베이션하였다. 아폽토시스 세포를 아넥신 V-PE 염색에 의하여 정량하였다.

12. 아넥신 V- PE 시험

일차 근세포에 트립신처리하여 PBS로 추 차례 세척하였다. 원심분리 후, 각 세포 펠릿을 200 ㎕ 아넥신 V 결합 완충, 10 ㎕ 아넥신 V-PE 및 10 ㎕ 7-AAD액에 재현탁하였다. 15분 동안 어두운 실온에서 인큐베이션한 후, 세포를 원심분리하고 FACS 고정 완충액에 재현탁한 후 FACS 분석을 수행하였다. FACScalibur 유동세포계측기 (flow cytometer) (Beckton Dickinson)를 사용하여 20,000 개의 세포를 함유하는 샘플을 분석하였다 (아넥신 V-PE에 대하여는 FL2-H 필터 사용 및 7-AAD에 대해서는 FL3-H 사용).

13. 열-가역성 복합체 코아세르베이트 조합겔의 제조

메틸셀룰로스(MC) 분말을 전체 필요 부피의 절반쯤 되는 양의, 90 ℃로 예열된 포스페이트 완충 식염수 (PBS)에 완전히 젖을 때까지 분산 및 교반함에 의하여 MC 용액을 제조하였다. 잔여 부피의 차가운 PBS를 가하고 혼합물을 30 분 동안 얼음조에서 약하게 교반하여 무색 투명한 용액을 제조하였다. 용액을 잘 흔들고 냉장시켰다.

튜브 거꾸로 세우기(tube inverting) 방법에 의하여 MC 수용액의 젤라틴 형성 온도를 측정하였다. 5분 간격으로 0.5 ℃씩 상승시켜 25-60 ℃ 온도 범위에서 수행하였다. 염석 염 시약인 AS를 MS 용액에 가한 후, 동일한 방법으로 유효한 젤라틴 형성 온도를 측정하였다. 양이온성 프로타민으로 구성된 복합 코아세르베이트, 복합 겔을 제조하기 위하여 음이온성 BSA를 AS를 함유하는 MC에 가하였다. 혼합된 용액을 5 내지 10 분 동안 실온에서 교반한 후 수조에서 37 ℃로 인큐베이션하였다.

14. 겔 형성 및 점도 측정

진동 유량계 (Bohlin, Malvern, UK)를 사용하여 0-60 ℃ 온도 범위에서 원뿔형 및 플레이트 형상을 사용하여 여러 온도에서 겔 형성 및 점도를 측정하였다. 샘플 (500 ㎕)을 서로 500 ㎛ 간격으로 떨어진 두 개의 20 mm 평형 플레이트 사이에 놓았다. 간격 온도는 25 또는 37 ℃로 세팅하였다. 조합 겔의 상은: 투명 용액, 반투명 겔 및 상 분리의 세 단계로 분류하였다.

15. 심근 경색 유도

실험은 실험동물의 관리 및 이용에 관한 국제 지침에 따라 수행하였다. 실험 프로토콜은 연세대학교 의과대학의 동물연구위원회로부터 승인받았다. 심근 경색을 수컷 Sprague-Dawley 래트 (200 ± 30 g) 좌전방 하행 관상동맥 수술적 폐쇄에 의해서 만들었다. 요약하면, 케타민 (10 mg/kg) 및 크실라진 (5 mg/kg)으로 마취 후, 심장을 개흉하여 꺼낸다. 5-0 프롤렌 봉합사(ETHICON)로 좌 관상동맥을 그 원래 위치로부터 2 내지 3 mm 결찰하였다.

16. 단백질을 함유한 열-가역성 겔의 심근 내 주사

LAD 폐쇄 후, 겔 (35㎕) 및 단백질 (15 ㎕, 11R-Hsp 27(15 ㎍) 또는 TAT-Hsp 27(15 ㎍))을 혼합하여 26 GX 1/2 게이지, 멸균 피하주사기로 래트의 심장 내로 주입하였다. 수술 동안 동물을 Harvard 송풍기를 사용하여 95% O₂ 및 5% CO₂ 로 환기시켰다.

