ES2294048T3 - Fragmento funcional de receptor de leptina. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la generación y distribución de claves secretas para la encriptación punto a punto de información de un enlace de comunicaciones entre dos usuarios (X;Y) de un sistema digital de comunicaciones que, para la encriptación punto a punto, utiliza un procedimiento de encriptación simétrico empleando una componente central del sistema de comunicaciones que controla determinados elementos de clave, y la clave secreta (R) necesaria para ello es intercambiada entre los usuarios mediante un procedimiento de encriptación asimétrico, generando uno de los dos usuarios la clave secreta (R), la encripta por medio de la parte pública de una clave privada del otro usuario y la transfiere por medio del sistema de comunicaciones al segundo usuario, decodificando el segundo usuario la cifra encriptada transmitida por medio de la parte secreta de su propia clave y obteniendo de esta forma la clave secreta (R), siendo los elementos de clave públicos (KPX, MX o KPY, MY) de cada usuario almacenado en la componente central (3) del sistema de comunicaciones (1) como un servicio adicional de pago (5.3, línea 2), realizándose en el componente central del sistema de comunicaciones una verificación para determinar si el usuario está autorizado a realizar una solicitud de encriptación, de manera que, como resultado de la solicitud de encriptación del usuario (X), por medio del canal de datos o de señalización (2) independiente del enlace de comunicación, los elementos de clave RSA públicos (KPY, MY) del otro usuario (Y) están a disposición del primer usuario (X) desde la componente central (3) del sistema de comunicaciones, que una clave secreta (R) es generada por parte del primer usuario (X) como una cifra aleatoria y almacenada, y la clave (R) es encriptada a un valor Z por medio del procedimiento RSA utilizando los elementos de clave RSA públicos (KPY, KY) del segundo usuario (Y) y transmitidos a través del sistema de comunicaciones al segundo usuario (Y), y que el valor (Z) transmitido es decodificado a la clave secreta (R) por el segundo usuario (Y) utilizando los elementos de clave RSA secretos (KSY, KY) del segundo usuario (Y) y almacenado, y que los cálculos para generar y transmitir la clave secreta (R) y el almacenamiento de los elementos de clave RSA secretos tenga lugar exclusivamente en una tarjeta electrónica segura en el equipo terminal del lado de los usuarios.
Description
Fragmento funcional del receptor de leptina.
La presente invención se refiere a un fragmento
funcional de un receptor, importante en la señalización. Más
concretamente, la presente invención se refiere a un fragmento
funcional del receptor de leptina implicado en la señalización de
SOCS3, CIS y/o Vav.
La leptina, una hormona derivada de los
adipocitos, emite sus señales de supresión del apetito atravesando
la barrera hematoencefálica y enlazándose con la forma específica de
señalización de su receptor en ciertos núcleos del hipotálamo. De
esta forma constituye un mecanismo de retroalimentación que regula
la masa del tejido adiposo. Las mutaciones dentro del sistema de la
leptina dan por resultado un fenotipo marcadamente obeso y un
deterioro del funcionamiento endocrinológico (Zhang et al.,
1994, Chen et al., 1996). Aunque la forma larga de
señalización del receptor de leptina muestra altos niveles de
expresión en dichos núcleos del hipotálamo, se expresa también en
varios tejidos periféricos, incluidos los nodos y gónadas
pulmonares, hepáticos y linfáticos (Tartaglia et al., 1995,
Ghilardi et al., 1996). Esto lleva a la implicación de la
leptina en diversas funciones periféricas, convirtiéndola en una
típica citoquina pleiotrópica.
Hasta hoy el uso terapéutico de la leptina como
agente reductor del peso permanece limitado (Heymsfield et
al., 1999). Se ha observado que en la mayoría de las personas
obesas existe una correlación entre la masa adiposa y los niveles
de leptina, un fenómeno que se suele explicar por la resistencia de
la leptina (Maffei et al., 1995). Se ha sugerido una serie
de posibles explicaciones para esta resistencia: un transporte
saturable a través de la barrera hematoencefálica que da por
resultado una actividad limitada de la leptina en el hipotálamo
(Schwartz et al., 1996, El Haschimi et al., 2000),
interferencia con el sistema glucocorticoide (Zakrzewska et
al., 1997), o defectos en el nivel del receptor de leptina, por
ejemplo una elevada expresión del inhibidor de señalización
(Bjorbaek et al.,
1998).
1998).
Recientemente se ha visto bien claro que la
leptina no sólo desempeña un papel en la regulación de la toma de
sangre, sino que se ha demostrado sus funciones en la angiogénesis
(Sierra-Honigmann et al., 1998) y en la
invasividad de las células epiteliales renales y colónicas (Attoub
et. al, 2000).
Al ser miembro de la familia del receptor de
citoquina de tipo 1, el receptor de leptina se activa mediante la
fosforilación cruzada de las quinasas asociadas a JAK, lo más
probable a JAK2 y/o JAK1 (Bjorbaek et al., 1997,Bnks et
al., 2000). La activación del receptor de leptina conduce a la
incorporación de moléculas de señalización que contengan módulos de
SH2 de enlace con la fosfotirosina. Tanto las moléculas de los
Transductores de Señal y Activadores de Transcripción (STAT)
(Baumann et al., 1996, Vaisse et al., 1996) como el
SH2 asociado al receptor y que contiene SHP-2 de
fosfatasa (Carpenter et al., 1998, Li y Friedman, 1999) se
incorporan al complejo del receptor de leptina activado. La
activación mediada por leptina de las Quinasas de Proteínas
Activadas por Mitógeno (MAPK) y del Sustrato 1 del Receptor de
Insulina (IRS-1) se ha comprobado en diversos
sistemas celulares (Cohen et al., 2000). La promoción de la
invasividad mediante leptina parece que es mediada por rutas de
señalización de fosfoinositide quinasa-3
dependientes de Rho- y Rac- (Attoub et al., 2000).
La leptina induce rápidamente la proteína que
contiene SH2 inducible por citoquina (CIS), tanto in vitro
como in vivo. La leptina también puede inducir poderosa y
rápidamente la producción del inhibidor de transducción de señales
supresor de la señalización 3 de citoquina (SOCS3) en diversos tipos
de células y también in vivo (Bjorbaek et al., 1998,
Emilsson et al., 1999, Waelput et al., 2000). Tanto el
CIS como el SOCS3 son miembros de una creciente familia del SH2 que
contiene proteínas, formada típicamente por un dominio de
pre-SH2, un dominio de SH2 central y una secuencia
de caja de SOCS bien conservado. El último motivo se encuentra
también en una serie de otras moléculas señalizadotas (Milton et
al., 1998) y parece estar en relación con la función
proteasómica (Zhang et al., 1999). El hecho de que se haya
observado que la cepa AYla de ratones mutantes resistente a la
leptina muestra unos niveles elevados de SOCS3 hace de esta proteína
un posible mediador de la resistencia a la leptina (Bjorbaek et
al., 1998).
