JP2019528067A - 血管拡張作用および／または利尿作用を有するペプチド - Google Patents

Abstract

本発明は、血管拡張作用および／または利尿作用を有するペプチドに関する。具体的には、本発明は、異なる作用および特性を達成するための、ナトリウム利尿ペプチドにおける極めて重要なアミノ酸残基の修飾に関する。したがって、本発明はまた、修飾されたナトリウム利尿ペプチドを包含する。本発明はまた、血圧および血液量を調節し、心臓の病態を治療するための、上記ペプチドの使用に関する。

Description

本発明は、血管拡張作用および／または利尿作用を有するペプチドに関する。本発明はまた、血圧および血液量を調節するための上記ペプチドの使用に関する。

心不全（ＨＦ）は、世界の主たる死亡原因の１つ（死亡数４につき１）である［Roger, V. L.; et al., Circulation 123 (4): e18-e209 (2011)］。ＨＦは、冠動脈疾患、心筋梗塞、長期にわたる高血圧症、心筋症などのいくつかの因子によって発症しうるが、その徴候の進行は、神経体液系、特に血液量を増加させ、血圧を上昇させるレニン−アンジオテンシンアルドステロン系（ＲＡＡＳ）および交感神経系（ＳＮＳ）の活性化に関連している［MacMahon, K. M.; Lip, G. Y., Arch Intern Med 162 (5): 509-16 (2002)］。ＨＦの際立った特徴としては、血管収縮に伴う心臓の機能的変化および構造的変化、程度の差はあるにせよ腎臓による水分およびナトリウムの貯留が挙げられる［McMurray, J. J.; Pfeffer, M. A., Lancet 365 (9474): 1877-89 (2005)］。ＨＦの患者は、（ａ）血液量が正常またはやや過多である高血圧性ＨＦ、（ｂ）血液量減少状態を伴う正常血圧性ＨＦ、および（ｃ）血液量過多状態または血液量減少状態を伴う低血圧性ＨＦに大きく分類されうる［Packer, M., Am J Cardiol 71 (9): 3C-11C (1993); Strobeck, J. E.; Silver, M. A., Congest Heart Fail 10 (2 Suppl 2): 1-6 (2004)］。

ナトリウム利尿ペプチド（ＮＰ）は、血管緊張および体内の体液量を調節することにより心臓血管を保護する、生命維持に必要なホルモン群である［Brenner, B. M.; et al., Physiol Rev 70 (3): 665-99 (1990)］。ナトリウム利尿ペプチドは、生理学的条件下および病理学的条件下において生物の血行動態に影響を与えるという重要な役割を有する。ＮＰとしては、３種のアイソフォーム、すなわちＡＮＰ、ＢＮＰおよびＣＮＰが存在し、これらは哺乳動物において同定されている［Kangawa, K.; Matsuo, H., Biochem Biophys Res Commun 118 (1): 131-9 (1984); Sudoh, T.; et al., Nature 332 (6159): 78-81 (1988); Sudoh, T.; et al., Biochem Biophys Res Commun 168 (2): 863-70 (1990)］。これらのペプチドは、ジスルフィド結合により保持されている進化的に保存された１７残基からなる環と、可変Ｎ末端テイルおよび可変Ｃ末端テイルとを有する。ＡＮＰおよびＢＮＰは、心腔における充満圧の増大に応じて心臓壁により分泌され［de Bold, A. J., Science 230 (4727): 767-70 (1985)］、一方ＣＮＰは、血管内皮により産生される［Suga, S.; et al., Endocrinology 133 (6): 3038-41 (1993)］。これらのペプチドは、特定の膜結合ナトリウム利尿ペプチド受容体（ＮＰＲ−Ａ、ＮＰＲ−ＢまたはＮＰＲ−Ｃ）に結合する。ＡＮＰおよびＢＮＰは、ＮＰＲ−Ａを活性化し［Waldman, S. A.; et al., J Biol Chem 259 (23): 14332-4 (1984)］、ＣＮＰは、ＮＰＲ−Ｂを通じて細胞内ｃＧＭＰレベルを上昇させる機能を果たす［Suga, S.; et al., Endocrinology 130 (1): 229-39 (1992)］。ＡＮＰ／ＮＰＲ−Ａシグナル伝達の下流活性には、血管拡張、腎臓による水分および電解質の排出増加、内皮透過性の増加ならびにレニン−アンジオテンシンアルドステロン系（ＲＡＡＳ）および交感神経系（ＳＮＳ）の抑制が含まれる［Brenner, B. M.; et al., Physiol Rev 70 (3): 665-99 (1990); Maack, T.; et al., Fed Proc 45 (7): 2128-32 (1986); Sasaki, A.; et al., Eur J Pharmacol 109 (3): 405-7 (1985)］。血行動態および拮抗因子の分泌の阻害に対するこれらの直接的作用は、ＮＰの抗高血圧・抗血液量過多作用に寄与する［Brenner, B. M.; et al., Physiol Rev 70 (3): 665-99 (1990)］。これに対し、ＣＮＰ／ＮＰＲ−Ｂシグナル伝達は、主として、血管拡張による緩やかな血圧低下作用に加えて、組織の再構成、再生および脳の機能に関与する［Chusho, H.; et al., Proc Natl Acad Sci U S A 98 (7): 4016-21 (2001)］。保存されたＮＰ環内の残基は、受容体結合にとって必要であり、一方、特定ＮＰＲに対する分子認識は、Ｃ末端伸長のような、それらの配列のわずかな差異に因るものである［Brenner, B. M.; et al., Physiol Rev 70 (3): 665-99 (1990)］。

ＨＦに対する現行の治療戦略には、血液量および血圧を減少させ、２次応答としてＮＰ活性およびｃＧＭＰ産生を増大させるアンジオテンシン変換酵素阻害剤、ネプリライシン阻害剤、アンジオテンシン受容体阻害剤および利尿剤を用いた、ＲＡＡＳおよびＳＮＳの活性化に対する薬理学的介入が含まれる［Rogers, C.; Bush, N., Nurs Clin North Am 50 (4): 787-99 (2015)］。ＮＰは、血管緊張の調節、ナトリウム利尿、利尿ならびにＲＡＡＳおよびＳＮＳの抑制を通じた血圧および血液量ホメオスタシスの回復において重大な役割を有する［Lee, C. Y.; Burnett, J. C., Jr., Heart Fail Rev 12 (2): 131-42 (2007)］。ＡＮＰレベルおよびＢＮＰレベルはいずれも、ＨＦ患者では高くなっているが、（ａ）生物活性ペプチドの利用能が低いこと、また（ｂ）ＮＰ受容体の発現レベルが低いことにより、それらの有益な役割を果たすことができない［Mukaddam-Daher, S., Expert Opin Ther Targets 10 (2): 239-52 (2006)］。ＡＮＰレベルおよびＢＮＰレベルが高いＨＦ患者に対してＡＮＰまたはＢＮＰの体外から注入すると、患者の臨床状態の改善が示された［Lee, C. Y.; Burnett, J. C., Jr., Heart Fail Rev 12 (2): 131-42 (2007); Mukaddam-Daher, S., Expert Opin Ther Targets 10 (2): 239-52 (2006)］。ＡＮＰおよびＢＮＰの体外からの注入は、有益な役割があるにもかかわらず、生理学的作用が多様であるために、苦痛をもたらすものとされてきた。したがって、ＮＰの血管作用と腎作用とを区別するリガンドは、異なる平衡失調を伴う様々なＨＦ患者の個別のニーズを満たす上で大きな価値を有するであろう［Strobeck, J. E.; Silver, M. A., Congest Heart Fail 10 (2 Suppl 2): 1-6 (2004); Volpe, M.; et al., Clin Sci (Lond) 130 (2): 57-77 (2016)］。

ＨＦは、（ａ）血液量が正常またはやや過多である高血圧性ＨＦ、（ｂ）血液量減少状態を伴う正常血圧性ＨＦ、および（ｃ）血液量過多状態または血液量減少状態を伴う低血圧性ＨＦに大きく分類されうる。ナトリウム利尿ペプチド（ＮＰ）は、血管、腎臓、心臓および交感神経系に対する多面的な作用を通じて血圧および血液量を低減させる極めて重要なホルモンである。この多面的作用ゆえに、ＨＦ患者に対してＮＰを注入することは、血圧および血液量の過負荷の低減において有益である。しかしながら、ＮＰの注入はまた、重度の低血圧とも関連付けられている。

心不全における様々な緊張状態およびボルミック状態のための新規薬剤リードが所望される。

本発明は、血管拡張作用および／または利尿作用を有することにより血圧を調整するペプチドを提供する。

第１の態様によれば、本発明は、配列番号１（ＣＦＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＸ_８Ｘ_９ＧＣ）（式中、Ｘ_１、Ｘ_２およびＸ_８は各々独立して任意のアミノ酸を含み；Ｘ_３はＲまたはＫを含み；Ｘ_４はＭ、ＩまたはＬを含み；Ｘ_５はＧ、ＳまたはＮを含み；Ｘ_６はＡ、ＨまたはＳを含み；Ｘ_７はＱ、Ｔ、Ｓ、ＭまたはＶを含み；Ｘ_９はＩまたはＬを含む）を含む単離されたペプチドを提供する。

第２の態様によれば、本発明は、医薬における使用、治療における使用および／または薬剤としての使用のための、本発明の任意の態様による単離されたペプチドを提供する。

第３の態様によれば、本発明は、血圧および血液量を調節するための、かつ／または心臓の病態を治療するための薬剤の調製における、本発明の任意の態様による少なくとも１つの単離されたペプチドの使用を提供する。

第４の態様によれば、本発明は、対象において血圧および血液量を調節するための、かつ／または心臓の病態を治療するための方法であって、本発明の任意の態様による単離されたペプチドの有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。

図１Ａ〜図１Ｃは、Ｋ環が血管拡張剤であることを示す。図１Ａ：哺乳動物ＮＰおよび毒液ＮＰの配列比較。ＮＰは、ジスルフィド結合により保持された標準的な１７員環を有する。ピンク色の残基は、全ＮＰにおいて保存されており、影を付けて強調表示された残基はＮＰ受容体結合にとって重要である。Ｋ環は、３位および１４位において２つの主要な置換がなされ、保存されたＧ残基がＤに置換されており、２残基のＣ末端テイルを有する。雄性ＳＤラットにナトリウムペントバルビタールで麻酔をかけ、大腿動脈および大腿静脈ならびに膀胱にカテーテルを挿入した。ペプチド含有または不含有の生理食塩水を、実験の最初から最後まで連続的に注入した。影を付けた領域は、ペプチドの注入を表す。図１Ｂ：麻酔をかけたラットのＭＡＰに対するＡＮＰおよびＫ環の用量依存的効果。図１Ｃ：麻酔をかけたラットの尿流速に対するＡＮＰおよびＫ環の用量依存的効果。これらのデータは、５つの独立した実験の平均値±ＳＥとして表されている。 対照群、０．２ｎｍｏｌ／ｋｇ／分のＡＮＰおよび２ｎｍｏｌ／ｋｇ／分のＫ環のプロファイルは、Sridharan et al.,［Biochem J 469 (2): 255-66 (2015)］から得た。

図２Ａ〜図２Ｃは、環におけるアスパラギン酸残基とＣ末端テイルが、ＮＰのインビボ活性を制御する分子スイッチであることを示す。図２Ａ：Ｋ環バリアントの配列およびそれらのインビボ応答（置換された残基は緑色で示している）。ナトリウムペントバルビタールで麻酔をかけた雄性ＳＤラットの大腿動脈および大腿静脈ならびに膀胱にカテーテルを挿入し、ペプチドの注入と併せて血行動態および尿量を測定した。ペプチド含有または不含有の生理食塩水を、実験の最初から最後まで連続的に注入した。影を付けた領域は、ペプチドの注入期間を表す。図２Ｂ：麻酔をかけたラットのＭＡＰに対するＫ環およびそのバリアントの用量依存的（２ｎｍｏｌ／ｋｇ／分）効果。図２Ｃ：麻酔をかけたラットにの尿流速に対するＫ環およびそのバリアントの用量依存的効果。これらのデータは、５つの独立した実験の平均値±ＳＥとして表されている。 対照および２ｎｍｏｌ／ｋｇ／分のＫ環のプロファイルは、Sridharan et al.,［Biochem J 469 (2): 255-66 (2015)］から得た。

