JP3755555B2 - プロスタグランジンｅ２受容体、その製造方法、その受容体をコードするｄｎａ、そのｄｎａからなるベクターおよびそのベクターで形質転換された宿主細胞 - Google Patents
プロスタグランジンｅ２受容体、その製造方法、その受容体をコードするｄｎａ、そのｄｎａからなるベクターおよびそのベクターで形質転換された宿主細胞 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトのプロスタグランジンＥ2 受容体、その製造方法、その受容体をコードするＤＮＡ、そのＤＮＡからなる複製または発現ベクターおよびそのベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロスタグランジン（ＰＧｓ）、トロンボキサン（ＴＸ）およびロイコトリエン（ＬＴｓ）のようなプロスタノイドは、アラキドン酸の酸化代謝物のひとつのファミリーであり、生体内で局所ホメオスタシスを維持するために種々の生理作用を発揮している（The Pharmacological Basis of Therapeutics (Gilman, A. G., Goodman, L. S., Rall, T. W., and Murad, F.,eds) 7th Ed., pp 660, Macmillan Publishing Co., New York (1985) 参照のこと）。それらの生理作用はそれぞれのプロスタノイドに特有の細胞膜受容体およびＧＴＰ結合蛋白（Ｇ蛋白）の活性化によって誘発される細胞内応答により発現されていると考えられている。現在までに、ＴＸＡ2 、ＰＧＥ2 、ＰＧＩ2 、ＰＧＦ2 α、ＰＧＤ2 に対する受容体の存在が確認されており、それぞれＴＰ、ＥＰ、ＩＰ、ＦＰおよびＤＰ受容体と呼ばれている（Comprehensive Medical Chemistry, 3, 643-714 (1990)参照のこと）。
【０００３】
プロスタノイドの一員であるプロスタグランジンＥ2 （ＰＧＥ2 ）は、消化管の収縮および弛緩、胃酸の分泌、平滑筋の弛緩、神経伝達物質の遊離等の生理作用の発現に広く関与している。ＰＧＥ2 の生理作用と薬理作用、およびその作用部位を解析した結果からＰＧＥ2 の受容体であるＥＰ受容体には、ＥＰ1 、ＥＰ2 ＥＰ3 およびＥＰ4 の少なくとも４つの受容体サブタイプが存在していて、それぞれ異なった情報伝達に関与していると考えられている。
ｃＤＮＡクローニングの結果から、これらの受容体は、７ヶ所の細胞膜貫通領域を有していることが判明している（Pharmacol. Rev., 46, 205-229 (1994) 参照のこと）。
【０００４】
さらに、ヒトＥＰ3 受容体は、選択的なｍＲＮＡスプライシング機構によって、Ｃ末端側に異なった種々のアミノ酸が配列されるため多数の異性体からなりたっていることが最近判明した（Nature, 365, 166-170 (1993) およびJ. Biol. Chem., 269, 6163-6169 (1994) 参照のこと）。それぞれのＣ末端側のアミノ酸配列の違いにより、結合するＧ蛋白への特異性や、シグナリング経路が決定されている（Nature,365,166-170 (1993) 参照のこと）。今までのところ、ヒトＥＰ3 受容体の異性体として、７種類発見されている（FEBS Lett., 338, 170-174 (1994), Br. J. Pharmacol., 112, 377-385 (1994), Eur. J. Biochem., 228, 23-30 (1995)およびMol. Pharmacol., 48, 869-879 (1995) 参照のこと）。これらＥＰ3 受容体の異性体は、Ｇ蛋白に結合してアデニレートシクラーゼの刺激または抑制および／またはホスホイノシチド交換の刺激作用を有している。ヒトＥＰ3 受容体の遺伝子は１種類であるが、ヒトＥＰ3 受容体異性体のｍＲＮＡは、個々の生体組織内で各組織に特異的な形態で発現されている（ Mol. Pharmacol., 48, 869-879 (1995) 参照のこと）。これらの事実は、ＰＧＥ2 の多様な活性は、ＥＰ3 受容体の各異性体によって発揮されていることを示唆している。
【０００５】
【発明の目的】
ＰＧＥ2 の多様な活性を研究するためには、ＥＰ3 受容体異性体の構造、シグナリングおよび生体内での分布を解析することが必須であると考えられる。本発明者は、ヒトＥＰ3 受容体のｍＲＮＡスプライシング機構の研究において、従来から知られていた７種類のＥＰ3 受容体異性体とは、全く異なったアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡのクローニングに成功し本発明を完成した。
スイスプロット（Swiss Prot Release 20 ）に登録されている既知のポリペプチドのアミノ酸配列を調査したが、本発明のポリペプチドと同一の配列を有しているものは全く無かった。さらに、ジーンバンク（GenBank Release 70.0）に登録されているヌクレオチド配列も調査したが、本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡと同一の配列は見つからなかった。従って、本発明のポリペプチドは新規なものであることが確認された。
【０００６】
【発明の構成】
本発明は、実質的に純粋な形であるヒトＥＰ3-V およびＥＰ3-VI受容体に関する。具体的には、ヒトのＥＰ3-V 受容体としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、そのホモローグ、その配列のフラグメント、およびそのホモローグに関する。本発明はさらにそれらのポリペプチドをコードするＤＮＡに関する。より具体的には、配列番号２または３で示される塩基配列を有するＤＮＡ、および配列番号２または３で示される塩基配列に選択的にハイブリダイズするフラグメントを有するＤＮＡに関する。また、ヒトのＥＰ3-VI受容体としては、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、そのホモローグ、その配列のフラグメント、およびそのホモローグ、およびそれらのポリペプチドをコードするＤＮＡ、より具体的には、配列番号６または７で示される塩基配列を有するＤＮＡ、および配列番号６または７で示される塩基配列に選択的にハイブリダイズするフラグメントを有するＤＮＡに関する。
【０００７】
特に、本発明は、
（１）配列番号１または５で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）前記（１）に記載したポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（３）配列番号２または３で示される塩基配列を有するＤＮＡ、および
（４）配列番号６または７で示される塩基配列を有するＤＮＡ
に関する。
【０００８】
先述した７種類の公知のＥＰ3 受容体異性体のｃＤＮＡおよびそれらをコードしているゲノムＤＮＡの塩基配列から、ヒトＥＰ3 受容体の遺伝子配列上には、少なくとも、９個のエクソンと８個のイントロンがあることが示唆されていた。本発明の配列番号１または５で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドおよびそのポリペプチドをコードするＤＮＡについて、ヒトＥＰ3 受容体の遺伝子で従来イントロンとみなされた領域中に、新たにエクソン領域（ヒトＥＰ3 受容体の遺伝子の５’−末端から数えて７番目のエクソンにあたる領域で以後エクソン７と呼ぶ。）を見い出したものであり、全く新規なペプチドおよびそのｃＤＮＡである。以後、ヒトＥＰ3 受容体の遺伝子において、５’−末端からのエクソンの順番に従ってエクソン１からエクソン１０と呼ぶ（図１、図２、図３および表１参照。表１はヒトＥＰ3 受容体遺伝子の塩基配列および推定アミノ酸配列を示す。表１中、エクソン配列は、大文字で表記し、イントロン配列は、小文字で表記した。エクソンおよびイントロンの開始部位の塩基のすぐ上に、それぞれＥｘｏｎ、Ｉｎｔｒｏｎと表記した。エクソン配列中の塩基の数を右端に表示した。）。
【０００９】
本発明のヒトＥＰ3-V 受容体のｃＤＮＡは、エクソン１、エクソン２ａ（エクソン２は内部にスプライスドナー部位があり、エクソン２ａとエクソン２ｂに分かれる。）、エクソン５、エクソン７、エクソン９およびエクソン１０からなる（図３）。
本発明のヒトＥＰ3-VI受容体のｃＤＮＡは、エクソン１、エクソン２ａ、エクソン７、エクソン９およびエクソン１０からなる（図３）。
エクソン１およびエクソン２ａは、先述した７種類の公知のＥＰ3 受容体異性体および本発明のＥＰ3-V およびＥＰ3-VI受容体の各ｃＤＮＡに共通して含まれる。
【００１０】
配列番号１または５で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドとは、配列番号１または５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドだけでなく、そのポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に、配列番号１または５で示されるアミノ酸数の２０％、より好ましくは５％以内の別個のポリペプチドを付加したポリペプチドを意味する。
実質的に純粋な形である配列番号１または５で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドとは、一般に、生産時のポリペプチドの９０％以上、例えば９５、９８または９９％が配列番号１または５で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを意味する。