Se ha observado recientemente que se requiere un
sitio de incorporación de tirosina dentro de gp130, el componente
de señalización del complejo IL-6, para el enlace y
la consiguiente actividad inhibitoria del SOCS3 (Nicholson et
al., 2000, Schmidt et al., 2000). Esto se halla en
contraste con SOCS1, que enlaza directamente con las quinasas JAK e
inhibe directamente su actividad quinásica (Yasukawa et al.,
1999). Se han obtenido resultados similares para el receptor de
insulina y el receptor de eritropoyetina (Emanuelli et al.,
2000, Sasaki et al., 2000).
En estudios anteriores se ha observado que la
leptina induce dos grupos de genes en la línea celular de
feocromocitoma de rata PC12 que expresa de manera estable el
receptor de leptina de ratón. Parece que muchos de estos genes
están regulados in vivo (Waelput et al., 2000).
Mediante un enfoque mutacional se observó que en el receptor de
leptina de ratón está implicado el residuo Y985 en una señal de
retroalimentación negativa, y además que este efecto es más
pronunciado cuando muta en concordancia con otra tirosina, Y1077
(Eyckermann et al., 1999). No obstante, nunca se ha
demostrado la fosforilación de esta tirosina, lo que sugiere que
este sitio no jugaba un papel importante. De forma inesperada,
descubrimos que un pequeño fragmento funcional alrededor de dicha
tirosina Y1077 es suficiente para SOCS3 y para el enlace y/o la
señalización de CIS. Además, pudimos demostrar que dicho fragmento
funcional también es suficiente para la señalización de Vav. Esta
Vav parece ser una molécula de señalización general, pero nunca se
ha observado que esté implicada en la señalización de leptina. Dicha
secuencia funcional corta se conserva excelentemente, lo que la
hace un destino atractivo para los compuestos farmacéuticos que
modulan la señalización mediada por SOCS3, CIS y/o Vav en general y
la señalización inducida por leptina en particular.
Un primer aspecto de la invención es suministrar
un fragmento funcional de un receptor que consiste en una secuencia
seleccionada del grupo formado por SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 2, SEQ ID
Nº 3 y SEQ ID Nº 4, a ser posible que consista esencialmente en una
secuencia seleccionada del grupo formado por SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº
2 y SEQ ID Nº 3 y SEQ ID Nº 4, mejor aún si consiste en una
secuencia seleccionada del grupo formado por SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº
2, SEQ ID Nº 3 y SEQ ID Nº 4. A ser posible, dicho fragmento
consistirá esencialmente en una secuencia consistente en SEQ ID Nº
5 y SEQ ID Nº 6. Preferentemente, dicho fragmento funcional estará
implicado en la señalización por SOCS3, CIS y/o Vav cuando consista
en SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 2 o SEQ ID Nº 6 y esté implicado en la
señalización por Vav cuando consista en SEQ ID Nº 3, SEQ ID Nº 4 o
SEQ ID Nº 5. En los casos en los que la secuencia conste de un
residuo de tirosina, el fragmento funcional puede estar fosforilado
en ese residuo o no. En caso de señalización por SOCS3 y CIS, dicho
residuo de tirosina estará a ser posible fosforilado. La
fosforilzación puede llevarse a cabo mediante una quinasa asociada,
por ej., un aquinasa KAK como JAK2, que enlaza con otro dominio del
receptor, o mediante una actividad de quinasa inherente al receptor
mismo. En efecto, aunque el fragmento funcional derive del dominio
citoplasmático del receptor de leptina, es evidente para la persona
experimentada en la técnica que puede incorporarse a otros
receptores como, sin que el ejemplo sea excluyente, la familia de
los receptores de citoquina o la familia de quinasas proteínas
tirosinas, donde puede funcionar como sitio de incorporación para
las moléculas de señalización.
Otro aspecto de la invención es usar dicho
fragmento funcional para modular la señalización modulada por
ligandos. En efecto, dicho fragmento funcional está implicado en la
señalización por SOCS3, de la que se sabe que es un supresor de la
señalización de citoquina. Por lo tanto, se espera que la
incorporación de dicho fragmento funcional a un receptor de
citoquina module la señalización inducida por citoquina. Se espera
un efecto similar de otros receptores, debido a la implicación de
de la señalización por Vav. Una materialización elegida consiste en
el uso de de dicho fragmento funcional para que module la
señalización inducida por leptina. Dicha modulación puede ser útil
no sólo en los desórdenes de ingesta de alimentos y en la regulación
del peso corporal, sino también en otros fenómenos mediados por
leptina, como la angiogénesis, la curación de heridas y la
susceptibilidad a cánceres del aparato digestivo.
La modulación de lo último reviste una
importancia especial, pues se ha visto que Vav enlaza con dicho
fragmento funcional, y se sabe que Vav actúa como factor de
intercambio de guanosina y nucleótido para Rac-1,
que se halla implicado en la invasividad inducida por leptina de
las células epiteliales renales y colónicas (Attoub et al.,
2000).
Otro aspecto de la invención es el uso de dicho
fragmento funcional para cribar compuestos que interfieran con el
enlace de dicho fragmento funcional con una molécula de
señalización. En efecto, se puede construir un receptor en el que
dicho fragmento funcional sea el único fragmento funcional, como,
como ejemplo no excluyente, un receptor de leptina de ratón en el
que los residuos de tirosina de las posiciones 985 y 1138 han sido
reemplazados por una fenilalanina. Este receptor, que comprende el
fragmento funcional, puede expresarse en una célula huésped
apropiada. El enlace de un ligando con dicho receptor puede inducir
un gen indicador, con el que se media la inducción enlazando una
molécula de señalización con el fragmento funcional. Al poner en
contacto dicha célula huésped con un banco de pequeñas moléculas, o
al transfectar dicha célula huésped mediante un banco de
codificación de péptidos potencialmente inhibidores, los compuestos
que inhiben el enlace de una molécula de señalización con dicho
fragmento funcional pueden identificarse seleccionando aquellas
células huésped en las que ya no se ve inducción del gen indicador
al poner en contacto dicho receptor con su ligando. Como
alternativa, se puede monitorizar la inducción de la ruta de
señalización como tal, en lugar de inducir un gen indicador.
Otro aspecto más de la invención es un compuesto
aislado mediante el uso de dicho fragmento funcional. Dicho
compuesto puede ser, como ejemplo no excluyente, un péptido soluble
que tenga la misma secuencia que dicho fragmento funcional, o un
péptido-mimético del mismo, un anticuerpo enlazado
con dicho fragmento funcional, o un anticuerpo enlazado con un
dominio en SOCS3, CIS o Vav que enlace directa o indirectamente con
dicho fragmento funcional.