図３Ａ〜図３Ｃは、ＡＮＰスカホールドにアスパラギン酸残基およびアルギニン残基を組み込むことにより血管作用および腎作用が変化することを示す。図３Ａ：ＡＮＰバリアントの配列およびそれらのインビボ応答（置換された残基は緑色で示している）。ナトリウムペントバルビタールで麻酔をかけた雄性ＳＤラットの大腿動脈および大腿静脈ならびに膀胱にカテーテルを挿入し、ペプチドの注入と併せて血行動態および尿量を測定した。ペプチド含有または不含有の生理食塩水を、実験の最初から最後まで連続的に注入した。影を付けた領域はペプチドの注入期間を表す。図３Ｂ：麻酔をかけたラットのＭＡＰに対するＡＮＰおよびそのバリアントの用量依存的効果。図３Ｃ：麻酔をかけたラットの尿流速に対するＡＮＰおよびそのバリアントの用量依存的効果。これらのデータは、５つの独立した実験の平均値±ＳＥとして表されている。 対照および０．２ｎｍｏｌ／ｋｇ／分のＡＮＰのプロファイルは、Sridharan et al.,［Biochem J 469 (2): 255-66 (2015)］から得た。

図４Ａ〜図４Ｆは、ＡＮＰおよびＫ環のバリアントがＮＰＲ−Ａの部分的アゴニストであることを示す。ＮＰ類似体による（ＮＰＲ−Ａを一時的に発現している）細胞の処理後に蓄積されたｃＧＭＰの量を求めた。図４Ａ、図４Ｂ：ＡＮＰ、Ｋ環およびそれらのバリアントで３０分間処理した後のｃＧＭＰ産生の用量応答。図４Ｃ、図４Ｄ：ＥＣ５０濃度のペプチドを用いた時間追跡調査において測定されたＮＰＲ−Ａの活性化動態。図４Ｅ、図４Ｆ：ＮＰ１ピコモル当たりのＮＰＲ−Ａの活性化動態。これらのデータは、３つの独立した実験の平均値±ＳＥとして表されている。

ＡＮＰ、Ｋ環およびそれらのバリアントの分子質量および等質性を示す。Ｆｍｏｃに基づく固相ペプチド化学を用いて合成ＡＮＰ、Ｋ環およびそれらのバリアントを合成し、逆相ＨＰＬＣにより精製した。精製したペプチドを、アルカリ条件下１０％ＤＭＳＯ溶液を用いて酸化し、ＨＰＬＣで精製した。精製した酸化ペプチドの質量をＥＳＩイオントラップＭＳにより分析した。算出したペプチドの質量を示す。

図６Ａ〜図６Ｄは、ＡＮＰおよびＫ環の用量依存的注入に応じた血管パラメータの変化を示す。 ナトリウムペントバルビタールを用いて麻酔をかけた雄性ＳＤラットの大腿動脈および大腿静脈ならびに膀胱にカテーテルを挿入した。ペプチド含有または不含有の生理食塩水を、実験の最後まで連続的に注入した。影を付けた領域はペプチドの注入を表す。図６Ａ：心拍数、図６Ｂ：脈圧、図６Ｃ：収縮期圧、図６Ｄ：拡張期圧は、２つの異なる用量のＡＮＰおよびＫ環の注入に伴って変化する。

図７Ａ〜図７Ｄは、Ｋ環バリアントの用量依存的注入に応じた血管パラメータの変化を示す。ナトリウムペントバルビタールを用いて麻酔をかけた雄性ＳＤラットの大腿動脈および大腿静脈ならびに膀胱にカテーテルを挿入した。ペプチド含有または不含有の生理食塩水を、実験の最後まで連続的に注入した。影を付けた領域はペプチドの注入を表す。図７Ａ：心拍数、図７Ｂ：脈圧、図７Ｃ：収縮期圧、図７Ｄ：拡張期圧は、Ｋ環バリアントの注入に伴って変化する。示されたデータは、５つの独立した試験の平均であり、平均値±ＳＥとして表されている。対照および２ｎｍｏｌ／ｋｇ／分のＫ環のプロファイルは、Sridharan et al.,［Biochem J 469 (2): 255-66 (2015)］から得た。

図８Ａ〜図８Ｄは、ＡＮＰバリアントの用量依存的注入に応じた血管パラメータの変化を示す。 ナトリウムペントバルビタールを用いて麻酔をかけた雄性ＳＤラットの大腿動脈および大腿静脈ならびに膀胱にカテーテルを挿入した。ペプチド含有または不含有の生理食塩水を、実験の最後まで連続的に注入した。影を付けた領域はペプチドの注入を表す。図８Ａ：心拍数、図８Ｂ：脈圧、図８Ｃ：収縮期圧、図８Ｄ：拡張期圧は、ＡＮＰバリアントの注入に伴って変化する。 示されたデータは、５つの独立した試験の平均であり、平均値±ＳＥとして表されている。対照群、０．２ｎｍｏｌ／ｋｇ／分のＡＮＰおよび２ｎｍｏｌ／ｋｇ／分のＫ環のプロファイルは、Sridharan et al.,［Biochem J 469 (2): 255-66 (2015)］から得た。定義

本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で使用されている特定の用語を、便宜のため、ここにまとめて記載する。

本明細書において、用語「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列もしくはタンパク質配列、またはこれらのいずれかのフラグメントを指し、天然に存する分子または合成分子を指す。

「同類アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で規定されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝状側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。ペプチド活性を変化させるためにナトリウム利尿ペプチドの１７残基環の２位、３位および／または１４位において置換されているアミノ酸残基は、類似したアミノ酸により置き換えることができ、この場合、ペプチド活性は実質的に変化しない。例えば、ペプチド活性を変化させるためにナトリウム利尿ペプチドの１７残基環においてＤ（Ａｓｐ）への置換がなされる場合、これを、同じ（酸性残基）側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基、例えばＥ（Ｇｌｕ）などと置き換えることができる。同様に、Ｋ（Ｌｙｓ）とＲ（Ａｒｇ）とはいずれも塩基性残基であるため、Ｋ（Ｌｙｓ）をＲ（Ａｒｇ）の代わりに使用することができる。さらに、Ｃ末端のＮＳＦＲＹは、受容体と相互作用することが知られている。アミノ酸Ｑ（Ｇｌｎ）はＮ（Ａｓｎ）と同等（いずれも親水性中性残基）であり、Ｔ（Ｔｈｒ）はＳ（Ｓｅｒ）と同等（いずれもヒドロキシル側鎖を有する親水性中性残基）であり、Ｙ（Ｔｙｒ）およびＷ（Ｔｒｐ）はＦ（Ｐｈｅ）と同等（いずれも疎水性芳香族残基）である。また、これらの残基の置換は、Ｃ末端テイルの修飾にも役立ちうる。

「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定のアミノ酸配列を含む組成物」は、本明細書において、本発明の当該所定のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む広範な任意の組成物を指す。この組成物は、乾燥製剤または水溶液を含みうる。

本明細書において、用語「核酸」または「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドもしくはそれらの任意のフラグメント、１本鎖でも２本鎖でもよく、センス鎖もしくはアンチセンス鎖を表しうるゲノム由来もしくは合成起源のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）または任意のＤＮＡ様物質もしくはＲＮＡ様物質を指す。

本明細書において、用語「対象」は、脊椎動物、特に哺乳動物、より具体的にはヒトとして定義される。研究目的では、該対象は、具体的には少なくとも１つの動物モデル、例えばマウス、ラットなどでありうる。特に、血圧関連疾患の処置または予防に関して、該対象はヒトでありうる。

本発明の文脈において、用語「処置」は、改善処置、治療的処置または根治的処置を指す。

本明細書において、用語「含んでいる」または「包含している」は、言及されている特徴、整数、工程または構成要素の存在を規定するものと解釈されるが、１つもしくは複数の特徴、整数、工程もしくは構成要素、またはそれらの群の存在または追加を排除するものではない。しかしながら、本開示に関して、用語「含んでいる」または「包含している」はまた、「からなる」を包含する。「含む」のような「含んでいる」の変化形、および「包含する」のような「包含している」の変化形は、相応じて変化した意味を有する。

本明細書で言及される参照文献は、便宜上、参照文献リストの形態で実施例の最後に付加して記載する。

本発明は、配列番号１（ＣＦＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＸ_８Ｘ_９ＧＣ）（式中、Ｘ_１、Ｘ_２およびＸ_８は各々独立して任意のアミノ酸を含み；Ｘ_３はＲまたはＫを含み；Ｘ_４はＭ、ＩまたはＬを含み；Ｘ_５はＧ、ＳまたはＮを含み；Ｘ_６はＡ、ＨまたはＳを含み；Ｘ_７はＱ、Ｔ、Ｓ、ＭまたはＶを含み；Ｘ_９はＩまたはＬを含む）を含む単離されたペプチドを提供する。

好ましい一実施形態において、本発明の単離されたペプチドおよび／または核酸は、天然に存在するペプチドおよび／または核酸分子を除外するが、例えばインビボおよび／またはインビトロでの安定性を高めるなどの目的のために当業界で既知の標準的方法により何らかの形で修飾されているものについては、この限りではない。

また別の好ましい一実施形態において、天然に存在するペプチドをコードするエキソンの天然に存在する配列を複製する単離されたｃＤＮＡ分子もまた、本発明から除外される。

天然に存在するペプチドの例としては、
ＳＬＲＲＳＳＣＦＧＧＲＭＤＲＩＧＡＱＳＧＬＧＣＮＳＦＲＹ（配列番号５２）を有する心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、
ＧＬＬＩＳＣＦＤＲＲＩＤＲＩＳＨＴＳＤＩＧＣＲＨＲＫＤＰＰＲＡＰＰＡＡＰＳＡＡＰＬＡＶＴＷＬＩＲＤＬＲＡＤＳＫＱＳＲＡＡ（配列番号５３）を有するアマガサヘビ毒液ナトリウム利尿ペプチド（ＫＮＰ）、
ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＫＶＬＲＲＨ（配列番号５４）を有するＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、
ＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号５５）を有するＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、
ＥＶＫＹＤＰＣＦＧＨＫＩＤＲＩＮＨＶＳＮＬＧＣＰＳＬＲＤＰＲＰＮＡＰＳＴＳＡ（配列番号５６）を有するマンバ属ナトリウム利尿ペプチド（ＤＮＰ）
が挙げられる。

ｃＤＮＡ分子、天然に存在するペプチドおよび／または天然に存在する核酸分子の使用はいずれも、本発明の一部とみなされる。

ナトリウム利尿ペプチドの１７残基環の配列を含むかまたは該配列から構成される単離されたペプチドが本発明に包含されることは、理解されるであろう。

ナトリウム利尿ペプチドの１７残基環の配列を含み、１７残基環の２位、３位および／または１４位に少なくとも１つの修飾されたアミノ酸を含むペプチドもまた本発明に包含されることは、理解されるであろう。「修飾された」という語は、ナトリウム利尿ペプチドの１７残基環にある１つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換されていることを包含する。例えば、２位のアミノ酸Ｇ（Ｇｌｙ）を、アミノ酸Ｄ（Ａｓｐ）で置換してもよい。

ナトリウム利尿ペプチドの１７残基環の２位、３位および／または１４位に少なくとも１つの修飾アミノ酸を含む単離された完全長ナトリウム利尿ペプチドもまた本発明に包含されることは、理解されるであろう。さらに、２位、３位および／または１４位でなされたアミノ酸置換を、同類アミノ酸により置換できることが理解されるであろう。例えば、３位をＲ（Ａｒｇ）で置換する場合、Ｋ（Ｌｙｓ）のような別の類似（同類）アミノ酸を用いても、ペプチド活性に対するＲの影響を再現できる。