配列番号１または５で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのホモローグ、またはその配列のフラグメントのホモログとは、一般に少なくとも１００個、好ましくは少なくとも１５０個、例えば２００、２５０または３００個の連続したアミノ酸領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上相同性のあるものであり、そのようなホモローグは、以後本発明のポリペプチドとして記載される。
【００１１】
さらに、配列番号１または５で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのフラグメントとは、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも１５アミノ酸、例えば２０、２５、３０、４０、５０または６０アミノ酸部分を意味する。
配列番号２、３、６または７で示される塩基配列を有するＤＮＡに選択的にハイブリダイズするＤＮＡとは、一般に、少なくとも１００個、好ましくは、少なくとも１５０個、例えば２００、２５０または３００個の連続した塩基配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上の相同性のあるものであり、そのようなＤＮＡは、以後本発明のＤＮＡとして記載される。
配列番号２、３、６または７で示される塩基配列を有するＤＮＡのフラグメントとは、少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも１５塩基、例えば２０、２５、３０または４０塩基部分を意味し、そのようなフラグメントも本発明のＤＮＡに含まれる。
【００１２】
本発明のＤＮＡは、遺伝子組み換え法、合成法あるいは当業者に公知の方法によって取得することができる。
さらに、本発明には、本発明のＤＮＡからなる複製または発現ベクターが含まれる。ベクターとしては、例えば、ｏｒｉ領域と、必要により上記ＤＮＡの発現のためのプロモーター、プロモーターの制御因子などからなるプラスミド、ウィルスまたはファージベクターが挙げられる。ベクターはひとつまたはそれ以上の選択的マーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子を含んでいてもよい。
さらに、本発明には、配列番号２、３、６または７で示される塩基配列、またはそれらのオープンリーディングフレームを有するＤＮＡを含む本発明のＤＮＡを複製または発現させるためのベクターで形質転換された宿主細胞も含まれる。細胞としては、例えば細菌、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞が挙げられる。
さらに、本発明には、本発明のポリペプチドを発現させるための条件下で、本発明の宿主細胞を培養することからなる本発明のポリペプチドの製造方法も含まれる。
【００１３】
本発明のポリペプチドとしては、配列番号１または５で示されたアミノ酸配列を有するもの以外に、その一部が欠損したもの（例えば、成熟蛋白中、生物活性の発現に必須な部分だけからなるポリペプチド）、その一部が他のアミノ酸と置換したもの（例えば、物性の類似したアミノ酸に置換したもの）、およびその一部に他のアミノ酸が付加または挿入されたものも含まれる。
よく知られているように、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは１〜６種類（例えば、メチオニン（Ｍｅｔ）は１種類、ロイシン（Ｌｅｕ）は６種類）知られている。従って、ポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくＤＮＡの塩基配列を変えることができる。
（２）で特定される本発明のＤＮＡには、それぞれ配列番号１または５で示されるポリペプチドをコードするすべての塩基配列群が含まれる。塩基配列を変えることによって、ポリペプチドの生産性が向上することがある。
（３）で特定されるＤＮＡは、（２）で示されるＤＮＡの一態様であり、天然型配列を表わす。
（４）に示されるＤＮＡは、（３）で特定されるＤＮＡに天然の非翻訳部分を加えた配列を示す。
【００１４】
配列番号３または７で示される塩基配列を有するＤＮＡの作製は、後述する実施例の方法または、以下の方法に従って行なわれる。
すなわち、
(i)本発明のポリペプチドが産生される細胞からｍＲＮＡを分離し、
(ii) 該ｍＲＮＡからファーストストランド（１本鎖ＤＮＡ）、次いでセカンドストランド（２本鎖ＤＮＡ）を合成し（ｃＤＮＡの作製）、
(iii) 該ｃＤＮＡを適当なプラスミドベクターに組み込み、
(iv) 得られた組み換えベクターで宿主細胞を形質転換し（ｃＤＮＡライブラリーの作製）、
(v)得られたｃＤＮＡライブラリーより、ハイブリダイゼーション法により目的とするＤＮＡ含有プラスミドを単離し、
(vi)目的とするＤＮＡの塩基配列を決定することによって作製することができる。
【００１５】
より詳細に説明すると、工程 (i)は、ヒトの組織中、ＥＰ3 受容体を発現していると考えられる組織、好ましくは、腎臓、子宮等の組織細胞または細胞株より、オカヤマ(Okayama, H.) 等の方法［Method in Enzymology, 154, 3(1987)に記載］、Chirgwin, J. M. 等の方法［Biochem., 18, 5294 (1979) に記載］等の方法に従って行なわれる。
(ii)、(iii) および(iv)の工程はｃＤＮＡライブラリー作製の工程であり、改変したGubler＆Hoffman 法［Gene, 25, 263(1983) に記載］に準じて行なわれる。(iii) の工程で用いられるプラスミドベクターとしては大腸菌内で機能するもの（例えば、ｐＢＲ３２２）や枯草菌内で機能するもの（例えば、ｐＵＢ１１０）が多数知られているが、好適には、大腸菌内で機能するl-ZAPII が用いられる。
(iv)の工程で用いられる宿主細胞は既に多くのものが知られており、いずれを用いてもよいが、好ましくはＤＨ５のコンピテントセル［Gene, 96, 23(1990)記載の方法により調整される。］である。
工程 (v)は、それ自体公知であり、例えば、プラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法［Gene, 10, 63 (1980) に記載］等によって行なわれる。また、適当なプローブとしては、ヒトＥＰ3 受容体異性体、例えば、ヒトＥＰ3 受容体のＤＮＡまたはそのフラグメントまたは該ＤＮＡとホモロジーを有するＤＮＡが用いられる。
工程(vi)はそれ自体公知であり、例えばジデオキシターミネーター(dideoxy terminator)法やマキサム・ギルバート（Maxam-Gilbert ）法により行なわれる。
配列番号２、３、６または７で示される塩基配列が、一旦確定されると、その後は、化学合成によって、またはＰＣＲ法によって、あるいは該塩基配列の断片をプローブとしたハイブリダイズ法によって、本発明のＤＮＡを得ることができる。さらに、本ＤＮＡを含有するベクターＤＮＡを適当な宿主に導入し、これを増殖させることによって、目的とする本発明ＤＮＡを必要量得ることができる。
【００１６】
本発明のポリペプチド（配列番号１または５）を取得する方法としては、
（１）生体または培養細胞から精製単離する方法、
（２）ペプチド合成する方法、または
（３）遺伝子組み換え技術を用いて生産する方法、
などが挙げられるが、工業的には（３）に記載した遺伝子組み換え技術による方法が好ましい。
【００１７】
遺伝子組み換え技術を用いてポリペプチドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系が挙げられる。
例えば、大腸菌で発現させる場合には、蛋白部分をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号２または６で示される塩基配列をコードするＤＮＡ）を、適当なプロモーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター等）の下流に接続し、大腸菌内で機能するベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）に挿入して発現ベクターを作製する。次に、この発現ベクターで形質転換した大腸菌（例えば、 E.coli ＤＨ１、 E.coli ＪＭ１０９、 E.coli ＨＢ１０１株等）を適当な培地で培養して、その菌体より目的とするポリペプチドを得ることができる。また、バクテリアのシグナルペプチド（例えば、ｐｅｌＢのシグナルペプチド）を利用すれば、ペリプラズム中に目的とするポリペプチドを分泌することもできる。さらに、他のポリペプチドとのヒュージョンプロテイン (fusion protein) を生産することもできる。
【００１８】
また、哺乳動物細胞で発現させる場合には、例えば、配列番号３または７で示される塩基配列をコードするＤＮＡを適当なベクター（例えば、レトロウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、メタロチオネインプロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを作製する。次に、得られた発現ベクターで適当な哺乳動物細胞（例えば、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞等）を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、その培養液中に目的とするポリペプチドが分泌される。以上のようにして得られたポリペプチドは、一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。
【００１９】
【発明の効果】
本発明のポリペプチドは、それ自体ＰＧＥ2 と特異的に結合するのでＰＧＥ2 過剰産生によって生ずる疾患、例えば、炎症等の疾患の予防および／または治療剤として用いることができる。また、ＰＧＥ2 のアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する物質のスクリーニングに用いられる。