El fragmento funcional, tal como se usa aquí, es
un péptido o polipéptido, que lleva opcionalmente una o más
modificaciones, y que, cuando se integra en una molécula de un
receptor apropiado, funciona como sitio de enlace para una moléculas
de señalización. Este enlace puede ser constitutivo o inducido por
ligando.
La modificación, tal como se usa aquí, puede ser
cualquier modificación de aminoácidos conocido por las personas
experimentadas en la técnica, como, en ejemplo no excluyente, la
fosforilación, la glicosilación o la ubicuitinilación.
Consistente esencialmente significa aquí que la
citada SEQ ID se halla inserto en un fragmento funcional total de
sólo 50 aminoácidos, a ser posible de sólo 30 aminoácidos, y mejor
aún, de sólo 20 aminoácidos.
Compuesto significa cualquier compuesto químico
o biológico, incluido las moléculas orgánicas o inorgánicas simples
o compuestas, los péptidos, los péptido-miméticos,
las proteínas, los anticuerpos, los hidratos de carbono, los ácidos
nucleicos o los derivados de los mismos.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Enlace o enlazar significa cualquier
interacción, sea directa o indirecta. La interacción directa implica
contacto entre los socios del enlace. La interacción indirecta
significa cualquier interacción mediante la cual los socios de la
interacción interactúen en un complejo de más de dos compuestos. La
interacción puede ser completamente indirecta, con la ayuda de una
o más moléculas puente, o parcialmente indirecta, cuando todavía
hay contacto directo entre los socios, y que se estabiliza mediante
la interacción adicional de uno o más compuestos.
Molécula de señalización, tal como se usa aquí,
significa cualquier molécula que esté implicada en la transferencia
o inhibición de la transferencia de un receptor activado a un gen
indicador. A este respecto, una molécula que no esté directamente
implicada en la señalización misma, pero que al enlazarse al
receptor impida a otra molécula que se enlace e induzca la ruta de
señalización, se considera también molécula de señalización.
Gen indicador es cualquier gen que conduzca a
una señal detectable, y puede ser, como ejemplo no excluyente, un
gen de resistencia, un gen de toxina que da por resultado la muerte
de la célula, un gen codificador de una proteína fluorescente como
GFP, o un gen codificador de la actividad de una enzima como la
\beta-galactosidasa. La secuencia de codificación
se pone bajo el control de un promotor apropiado, esto es, un
promotor inducido mediante el enlace de un ligando al receptor y la
consiguiente inducción de la ruta del indicador.
Figura
1
Se co-transfectó células PC12
LR8 con un plásmido con codificación de SOCS3
(pMET7-fSOCS3) o vector vacío (mock, pMET7) y una
construcción indicadora pGL3-rPAP1luci. 48 horas
después de la transfección, se estimuló las células con leptina o se
las dejó sin tratar. A las 24 horas se midió por triplicado la
actividad de la luciferasa. CPS: recuento de luminiscencia absoluta
por segundo. NS: control negativo no estimulado.
Figura
2
(LRlo), que muestra partes extracelulares (EC),
de transmembrana (TM) e intracelulares (IC). Se muestra el motivo de
la Caja 1 y las tres tirosinas implicadas en la transducción de
señales.
Se transfectó transitoriamente células PC12 con
plásmidos con codificación de diferentes variantes de receptor de
leptina y se las estimuló con leptina durante 24 horas. Se llevó a
cabo un análisis por transferencia de Northern en lisados mediante
una sonda de SOCS3 de rata. Se usó una sonda
\beta-actina para la cuantificación de mARN. Se
muestra también la inducción de SOCS3 para células PC12LR8, que
expresa establemente el receptor de leptina murina. LR: receptor de
leptina; sh: isoforma corta; lo: isoforma larga; F3: todas las
tirosinas citoplasmáticas mutaron a fenilalanina.
Figura
3
Se transfectó transitoriamente células HEK293T
con plásmidos con codificación de diferentes variantes de receptor
de leptina,de SOCS3 o de vector vacío, junto con la construcción
indicadora pXP2d2-rPAP1luc. (A) Se midió los niveles
de expresión de LR en células transfectadas mediante incubación
durante 90 minutos con proteína de fusión de
Leptina-SEAP con o sin exceso de leptina (100x). Las
barras indican el valor medio y los valores SD de las mediciones
triplicadas. (B) Las células transfectadas bien se las estimuló
durante 24 horas con leptina o bien se las dejó sin tratar. Se llevó
a cabo mediciones de luciferasa por triplicado y se las normalizó
mediante co-transfección entre la construcción
pUT651 \beta-galactosidasa y un ensayo de la
actividad de la \beta-galactosidasa. Los
resultados se muestran en inducción de pliegue. (C) Análisis por
transferencia de Western de la expresión de SOCS3. La proteína SOCS3
con etiqueta FLAG se reveló en lisados de células transfectadas
mediante anticuerpo anti-FLAG. CPS: recuento por
segundo de luminiscencia absoluta; LRlo: isoforma larga del receptor
de leptina.
Figura
4
Los lisados de las células Hek293T que
sobreexpresan la proteína SOCS3 con etiqueta FLAG se incubaron con
péptidos ajustados a a los sitios Y985 e Y1077 de receptor de
leptina, fosforilados o no. El enlace específico de SOCS3 se reveló
mediante inmunotransferencia usando un anticuerpo
anti-FLAG.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Figura
5
Se transfectó transitoriamente células HEK293T
con los mutantes pGL3-rPAP1luci,
pMG1-CIS y pMET7-LR, tal como se
indica. A las 36 horas de efectuar la transfección, se estimuló las
células con leptina durante 24 horas (barras abiertas) o se las dejó
sin tratar (barras macizas). La actividad de la luciferasa se indica
como la media de mediciones por triplicado +/- SD. La actividad de
la \beta-galactosidasa a partir de pUT651 se usó
para la normalización tras las variaciones en las eficiencias de
transfección. CPS: recuento de luz por segundo.
Figura
6
Se transfectó células con:
- a.
- pMET7-mLR F3 + pMG1-VavS + pXP2d2-rPAP1luci + pUT651
- b.
- pMET7-mLR F3 Del1 + pMG1-VavS + pXP2d2-rPAP1luci + pUT651
- c.
- pMET7-mLR F3 De12 + pMG1-VavS + pXP2d2-rPAP1luci + pUT651
- d.
- pMET7-mLR F3 Del3 + pMG1-VavS + pXP2d2-rPAP1luci + pUT651
Los resultados se presentan como inducción de
pliegue comparada con el control negativo no estimulado.
(L: estimulación cen leptina; NC: control
negativo no estimulado).
