ES2282160T3

ES2282160T3 - Peptidos natriureticos quimericos.

Info

Publication number: ES2282160T3
Application number: ES00988092T
Authority: ES
Inventors: John Burnett, Jr.; Ondrej Lisy
Original assignee: Mayo Foundation for Medical Education and Research
Current assignee: Mayo Foundation for Medical Education and Research
Priority date: 1999-12-17
Filing date: 2000-12-15
Publication date: 2007-10-16
Anticipated expiration: 2020-12-15
Also published as: US7964564B2; DK1242452T3; DE60033431T2; US7384917B2; CA2395585C; ATE353916T1; PT1242452E; CA2395585A1; EP1242452A2; US20050059600A1; JP5031964B2; DE60033431D1; AU2433901A; US20020082219A1; EP1242452B1; JP2003517005A; WO2001044284A3; US20090170756A1; US6818619B2; US6407211B1

Abstract

Un fragmento peptídico biológicamente activo aislado y purificado del péptido natriurético Dendroaspis (DNP), que comprende la SEQ ID NO: 3, en donde el péptido tiene por lo menos una actividad seleccionada del grupo que consiste en vasodilatación, natriuresis, diuresis y actividad supresora de renina.

Description

Péptidos natriuréticos quiméricos.

Antecedentes de la invención

El péptido natriurético auricular (ANP) es el primer péptido descrito en una familia de hormonas que regulan la homeostasis de los fluidos corporales (véase Brenner et al., 1990). La descripción de las potentes propiedades diuréticas y natriuréticas de los extractos auriculares por Bold et al. (1981) fue el primer indicio de que el corazón podría ser un órgano endocrino. El subsiguiente aislamiento y la caracterización de esta actividad por grupos que incluyen a Flynn et al. (1981) caracterizaron al ANP como la primera hormona cardíaca segregada. El ANP es segregado por miocitos auriculares en respuesta a un aumento en el volumen intravascular. Una vez en la circulación, tiene efectos principalmente en el riñón, el tejido vascular y la glándula suprarrenal, en donde sus acciones conducen a la excreción de sodio y agua
por parte de los riñones y a una disminución en el volumen intravascular y en la presión arterial (Atlas et al., 1987).

Matsuo y sus co-trabajadores aislaron otros dos péptidos natriuréticos. El péptido natriurético cerebral (BNP) y el péptido natriurético de tipo C (CNP) se aislaron ambos de extractos de cerebro porcino en base a sus potentes efectos relajantes sobre el recto de pollo (Sudeh et al., 1988; Sudeh et al., 1990). El BNP es de origen celular de miocardio, y al igual que el ANP circula en plasma humano (de Bold et al., 1981; Burnett et al., 1984). El BNP es natriurético, inhibidor de renina, vasodilatador y lusitrópico (Mukoyama et al., 1991; Yamamoto et al. 1996; Grantham et al., 1996). El CNP es de origen celular endotelial y funciona como un péptido inhibidor del crecimiento y vasodilatador (Suga et al., 1992; Stingo et al., 1992; Koller et al., 1991). El ANP y el BNP aumentan en el plasma y el corazón durante la insuficiencia cardíaca congestiva (CHF) en seres humanos, y ejercen importantes acciones protectoras cardiorrenales además de servir como marcadores de suero para la disfunción ventricular (Stevens et al., 1995; Yamamoto et al., 1997; McDonagh et al., 1998).

El ANP, BNP y CNP se sintetizan a partir de grandes proteínas precursoras, y los péptidos activos maduros tienen un lazo de 17 aminoácidos formado por un ligamiento disulfuro intramolecular. En los péptidos humanos, 11 de estos aminoácidos son idénticos en ANP, BNP y CNP, mientras que los extremos - y C varían tanto en longitud como en composición (véanse Kambayashi et al., 1990; y Tawaragi et al., 1991). El CNP no tiene extremo C, y los estudios de la estructura del gen para el CNP demostraron que la traducción es terminada por un codón finalizador inmediatamente después del codón de cisteína final en el ARNm.

Entre las especies, la secuencia de aminoácidos tanto de ANP como de CNP se conserva en gran medida, mientras que la estructura del BNP varía ampliamente. Por ejemplo, los ANP humanos y porcinos de 28 aminoácidos maduros son idénticos, y hay solo una sustitución en el péptido de rata. La existencia de esta variación estructural, sumada a la presencia de por lo menos tres tipos de receptores específicos para los péptidos natriuréticos, sugiere que el control fisiológico de la homeostasis de los fluidos corporales es compleja. El ANP y el CNP disminuyen ambos la pre-carga cardíaca. No obstante, a diferencia del ANP, el CNP no es natriurético (Stingo et al., 1992).

Las diversas acciones del ANP, BNP y CNP tanto en el sistema cardiovascular como en el riñón, como también sus funciones en los estados patofisiológicos tales como insuficiencia cardíaca, hipertensión y nefropatía, han hecho que los péptidos nativos y sus moléculas análogas sean de gran interés tanto para científicos clínicos como básicos. Véanse, por ejemplo, Lewicki et al. (patentes estadounidenses Nos. 5,114,923, 4,804,650 y 4,757,048), Johnson et al. (patente estadounidense No. 5,047,397) y Johnson et al. (patente estadounidense No. 4,935,492), y Wei et al. (patente estadounidense No. 5,583,108). La patente estadounidense No. 5,583,108 se refiere a una quimera de ANP y CNP, que se denomina péptido vasonatrina (VNP). El VNP, que incluye 22 aminoácidos de CNP y los 5 aminoácidos en el extremo carboxi de ANP, tiene efectos vasodilatadores arteriales y venosos, y natriuréticos.

Un cuarto péptido natriurético (NP), el péptido natriurético Dendroaspis (DNP), posee una similitud estructural con ANP, BNP y CNP. Aislado de veneno de Dendroaspis angusticeps o serpiente mamba verde, el DNP es un péptido de 38 aminoácidos que contiene una estructura de anillo disulfuro de 17 aminoácidos similar a aquella de ANP, BNP y CNP (Figura 1), los cuales median todos las acciones biológicas a través de receptores de guanilil ciclasa particulada y de la generación de guanosina monofosfato cíclico (cGMP) (Schweitz et al., 1992). El DNP relaja los vasos de aorta de roedores y arterias coronarias caninas aisladas con potencia comparable a aquella del ANP (Schweitz et al., 1992; Wennberg et al., 1997). Además, el DNP aumenta sustancialmente la formación de cGMP, el segundo mensajero para los otros péptidos natriuréticos, en células endoteliales aórticas (Schweitz et al., 1992).

Por lo tanto, existe una necesidad continua de identificar péptidos con propiedades tales como aquellas de los péptidos natriuréticos que sean útiles para prevenir y tratar trastornos cardiovasculares, p. ej., la insuficiencia cardíaca congestiva.

Sumario de la invención

La presente invención provee un compuesto peptídico aislado y purificado que tiene por lo menos una de las siguientes actividades, es decir, actividad supresora de renina, diurética y/o vasodilatadora en mamíferos. Este péptido es un fragmento del extremo carboxi del péptido natriurético Dendroaspis, que consiste en la Secuencia no. 3 o una variante biológicamente activa o fragmento de la Secuencia no. 3. Puede además comprender una porción de un péptido natriurético que no es el péptido natriurético Dendroaspis. Este último, si está presente, es el extremo N del BNP humano, es decir, Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Glu-Ser-Gly-Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly (SEQ ID NO:7), o el extremo N del CNP humano, es decir, Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Met-Ser-Gly-Leu-Gly (SEQ ID NO:8).

Un péptido preferido de la invención incluye un péptido quimérico que es un péptido de 41 aminoácidos que combina la estructura de anillo de núcleo del BNP con el extremo C del DNP. Por lo tanto, un compuesto preferido de fórmula (I) es un péptido quimérico que comprende Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Pro-Ser-Leu-Arg-Asp-Pro-Arg-Pro-Asn-Ala-Pro-Ser-Thr-Ser-Ala (SEQ ID NO:1; BD-NP; véase la Figura 4), o su fragmento o variante biológicamente activa. Preferiblemente, el péptido quimérico tiene un puente disulfuro entre Cys 10 y Cys 26. Otros péptidos preferidos de la invención incluyen un péptido de 37 aminoácidos que combina la estructura de anillo de núcleo del CNP con el extremo C de DNP. Por lo tanto, otro compuesto preferido de fórmula (I) es un péptido quimérico que comprende Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Met-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Pro-Ser-Leu-Arg-Asp-Pro-Arg-Pro-Asn-Ala-Pro-Ser-Thr-Ser-Ala (SEQ ID NO:2; CD-NP; véase la Figura 4), o su fragmento o variante biológicamente activa. Preferiblemente, el péptido quimérico tiene un puente disulfuro entre Cys 6 y Cys 22. Incluso otro péptido preferido incluye una porción del extremo carboxi de DNP, preferiblemente que incluye los 15 aminoácidos carboxiterminales (SEQ ID NO: 3; véase la Figura 4), o su fragmento o variante biológicamente activa. Tal como se emplea en la presente memoria, la expresión "biológicamente activo" significa que un péptido de la invención tiene por lo menos una de las actividades de un péptido natriurético nativo.

Tal como se describe a continuación, el BD-NP tiene un efecto combinado in vivo, que incluye vasodilatación potente con un foco en la vasodilatación pulmonar, la natriuresis y la supresión de renina. Por ejemplo, en mamíferos normales, la administración de BD-NP aumenta significativamente el índice de filtración glomerular (GFR) disminuye la reabsorción fraccionaria proximal de sodio (PFRNa), y suprime más fuertemente la actividad de renina en plasma, en relación con la administración de DNP. Además, en mamíferos normales, la administración de BD-NP (p. ej., a 50 ng/kg/minuto) no tiene ningún efecto sobre el flujo sanguíneo renal (RBF), aumenta la excreción de cGMP en la orina (UcGMPV), tiene un potente efecto supresor de renina, disminuye más potentemente la presión arterial media (MAP), y disminuye más potentemente la presión auricular derecha (RAP) y la presión capilar pulmonar (PCWP) con una vasodilatación pulmonar más potente, en relación con la administración de BNP.

Como se describe también a continuación, la inmunorreactividad de tipo DNP (DNP-LI) estuvo presente en el plasma humano y en el miocardio auricular, como también en la orina humana. A su vez, la DNP-LI aumentó en plasma humano en pacientes con CHF. El DNP también está presente en otras especies mamíferas, p. ej., en el plasma, la orina y el miocardio de caninos. in vivo, el DNP es un estimulador muy potente de la generación de cGMP de plasma y orina y tiene potentes propiedades natriuréticas, diuréticas, vasodilatadoras y supresoras de renina (Lisy et al., 1999b). Además, el DNP muestra eficacia terapéutica en caninos normales (véase Lisy et al., 1999b) como también en un modelo canino de insuficiencia cardíaca experimental (Lisy et al., 1999a).

Como se describe también a continuación, la administración exógena de DNP a caninos con insuficiencia cardíaca congestiva leve o sintomática produce disminuciones de las presiones de llenado cardíaco y la presión arterial media, conserva el gasto cardíaco y aumenta el índice de filtración glomerular. Por lo tanto, la presente invención provee un método para la preparación del fármaco para tratar la insuficiencia cardíaca congestiva, que comprende la administración de DNP o su porción biológicamente activa, un péptido que es un péptido natriurético quimérico de DNP, o su fragmento o variante biológicamente activa.

Por lo tanto, la presente invención también provee una composición útil como natriurético, supresor de renina, diurético y/o vasodilatador. La composición comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de por lo menos un péptido de la invención en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por lo tanto, la invención provee además un método para la preparación de un fármaco para inducir la natriuresis, diuresis o vasodilatación en un mamífero, p. ej., un ser humano. El método comprende administrar al mamífero una cantidad farmacéuticamente eficaz de un compuesto o composición de la invención. Los presentes péptidos pueden ser útiles, ya sea individualmente o en combinación, para tratar (aliviar o prevenir) una serie de condiciones patológicas, que incluyen insuficiencia cardíaca congestiva, insuficiencia renal aguda o crónica, hipertensión, cirrosis hepática, síndrome nefrótico y otros estados edematosos.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra las estructuras de los aminoácidos péptidos natriuréticos auriculares, (ANP, 28 aminoácidos), cerebrales (BNP, 32 aminoácidos), de tipo C (CNP, 22 aminoácidos) y Dendroaspis (38 aminoácidos).

La Figura 2 es un trazado de la inmunorreactividad de tipo péptido natriurético Dendroaspis en plasma en voluntarios humanos normales (N = 19) y seres humanos con insuficiencia cardíaca (N =19) (clase NYHA III y IV; Schirger et al, 1999). Líneas horizontales del medio = medias; barras verticales = error estándar de la media.

La Figura 3 muestra inmunotinción para el péptido natriurético Dendroaspis. Corazón humano normal, izquierda. Medio, ser humano con insuficiencia cardíaca congestiva (CHF). Derecha, tinción con suero de respuesta no inmune (NRS) del mismo corazón que se muestra en el panel del medio (ampliación original, x400).

La Figura 4 representa la secuencia de aminoácidos de péptidos ilustrativos de la invención (SEQ ID Nos. 1-3).

La Figura 5 ilustra la detección de BD-NP por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

La Figura 6 muestra la detección de CD-NP por HPLC.

La Figura 7 ilustra la detección del extremo C de DNP por HPLC.

La Figura 8 muestra codones para los distintos aminoácidos.

La Figura 9 representa sustituciones de aminoácidos ilustrativas y preferidas.

La Figura 10 muestra los niveles iniciales en plasma de DNP en caninos normales, con CHF leve y CHF sintomática antes de la infusión de DNP exógeno. La barra lisa representa los sujetos normales, la barra rayada representa CHF leve y la barra cuadriculada representa CHF sintomática. Los valores se expresan como error estándar de la media.
* P < 0,05 vs. normales.

La Figura 11 representa los cambios maximales en el gasto cardíaco - \Delta CO (A), resistencia vascular sistémica - \Delta SVR (B), presión auricular derecha - \Delta RAP (C) y presión de enclavamiento capilar pulmonar - \Delta PCWP (D) durante la administración de DNP. La barra lisa representa participantes normales, la barra rayada representa participantes con CHF leve y la barra cuadriculada representa participantes con CHF sintomática. Los valores se expresan como error estándar de la media. * P < 0,05 vs. normales.

La Figura 12 muestra la relación de cGMP en plasma/DNP en plasma con alta dosis de DNP en caninos normales, con CHF leve y con CHF sintomática. La barra lisa representa los valores de referencia, la barra rayada representa CHF leve y la barra cuadriculada representa CHF sintomática. Los valores se expresan como error estándar de la media. * P < 0,05 vs. normales.

Descripción detallada de la invención Definiciones

Tal como se emplea en la presente memoria, la expresión "péptido natriurético" o "NP" incluye un NP nativo, p. ej., ANP, BNP, CNP o DNP, porciones de un NP, variantes de un NP, o sus quimeras. Preferiblemente, las quimeras incluyen únicamente porciones de la forma madura del NP.