さらに、該ポリペプチドのポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いて、生体における該ポリペプチドの定量が行なえ、これによって該ポリペプチドと疾患との関係の研究あるいは疾患の診断等に利用することができる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は該ポリペプチドあるいはその断片を抗原として用いて常法により作製することができる。
本発明のＤＮＡは、多大な有用性が期待される本発明のポリペプチドを生産する際の重要かつ必須の鋳型となるだけでなく、遺伝病の診断や治療に利用できる。また、本発明のＤＮＡをプローブとしてジェノミック(genomic) ＤＮＡを分離できる。同様にして、本発明ＤＮＡと相同性の高いヒトの関連ポリペプチドの遺伝子、またヒト以外の生物における本発明ポリペプチドと相同性の高いポリペプチドの遺伝子を分離することも可能である。
【００２０】
本発明のポリペプチドを炎症等の疾患の予防および／または治療のために用いるには、通常、全身的または局所的に、経口または非経口の形で投与される。
投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人一人当たり、一回につき、１μｇから１００ｍｇの範囲で一日一回から数回、経口投与されるか、または成人一人当たり、一回につき、 0.1μｇから１０ｍｇの範囲で一日一回から数回非経口投与（好ましくは、静脈内投与）されるか、または一日１時間から２４時間の範囲で静脈内に持続投与される。
もちろん前記したように、投与量は種々の条件により変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、また範囲を越えて投与の必要な場合もある。
【００２１】
本発明のポリペプチドを投与する際には、経口投与のための固体組成物、液体組成物およびその他の組成物、非経口投与のための注射剤、外用剤、坐剤等として用いられる。
経口投与のための固体組成物には、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等が含まれる。
カプセル剤には、ハードカプセルおよびソフトカプセルが含まれる。
【００２２】
このような固体組成物においては、ひとつまたはそれ以上の活性物質が、少なくともひとつの不活性な希釈剤、例えばラクトース、マンニトール、マンニット、グルコース、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムと混和される。組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加物、例えばステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、繊維素グリコール酸カルシウムのような崩壊剤、グルタミン酸またはアスパラギン酸のような溶解補助剤を含有してもよい。錠剤または丸剤は必要により白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースフタレートなどの胃溶性あるいは腸溶性物質のフィルムで被膜していてもよいし、また２以上の層で被膜していてもよい。さらにゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも包含される。
【００２３】
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含む。このような液体組成物においては、ひとつまたはそれ以上の活性物質が、一般的に用いられる不活性な希釈剤（例えば精製水、エタノール）に含有される。この組成物は、不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有してもよい。
経口投与のためのその他の組成物としては、ひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、それ自体公知の方法により処方されるスプレー剤が含まれる。この組成物は不活性な希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリウムのような安定剤と等張性を与えるような安定化剤、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムあるいはクエン酸のような等張剤を含有していてもよい。スプレー剤の製造方法は、例えば米国特許第2,868,691 号および同第3,095,355 号明細書に詳しく記載されている。
【００２４】
本発明のポリペプチドの非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤を包含する。水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば注射用蒸留水および生理食塩水が含まれる。非水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート８０（登録商標）等がある。このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解補助剤（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）のような補助剤を含んでいてもよい。これらはバクテリア保留フィルターを通すろ過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化される。これらはまた無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌化または無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することもできる。
非経口投与のためその他の組成物としては、ひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される外用液剤、軟膏、塗布剤、直腸内投与のための坐剤および腟内投与のためのペッサリー等が含まれる。
【００２５】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
【００２６】
実施例１：ヒトＥＰ3-V ，ＥＰ3-VI受容体のｃＤＮＡクローニング
（１）ヒトの組織およびＲＮＡの抽出
ヒトの腎臓および子宮組織を剖検または組織解剖の時に採集し、液体窒素で凍結させ、−７０℃で保存し、使用時に解凍した。総ＲＮＡをアシッド・グアニジウム・フェノール・クロロホルム (acid guanidium phenol chloroform) 法（Molecular cloning (Maniatis, T., Fritsch, E. F., and Sambrock, J. eds) 2nd ed., a laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989) に記載）に従って分離した。ポリＡが付加されたＲＮＡをビオチン化オリゴ（ｄＴ）プライマー(biotinylated oligo(dT) primer) (Poly A Tract, Promega Corp.社製）を用いて精製した。
【００２７】
（２）逆転写酵素反応 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)
約１０μｇの総ＲＮＡをヒトの子宮から採取し、それを、オリゴ（ｄＴ）１５プライマーとスーパースクリプト・モロニー・ミューリン・ロイケミア・ウイルス(Superscript Moloney Murine Leukemia Virus) の逆転写酵素 (Life Technologies, Inc. 社製) を用いて逆転写した。
一本鎖ｃＤＮＡをエクソン５に特異的なセンスプライマー：
【化１】
５'−ＡＴＧＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＣＴＣＡＧＡＧＡＧＣＡＡ−３'、
【００２８】
およびエクソン９に特異的なアンチセンスプライマー：
【化２】
５'−ＡＴＣＴＧＣＴＧＴＣＡＡＡＡＴＡＧＴＴＣ−３'、
【００２９】
を用いたＲＴ−ＰＣＲに供した。また別の一本鎖ｃＤＮＡをエクソン１に特異的なセンスプライマー：
【化３】
５'−ＣＣＴＣＣＴＣＡＣＣＴＣＧＡＡＧＣＣＡＡＣ−３'、
【００３０】
およびエクソン９に特異的なアンチセンスプライマー：
【化４】
５'−ＴＣＡＧＣＴＴＡＧＣＴＧＧＡＣＡＣＴＧＣＡＧＧＧＴＴＣＴＣＴＡＴ−３'
【００３１】
を用いたＲＴ−ＰＣＲに供した。増幅は、鋳型としてそれぞれの一本鎖ｃＤＮＡを用いて、まず、９４℃で２分間変性した後、９４℃で３０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング、７２℃で１分間イクステンションの１サイクルを３５回行ない、そして最後に７２℃で１０分間イクステンションを行なった。ＰＣＲ産物をｐＣＲＴＭＩＩベクター(Invitrogen Corp. 社製）にサブクローンした後、シークエンス解析に供した。
【００３２】
（３）ジェノミックライブラリースクリーニング