Figura
7
Se cotransfectó transitoriamente las células
HEK293T con los mutantes pGL3-rPAP1luci,
pMG1-CIS y pMET7-LR, tal como se
indica. A las 36 horas de efectuar la transfección, se estimuló las
células con leptina durante 24 horas (barras abiertas) o se las dejó
sin tratar (barras macizas). La actividad de la luciferasa se indica
como la media de mediciones por triplicado +/- SD. La actividad de
la \beta-galactosidasa a partir de pUT651 se usó
para la normalización tras las variaciones en las eficiencias de
transfección. CPS: recuento de luz por segundo.
(L: estimulación cen leptina; NC: control
negativo no estimulado).
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo el anticuerpo M2 monoclonal
anti-FLAG a partir de Sigma. La leptina recombinante
de ratón se adquirió a R&D Systems. Los péptidos se
sintetizaron mediante química de fase sólida de Fmoc aminoácido
estándar en un sintetizador de péptidos de biosistemas aplicados,
modelo 431A. Se esterificó manualmente la biotina siguiendo
procedimientos similares a los del sintetizador y se la añadió a la
mezcla de la reacción. Se efectuó la incorporación de fosfotirosina
mediante un fosfobenciléster de Fmoc tirosina protegido
(Novabiochem). Después de purificarla, se confirmó la masa de los
péptidos mediante espectrometría de masa. Las secuencias de los
péptidos que se usó fueron
biotina-QRQPSVK(p)Y_{985} TLVSNDK y
biotina-NHREKSVC(p) Y_{1077}LGVTSVNR.
\vskip1.000000\baselineskip
Generación de los mutantes del receptor de
leptina, del borrado de LepR F3 y de los mutantes punta de mLR
F3.
La generación de los mutantes del receptor de
leptina fue descrita por Eyckerman et al. (1999). El receptor
de leptina mutante (isoforma larga) aparece indicado como mLR. MLR
F3 es el mutante en el que todos los residuos citoplasmáticos mutan
a fenilalanina.
Mediante mutagénesis específica puntual
(Quikchange ^{TM}, Strategene) se construyó tres borrados y un
mutante punta del mLR F3, clonado en el vector de expresión pMET7.
Los mutantes de borrado LR F3 Del1 (aa: 1-1103), LR
F3 Del2 (aa: 1-1050) y LRF3 Del3
(aa:1-952) se crearon mutando Ala en la posición
1104 (combinaciones de cebo
MBU-O-993 y
MBU-O-994), Ser en la posición 1051
(combinación de cebo MBU-O-885 y
MBU-O-886) y Cys en la posición 953
(combinación de cebo MBU-O-887 y
MBU-O-888) a un codón de
terminación, respectivamente. En cada caso se construyó
simultáneamente un sitio extra de restricción EcoRV para distinguir
el ADN mutado del parental.
Se amplificó el cADN SOCS3 de rata mediante
5'-GAAGATCTGTGCGCCATGGTCACCCACAGCAAGTT y
5'-GCTCTAGATTTTGCTCCTTAAAGTGGAGCATCATA como cebo
directo e inverso, respectivamente, y mediante mARN de células PC12
estimuladas por leptina como plantilla. El sADN se preparó mediante
un procedimiento RT estándar con Transcriptasa Inversa de Índice
Superior (Life Technologies). La amplificación se realizó mediante
polimerasa Pfu (Stratagene). El fragmento SOCS3 se volvió a
amplificar mediante el cebo directo
5'-GCGAGATCT
CAGAATTCGTCACCCACAGCAAGTTTCC y el cebo inverso descrito más arriba, que permite el clonado basado en Bglll-Xbal en una variante de pMET7 que contiene una secuencia de etiqueta FLAG de N-terminal (MDYKDDDDK), lo que da por resultado pMET7-fSOCS3.
CAGAATTCGTCACCCACAGCAAGTTTCC y el cebo inverso descrito más arriba, que permite el clonado basado en Bglll-Xbal en una variante de pMET7 que contiene una secuencia de etiqueta FLAG de N-terminal (MDYKDDDDK), lo que da por resultado pMET7-fSOCS3.
Se generó construcciones en el vector pMET7,
bajo el control del promotor SR\alpha. Mediante mutagénesis
específica puntual (Quikchange ^{TM}, Stratagene) se generó un
único sitio de restricción Apal entre el promotor SR\alpha y el
sitio EcoRI en la construcción mMET7mcs, un derivado de pMET7 que
contiene un sitio de clonación múltiple. Se amplificó la parte del
terminal C del aminoácido 158 mediante los cebos
5'GACGGGCCCGCCACCATGGATTACAAG
GATGAC-GACGATAAGATCTCGACCGT GGTACACAGTGGC y 5'GCGAATTCCGAACCGCCCTGAGGCATG
TAGCCGCC. El cebo directo también lleva codificada la secuencia de etiqueta FLAG (MDYKDDDDK) y contiene sitios Apal y Bglll. El cebo inverso contiene una secuencia bisagra GGS y un sitio de restricción EcoRI que permite una clonación basada en Apal-EcoRI en la construcción pMET7, lo que da por resultado el vector básico pMG1.
GATGAC-GACGATAAGATCTCGACCGT GGTACACAGTGGC y 5'GCGAATTCCGAACCGCCCTGAGGCATG
TAGCCGCC. El cebo directo también lleva codificada la secuencia de etiqueta FLAG (MDYKDDDDK) y contiene sitios Apal y Bglll. El cebo inverso contiene una secuencia bisagra GGS y un sitio de restricción EcoRI que permite una clonación basada en Apal-EcoRI en la construcción pMET7, lo que da por resultado el vector básico pMG1.
Se amplificó un fragmento del antígeno
SV40-T (aminoácido 261-708) mediante
los cebos 5'GCGAATTCG
AAG-CAGAGGAAACTAAACAAGTG y 5'CGTCTAGAGCGGCCGCAGATCTCGAGTCGCGATTATGTTTCAGG
TTCAG-GGGGAG. La parte N-terminal de SV40-T que contenía la señal de localización nuclear se borró para impedir el vaivén nuclear. El cebo directo contiene un sitio EcoRI, mientras que el inverso contiene un codón de terminación y sitios de restricción NruI, XhoI, BgIII, NotI y XbaI. El enlace de este fragmento con el vector pMG1 da por resultado el vector pMG1-SVT.
AAG-CAGAGGAAACTAAACAAGTG y 5'CGTCTAGAGCGGCCGCAGATCTCGAGTCGCGATTATGTTTCAGG
TTCAG-GGGGAG. La parte N-terminal de SV40-T que contenía la señal de localización nuclear se borró para impedir el vaivén nuclear. El cebo directo contiene un sitio EcoRI, mientras que el inverso contiene un codón de terminación y sitios de restricción NruI, XhoI, BgIII, NotI y XbaI. El enlace de este fragmento con el vector pMG1 da por resultado el vector pMG1-SVT.