本発明について、以下の発明の実施形態によってさらに説明する。

第１の態様によれば、本発明は、哺乳動物において血管拡張作用および／または利尿作用を有する単離されたペプチドであって、アミノ酸配列、配列番号１（ＣＦＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＸ_８Ｘ_９ＧＣ）（式中、Ｘ_１、Ｘ_２およびＸ_８は各々独立して任意のアミノ酸を含み；Ｘ_３はＲまたはＫを含み；Ｘ_４はＭ、ＩまたはＬを含み；Ｘ_５はＧ、ＳまたはＮを含み；Ｘ_６はＡ、ＨまたはＳを含み；Ｘ_７はＱ、Ｔ、Ｓ、ＭまたはＶを含み；Ｘ_９はＩまたはＬを含む）を含み、かつ配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５または配列番号５６で示されるアミノ酸配列から構成されるものではないペプチドを提供する。

好ましい一実施形態によれば、第１の態様による単離されたペプチドは、配列番号２（ＣＦＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＸ_８Ｘ_９ＧＣ）（式中、Ｘ_１はＤまたはＧを含む）を含む。Ｘ_１は、Ｄの代わりにＥを含みうる。

別の好ましい一実施形態によれば、第１の態様による単離されたペプチドは、配列番号３（ＣＦＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＸ_８Ｘ_９ＧＣ）（式中、Ｘ_２はＲまたはＧを含む）を含む。Ｘ_２は、Ｒの代わりにＫを含みうる。

別の好ましい一実施形態によれば、第１の態様による単離されたペプチドは、配列番号４（ＣＦＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＸ_８Ｘ_９ＧＣ）（式中、Ｘ_８はＤまたはＧを含む）を含む。Ｘ_８は、Ｄの代わりにＥを含みうる。

別の好ましい一実施形態によれば、第１の態様または第１の好ましい実施形態による単離されたペプチドは、配列番号５（ＣＦＤＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＸ_８Ｘ_９ＧＣ）を含む。

別の好ましい一実施形態によれば、第１の態様または第１の好ましい実施形態による単離されたペプチドは、配列番号６（ＣＦＧＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＸ_８Ｘ_９ＧＣ）を含む。

別の好ましい一実施形態によれば、第１の態様または第２の好ましい実施形態による単離されたペプチドは、配列番号７（ＣＦＸ_１ＲＸ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＸ_８Ｘ_９ＧＣ）を含む。

別の好ましい一実施形態によれば、第１の態様または第２の好ましい実施形態による単離されたペプチドは、配列番号８（ＣＦＸ_１ＧＸ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＸ_８Ｘ_９ＧＣ）を含む。

別の好ましい一実施形態によれば、第１の態様または第３の好ましい実施形態による単離されたペプチドは、配列番号９（ＣＦＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＤＸ_９ＧＣ）を含む。

別の好ましい一実施形態によれば、第１の態様または第３の好ましい実施形態による単離されたペプチドは、配列番号１０（ＣＦＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＧＸ_９ＧＣ）を含む。

別の好ましい一実施形態によれば、第１の態様による単離されたペプチドは、配列番号１１（ＣＦＤＲＸ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＸ_８Ｘ_９ＧＣ）を含む。

別の好ましい一実施形態によれば、第１の態様による単離されたペプチドは、配列番号１２（ＣＦＧＲＸ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＸ_８Ｘ_９ＧＣ）を含む。

別の好ましい一実施形態によれば、第１の態様による単離されたペプチドは、配列番号１３（ＣＦＤＧＸ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＸ_８Ｘ_９ＧＣ）を含む。

別の好ましい一実施形態によれば、第１の態様による単離されたペプチドは、配列番号１４（ＣＦＧＧＸ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＸ_８Ｘ_９ＧＣ）を含む。

別の好ましい一実施形態によれば、第１の態様による単離されたペプチドは、配列番号１５（ＣＦＤＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＤＸ_９ＧＣ）を含む。

別の好ましい一実施形態によれば、第１の態様による単離されたペプチドは、配列番号１６（ＣＦＧＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＤＸ_９ＧＣ）を含む。

別の好ましい一実施形態によれば、第１の態様による単離されたペプチドは、配列番号１７（ＣＦＤＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＧＸ_９ＧＣ）を含む。

別の好ましい一実施形態によれば、第１の態様による単離されたペプチドは、配列番号１８（ＣＦＧＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＧＸ_９ＧＣ）を含む。

別の好ましい一実施形態によれば、第１の態様による単離されたペプチドは、配列番号１９（ＣＦＸ_１ＲＸ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＤＸ_９ＧＣ）を含む。

別の好ましい一実施形態によれば、第１の態様による単離されたペプチドは、配列番号２０（ＣＦＸ_１ＲＸ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＧＸ_９ＧＣ）を含む。

別の好ましい一実施形態によれば、第１の態様による単離されたペプチドは、配列番号２１（ＣＦＸ_１ＧＸ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＤＸ_９ＧＣ）を含む。

別の好ましい一実施形態によれば、第１の態様による単離されたペプチドは、配列番号２２（ＣＦＸ_１ＧＸ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＧＸ_９ＧＣ）を含む。

別の好ましい一実施形態によれば、第１の態様による単離されたペプチドは配列番号１を含み、Ｘ_１はＧまたはＤであり、Ｘ_２はＧまたはＲであり、Ｘ_８はＧまたはＤである。

別の好ましい一実施形態によれば、第１の態様による単離されたペプチドは配列番号１を含み、Ｘ_１、Ｘ_２およびＸ_８は、それぞれ、Ｇ、ＲおよびＤ；Ｄ、ＲおよびＧ；Ｄ、ＧおよびＤ；ならびにＤ、ＲおよびＤから選択される。

別の好ましい一実施形態によれば、第１の態様による単離されたペプチドは、配列番号２３（ＣＦＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＸ_８Ｘ_９ＧＣＮＳＦＲＹ）を含む。ＮＳＦＲＹテイル内で、アミノ酸ＮがＱと同等（いずれも親水性中性残基）であり、ＳがＴと同等（いずれもヒドロキシル側鎖を有する親水性中性残基）であり、ＦがＷおよびＹと同等（いずれも疎水性芳香族残基）であることは理解されよう。これらの同類残基による置換は、Ｃ末端テイルの活性を著しく変化させるものではないはずである。

別の好ましい一実施形態によれば、第１の態様による単離されたペプチドは、
配列番号２４（ＣＦＤＲＲＩＤＲＩＳＨＴＳＤＩＧＣ）；
配列番号２５（ＣＦＧＲＲＩＤＲＩＳＨＴＳＤＩＧＣ）；
配列番号２６（ＣＦＤＧＲＩＤＲＩＳＨＴＳＤＩＧＣ）；
配列番号２７（ＣＦＤＲＲＩＤＲＩＳＨＴＳＧＩＧＣ）；
配列番号２８（ＣＦＧＧＲＩＤＲＩＳＨＴＳＤＩＧＣ）；
配列番号２９（ＣＦＧＲＲＩＤＲＩＳＨＴＳＧＩＧＣ）；
配列番号３０（ＣＦＤＧＲＩＤＲＩＳＨＴＳＧＩＧＣ）；および
配列番号３１（ＣＦＧＧＲＩＤＲＩＳＨＴＳＧＩＧＣ）
からなる群から選択される配列を含む。

別の好ましい一実施形態によれば、第１の態様による単離されたペプチドは、
配列番号３２（ＧＬＬＩＳＣＦＤＲＲＩＤＲＩＳＨＴＳＤＩＧＣＲＨ）；
配列番号３３（ＧＬＬＩＳＣＦＤＲＲＩＤＲＩＳＨＴＳＧＩＧＣＲＨ）；
配列番号３４（ＧＬＬＩＳＣＦＧＲＲＩＤＲＩＳＨＴＳＤＩＧＣＲＨ）；
配列番号３５（ＧＬＬＩＳＣＦＤＧＲＩＤＲＩＳＨＴＳＤＩＧＣＲＨ）；
配列番号３６（ＧＬＬＩＳＣＦＧＲＲＩＤＲＩＳＨＴＳＧＩＧＣＲＨ）；
配列番号３７（ＧＬＬＩＳＣＦＤＲＲＩＤＲＩＳＨＴＳＤＩＧＣＮＳＦＲＹ）；
配列番号３８（ＧＬＬＩＳＣＦＧＲＲＩＤＲＩＳＨＴＳＤＩＧＣＲＨＲＫＤＰＰＲＡＰＰＡＡＰＳＡＡＰＬＡＶＴＷＬＩＲＤＬＲＡＤＳＫＱＳＲＡＡ；
配列番号３９（ＧＬＬＩＳＣＦＤＧＲＩＤＲＩＳＨＴＳＤＩＧＣＲＨＲＫＤＰＰＲＡＰＰＡＡＰＳＡＡＰＬＡＶＴＷＬＩＲＤＬＲＡＤＳＫＱＳＲＡＡ）；
配列番号４０（ＧＬＬＩＳＣＦＤＲＲＩＤＲＩＳＨＴＳＧＩＧＣＲＨＲＫＤＰＰＲＡＰＰＡＡＰＳＡＡＰＬＡＶＴＷＬＩＲＤＬＲＡＤＳＫＱＳＲＡＡ）；
配列番号４１（ＧＬＬＩＳＣＦＧＧＲＩＤＲＩＳＨＴＳＤＩＧＣＲＨＲＫＤＰＰＲＡＰＰＡＡＰＳＡＡＰＬＡＶＴＷＬＩＲＤＬＲＡＤＳＫＱＳＲＡＡ）；
配列番号４２（ＧＬＬＩＳＣＦＧＲＲＩＤＲＩＳＨＴＳＧＩＧＣＲＨＲＫＤＰＰＲＡＰＰＡＡＰＳＡＡＰＬＡＶＴＷＬＩＲＤＬＲＡＤＳＫＱＳＲＡＡ；
配列番号４３（ＧＬＬＩＳＣＦＤＧＲＩＤＲＩＳＨＴＳＧＩＧＣＲＨＲＫＤＰＰＲＡＰＰＡＡＰＳＡＡＰＬＡＶＴＷＬＩＲＤＬＲＡＤＳＫＱＳＲＡＡ）；および
配列番号４４（ＧＬＬＩＳＣＦＧＧＲＩＤＲＩＳＨＴＳＧＩＧＣＲＨＲＫＤＰＰＲＡＰＰＡＡＰＳＡＡＰＬＡＶＴＷＬＩＲＤＬＲＡＤＳＫＱＳＲＡＡ）
からなる群から選択される。

別の好ましい一実施形態によれば、第１の態様による単離されたペプチドは、
配列番号４５（ＳＬＲＲＳＳＣＦＤＧＲＭＥＲＩＧＡＱＳＧＬＧＣＮＳＦＲＹ）；
配列番号４６（ＳＬＲＲＳＳＣＦＧＲＲＭＤＲＩＧＡＱＳＧＬＧＣＮＳＦＲＹ）；
配列番号４７（ＳＬＲＲＳＳＣＦＧＧＲＭＤＲＩＧＡＱＳＤＬＧＣＮＳＦＲＹ）；
配列番号４８（ＳＬＲＲＳＳＣＦＤＲＲＭＤＲＩＧＡＱＳＧＬＧＣＮＳＦＲＹ）；
配列番号４９（ＳＬＲＲＳＳＣＦＤＧＲＭＤＲＩＧＡＱＳＤＬＧＣＮＳＦＲＹ）；
配列番号５０（ＳＬＲＲＳＳＣＦＧＲＲＭＤＲＩＧＡＱＳＤＬＧＣＮＳＦＲＹ）；および
配列番号５１（ＳＬＲＲＳＳＣＦＤＲＲＭＤＲＩＧＡＱＳＤＬＧＣＮＳＦＲＹ）
からなる群から選択される。