λＥＭＢＬ３およびλＥＭＢＬ３ＳＰ６／Ｔ７ベクター(Clontech Laboratories Inc. 社製) 中で増殖させた二つのヒトジェノミックＤＮＡライブラリーを大腸菌宿主 (Escherichia coli host strain LE392) に導入し、ジーン・スクリーン・プラス・ナイロンフィルター(Gene Screen Plus nylon filters) (DuPont/NEN 社製) 上に移した。総数 2.0×１０6 個のファージクローンを32Ｐ標識ヒトＥＰ3-I 、ＥＰ3-IV受容体のｃＤＮＡフラグメント(Mol. Pharmacol., 48, 869-879 (1995) 参照のこと）およびＥＰ3e，ＥＰ3f受容体のｃＤＮＡフラグメント(Eur. J. Biochem., 228, 23-30 (1995) 参照のこと）をプローブとして用いてプレハイブリダイゼ−ションおよびハイブリダイゼ−ションを行なってスクリーニングした。プレハイブリダイゼ−ションは、１％ＳＤＳ，２００μｇ／ｍｌの熱変性させたサケ精子ＤＮＡを含有する６×ＳＳＣ（１０％硫酸デキストラン、１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ 7.5））中、６０℃で１２時間行なった。ハイブリダイゼーションも同じ条件で先述した32Ｐで標識したプローブを加えた溶液中で行なった。ハイブリダイゼーション後、フィルターは、６０℃で１時間、 0.1％ＳＤＳ含有 0.1×ＳＳＣで３回洗浄した。λＨＥＰＲ１−５と命名されたインサートを有する５個のポジティブファージクローンを単離し、制限酵素地図およびサザンブロット解析 (Southern blot analysis) によって同定した（図１）。サザンブロット解析のポジティブＤＮＡ断片をpBluescript ベクター(Stratagene Inc.製）にサブクローンした後、シークエンス解析に供した。
【００３３】
（４）ジェノミックＰＣＲ
ヒトジェノミックＤＮＡを鋳型として、ＬＡ ＰＣＲインビトロクローニングキット(LA PCR in vitor Cloning Kit) （宝酒造社製）を用いて、ＰＣＲを行ない、エクソン１０を含むヒトＥＰ3 受容体遺伝子を含有するジェノミッククローンを単離した。白血球から抽出した５μｇのヒトジェノミックＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、ＤＮＡライゲーションキット（DNA ligation Kit）（宝酒造社製）を用いてアダプターを結合させ、センスアダプタープライマーおよびエクソン１０に特異的なアンチセンスプライマー：
【化５】
５'−ＧＡＧＡＧＴＣＡＴＧＧＡＧＣＴＴＣＣＡＧＴＧＡＴＧＴＧＡＴＣ−３'（表１）、
【００３４】
を用いてＰＣＲを行なった。エクソン１０の３'−側の中にイントロンが存在するかどうか決定するために、センスプライマー：
【化６】
５'−ＣＣＡＡＴＣＣＴＡＡＴＴＧＡＴＴＴＧＴＴ−３
【００３５】
およびポリＡ付加部位の上流に位置するアンチセンスプライマー：
【化７】
５'−ＧＴＣＣＡＡＣＣＡＡＡＴＴＡＴＧＣＴＴＴ−３'（表１）
【００３６】
を用いてＰＣＲを行なった。いずれのＰＣＲの増幅は、まず、９８℃で２分間変性した後、９８℃で１５秒間変性、６８℃で２０分間アニーリング、６８℃で２０分間イクステンションの１サイクルを３０回行ない、そして最後に６８℃で２０分間イクステンションを行なった。ＰＣＲ産物であるＨＥＰＣＲ１およびＨＥＰＣＲ２（図１）をｐＣＲＴＭＩＩベクターにサブクローンした後、シークエンス解析に供した。
【００３７】
（５）５'-ＲＡＣＥ
ヒトＥＰ3 受容体遺伝子の転写開始部位を決定するために、マラソンＴＭ ｃＤＮＡ増幅キット（Marathon TM cDNA Amplification Kit ,Clontech社製）を用いて５'−ＲＡＣＥ実験を行なった。約２μｇのポリＡが付加したＲＮＡをヒト腎臓から採集し、ヒトＥＰ3 受容体のｃＤＮＡに特異的なアンチセンスプライマー：
【化８】
５'−ＣＡＣＡＴＧＣＣＴＧＴＧＴＡＧＧＡＡＴＧ−３'（表１）
【００３８】
を用いて逆転写した。二本鎖ｃＤＮＡを製造した後、二本鎖ｃＤＮＡにＴ４ＤＮＡリガーゼでマラトンｃＤＮＡアダプターを結合させ、センスアダプタープライマーおよびＥＰ3 受容体のｃＤＮＡに特異的なアンチセンスプライマー：
【化９】
５'−ＧＴＴＧＡＧＧＣＧＧＧＡＣＧＡＧＡＡＧＧ−３'（表１）
【００３９】
を用いたＰＣＲで増幅させた。
増幅は、まず、９４℃で２分間変性した後、９４℃で３０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング、７２℃で１分間イクステンションの１サイクルを３５回行ない、そして最後に７２℃で１０分間イクステンションを行なった。得られた約３００ｂｐの一本鎖の断片をｐＣＲＴＭＩＩベクターにサブクローンした後、シークエンス解析に供した。
【００４０】
（６）３'-ＲＡＣＥ
３'-ＲＡＣＥ実験（Genomics, 27, 142-148 (1995)を参照のこと。）を行なってヒトＥＰ3 受容体のｃＤＮＡの３'−末端側の配列を決定した（表１および図３）。（１）で製造した２μｇのポリＡが付加されたＲＮＡをアダプターオリゴ（ｄＴ）１５プライミング：
【化１０】
５'−ＧＧＣＡＧＴＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３'
【００４１】
とスーパースクリプト・モロニー・ミューリン・ロイケミア・ウイルス（ Superscript Moloney Murine Leukemia Virus）の逆転写酵素（Life Technologies, Inc. 社製）を用いて逆転写した。各々の５'−末端の遺伝子に特異的なプライマーとして、次のプライマーを用いた。
【００４２】
１）ＥＰ3-V およびＥＰ3-VI受容体のｃＤＮＡ用として
【化１１】
５'−ＧＡＧＡＴＧＧＧＧＣＣＴＧＡＴＧＧＡＡＧ−３'、
【００４３】
２）ＥＰ3-I （ｐＥＰＲ−Ｉａ）受容体のｃＤＮＡ用として
【化１２】
５'−ＣＡＴＴＴＣＡＴＧＡＴＡＧＣＴＴＧＣ−３'、
【００４４】
３）ＥＰ3-I （ｐＥＰＲ−Ｉｂ）、ＥＰ3-III 、ＥＰ3-IVおよびＥＰ3f受容体のｃＤＮＡ用として
【化１３】
５'−ＣＡＣＡＧＡＡＡＣＡＣＣＣＡＣＣＴＣＣ−３'、
【００４５】
４）ＥＰ3-II受容体のｃＤＮＡ用として
【化１４】
５'−ＧＴＡＣＡＧＡＧＡＣＴＡＧＡＧＣＧＧＴＧ−３'、
【００４６】
５）ＥＰ3e受容体のｃＤＮＡ用として
【化１５】
５'−ＴＴＧＣＧＡＡＣＴＣＴＣＡＧＡＴＡＣＡＧ−３
を用いた（表１）。各遺伝子に特異的なセンスプライマーとアダプターオリゴヌクレオチド（３'−末端上の１３ｄＴヌクレオチドは除く）を用いてＰＣＲを行なった。
増幅は、まず、４℃で２分間変性した後、９４℃で３０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング、７２℃で１分間イクステンションの１サイクルを３５回行ない、そして最後に７２℃で１０分間イクステンションを行なった。
１）のＥＰ3-V およびＥＰ3-VI受容体のｃＤＮＡは、この一度のＰＣＲでそして、２）から５）の他のＥＰ3 受容体各異性体については、各々の反応の後、下流の各遺伝子に特異的なセンスプライマーとして、２）ＥＰ3-I （ｐＥＰＲ−Ｉａ）受容体のｃＤＮＡ用として
【化１６】
５'−ＣＴＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＣＴＴＡＡＴＴＧ−３'、
【００４７】
３）ＥＰ3-I （ｐＥＰＲ−Ｉｂ）、ＥＰ3-III 、ＥＰ3-IVおよびＥＰ3f受容体のｃＤＮＡ用として
【化１７】
５'−ＣＣＡＧＡＡＧＣＴＧＴＴＡＴＧＴＣＣＴＧ−３'、
【００４８】
４）ＥＰ3-II受容体のｃＤＮＡ用として
【化１８】
５'−ＣＣＡＴＡＣＡＴＡＴＧＴＣＴＡＡＴＣＡＧ−３'、
【００４９】
５）ＥＰ3e受容体のｃＤＮＡ用として
【化１９】
５'−ＡＴＡＡＣＴＡＣＡＧＧＡＧＴＧＣＴＧＴＧ−３'（表１）
【００５０】
およびアンチセンスアダプタープライマーを用いてさらにＰＣＲを行なった。増幅は、一度目のＰＣＲと同じ条件で行なった。３'−ＲＡＣＥ産物を 1.5％アガロースゲルで分析し、増幅させたＤＮＡをｐＣＲＴＭＩＩベクターにサブクローンした後、配列決定に供した。
【００５１】
（７）ＤＮＡ配列決定
核酸の塩基配列は、ダイデオキシ・ターミネーター・サイクル・シクエンシング・キット（DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit）（Applied Biosystems Inc. 製）を用いて決定した。配列に特異的なプライマーをモデル３８１Ａ ＤＮＡシンセサイゼー（Model 381A DNA synthesizer）（Applied Biosystems Inc. 製）を用いて合成した。新たに単離した２種類のｃＤＮＡ（ｐＥＰＲ−ＶおよびｐＥＰＲ−ＶＩ）の全長の塩基配列を、配列番号３および７に示す。また、転写解読枠より推定されるアミノ酸配列を配列番号１および５に示す。
【００５２】
実施例２：ＣＨＯ細胞による発現とリガンドとのバインディングアッセイ
（１）ＣＨＯ細胞による発現
ｐＥＰＲ−ＶおよびｐＥＰＲ−ＶＩのｃＤＮＡ（実施例１で得た。）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩインサートを真核細胞発現ベクターであるｐＲＣ／ＲＳＶ（Invitrogen社製）にサブクローンし、得られたプラスミドＤＮＡをデアエデキストラン（DEAE-dextran）法（Mol. Cell. Biol., 4, 1641 (1984)に記載）によって、ＣＨＯ細胞に形質転換した。形質転換したＣＨＯ細胞を８００μｇ／ｍｌ antibiotic G418 (GIBCO-BRL 社製）含有のＨａｍｓ Ｆ−１２培地 (ICN Biomedicals 社製）で７２時間培養し、回収した後、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5)、0.25Ｍショ糖、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび 0.1ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライドからなる溶液中、ポッタ−エルベジェム（Potter-Elvehjem)ホモジナイザーを用いて、ホモジネートした。ホモジネート液は、８００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を取り置き、今回得られた上清を、１００、０００×ｇで３０分間、再度遠心分離した。得られたペレットを懸濁バッファー（２０ｍＭ ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸一水和物、ｐＨ6.0 ）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 および１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に懸濁させてクルードな膜組織として用いた。