Se amplificó el CIS murino con cebo directo
5'GCGGAATTCGTCCTCTGCGTACAG GGATC y con el cebo inverso
5'GCCTCTAGATCAGAGTTGGAAGGGGTACTG). La clonación basada en
EcoRI-XbaI en la construcción
pMG1-SVT dio por resultado el plásmido
pMG1-CIS.
Un vector del CIS2 humano (aa
34-198) que contenía el dominio SH2 y la secuencia
de caja SOCS se amplificó mediante RT-PCR usando
los cebos MBU-O-1046 y
MB-O-1047 como cebo directo e
inverso respectivamente. El cebo directo contiene un sitio EcoRI,
mientras que el inverso contiene el codón de terminación y un sitio
de restricción NotI. El ARN de las células HEK293 cl16 se usó como
entrada en un procedimiento de un solo paso RT-PCR
(kit Qiagen Onestep RT-PCR). La clonación de EcoRI
NOtI en pMG1-SVT dio por resultado
pMG1-CIS2.
Se amplificó un fragmento de Vav1 humano (VavS:
aa 259-789) mediante polimerasa Pfu del mARN de la
línea de células del TF1 humano con técnicas estándar
RT-PCR. El cebo directo fue
MBU-O-737, y el inverso,
MBU-O-738.
MBU-O-737 contiene un EcoRI extra
que permite la fusión de trama con gp130, mientras que
MBU-O-738 contiene un codón de
terminación y un sitio de reconocimiento de XhoI. Se subclonó el
fragmento amplificado en el vector pCR® -Blunt y se lo enlazó con
el vector pMG1 por intercambio basado en EcoRI-XhoI,
lo que dio por resultado pMG1-VavS.
La construcción pUT651 que expresa la
\beta-galactosidasa fue proporcionada por
Eurogentec. La generación de la construcción
pGL3-rPAP1luci fue descrita por Eyckerman et
al. (1999). El fragmento promotor de rPAP1 de longitud completa
se extirpó mediante digestión parcial con KpnI y XhoI y se lo enlazó
con el vector pXP2d2 de KpnI-XhoI resumido
(obsequio del profesor S. Nordeen), lo que dio por resultado la
construcción indicadora
pXP2d2-rPAP1-luci sensible a la
leptina. El vector pXP2d2 es un derivado de pXP2 que carece de los
sitios potenciales de Proteína 1 Activadora críptica (Grima y
Nordeen, 1999).
Se verificó todas las construcciones mediante
restricción y análisis secuencial.
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
- MBU-O-737 cebo hVavS
- F 5'-GCGGAATTCAAGCTGGAGGAATGTTCTCA
- MBU-O-738 cebo hVavS
- R 5'-GCCTCGAGTTACACGTAGTTGGCAGGGAACC
- MBU-O-993 mutagénesis mLR F3 Del1
- F 5'-TCCTGTGCACATTCCCATGACCATGGCTGTTC AGTGACATCA
- MBU-O-994 mutagénesis mLR F3 Del1
- R 5'-TGATGTCACTGAACAGCCATGGTCATGGGAAT GTGCACAGGA
- MBU-O-885 mutagénesis mLR F3 Del2
- F 5'-GATTTCACCACAACTTTGATATCCGGGGTTGG ATGAGC
- MBU-O-886 mutagénesis mLR F3 Del2
- R 5'-GCTCATCCAACCCCGGATATCAAAGTTGTGGT GAAATC
- MBU-O-887 mutagénesis mLR F3 Del3
- F 5'-GAAAGCAGTTCTATTTGATATCGTGACCAGTG TAACAG
- MBU-O-888 mutagénesis mLR F3 Del3
- R 5'-CTGTTACACTGGTCACGATATCAAATAGAACT GCTTTC
- MBU-O-924 mutagénesis mLR Fall R225A/E226A
- F 5'-CACCTCCGTCAACAGAGCGGCTAGCGGTGTG CTTTTGACTGGTG
- MBU-O-925 mutagénesis mLR Fall R225A/E226A
- R 5'-CACCAGTCAAAAGCACACCGCTAGCCGCTCT GTTGACGGAGGTG
- MBU-O-1045 cebo CIS2
- F 5'-GCAGAATTCACCCTGCGGTGCCTGGAGCC
- MBU-O-1046 cebo CIS2
- R 5'-GCTGCGGCCGCTTATACCTGGAATTTATATTC TTCC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones de cultivo y los procedimientos
de transfección transitoria para PC12 y la generación de la línea de
células PC12LR8 fueron como se ha explicado antes (Eyckerman et
al., 1999, Waelput et al., 2000).
Se mantuvo las células HEK293T en una atmósfera
humidificada al 10% de Co_{2} y a 37º, y se criaron mediante DMEM
con glucosa a 4.500 mg/l, 10% de suero fetal bovino y gentamicina a
50 \mug/ml (todos ellos suministrados por Life Technologies). De
forma típica, se sembró 4,10^{5} células el día antes de la
transfección en una placa de 6 pocillos y se las transfectó por la
noche con unos 2 \mug de ADN plásmido mediante un procedimiento
estándar de precipitación de fosfato de calcio. Al día siguiente de
la transfección, se volvió a suspender las células con Agente de
Disociación de Células (Life Technologies), se las sembró en una
placa de pocillos negra (Costar) y se las estimuló durante la noche
con 100 ng/mg de leptina, o se las dejó sin estimular.
Los ensayos de luciferasa, los ensayos de enlace
mediante Leptina-SEAP y las hibridaciones de la
transferencia de Northern con SOCS3 y sondas de actina fueron
descritos anteriormente por Eyckerman et al. (1999). Se midió
la actividad de la \beta-galactosidasa por medio
del kit de detección quimiluminiscente
Galacto-Star^{TM} (Tropix) y con un contador de
quimiluminiscencia Topcount (Packard).
Se lisó aproximadamente 10^{6} células HEKT en
2 x solución tampón de carga de 150 \mul. Tras la sonicación, se
cargó 30 \mul en un gel de poliacrilamida al 10%. Se dejó
transferir toda la noche y luego se reveló el SOCS3 con etiqueta
FLAG mediante una dilución a 1/2500 de anticuerpo
anti-FLAG. La eficiencia de la transferencia se
comprobó mediante tintura de Ponceau (Sigma). Para la cromatografía
de afinidad fosfopeptídica, se lisó aproximadamente 3,10^{7}
células HEK293T transfectadas transitoriamente como se ha indicado
más arriba en solución tampón de lisado (20 mM de Hepes pH7; 1 mM
de MgCl_{2}; 10 mM de KCl; 0,5 mM de DTT; 15 0 mM de NaCl; 0,5%
de NP40; 1 mM de NaVO_{4}; 5 mM de NaF; 20% de glicerol; Cóctel
inhibidor de proteasa Complete^{TM} [Roche]).El material
precipitado se aclaró por centrifugado durante 5 minutos a 10.000 g.