Tal como se usan en la presente memoria, los términos "aislado y/o purificado" se refieren a la preparación, aislamiento y/o purificación in vitro de un ácido nucleico, p. ej., ADN o molécula de polipéptido de su entorno celular natural, y a partir de la asociación con otros componentes de la células, como ácido nucleico o polipéptido, es decir, no se asocia con sustancias in vivo. Por lo tanto, con respecto a una "molécula de ácido nucleico aislada", que incluye un polinucleótido de ADNc genómico, u origen sintético o alguna de sus combinaciones, la "molécula de ácido nucleico aislada" (1) no se asocia con todo o parte de un polinucleótido en el que se encuentra la "molécula de ácido nucleico aislada" en la naturaleza, (2) está operativamente unida a un polinucleótido que no está unido en la naturaleza, o (3) no ocurre en la naturaleza como parte de una secuencia más grande. Una molécula de ácido nucleico aislada significa una forma polimérica de nucleótidos de por lo menos 10 bases de longitud, bien ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquiera de los dos tipos de nucleótidos. La expresión incluye formas monocatenarias y bicatenarias de ADN. El término "oligonucleótido" al que se hace referencia en la presente memoria incluye nucleótidos naturales y modificados unidos entre sí por ligamientos de oligonucleótidos naturales y modificados. Los oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótidos con 200 bases de longitud o menos. Preferiblemente, los oligonucleótidos tienen 10 a 60 bases de longitud y más preferiblemente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos son usualmente monocatenarios, p. ej., para sondas; aunque los oligonucleótidos pueden ser bicatenarios, p. ej., para uso en la construcción de una secuencia de ácido nucleico variante. Los oligonucleótidos de la invención pueden ser oligonucleótidos sentido o antisentido. La expresión "nucleótidos naturales", a la que se hace referencia en la presente memoria, incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. La expresión "nucleótidos modificados", a la que se hace referencia en la presente memoria, incluye nucleótidos con grupos azúcar modificados o sustituidos y similares. La expresión "ligamientos de oligonucleótidos", a la que se hace referencia en la presente memoria, incluye ligamientos de oligonucleótidos tales como fosforotiato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforoaniladato, fosforoamidato y similares. Un oligonucleótido puede incluir una marca para la detección, si se desea.

Por ejemplo, "ácido nucleico de DNP aislado" es ARN o ADN que contiene más de 9, preferiblemente 36, y más preferiblemente 45 o más bases nucleotídicas de secuencias que codifican por lo menos una porción de DNP o un ARN o ADN complementario, que es complementario o se hibrida, respectivamente, al ARN o ADN que codifica DNP y permanece establemente unido bajo condiciones restrictivas, como se define por métodos conocidos en la técnica, p. ej., en Sambrook et al. (1989). Por lo tanto, el ARN o ADN se "aisla" en el sentido que queda libre de por lo menos un ácido nucleico contaminante con el que se asocia normalmente en la fuente natural de ARN o ADN y está preferiblemente prácticamente libre de cualquier otro ARN o ADN celular, p. ej., ADN o ARN eucariótico o mamífero. La frase "libre de por lo menos un ácido nucleico de fuente contaminante con el que se asocia normalmente" incluye el caso en que el ácido nucleico se reintroduce en la fuente o la célula natural pero está en una ubicación cromosómica diferente o está flanqueado por secuencias de ácido nucleico normalmente no halladas en la célula fuente.

Tal como se emplea en la presente memoria, la expresión "ácido nucleico recombinante" o "ácido nucleico preseleccionado", p. ej., "secuencia o segmento de ADN recombinante" o "secuencia o segmento de ADN preseleccionado" se refiere a un ácido nucleico, p. ej., a ADN, que se ha derivado o aislado de cualquier fuente de tejido apropiado, que puede ser posteriormente alterada químicamente in vitro, de modo que su secuencia no es natural o corresponde a secuencias naturales que no están ubicadas como lo estarían en un genoma que no ha sido transformado con ADN exógeno. Un ejemplo de ADN preseleccionado "derivado" de una fuente, sería una secuencia de ADN que se identifica como fragmento útil dentro de un organismo determinado, y que luego se sintetiza químicamente en forma esencialmente pura. Un ejemplo de dicho ADN "aislado" de una fuente sería una secuencia de ADN útil que se escinde o saca de dicha fuente por medios químicos, p. ej., mediante el uso de endonucleasas de restricción, de modo que pueda ser posteriormente manipulado, p. ej., ampliado, para uso en la invención, por la metodología de ingeniería genética. Por lo tanto, la recuperación o aislamiento de un fragmento determinado de ADN de una digestión de restricción puede emplear separación de la digestión en gel de poliacrilamida o agarosa por electroforesis, identificación del fragmento de interés por comparación de su movilidad frente a aquella de los fragmentos de ADN del marcador de peso molecular conocido, eliminación de la sección de gel que contiene el fragmento deseado y separación del gel del ADN. Véanse Lawn et al. (1981), y Goeddel et al. (1980). Por lo tanto, el "ADN preseleccionado" incluye secuencias de ADN completamente sintéticas, secuencias de ADN semisintéticas, secuencias de ADN aisladas de fuentes biológicas y secuencias de ADN derivadas de ARN, como también sus mezclas.

Tal como se emplea en la presente memoria, el término "derivado" con respecto a una molécula de ARN significa que la molécula de ARN tiene identidad de secuencia complementaria a una molécula de ADN particular.

La expresión "péptido o polipéptido aislado" significa un polipéptido o péptido, por ejemplo, codificado por ADN o ARN, incluyendo ADN o ARN sintético, o alguna de sus combinaciones, donde el polipéptido o péptido aislado (1) no está asociado con proteínas que se hayan en la naturaleza, (2) está libre de otras proteínas de la misma fuente, p. ej., libre de proteínas humanas, (3) se expresa mediante una célula de una especie diferente, o (4) no ocurre en la naturaleza. Un péptido "aislado" contiene más de 3, preferiblemente más de 6, y más preferiblemente 12 o más residuos de aminoácidos.

La expresión "homología de secuencia" significa la proporción de apareamientos de base entre las secuencias de ácido nucleico o la proporción de apareamientos de aminoácidos entre dos secuencias de aminoácidos. Cuando la homología de secuencia se expresa como porcentaje, p. ej., 50%, el porcentaje denota la proporción de apareamientos en la longitud de la secuencia que se compara con alguna otra secuencia. Los espacios (en cualquiera de las dos secuencias) se permiten para maximizar el apareamiento; usualmente se utilizan longitudes de los espacios de 15 bases o menos, se prefieren 6 bases o menos, prefiriéndose incluso más 2 bases o menos. Cuando se usen oligonucleótidos como sondas o tratamientos, la homología de secuencia entre el ácido nucleico diana y la secuencia oligonucleotídica en general no es inferior a 17 apareamientos de base diana de 20 apareamientos de pares de bases de oligonucleótidos posibles (85%); preferiblemente no inferior a 9 apareamientos de 10 apareamientos de pares de bases posibles (90%), y más preferiblemente no inferior a 19 apareamientos de 20 apareamientos de pares de bases posibles (95%).

La expresión "hibridar selectivamente" significa unirse detectable y específicamente. Los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de la invención se hibridan selectivamente a cadenas de ácido nucleico bajo condiciones de hibridación y lavado que minimizan cantidades apreciables de unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Las condiciones altamente restrictivas se pueden usar para lograr condiciones de hibridación selectivas como se conoce en la técnica y se analiza en la presente memoria. En general, la homología de secuencia de ácido nucleico entre los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de la invención y una secuencia de ácido nucleico de interés es por lo menos 65%, y más típicamente con homologías preferiblemente en aumento de por lo menos aproximadamente 70%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 98% y 100%.

Las moléculas de ácido nucleico que se abarcan dentro del alcance de la invención incluyen aquellas que se hibridan bajo condiciones de hibridación estrictas a una molécula de ácido nucleico que codifica un NP de la invención, p. ej., moléculas de ácido nucleico que codifican las SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, o SEQ ID NO:3. Las condiciones de hibridación moderadas y estrictas se conocen en la técnica, véanse, por ejemplo, las secciones 9.47-9.51 de Sambrook et al. (1989). Por ejemplo, las condiciones estrictas son aquellas que (1) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura de lavado, por ejemplo, NaCl 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M (SSC); laurilsulfato sódico al 0,1% (SDS) a 50ºC, o (2) emplean un agente desnaturalizante tal como formamida durante la hibridación, p. ej., formamida al 50% con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficoll 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón de fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con NaCl 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42ºC. Otro ejemplo es el uso de formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,75 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), fosfato sódico al 0,1%, 5 x disolución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), dodecilsulfato de sodio al 0,1% (SDS) y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 X SSC y SDS al 0,1%.

Dos secuencias de aminoácidos son homólogas si hay una identidad parcial o completa entre sus secuencias. Por ejemplo, 85% de homología significa que 85% de los aminoácidos son idénticos cuando las dos secuencias se alinean para apareamiento máximo. Se permiten espacios (en cualquiera de las dos secuencias están apareados) para maximizar el apareamiento; se prefieren longitudes de los espacios de 5 o menos, prefiriéndose más las longitudes de 2 o menos. Alternativa y preferiblemente, dos secuencias de proteínas (o secuencias de polipéptidos derivadas de ellas de por lo menos 30 aminoácidos de longitud) son homólogas, tal como se utiliza este término en la presente memoria, si tienen un puntaje de alineación de más de 5 (en unidades de desviación estándar) usando el programa ALIGN con la matriz de datos de mutación y una penalidad de espacio de 6 o más. Véase Dayhoff, M. O., en Atlas of Protein Sequence and Structure, 1972, volumen 5, National Biomedical Research Foundation, pág. 101-110, y Suplemento 2 de este volumen, pág. 1-10. Las dos secuencias o partes de las mismas son más preferiblemente homólogas si sus aminoácidos son mayores o iguales a 50% idénticos cuando se alinean óptimamente usando el programa ALIGN.

La expresión "corresponde a" se usa en la presente memoria para expresar que una secuencia polinucleotídica es homóloga (es decir, es idéntica, no estrictamente relacionada en evolución) a todo o parte de una secuencia polinucleotídica de referencia, o que una secuencia polipeptídica es idéntica a una secuencia polipeptídica de referencia. En contraste, la expresión "complementaria a" se utiliza en la presente memoria para expresar que la secuencia complementaria es homóloga a todo o parte de de una secuencia polinucleotídica de referencia. Para ilustración, la secuencia nucleotídica "TATAC" corresponde a una secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria a una secuencia de referencia "GTATA".

Los siguientes términos y expresiones se usan para describir las relaciones de secuencias entre dos o más polinucleótidos: "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" e "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida empleada como base para una secuencia de comparación; una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande, por ejemplo, como un segmento de un ADNc de longitud total o una secuencia génica de una lista de secuencias, o puede comprender un ADNc completo o una secuencia génica. En general, una secuencia de referencia tiene por lo menos 20 nucleótidos de longitud, frecuentemente por lo menos 25 nucleótidos de longitud y a menudo por lo menos 50 nucleótidos de longitud. Dado que dos polinucleótidos pueden cada uno (1) comprender una secuencia (es decir, una porción de la secuencia polinucleotídica completa) que es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) adicionalmente comprender una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos se realizan típicamente comparando secuencias de los dos polinucleótidos en una "ventana de comparación" para identificar y comparar las regiones locales con similitud de secuencias.

Una "ventana de comparación", tal como se emplea en la presente memoria, se refiere a un segmento conceptual de por lo menos 20 nucleótidos contiguos y donde la porción de la secuencia polinucleotídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, espacios) de 20 por ciento o menos según lo comparado con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para alineación óptima de las dos secuencias. La alineación óptima de secuencias para alinear una ventana de comparación se puede llevar a cabo mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (1970), mediante la búsqueda del método de similitud de Pearson y Lipman (1988), mediante implementos computarizados de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Software de Genética de Wisconsin, versión 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o mediante inspección visual y/o manual, y se selecciona la mejor alineación (es decir, la que produce el porcentaje más alto de homología en la ventana de comparación) generada por los distintos métodos.

La expresión "identidad de secuencia" significa que dos secuencias polinucleotídicas son idénticas (es decir, en una base nucleótido por nucleótido) en la ventana de comparación. La expresión "porcentaje de identidad de secuencia" significa que dos secuencias polinucleotídicas son idénticas (es decir, en una base nucleótido por nucleótido) en la ventana de comparación. La expresión "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula comparando dos secuencias óptimamente alineadas en la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico idéntica (p. ej., A, T, C, G, U o I) ocurre en ambas secuencias para producir el número de posiciones apareadas, dividiendo el número de posiciones apareadas por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. La expresión "identidad sustancial", tal como se utiliza en la presente memoria, denota una característica de una secuencia polinucleotídica, en la que el polinucleótido comprende una secuencia que tiene por lo menos 85 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente por lo menos 90 a 95 por ciento de identidad de secuencia, más usualmente por lo menos 99 por ciento de identidad de secuencia según lo comparado con la secuencia de referencia en la ventana de comparación de por lo menos 20 posiciones de nucleótidos, frecuentemente en una ventana de por lo menos 20-50 nucleótidos, donde el porcentaje de identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia polinucleotídica que puede incluir deleciones o adiciones que suman un total de 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia en la ventana de comparación.

Tal como se aplica a polipéptidos, la expresión "identidad sustancial" significa que las dos secuencias de péptidos, cuando se alinean óptimamente, como por los programas GAP o BESTFIT usando pesos de los espacios por defecto, comparten por lo menos aproximadamente 80 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente por lo menos aproximadamente 90 por ciento de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 95 por ciento de identidad de secuencia y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 99 por ciento de identidad de secuencia.

I. Moléculas de ácido nucleico de la invención A. Fuentes de las moléculas de ácido nucleico de la invención

Las fuentes de secuencias nucleotídicas a partir de las cuales se pueden obtener las moléculas de ácido nucleico que codifican un NP de la invención o su complemento de ácido nucleico, incluyen ARN total o polyA^{+} de cualquier fuente celular eucariótica, preferiblemente de reptil, p. ej., serpiente, o mamífera, p. ej., ser humano, rata, ratón, canino, bovino, equino, ovino, caprino, felino, más preferiblemente primate, p. ej., ser humano, derivada por métodos conocidos en la técnica. Otras fuentes de las moléculas de ADN de la invención incluyen genotecas derivadas de cualquier fuente celular eucariótica, preferiblemente mamífera, p. ej., aquellas ya ejemplificadas.

B. Aislamiento de un gen que codifica NP

Se puede identificar y aislar una molécula de ácido nucleico que codifica un NP nativo usando métodos convencionales, como lo describen Sambrook et al. (1989). Por ejemplo, se puede emplear PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR) para aislar y clonar los ADN de NP. Se puede emplear Oligo-dT como cebador en una reacción de transcriptasa inversa para preparar ADNc de primera cadena a partir de ARN aislado que contiene secuencia de ARN de interés, p. ej., ADN total aislado de tejido humano. El ARN se puede aislar por métodos conocidos en la técnica, p. ej., usando el reactivo TRIZOL™ (GIBCO-BRL/Life Technologies, Gaithersburg, MD). Los ADNc de primera cadena resultantes se amplían luego en reacciones PCR.

"Reacción por la polimerasa en cadena" o "PCR" se refiere a un procedimiento o técnica en donde las cantidades de un fragmento preseleccionado de ácido nucleico, ARN y/o ADN se amplían como se describe en la patente estadounidense No. 4,683,195. En general, se emplea la información de la secuencia de los extremos de la región de interés o más allá para designar los cebadores oligonucleotídicos que comprenden por lo menos 7-8 nucleótidos. Estos cebadores serán idénticos o similares en secuencia a las cadenas opuestas del molde que se ha de ampliar. Se puede utilizar PCR para ampliar secuencias de ARN específicas, secuencias de ADN específicas del ADN genómico total y ADNc transcrito del ARN celular total, secuencias de plásmidos o bacteriófago, y similares. Véase en general Mullis et al., 1987; Erlich, 1989. Por lo tanto, los planteamientos de clonación basados en PCR se basan en secuencias conservadas deducidas de alineación de secuencias génicas o polipeptídicas relacionadas.