別の好ましい一実施形態によれば、第１の態様による単離されたペプチドであって、Ｘ１がＧであり、かつＸ８がＧである場合、またはＮＳＦＲＹが前記ペプチドのＣ末端に存在する場合に、前記ペプチドの利尿作用が誘発される、単離されたペプチドが提供される。

別の好ましい一実施形態によれば、第１の態様による単離されたペプチドであって、
ａ）Ｘ１がＧである場合に、Ｘ１がＤである場合と比べて心拍数および脈圧を低下させ、
ｂ）Ｘ２がＧである場合に、低用量では利尿のみを誘発し、高用量では利尿とともに血圧低下を誘発し；
ｃ）Ｘ２がＲである場合に、低用量と高用量で誘発される薬理活性がｂ）の逆になり；
ｄ）Ｘ８がＧである場合に、Ｘ８がＤである場合と比べて持続的な血管拡張作用を誘発し；かつ
ｅ）Ｘ１がＤであり、かつＸ８がＤである場合に、有意な利尿を伴わずに血圧低下のみを誘発する、
単離されたペプチドが提供される。

本発明の好ましい一実施形態において、血管拡張作用および／または利尿作用を有する単離されたペプチドが提供される。好ましくは、該単離されたペプチドは、配列番号１〜配列番号５１のうちいずれか１つのアミノ酸配列を有する。

別の好ましい一実施形態によれば、第１の態様による単離されたペプチドが提供され、ここで配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号５１を含む群のペプチドは血管拡張作用を有し；配列番号２９、配列番号３６および配列番号３７を含む群のペプチドは血管拡張作用および利尿作用を有し；かつ配列番号４９を含む群のペプチドは腎作用を有する。

本発明は、医薬における使用、治療における使用および／または薬剤としての使用のための、本明細書で開示されている単離されたペプチドを包含する。例えば、本発明は、（例えば高血圧または低血圧における）血圧および血液量の調節ならびに／または利尿における使用のための、本明細書で開示されている単離されたペプチドを包含する。本発明はまた、心臓の病態（例えば心不全）の治療における使用のための、本明細書で開示されている単離されたペプチドを包含する。

第２の態様によれば、本発明は、医薬における使用、治療における使用および／または薬剤としての使用のための、本発明のいずれかの態様による単離されたペプチドを提供する。

本発明は、（例えば高血圧または低血圧において）血圧および血液量を調節するための、かつ／または利尿のための薬剤の調製における、本明細書で開示されている少なくとも１つの単離されたペプチドの使用を包含する。本発明はまた、心臓の病態（例えば心不全）を治療するための薬剤の調製における、本明細書で開示されている少なくとも１つの単離されたペプチドの使用を包含する。

第３の態様によれば、本発明は、血圧および血液量を調節するための、かつ／または心臓の病態を治療するための薬剤の調製における、本発明のいずれかの態様による少なくとも１つの単離されたペプチドの使用を提供する。

本発明は、対象において、（例えば高血圧または低血圧において）血圧および血液量を調節するための方法であって、本明細書で開示されている単離されたペプチドの有効量を対象に投与することを含む方法を包含する。本発明は、対象において心臓の病態（例えば心不全）を治療するための方法であって、本明細書で開示されている単離されたペプチドの有効量を対象に投与することを含む方法を包含する。

第４の態様によれば、本発明は、対象において血圧および血液量を調節するための、かつ／または心臓の病態を治療するための方法であって、本発明のいずれかの態様による単離されたペプチドの有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。

本発明の純粋な血管拡張剤（ＤＲＧ−Ｋ環、ＧＲＤ−Ｋ環、ＤＧＤ−Ｋ環など；配列番号３３〜配列番号３５）およびＤＲＤ−ＡＮＰ（配列番号５１）の使用は、血液量を心臓および胸郭から末梢系へ再配分しつつ液量の深刻な枯渇を回避する必要のある、「温かく」かつ「水分」が最小限である患者とって有用でありうる。このような患者のＢＰは良好に維持されており、極端な液量の増加は見られず、ＢＰの低下に耐えることができる。

利尿のみを目的とする本発明の薬剤（ＤＧＤ−ＡＮＰ；配列番号４９など）は、肺と末梢系のいずれにも過度の体液を有するが血圧の低い体積膨張（浮腫）患者に適用されうる。この「水分が多く、かつ冷えた」サブグループの治療は非常に困難であるが、これは、腎不全に併発するショックを悪化させかねないさらなるＢＰ低下を回避しながら、過剰量（ナトリウムおよび水分）を排出させる必要があることによる。

本発明の化合物は、通常、薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体と混合した医薬製剤として投与される。該アジュバント、希釈剤または担体は、意図する投与経路および標準的薬学実務を十分に考慮して選択することができる。薬学的に許容される担体は、活性化合物に対して化学的に不活性であってよく、使用条件下で有害な副作用や毒性を有さないものであってよい。好適な医薬製剤は、例えば、Remington The Science and Practice of Pharmacy, 19th ed., Mack Printing Company, Easton, Pennsylvania (1995) に見出されうる。非経口投与には、発熱物質不含であり、必要とされるｐＨ、等張性および安定性を有する、非経口的に許容される水溶液が使用されうる。好適な溶液は当業者によく知られており、多様な方法が文献に記載されている。また、薬剤送達方法の簡単な説明は、例えばLanger,Science (1990) 249,1527に見出されうる。

また、好適な製剤の調製は、当業者が、常用の技術を用いて、かつ／または標準的なかつ／もしくは一般に認められた慣例に従って、常用の手法により達成してもよい。

本発明に従って使用される任意の医薬製剤における化合物の量は、治療される病態の重症度、治療される個々の患者および使用する化合物などの様々な因子に依存するが、いずれにせよ、製剤中の化合物の量は、当業者が常用の手法により決定してもよい。

例えば、錠剤またはカプセル剤などの固体経口組成物は、１〜９９％（ｗ／ｗ）の有効成分、０〜９９％（ｗ／ｗ）の希釈剤または充填剤、０〜２０％（ｗ／ｗ）の崩壊剤、０〜５％（ｗ／ｗ）の滑沢剤、０〜５％（ｗ／ｗ）の流動助剤、０〜５０％（ｗ／ｗ）の造粒剤または結合剤、０〜５％（ｗ／ｗ）の酸化防止剤、および０〜５％（ｗ／ｗ）の着色剤を含有してもよい。徐放性錠剤は、さらに０〜９０％（ｗ／ｗ）の放出制御性ポリマーを含みうる。

非経口製剤（注射用の溶液もしくは懸濁液または注入用の溶液など）は、１〜５０％（ｗ／ｗ）の有効成分、および５０％（ｗ／ｗ）〜９９％（ｗ／ｗ）の液体もしくは半固体の担体または基剤（例えば、水などの溶媒）、ならびに０〜２０％（ｗ／ｗ）の１種以上のさらなる賦形剤、例えば緩衝剤、酸化防止剤、懸濁安定剤、等張化剤および保存剤などを含有してもよい。

治療される障害および患者ならびに投与経路に応じて、化合物は、様々な治療有効用量でそれを必要とする患者に投与されうる。

しかしながら、本発明において、哺乳動物、特にヒトに投与される用量は、妥当な時間枠にわたって該哺乳動物に治療効果をもたらすのに十分な量でなくてはならない。正確な用量および組成ならびに最適な送達方式の選択もまた、特に製剤の薬理特性、治療されている病態の性質および重症度、ならびに受容者の体調および精神的鋭敏さ、ならびに該特定の化合物の効力、治療される患者の年齢、状態、体重、性別および応答性、および疾患の段階／重症度による影響を受けることは、当業者であれば認識するであろう。

したがって、本発明の好ましい一実施形態おいて、本発明は、本発明の所定のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む任意の組成物をすべて包含する。

本発明はまた、本明細書に開示されている単離されたペプチドをコードする単離された核酸分子を包含する。

第５の態様によれば、本発明は、本発明のいずれかの態様による単離されたペプチドをコードする単離された核酸分子またはポリヌクレオチドを提供する。好ましくは、該核酸分子またはポリヌクレオチドは、本発明のペプチドを製造するための発現コンストラクト内に含まれる。

本発明を概説してきたが、本発明の限定を意図したものではなく例示のために提供される以下の実施例を参照することにより、同じ内容がさらに容易に理解されるであろう。

本明細書に特に記載のない、当技術分野において既知である標準的な分子生物学的手法は、全般的にGreen and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (2012)の記載に従った。

実施例１
材料および方法
ＡＮＰ、Ｋ環およびバリアントの合成および精製
ペプチドの合成はいずれも、Ｆｍｏｃ法に基づく手作業によるペプチド合成を用いて実施した。Ｔｙｒ前負荷Ｗａｎｇ樹脂を用いてＡＮＰおよびバリアントを合成する一方で、ＮｏｖａｓｙｎＴＧＲ樹脂を用いてＫ環およびバリアントを合成した。合成、精製および折り畳みに採用した方法は、Sridharan et al.,［Biochem J 469 (2): 255-66 (2015)］の記載のとおりである。

動物
雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（２２０〜２８０ｇ）を、シンガポールのＩｎｖｉｖｏｓから入手した。実験前の３日間、ＮＵＳ（シンガポール国立大学）の動物保持ユニット内で動物を馴化させた。実験は、ＮＵＳの動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の指導および承認（０４１／１２）のもとで実施した。

インビボ活性アッセイ
実験は、Sridharan et al.,［Biochem J 469 (2): 255-66 (2015)］の記載のとおりに実施した。簡単に述べると、動物にナトリウムペントバルビタール（６０〜７０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔をかけ、カテーテルを大腿動脈および大腿静脈ならびに膀胱に挿入した。３７℃のサーモスタット加熱パッドを用いて、動物の体温を維持した。０．２％ＢＳＡ生理食塩水（ペプチド含有または不含有）を大腿静脈から連続注入（２ｍｌ／時）し、その間大腿動脈に取り付けた圧力変換器により平均動脈圧（ＭＡＰ）、心拍数（ＨＲ）および脈圧（ＰＰ）の変化をオンラインで記録した。採尿し、１０分ごとに量を測定した。実験は、対照期間（２×１０分間）、実験期間（１×１０分間）および回復期間（４×１０分間）を含む。動物はいずれも、実験終了時に二酸化炭素チャンバ内で安楽死させた。

細胞培養およびトランスフェクション
実験は、Sridharan et al.,［Biochem J 469 (2): 255-66 (2015)］の記載のとおりに実施した。１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２ｍＭのグルタミンを補ったダルベッコ改変イーグル培地を使用して、５％ＣＯ_２を含む３７℃の加湿インキュベータ内でＣＨＯ−Ｋ１細胞を増殖させた。３日ごとに０．５％トリプシンを用いて継代培養することにより細胞を維持した。２４ウェルプレートの各ウェルに細胞（１×１０^５）を播種し、１６時間かけて増殖させた。各ウェルの細胞に対し、２μｌのリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、登録商標）２０００トランスフェクション試薬を用いて、ラットＮＰＲ−Ａをコードするプラスミド０．８μｇによるトランスフェクションを行った。トランスフェクションの２４時間後に、細胞をペプチドで処理した。

全細胞ｃＧＭＰアッセイ
ＮＰＲ−ＡトランスフェクションＣＨＯ−Ｋ１細胞を、様々な濃度のペプチド（１０ｎＭ〜１０μＭ、０．５ｍＭのＩＢＭＸを含有する基礎培地に溶解）を用いて３０分間処理した。２００μｌの０．１Ｎ ＨＣｌで細胞を溶解させた後、Ｅｎｚｏ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｃＧＭＰ ＥＬＩＳＡキット（製造業者のプロトコル）を用いてｃＧＭＰの終蓄積を測定した。