A fin de eliminar las interacciones a-específicas,
se llevó los sobrenadantes a una precolumna que contenía nódulos de
Sefarosa 4B, anteriormente a la cromatografía de afinidad
fosfopeptídica en nódulos de agarosa unidos a streptavidina (Sigma).
Se determinó las concentraciones de péptidos por ensayo
colorimétrico mediante hidrólisis alcalina y un reactivo de
ninhidrina. Se incubó 50 \mul de suspensión de
streptavidina-agarosa con 50 nmoles de péptido para
cada reacción. Se incubó el lisado aclarado durante 2 horas a 4ºC a
remoción lenta. Tras la incubación, se lavó los nódulos cuatro
veces con solución tampón de lisis y se los volvió a poner en
suspensión en 2 x solución tampón de carga.
La observación de que la mayoría de pacientes
obesos muestran elevados niveles de leptina sugiere la existencia
de una llamada resistencia a la leptina (Maffei et al.,
1995). SOCS3, mediador potencial de esta resistencia (Bjorbaek
et al., 1998) es miembro de una familia del dominio SH2 que
contiene proteínas implicadas mayormente en la regulación negativa
de las rutas de transducción de señales (Hilton et al.,
1998).
Mediante análisis de diferencia representativa,
se identificó un cribado de expresión diferencial basado en PCR en
células PC12 que expresaban el receptor de leptina de ratón y varias
transcripciones inducidas por leptina, incluido SOCS3. A fin de
comprobar el papel inhibitorio de SOCS3 en la señalización de
leptina en los sistemas de células usados, se generó un vector de
expresión que contenía SOCS3 de rata. La expresión transitoria de
SOCS3 en células PC12 LR8, un clon PC12 que expresa de manera
estable el receptor de leptina, junto con la construcción
pGL3-rPAP luci, conduce a una marcada inhibición de
la inducción del indicador mediado por leptina (Fig. 1). El
promotor rPAP1 deriva del gen de rata de la Proteína 1 Asociada a la
Pancreatitis que muestra una fuerte inducción en células PC12
durante el tratamiento con leptina más forskolina (Waelput et
al., 2000). Se obtuvo similares resultados en células HEK293T
transfectadas transitoriamente con el receptor de leptina, SOCS3 y
las construcciones pXP2d2-rPAP1luci. La construcción
pXP2d2-rPAP1luci mostró enla célula HEK293T una
proporción señal/fondo aumentada 4 veces y una reproducibilidad más
alta en comparación con la construcción del indicador basada en
pGL3. Tomados en conjunto, estos hallazgos confirman la actividad
inhibitoria de SOCS3 en nuestros sistemas de indicador basados en
células.
El receptor de leptina murina contiene tres
residuos de tiroxina dentro de su dominio citoplasmático (Fig. 2A).
Y1138 está situado dentro de un motivo de incorporación caja 3 o
STAT 3 y es crítica para la inducción de gen mediado por leptina.
Previamente se observó un papel crítico para Y985 y, en menor
medida, también para Y1077, en el receptor de leptina murina en una
señal de retroalimentación negativa (Eyckerman et al.,
1999). Para evaluar el efecto de las mutaciones Y a F dentro del
receptor de leptina en la propia expresión SOCS3, se llevó a cabo
el análisis de transferencia de Northern mediante células PC12
transfectadas transitoriamente con mutantes del receptor de
leptina. 48 horas después de la transfección, se estimuló las
células con leptina (100 ng/ml) o se las dejó sin tratar (Fig. 2B).
Los resultados obtenidos previamente indican que la transcripción
de SOCS3 es rápidamente inducida en células PC12 con un tiempo
óptimo de 30 minutos aproximadamente, pero también que persiste una
débil expresión de SOCS3 hasta puntas de tiempo final (Waelput et
al., 2000). Los resultados que aparecen en la Fig. 2B implican
que durante esta última fase de inducción, la mutación de Y985 da
por resultado una fuerte regulación ascendente de la transcripción
de SOCS3. Esto se da sólo en conjunción con Y1138, un sitio de
activación de STAT3, e indica que la expresión de SOCS3 es
dependiente de STAT, como ya se ha observado anteriormente en la
señalización mediante los receptores de IL-6 y del
factor inhibitorio de la leucemia (Auernhammer et al., 1999,
Schmitz et al., 2000). La ausencia del sitio Y1077 no conduce
a la expresión de SOCS3 mARN alterado, sino que carece de
resultados de ambos sitios en un posterior nivel de inducción
aumentado sobre lo que se observó para sólo el mutante Y985. Estos
resultados concuerdan con los anteriores resultados para la
regulación de metalotioneína mARN II (Eyckerman et al.,
1999). Una posible explicación del elevado nivel de de expresión de
SOCS3 podría ser la pérdida de retroalimentación negativa mediante
el propio SOCS3 o, como alternativa, mediante el SH2 que contiene
fosfatasa SHP-2 (Carpenter et al., 1998, Li y
Friedman, 1999).
Se ha observado que tanto SOCS3 como la proteína
que contiene SH2 inducible por citoquina (CIS), otro miembro de la
familia SOCS, enlazan receptores activados. SOCS3 enlaza con el
componente señalizador de gp130 del complejo IL-6
(NIcholson et al., 2000,Schmitz et al., 2000), el
receptor de eritropoyetína (Sasaki et al. 2000) y el
receptor de insulina (Emanuelli et al., 2000), mientras que
CIS enlaza con el receptor de eritropoyetína y la cadena ordinaria
\beta (Yoshimura et al., 1995) pero también con el receptor
de leptina (véase ejemplo 2). Basándonos en su semejanza funcional
con la cadena gp130, hicimos una prueba de la interacción del
receptor de leptina con SOCS3. Variantes del receptor de leptina
que contienen mutaciones Y a F en las posiciones Y985, Y1077, o en
ambos sitios, se sometieron a prueba en un ensayo funcional basado
en inducción rPAP1. la señalización mediante las variantes del
receptor de leptina se analizó en la transfección transitoria en
células HEK293T con la construcción de expresión
pXP2d2-rPAP1luci y pMET7-fSOCS3 con
etiqueta FLAG. Se normalizó los datos de la actividad de luciferasa
mediante transfección con pUT651 y un ensayo de actividad de
\beta-galactosidasa (Fig. 3B). La expresión de
los variantes del receptor de leptina y de SOCS se confirmó
respectivamente mediante un ensayo de enlace usando una proteína de
fusión leptina-SEAP (Fig. 3A) y un análisis de
transferencia de Western usando un anticuerpo
anti-FLAG (Fig. 3C). Los resultados indicaron una
fuerte actividad inhibitoria de SOCS3 (inhibición del
80-90%) cuando se expresó bien el tipo natural o
bien el mutante Y1077F del receptor de leptina, y una inhibición
moderada (del 30-50%) en la expresión de una
variante del receptor Y985F. En el caso del mutante doble
Y985/1077F, no se observó ninguna inhibición.