17. 심근 경색부 크기(섬유화 영역)의 측정

경색부의 크기를 측정하기 위하여 래트 심장을 늑골 사이로 노출시켜 잘라내고 포스페이트 완충 식염수 (Gibco BRL)로 관류시켜 혈액을 제거하였다. 관류된 심장을 10 % 폴르말린 용액 (Sigma Chemical St.)에서 24 시간 동안 4 ℃에서 고정시켰다. 이어, 파라핀 블럭을 제조하여 Masson's 삼색염색을 위해 2 ㎛ 슬라이드를 제조하였다. 전체 경색부 면적을 MetaMorph 소프트웨어 버젼 4.6 (Universal Imaging Corp.)을 사용하여 측정하였는데, 대조구 (n=6), MI+식염수 (n=6), MI+TAT-Hsp27 (n=6), 및 MI+11R-Hsp27 (n=6) 군으로 수행하였고 전체 좌심실의 백 분율로 표시하였다.

18. 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 -매개 dUTP Nick - 엔드 표지 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase - Mediated dUTP Nick - End Labeling : TUNEL ) 검정

제조자의 지시에 따라 TUNEL 검정을 수행하였다(Chemicon). 요약하면, 절개된 심장 조직을 3.7 % 완충된 포름알데히드로 고정시키고 파라핀에 포매시켰다. 5 ㎛ 두께의 조직 절편을 파라핀 제거 후 재 수화한 후 PBS로 세척하였다. DNase I (10 U/ml, 10분 동안 실온에서)로 처리한 정상 심장 절편으로부터 포지티브 대조구 샘플을 제조하였다. 절편을 3.0 % H₂O₂ 로 전처리한 후 TdT 효소로 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시키고 디곡시제닌 (digoxigenin)-융합 뉴클레오티드 기질과 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 3,3-디아미노 벤지딘 (DAB) (Vector Laboratories)에 의하여 5 분 동안 DNA 단편화를 나타내는 핵 분석을 수행하였다. 아폽토시스 심근의 핵은 암갈색으로 염색되었다. 마지막으로, 절편을 메틸 그린으로 대조염색하고 커버를 살짝 덮었다. 절편을 광학 현미경으로 관찰하였다. 한 군 당 6 개의 절편을 제조하여 각 잘편에서 10 개의 상이한 부분을 관찰하였다(× 400).

19. 래트 심초음파검사( echocardiography )

졸레틸(zoletil) (50 mg/kg) 자일라진 (5 mg/kg)을 복강내 주사하여 래트를 안정시켰다. 이미지 작업은 초음파 시스템(Vivid 7, GE Vingmed Ultrasound)으로 조정된 선형 변환기로 15 MHz에서 수행하였다. 2-차원 안내된 M-모드 및 2-차원 심초음파 연구를 유두근 수준에서 수행하였고 모든 데이터는 기록한 후 분석하였다.각 동물에 대하여 M-모드 트레이싱으로부터 좌심실 확장기말 (LV end-systolic: LVESD) 및 수축기말 (end-diastolic: LVEDD) 내경을 측정하여 죄심실 내경 단축률(LV shortening fraction: FS) 및 구획률 (ejection fraction: EF)을 계산하였다.

실시예 1: 융합 단백질의 발현 및 정제

PTD를 함유하는 Hsp27 융합 단백질(도 1a)을 제조하기 위하여 전장 인간 Hsp27 cDNA를 분리한 후, His 태그 펩티드(his-6) 및 PTD-Tat 또는 11R에 대한 서열을 함유하도록 사전에 재구성된 pRSET 플라스미드 내로 서브클로닝을 수행하였다. 대조군으로서 pAcGFP1-N 벡터로부터 다른 세트의 GFP 융합 단백질 또한 분리하여 His 태그 펩티드, 및 PTD-Tat/11R를 함유하거나 함유하지 않는 pRSET 플라스미드 내로 서브클로닝을 수행하였다. 단백질 생산 전에 모든 구성체의 뉴클레오티드 서열을 서열 분석에 의하여 확인하였다. PTD 융합 단백질의 발현을 위하여, 제작된 플라스미드를 BL21 E. 콜라이 (E. coli) 에서 발현한 후 Ni² ⁺ 친화성 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 그 후, 정제된 단백질을 투석하고 농축하였다. 도 1b에 나타난 바와 같이 PTD-Hsp27 융합 단백질은 높은 수준으로 발현되었고 정제된 재조합 PTD-Hsp27 융합 단백질은 약 30 kDa의 분자량을 나타내었다. PTD-Hsp27 융합 단백질을 인간 Hsp27에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블롯 검정에 의하여 확인하 였다(도 1c).