細胞をＥＣ_５０濃度の前記ペプチドで処理することにより、時間追跡調査を実施した。示された時点（０分、２分、５分、１０分、２０分および３０分）で、細胞を０．１ＮのＨＣｌで処理し、反応を終了させた。ｃＧＭＰ ＥＬＩＳＡキット（Ｅｎｚｏ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞溶解液中のｃＧＭＰ濃度を測定した。

統計解析
データは、平均値±ＳＥＭとして表している。両側ｔ検定を用いた一元配置分散分析を用いて、統計解析を実施した。ｐ値＜０．５を有意とみなした。

実施例２
血行動態作用に関与するＫ環における作用スイッチ
Ｋ環およびＣ末端テイル内における特異な置換の役割を理解するため、発明者らは、いくつかの変異体の薬理活性を評価した。第一世代の単一変異体は、Ｋ環内にＤ３、Ｒ４およびＤ１４のＧへの置換を含んでいた（図２Ａ）。これらの単一点変異体、すなわち ^ＧＲＤＫ環、^ＤＧＤＫ環および^ＤＲＧ Ｋ環（「変異」した残基に下線を引いている）を合成し（図５、表３）、麻酔したラットにおいてインビボ活性を評価した（図２Ｂ、図２Ｃ）。前記３つの単一変異体を２ｎｍｏｌ／ｋｇ／分で注入したところ、いずれも、Ｋ環と同様に、尿量の有意な変化を伴うことなく、類似したＭＡＰの低下（約１２ｍｍＨｇ）を誘発した（図２Ｂ、図２Ｃ、表１）。 ^ＧＲＤＫ環は、Ｋ環（−２２．２±１２．１ＢＰＭ）と比べて心拍数（ＨＲ）の低下（−４４．８±２０．２ＢＰＭ）が大きく、これは０．２ｎｍｏｌ／ｋｇ／分でＡＮＰを注入した場合の低下（−４７．０±１３．５ＢＰＭ）と類似していた（図６Ａ、図６Ｂ、表１）。このペプチドはまた、Ｋ環（−４．５±１．７ｍｍＨｇ）およびＡＮＰ（−７．７±３．９ｍｍＨｇ）のいずれと比べてもより大きな脈圧（ＰＰ）の低下（−１１．５±２．３ｍｍＨｇ）を誘発した（図５Ａ、図５Ｂ、図６Ａ、図６Ｂ、表１）。^ＤＧＤＫ環を注入すると、ＨＲおよびＰＰにＫ環の場合と同様の変化（−２１．８±９．５ＢＰＭ，−５．８±０．９７ｍｍＨｇ）が見られた（表１）。この変異体は、該ペプチドを注入した際の、ＢＰおよびＨＲの初期の減少は緩やかであった（図６Ａ、図６Ｂ）。^ＤＲＧ Ｋ環を注入すると、Ｋ環と同様の血管応答（ＨＲ：−１８．１±３．１ＢＰＭおよびＰＰ：−３．２±３．０ｍｍＨｇ）が見られたが（表１）、ＭＡＰおよびＨＲの変化は、実験期間内にベースラインまで回復することはなかった（図２Ｂ、図６Ａ、図６Ｂ）。続いて、発明者らは、二重変異体、すなわち ^ＧＲＧ Ｋ環（Ｄ残基がいずれもＧに置換されている）を合成した。このペプチドにより、ＭＡＰ、ＨＲおよび尿流速には類似した変化（ＭＡＰ：−１１．８±１．５ｍｍＨｇ，ＨＲ：−３９．１±１１．５ＢＰＭ，１１．４±３．８μｌ／分）が見られた。ＡＮＰと類似した応答ではあるものの、 ^ＧＲＧ Ｋ環は、 ^ＧＲＤＫ環と同様、ＰＰに対してより大きな影響（−１２．９±０．７ｍｍＨｇ）を示した（図２、図６Ａ、図６Ｂ）。この実験結果から、Ｄ３Ｇ置換は、ＭＡＰの変化が同様であっても、ＨＲおよびＰＰのより大幅な低下をもたらし、またＤ１４Ｇ置換は、ＭＡＰおよびＨＲの回復を遅らせることがわかった。興味深いことに、Ｄ３およびＤ１４をいずれもＧで置換することにより、Ｋ環ペプチドに腎作用が導入される。すなわち、Ｄ３およびＤ１４残基はいずれも、（腎活性および血管活性をいずれも有する）古典的ＮＰの機能を切り替えて血管拡張性のみを有するペプチドへと変換する制御スイッチとして作用する。

ＮＰのインビボ作用におけるＣ末端テイルの役割を理解するために、Ｋ環のＣ末端テイル（ＲＨ）をＡＮＰのＣ末端テイル（ＮＳＦＲＹ）と置き換えた。このバリアント、すなわちＫ環 ^{ＮＳＦＲＹ} は、２ｎｍｏｌ／ｋｇ／分の注入においてＭＡＰを約１５ｍｍＨｇ低下させた。このバリアントは、利尿作用（１２．３±３．８μｌ／分）とともに、ＨＲとＰＰにおいてＡＮＰと同様の変化（−３７．５±１５．１ＢＰＭおよび−７．３±０．７ｍｍＨｇ；図２、図６Ａ、図６Ｂ）をもたらした。利尿のピークには、１０分間の遅延が見られた（図２Ｃ）。すなわち、キメラＫ環 ^{ＮＳＦＲＹ} は、腎応答の遅延を伴うＡＮＰの主要な特徴を示した。このため、ＮＳＦＲＹテイルの存在は、環内のＤ３残基、Ｒ４残基およびＤ１４残基の存在に打ち勝つものと思われる。したがって、Ｃ末端テイルは、インビボ薬理作用を制御する、代替的ではあるが「強力」な分子スイッチとして機能すると考えられる。このように、発明者らは、系統的な変異調査を通じて、利尿に関する２種の作用スイッチ、すなわち環内の２つのＧｌｙ残基およびＮＳＦＲＹテイルを同定した。これらのスイッチを用いることで、Ｋ環の薬理作用を操作することができる。

実施例３
作用スイッチは移行可能である
前記スイッチの意義をさらに深く理解するため、ＡＮＰに対し、Ａｓｐ残基（Ｇ３およびＧ１４を置換）およびＡｒｇ残基（Ｇ４を置換）を系統的に導入した。 ^ＤＧＤ ＡＮＰを２ｎｍｏｌ／ｋｇ／分で注入すると、ＡＮＰの場合（８．８±１．３μｌ／分）と同様に、尿流速の顕著な増加（７．９±２．１μｌ／分）が見られたが、ＭＡＰ、ＨＲおよびＰＰにおける変化（それぞれ、−４．８±２．３ｍｍＨｇ，−７．８±９ＢＰＭおよび−４．３±１．４ｍｍＨｇ）は、０．２ｎｍｏｌ／ｋｇ／分のＡＮＰを与えた動物の場合（それぞれ、−１０．１±０．８ｍｍＨｇ，−４７．１±１３．５ＢＰＭおよび−７．７±１．８ｍｍＨｇ）と比べてかなり緩やかであった（図３Ｂ、図３Ｃ、図７Ａ、図７Ｂ、表１）。 ^ＤＧＤ ＡＮＰを与えたことで、利尿のピークには、Ｋ環 ^{ＮＳＦＲＹ} の場合と同様、１０分間の遅延が見られた。すなわち、このバリアントは、ＡＮＰと類似した活性プロファイルを有し、利尿作用が血圧降下作用に先行するが、Ｄ３およびＤ１４の導入により、利尿の誘導に必要な有効ペプチド濃度と血管拡張の誘導に必要な有効ペプチド濃度との差は大きくなった。対照的に、２ｎｍｏｌ／ｋｇ／分の ^ＤＲＤ ＡＮＰを注入すると、ＡＮＰよりも強い腎作用（尿流速１８．７±０．７μｌ／分）が見られるとともに、強力な血管作用（ＭＡＰにおいて−１８．３±２．３ｍｍＨｇ、ＨＲにおいて−６６．６±１４．６ＢＰＭ、ＰＰにおいて−７．９±１．８ｍｍＨｇ）が見られた（図３Ｂ、図３Ｃ、図８Ａ、図８Ｂ、表１）。低用量（０．２ｎｍｏｌ／ｋｇ／分）の場合、 ^ＤＲＤ ＡＮＰは、等モルのＡＮＰを注入した場合と同様のＢＰ、ＨＲおよびＰＰの低下（それぞれ−１２．９±１．５ｍｍＨｇ，−３７．５±９．５ＢＰＭ，−５．８±２．８ｍｍＨｇ）を示したが、利尿作用は誘発されなかった（表１）。すなわち、 ^ＤＲＤ ＡＮＰの注入は、腎作用よりも血管作用を優位に示した（図３Ｄ、図３Ｅ、図８Ａ、図８Ｂ）。これらの観察結果は、作用スイッチとしてのＤ３残基およびＤ１４残基の役割を裏付けるものである。Ｄ３およびＤ１４のみならず、残基Ｒ４もまた、用量依存的にインビボ活性を逆転させるものと思われる。すなわち低用量では血圧低下作用を示し、その後ペプチド濃度の増加に伴って、血管作用と腎作用をいずれも示すようになる（図３Ｂ、図３Ｃ）。これらの結果から、Ｋ環において同定された作用スイッチはＡＮＰにも移行可能であることがわかる。

実施例４
ＮＰＲ−Ａのグアニリルシクラーゼ活性の刺激
生理学的に、ＡＮＰは、ＮＰＲ−Ａと相互作用し、そのグアニリルシクラーゼ活性に刺激を与えて細胞内ｃＧＭＰレベルを上昇させる［Oliver, P. M.; et al., Proc Natl Acad Sci U S A 94 (26): 14730-5 (1997)］。以前、発明者らは、Ｋ環がＮＰＲ−Ａアゴニストであり、その効力はＡＮＰの１０分の１であることを示した［Sridharan, S.; Kini, R. M., Biochem J 469 (2): 255-66 (2015)］。Ｋ環およびＡＮＰ変異体における様々な残基の役割を理解するため、発明者らは、ラットＮＰＲ−Ａ受容体を一時的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞においてｃＧＭＰ応答を誘起する当該残基の能力を評価した（図４Ａ、図４Ｂ、表２）。Ｋ環の単一点変異体のうち、 ^ＧＲＤＫ環は、Ｋ環の５倍という高い効力を示し、^ＤＲＧ Ｋ環および^ＤＧＤＫ環は、３分の１〜４分の１という効力の低下を示した。二重変異体 ^ＧＲＧ Ｋ環もまた、Ｋ環の４倍という高い効力を示した（図４Ａ、表２）。これらの結果は、Ｄ３Ｇ置換が効力の増加を招き、他の位置での置換が効力の低下を招くことを示している。二重変異体では、Ｄ３の置換は効力を増加させるが、Ｄ１４における第２の置換により、効力の２０％が失われた。Ｋ環 ^{ＮＳＦＲＹ} にＡＮＰのＣ末端テイルを導入すると、活性が改善され５倍となった。したがって、３位に第１のＧｌｙ残基が存在することまたはＡＮＰのＣ末端テイルが存在することにより受容体活性化の効力が改善されることは明白である。

ＡＮＰの変異体である ^ＤＲＤ ＡＮＰおよび ^ＤＧＤ ＡＮＰの活性は、ＡＮＰと比べると３分の１および８分の１であった（図４Ｂ、表２）。Ｋ環 ^{ＮＳＦＲＹ} および ^ＤＲＤ ＡＮＰは、いずれも等効力の応答を示した。 ^ＤＧＤ ＡＮＰと ^ＤＲＤ ＡＮＰとの効力の差が、Ｋ環と^ＤＧＤＫ環との効力の差と類似していることから、ＲからＧへの変化およびＧからＲへの変化はいずれのＮＰにおいても等しく寄与していることが暗示される。