\newpage
Los sitios de interacción de SOCS3 con el
receptor de leptina se confirmaron mediante enfoque bioquímico. El
SOCS3 con etiqueta FLAG se expresó en la transfección transitoria de
pMET7-fSOCS3 en células HEK293T, y se analizó su
enlace con la (fosfo)-tirosina que contiene péptidos
y que se corresponde con los dos motivos de dentro del receptor de
leptina. Se incubó lisados de aproximadamente 3x10^{7} células
transfectadas con péptidos biotinilados que rodeaban residuos Y985
o Y1077 en el receptor de leptina. Un análisis de trasferencia de
Western mediante un anticuerpo anti-FLAG mostró un
claro y específico enlace de SOCS3 con el péptido fosforilado Y985,
mientras que el péptido no fosforilado no enlazó con ninguna
proteína SOCS3. SOCS3 también enlaza específicamente con una
afinidad mucho más baja, confirmando su papel accesorio en la
inhibición mediada por SOCS3.
En conjunto, estos hallazgos sugieren que ambas
tirosinas están implicadas en la incorporación de SOCS3 al complejo
activado del receptor de leptina, aunque el enlace con la posición
Y1077 se da claramente en una eficiencia significativamente más
baja, lo que sugiere un papel accesorio para este sitio. Esta
observación podría explicar por qué, en la postestimuación de
puntas de tiempo final, el mutante simple Y1077 no conduce a
diferencias detectables en la inducción de genes de metalotioneína
II y SOCS3 si se compara con el receptor de tipo natural, mientras
que se observa una inducción más pronunciada si se compara el doble
mutante Y985/1077F con la variante del receptor de Y985F (Fig. 2).
En la misma línea de estos hallazgos, la incorporación de SOCS3 al
motivo simple de Y1077 fosforilado muestra una moderada inhibición
de la señalización de leptina (Fig. 3). Tall vez este papel
accesorio del motivo Y1077 es sólo funcional cuando los niveles de
expresión de SOCS3 son muy elevados, lo que sugiere que pueden
existir diferentes niveles umbral para la señalización de del
receptor de leptina. Aunque diferentes grupos no fueron capaces de
mostrar fosforilación dependiente de leptina del sitio Y1077 en el
receptor de leptina mediante anticuerpos
anti-fosfotirosina (Li y Friedman, 1999, Banks
et al., 2000), nuestros resultados indican un papel funcional
dependiente de fosforilación para este sitio en la señalización de
leptina.
Es de notar que un tramo de 10 aminoácido aguas
abajo del motivo Y1077 se conserva muy bien a lo largo de la
evolución. Esta conservación tan pronunciada del motivo Y1077
subraya también su importancia funcional en la señalización de
leptina.
La expresión CIS es rápidamente inducida por la
leptina, pero nunca se ha visto su incorporación al receptor de
leptina. Mediante ensayo funcional se ha demostrado el enlace de CIS
con los dos motivos fosforilados Y985 e Y1077. Se usó los mutantes
del receptor de leptina que contenían la mutación de Y1138F, lo que
dio por resultado la ausencia de STAT (Baumann et al., 1996)
y la activación del promotor rPAP1 (Eyckerman et al., 1999).
Los mutantes del receptor Y1138F que contenían sustituciones
adicionales Y a F en las posiciones Y985, Y1077, o ambas, se
transfectaron transitoriamente con la construcción
gp130-CIS y los vectores indicadores
pXP2d2-rPAP1luci y pUT651. Los datos de la
luciferasa normalizada aparecen en la Figura 5 e indican la
incorporación funcional comparable de CIS a los dos motivos de
tirosina sencillos, Y985 e Y1077, dentro del receptor de leptina.
Conforme al uso de ambos sitios, se obtiene una señal más potente
para el receptor simple del mutante Y1138F. En el caso de células
transfectadas con pMET7-LR-F3 o con
vector vacío, no se induce actividad de luciferasa. No se observó
diferencia alguna en los niveles de expresión de los receptores
mutantes.
La comparación mutua y la relación cruzada entre
especies de los contextos de aminoácido de los residuos de Y985 e
Y1077 son la base de los datos funcionales sobre la incorporación de
CIS en ambos lados.
Se comprobó la funcionalidad de los borrados mLR
F3 mediante las siguientes transfecciones en células HEK293T:
- a.
- pMET7-mLR F3 + pMG1-VavS + pXP2d2-rPAP1luci + pUT651
- b.
- pMET7-mLR F3 Del1 + pMG1-VavS + pXP2d2-rPAP1luci + pUT651
- c.
- pMET7-mLR F3 Del2 + pMG1-VavS + pXP2d2-rPAP1luci + pUT651
- d.
- pMET7-mLR F3 Del3 + pMG1-VavS + pXP2d2-rPAP1luci + pUT651
La transfección se llevó a cabo de la manera
siguiente: Se preparó 300 \mul de una mezcla de precipitado que
contenía 3,05 \mug de ADN (0,05 \mug de pUT651; 1 \mug de cada
uno de los demás vectores). Se añadió 200 \mul de esta mezcla a
4,10^{5} células durante 18 horas. Tras lavarlas con
PBS-A, se incubó otra vez las células en 3 ml de
medio DMEM durante 24 horas. Luego se las volvió a suspender con 200
\mul de agente de disociación celular y se añadió medio DMEM
hasta un volumen total de 2 ml. Se transfirió 50 \mul de esta
suspensión celular a una placa de 96 pocillos por cada transfección
y se llevó a cabo una estimulación con leptina (concentración final
ng/ml) por triplicado. A las 24 horas de la estimulación se midió la
luciferasa y la \beta-galactosidasa como se ha
explicado más arriba.
Como se ve en la figura 6, los resultados
ilustran el hecho de que, de los tres mutantes de borrado, sólo el
mLR F3 Del1 (transfección b) muestra una inducción significativa del
promotor rPAP1. Las transfecciones c y d, si se las compara con el
mLR F3 (transfección a), carecen de inducción de actividad de
luciferasa con leptina.
Se llevó a cabo un ensayo funcional en células
HEK293T parecido al del ejemplo 2. Se co-transfectó
los mutantes de la variante del receptor de leptina con la
construcción pMG1-CIS2 y con los dos indicadores
pXP2d2-rPAP1luci y pUT651. En la Figura 7 aparecen
los datos de la luciferasa normalizada. No se observó diferencia
alguna en los niveles de expresión de los receptores mutantes. Los
datos que aparecen son la media de mediciones por triplicado. CIS2
enlaza predominantemente con el sitio Y1077, mientras que el enlace
con el sitio Y985 es menos pronunciado. No se observó inducción
significativa de luciferasa cuando se transfectó el mutante
LR-F3.