【００５３】
（２）リガンドとのバインディングアッセイ
［3Ｈ］ＰＧＥ2 とのバインディングアッセイは、以下のようにして行なった 。すなわち、クルードな膜組織、４０μｇ膜蛋白と種々の濃度（ 0.5−１６ｎＭ）の［５，６，８，１１，１２，１４，１５−3Ｈ］ＰＧＥ2 （１５４Ｃｉ／ｍ ｍｏｌ）（Du Pont-New England Nuclear 社製、Scatchard 分析用）または４ｎＭ ［3Ｈ］ＰＧＥ2 （置き換え実験用）を全ボリューム１００μｌとなるよう に懸濁バッファー中に懸濁させて、３０℃で１時間培養した。培養は、氷冷した洗浄バッファー（１０ｍＭ ＫＨ2 Ｏ4 、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 および１ｍＭ ＥＤＴＡ）２ｍｌを加えることにより終結させた。混合物をすばやくワットマン（Whatman ）ＧＦ／Ｃフィルターでろ過した。フィルターは、氷冷した洗浄バッファー２ｍｌで４回洗浄した後、フィルター上の放射活性を常法により測定した。
【００５４】
（３）結果
このアッセイの結果、ＰＧＥ受容体に対するリガンドである［3Ｈ］ＰＧＥ2 、はｐＥＰＲ−ＶおよびｐＥＰＲ−ＶＩを発現したＣＨＯ細胞の細胞膜に特異的に結合することがわかった。それぞれの結合飽和曲線を図４および図５に示す。また、この結合のScatchard 分析の結果をそれぞれ、図６および図７に示す。この結合の解離常数は、それぞれ、3.87および1.37ｎＭ、最大結合は、それぞれ、4402.3および989.2 ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白であった。さらに［3Ｈ］ＰＧＥ2 特異的結合に対する種々のプロスタノイドの阻害活性をそれぞれ、図８および図９に示す。種々のプロスタノイドによる阻害活性は、ＥＰ３−Ｖでは、ＰＧＥ2 ＝Ｍ＆Ｂ28767 （ＥＰ3 アゴニスト）＝ＰＧＥ1 ＞＞iloprost（ＰＧＩ2 アゴニスト）＞ＰＧＦ2a＞ＰＧＤ2 であり、ＥＰ3-VIでは、ＰＧＥ2 ＝Ｍ＆Ｂ28767 （ＥＰ3 アゴニスト）＝ＰＧＥ1 ＞＞iloprost（ＰＧＩ2 アゴニスト）＝ＰＧＦ2a＝ＰＧＤ2 であった。
【００５５】
【表１】
【００５６】
【表２】
【００５７】
【表３】
【００５８】
【表４】
【００５９】
【表５】
【００６０】
【表６】
【００６１】
【表７】
【００６２】
【表８】
【００６３】
【配列表】
【００６４】
【００６５】
【００６６】
【００６７】
【００６８】
【００６９】
【００７０】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒトＥＰ3 受容体遺伝子のうちの単離したＤＮＡ断片の構造配置であり、制限地図および配列決定方法の説明図である。λＨＥＰＲ１、２、３、４、５およびＨＥＰＣＲ１、２のサイズはそれぞれ、15.5、14.0、14.5、15.0、12.0、10.0および0.5 ｋｂである。エクソンは、黒塗りしたボックスで示した。→は、得られた配列の程度を示す。
【図２】 ヒトＥＰ3 受容体遺伝子の構造配置を示す。ヒトＥＰ3 受容体遺伝子のうち単離したＤＮＡ断片をヒトＥＰ3 受容体異性体のｃＤＮＡ配列にあわせて表示した。エクソンを黒塗りまたは点々をふったボックスで示した。エクソン２は、エクソン２ａ（黒塗り部分）とエクソン２ｂ（点々をふった部分）に分かれる。エクソン２の＊印は、選択的なスプライスドナー部位を示す。＃印は、ポリＡ付加部位を示す。
【図３】 ヒトＥＰ3 受容体遺伝子のエクソン（最上部）および選択的なｍＲＮＡスプライシング機構による本発明のＥＰ3-V およびＥＰ3-VI受容体を含む９種類のヒトＥＰ3 受容体異性体のｃＤＮＡのエクソンを示す。エクソンを黒塗りまたは白抜きのボックスで示した。白抜きのボックスは、すべての異性体に共通のエクソン部分であり、黒塗りしたボックスは、各異性体独自のエクソン部分である。高さが高いボックスは、翻訳領域を示し、低く圧縮したボックスは、非翻訳領域を示す。最上部に表示した遺伝子のエクソン２の＊印は、選択的なスプライスドナー部位を示す。＃印は、ポリＡ付加部位を示す。エクソン１および２ａのボックス中の白黒の縞模様は、膜貫通領域を示す。
【図４】 ［3Ｈ］ＰＧＥ2 の、ｐＥＰＲ−Ｖを発現したＣＨＯ細胞の細胞膜への特異的結合の飽和曲線を示す。
【図５】 ［3Ｈ］ＰＧＥ2 の、ｐＥＰＲ−ＶＩを発現したＣＨＯ細胞の細胞膜への特異的結合の飽和曲線を示す。
【図６】 ［3Ｈ］ＰＧＥ2 の、ｐＥＰＲ−Ｖを発現したＣＨＯ細胞の細胞膜への結合実験のScatchard 分析の結果を示す。
【図７】 ［3Ｈ］ＰＧＥ2 の、ｐＥＰＲ−ＶＩを発現したＣＨＯ細胞の細胞膜への結合実験のScatchard 分析の結果を示す。
【図８】 ［3Ｈ］ＰＧＥ2 の、ｐＥＰＲ−Ｖを発現したＣＨＯ細胞の細胞膜への結合に対する種々のリガンド（ＰＧＥ2 、Ｍ＆Ｂ28767 （ＥＰ3 アゴニスト）、ＰＧＥ1 、iloprost（安定なＰＧＩ2 アゴニスト）、ＰＧＦ2a、ＰＧＤ2 ）の阻害活性を示す。
【図９】 ［3Ｈ］ＰＧＥ2 の、ｐＥＰＲ−ＶＩを発現したＣＨＯ細胞の細胞膜への結合に対する種々のリガンド（ＰＧＥ2 、Ｍ＆Ｂ28767 （ＥＰ3 アゴニスト）、ＰＧＥ1 、iloprost（安定なＰＧＩ2 アゴニスト）、ＰＧＦ2a、ＰＧＤ2 ）の阻害活性を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトのプロスタグランジンＥ2 受容体、その製造方法、その受容体をコードするＤＮＡ、そのＤＮＡからなる複製または発現ベクターおよびそのベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロスタグランジン（ＰＧｓ）、トロンボキサン（ＴＸ）およびロイコトリエン（ＬＴｓ）のようなプロスタノイドは、アラキドン酸の酸化代謝物のひとつのファミリーであり、生体内で局所ホメオスタシスを維持するために種々の生理作用を発揮している（The Pharmacological Basis of Therapeutics (Gilman, A. G., Goodman, L. S., Rall, T. W., and Murad, F.,eds) 7th Ed., pp 660, Macmillan Publishing Co., New York (1985) 参照のこと）。それらの生理作用はそれぞれのプロスタノイドに特有の細胞膜受容体およびＧＴＰ結合蛋白（Ｇ蛋白）の活性化によって誘発される細胞内応答により発現されていると考えられている。現在までに、ＴＸＡ2 、ＰＧＥ2 、ＰＧＩ2 、ＰＧＦ2 α、ＰＧＤ2 に対する受容体の存在が確認されており、それぞれＴＰ、ＥＰ、ＩＰ、ＦＰおよびＤＰ受容体と呼ばれている（Comprehensive Medical Chemistry, 3, 643-714 (1990)参照のこと）。
【０００３】
プロスタノイドの一員であるプロスタグランジンＥ2 （ＰＧＥ2 ）は、消化管の収縮および弛緩、胃酸の分泌、平滑筋の弛緩、神経伝達物質の遊離等の生理作用の発現に広く関与している。ＰＧＥ2 の生理作用と薬理作用、およびその作用部位を解析した結果からＰＧＥ2 の受容体であるＥＰ受容体には、ＥＰ1 、ＥＰ2 ＥＰ3 およびＥＰ4 の少なくとも４つの受容体サブタイプが存在していて、それぞれ異なった情報伝達に関与していると考えられている。
ｃＤＮＡクローニングの結果から、これらの受容体は、７ヶ所の細胞膜貫通領域を有していることが判明している（Pharmacol. Rev., 46, 205-229 (1994) 参照のこと）。
【０００４】
さらに、ヒトＥＰ3 受容体は、選択的なｍＲＮＡスプライシング機構によって、Ｃ末端側に異なった種々のアミノ酸が配列されるため多数の異性体からなりたっていることが最近判明した（Nature, 365, 166-170 (1993) およびJ. Biol. Chem., 269, 6163-6169 (1994) 参照のこと）。それぞれのＣ末端側のアミノ酸配列の違いにより、結合するＧ蛋白への特異性や、シグナリング経路が決定されている（Nature,365,166-170 (1993) 参照のこと）。今までのところ、ヒトＥＰ3 受容体の異性体として、７種類発見されている（FEBS Lett., 338, 170-174 (1994), Br. J. Pharmacol., 112, 377-385 (1994), Eur. J. Biochem., 228, 23-30 (1995)およびMol. Pharmacol., 48, 869-879 (1995) 参照のこと）。これらＥＰ3 受容体の異性体は、Ｇ蛋白に結合してアデニレートシクラーゼの刺激または抑制および／またはホスホイノシチド交換の刺激作用を有している。ヒトＥＰ3 受容体の遺伝子は１種類であるが、ヒトＥＰ3 受容体異性体のｍＲＮＡは、個々の生体組織内で各組織に特異的な形態で発現されている（ Mol. Pharmacol., 48, 869-879 (1995) 参照のこと）。これらの事実は、ＰＧＥ2 の多様な活性は、ＥＰ3 受容体の各異性体によって発揮されていることを示唆している。
【０００５】
【発明の目的】