発明者らはまた、２次メッセンジャーの空間的時間的分布に影響を及ぼすことになるｃＧＭＰ生成の動態変化を理解するため、前記変異体ＡＮＰおよび変異体Ｋ環の存在下におけるＮＰＲ−Ａの活性化動態を評価した。ペプチドのＥＣ_５０濃度におけるｃＧＭＰ蓄積の時間追跡調査による評価を行った。ＡＮＰはｃＧＭＰレベルを即時に増加させたが、Ｋ環はより緩慢な活性化動態を呈した（同等レベルのｃＧＭＰの生成に要した時間は、２分間対３０分間であった）（図４Ｃ〜図４Ｆ）。単一点変異体である^ＤＲＧ Ｋ環および^ＤＧＤＫ環によるｃＧＭＰの生成速度は、Ｋ環よりも遅かったが、 ^ＧＲＤＫ環は、ｃＧＭＰ生成速度をわずかに増加させた。この二重変異体 ^ＧＲＧ Ｋ環において、活性化動態はＫ環と比べて（３倍に）改善されており、１０分以内でｃＧＭＰの最大蓄積に達した。 ^ＧＲＤＫ環および ^ＧＲＧ Ｋ環も、ＥＣ_５０濃度は同等であったが、活性化動態は明らかに異なっていた（ｃＧＭＰ生成のピークは、それぞれ１０分および２０分であった）。Ｋ環 ^{ＮＳＦＲＹ} では、 ^ＧＲＧ Ｋ環と類似した活性化動態の改善が見られ、ｃＧＭＰの生成は１０分でピーク応答を示した後、ゆっくりと減衰して飽和値に達した。ＡＮＰのバリアントは、野生型と比べて緩慢な活性化動態を示し、 ^ＤＲＤ ＡＮＰおよび ^ＤＧＤ ＡＮＰはいずれも速度論的に緩慢（２．６倍および７．８倍遅く、最大ｃＧＭＰは１０分）であった。 ^ＤＧＤ ＡＮＰは、 ^ＤＲＤ ＡＮＰと比べて細胞内ｃＧＭＰの減衰が速い。これらの観察結果から、Ｄ残基が事実上、受容体結合および２次メッセンジャー生成に影響を及ぼすことが示唆される。活性化動態の速いバリアントは、ピーク応答後にｃＧＭＰの減衰を示すと考えられた。細胞をホスホジエステラーゼ阻害剤（０．５ｍＭ）で処理したため、ｃＧＭＰの分解速度はほぼ無視できる。細胞をＥＣ_５０濃度のペプチドで処理したため、細胞性ＧＴＰが限定的ではないことは確かである。このため、特定のバリアントでｃＧＭＰ生成の減衰が観察されたことは、これらのペプチドがほぼ確実に受容体の脱感作を誘発したことを示唆している。

概して、ＮＰＲ−Ａの活性化動態は、様々なＮＰ変異体を明確に区別するものである。血管活性および腎活性を有するＮＰが比較的速い動態を示すのに対し、血管活性ＮＰは緩やかな動態を示す。

検討
ＡＮＰの抗高血圧特性および抗血液量過多特性は濃度依存的であり、低用量（０．０２〜０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ／分）では腎作用のみが現れ、やや高い用量（＞０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ／分）では両活性が示される［Morice, A.; et al., Clin Sci (Lond) 74 (4): 359-63 (1988)］。したがって、腎臓に対する活性と循環系に対する活性とを分ける閾値濃度の差は、５倍と開いておらず、調査が異なれば変動しうる［Soejima, H.; et al., Am J Physiol 255 (3 Pt 2): R449-55 (1988); Morice, A.; et al., Clin Sci (Lond) 74 (4): 359-63 (1988)］。この用量依存性は標的組織におけるＮＰＲ−Ａ発現レベル（腎臓＞血管系）に起因しうるが［Uhlen, M.; et al., Science 347 (6220): 1260419 (2015)］、正確な分子機構ははっきりしていない。ＡＮＰの構造と活性についての調査により、ＮＰＲ−Ａ結合［Olins, G. M.; et al., J Biol Chem 263 (22): 10989-93 (1988)］および生理学的活性の付与に必要不可欠な残基（環内のＦ８、Ｍ１３、Ｄ１４およびＲ１５ならびにＣ末端ＮＳＦＲＹ）が同定された。いくつかの調査では、ＮＰＲ−Ａに対するＡＮＰバリアントの特異性を高め、ナトリウム利尿／利尿応答を改善するためにファージディスプレイを使用した［Jin, H.; Li, B.; et al., J Clin Invest 98 (4): 969-76 (1996)］。しかしながら、ＮＰにおける血管作用および腎作用の分子決定因子は依然として同定されていない。

最近、発明者らは、アマガサヘビ毒液由来の外因性ＮＰ（ＫＮＰ）を同定し、特性を確認した［Sridharan, S.; Kini, R. M., Biochem J 469 (2): 255-66 (2015)］。このペプチドは、αヘリックス形成傾向を有する３８残基長のＣ末端テイル（図１Ａ）を伴う保存されたＮＰ環を有する。発明者らによる構造と機能についての調査から、ＫＮＰが２つの薬理作用団、すなわちＫ環およびヘリックスを有することが明らとなった。これらの機能的セグメントは、直交経路による血管拡張作用を誘導した。Ｋ環は、古典的ＮＰと同様に、効力がＡＮＰの１０分の１であるＮＰＲ−Ａの活性化を通じて細胞内ｃＧＭＰレベルを上昇させ、一方でヘリックスは、ＮＯ依存的機構を使用する［Sridharan, S.; Kini, R. M., Biochem J 469 (2): 255-66 (2015)］。

さらに、発明者らの観察によれば、麻酔したラットに２ｎｍｏｌ／ｋｇ／分のＫ環を注入すると、尿量の有意な変化を伴わずに平均動脈圧（ＭＡＰ）が１２ｍｍＨｇ低下した（これは、実験期間中にベースラインまで回復した）［Sridharan, S.; Kini, R. M., Biochem J 469 (2): 255-66 (2015)］。Ｋ環の用量を５倍にすると、ＭＡＰはさらに低下したが（−１９．１±２．５ｍｍＨｇ、回復せず）、尿量への影響は見られなかった（図１Ｂ、図１Ｃ）。このように、Ｋ環は、利尿作用をほとんどまたは全く伴わずに血管拡張作用を誘導した。これは、利尿作用と血管拡張作用とを誘導するＡＮＰの能力とは対照的である。ＡＮＰは、低用量（０．０８ｎｍｏｌ／ｋｇ／分）ではＭＡＰを変化させることなく尿量を増加させ、やや高用量（０．２ｎｍｏｌ／ｋｇ／分）では、ＭＡＰの低下と利尿のいずれもが見られた（図１Ｂ、図１Ｃ）。これは、以前の観察結果［Soejima, H.; et al., Am J Physiol 255 (3 Pt 2): R449-55 (1988)］と同様である。これらのペプチドのインビボ活性にこのような差異が認められたことから、Ｋ環が、ＡＮＰとは異なる血行動態作用および利尿作用を有すること、ならびにＮＰにおける血圧低下作用および利尿作用の決定因子を説明する分子ロードマップとしての役割を果たしうることが示唆される。

ＡＮＰの構造と活性についての調査から、１７員環内に保存されている特定の残基（Ｆ２、Ｍ６、Ｄ７、Ｒ８、Ｉ９およびＬ１５）およびそのＣ末端テイル（ＮＳＦＲＹ）が、ＮＰＲ−Ａの結合およびインビボ活性に非常に重要であることがわかる［Li, B.; et al., Science 270 (5242): 1657-60 (1995); Olins, G. M.; et al., J Biol Chem 263 (22): 10989-93 (1988); Ogawa, H.; et al., J Biol Chem 279 (27): 28625-31 (2004)］。前記１７員環内の、受容体結合に必須の重要な残基はすべてＫ環に保存されているが、そのＣ末端テイルが有する残基は２つ（ＲＨ）のみである。ＡＮＰと比較すると、Ｋ環は、環内にいくつかの置換（Ｇ３Ｄ、Ｇ４Ｒ、Ｇ９Ｓ、Ａ１０Ｔ、Ｑ１１ＨおよびＧ１４Ｄ）を有している。これらのうち、９位、１０位および１１位の残基は、いくつかのＮＰにおいて異なっている（図１Ａ）。したがって、発明者らは、このような構造上の差異、すなわちＧ３Ｄ、Ｇ４ＲおよびＧ１４Ｄ置換ならびに短縮されているＣ末端テイルは、ＡＮＰとＫ環との間で観察された血行動態作用および利尿作用の差異に関与するのではないかと仮定した。この調査において、発明者らは、ＮＰへのインビボ作用の付与におけるＡＮＰおよびＫ環の役割を、系統的な置換を用いて解明することに取り組んだ。さらに、解明された詳細な構造を用いて、血管作用または腎作用のいずれかを有するＡＮＰ類似体を設計した。このような、いずれかの作用のみを有するバリアントは、心不全患者の治療に用いる治療剤として大きな価値を有する。また、構造と機能との関連を調べるこの調査では、ＮＰが誘導する血管拡張、心拍数および利尿作用に影響を及ぼす極めて重要な残基が同定される。

Ｋ環は、血管拡張作用および利尿作用の概要説明に役立つ
発明者らの以前の調査では、Ｋ環（ＡＮＰと７０％同一である）が、ＮＰＲ−Ａアゴニストであるにもかかわらず、尿量を変化させず、血圧低下のみを誘導することが示された［Sridharan, S.; Kini, R. M., Biochem J 469 (2): 255-66 (2015)］。このペプチドは、利尿のみを誘導するＡＮＰの１００倍の濃度であっても、腎応答を誘発することはなかった（図１Ｂ、図１Ｃ）。したがって、Ｋ環構造は、ＮＰの組織特異的応答に影響を与える分子情報をコードするものと考えられ、したがって、血管作用および／または腎作用に対する選択性の決定において重大な役割を演じ、作用スイッチとして働く残基を同定するきっかけとなるものである。

Ｇ３の役割：Ｇ３はほとんどすべてのＮＰにおいて保存されている。しかしながら、この残基は、Ｋ環においてはＡｓｐに置換されている（図１Ａ）。発明者らの得た結果は、Ｇ３が、強力な血管作用を与えるＮＰの環内における非常に重要な残基であることを示唆している。この残基が、負に荷電したＡｓｐに置換されると、ＮＰＲ−Ａを活性化する効力が約３分の１〜１０分の１に減少し（図４Ａ、図４Ｂ、表２）、活性化動態が（５分の１に）低下した（図４Ｃ、図４Ｄ、表２）。Ｇ３Ｄ置換はまた、類似したＢＰ変化におけるＨＲおよびＰＰへの影響を低減させるように思われる（図２Ａ、図６Ａ、図６Ｂ）。ＢＰの低下１ｍｍＨｇ当たりのＨＲおよびＰＰの変化を比較すると、Ｄ３バリアントによる変化（それぞれ、１．５倍および０．３倍）は、Ｇ３バリアントによる変化（それぞれ、３．０倍および０．８倍）よりも小さかった（表４）。このように、Ｇ３からＤ３への変化およびＤ３からＧ３の変化は、ＮＰによるＨＲおよびＰＰの変化を制御する分子スイッチとして作用している。

Ｇ１４の役割：Ｋ環スカホールド内におけるＤ１４のＧへの置換は、ＮＰＲ−Ａの効力を１０分の１に低下させ（表２）、活性化動態を３分の１に低下させた（図４Ｃ）ように思われる。１４位におけるこの変異によるＢＰおよびＨＲの変化は、実験期間を通じて持続し、回復はほとんど見られなかった。したがって、Ｇ１４は、持続的な血管作用を誘発するために必要な、極めて重要な残基であることが示唆されうる。 ^ＧＲＧ Ｋ環、^ＤＲＧ Ｋ環および ^ＧＲＤＫ環の間で比較を行うと、Ｇ１４がＮＰの腎作用を制御することは明白である。ＮＰの腎作用を保証するには、Ｇ３およびＧ１４のいずれもが存在しなくてはならない。