Los cebadores se crean para corresponder a regiones altamente conservadas de secuencias de nucleótidos o polipéptidos que se identificaron y compararon para generar los cebadores, p. ej., mediante una comparación de secuencias de otros NP eucarióticos. Se prepara un cebador que se pronostica que se renaturalizará a la cadena antisentido, y se prepara otro cebador que se pronostica que se renaturalizará a la cadena sentido, de una molécula de ADN que codifica, por ejemplo, un polipéptido inmunorreactivo de tipo DNP (p. ej., DNP-LI).

Los productos de cada reacción de PCR se separan vía un gel de agarosa y todos los productos consistentemente ampliados se purifican con gel y se clonan directamente en un vector adecuado, como un vector de plásmido conocido. Los plásmidos resultantes se someten a endonucleasa de restricción y secuenciación de didesoxi de los ADN de plásmidos bicatenarios.

Otro planteamiento para identificar, aislar y clonar los ADNc que codifican un NP consiste en detectar una genoteca de ADNc. La detección de fragmentos de ADN que codifican todo o parte de un ADNc que codifica un NP se puede lograr usando una sonda en la genoteca, que tenga secuencias que se conserven altamente entre genes que se cree están relacionados con el NP, p. ej., el homólogo de un NP particular de una especie diferente, o detectando placas para unión a anticuerpos que reconozcan específicamente un NP. Los fragmentos de ADN que se unen a una sonda que tiene secuencias relacionadas con el NP, o que son inmunorreactivas con anticuerpos para el NP, se pueden subclonar en un vector adecuado y secuenciar y/o usar como sondas para identificar otros ADNc que codifican todo o parte del NP.

C. NP variante o quimérico codificado por las moléculas de ácido nucleico de la invención

Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencias de aminoácido de un NP nativo se preparan mediante una diversidad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, aunque sin limitarse a ello, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos naturales) o preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio), mutagénesis por PCR y mutagénesis por inserción de un casete de una variante preparada con anterioridad o una versión no variante del NP, o por síntesis química (véase a continuación). Los NP quiméricos se pueden preparar, por ejemplo, usando metodologías basadas en ADN recombinante o síntesis química. Por ejemplo, un NP quimérico se puede preparar usando oligonucleótidos superpuestos y PCR. Un oligonucleótido sentido que codifica por lo menos una porción de los residuos aminoterminales de un NP y una porción de un segundo NP se renaturaliza a un oligonucleótido antisentido que tiene secuencias complementarias a las secuencias en 3' del oligonucleótido sentido como también otras secuencias complementarias a aquellas que codifican el extremo carboxi del NP quimérico. Se emplea luego PCR para preparar ADN bicatenario que codifica NP quimérico de longitud total.

Para variantes de sustitución de aminoácidos de un NP, un método preferido para preparar las variantes es la mutagénesis mediada por oligonucleótidos. Esta técnica se conoce en el campo, como lo describen Adelman et al. (1983). En síntesis, por ejemplo se altera DNP ADN hibridando un oligonucleótido que codifica la mutación deseada a un molde de ADN, donde el molde es la forma monocatenaria de un plásmido o bacteriófago que contiene la secuencia de ADN no alterada o nativa del DNP. Después de la hibridación, se usa una ADN polimerasa para sintetizar una segunda cadena complementaria completa del molde que por lo tanto incorporará el cebador oligonucleotídico y codificará la alteración seleccionada en el DNP ADN.

En general, se utilizan oligonucleótidos de por lo menos 25 nucleótidos de longitud. Un oligonucleótido óptimo tendrá 12 a 15 nucleótidos que son completamente complementarios al molde en cualquiera de los lados del nucleó-
tido(s) que codifica para la mutación. Esto asegura que el oligonucleótido se hibridará correctamente a la molécula molde de ADN monocatenario. Los oligonucleótidos se sintetizan fácilmente usando técnicas conocidas en el campo, como aquella descrita por Crea et al. (1978).

El molde de ADN se puede generar por aquellos vectores que derivan de los vectores del bacteriófago M13 (los vectores M13mp18 y M13mp19 comercialmente disponibles son adecuados), o aquellos vectores que contienen un origen de fago monocatenario de replicación como lo describen Viera et al. (1987). Por lo tanto, el ADN que se ha de mutar se puede insertar a uno de estos vectores para generar un molde monocatenario. La producción del molde monocatenario se describe en las Secciones 4.21-4.41 de Sambrook et al. (1989).

Alternativamente, el molde de ADN monocatenario se puede generar desnaturalizando ADN de plásmido (u otro) bicatenario, usando técnicas convencionales.

Para alteración de la secuencia de ADN nativo (para generar las variantes de la secuencia de aminoácidos, por ejemplo), el oligonucleótido se hibrida al molde monocatenario bajo condiciones de hibridación adecuadas. Una enzima de polimerización de ADN, usualmente un fragmento Klenow de ADN polimerasa I, se añade luego para sintetizar la cadena complementaria del molde usando el oligonucleótido como cebador para síntesis. Se forma así una molécula heterodúplex de modo tal que una cadena de ADN codifica la forma mutada de, por ejemplo, DNP, y la otra cadena (el molde original) codifica la secuencia nativa, no modificada de DNP. Esta molécula heterodúplex se transforma luego en una célula hospedante adecuada, usualmente una célula procariota tal como E. coli JM101. Después de que las células se desarrollan, se colocan en placas de agarosa y se estudian usando el cebador oligonucleotídico radiomarcado con 32-fosfato para identificar las colonias bacterianas que contienen el ADN mutado. La región mutada luego se elimina y se dispone en un vector apropiado para producción de péptidos o polipéptidos, en general un vector de expresión del tipo típicamente empleado para transformación de un hospedante apropiado.

El método descrito inmediatamente arriba se puede modificar de modo tal que se cree una molécula homodúplex en la que ambas cadenas del plásmido contengan la mutación o mutaciones. Las modificaciones son las siguientes: el oligonucleótido monocatenario se renaturaliza al molde monocatenario tal como se describió anteriormente. Se combina una mezcla de tres desoxirribonucleótidos, desoxirriboenosina (dATP), desoxirriboguanosina (dGTP) y desoxirribotimidina (dTTP), con una tiodesoxirribocitosina modificada llamada dCTP-(\alphaS) (que se puede obtener de Amersham Corporation). Esta mezcla se añade al complejo molde-oligonucleótido. Tras la adición de ADN polimerasa a esta mezcla, se genera una cadena de ADN idéntica al molde excepto por las bases mutadas. Además, esta nueva cadena de ADN contendrá dCTP-(\alphaS) en lugar de dCTP, que sirve para protegerla de la digestión de endonucleasa de restricción.

Después de que la cadena del molde del heterodúplex bicatenario se introduce con una enzima de restricción apropiada, la cadena del molde se puede digerir con nucleasa ExoIII u otra nucleasa adecuada pasando la región que contiene el sitio(s) que se ha de mutagenizar. La reacción luego se detiene para dejar una molécula que es únicamente parcialmente monocatenaria. Se forma entonces un homodúplex de ADN bicatenario completo usando ADN polimerasa en presencia de los cuatro trifosfatos de desoxirribonucleótidos, ATP y ADN ligasa. Esta molécula homodúplex puede luego transformarse en una célula hospedante adecuada tal como E. coli JM101.

Por ejemplo, una realización de la invención es una molécula de ADN aislada y purificada que comprende un segmento de ADN que codifica los 15 aminoácidos carboxiterminales de DNP (SEQ ID NO:3), donde los aminoácidos pueden ser codificados por cualquier codón que codifique ese aminoácido (véanse la Figura 8 y la página D1 en el Anexo D de Sambrook et al. (1989)).

También se contempla que uno o más de los residuos del péptido codificado por las moléculas de ácido nucleico de la invención se pueden alterar, siempre y cuando la variante peptídica tenga actividad biológica. Se prefiere que la variante tenga por lo menos aproximadamente 10% de la actividad biológica de un péptido de la invención, p. ej., un péptido que tiene SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO:3. La actividad biológica de un péptido de la invención se puede determinar usando métodos conocidos en la técnica, que incluyen inmunoensayos y estudios in vivo, tales como aquellos descritos a continuación.

II. Preparación de los agentes que se incluyen dentro del alcance de la invención A. Casetes de expresión quimérica

Para preparar casetes de expresión para transformación, la secuencia o segmento de ADN recombinante o preseleccionado puede ser circular o lineal, bicatenario o monocatenario. Una secuencia de ADN preseleccionada que codifica una secuencia de ARN que es prácticamente complementaria a una secuencia de ARNm que codifica un NP, como un ADN que codifica un NP quimérico que comprende BNP y DNP, es típicamente una secuencia de ADN "sentido" clonada a un casete en la orientación opuesta (es decir, 3' a 5' en lugar de 5' a 3'). En general, la secuencia o segmento de ADN preseleccionado tiene la forma de ADN quimérico, tal como ADN plásmido, que también puede contener regiones codificantes flanqueadas por secuencias de control que promueven la expresión del ADN preseleccionado presente en la línea celular resultante.

Tal como se emplea en la presente memoria con respecto a un casete o vector, "quimérico" significa que el vector comprende ADN de por lo menos dos especies diferentes, o comprende ADN de la misma especie, que está unido o asociado en un modo que no ocurre en las especies "nativas" o de tipo salvaje.

Aparte de las secuencias de ADN preseleccionadas que sirven como unidades de transcripción para NP, o sus porciones, una porción del ADN preseleccionado puede no ser transcrita, cumpliendo una función reguladora o estructural. Por ejemplo, el ADN preseleccionado puede en sí mismo comprender un promotor que sea activo en células mamíferas, o puede utilizar un promotor ya presente en el genoma que es la diana de transformación. Dichos promotores incluyen el promotor CMV, como también el promotor posterior SV40 y LTR retrovíricos (elementos de repeticiones terminales largas), aunque se pueden emplear muchos otros elementos conocidos en la técnica para la práctica de la invención.

Otros elementos funcionales en las células hospedantes, como intrones, intensificadores, secuencias de poliadenilación y similares, también pueden ser parte del ADN preseleccionado. Dichos elementos pueden o no ser necesarios para la función del ADN, pero pueden proveer mejor expresión del ADN afectando la transcripción, estabilidad del ARNm o similar. Dichos elementos pueden incluirse en el ADN según se desee para obtener el desempeño óptimo del ADN transformante en la célula.

"Secuencias de control" se define como las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante operativamente unida en un organismo hospedante particular. Las secuencias de control que son adecuadas para células procarióticas, por ejemplo, incluyen un promotor, y opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión de ribosomas. Se sabe que las células eucarióticas utilizan promotores, señales de poliadenilación e intensificadores.

"Operativamente unido" significa que los ácidos nucleicos se disponen en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de un líder pre-secuencia o secretor está operativamente unido al ADN de un péptido o polipéptido si se expresa como una pre-proteína que participa de la secreción del péptido o polipéptido; un promotor o intensificador está operativamente unido a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión de ribosomas está operativamente unido a una secuencia codificante si está ubicado como para facilitar la traducción. En general, "operativamente unido" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. No obstante, los intensificadores no tienen que ser contiguos. La unión se logra por ligación en sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, se usan adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

El ADN preseleccionado que se ha de introducir en las células en general también contendrá un gen marcador o un gen indicador seleccionable o ambos para facilitar la identificación y selección de las células transformadas de la población de células que se busca para transformar. Alternativamente, el marcador seleccionable se pueden realizar en una pieza separada de ADN y usarse en un procedimiento de co-transformación. Tanto los marcadores seleccionables como los genes indicadores se pueden flanquear con secuencias reguladoras adecuadas para permitir la expresión en células hospedantes. Los marcadores seleccionables útiles se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos y herbicidas, tales como neo, hpt, dhfr, bar, aroA, dapA y similares. Véanse también, los genes enumerados en la Tabla 1 de Lundquist et al. (patente estadounidense No. 5,848,956).

Los genes indicadores se usan para identificar células potencialmente transformadas y para evaluar la funcionalidad de las secuencias reguladoras. Los genes indicadores que codifican proteínas fácilmente ensayables se conocen en la técnica. En general, un gen indicador es un gen que no está presente ni es expresado por el organismo o tejido receptor que codifica una proteína cuya expresión se manifiesta a través de alguna propiedad fácilmente detectable, p. ej., actividad enzimática. Los genes preferidos incluyen el gen cloranfenicol acetil transferasa (cat) de Tn9 de E. coli, el gen beta-glucuronidasa (gus) de locus uidA de E. coli y el gen de luciferasa de luciérnaga Photinus pyralis. La expresión del gen indicador se ensaya en un momento adecuado después de haber introducido el ADN en las células receptoras.

Los expertos en la técnica conocen los métodos generales para construir ADN recombinante que pueden transformar las células diana, y las mismas composiciones y métodos de construcción se pueden utilizar para producir el ADN útil en la presente memoria. Por ejemplo, Sambrook et al. (1989) provee métodos adecuados de construcción.

B. Transformación en células hospedantes

El ADN recombinante se puede introducir fácilmente en las células hospedantes, p. ej., células mamíferas, bacterianas, de levadura o insectos, por transfección con un vector de expresión que comprende ADN que codifica un NP, su variante, su quimera o su complemento, mediante cualquier procedimiento útil para la introducción a una célula particular, p. ej., métodos físicos o biológicos, para producir una célula transformada que tenga el ADN recombinante establemente integrado a su genoma, de modo que las moléculas, secuencias o segmentos de ADN de la presente invención se expresen mediante la célula hospedante.

Los métodos físicos para introducir un ADN preseleccionado a una célula hospedante incluyen precipitación de fosfato de calcio, lipofección, bombardeo de partículas, microinyección, electroporación y similares. Los métodos biológicos para introducir el ADN de interés a una célula hospedante incluyen el uso de vectores víricos de ADN y ARN. La ventaja principal de los métodos físicos es que no se asocian con procesos patológicos u oncogénicos de virus. No obstante, son menos precisos, a menudo producen inserciones de múltiples copias, integración aleatoria, disrupción de secuencias génicas exógenas y endógenas, y expresión impredecible. Para terapia génica de mamíferos, los vectores víricos se han convertido en el método más utilizado para introducir genes a células mamíferas, p. ej., humanas. Los vectores víricos pueden derivar del virus de la viruela, virus del herpes simple I, adenovirus y virus asociados al adenovirus, retrovirus, lentivirus y similares.

Tal como se emplea en la presente memoria, la expresión "línea celular" o "línea hospedante" tiene como fin referirse a poblaciones de células homogéneas, bien caracterizadas y biológicamente puras. Estas células pueden ser células eucarióticas que son neoplásicas o que han sido "inmortalizadas" in vitro por métodos conocidos en la técnica, como también células primarias o células procarióticas. La línea celular o célula hospedante es preferiblemente de origen mamífero, pero se pueden emplear líneas celulares o células hospedantes de origen no mamífero, incluyendo fuentes vegetales, de insectos, levadura, hongos o bacterias. En general, la secuencia de ADN preseleccionada se relaciona con una secuencia de ADN que reside en el genoma de la célula hospedante pero que no se expresa, o no se expresa en gran medida o, alternativamente, se expresa excesivamente.