실시예 2: PTD - GFP 융합 단백질을 H9c2 세포 내로 전달함

PTD-Hsp27 융합 단백질이 H9c2 세포 내로 전달된 것을 확인하는 제 1 단계는 세포를 4 시간 동안 융합 단백질로 처리한 후 직접 형광 현미경으로 검출을 수행하는 것이었다. PTD-GFP 단백질로 처리된 세포에 대해서는 대부분의 세포가 형광으로 염색된 반면, PTD-Tat/11R 없이 GFP 단백질만으로 처리한 세포인 네거티브 대조군에서는 형광 염색이 검출되지 않았다(도 2a). PTD-Tat/11R의 전달의 투여량 의존성을 시험하기 위하여 PTD-GFP 및 GFP 융합 단백질을 여러 농도(0.1 내지 2 μM)에서 4 시간 동안 세포 내로 가하고 전달된 단백질의 양을 형광 활성 세포 분류기(fluorescence-activated Cell Sorter: FACS)를 사용하여 측정하였다. 도 2a에 나타낸 바와 같이, PTD-GFP 융합 단백질 농도가 증가함에 따라 전달된 세포의 강도 및 수가 증가하였는데, 이는 융합 단백질이 세포 내로 전달되는 것이 농도 의존적임을 나타낸다. 그러나, 대조군 GFP 단백질은 세포 내로 전달되지 않았다. 도 2b로부터 판단하면, Tat-GFP가 11R-GFP과 비교하여 전달 효율이 더 양호한 것으로 보였다.

실시예 3: 미토콘드리아-의존적 아폽토시스에서 PTD - Hsp27 융합 단백질의 세포에 대한 영향 평가

미토콘드리아-의존적 아폽토시스에서 PTD-Hsp27 융합 단백질이 세포에 영향을 끼치는지 알아보기 위하여, 아폽토시스 유도제의 처리 후 세포의 각 샘플에 의하여 생성되는 캐스파제-3 활성을 시험하였다. H9c2 세포를 PTD-Hsp27로 1 시간 동 안 전처리한 후 10 nM 스토로스포린을 첨가한 경우 캐스파제-3 활성이 유의하게 저해되었다. 이 PTD-Hsp27의 캐스파제-3 활성 저해는 투여량 의존적이었다(도 3 a). 11R-Hsp27는 Tat-Hsp27보다 미토콘드리아-의존적 아폽토시스 경로 저해에서 더 양호한 효과를 나타내었다.

실시예 4: 미토콘드리아- 비의존적 아폽토시스에서 PTD - Hsp27 융합 단백질의 세포에 대한 영향 평가

미토콘드리아-비의존적 아폽토시스 경로의 저해에서 PTD-Hsp27 융합 단백질의 영향을 알아보기 위하여, 염화코발트 시약의 처리 후 세포에 의하여 생성되는 캐스파제-3 활성을 시험하였다. 이전 실험 조건과 마찬가지로, H9c2 세포를 PTD-Hsp27로 1 시간 동안 전처리한 후 400 μM 염화코발트를 가하였다. 도 3b에서 알 수 있는 바와 같이, PTD-Hsp27로 처리한 세포는 Tat와 11R 둘 다에 대하여 유의하게 캐스파제-3 활성이 감소하였다. 도 3b는 PTD-Hsp27가 투여량 의존적이고 11R-Hsp27가 Tat-Hsp27보다 더 양호한 효과는 가짐을 나타내었다.