残基Ｄ３およびＤ１４は、ｃＧＭＰ応答を誘発するＮＰの能力を低下させるものと思われる。ＡＮＰ−ＮＰＲ−Ａ複合体の結晶構造から、Ｇ３およびＧ１４は、負に荷電したポケット（受容体サブユニットのＥ１６９^ＡおよびＥ１６９^Ｂ）の近傍に存在するように思われる［Ogawa, H.; et al., J Biol Chem 279 (27): 28625-31 (2004)］。Ｇの位置にＤが存在していると、立体構造状の制約およびＮＰＲ−Ａの負に荷電したポケットとの静電反発力が誘導される可能性があり、その結果、極めて重要な分子間相互作用が解消され、高親和性の天然リガンドとは異なる構造枠組みを通じて活性化が伝達されることになりうる。異なるリガンドにより細胞外ドメインに与えられた立体構造的な選択性の差異によって、細胞内グアニルシクラーゼドメインのアロステリック活性化リレーが改変されることもあり、それにより特有の活性化動態が誘導されうる。以前の研究によれば、Ｇ３ＡおよびＧ１４Ａの変異が結合有効性を大きく変えることはなく、Ｇｌｙ残基が存在せず立体配座の柔軟性が失われていても影響はないことが示唆されている［Li, B.; et al., Science 270 (5242): 1657-60 (1995); Watanabe, T. X.; et al., Eur J Pharmacol 147 (1): 49-57 (1988)］。発明者らの得た結果は、３位および１４位にＡｓｐ残基を組み込み、かつ荷電したかさ高い側鎖を導入すると、ＮＰＲ−Ａを活性化してそのインビボ活性に影響を及ぼす該リガンドの能力は低下しうることを示している。

Ｇ４の役割：Ｇ４をＡｒｇへと置換することにより、ＮＰＲ−Ａ活性化効力は３倍に改善されるように思われた。^ＤＧＤＫ環とＫ環との間および ^ＤＧＤ ＡＮＰと ^ＤＲＤ ＡＮＰとの間で活性の差異が観察されたことから、Ｒ４は、負に荷電した残基が両スカホールドに導入されたことに起因するＮＰＲ−Ａとの相互作用の解消を埋め合わせるのに重要でありうることが示唆される。この残基は、ＡＮＰ枠組みにおける作用選択性（血管作用の後に腎作用）の逆転に重要であると考えられる。^ＤＧＤＫ環は、^ＤＲＤＫ環と比べて誘導するＢＰ低下が緩慢であることから、この系に対する影響も低いことが示唆される（図２Ｂ、図２Ｃ）。Ｇ３およびＧ１４を有するＮＰバリアントは、これらの位置にＡｓｐを有するバリアントと比べて、ＮＰＲ−Ａ活性化効力は１０倍に、また活性化動態は３倍に改善されていた。Ｇ３およびＧ１４はいずれも、Ｋ環スカホールドにおいて腎作用を示すために必要であると考えられることから、「利尿スイッチ残基」として同定された。

Ｃ末端ＮＳＦＲＹの役割：Ｃ末端ＮＳＦＲＹは、血圧低下作用のみを示すペプチドに腎作用を導入する、代替的ではあるが「強力」な利尿作用スイッチとして作用する。Ｋ環にＣ末端テイルを付加すると、ＮＰＲ−Ａ活性化効力および動態が（それぞれ５倍および１０倍に）改善される。ＡＮＰ−ＮＰＲ−Ａの結晶構造から、Ｃ末端テイルの残基Ｎ、Ｓ、Ｆ、Ｒが水素結合を形成していること、および受容体のＱ１８６^Ｂ、Ｅ１８７^ＢおよびＦ１８８^Ｂとのπ−π相互作用を示していることがわかる。以前の突然変異誘発調査によれば、Ｃ末端テイルが存在しない場合、血管弛緩作用およびナトリウム利尿作用を誘発するＡＮＰの能力が（それぞれ３０分の１および３分の１に）低減することもまた明らかになった［Watanabe, T. X.; et al., Eur J Pharmacol 147 (1): 49-57 (1988)］。したがって、Ｃ末端テイルは、重要な分子スイッチであると考えられる。Ｃ末端テイルの存在は、ＨＲおよびＰＰに対する影響を増大させる（図３Ａ〜図３Ｃ、図７Ａ〜図７Ｄ）。このように、Ｃ末端テイルを付加することで、血管活性が改善され、腎作用が付与された。 ^ＤＲＤ ＡＮＰおよびＫ環 ^{ＮＳＦＲＹ} はいずれも、ＮＰＲ−Ａの活性化効力および活性化動態を等効力で誘発したが、これらのペプチドを当モルで注入すると、 ^ＤＲＤ ＡＮＰはＫ環 ^{ＮＳＦＲＹ} と比べて、ＨＲに対しても利尿に対しても（それぞれ２倍の）大きな影響を及ぼした（表１）。

Ｋ環スカホールドにＣ末端テイルとしてＮＳＦＲＹを組み込むと、 ^DRD ANPと比べて利尿ピークの遅延が見られた（図３Ｃ）。このようなインビボ作用の差異は、２つのＮＰの９位、１０位および１１位における構造上の差異（ＡＮＰではＧ、Ａ、Ｑであり、Ｋ環ではＳ、Ｈ、Ｔである）に起因している可能性がある。ファージディスプレイライブラリを用いた以前の調査によれば、Ｇ９Ｒ、Ａ１０ＥおよびＱ１１Ａの変異により、ナトリウム利尿作用および利尿作用が改善されると考えられる［Cunningham, B. C.; et al., EMBO J 13 (11): 2508-15 (1994)］。したがって、ＮＰの腎作用におけるこれらの残基の役割を評価するためには、さらなる調査が必要とされる。

ＮＰＲ−Ａ受容体活性化動態および活性化作用
ＮＰバリアントの薬理作用の差異については、（ａ）異なる標的組織におけるＮＰＲ−Ａの発現レベル、（ｂ）クリアランス受容体（ＮＰＲ−Ｃ）の発現パターン、（ｃ）リガンドの結合および活性化動態、ならびに（ｄ）シグナルの区画化を通じて説明されうる。遺伝子発現レベルおよび組織化学的染色実験から、腎臓におけるＮＰＲ−Ａ発現レベルが、血管平滑筋におけるそれよりも高いことがわかる［Uhlen, M.; et al., Science 347 (6220): 1260419 (2015)］。ＮＰＲ−Ｃの発現も同様の傾向（血管平滑筋と比べて腎臓での発現レベルが高い）を示すが、これらの組織におけるＮＰＲ−ＡとＮＰＲ−Ｃの比率（それによって活性化プロファイルが決まる）は異なっている［Uhlen, M.; et al., Science 347 (6220): 1260419 (2015)］。低用量のＡＮＰで腎作用が開始されることは、標的組織において受容体の発現パターンが異なることに起因する可能性がある。ＮＰの類似体はいずれもＮＰＲ−Ａを活性化したが、それらの活性化動態は顕著に異なっていた（表２）。データから、（ｉ）血圧降下性のみを有するペプチドが、利尿性および血管拡張性をいずれも有するペプチドと比べて緩慢な活性化動態を示したこと、ならびに（ｉｉ）活性化の速いペプチドが、ピーク応答後にｃＧＭＰシグナルの減衰を示したことがわかる。このようにｃＧＭＰの合成速度が異なることによって拡散速度が変わる可能性があり、それによってシグナルの空間的時間的分布および区画化に特異性が導入され、特定の下流エフェクターのみを活性化して、選択的下流作用を誘導しうる［Piggott, L. A.; et al., J Gen Physiol 128 (1): 3-14 (2006)］。両細胞型における重要な下流エフェクターは、プロテインキナーゼＧ（細胞質性）、ホスホジエステラーゼ（細胞質性および膜関連性いずれも）および環状ヌクレオチドゲートイオンチャンネル（膜結合性）である［Potter, L. R.; et al., Handb Exp Pharmacol (191): 341-66 (2009）］。これらのタンパク質が特異的に局在していることから、シグナル伝達カスケードを開始させるためには２次メッセンジャーの拡散が必要となる。環状ヌクレオチドシグナルの区画化におけるホスホジエステラーゼの役割を明確に説明する実質的な証拠があり［Fischmeister, R.; et al., Circ Res 99 (8): 816-28 (2006)］、この２００６年の調査からは、シグナルの輪郭の拡散によって空間的隔絶が促進され、寄与する特異的下流作用を特定する上で助けとなりうることが示唆される。したがって、天然リガンド（ＡＮＰおよびＢＮＰ）または本明細書記載のＮＰ類似体により与えられた細胞内シグナルにおける差異をさらに特徴付けることは、これらのペプチドがどのようにして独特の生理学的プロファイルまたは薬理学的プロファイルを示すのかを理解する上で役立ちうる。

ＮＰの血管拡張作用と利尿作用との切り離し
発明者らの調査は、ＮＰの顕著な特徴について概説し、ＮＰの血管拡張作用および／または利尿作用を決定する分子作用スイッチを同定するものであった。Ｃ末端テイルが存在しない場合の３位および１４位のＡｓｐ残基は、血管活性のみを有するＮＰを開発するための、重要かつ顕著な特徴である。残基Ｇ３はＨＲおよびＰＰの大幅な低下を誘発すると考えられ、これをＡｓｐで置換すると、ＭＡＰの同様の変化に対するこれらのパラメータの低下は弱まる。Ｇ３およびＧ１４の存在またはＣ末端テイルの存在は、利尿作用を誘導する。上述のように、ＨＦシナリオは、血圧および血液量の過負荷の程度により異なる個別の医療を必要とする。上記の作用スイッチは、ＨＦ患者に対する個別の処置に合わせて調整することのできるＮＰの創薬において助けとなる。したがって、この調査は、極めて重要な治療用分子の開発において役立つ可能性のあるＮＰ類似体の設計を提供するものである。本調査は、麻酔したラットにおけるこれらのペプチドの薬理学的役割を調べるものである。

結論を言えば、この調査により、平滑筋および腎臓に対するＮＰの活性を制御する分子スイッチを突き止めることができた。この調査は、特定の要望に応じたリガンドの設計の幅を広げ、ＮＰＲ−Ａの受容体−エフェクター系を探究するための基盤を提供する。設計されたＮＰ類似体は、異なるコホートのＨＦ患者において血圧または血液量のいずれかを調整するのに役立ちうる極めて重要な治療用リード化合物としての役割を果たしうる。

要旨
ナトリウム利尿ペプチドは、心不全において平衡を取り戻すための極めて重要な作用を有する。ＡＮＰは、濃度依存的な利尿作用および／または血圧低下作用を誘発する。低用量では腎作用のみを、やや高用量では血管作用および腎作用をいずれも誘発する。Ｋ環は、アマガサヘビ毒液ＮＰにおける保存された環であり、ＡＮＰの１００倍濃度で、尿量を変化させることなく血管拡張作用のみを示した。本明細書において、発明者らは、環内の３位、４位および１４位ならびにＣ末端テイルに存在する残基の系統的置換を通じて、その血管拡張作用および利尿作用を制御する分子スイッチについて説明した。麻酔したラットに対する様々なＮＰ類似体の注入により、
（ａ）Ｇ３類似体は、Ｄ３類似体と比べて、心拍数および脈圧を顕著に低下させること；
（ｂ）Ｇ４類似体は、低用量では利尿作用のみを呈し、高用量では利尿作用とともに血圧低下作用を呈するが、Ｒ４類似体は、逆の薬理活性を誘発すること；
（ｃ）Ｇ１４類似体は、Ｄ１４類似体と比べて持続的な血管拡張作用を示すこと；
（ｄ）Ｇ３およびＧ１４のいずれもの置換を伴う類似体は利尿作用を誘発するが、Ｄ３類似体およびＤ１４類似体は有意な利尿を伴わずに血圧低下作用のみを呈するため、「血管拡張−利尿トグル」スイッチとして作用すること；ならびに
（ｅ）Ｃ末端テイル（ＮＳＦＲＹ）を有する類似体は、Ｄ３およびＤ１４残基の影響を覆し、Ｃ末端テイルがなければ血管拡張のみを示すペプチドにおいて利尿を誘導することにより、「強力な利尿」スイッチとして作用すること
を示した。これらのペプチドのＮＰＲ−Ａ活性化効力および活性化動態は、観察された薬理学的プロファイルを区別するものであった。活性化動態が緩慢である部分的アゴニストは血管拡張特性のみを呈し、活性化動態が迅速なものは血管拡張作用と利尿作用をいずれも誘発した。