"Transfectado" o "transformado" se usa en la presente memoria para incluir cualquier célula hospedante o línea celular, el genoma del cual se ha alterado o aumentado por la presencia de por lo menos una secuencia de ADN preseleccionada, en donde el ADN también se denomina, en la técnica de ingeniería genética, "ADN heterólogo", "ADN recombinante", "ADN exógeno", "ADN genéticamente modificado" o "ADN no nativo", en donde dicho ADN se aisló e introdujo al genoma de la célula hospedante o línea celular mediante el procedimiento de ingeniería genética. Las células hospedantes de la presente invención típicamente se producen por transfección con una secuencia de ADN en un vector de expresión de plásmido, un vector de expresión vírica o una secuencia de ADN lineal aislada. Preferiblemente, el ADN transfectado es una secuencia de ADN recombinante cromosómicamente integrada, que comprende un gen que codifica NP o su complemento, donde la célula hospedante puede o no expresar niveles significativos de NP autólogo o "nativo".

Para confirmar la presencia del ADN preseleccionado en la célula hospedante, se puede realizar una diversidad de ensayos. Dichos ensayos incluyen, por ejemplo, ensayos "biológicos moleculares" conocidos por aquellos con experiencia en la técnica, como transferencia Southern y Northern, RT-PCR y PCR; ensayos "bioquímicos", como detección de la presencia o ausencia de un NP particular, p. ej., por medios inmunológicos (inmunoensayos, como ELISA e inmunoelectrotransferencia) o por los ensayos descritos en la presente memoria para identificar agentes que se incluyen dentro del alcance de la invención.

Para detectar y cuantificar ARN producido a partir de segmentos de ADN preseleccionados introducidos, se puede emplear RT-PCR. En esta aplicación de la PCR, primero es necesario transcribir inversamente ARN en ADN, usando enzimas tales como transcriptasa inversa, y luego a través del uso de técnicas convencionales de PCR, ampliar el ADN. En la mayoría de los casos, las técnicas de PCR, si bien son útiles, no demostrarán integridad del producto de ARN. Se puede obtener más información sobre la naturaleza del producto de ARN por el método Northern. Esta técnica demuestra la presencia de una especie de ARN y da información sobre la integridad de ese ARN. La presencia o ausencia de una especie de ARN también se puede determinar usando hibridaciones Northern dot o slot. Estas técnicas son modificaciones del método Northern y solamente demuestran la presencia o ausencia de una especie de ARN.

Si bien se pueden usar el método Southern y PCR para detectar el segmento de ADN preseleccionado en cuestión, no proveen información en cuanto a si se está expresando el segmento de ADN preseleccionado. La expresión se puede evaluar identificando específicamente los productos peptídicos de las secuencias de ADN preseleccionado introducidas o evaluando los cambios fenotípicos producidos por la expresión del segmento de ADN preseleccionado introducido en el hospedante o en la célula hospedante.

III. Péptidos de la invención

Los péptidos de la invención se pueden sintetizar por el método de síntesis peptídica de fase sólida (o Merrifield). Este método arraigado y muy utilizado, incluyendo los procedimientos experimentales, se describe en las siguientes referencias: Stewart et al., 1969; Merrifield, 1963; Meienhofer, 1973; y Barany and Merrifield, 1980. La síntesis comienza en el extremo carboxi del péptido, usando un aminoácido protegido por alfa amino. Se pueden emplear grupos protectores fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) o t-butiloxicarbonilo (Boc) para todos los grupos aminoácido aunque son adecuados otros grupos protectores. Por ejemplo, Boc-Asn-OH, Boc-Ser-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Arg-OH o Boc-Tyr-OH (es decir, aminoácidos carboxiterminales análogos de ANP seleccionados) se pueden esterificar a soportes de resina de poliestireno clorometilado. El soporte de resina de poliestireno es preferiblemente un copolímero de estireno con aproximadamente 0,5 a 2% divinilbenceno como un agente de reticulación que causa que el polímero de poliestireno sea insoluble en ciertos disolventes orgánicos. Véanse Carpino et al., 1972; Meinhofer, 1978; y Merrifield, 1963. Éstos y otros métodos de síntesis de péptidos también se ilustran en las patentes estadounidenses Nos. 3,862,925; 3,842,067; 3,972,859, 4,105,602 y en la patente estadounidense No. 4,757,048.

El péptido inmovilizado se desprotege luego con N y se añaden otros aminoácidos que tienen grupos amino protegidos en un modo gradual para inmovilizar el péptido. Al final del procedimiento, el péptido final se escinde de la resina, y se elimina cualquier grupo protector restante, por tratamiento bajo condiciones ácidas tales como, por ejemplo, con una mezcla de ácido bromhídrico y ácido trifluoroacético o con ácido fluorhídrico, o la escisión de la resina se puede efectuar bajo condiciones ácidas, por ejemplo con trietilamina, eliminando luego los grupos protectores bajo condiciones ácidas.

Los péptidos escindidos se aislan y purifican por métodos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, liofilización seguida de cromatografía de exclusión o partición en medio de gel de polisacárido tal como Sephadex G-25, o distribución contracorriente. La composición del péptido final se puede confirmar por análisis de aminoácidos después de la degradación del péptido por métodos convencionales.

Las sales de grupos carboxilo del péptido se pueden preparar en el modo usual, contactando el péptido con uno o más equivalentes de una base deseada, tal como, por ejemplo, una base de hidróxido metálico, p. ej., hidróxido sódico; una base de carbonato o bicarbonato de metal tal como, por ejemplo, carbonato de sodio o bicarbonato de sodio; o una base de amina, por ejemplo, trietilamina, trietanolamina y similares.

Las sales de adición de ácido de los polipéptidos se pueden preparar contactando el polipéptido con uno o más equivalentes del ácido inorgánico u orgánico deseado, como por ejemplo ácido clorhídrico.

Los ésteres de grupos carboxilo de los polipéptidos se pueden preparar mediante cualquier método usual conocido en la técnica para transformar un ácido carboxílico o precursor en un éster. Un método preferido para preparar ésteres de los presentes polipéptidos, cuando se usa la síntesis Merrifield anteriormente descrita, consiste en escindir el polipéptido completado de la resina en presencia del alcohol deseado, bien bajo condiciones básicas o ácidas, dependiendo de la resina. Por lo tanto, el extremo C del péptido, cuando se libera de la resina, se esterifica directamente sin aislamiento del ácido libre.

Las amidas de los polipéptidos de la presente invención pueden también prepararse por técnicas conocidas en el campo para transformar un grupo ácido carboxílico o precursor en una amida. Un método preferido para la formación de amidas en el grupo carboxilo C-terminal consiste en escindir el polipéptido de un grupo sólido con una amina apropiada, o escindir en presencia de un alcohol, produciendo un éster, seguido de aminólisis con la amina deseada.

Los derivados de N-acilo de un grupo amino de los presente polipéptidos se pueden preparar utilizando un aminoácido protegido con N-acilo para la condensación final, o acilando un péptido protegido o no protegido. Los derivados de O-acilo se pueden preparar, por ejemplo, por acilación de un péptido o resina de péptido de hidroxi libre. Cualquiera de las acilaciones se puede llevar a cabo usando un reactivo de acilación convencional, como acil haluros, anhídridos, acil imidazoles y similares. Ambas acilaciones - y O- se pueden llevar a cabo juntas, si se desea.

La síntesis puede usar técnicas manuales o puede ser completamente automática, empleando, por ejemplo, un sintetizador de polipéptidos Applied BioSystems 431 A (Foster City, Calif.) o un sintetizador de péptidos automático Biosearch SAM II (Bio-search, Inc., San Rafael, Calif.), siguiendo las instrucciones provistas en el manual de instrucciones y los reactivos suministrados por el fabricante. Se pueden introducir enlaces disulfuro entre los residuos Cys mediante oxidación leve del péptido lineal por KCN, como se describe en la patente estadounidense No. 4,757,048 en Col. 20.

Los compuestos cíclicos de la presente invención se pueden proveer uniendo residuos cisteína, no obstante, también se contempla el reemplazo de un grupo sulfhidrilo en el residuo cisteína con un grupo alternativo, por ejemplo, -CH_{2}-CH_{2}-. Por ejemplo, para reemplazar grupos sulfhidrilo con un grupo -CH_{2}-, los residuos cisteína se reemplazan con el ácido alfa-aminobutírico análogo. Estos péptidos análogos cíclicos se pueden formar, por ejemplo, de acuerdo con la metodología de M. Lebl y Hruby (1984), o empleando el procedimiento descrito en la patente estadounidense No. 4,161,521.

Los puentes éster o amida también se pueden formar haciendo reaccionar OH o serina o treonina y el carboxilo de ácido aspártico o ácido glutámico, para producir un puente de la estructura -CH_{2}-CO_{2}CH_{2}-. De modo similar, se puede obtener una amida haciendo reaccionar la cadena lateral de lisina y ácido aspártico o glutámico para producir un puente de la estructura -CH_{2}-C(O)NH-(CH_{2})_{4}-. Los métodos para la síntesis de estos puentes se encuentran en Schiller et al. (1985a) y Schiller et al. (1985b). Otros residuos y reacciones de aminoácidos formadores de puentes se proveen en la patente estadounidense No. 4,935,492.

Las siguientes referencias describen la preparación de análogos de péptidos que incluyen enlaces no peptídicos para unir los residuos de aminoácidos. Spatola, 1983a; Spatola, 1983b; Morley, 1980; Hudson et al., 1979; Spatola et al., 1986; Hann, 1982; Almquist et al., 1980; Jennings-White et al., 1982; Szelke et al., solicitud de patente europea EP 45665 (1982); Holladay et al., 1983; y Hruby, 1982.

IV. Dosis, formulaciones y vías de administración de los agentes de la invención

Las moléculas de ácido nucleico y péptidos de la invención preferiblemente se administran a un mamífero, p. ej., un ser humano o no humano, como un animal doméstico, en dosis de por lo menos aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 mg/kg, más preferiblemente aproximadamente 0,05 a aproximadamente 50 mg/kg e incluso más preferiblemente aproximadamente 0,1 a aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal (p. ej., aproximadamente 10 a aproximadamente 50 ng/kg en caninos), aunque se pueden proveer otras dosis con resultados beneficiosos. La cantidad administrada variará dependiendo de los diversos factores que incluyen, aunque sin limitarse a ello, el agente elegido, la enfermedad y si se va a lograr la prevención o el tratamiento. Se contemplan tanto la administración local como la sistémica. Se prefiere la administración sistémica.

Por consiguiente, la administración de los agentes terapéuticos de acuerdo con la presente invención puede ser continua o intermitente, dependiendo, por ejemplo, de la condición fisiológica del receptor, de si el propósito de la administración es terapéutico o profiláctico y de otros factores conocidos por los expertos en la técnica. La administración de los agentes de la invención puede ser esencialmente continua por un período de tiempo preseleccionado o puede ser en una serie de dosis espaciadas.

La administración de la molécula de ácido nucleico sentido o antisentido puede llevarse a cabo a través de la introducción de células transformadas con un casete de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico (véase, por ejemplo, WO 93/02556) o la administración de la molécula de ácido nucleico (véanse, por ejemplo, Feigner et al., patente estadounidense No. 5,580,859, Pardoll et al., 1995; Stevenson et al., 1995; Moiling, 1997; Donnelly et al., 1995; Yang et al., 1996; Abdallah et al., 1995; Wolff et al., 1990; Tripathy et al., 1994; Tripathy et al., 1996a; Tripathy et al., 1996b; Tsurumi et al., 1996; Baumgartner et al., 1997; Lin et al., 1990). Las formulaciones, dosis y vías de administración farmacéuticas se describen en general, por ejemplo, en Feigner et al.,
supra.

Los compuestos peptídicos se pueden formular en las composiciones como formas neutras o salinas. Las sales no tóxicas farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres) y que se forman por la reacción con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico, sulfúrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, acético, oxálico, tartárico, mandélico, cítrico, málico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o hierro, y dichas bases orgánicas tales como aminas, es decir, isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína y similares.

Una o más formas de administración unitaria adecuadas que comprenden el péptido o la molécula de ácido nucleico de la invención que, como se analizó anteriormente, pueden opcionalmente formularse para liberación sostenida, se pueden administrar mediante una diversidad de vías que incluyen las vías oral o parenteral, rectal, bucal, vaginal y sublingual, transdérmica, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intratorácica, intracoronaria, intrapulmonar e intranasal. Las formulaciones pueden, cuando resulte apropiado, presentarse en formas de administración unitaria discretas y pueden prepararse por cualquiera de los métodos conocidos en farmacia. Dichos métodos pueden incluir la etapa de asociar el agente terapéutico con vehículos líquidos, matrices sólidas, vehículos semi-sólidos, vehículos sólidos finamente divididos o sus combinaciones, y luego, si es necesario, introducir o dar forma al producto con el sistema de administración deseado.

Cuando el péptido o molécula de ácido nucleico de la invención se prepare para administración oral, preferiblemente se combinará con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, para formar una formulación farmacéutica o forma de dosis unitaria. Los ingredientes activos totales en dichas formulaciones comprenden entre 0,1 y 99,9% en peso de la formulación. Por "farmacéuticamente aceptable" se entiende que el vehículo, diluyente, excipiente y/o sal debe ser compatible con los otros ingredientes de la formulación, y no perjudicial para su receptor. El ingrediente activo para administración oral puede estar presente como polvo o como gránulos; como una disolución, una suspensión o una emulsión; o en una base tal como una resina sintética para ingestión de los ingredientes activos a partir de una goma de mascar. El ingrediente activo también puede presentarse como una inyección intravenosa rápida, electuario o pasta.

Las formulaciones farmacéuticas que contienen el péptido o la molécula de ácido nucleico de la invención se pueden preparar por procedimientos conocidos en la técnica, usando ingredientes conocidos y fácilmente disponibles. Por ejemplo, el péptido o la molécula de ácido nucleico se puede formular con excipientes, diluyentes o vehículos comunes, y formarse en comprimidos, cápsulas, suspensiones, polvos y similares. Los ejemplos de excipientes, diluyentes y vehículos que son adecuados para dichas formulaciones incluyen las siguientes cargas y expansores tales como almidón, azúcares, manitol y derivados silícicos; agentes de unión tales como carboximetil celulosa, HPMC y otros derivados de celulosa, alginatos, gelatina y polivinilpirrolidona; agentes humectantes tales como glicerol; agentes desintegrantes tales como carbonato de calcio y bicarbonato de sodio; agentes para retrasar la disolución tales como parafina; aceleradores de resorción tales como compuestos de amonio cuaternario; agentes activos de superficie tales como alcohol cetílico, glicerol monostearato; vehículos de adsorción tales como caolina y bentonita; y lubricantes tales como talco, calcio y estearato de magnesio, y polietilglicoles.

Por ejemplo, los comprimidos o comprimidos oblongos que contienen el péptido o la molécula de ácido nucleico de la invención pueden incluir agentes tampón tales como carbonato de calcio, óxido de magnesio y carbonato de magnesio. Los y los comprimidos oblongos también pueden incluir ingredientes inactivos tales como celulosa, almidón pre-gelatinizado, dióxido de silicio, hidroxipropilmetilcelulosa, estearato de magnesio, celulosa microcristalina, almidón, talco, dióxido de titanio, ácido benzoico, ácido cítrico, almidón de maíz, aceite mineral, polipropilenglicol, fosfato de sodio y estearato de zinc, y similares. Las cápsulas de gelatina dura o blanda que contienen el péptido o la molécula de ácido nucleico de la invención pueden contener ingredientes inactivos tales como gelatina, celulosa microcristalina, laurilsulfato de sodio, almidón, talco y dióxido de titanio y similares, como también vehículos líquidos tales como polietilenglicoles (PEG) y aceite vegetal. Además, los comprimidos o comprimidos oblongos entéricos recubiertos del péptido o la molécula de ácido nucleico de la invención están diseñados para resistir la desintegración en el estómago y disolverse en el entorno más neutro a alcalino del duodeno.