\vskip1.000000\baselineskip
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Esta lista de los documentos mencionados por
el solicitante ha sido confeccionada exclusivamente para la
información del lector y no forma parte integral del documento de
patente europea. La misma fue confeccionada con sumo cuidado; pero
la EPA no asume ninguna responsabilidad por cualquier error u
omisión.
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VOOR BIOTECHNOLOGIE VZW
\vskip1.000000\baselineskip
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<120> FRAGMENTO FUNCIONAL DE UN
RECEPTOR
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<130> JTA/TYR/V076
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<150> EP 00204001.2
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<151>
2000-11-14
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<150> US 60/248,970
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<151>
2000-11-15
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<160> 30
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<170> PatentIn versión 3.1
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<223> Descripción de secuencia artificial:
fragmento funcional del receptor de leptina
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
fragmento funcional del receptor de leptina
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<223> Descripción de secuencia artificial:
fragmento funcional del receptor de leptina
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<223> Descripción de secuencia artificial:
fragmento funcional del receptor de leptina
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<223> Descripción de secuencia artificial:
fragmento funcional del receptor de leptina
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<221> RASGO MISCELÁNEO
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<222> (2) .. (4)
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<223> X desde posición 2 a 4 puede ser
cualquier aminoácido
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<221> RASGO MISCELÁNEO
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<222> (7) .. (7)
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<223> X desde posición 7 puede ser un Val,
Ile o Leu
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<221> RASGO MISCELÁNEO
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<223> X desde posición 8 puede ser un Cys
o Tyr
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<221> RASGO MISCELÁNEO
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<223> X desde posición 12 puede ser un Val
o Ile
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<221> RASGO MISCELÁNEO
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<223> X desde posición 15 puede ser un Val
o Ile
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cualquier aminoácido
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de secuencia artificial:
fragmento funcional del receptor de leptina
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<221> RASGO MISCELÁNEO
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<223> X desde posición 2 a 4 puede ser
cualquier aminoácido
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<223> X desde posición 7 puede ser un Val
o Ile
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<221> MISC_FEATURE
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<223> X desde posición 8 puede ser un Cys
or Tyr
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<223> X desde posición 12 puede ser un Val
o Ile
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<221> RASGO MISCELÁNEO
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<223> X desde posición 15 puede ser un Val
o Ile
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<223> X desde posición 16 a 17 puede ser
cualquier aminoácido
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\sa{Asn Xaa Xaa Xaa Lys Ser Xaa Xaa Tyr Leu Gly
Xaa Thr Ser Xaa Xaa}
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<213> Secuencia artificial
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<223> La secuencia comienza con
biotina-Q
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<221> RASGO MISCELÁNEO
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<223> Tyr985 es fosforilado
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Val Ser Asn Asp Lys}
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia comienza con
biotina-N
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> RASGO MISCELÁNEO
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<223> Tyr1077 es fosforilado
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 8
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\sa{Asn His Arg Glu Lys Ser Val Cys Tyr Leu Gly
Val Thr Ser Val Asn}
\sac{Arg}
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<210> 9
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<211> 35
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebo directo para amplificación de SOCS3 cADN de rata
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskipgaagatctgt gcgccatggt cacccacagc aagtt
\hfill35
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<210> 10
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebo inverso para amplificación de SOCS3 cADN de rata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctctagatt ttgctcctta aagtggagca tcata
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebo directo para reamplificación del fragmento SOCS3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgagatctc agaattcgtc acccacagca agtttcc
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
secuencia N-terminal con etiqueta FLAG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebo usado para amplificación de la parte 158 AA
C-terminal del gp130 humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebo usado para amplificación de la parte 158 AA
C-terminal del gp130 humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgaattccg aaccgccctg aggcatgtag ccgcc
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebo para la amplificación de un fragmento del antígeno
SV40-T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgaattcga agcagaggaa actaaacaag tg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebo para la amplificación de un fragmento del antígeno
SV40-T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtctagagc ggccgcagat ctcgagtcgc gattatgttt caggttcagg gggag
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebo directo para amplificación de CIS murino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggaattcg tcctctgcgt acagggatc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebo inverso para amplificación de CIS murino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcctctagat cagagttgga aggggtactg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebo MBU-O-737
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggaattca agctggagga atgttctca
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebo MBU-O-738
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcctcgagtt acacgtagtt ggcagggaac c
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebo MBU-O-993
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcctgtgcac attcccatga ccatggctgt tcagtgacat ca
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebo MBU-O-994
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgatgtcact gaacagccat ggtcatggga atgtgcacag ga
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebo MBU-O-885
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatttcacca caactttgat atccggggtt ggatgagc
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebo MBU-O-886
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctcatccaa ccccggatat caaagttgtg gtgaaatc
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebo MBU-O-887
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaagcagtt ctatttgata tcgtgaccag tgtaacag
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebo MBU-O-888
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgttacact ggtcacgata tcaaatagaa ctgctttc
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebo MBU-O-924
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacctccgtc aacagagcgg ctagcggtgt gcttttgact ggtg
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebo MBU-O-925
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaccagtcaa aagcacaccg ctagccgctc tgttgacgga ggtg
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebo MBU-O-1045
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagaattca ccctgcggtg cctggagcc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebo MBU-O-1046
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctgcggccg cttatacctg gaatttatat tcttcc
\hfill36
Claims (10)
1. Fragmento funcional de un receptor
constituido por un máximo de 50 aminoácidos, que comprende una
secuencia seleccionada del grupo formado por SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº
2, SEQ ID Nº3 y SEQ ID Nº 4.
2. Fragmento funcional de un receptor
constituido por la SEQ ID Nº 5.
3. Fragmento funcional de un receptor
constituido por la SEQ ID Nº 6.
4. El fragmento funcional según la
reivindicación 1 ó 2, implicado en la señalización de Vav.
5. El fragmento funcional según la
reivindicación 1, en donde dicha secuencia es SEQ ID Nº 1 o SEQ ID
Nº 2, implicado en la señalización de Vav, SOCS3 o CIS.
6. El fragmento funcional según la
reivindicación 3, implicado en la señalización de Vav, SOCS3 o
CIS.
7. Fragmento funcional según una de las
reivindicaciones 1-6 destinado a uso como
medicamento.
8. Uso de un fragmento funcional según la
reivindicación 7 para la preparación de un medicamento para tratar
los desórdenes de la ingesta de alimentos, la angiogénesis
patológica y el cáncer.
9. Uso de un fragmento funcional según una de
las reivindicaciones 1-6 para cribar los compuestos
que interfieren con el enlace de dicho fragmento funcional con una
molécula de señalización.
10. Utilización de un fragmento funcional según
la reivindicación 9, en donde dicha molécula de señalización es Vav,
SOCS3 o CIS.
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