ＰＧＥ2 の多様な活性を研究するためには、ＥＰ3 受容体異性体の構造、シグナリングおよび生体内での分布を解析することが必須であると考えられる。本発明者は、ヒトＥＰ3 受容体のｍＲＮＡスプライシング機構の研究において、従来から知られていた７種類のＥＰ3 受容体異性体とは、全く異なったアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡのクローニングに成功し本発明を完成した。
スイスプロット（Swiss Prot Release 20 ）に登録されている既知のポリペプチドのアミノ酸配列を調査したが、本発明のポリペプチドと同一の配列を有しているものは全く無かった。さらに、ジーンバンク（GenBank Release 70.0）に登録されているヌクレオチド配列も調査したが、本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡと同一の配列は見つからなかった。従って、本発明のポリペプチドは新規なものであることが確認された。
【０００６】
【発明の構成】
本発明は、実質的に純粋な形であるヒトＥＰ3-V およびＥＰ3-VI受容体に関する。具体的には、ヒトのＥＰ3-V 受容体としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、そのホモローグ、その配列のフラグメント、およびそのホモローグに関する。本発明はさらにそれらのポリペプチドをコードするＤＮＡに関する。より具体的には、配列番号２または３で示される塩基配列を有するＤＮＡ、および配列番号２または３で示される塩基配列に選択的にハイブリダイズするフラグメントを有するＤＮＡに関する。また、ヒトのＥＰ3-VI受容体としては、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、そのホモローグ、その配列のフラグメント、およびそのホモローグ、およびそれらのポリペプチドをコードするＤＮＡ、より具体的には、配列番号６または７で示される塩基配列を有するＤＮＡ、および配列番号６または７で示される塩基配列に選択的にハイブリダイズするフラグメントを有するＤＮＡに関する。
【０００７】
特に、本発明は、
（１）配列番号１または５で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）前記（１）に記載したポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（３）配列番号２または３で示される塩基配列を有するＤＮＡ、および
（４）配列番号６または７で示される塩基配列を有するＤＮＡ
に関する。
【０００８】
先述した７種類の公知のＥＰ3 受容体異性体のｃＤＮＡおよびそれらをコードしているゲノムＤＮＡの塩基配列から、ヒトＥＰ3 受容体の遺伝子配列上には、少なくとも、９個のエクソンと８個のイントロンがあることが示唆されていた。本発明の配列番号１または５で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドおよびそのポリペプチドをコードするＤＮＡについて、ヒトＥＰ3 受容体の遺伝子で従来イントロンとみなされた領域中に、新たにエクソン領域（ヒトＥＰ3 受容体の遺伝子の５’−末端から数えて７番目のエクソンにあたる領域で以後エクソン７と呼ぶ。）を見い出したものであり、全く新規なペプチドおよびそのｃＤＮＡである。以後、ヒトＥＰ3 受容体の遺伝子において、５’−末端からのエクソンの順番に従ってエクソン１からエクソン１０と呼ぶ（図１、図２、図３および表１参照。表１はヒトＥＰ3 受容体遺伝子の塩基配列および推定アミノ酸配列を示す。表１中、エクソン配列は、大文字で表記し、イントロン配列は、小文字で表記した。エクソンおよびイントロンの開始部位の塩基のすぐ上に、それぞれＥｘｏｎ、Ｉｎｔｒｏｎと表記した。エクソン配列中の塩基の数を右端に表示した。）。
【０００９】
本発明のヒトＥＰ3-V 受容体のｃＤＮＡは、エクソン１、エクソン２ａ（エクソン２は内部にスプライスドナー部位があり、エクソン２ａとエクソン２ｂに分かれる。）、エクソン５、エクソン７、エクソン９およびエクソン１０からなる（図３）。
本発明のヒトＥＰ3-VI受容体のｃＤＮＡは、エクソン１、エクソン２ａ、エクソン７、エクソン９およびエクソン１０からなる（図３）。
エクソン１およびエクソン２ａは、先述した７種類の公知のＥＰ3 受容体異性体および本発明のＥＰ3-V およびＥＰ3-VI受容体の各ｃＤＮＡに共通して含まれる。
【００１０】
配列番号１または５で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドとは、配列番号１または５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドだけでなく、そのポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に、配列番号１または５で示されるアミノ酸数の２０％、より好ましくは５％以内の別個のポリペプチドを付加したポリペプチドを意味する。
実質的に純粋な形である配列番号１または５で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドとは、一般に、生産時のポリペプチドの９０％以上、例えば９５、９８または９９％が配列番号１または５で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを意味する。
配列番号１または５で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのホモローグ、またはその配列のフラグメントのホモログとは、一般に少なくとも１００個、好ましくは少なくとも１５０個、例えば２００、２５０または３００個の連続したアミノ酸領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上相同性のあるものであり、そのようなホモローグは、以後本発明のポリペプチドとして記載される。
【００１１】
さらに、配列番号１または５で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのフラグメントとは、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも１５アミノ酸、例えば２０、２５、３０、４０、５０または６０アミノ酸部分を意味する。
配列番号２、３、６または７で示される塩基配列を有するＤＮＡに選択的にハイブリダイズするＤＮＡとは、一般に、少なくとも１００個、好ましくは、少なくとも１５０個、例えば２００、２５０または３００個の連続した塩基配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上の相同性のあるものであり、そのようなＤＮＡは、以後本発明のＤＮＡとして記載される。
配列番号２、３、６または７で示される塩基配列を有するＤＮＡのフラグメントとは、少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも１５塩基、例えば２０、２５、３０または４０塩基部分を意味し、そのようなフラグメントも本発明のＤＮＡに含まれる。
【００１２】
本発明のＤＮＡは、遺伝子組み換え法、合成法あるいは当業者に公知の方法によって取得することができる。
さらに、本発明には、本発明のＤＮＡからなる複製または発現ベクターが含まれる。ベクターとしては、例えば、ｏｒｉ領域と、必要により上記ＤＮＡの発現のためのプロモーター、プロモーターの制御因子などからなるプラスミド、ウィルスまたはファージベクターが挙げられる。ベクターはひとつまたはそれ以上の選択的マーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子を含んでいてもよい。
さらに、本発明には、配列番号２、３、６または７で示される塩基配列、またはそれらのオープンリーディングフレームを有するＤＮＡを含む本発明のＤＮＡを複製または発現させるためのベクターで形質転換された宿主細胞も含まれる。細胞としては、例えば細菌、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞が挙げられる。
さらに、本発明には、本発明のポリペプチドを発現させるための条件下で、本発明の宿主細胞を培養することからなる本発明のポリペプチドの製造方法も含まれる。
【００１３】
本発明のポリペプチドとしては、配列番号１または５で示されたアミノ酸配列を有するもの以外に、その一部が欠損したもの（例えば、成熟蛋白中、生物活性の発現に必須な部分だけからなるポリペプチド）、その一部が他のアミノ酸と置換したもの（例えば、物性の類似したアミノ酸に置換したもの）、およびその一部に他のアミノ酸が付加または挿入されたものも含まれる。
よく知られているように、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは１〜６種類（例えば、メチオニン（Ｍｅｔ）は１種類、ロイシン（Ｌｅｕ）は６種類）知られている。従って、ポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくＤＮＡの塩基配列を変えることができる。
（２）で特定される本発明のＤＮＡには、それぞれ配列番号１または５で示されるポリペプチドをコードするすべての塩基配列群が含まれる。塩基配列を変えることによって、ポリペプチドの生産性が向上することがある。
（３）で特定されるＤＮＡは、（２）で示されるＤＮＡの一態様であり、天然型配列を表わす。
（４）に示されるＤＮＡは、（３）で特定されるＤＮＡに天然の非翻訳部分を加えた配列を示す。
【００１４】
配列番号３または７で示される塩基配列を有するＤＮＡの作製は、後述する実施例の方法または、以下の方法に従って行なわれる。
すなわち、
(i)本発明のポリペプチドが産生される細胞からｍＲＮＡを分離し、
(ii) 該ｍＲＮＡからファーストストランド（１本鎖ＤＮＡ）、次いでセカンドストランド（２本鎖ＤＮＡ）を合成し（ｃＤＮＡの作製）、
(iii) 該ｃＤＮＡを適当なプラスミドベクターに組み込み、