El péptido o la molécula de ácido nucleico de la invención también se puede formular como elixires o disoluciones para administración oral conveniente o como disoluciones adecuadas para administración parenteral, por ejemplo por las vías intramuscular, subcutánea o intravenosa.

Las formulaciones farmacéuticas del péptido o la molécula de ácido nucleico de la invención también pueden tener la forma de una disolución o dispersión acuosa o anhidra, o alternativamente la forma de una emulsión o sus-
pensión.

Por lo tanto, el péptido o la molécula de ácido nucleico se puede formular para administración parenteral (p. ej., por inyección, por ejemplo, inyección intravenosa rápida o infusión continua) y se puede presentar en forma de dosis unitaria en ampollas, jeringas pre-rellenas, envases de infusión de volumen pequeño o envases de dosis múltiples con la adición de un conservante. Los ingredientes activos pueden tener formas tales como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Alternativamente, los ingredientes activos pueden tener forma de polvo, obtenida por aislamiento aséptico de sólido estéril o por liofilización de la disolución, para constitución con un vehículo adecuado, p. ej., agua estéril, libre de pirógeno, antes del uso.

Estas formulaciones pueden contener vehículos y adyuvantes farmacéuticamente aceptables conocidos en la técnica anterior. Es posible, por ejemplo, preparar disoluciones usando uno o más disolventes orgánicos que sean aceptables desde el punto de vista fisiológico, además de agua, disolventes tales como acetona, etanol, alcohol isopropílico, éteres de glicol tales como los productos comercializados bajo el nombre "Dowanol", poliglicoles y polietilenglicoles, ésteres alquílicos C_{1}-C_{4} de ácidos de cadena corta, preferiblemente etil o isopropil lactato, triglicéridos de ácido graso tales como los productos comercializados con el nombre "Miglyol", isopropil miristato, aceites animales, minerales y vegetales, y polisiloxanos.

Las composiciones de acuerdo con la invención pueden también contener agentes espesantes tales como celulosa y/o derivados de celulosa. También pueden contener gomas tales como goma xantano, guar o carbo o goma arábiga, o, alternativamente, polietilenglicoles, bentonas y montmorilonitas, y similares.

Es posible añadir, si es necesario, una adyuvante seleccionado entre antioxidantes, tensioactivos, otros conservantes, formadores de película, agentes queratolíticos o comedolíticos, perfumes y colorantes. Además, se pueden añadir otros ingredientes activos, ya sea para las condiciones descritas o alguna otra condición.

Por ejemplo, entre los antioxidantes, se pueden mencionar t-butilhidroquinona, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado y \alpha-tocoferol y sus derivados. Las formas galénicas principalmente acondicionadas para aplicación tópica pueden tener la forma de cremas, leches, geles, dispersiones, microemulsiones, lociones espesadas en mayor o menor grado, almohadillas impregnadas, ungüentos o adhesivos, o alternativamente la forma de formulaciones en aerosol o la forma de espuma o, alternativamente, la forma de una torta de jabón.

Adicionalmente, los agentes son muy adecuados para formulación como formas de administración de liberación sostenida y similares. Las formulaciones se pueden constituir de modo tal que liberen el ingrediente activo solamente o preferiblemente en una parte particular del tubo digestivo o respiratorio, posiblemente durante un período de tiempo. Los recubrimientos, envolturas y matrices protectoras se pueden elaborar, por ejemplo, a partir de sustancias poliméricas, tales como polilactida-glicolatos, liposomas, microemulsiones, micropartículas, nanopartículas o ceras. Estos recubrimientos, envolturas y matrices protectoras son útiles para recubrir dispositivos permanentes, p. ej., stents, catéteres, tubos de diálisis peritoneal y similares.

El péptido o la molécula de ácido nucleico de la invención se puede administrar mediante parches para administración transdérmica. Véase la patente estadounidense No. 5,560,922 para ejemplos de parches adecuados para administración transdérmica de un agente terapéutico. Los parches para administración transdérmica pueden comprender una capa de revestimiento y una matriz polimérica que ha dispersado o disuelto allí un agente terapéutico, junto con uno o más intensificadores de permeación en la piel. La capa de revestimiento puede estar hecha de cualquier material adecuado que sea impermeable al agente terapéutico. La capa de revestimiento sirve como una cubierta protectora para la capa de matriz y proporciona también una función de soporte. El revestimiento puede formarse de modo tal que tenga esencialmente el mismo tamaño de capa que la matriz polimérica o puede ser de una dimensión mayor de modo que se extienda más allá del lado de la matriz polimérica o superponga el lado o lados de la matriz polimérica y luego se extienda hacia afuera en un modo en que la superficie de la extensión de la capa de revestimiento pueda ser la base para un medio adhesivo. Alternativamente, la matriz polimérica puede contener o estar formulada de un polímero adhesivo, tal como un copolímero de acrilato/vinil acetato o poliacrilato. Para aplicaciones a largo plazo, podría ser conveniente usar laminados de revestimiento microporosos y/o respirables, de modo que la hidratación o maceración de la piel puedan minimizarse.

Los ejemplos de materiales adecuados para elaborar la capa de revestimiento son películas de polietileno de alta y baja densidad, polipropileno, poliuretano, polivinilcloruro, poliésteres tales como poli(etilen ftalato), laminados de papel metálico de dichas películas poliméricas adecuadas y similares. Preferiblemente, los materiales usados para la capa de revestimiento son laminados tales como películas poliméricas con un papel metálico tal como papel de aluminio. En dichos laminados, una película de polímero del laminado usualmente se pondrá en contacto con la matriz polimérica adhesiva.

La capa de revestimiento puede tener cualquier espesor adecuado que proporcione las funciones protectora y de soporte deseadas. Un espesor adecuado sería aproximadamente 10 a aproximadamente 200 micrómetros.

En general, los polímeros utilizados para formar la capa polimérica adhesiva biológicamente aceptable son aquellos capaces de formar cuerpos con forma, paredes delgadas o recubrimientos a través de los cuales los agentes terapéuticos pueden pasar a una velocidad controlada. Los polímeros adecuados son biológica y farmacéuticamente compatibles, no alergénicos e insolubles y compatibles con los fluidos o tejidos corporales con los que se pone en contacto el dispositivo. Se debe evitar el uso de polímeros solubles, ya que la disolución o erosión de la matriz por la humedad de la piel afectaría el índice de liberación de los agentes terapéuticos como así también la capacidad de la unidad de dosificación para permanecer en su lugar para comodidad de eliminación.

Los materiales ilustrativos para fabricar la capa polimérica adhesiva incluyen polietileno, polipropileno, poliuretano, copolímeros de etileno/propileno, copolímeros de etileno/etilacrilato, copolímeros de etileno/vinilacetato, elastómeros de silicona, especialmente los polidimetilsiloxanos de grado médico, goma de neopreno, poliisobutileno, poliacrilatos, polietileno clorado, cloruro de polivinilo, copolímero de cloruro de vinilo-acetato de vinilo, polímeros de polimetacrilato reticulado (hidrogel), cloruro de polivinilideno, poli(etilentereftalato), goma de butilo, gomas de epiclorhidrina, copolímeros de alcohol etilenvinílico, copolímeros de etileno-viniloxoxietanol; copolímeros de silicona, por ejemplo, copolímeros de polisiloxano-policarbonato, copolímeros de óxido de polisiloxanopolietileno, copolímeros de polisiloxano-polimetacrilato, copolímeros de polisiloxano-alquileno (p. ej., copolímeros de polisiloxano-etileno), copolímeros de polisiloxano-alquilensilano (p. ej., copolímeros de polisiloxano-etilensilano) y similares; polímeros de celulosa, por ejemplo metil o etil celulosa, hidroxipropil metilcelulosa y ésteres de celulosa; policarbonatos; politetrafluoroetileno; y similares.

Preferiblemente, se debe seleccionar una matriz polimérica adhesiva biológicamente aceptable a partir de polímeros con temperatura de transición vítrea inferior a temperatura ambiente. El polímero puede, pero no necesita, tener un grado de cristalinidad a temperatura ambiente. Se pueden incorporar unidades o sitios monoméricos de reticulación a dichos polímeros. Por ejemplo, se pueden incorporar monómeros de reticulación a polímeros de poliacrilato, que proveen sitios de reticulación de la matriz después de dispersar el agente terapéutico en el polímero. Los monómeros de reticulación conocidos para polímeros de poliacrilato incluyen ésteres polimetacrílicos de polioles tales como butilendiacrilato y dimetacrilato, trimetilol propantrimetacrilato y similares. Otros monómeros que proveen dichos sitios incluyen alil acrilato, alil metacrilato, dialil maleato y similares.

Preferiblemente, se dispersa un plastificante y/o humectante dentro de la matriz polimérica adhesiva. Los polioles solubles en agua en general son adecuados para este fin. La incorporación de un humectante en la formulación permite que la unidad de dosificación absorba la humedad en la superficie de la piel que a su vez ayuda a reducir la irritación de la piel y a prevenir que fracase la capa polimérica adhesiva del sistema de administración.

Los agentes terapéuticos liberados desde un sistema de administración transdérmico deben ser capaces de penetrar cada capa de la piel. Con el fin de aumentar el índice de permeación de un agente terapéutico, un sistema de administración de fármacos transdérmico debe ser capaz, en particular, de aumentar la permeabilidad de la capa externa de la piel, el estrato córneo, que ofrece la mayor resistencia a la penetración de moléculas. La fabricación de parches para administración transdérmica de agentes terapéuticos se conoce en la técnica.

Para administración a las vías respiratorias superiores (nasales) o inferiores por inhalación, el péptido o la molécula de ácido nucleico de la invención se administra convenientemente desde un insuflador, nebulizador o envase presurizado u otro medio conveniente para administrar una pulverización en aerosol. Los envases presurizados pueden comprender un propulsor adecuado tal como diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para administrar una cantidad dosificada.

Alternativamente, para administración por inhalación o insuflación, la composición puede adoptar la forma de un polvo seco, por ejemplo, una mezcla en polvo del agente terapéutico y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón. La composición en polvo se puede presentar en forma de dosis unitaria, por ejemplo, en cápsulas o cartuchos, o, p. ej., en envases blíster o de gelatina a desde los cuales se puede administrar el polvo con la ayuda de un inhalador o insuflador o inhalador de dosis determinada.

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Para administración intranasal, el péptido o la molécula de ácido nucleico se puede administrar mediante gotas nasales, una pulverización líquida, como vía un atomizador en frasco plástico o un inhalador con una dosis determinada. Los atomizadores típicos son Mistometer (Wintrop) y Medihaler (Riker).

La administración local del péptido o la molécula de ácido nucleico de la invención también se puede realizar mediante una diversidad de técnicas que administran el agente en el sitio de la enfermedad o prácticamente allí. Los ejemplos de administración local específica del sitio o dirigida a éste no tienen como fin ser limitativos sino ilustrativos de las técnicas disponibles. Los ejemplos incluyen catéteres de administración local, como un catéter de infusión o permanente, p. ej., un catéter para infusión de aguja, shunts y stents u otros dispositivos implantables, vehículos específicos del sitio, inyección directa o aplicaciones directas.

Para administración tópica, el péptido o la molécula de ácido nucleico se puede formular como se conoce en la técnica, por aplicación directa a un área diana. Las formas convencionales para este propósito incluyen apósitos para heridas, bandas recubiertas u otros recubrimientos poliméricos, ungüentos, cremas, lociones, pastas, jaleas, pulverizaciones y aerosoles, como también pasta dentífrica y enjuague bucal, o por otras formas conocidas, p. ej., vía un condón recubierto. Los ungüentos y cremas pueden, por ejemplo, formularse con una base acuosa u oleosa con la adición de agentes espesantes y/o de gelificación adecuados. Las lociones se pueden formular con una base acuosa u oleosa y en general también contienen uno o más agentes emulsionantes, agentes estabilizantes, agentes dispersantes, agentes suspensores, agentes espesantes o agentes colorantes. Los ingredientes activos también se pueden administrar vía iontoforesis, p. ej., como se describe en las patentes estadounidenses Nos. 4,140,122; 4,383,529; ó 4,051,842. El porcentaje en peso del péptido o la molécula de ácido nucleico de la invención presente en una formulación tópica dependerá de distintos factores, pero en general será entre 0,01% y 95% del peso total de la formulación, y típicamente 0,1-25% en peso.

Cuando se desee, las formulaciones anteriormente descritas se podrán adaptar para producir liberación sostenida del ingrediente activo empleado, p. ej., por combinación con determinadas matrices poliméricas hidrófilas, p. ej., geles naturales, geles poliméricos sintéticos o sus mezclas.

Se pueden formular gotas, tales como gotas oculares o nasales, con una base acuosa o no acuosa que también comprende uno o más agentes dispersantes, agentes solubilizantes o agentes de suspensión. Las pulverizaciones líquidas convenientemente se pulverizan desde envases presurizados. Las gotas se pueden administrar vía un frasco gotero simple con tapa, o vía un frasco plástico adaptado para administrar los contenidos líquidos a través de un cierre con forma especial.

El péptido o la molécula de ácido nucleico puede además formularse para administración tópica a la boca o garganta. Por ejemplo, los ingredientes activos se pueden formular como una tableta que además comprende una base saporífera, usualmente sacarosa y acacia o tragacanto; pastillas que comprenden la composición en una base inerte tal como gelatina y glicerina o sacarosa y acacia; enjuagues bucales que comprenden la composición de la presente invención en un vehículo líquido adecuado; y pastas y geles, p. ej., pastas o geles dentífricos, que comprenden la composición de la invención.

Las formulaciones y composiciones descritas en la presente memoria también pueden contener otros ingredientes tales como agentes antimicrobianos o conservantes. Asimismo, también se pueden emplear ingredientes activos en combinación con otros agentes terapéuticos.

La invención será ahora descrita más detalladamente mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 Materiales y métodos

Se sintetizó VNP en la Instalación Mayo Protein Core Facility, usando química de fluorenilmetoxi-carbonilo (FMOC) en un sintetizador de péptidos ABI 431 A (Applied Biosystems Inc., Foster City, Calif.) con los protocolos y reactivos provistos por el fabricante. El péptido se purificó por cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (HPLC) usando una columna Vydac C8 (The Separations Group, Hesperia, Calif.). La síntesis se confirmó mediante el análisis de aminoácidos y espectrometría de masas de absorción en plasma.

Las muestras de plasma y orina se analizaron usando HPLC de fase inversa con una columna Vydac C18 (4,6 mm x 250 mm) (The Separations Group, Hesperia, Calif.). Los componentes del sistema HPLC fueron dos bombas Beckman 114 (Beckman Instruments, San Ramon, Calif.), un detector de absorbancia ABI 759A (Applied Biosystems, Inc., Foster City, Calif.) y un ordenador IBM PS2 50Z con el software Beckman System Gold Chromatography. El tampón A fue ácido trifluoroacético al 0,1% y el tampón B fue acetonitrilo al 80%/agua al 20%/ácido trifluoracético al 0,1%. La separación tuvo lugar con un gradiente de 5% a 70% tampón B en 60 minutos.

Los resultados obtenidos se expresan como el error estándar de la media. En estudios de cámara de órganos, n equivale al número de caninos de los cuales se tomaron los anillos. Los anillos con y sin endotelio se estudiaron en paralelo, y se usó la prueba de la t de Student para observaciones desapareadas a fin de determinar la significancia estadística entre las respuestas de anillo con y sin endotelio y entre respuestas de arterias y venas. En estudios en ratas, los datos se analizaron usando ANOVA para medidas repetidas seguidas por la prueba de diferencia menos significativa de Fisher cuando fue apropiado dentro del grupo. Los datos entre grupos se analizaron por la prueba de la t de Student no apareada. La diferencia estadística se determinó a p < 0,05.