실시예 5: 세포독성 시험/ CCK 검정

PTD-Hsp27가 사용하기 효과적인 처리가 되기 위하여는, 융합 단백질의 유효 농도 사용의 독성은 매우 낮아야 한다. H9c2 세포에 대한 CCK 검정을 사용한 결과, 관찰된 독성은 Tat-Hsp27 및 11R-Hsp27 둘 다 0.1 μM 내지 1.0 μM 범위로 허용 가능하였다. 즉, 다른 융합 단백질 처리를 하지 않은 대조구와 비교하여 80% 이상의 세포 생존률을 나타냈다(도 4a). 융합 단백질의 농도를 증가시켠 세포 독성이 증가한다. 일차 근세포의 경우에는, 0.05 μM 내지 2.0μM 농도 범위에서 PTD- Hsp27 융합 단백질이 유의한 세포 독성을 나타내지 않았다(도 4b).

실시예 6: 시뮬레이션된 허혈

PTD-Hsp27 융합 단백질이 일차 근세포에서 아폽토시스를 저해하는 효과를 관찰하기 위하여, 세포를 0.1 μM PTD-Hsp27로 1 시간 전처리한 후 저산소 상태로 12 시간 동안 처리하였고, 대조구로서는 정상 산소 상태에서 미처리 세포를 배양하였다. 도 5a에서 알 수 있는 바와 같이, 세포를 저산소 처리한 후에 63.5%의 세포가 아폽토시스를 겪은 반면, 정상 산소 조건에서는 40%가 아폽토시스를 겪었다. 세포를 PTD-Hsp27로 전처리한 경우에는, 전처리 없이는 63.5%였던 아폽토시스 세포가 거의 정상 산소 조건에서의 아폽토시스 비율과 거의 동등하게 Tat-Hsp27 및 11R-Hsp27에 대하여 각각 43% 및 42%로 돌아왔다. 0.1 μM로 낮은 농도의 PTD-Hsp27 융합 단백질도 저산소 세포에서의 아폽토시스 방지에 유의한 효과를 나타내었고, Tat-Hsp27과 11R-Hsp27의 효과 사이에는 유의한 차이가 없었다(도 5b).

실시예 7: 온도 가역적 MC -겔 및 이를 함유한 복합 코아세르베이트의 최적화

7.1. 온도 가역적 MC - 겔의 최적화

복합 코아세르베이트가 약물 전달 시스템에서, 특히 원위치 형성 겔로서 사용되기 위하여, 복합체는 체온에서 안정하고 즉각적으로 점성이 있는 겔을 형성할 필요가 있다. MC 겔이 통합된 복합 코아세르베이트로 주사 가능한 제제로서 시험하였다. 실온에서, 수성 MC 용액은 투명한 졸이었고, 약 50 ℃로 가열하면 용액은 탁한 겔이 되었다. 실용성을 증가시키기 위하여, MC의 농도를 조절하거나 폴리머, 비전해질 또는 염 같은 첨가제를 사용함으로써 MC 겔화 온도는 거의 체온 수준으로 낮아질 수 있다. MC 농도를 증가시켜 겔화 온도를 낮추는 방법은 용액 점도가 너무 높아 취급성이 떨어져 실용적이지 않았다. 그러므로, AS 같은 염석염을 첨가하는 방법이 MC 수용액의 겔화 온도를 낮추는 방법으로 간편하고 효율적인 방법이었다.

도 6은 1% MC 용액의 겔화 온도를 AS 농도의 함수로 나타낸다. AS 농도가 증가할수록 겔화 온도는 유의하게 감소하여 2.5% 및 4.5% AS에서 겔화 온도가 각각 37 ℃ 및 25 ℃였다.

7.2. 온도가역성 겔 함유 복합 코아세르베이트의 최적화

온도가역성 겔 함유 P/BSA 복합 코아세르베이트를 제조하기 위하여, 여러 농도의 프로타민과 BSA의 혼합물을 4.5%의 AS를 함유한 1% MC 용액에 가하였다. 이 것은 체온 부근에서 졸 형태로부터 겔 형태로 변환하였다. 프로타민과 BSA는 반대로 하전된 폴리전해질(polyelectrolute) 사이의 이온성 상호작용에 의하여 복합 코아세르베이트를 형성한다. 코아세르베이트의 전하가 감소하면 히드록실기와 소수성 메틸기를 함유하는 MC와의 수소 결합과 소수성 상호작용이 가속화될 수 있다. 도 7은 P/BSA/MC/AS 혼합물의 온도 의존적 점도 증가를 나타낸다. 최적 비율로 P/BSA 코아세르베이트가 있거나 없는 MC/AS 혼합 용액은 25 ℃에는 졸이고 37 ℃에는 안정한 겔이었다. 이 겔화 거동은 가역적이어서 겔화 온도 미만으로 온도가 내려가면 투명한 졸 상태로 돌아갔다. 탁도에 관한 데이터와 연계하여 보면, 이 결과는 P/BSA 코아세르베이트 및 MS 사이의 강한 상호작용을 나타낸다.