(iv) 得られた組み換えベクターで宿主細胞を形質転換し（ｃＤＮＡライブラリーの作製）、
(v)得られたｃＤＮＡライブラリーより、ハイブリダイゼーション法により目的とするＤＮＡ含有プラスミドを単離し、
(vi)目的とするＤＮＡの塩基配列を決定することによって作製することができる。
【００１５】
より詳細に説明すると、工程 (i)は、ヒトの組織中、ＥＰ3 受容体を発現していると考えられる組織、好ましくは、腎臓、子宮等の組織細胞または細胞株より、オカヤマ(Okayama, H.) 等の方法［Method in Enzymology, 154, 3(1987)に記載］、Chirgwin, J. M. 等の方法［Biochem., 18, 5294 (1979) に記載］等の方法に従って行なわれる。
(ii)、(iii) および(iv)の工程はｃＤＮＡライブラリー作製の工程であり、改変したGubler＆Hoffman 法［Gene, 25, 263(1983) に記載］に準じて行なわれる。(iii) の工程で用いられるプラスミドベクターとしては大腸菌内で機能するもの（例えば、ｐＢＲ３２２）や枯草菌内で機能するもの（例えば、ｐＵＢ１１０）が多数知られているが、好適には、大腸菌内で機能するl-ZAPII が用いられる。
(iv)の工程で用いられる宿主細胞は既に多くのものが知られており、いずれを用いてもよいが、好ましくはＤＨ５のコンピテントセル［Gene, 96, 23(1990)記載の方法により調整される。］である。
工程 (v)は、それ自体公知であり、例えば、プラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法［Gene, 10, 63 (1980) に記載］等によって行なわれる。また、適当なプローブとしては、ヒトＥＰ3 受容体異性体、例えば、ヒトＥＰ3 受容体のＤＮＡまたはそのフラグメントまたは該ＤＮＡとホモロジーを有するＤＮＡが用いられる。
工程(vi)はそれ自体公知であり、例えばジデオキシターミネーター(dideoxy terminator)法やマキサム・ギルバート（Maxam-Gilbert ）法により行なわれる。
配列番号２、３、６または７で示される塩基配列が、一旦確定されると、その後は、化学合成によって、またはＰＣＲ法によって、あるいは該塩基配列の断片をプローブとしたハイブリダイズ法によって、本発明のＤＮＡを得ることができる。さらに、本ＤＮＡを含有するベクターＤＮＡを適当な宿主に導入し、これを増殖させることによって、目的とする本発明ＤＮＡを必要量得ることができる。
【００１６】
本発明のポリペプチド（配列番号１または５）を取得する方法としては、
（１）生体または培養細胞から精製単離する方法、
（２）ペプチド合成する方法、または
（３）遺伝子組み換え技術を用いて生産する方法、
などが挙げられるが、工業的には（３）に記載した遺伝子組み換え技術による方法が好ましい。
【００１７】
遺伝子組み換え技術を用いてポリペプチドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系が挙げられる。
例えば、大腸菌で発現させる場合には、蛋白部分をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号２または６で示される塩基配列をコードするＤＮＡ）を、適当なプロモーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター等）の下流に接続し、大腸菌内で機能するベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）に挿入して発現ベクターを作製する。次に、この発現ベクターで形質転換した大腸菌（例えば、 E.coli ＤＨ１、 E.coli ＪＭ１０９、 E.coli ＨＢ１０１株等）を適当な培地で培養して、その菌体より目的とするポリペプチドを得ることができる。また、バクテリアのシグナルペプチド（例えば、ｐｅｌＢのシグナルペプチド）を利用すれば、ペリプラズム中に目的とするポリペプチドを分泌することもできる。さらに、他のポリペプチドとのヒュージョンプロテイン (fusion protein) を生産することもできる。
【００１８】
また、哺乳動物細胞で発現させる場合には、例えば、配列番号３または７で示される塩基配列をコードするＤＮＡを適当なベクター（例えば、レトロウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、メタロチオネインプロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを作製する。次に、得られた発現ベクターで適当な哺乳動物細胞（例えば、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞等）を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、その培養液中に目的とするポリペプチドが分泌される。以上のようにして得られたポリペプチドは、一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。
【００１９】
【発明の効果】
本発明のポリペプチドは、それ自体ＰＧＥ2 と特異的に結合するのでＰＧＥ2 過剰産生によって生ずる疾患、例えば、炎症等の疾患の予防および／または治療剤として用いることができる。また、ＰＧＥ2 のアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する物質のスクリーニングに用いられる。
さらに、該ポリペプチドのポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いて、生体における該ポリペプチドの定量が行なえ、これによって該ポリペプチドと疾患との関係の研究あるいは疾患の診断等に利用することができる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は該ポリペプチドあるいはその断片を抗原として用いて常法により作製することができる。
本発明のＤＮＡは、多大な有用性が期待される本発明のポリペプチドを生産する際の重要かつ必須の鋳型となるだけでなく、遺伝病の診断や治療に利用できる。また、本発明のＤＮＡをプローブとしてジェノミック(genomic) ＤＮＡを分離できる。同様にして、本発明ＤＮＡと相同性の高いヒトの関連ポリペプチドの遺伝子、またヒト以外の生物における本発明ポリペプチドと相同性の高いポリペプチドの遺伝子を分離することも可能である。
【００２０】
本発明のポリペプチドを炎症等の疾患の予防および／または治療のために用いるには、通常、全身的または局所的に、経口または非経口の形で投与される。
投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人一人当たり、一回につき、１μｇから１００ｍｇの範囲で一日一回から数回、経口投与されるか、または成人一人当たり、一回につき、 0.1μｇから１０ｍｇの範囲で一日一回から数回非経口投与（好ましくは、静脈内投与）されるか、または一日１時間から２４時間の範囲で静脈内に持続投与される。
もちろん前記したように、投与量は種々の条件により変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、また範囲を越えて投与の必要な場合もある。
【００２１】
本発明のポリペプチドを投与する際には、経口投与のための固体組成物、液体組成物およびその他の組成物、非経口投与のための注射剤、外用剤、坐剤等として用いられる。
経口投与のための固体組成物には、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等が含まれる。
カプセル剤には、ハードカプセルおよびソフトカプセルが含まれる。
【００２２】
このような固体組成物においては、ひとつまたはそれ以上の活性物質が、少なくともひとつの不活性な希釈剤、例えばラクトース、マンニトール、マンニット、グルコース、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムと混和される。組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加物、例えばステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、繊維素グリコール酸カルシウムのような崩壊剤、グルタミン酸またはアスパラギン酸のような溶解補助剤を含有してもよい。錠剤または丸剤は必要により白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースフタレートなどの胃溶性あるいは腸溶性物質のフィルムで被膜していてもよいし、また２以上の層で被膜していてもよい。さらにゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも包含される。
【００２３】
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含む。このような液体組成物においては、ひとつまたはそれ以上の活性物質が、一般的に用いられる不活性な希釈剤（例えば精製水、エタノール）に含有される。この組成物は、不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有してもよい。
経口投与のためのその他の組成物としては、ひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、それ自体公知の方法により処方されるスプレー剤が含まれる。この組成物は不活性な希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリウムのような安定剤と等張性を与えるような安定化剤、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムあるいはクエン酸のような等張剤を含有していてもよい。スプレー剤の製造方法は、例えば米国特許第2,868,691 号および同第3,095,355 号明細書に詳しく記載されている。