Los experimentos se realizaron de acuerdo con la Ley de Bienestar de los Animales (Animal Welfare Act). Se anestesiaron ratas Wistar y ratas espontáneamente hipertensas (SHR) (400 g; Harlan Sprague-Dawley, Indianápolis, In.) con Inactin (100 mg/kg; intraperitoneal; BYK Gulden, Konstanz, Alemania). La temperatura corporal se mantuvo entre 36º y 38ºC mediante una almohadilla de calor. Se realizó una traqueotomía; no obstante, los animales no recibieron ventilación artificial. Se dispusieron catéteres de polietileno (PE-50; Becton Dickinson Co., Parsippay, N.J.) en la vena yugular izquierda para infusiones de disolución salina y fármacos, en la vena yugular derecha hacia la aurícula derecha a fin de monitorizar la presión articular derecha, y en la arteria carótida para obtención de muestras de sangre y para monitorizar la presión arterial media. Se dispuso una sonda PE-90 en la vejiga para recolección de orina.

Los experimentos se llevaron a cabo en tres grupos para ratas normales: grupo ANP (n = 4), grupo CNP (n = 4) y grupo VNP (n = 4). El VNP también se estudió en ratas SHR (n = 4). Las infusiones intravenosas de disolución salina (0,9% NaCl) se realizaron (1 ml/100 gm peso corporal/hora) a través del catéter de la vena yugular izquierda. Después de completar la cirugía, se dejó estabilizar las ratas durante 30 minutos. En cada grupo, siguió un período inicial de 15 minutos. Después del período inicial, se administró disolución salina (0,9% NaCl) en un modo intravenoso rápido (0,1 ml) y a esto le siguió un período de 15 minutos. Después del período de disolución salina, se administró el péptido (ANP, CNP o VNP) por inyección intravenosa rápida (0,1 ml) a 5 \mug/kg que fue seguido de un período de 15 minutos. Esto fue seguido de una segunda inyección intravenosa rápida (0,1 ml) a 50 \mug/kg y un período de 15 minutos. Después de un lavado de 30 minutos, tuvo lugar un período de recuperación de 15 minutos. Durante cada período experimental, se midieron la presión arterial media (MAP), la frecuencia cardíaca (HR) y la presión auricular derecha (RAP). En el punto medio desde la situación inicial, en la segunda inyección intravenosa rápida (50 \mug/kg) y en los períodos de recuperación, se tomaron muestras de sangre para cGMP en plasma. Al final de cada período, se midió el volumen de orina (UV), y las muestras se conservaron para análisis de electrólitos y cGMP.

La sangre para el análisis de cGMP en plasma se recogió en tubos de EDTA, se dispuso inmediatamente en hielo y se centrifugó a 2.5000 rpm a 4ºC. El plasma se separó y se conservó a -20ºC hasta el ensayo. La orina para determinación de cGMP se calentó hasta > 90ºC antes de conservar. El cGMP en plasma y orina se determinó mediante RIA específico como lo describieron previamente A. L. Steiner et al., J. Hypertension, 5 (Supl. 5), 551-553 (1987).

La Tabla 2 resume las acciones cardiovasculares y renales de la administración de ANP, CNP y VNP en ratas normales.

Como se demuestra a través de los datos de de la Tabla 2, la administración intravenosa rápida (0,1 ml) de disolución salina no tuvo acciones cardiovasculares o renales. La administración intravenosa rápida (0,1 ml) de altas dosis (50 \mug/kg) de ANP, CNP y VNP produjo una disminución significativa en MAP y RAP, y aumentó el flujo de orina, la excreción de sodio, el cGMP en plasma y el volumen de cGMP en orina. El aumento del flujo de orina, excreción de sodio, volumen de cGMP en orina fue significativamente mayor con VNP que con CNP, pero menos que con ANP.

La Tabla 3 demuestra los efectos cardiovasculares y renales del VNP en ratas normales y SHR.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2

1

TABLA 3

2

Como lo demuestran los datos de la Tabla 3, la MAP inicial de la SHR fue significativamente superior que aquella de las ratas normales, y el volumen de orina inicial de la SHR fue acentuadamente inferior que aquel de las ratas normales. Durante la infusión rápida de VNP, la MAP y la RAP disminuyeron significativamente, el flujo de orina, la excreción de sodio y el cGMP en plasma y el volumen de cGMP en orina aumentaron significativamente tanto en los grupos normales como en SHR. Si bien la disminución de MAP a VNP fue similar en ambos grupos, las acciones renales y los efectos de cGMP en orina del VNP se atenuaron en ratas SHR, en comparación con ratas normales. El VNP es un péptido vasorrelajante independiente del endotelio tanto en arterias como en venas, en comparación con el ANP y el CNP. El VNP también tiene un potente efecto natriurético in vivo.

Ejemplo 2 Pacientes y métodos

El protocolo de estudio coincidió con las pautas del Mayo Institutional Review Board. Se obtuvo el consentimiento informado de cada paciente y su familiar.

Sujetos de estudio para DNP circulante

Se evaluó el DNP circulante en 19 voluntarios humanos sanos normales y 19 pacientes con insuficiencia cardíaca. Todos los pacientes con insuficiencia cardíaca se sometieron a una exploración física completa y a una evaluación de laboratorio, y fueron categorizados como clase III o IV por los criterios de clase funcional de la New York Heart Association (NYHA) en base a sus síntomas cardíacos después de la exploración física. Las causas de disfunción ventricular en estos pacientes con insuficiencia cardíaca incluían cardiomiopatía dilatada idiopática y cardiomiopatía isquémica. Todos los pacientes con insuficiencia cardíaca estaban recibiendo tratamiento cardiovascular convencional.

Cuantificación de concentración de DNP en plasma

Se obtuvieron muestras de sangre para el ensayo de DNP en tubos fríos que contenían ácido etilendiamintetraacético y se dispusieron inmediatamente en hielo. Después de la centrifugación a 2.500 rpm a 4ºC durante 10 minutos, el plasma se decantó y se conservó a -20ºC hasta que se analizó. El plasma (1 mL) se extrajo en cartuchos C-8 Bond Elute, que se lavaron con metanol y agua destilada. El DNP se eluyó con metanol al 95% que contenía ácido trifluoroacético al 1%. Los eluatos concentrados se ensayaron luego con un radioinmunoensayo específico y sensible para DNP (Phoenix Pharmaceuticals, Mountain View, California). Las muestras y los estándares se incubaron con anti-DNP de conejo a 4ºC durante 24 horas. Se añadió DNP ^{125}l-marcado (100 \muL), y la incubación continuó durante otras 24 horas a 4ºC. Las fracciones libres y ligadas se separaron luego por adición de un segundo anticuerpo y suero de conejo normal y se centrifugaron. La radiactividad de la fracción ligada se midió con un contador gamma. El nivel mínimo detectable para este ensayo es 0,5 pg por tubo, y la concentración inhibidora de 50% de la curva estándar fue de 29,0 pg. La recuperación fue de 83,0 \pm 1,8%, y la variación intra-ensayo fue de 10,0 \pm 3,2%. No se observó reactividad cruzada del anticuerpo a DNP con ANP, BNP, CNP o endotelina.

Sujetos de estudio para inmunohistoquímica de DNP

Se obtuvo tejido cardíaco para estudios inmunohistoquímicos del miocardio auricular de cuatro pacientes con CHF terminal que se habían sometido a un trasplante cardíaco en la Clínica Mayo de Rochester. Las causas de la CHF incluían cardiomiopatía dilatada idiopática y cardiomiopatía isquémica. Las secciones de tejido se obtuvieron a partir de apéndices auriculares y paredes libres. El tejido auricular normal se obtuvo de tres corazones donados al momento del trasplante cardíaco.

Tinción inmunohistoquímica

Los estudios inmunohistoquímicos se realizaron por el método de inmunoperoxidasa indirecta, según lo describieron previamente Wei et al. (1993). Los tejidos se fijaron inmediatamente con formalina tamponada al 10% y se embebieron en parafina; las secciones de 6 \mum de espesor se cortaron y montaron en portaobjetos de vidrio silanizadas. Los portaobjetos se incubaron 60ºC y se desparafinizaron con concentraciones graduadas de xileno y etanol. Para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena, se incubaron los portaobjetos con peróxido de hidrógeno al 0,6% en metanol por 20 minutos a temperatura ambiente. Después de lavarse, las secciones se incubaron en suero de cabra al 5% (Dako Corp., Carpinteria, California) durante 10 minutos a temperatura ambiente para reducir la tinción de fondo no específica, y luego se incubaron con antisuero anti-DNP de conejo policlonal (Phoenix Pharmaceuticals) en una dilución de 1:500 (en suero de cabra normal) en cámaras humidificadas durante 24 horas a temperatura ambiente. Todos los portaobjetos se incubaron durante 30 minutos con un segundo conjugado de peroxidasa de rábano picante-anticuerpo (BioSource, Camarillo, California). La reacción se visualizó incubando las secciones con reactivo recién preparado que contenía 3'-amino-9'-etilcarbazol (Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri) en dimetiformamida y acetato de sodio. Las secciones se contra-tiñieron con hematoxilina, se les aplicó el cubreobjetos y se revisaron con el uso de un microscopio Olympus. Seis observadores independientes, sin conocimiento de los respectivos grupos de los cuales se originaron los tejidos, revisaron estas secciones. La presencia de DNP-LI se cuantificó en base a la siguiente escala de tinción: 0 = ninguna; 1 = densidad mínima; 2 = densidad leve; 3 = densidad moderada; y 4 = densidad máxima. Las secciones de control se tiñieron con suero de cabra no inmune al 1%.

Análisis estadístico

Los datos se registraron como valores de error estándar de la media, a menos que se indique otra cosa. Las comparaciones estadísticas entre los grupos se realizaron con el uso de la prueba de la t de Student no apareada, usando el software Graph Pad prism. Los valores P de menos de 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Resultados DNP-LI en plasma de sujetos normales y pacientes con CHF

En un estudio de 19 voluntarios normales, se descubrió que la DNP-LI estaba presente en plasma humano normal (media, 6,3 \pm 1,0 pg/mL; mediana, 4,7; desviación estándar, 2,3). Asimismo, se observó que la DNP-LI en plasma había aumentado en los 19 seres humanos con CHF en comparación con los sujetos de control normales (media, 37,3 \pm
15,0 pg/mL; mediana, 17,0; desviación estándar, 58,9; P<0,05) (Figura 2).

Estudios inmunohistoquímicos de miocardio de sujetos normales y pacientes con CHF

Los estudios inmunohistoquímicos revelaron la presencia de DNP-LI en el miocardio auricular del corazón humano normal y del insuficiente (Figura 3). Se observó DNP-LI dentro del citoplasma de miocitos auriculares y se distribuyó ampliamente en el citoplasma periférico. La DNP-LI también se localizó en la región perinuclear. Los puntajes inmunohistoquímicos para DNP-LI en el miocardio auricular no difirieron significativamente en los corazones humanos normales (N = 3) e insuficientes (N = 4) (1,8 \pm 0,5 versus 2,2 \pm 0,7).

Análisis

Usando un radioinmunoensayo sensible para DNP, que emplea un anticuerpo de conejo policlonal para DNP que no posee reactividad cruzada con ANP, BNP o CNP, se detectó DNP-LI en el plasma humano normal. Las concentraciones observadas fueron similares a aquellas indicadas para los otros péptidos natriuréticos (Mukoyama et al., 1991; Burnett et al., 1986; Wei et al., 1993). Además, usando este anticuerpo para DNP, se determinó la presencia y distribución de DNP-LI en el miocardio auricular humano. La DNP-LI, similar a ANP y BNP, se observó presente y se distribuyó ampliamente en el citoplasma periférico de miocitos auriculares y también en la región perinuclear (Wei et al., 1993). Colectivamente, la presencia de DNP-LI en plasma humano y miocardio auricular sugiere que el DNP, al igual que el ANP y el BNP, puede ser producido y segregado por el corazón humano.

Un hallazgo importante adicional fue que la DNP-LI en plasma aumentó en seres humanos con CHF, específicamente en pacientes categorizados en la clase III o IV de la NYHA. Este incremento en la concentración en plasma de DNP-LI es análogo a aquel visto con ANP y BNP, que se activan en la CHF crónica secundaria a presiones de llenado cardíaco aumentadas y estiramiento auricular (Bruneau et al., 1997; Edwards et al., 1988). La mayor concentración de DNP-LI en CHF humana, junto con las propiedades vasorrelajantes del DNP en la aorta de rata y en las arterias coronarias caninas, como también la potenciación de cGMP por DNP in vitro, sugieren que, al igual que el ANP y el BNP, el aumento de DNP-LI puede ser parte de una respuesta neurohumoral compensadora del corazón insuficiente para mantener la homeostasis cardiovascular (Schweitz et al., 1992; Wennberg et al., 1997). A su vez, la presencia de DNP-LI en el plasma puede, al igual que el ANP y el BNP, tener potencial diagnóstico en la disfunción ventricular izquierda (Stevens et al., 1995; Yamamoto et al., 1997; McDonagh et al., 1998).

Los niveles auriculares de tinción inmunohistoquímica de DNP-LI indicados en estos estudios no difirieron en CHF, en comparación con las aurículas normales. Este hallazgo sugiere similitudes con un ANP, que está presente en concentraciones similares en el miocardio auricular humano normal e insuficiente como consecuencia de la producción y secreción en aumento por el miocardio insuficiente, conduciendo a un mayor ANP circulante en la CHF (Bruneau et al., 1997). La producción y secreción de DNP por parte del miocardio auricular en CHF humana puede explicar el aumento de concentración de DNP-LI en plasma en ausencia de cualquier cambio en DNP-LI en las aurículas, según lo detectado por los estudios inmunohistoquímicos. Alternativamente, los aumentos en la DNP-LI circulante también pueden implicar aclaramientos hepático y renal reducidos atribuibles a las funciones hepática y renal deterioradas en seres humanos con CHF. Asimismo, si bien los estudios actuales, que usaron un anticuerpo policlonal (sin reactividad cruzada para ANP, BNP, CNP o endotelina) para una secuencia de aminoácidos de DNP aislados de veneno de serpiente, sugieren la existencia de DNP en el plasma y las aurículas de seres humanos, se necesita más investigación para caracterizar al DNP humano más específicamente y sintetizar su secuencia de aminoácidos específica de especies precisas.

Ejemplo 3

Los péptidos natriuréticos conocidos ANP, BNP y CNP tienen potentes acciones biológicas que incluyen natriuresis, diuresis, vasodilatación y anti-mitogénesis. Como péptidos quiméricos, el BD-NP y el CD-NP, y el extremo C de DNP, pueden compartir algunas de las propiedades del ANP, BNP y CNP, como también algunas características únicas. Se evaluaron las propiedades in vivo de BD-NP, CD-NP y el extremo C de DNP.

Métodos

Los estudios se realizaron en siete perros macho híbridos que pesaban entre 20 y 25 kg. Los perros se mantuvieron en una dieta de sodio normal con alimento para perros estándar (Lab Canine Diet 5006; Purina Mills, St. Louis, MO) con libre acceso a agua corriente. Todos los estudios cumplieron con las pautas de la American Physiological Society y fueron aprobados por el Mayo Clinic Animal Care and Use Committee.