실시예 8: 급성 MI 후 심장 손상에 대한 PTD - Hsp27 융합 단백질의 보호 효과

시험관 내 결과를 생체 내에서도 확인하기 위하여, LAD 결찰된 래트 심장에 대한 PTD-Hsp27 융합 단백질의 직접적인 효과를 연구하였다. LAD 결찰은 8주 나이의 Sparague-Dawley 수컷 래트에서 수행하였다. Tat-Hsp27 또는 11R-Hsp27을 결찰된 심장에 주입하였다. 세포간 섬유형성의 비율을 심근경색 지수으로서 측정하여 심근 절편을 Masson's Trichrome으로 염색하였다. 대조군 심장(1.2 ± 0.5%)과 비교하여 처리하지 않은 결찰 심장은 유의한 세포간 섬유형성(38 ± 7%)을 보였다. Tat-Hsp27과 11R-Hsp27는 각각 3.5 ± 1.2% 및 22 ± 6.5%로 세포간 섬유형성을 유의하게 감소시켰다. TUNEL 검정을 사용하여, 아무것도 처리하지 않거나 Tat-Hsp27 또는 11R-Hsp27 처리한 MI 군에서 심 조직의 아폽토시스 세포의 비율을 측정하였다. LAD 결찰에 기인한 TUNEL-포지티브 심근 세포의 발생률은, MI 군과 비교할 때 Tat-Hsp27 또는 11R-Hsp27 처리한 MI 군에서 유의하게 감소하였다. 심근 조직에서 LAD-결찰 유도된 아폽토시스는 Tat-Hsp27 또는 11R-Hsp27 처리에 의하여 감소하였다.

실시예 9: 심 기능의 평가

흉강을 통한 심초음파에 의하여 심장 내경 및 기능 매개변수를 측정하였다. 네 개의 군(n=6/ 군): 대조군, MI, MI+Tat-Hsp27 및 MI+11R-Hsp27 으로 실험하였다. 심초음파 실험으로부터의 결과를 대조군 및 실험 동물군 사이에서 비교하였다. LV 기능 및 리모델링 지수를 도면에 요약하였다. 군 MI+Tat-Hsp27에서 LV 구획률이 군 MI와 비교하여 개선되었다. (MI 군에 대하여 P < 0.05)

도 1은 Hsp27과 GFP 융합 단백질 발현 벡터의 간략한 맵의 도식과 Hsp27과 GFP 융합 단백질의 정제를 나타낸다. A는 5 가지 발현 벡터인 pTat-Hsp27, p11R-Hsp27, pTat-GFP, p11R-GFP 및 pGFP의 개요도이고, B는 니켈 컬럼 크로마토그래피을 통하여 정제된 Hsp27과 GFP 융합 단백질의 SDS-PAGE 분석을 코마시 블루 염색한 것이고, C는 정제된 Hsp27 융합 단백질의 웨스턴 블롯 분석이다. 사이즈 마커는 39kDa 및 26kDa 밴드로 나타나며, (a) Tat-Hsp27; (b)11R-Hsp27; (c) Tat-GFP 및 (d)11R-GFP.

도 2는 H9c2 세포에서 GFP 융합 단백질 전달율 분석 결과이다. A는 여러 농도의 GFP 융합 단백질과 대조군인 GFP 단독의 H9c2 세포 내로의 전달율 비교 그래프이다. 흡수는 유동세포계측에 의하여 측정하였다. B는 PTD-GFP 융합 단백질 흡수의 히스토그램 비교이다. 처리 농도는 2.0 μM, CON는 처리하지 않은 정상 세포 대조군, G는 PTD를 포함하지 않는 GFP 융합 단백질; TG, Tat-GFP 융합 단백질; RG, 11R-GFP 융합 단백질.