参考文献
本明細書において、既公開とみなされる文書について列挙または検討したが、それらは必ずしも従来技術の一部であることや共通の一般常識であることを承認するものと捉えるべきではない。
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Claims (35)

1. 哺乳動物において血管拡張作用および／または利尿作用を有する単離されたペプチドであって、アミノ酸配列ＣＦＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＸ_８Ｘ_９ＧＣ（配列番号１）（式中、Ｘ_１、Ｘ_２およびＸ_８は各々独立して任意のアミノ酸を含み；Ｘ_３はＲまたはＫを含み；Ｘ_４はＭ、ＩまたはＬを含み；Ｘ_５はＧ、ＳまたはＮを含み；Ｘ_６はＡ、ＨまたはＳを含み；Ｘ_７はＱ、Ｔ、Ｓ、ＭまたはＶを含み；Ｘ_９はＩまたはＬを含む）を含み、かつ配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５または配列番号５６で示されるアミノ酸配列から構成されるものではない、ペプチド。
2. ＣＦＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＸ_８Ｘ_９ＧＣ（配列番号２）を含み、Ｘ_１がＤまたはＧを含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
3. ＣＦＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＸ_８Ｘ_９ＧＣ（配列番号３）を含み、Ｘ_２がＲまたはＧを含む、請求項１または２に記載の単離されたペプチド。
4. ＣＦＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＸ_８Ｘ_９ＧＣ（配列番号４）を含み、Ｘ_８がＤまたはＧを含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
5. ＣＦＤＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＸ_８Ｘ_９ＧＣ（配列番号５）を含む、請求項１または２に記載の単離されたペプチド。
6. ＣＦＧＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＸ_８Ｘ_９ＧＣ（配列番号６）を含む、請求項１または２に記載の単離されたペプチド。
7. ＣＦＸ_１ＲＸ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＸ_８Ｘ_９ＧＣ（配列番号７）を含む、請求項１または３に記載の単離されたペプチド。
8. ＣＦＸ_１ＧＸ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＸ_８Ｘ_９ＧＣ（配列番号８）を含む、請求項１または３に記載の単離されたペプチド。
9. ＣＦＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＤＸ_９ＧＣ（配列番号９）を含む、請求項１または４に記載の単離されたペプチド。
10. ＣＦＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＧＸ_９ＧＣ（配列番号１０）を含む、請求項１または４に記載の単離されたペプチド。
11. ＣＦＤＲＸ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＸ_８Ｘ_９ＧＣ（配列番号１１）を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
12. ＣＦＧＲＸ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＸ_８Ｘ_９ＧＣ（配列番号１２）を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
13. ＣＦＤＧＸ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＸ_８Ｘ_９ＧＣ（配列番号１３）を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
14. ＣＦＧＧＸ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＸ_８Ｘ_９ＧＣ（配列番号１４）を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
15. ＣＦＤＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＤＸ_９ＧＣ（配列番号１５）を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
16. ＣＦＧＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＤＸ_９ＧＣ（配列番号１６）を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
17. ＣＦＤＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＧＸ_９ＧＣ（配列番号１７）を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
18. ＣＦＧＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＧＸ_９ＧＣ（配列番号１８）を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
19. ＣＦＸ_１ＲＸ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＤＸ_９ＧＣ（配列番号１９）を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
20. ＣＦＸ_１ＲＸ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＧＸ_９ＧＣ（配列番号２０）を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
21. ＣＦＸ_１ＧＸ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＤＸ_９ＧＣ（配列番号２１）を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
22. ＣＦＸ_１ＧＸ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＧＸ_９ＧＣ（配列番号２２）を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
23. ＣＦＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＸ_８Ｘ_９ＧＣ（配列番号１）のアミノ酸配列を含み、Ｘ_１がＧまたはＤであり、Ｘ_２がＧまたはＲであり、かつＸ_８がＧまたはＤである、請求項１に記載の単離されたペプチド。
24. ＣＦＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＤＲＩＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＳＸ_８Ｘ_９ＧＣＮＳＦＲＹ（配列番号２３）を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
25. （配列番号２４）ＣＦＤＲＲＩＤＲＩＳＨＴＳＤＩＧＣ；
    （配列番号２５）ＣＦＧＲＲＩＤＲＩＳＨＴＳＤＩＧＣ；
    （配列番号２６）ＣＦＤＧＲＩＤＲＩＳＨＴＳＤＩＧＣ；
    （配列番号２７）ＣＦＤＲＲＩＤＲＩＳＨＴＳＧＩＧＣ；
    （配列番号２８）ＣＦＧＧＲＩＤＲＩＳＨＴＳＤＩＧＣ；
    （配列番号２９）ＣＦＧＲＲＩＤＲＩＳＨＴＳＧＩＧＣ；
    （配列番号３０）ＣＦＤＧＲＩＤＲＩＳＨＴＳＧＩＧＣ；および
    （配列番号３１）ＣＦＧＧＲＩＤＲＩＳＨＴＳＧＩＧＣ
    からなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
26. （配列番号３２）ＧＬＬＩＳＣＦＤＲＲＩＤＲＩＳＨＴＳＤＩＧＣＲＨ；
    （配列番号３３）ＧＬＬＩＳＣＦＤＲＲＩＤＲＩＳＨＴＳＧＩＧＣＲＨ；
    （配列番号３４）ＧＬＬＩＳＣＦＧＲＲＩＤＲＩＳＨＴＳＤＩＧＣＲＨ；
    （配列番号３５）ＧＬＬＩＳＣＦＤＧＲＩＤＲＩＳＨＴＳＤＩＧＣＲＨ；
    （配列番号３６）ＧＬＬＩＳＣＦＧＲＲＩＤＲＩＳＨＴＳＧＩＧＣＲＨ；
    （配列番号３７）ＧＬＬＩＳＣＦＤＲＲＩＤＲＩＳＨＴＳＤＩＧＣＮＳＦＲＹ；
    （配列番号３８）ＧＬＬＩＳＣＦＧＲＲＩＤＲＩＳＨＴＳＤＩＧＣＲＨＲＫＤＰＰＲＡＰＰＡＡＰＳＡＡＰＬＡＶＴＷＬＩＲＤＬＲＡＤＳＫＱＳＲＡＡ；
    （配列番号３９）ＧＬＬＩＳＣＦＤＧＲＩＤＲＩＳＨＴＳＤＩＧＣＲＨＲＫＤＰＰＲＡＰＰＡＡＰＳＡＡＰＬＡＶＴＷＬＩＲＤＬＲＡＤＳＫＱＳＲＡＡ；
    （配列番号４０）ＧＬＬＩＳＣＦＤＲＲＩＤＲＩＳＨＴＳＧＩＧＣＲＨＲＫＤＰＰＲＡＰＰＡＡＰＳＡＡＰＬＡＶＴＷＬＩＲＤＬＲＡＤＳＫＱＳＲＡＡ；
    （配列番号４１）ＧＬＬＩＳＣＦＧＧＲＩＤＲＩＳＨＴＳＤＩＧＣＲＨＲＫＤＰＰＲＡＰＰＡＡＰＳＡＡＰＬＡＶＴＷＬＩＲＤＬＲＡＤＳＫＱＳＲＡＡ；
    （配列番号４２）ＧＬＬＩＳＣＦＧＲＲＩＤＲＩＳＨＴＳＧＩＧＣＲＨＲＫＤＰＰＲＡＰＰＡＡＰＳＡＡＰＬＡＶＴＷＬＩＲＤＬＲＡＤＳＫＱＳＲＡＡ；
    （配列番号４３）ＧＬＬＩＳＣＦＤＧＲＩＤＲＩＳＨＴＳＧＩＧＣＲＨＲＫＤＰＰＲＡＰＰＡＡＰＳＡＡＰＬＡＶＴＷＬＩＲＤＬＲＡＤＳＫＱＳＲＡＡ；および
    （配列番号４４）ＧＬＬＩＳＣＦＧＧＲＩＤＲＩＳＨＴＳＧＩＧＣＲＨＲＫＤＰＰＲＡＰＰＡＡＰＳＡＡＰＬＡＶＴＷＬＩＲＤＬＲＡＤＳＫＱＳＲＡＡ
    からなる群から選択される、請求項１に記載の単離されたペプチド。
27. （配列番号４５）ＳＬＲＲＳＳＣＦＤＧＲＭＥＲＩＧＡＱＳＧＬＧＣＮＳＦＲＹ；
    （配列番号４６）ＳＬＲＲＳＳＣＦＧＲＲＭＤＲＩＧＡＱＳＧＬＧＣＮＳＦＲＹ；
    （配列番号４７）ＳＬＲＲＳＳＣＦＧＧＲＭＤＲＩＧＡＱＳＤＬＧＣＮＳＦＲＹ；
    （配列番号４８）ＳＬＲＲＳＳＣＦＤＲＲＭＤＲＩＧＡＱＳＧＬＧＣＮＳＦＲＹ；
    （配列番号４９）ＳＬＲＲＳＳＣＦＤＧＲＭＤＲＩＧＡＱＳＤＬＧＣＮＳＦＲＹ；
    （配列番号５０）ＳＬＲＲＳＳＣＦＧＲＲＭＤＲＩＧＡＱＳＤＬＧＣＮＳＦＲＹ；および
    （配列番号５１）ＳＬＲＲＳＳＣＦＤＲＲＭＤＲＩＧＡＱＳＤＬＧＣＮＳＦＲＹ
    からなる群から選択される、請求項１に記載の単離されたペプチド。
28. Ｘ_１がＧであり、かつＸ_８がＧである場合、またはＮＳＦＲＹが前記ペプチドのＣ末端に存在する場合に、前記ペプチドの利尿作用が誘発される、先行する請求項のいずれか１項に記載の単離されたペプチド。
29. ａ）Ｘ_１がＧである場合に、Ｘ_１がＤである場合と比べて心拍数および脈圧を低下させ、
    ｂ）Ｘ_２がＧである場合に、低用量では利尿のみを誘発し、高用量では利尿とともに血圧低下を誘発し；
    ｃ）Ｘ_２がＲである場合に、低用量と高用量で誘発される薬理活性がｂ）の逆になり；
    ｄ）Ｘ_８がＧである場合に、Ｘ_８がＤである場合と比べて持続的な血管拡張作用を誘発し；かつ
    ｅ）Ｘ_１がＤであり、かつＸ_８がＤである場合に、有意な利尿作用を伴わずに血圧低下のみを誘発する、
    先行する請求項のいずれか１項に記載の単離されたペプチド。
30. 配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号５１を含む群のペプチドが血管拡張作用を有し；
    配列番号２９、配列番号３６および配列番号３７を含む群のペプチドが血管拡張作用および利尿作用を有し；かつ
    配列番号４９を含む群のペプチドが腎作用を有する、
    先行する請求項のいずれか１項に記載の単離されたペプチド。
31. 医薬における使用、治療における使用および／または薬剤としての使用のための、先行する請求項のいずれか１項に記載の単離されたペプチド。
32. 血圧および血液量を調節するための、かつ／または心臓の病態を治療するための薬剤の調製における、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の少なくとも１つの単離されたペプチドの使用。
33. 対象において血圧および血液量を調節するための、かつ／または心臓の病態を治療するための方法であって、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の単離されたペプチドの有効量を対象に投与することを含む方法。
34. 請求項１〜３０のいずれか１項に記載のペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
35. 請求項１〜３０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物。