La noche anterior al experimento, se les administraron oralmente 300 mg de carbonato de litio para la evaluación de la función tubular renal, y los perros ayunaron durante toda la noche. En el día del experimento agudo, todos los perros fueron anestesiados con pentobarbital sódico suministrado por vía intravenosa (30 mg/kg). Se administraron dosis complementarias no hipotensoras de pentobarbital sódico según fue necesario durante el experimento. Después de la intubación traqueal, los perros fueron ventilados mecánicamente (respirador Harvard; Harvard Apparatus, Millis, MA) con 4 L/minuto de oxígeno complementario.

Se efectuaron las incisiones del flanco lateral izquierdo, y se expuso el riñón izquierdo mediante un planteamiento retroperitoneal. Se colocó una cánula en el uréter con sondas de polietileno (PE-200) durante el período de recolección de orina, y se dispuso cuidadosamente una sonda de flujo electromagnética calibrada sin cánula alrededor de la arteria renal izquierda y se conectó a un medidor de flujo (modelo FM 5010, Caroline Medical Electronics, King, NC, EE. UU.) para monitorización continua del flujo sanguíneo renal (RBF). Finalmente, se canuló la vena femoral derecha con dos catéteres de polietileno (PE-24), uno para infusión de inulina y el otro para la infusión de un péptido de la invención, p. ej., BD-NP. La arteria femoral derecha se canuló con un catéter de polietileno (PE-240), para medición de la presión arterial directa y extracción de muestras de sangre arterial.

Después de completar la preparación quirúrgica, se inyectó una dosis de inulina (ICN Biomedicals, Cleveland, OH, EE. UU.) disuelta en disolución salina isotónica, seguida por una infusión constante de 1 ml/minuto para lograr una concentración de inulina en equilibrio dinámico entre 40 y 60 mg/dl. Los perros se dispusieron en suspensión dorsal y se dejaron equilibrar por 60 minutos sin intervención. La temperatura corporal se mantuvo por calentamiento externo (lámpara infrarroja).

Después de un período de equilibrio de 60 minutos, se realizó un aclaramiento inicial de 30 minutos (situación inicial). A esto le siguió un período de introductorio de 15 minutos, durante el cual comenzó la infusión de BD-NP por vía intravenosa a 10 ng/kg/minuto, después de lo cual se realizó un segundo período de aclaramiento de 30 minutos. Después del segundo período de aclaramiento, la infusión intravenosa de BD-NP se cambió a 50 ng/kg/minuto. Después de un período introductorio de 15 minutos con esta dosis de BD-NP, se realizó un aclaramiento de 30 minutos. Al final del tercer aclaramiento, la infusión se detuvo y tuvo lugar un período de lavado de 30 minutos seguido por un aclaramiento de recuperación de 30 minutos.

Métodos analíticos

El plasma para mediciones de electrólitos e inulina se obtuvo de sangre recogida en tubos heparinizados. Los electrólitos en plasma y orina, incluyendo litio, se midieron con un espectrofotómetro de emisión de llamas (IL943, Flame Photometer; Instrumentation Laboratory, Lexington, MA). Las concentraciones de inulina en plasma y orina se midieron por el método de antrona, y el índice de filtración glomerular (GFR) se midió por el aclaramiento de inulina. Se empleó la técnica de aclaramiento de litio para estimar la reabsorción fraccionaria proximal y distal de sodio. La reabsorción fraccionaria proximal se calculó mediante la siguiente fórmula: [1-(aclaramiento de litio/GFR)] x 100. La reabsorción fraccionaria distal de sodio se calculó mediante esta fórmula: [(aclaramiento de litio – aclaramiento de sodio)/aclaramiento de litio] x 100.

Se midió el cGMP en plasma y orina por radioinmunoensayo, usando el método de Steiner et al. (1972). La orina para la medición de cGMP se calentó hasta 90ºC antes de conservar a -20ºC para inhibir la actividad enzimática de degradación.

Resultados

En el primer estudio, se evaluaron las acciones cardiorrenales y humorales del BD-NP administrado por vía parenteral, que tiene la estructura núcleo del BNP y del extremo C de DNP. El potencial terapéutico del BD-NP tras la función cardiorrenal y endocrina se determinó en 7 perros anestesiados normales. Se infundó BD-NP intravenoso después de las mediciones iniciales a 10 y 50 ng/kg/min.

La administración de BD-NP produjo una disminución de MAP (133 \pm 5 a 123 \pm 4 y 106 \pm 3* mmHg; *p < 0,05 vs. situación inicial)), RAP (3,0 \pm 0,4 a 1,8 \pm 0,3* y 1,2 \pm 0,3* mmHg), PAP (16,6 \pm 0,7 a 15,1 \pm 0,5* y 12,4 \pm 0,3* mmHg) y presión capilar pulmonar (PCWP) (5,3 \pm 0,4 a 3,6 \pm 0,4* y 2,0 \pm 0,4* mmHg). El índice de filtración glomerular (GFR) aumentó (30 \pm 2 a 45 \pm 4* y 45 \pm 4* ml/minuto) sin cambios en el flujo sanguíneo renal (RBF). Por lo tanto, el BD-NP tuvo un importante efecto diurético (UV: 0,24 \pm 0,1 a 1,12 \pm 0,3 y 2,17 \pm 0,5* ml/minuto) y natriurético (UNaV: 12,7 \pm 8 a 105,1 \pm 44* y 181,7 \pm 52* mEq/minuto) con una disminución de la reabsorción fraccionaria proximal de sodio (PFRNa) (84,9 \pm 4,3 a 66,5 \pm 3,8* y 59,0 \pm 4,1* %). El cGMP en plasma (11 \pm 1,5 a 26 \pm 2,5* y 45 \pm 4,9* pmol/ml) y la excreción de cGMP en orina (1414 \pm 164 a 3044 \pm 269 y 10840 \pm 1872* pmol/minuto) durante la administración de BD-NP aumentaron notablemente. Ambas dosis de BD-NP disminuyeron significativamente la actividad de la renina en el plasma (8,9 \pm 1 a 3,9 \pm 0,6* y 5,1 \pm 1,1* ng/ml/hora).

Por lo tanto, el BD-NP reduce potentemente las presiones de llenado cardíaco, aumenta la diuresis y la natriuresis y posee acciones supresoras de la renina. Estos hallazgos soportan una posible función para este péptido quimérico en el tratamiento de la CHF.

El segundo péptido, CD-NP, que comparte la estructura de núcleo del CNP y el extremo C del DNP, se ensayó en un grupo diferente de perros pero bajo las mismas condiciones experimentales. La administración de CD-NP en las mismas dosis (10 y 50 ng/kg/min) produjo un incremento en MAP (135 a 133 y 125 mmHg), RAP (3,0 a 2,8 y 2,0 mmHg), PAP (13,5 a 13,0 y 12,5 mmHg) y PCWP (8,0 a 6,0 y 5,0 mmHg) con un incremento en GFR (38 a 47 y 49 ml/minuto). Estos cambios se asociaron con una disminución en la resistencia sistémica vascular durante la administración de DNP de baja dosis (SVR: 39 a 33 mmHg/l/minuto). El CD-NP tuvo un efecto diurético (UV: 0,14 a 0,27 y 1,01 ml/minuto) y natriurético (UNaV: 3,4 a 14,2 y 63,8 \muEq/minuto) con una disminución en PFRNa (87 a 73 y 61%). El cGMP en plasma (11 a 15 y 35 pmol/ml) y la excreción de cGMP en orina (1931 a 2844 y 7551 pmol/minuto) durante la administración CD-NP aumentaron notablemente. Por lo tanto, la administración de CD-NP reduce potentemente las presiones de llenado cardíaco y aumenta la diuresis y la natriuresis. Estas acciones se asocian con la activación del sistema de cGMP.

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Un tercer péptido, es decir, el extremo C de DNP, se ensayó in vivo en otro grupo de perros normales anestesiados. La administración del extremo C de DNP (misma dosis) produjo diuresis (UV: 0,55 a 0,70 y 1,83 ml/minuto) y natriuresis (UNaV: 64 a 75 y 123 \muEq/minuto) con una disminución en PFRNa (67 a 58 y 56%). Hubo un incremento en GFR durante la administración de la dosis más alta (36 a 36 y 41 ml/minuto). Estos efectos del extremo C de DNP se asociaron con un incremento en el cGMP del plasma (7 a 11 y 12 pmol/ml) y en la excreción de cGMP en orina (1538 a 1842 y 1786 pmol/minuto) pero no se observaron cambios en la hemodinámica cardiovascular. No obstante, ambas dosis del extremo C de DNP disminuyeron la actividad de la renina en el plasma (4,0 a 1,8 y 1,9 ng/ml/hora). Por consiguiente, el extremo C del DNP tiene propiedades natriuréticas, diuréticas y supresoras de renina cuando se administra a caninos.

Ejemplo 4 Métodos

Para determinar las propiedades cardiorrenales y endocrinas de los péptidos de la invención en la CHF, se emplea un modelo animal para CHF leve y sintomática. Los estudios se realizan en tres grupos de perros híbridos macho. El primer grupo consiste en perros normales (normales; n = 5), el segundo grupo consiste en perros con insuficiencia cardíaca leve inducida por electroestimulación ventricular rápida a 180 bpm durante 10 días (CHF leve; n = 7) y el tercer grupo consiste en perros con insuficiencia cardíaca sintomática inducida por electroestimulación ventricular rápida a 245 bpm durante 10 días (CHF sintomática, n = 7). Se mantiene a los perros en una dieta de sodio fija (Hill's Prescription Diet, Canine i/d) con libre acceso a agua corriente. Todos los estudios cumplen con las pautas de la American Physiological Society y fueron aprobados por el Mayo Clinic Animal Care and Use Committee.

Implantación de un marcapasos

Los perros del segundo y tercer grupos se anestesian primero utilizando pentobarbital sódico (30 mg/kg, i.v.) dos semanas antes del protocolo. Después de la intubación de traqueal, los perros son ventilados mecánicamente utilizando un respirador Harvard (Harvard Apparatus, Millis, MA) con 4 L/minuto de oxígeno complementario. Se implanta una derivación epicárdica (Medtronic, Minneapolis, MN) en el ventrículo derecho vía una toracotomía izquierda con una pericardiotomía de 1-2 cm. La derivación del marcapasos se conecta a un generador de pulsos (Medtronic, Minneapolis, MN, modelo 8329) que luego se implanta subcutáneamente en la pared del tórax. La captura de la electroestimulación se verifica intraoperativamente antes de cerrar la cavidad torácica. El pericardio se cierra con sutura teniendo gran precaución de no distorsionar la anatomía del pericardio. Las incisiones profundas y superficiales de la cavidad torácica se cierran entonces en capas. Los perros reciben tratamiento profiláctico con antibióticos pre y post-operatorios con 225 mg de clindamicina subcutáneamente y 400.000 U de procaína penicilina G más 500 mg de dihidroestreptomicina por vía intramuscular (Combiotic, Pfizer, Inc., New York, NY). El tratamiento profiláctico con antibióticos continúa durante los primeros dos días post-operatorios.

Después de un período post-operatorio de 14 días de recuperación, se produce la CHF leve por electroestimulación ventricular rápida a 180 bpm durante 10 días. La CHF sintomática se produce por electroestimulación ventricular rápida a 245 bpm durante 10 días.

Protocolo agudo

El siguiente protocolo agudo se realiza en los tres grupos. La noche anterior al experimento agudo se hace ayunar a los animales, se les administran 300 mg de carbonato de litio para la evaluación de las funciones renales tubulares y se les permite libre acceso a agua. El día del experimento agudo (día 11 de la electroestimulación en los grupos de insuficiencia cardíaca), todos los perros son anestesiados con pentobarbital sódico administrado por vía intravenosa (15 mg/kg). Se administran dosis complementarias no hipotensoras de pentobarbital sódico, si es necesario, durante el experimento. Después de la intubación traqueal, se ventila mecánicamente a los perros (respirador Harvard, Millis, MA) con 4 L/minuto de oxígeno complementario. Se introduce un catéter de termodilución con globo dirigido al flujo (Ohmeda, Criticath, Madison, Wl) en la arteria pulmonar vía la vena yugular externa para mediciones de hemodinámica cardíaca. Se realiza una incisión en el flanco lateral izquierdo y se expone el riñón izquierdo mediante un planteamiento retroperitoneal.

Se canula el uréter con sondas de polietileno (PE-200) para la recolección de orina durante un período determinado, y se dispone cautelosamente una sonda de flujo electromagnética calibrada sin cánula alrededor de la arteria renal izquierda y se conecta a un medidor de flujo (modelo FM 5010, King, NC) para monitorización continua del flujo sanguíneo renal (RBF). Finalmente, se canula la vena femoral derecha con dos catéteres de polietileno (PE-240), uno para infusión de inulina y el otro para la infusión de un péptido natriurético (NP) de la invención. La arteria femoral derecha se canula con un catéter de polietileno (PE-240) para medición directa de la presión arterial y extracción de muestras de sangre arterial. Después de completar la preparación quirúrgica, se inyecta una dosis de inulina (ICN Biomedicals, Cleveland, OH) disuelta en disolución salina isotónica, seguida de una infusión constante de 1 mL/minuto para lograr una concentración de inulina en plasma en equilibrio dinámico entre 40 y 60 mg/dL. A los perros se los dispone en suspensión dorsal y se los deja equilibrarse durante 60 minutos sin intervención. La temperatura corporal se mantiene por calentamiento externo.

Después de un período de equilibrio de 60 minutos, se realiza un aclaramiento inicial de 30 minutos (situación inicial). A esto le sigue un período introductorio de 15 minutos durante los cuales comienza intravenosamente la infusión de NP a 10 ng/kg/minuto, después de lo cual tiene lugar el segundo período de aclaramiento de 30 minutos. Después del segundo período de aclaramiento, la infusión intravenosa de NP se cambia a 50 ng/kg/minuto. Después de un período introductorio con esta dosis de NP, tiene lugar un aclaramiento de 30 minutos. Al final del tercer aclaramiento, se detiene la infusión del péptido natriurético y le sigue un período de lavado de 90 minutos con un aclaramiento de recuperación de 30 minutos (Recuperación).

Métodos analíticos

Los parámetros cardiovasculares medidos durante el experimento agudo incluyen presión arterial media (MAP), presión auricular derecha (RAP), presión arterial pulmonar (PAP), gasto cardíaco (CO) y presión capilar pulmonar (PCWP). El CO se determina por termodilución por triplicado y se promedia (ordenador Cardiac Output, modelo 9510-A, American Edwards laboratories, Irvine, CA). La MAP se evalúa por medición directa del catéter arterial femoral. La resistencia vascular sistémica (SVR) se calcula como [SVR = (MAP - RAP)/CO]. La resistencia vascular pulmonar (PVR) se calcula como [PVR = (PAP - PCWP)/CO].

El plasma para mediciones de electrólitos e inulina se obtiene de sangre extraída en tubos heparinizados. Los electrólitos en plasma y orina, incluyendo litio, se miden por espectrofotómetro de emisión de llamas (IL943, Flame Photometer, Instrumentation Laboratory, Lexington, MA). Las concentraciones de inulina en plasma y orina se miden por el método de antrona, y el índice de filtración glomerular (GFR) se mide por el aclaramiento de inulina. Se emplea la técnica de aclaramiento de litio para estimar la reabsorción fraccionaria distal de sodio. La reabsorción fraccionaria proximal de sodio se calcula con la fórmula: [1-(aclaramiento de litio/índice de filtración glomerular) x 100. La reabsorción fraccionaria distal de sodio se calcula con la fórmula: [(aclaramiento de litio - aclaramiento de sodio)/aclaramiento de litio] x 100. La resistencia vascular renal (RVR) se calcula como [RVR = (MAP - RAP)/RBF]. El cGMP en plasma y orina se mide por radioinmunoensayo, usando el método de Steiner et al. (1972). La orina para la medición
de cGMP se calienta hasta 90ºC antes de conservarse a -20ºC para inhibir la actividad enzimática de degradación.