도 3은 H9c2 세포에서 아폽토시스 경로에 대한 PTD-Hsp27의 효과를 나타내는 그래프이다. 0.5μM 및 1.0μM PTD-Hsp27로 H9c2 세포를 1 시간 동안 전처리한 후, 스토로스포린을 3 시간 동안 처리함으로 써 미토콘드리아 의존적 아폽토시스를 유도하거나 (A), 염화 코발트를 24 시간 동안 처리하여 미토콘드리아 비의존적 아폽토시스를 유도하였고 (B), 각각의 처리후 세포를 Caspase-Glo 3/7 검정한 결과를 나타낸다. (p<0.05). -STA, 스토로스포린 처리하지 않음; +STA, 스토로스포린 처리 함; - CoCl₂, 염화코발트 처리하지 않음; + CoCl₂, 염화코발트 처리함; TH, 아폽토시스 유도 군에 Tat-Hsp27 처리; RH, 아폽토시스 유도군에 11R-Hsp27 처리, 스토로스포린 또는 CoCl₂에 의한 유도; * p<0.05 아폽토시스 유도군과 비교한 유의수준.

도 4는 PTD-Hsp27 전달이 세포 생존율에 끼치는 효과를 나타내는 그래프이다. 여러 농도의 PTD-Hsp27를 1 시간 동안 H9c2 세포 (A) 또는 일차 근세포 (B)에 처리한 후 세포 생존율을 CCK 검정에 의하여 측정한 그래프이다.

도 5는 저산소 상태의 래트 일차 근세포 및 근세포 아폽토시스에 대한 PTD-Hsp27 처리의 효과를 나타내는 분석자료이다. A는 래트 일차 근세포에서 저산소 조건에 의하여 유도된 세포 사멸을 아넥신 V-PE/7-AAD 염색에 의하여 분석한 데이터이다. 세포를 0.1 μM PTD-Hsp27 융합 단백질로 1 시간 동안 전처리한 후 저산소 상태에서 12 시간 동안 처리하였고, 대조군은 정상산소 상태에서 인큐베이션하였다. B는 A로부터의 데이터를 아넥신 V 포지티브 세포의 비율로 나타낸 막대그래프이다. 두 PTD-Hsp27 융합 단백질 처리 후, 아폽토시스 세포의 비율은 다시 감소하였고 그 비율은 정상산소 상태의 아폽토시스 세포와 거의 같았다.

도 6은 AS 농도의 함수로서 나타낸 1% MS 용액의 겔화 온도를 나타내는 그래프이다.

Claims

단백질 전달 도메인(protein transduction domain: PTD)과 열 충격 단백질 27 (Heat shock Protein 27: Hsp27)의 융합 단백질을 포함하는 세포 아폽토시스 저해용 조성물.
제 1 항에 있어서, 단백질 전달 도메인은 Tat 또는 11R 또는 9R인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 아폽토시스는 미토콘드리아 의존성 또는 미토콘드리아 비의존성 아폽토시스인 것을 특징으로 하는 조성물.
단백질 전달 도메인과 Hsp27의 융합 단백질을 포함하는, 아폽토시스 조절이상으로 인한 질환 치료용 조성물.
제 4 항에 있어서, 단백질 전달 도메인은 Tat 또는 11R 또는 9R인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 아폽토시스 조절이상으로 인한 질환은 신경퇴행성 질환, 허혈성 심장병, 자가면역질환 및 감염질환으로 구성된 군으로부터 선 택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
단백질 전달 도메인과 Hsp27의 융합 단백질 및 염석염을 포함하는 온도 가역적 셀룰로스 겔을 포함하는, 아폽토시스 조절이상으로 인한 질환 치료용 조성물.
제 7 항에 있어서, 아폽토시스 조절이상으로 인한 질환은 신경퇴행성 질환, 허혈성 심장병, 자가면역질환 및 감염질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 조성물은 주사용인 것을 특징으로 하는 조성물.