El NP en plasma y orina se determina utilizando un radioinmunoensayo antes, durante y después de la administración de NP (Lisy et al., 1999a y Schirger et al., 1999).

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Resultados para administración de DNP sintético Características iniciales

Las características iniciales de los tres grupos se indican en la Tabla 4. En la CHF leve, se redujeron MAP y CO, y aumentaron RAP y PCWP. Disminuyeron el GFR y la UNaV mientras que aumentó el ANP en el plasma. En la CHF sintomática, todos estos parámetros cambian de modo similar en asociación con un incremento adicional en RAP, PAP y PCWP y una notable disminución en la UNaV. Como se ilustra en la Figura 10, los niveles iniciales de DNP-LI en CHF leve y sintomática antes de la infusión de DNP exógeno fueron más altos que los niveles en el plasma de DNP en sujetos normales.

TABLA 4

3

Hemodinámica cardiovascular durante la administración de DNP

La hemodinámica cardiovascular antes y durante la administración de DNP se indica en la Tabla 5.

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TABLA 5

4

La administración de DNP produjo reducciones en la MAP durante la administración de dosis más altas de DNP en sujetos normales y en los grupos con CHF sintomática, con una tendencia a la disminución de MAP en la CHF leve. Si bien en CHF sintomática las acciones hipotensoras del DNP se mantuvieron, la MAP volvió a la situación inicial después de la administración de DNP en participantes normales y en CHF leve. El CO disminuyó en participantes normales durante la infusión de DNP, mientras que en CHF leve y sintomática, el CO se conservó. La RAP, PCWP y PAP disminuyeron en los tres grupos, particularmente en los dos grupos de CHF en los que ya estaban muy elevados en la situación inicial. Hubo una tendencia a disminución de SVR y PVR en los dos grupos de CHF durante la administración de DNP.

Los cambios maximales en CO, SVR, RAP y PCWP durante la administración de DNP se ilustran en la Figura 11. El Panel A describe una tendencia ascendente significativa en CO en ambos grupos de CHF en comparación con el grupo normal. El Panel B ilustra una tendencia descendente significativa en SVR también en ambos grupos de CHF leve y sintomática. La disminución en las presiones de llenado cardíaco en los tres grupos en respuesta al DNP se presenta en los Paneles C y D.

Función excretora y hemodinámica renal durante la administración de DNP

La Tabla 6 presenta la función excretora y hemodinámica renal durante la administración de DNP.

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TABLA 6

5

La administración de DNP en CHF leve y sintomática aumentó el GFR, una acción no observada en el grupo normal, en ausencia de cambios en el RBF. El DNP aumentó la UNaV en el grupo normal y en los grupos de CHF leve y sintomática durante el DNP de alta dosis. Si bien se atenuó la acción natriurética del DNP en CHF sintomática, tuvo lugar el incremento en la excreción de sodio a pesar de las reducciones significativas de MAP en CHF sintomática. El DNP de alta dosis también produjo una respuesta diurética importante en los tres grupos. En CHF leve y sintomática, el DNP disminuyó la PFRNa mientras que la DFRNa solo disminuyó en el grupo normal.

Funciones humorales durante la administración de DNP

La Tabla 7 presenta la respuesta hormonal a la administración de DNP.

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TABLA 7

6

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El DNP en plasma y orina aumentó durante la administración de DNP en todos los grupos. El DNP aumentó significativamente el cGMP en plasma en todos los grupos, mientras que el incremento de excreción de cGMP en orina fue significativo únicamente durante la administración de altas dosis de DNP. El ANP o BNP en plasma no aumentó durante la administración de DNP en ninguno de los tres grupos. El DNP en dosis bajas produjo una disminución importante de PRA en el grupo normal y en el de CHF sintomática.

A su vez, la relación de cGMP en plasma/DNP en plasma con altas dosis de DNP se calculó para los tres grupos (Figura 12). La relación fue mayor para los grupos con CHF en comparación con el grupo normal, lo que respalda una mejor generación de cGMP por parte del DNP en la CHF.

Análisis

El estudio actual demuestra que la administración exógena de DNP en CHF experimental leve y sintomática tiene acciones cardiovasculares, renales y humorales beneficiosas. Específicamente, el DNP en CHF leve y sintomática disminuyó notablemente las presiones elevadas de llenado cardíaco y conservó el gasto cardíaco. En segundo lugar, el DNP aumentó el índice de filtración glomerular en CHF en ausencia de cambios del flujo sanguíneo renal. Además, el DNP fue natriurético, aunque esta acción se atenuó en CHF sintomática. La natriuresis también se asoció con una reducción en la reabsorción tubular proximal de sodio a pesar de la reducción en la presión de perfusión renal. Las acciones renales también se asociaron con reducciones en la actividad de la renina en el plasma en bajas dosis en la CHF sintomática. Finalmente, las acciones del DNP se asociaron con una mejor capacidad de aumentar el cGMP en plasma en la CHF.

Un hallazgo importante fue la capacidad del DNP para disminuir notablemente las presiones de llenado cardíaco elevadas. Esta acción se asoció con una tendencia en aumento del gasto cardíaco y en disminución de la resistencia vascular sistémica que no se observaron en el grupo normal. Dicha respuesta hemodinámica aguda es más consistente con las reducciones en la precarga asociadas con una dilatación arterial periférica más modesta. La reducción de las presiones de llenado cardíaco ocurrió inmediatamente y por lo tanto se debió muy probablemente a una acción vascular directa independiente de la respuesta natriurética renal. Además, ya que el ANP en el plasma tendió a disminuir consistentemente con la disminución de secreción secundaria al estiramiento auricular, las acciones hemodinámicas observadas no fueron mediadas por un incremento indirecto en ANP.

La administración de DNP en CHF leve y sintomática aumentó de manera única el GFR, una acción no observada en el grupo normal. En ausencia de un incremento del flujo sanguíneo renal, las acciones glomerulares del DNP pueden explicarse mediante una dilatación arteriolar aferente y una constricción arteriolar eferente y/o una acción directa para aumentar el coeficiente de filtración. Este incremento en GFR es significativo, ya que ocurrió durante una reducción adicional de la presión de perfusión renal. El DNP en altas dosis fue significativamente natriurético en todos los grupos. Si bien la acción natriurética del DNP se atenuó en la CHF sintomática, el aumento en la excreción de sodio ocurrió a pesar de las importantes reducciones en la presión arterial media. A su vez, la acción natriurética se asoció con una disminución de la reabsorción proximal de sodio según lo determinado por la técnica de aclaramiento de litio. Esta respuesta renal, particularmente en el GFR, es importante, ya que una característica de la CHF sintomática experimental es una hiporreactividad renal al ANP administrado en forma exógena (Cavero et al., 1990). Las altas dosis de DNP también produjeron una importante respuesta diurética en todos los grupos. Por consiguiente, las acciones renales del DNP parecen ser exclusivas a pesar de las reducciones en la presión de reperfusión renal, el GFR aumentó y la reabsorción proximal de sodio disminuyó en asociación tanto con la natriuresis como con la
diuresis.

La DNP-LI en plasma de seres humanos normales promedia 6 pg/ml con un intervalo de 2 a 11 pg/ml. En CHF humana (NYHA III o IV), la DNP-LI en plasma promedia 37 pg/ml con un intervalo de 3 a 200 pg/ml. Usando un radioinmunoensayo específico y sensible, la DNP-LI en plasma de caninos normales promedia 6 pg/ml con un intervalo de 4 a 7 pg/ml. La DNP-LI en plasma de caninos con CHF experimental aumenta hasta un promedio de 12 pg/ml y con un intervalo de 9 a 15 pg/ml. Las concentraciones en plasma de DNP en la CHF son menos que aquellas indicadas para ANP y BNP pero por encima de aquellas indicadas para CNP (Burnett et al., 1986; Wei et al., 1993).

Se eligieron dos dosis diferentes para la administración de DNP a fin de establecer un amplio intervalo de concentraciones en plasma para definir las acciones terapéuticas potenciales del DNP en la CHF. Cabe destacar que la dosis inferior de 10 ng/kg/minuto de DNP logró concentraciones circulantes de aproximadamente 300 pg/ml en el grupo normal y en los grupos con CHF, que son prácticamente el intervalo más alto de aquellas observadas en la insuficiencia cardíaca humana y, por lo tanto, se pueden considerar patofisiológicas. La dosis mayor, 50 ng/kg/minuto, establece claramente las acciones farmacológicas del DNP. Usando esta dosis, las concentraciones en el plasma de DNP lograron aproximadamente 3.000 pg/ml en el grupo normal, pero únicamente 1.000 pg/ml en los dos grupos de CHF. Los niveles en plasma reducidos de DNP logrados durante la infusión en CHF pueden sugerir que se reduce la semivida del DNP infundido, lo que podría reflejar una alteración de los mecanismos de aclaramiento. A pesar de los niveles inferiores de DNP logrados en la CHF durante la infusión, se conserva la reactividad del tejido al DNP y posiblemente se mejora, según lo sugiere la relación del incremento de cGMP en el plasma a DNP en plasma
(Figura 12).

Se ha indicado que el ANP inhibe la renina en sujetos normales como también en CHF humana, mientras que los efectos inhibidores en la insuficiencia cardíaca se atenúan (Richards et al., 1988; Nicholls, 1994). El DNP comparte esta acción ya que se observó la capacidad del DNP en bajas dosis para disminuir PRA en el grupo de normales como también en CHF sintomática. En contraste, esta acción no se observa durante la administración a corto plazo de BNP exógeno en perros normales y con CHF, donde el BNP no suprime la PRA (Clavell et al., 1993). Dichas acciones inhibidoras de la renina ocurrieron a pesar de la presencia de estímulos de renina conocidos tales como reducciones en la presión auricular y en la presión de perfusión renal.

El potencial terapéutico de la administración exógena de DNP está también respaldado por el informe de un ensayo clínico en CHF, en el que la conservación de la función renal, particularmente el índice de filtración glomerular, fue el determinante más importante de supervivencia en pacientes con CHF grave (Girbes et al., 1998). A su vez, esta acción mejoradora del GFR se asoció con la capacidad del DNP para disminuir notablemente las presiones de llenado cardíaco elevadas en asociación con las propiedades inhibidoras de renina, natriuresis y diuresis. Estas acciones también se asociaron con una capacidad conservada del DNP de activar el sistema mensajero secundario de cGMP.

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Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes se incorporan a la presente memoria por referencia. Si bien en la memoria anterior esta invención ha sido descrita en relación con determinadas realizaciones preferidas de la misma y se han expuesto muchos detalles para fines ilustrativos, será obvio para el experto en la técnica que la invención es susceptible de realizaciones adicionales y que ciertos detalles de la presente memoria pueden variarse considerablemente sin desviarse de los principios básicos de la invención.

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<110> Mayo Foundation for Medical Education and Research Burnett, Jr., John C. Lisy, Ondrej

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<120> Péptidos natriuréticos quiméricos

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<130> 150.199WO1

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<150> US 09/466,268

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<151> 1999-12-17

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<160> 10

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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<210> 1

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<211> 41

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Un péptido quimérico

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<400> 1

31

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<210> 2

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<211> 37

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Un péptido quimérico

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<400> 2

32

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<210> 3

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Dendroaspis angusticeps

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<400> 3

33

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<210> 4

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<211> 53

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Un compuesto de fórmula I

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<221> SITIO

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<222> (1)...(35)

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<223> Todos o cada uno de los aminoácidos 1-35 pueden estar presentes o ausentes.

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<221> SITIO

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<222> 38, 50-52

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<223> Xaa es Ser o Thr.

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<221> SITIO

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<222> 40, 43, 47

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<223> Xaa es Leu, Lys, Arg, His, Orn, Asn o Gin.

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<221> SITIO

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<222> (41)...(41)

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<223> Xaa es Asp o Glu.

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<221> SITIO

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<222> 39, 45, 48

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<223> Xaa es Gly, Ala, Val, Met, Leu, Nle o Ile.

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<221> SITIO

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<222> (53)...(53)

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<223> Xaa es Lys, Arg, Orn, Ala, Thr, Asn o Gin.

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<400> 4

34

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<210> 5

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<211> 28

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

35

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<210> 6

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<211> 32

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

36

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<210> 7

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<211> 25

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

37

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<210> 8

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<211> 21

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

38

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<210> 9

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<211> 22

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

39

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<210> 10

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<211> 38

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<212> PRT

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<213> Dendroaspis angusticeps

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<400> 10

40

Claims

1. Un fragmento peptídico biológicamente activo aislado y purificado del péptido natriurético Dendroaspis (DNP), que comprende la SEQ ID NO: 3, en donde el péptido tiene por lo menos una actividad seleccionada del grupo que consiste en vasodilatación, natriuresis, diuresis y actividad supresora de renina.

2. El péptido según la reivindicación 1, que además comprende por lo menos una porción de un péptido natriurético que no es el péptido natriurético Dendroaspis.

3. El péptido según la reivindicación 2, en el que el péptido natriurético que no es el péptido natriurético Dendroaspis es el péptido natriurético cerebral (BNP) o el péptido natriurético de tipo C (CNP).

4. El péptido según la reivindicación 2, que comprende la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2.

5. Un compuesto peptídico de la fórmula (H)-Pro-Ser-Leu-Arg-Asp-Pro-Arg-Pro-Asn-Ala-Pro-Ser-Thr-Ser-Ala-(R) (SEQ ID NO: 3); o de la fórmula (H)-Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Pro-Ser-Leu-Arg-Asp-Pro-Arg-Pro-Asn-Ala-Pro-Ser-Thr-Ser-Ala-(R)
(SEQ ID NO: 1); o de la fórmula (H)-Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Met-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Pro-Ser-Leu-Arg-Asp-Pro-Arg-Pro-Asn-Ala-Pro-Ser-Thr-Ser-Ala(R) (SEQ ID NO: 2); en donde R es OH, NH_{2}, NHR^{3} o N (R^{3}) (R^{4}), donde R^{3} y R^{4} son independientemente fenilo o alquilo (C_{1}-C_{4}); y donde en las SEQ ID NOS: 1 y 2, los dos residuos Cys se conectan mediante un enlace disulfuro; o su sal farmacéuticamente aceptable.

6. Un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o el compuesto peptídico según la reivindicación 5 para uso en la terapia médica.

7. Una composición útil como natriurético, diurético, supresor de renina o vasodilatador, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto según la reivindicación 5, o su combinación, con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. Uso del péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o el compuesto peptídico según la reivindicación 5 para la preparación de un medicamento para inhibir o prevenir la insuficiencia cardíaca en un mamífero.

9. El uso según la reivindicación 8, en el que el medicamento es para administración parenteral.

10. El uso según la reivindicación 8, en el que el medicamento es para administración local o sistémica.

11. Uso de un fragmento biológicamente activo del péptido natriurético Dendroaspis (DNP) según lo definido en la reivindicación 1, para la preparación de un medicamento para tratar la insuficiencia cardíaca en un mamífero.

12. El uso según la reivindicación 8 o la reivindicación 11, en el que el mamífero es un ser humano, rata, ratón, canino, bovino, equino, ovino, caprino o felino.

13. Uso del péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o el compuesto peptídico según la reivindicación 5 para la preparación de un medicamento para inhibir o prevenir la insuficiencia renal en un mamífero.