【００２４】
本発明のポリペプチドの非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤を包含する。水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば注射用蒸留水および生理食塩水が含まれる。非水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート８０（登録商標）等がある。このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解補助剤（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）のような補助剤を含んでいてもよい。これらはバクテリア保留フィルターを通すろ過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化される。これらはまた無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌化または無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することもできる。
非経口投与のためその他の組成物としては、ひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される外用液剤、軟膏、塗布剤、直腸内投与のための坐剤および腟内投与のためのペッサリー等が含まれる。
【００２５】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
【００２６】
実施例１：ヒトＥＰ3-V ，ＥＰ3-VI受容体のｃＤＮＡクローニング
（１）ヒトの組織およびＲＮＡの抽出
ヒトの腎臓および子宮組織を剖検または組織解剖の時に採集し、液体窒素で凍結させ、−７０℃で保存し、使用時に解凍した。総ＲＮＡをアシッド・グアニジウム・フェノール・クロロホルム (acid guanidium phenol chloroform) 法（Molecular cloning (Maniatis, T., Fritsch, E. F., and Sambrock, J. eds) 2nd ed., a laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989) に記載）に従って分離した。ポリＡが付加されたＲＮＡをビオチン化オリゴ（ｄＴ）プライマー(biotinylated oligo(dT) primer) (Poly A Tract, Promega Corp.社製）を用いて精製した。
【００２７】
（２）逆転写酵素反応 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)
約１０μｇの総ＲＮＡをヒトの子宮から採取し、それを、オリゴ（ｄＴ）１５プライマーとスーパースクリプト・モロニー・ミューリン・ロイケミア・ウイルス(Superscript Moloney Murine Leukemia Virus) の逆転写酵素 (Life Technologies, Inc. 社製) を用いて逆転写した。
一本鎖ｃＤＮＡをエクソン５に特異的なセンスプライマー：
【化１】
５'−ＡＴＧＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＣＴＣＡＧＡＧＡＧＣＡＡ−３'、
【００２８】
およびエクソン９に特異的なアンチセンスプライマー：
【化２】
５'−ＡＴＣＴＧＣＴＧＴＣＡＡＡＡＴＡＧＴＴＣ−３'、
【００２９】
を用いたＲＴ−ＰＣＲに供した。また別の一本鎖ｃＤＮＡをエクソン１に特異的なセンスプライマー：
【化３】
５'−ＣＣＴＣＣＴＣＡＣＣＴＣＧＡＡＧＣＣＡＡＣ−３'、
【００３０】
およびエクソン９に特異的なアンチセンスプライマー：
【化４】
５'−ＴＣＡＧＣＴＴＡＧＣＴＧＧＡＣＡＣＴＧＣＡＧＧＧＴＴＣＴＣＴＡＴ−３'
【００３１】
を用いたＲＴ−ＰＣＲに供した。増幅は、鋳型としてそれぞれの一本鎖ｃＤＮＡを用いて、まず、９４℃で２分間変性した後、９４℃で３０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング、７２℃で１分間イクステンションの１サイクルを３５回行ない、そして最後に７２℃で１０分間イクステンションを行なった。ＰＣＲ産物をｐＣＲＴＭＩＩベクター(Invitrogen Corp. 社製）にサブクローンした後、シークエンス解析に供した。
【００３２】
（３）ジェノミックライブラリースクリーニング
λＥＭＢＬ３およびλＥＭＢＬ３ＳＰ６／Ｔ７ベクター(Clontech Laboratories Inc. 社製) 中で増殖させた二つのヒトジェノミックＤＮＡライブラリーを大腸菌宿主 (Escherichia coli host strain LE392) に導入し、ジーン・スクリーン・プラス・ナイロンフィルター(Gene Screen Plus nylon filters) (DuPont/NEN 社製) 上に移した。総数 2.0×１０6 個のファージクローンを32Ｐ標識ヒトＥＰ3-I 、ＥＰ3-IV受容体のｃＤＮＡフラグメント(Mol. Pharmacol., 48, 869-879 (1995) 参照のこと）およびＥＰ3e，ＥＰ3f受容体のｃＤＮＡフラグメント(Eur. J. Biochem., 228, 23-30 (1995) 参照のこと）をプローブとして用いてプレハイブリダイゼ−ションおよびハイブリダイゼ−ションを行なってスクリーニングした。プレハイブリダイゼ−ションは、１％ＳＤＳ，２００μｇ／ｍｌの熱変性させたサケ精子ＤＮＡを含有する６×ＳＳＣ（１０％硫酸デキストラン、１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ 7.5））中、６０℃で１２時間行なった。ハイブリダイゼーションも同じ条件で先述した32Ｐで標識したプローブを加えた溶液中で行なった。ハイブリダイゼーション後、フィルターは、６０℃で１時間、 0.1％ＳＤＳ含有 0.1×ＳＳＣで３回洗浄した。λＨＥＰＲ１−５と命名されたインサートを有する５個のポジティブファージクローンを単離し、制限酵素地図およびサザンブロット解析 (Southern blot analysis) によって同定した（図１）。サザンブロット解析のポジティブＤＮＡ断片をpBluescript ベクター(Stratagene Inc.製）にサブクローンした後、シークエンス解析に供した。
【００３３】
（４）ジェノミックＰＣＲ
ヒトジェノミックＤＮＡを鋳型として、ＬＡ ＰＣＲインビトロクローニングキット(LA PCR in vitor Cloning Kit) （宝酒造社製）を用いて、ＰＣＲを行ない、エクソン１０を含むヒトＥＰ3 受容体遺伝子を含有するジェノミッククローンを単離した。白血球から抽出した５μｇのヒトジェノミックＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、ＤＮＡライゲーションキット（DNA ligation Kit）（宝酒造社製）を用いてアダプターを結合させ、センスアダプタープライマーおよびエクソン１０に特異的なアンチセンスプライマー：
【化５】
５'−ＧＡＧＡＧＴＣＡＴＧＧＡＧＣＴＴＣＣＡＧＴＧＡＴＧＴＧＡＴＣ−３'（表１）、
【００３４】
を用いてＰＣＲを行なった。エクソン１０の３'−側の中にイントロンが存在するかどうか決定するために、センスプライマー：
【化６】
５'−ＣＣＡＡＴＣＣＴＡＡＴＴＧＡＴＴＴＧＴＴ−３
【００３５】
およびポリＡ付加部位の上流に位置するアンチセンスプライマー：
【化７】
５'−ＧＴＣＣＡＡＣＣＡＡＡＴＴＡＴＧＣＴＴＴ−３'（表１）
【００３６】
を用いてＰＣＲを行なった。いずれのＰＣＲの増幅は、まず、９８℃で２分間変性した後、９８℃で１５秒間変性、６８℃で２０分間アニーリング、６８℃で２０分間イクステンションの１サイクルを３０回行ない、そして最後に６８℃で２０分間イクステンションを行なった。ＰＣＲ産物であるＨＥＰＣＲ１およびＨＥＰＣＲ２（図１）をｐＣＲＴＭＩＩベクターにサブクローンした後、シークエンス解析に供した。
【００３７】
（５）５'-ＲＡＣＥ
ヒトＥＰ3 受容体遺伝子の転写開始部位を決定するために、マラソンＴＭ ｃＤＮＡ増幅キット（Marathon TM cDNA Amplification Kit ,Clontech社製）を用いて５'−ＲＡＣＥ実験を行なった。約２μｇのポリＡが付加したＲＮＡをヒト腎臓から採集し、ヒトＥＰ3 受容体のｃＤＮＡに特異的なアンチセンスプライマー：
【化８】
５'−ＣＡＣＡＴＧＣＣＴＧＴＧＴＡＧＧＡＡＴＧ−３'（表１）
【００３８】
を用いて逆転写した。二本鎖ｃＤＮＡを製造した後、二本鎖ｃＤＮＡにＴ４ＤＮＡリガーゼでマラトンｃＤＮＡアダプターを結合させ、センスアダプタープライマーおよびＥＰ3 受容体のｃＤＮＡに特異的なアンチセンスプライマー：
【化９】
５'−ＧＴＴＧＡＧＧＣＧＧＧＡＣＧＡＧＡＡＧＧ−３'（表１）
【００３９】
を用いたＰＣＲで増幅させた。
増幅は、まず、９４℃で２分間変性した後、９４℃で３０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング、７２℃で１分間イクステンションの１サイクルを３５回行ない、そして最後に７２℃で１０分間イクステンションを行なった。得られた約３００ｂｐの一本鎖の断片をｐＣＲＴＭＩＩベクターにサブクローンした後、シークエンス解析に供した。
【００４０】
（６）３'-ＲＡＣＥ
３'-ＲＡＣＥ実験（Genomics, 27, 142-148 (1995)を参照のこと。）を行なってヒトＥＰ3 受容体のｃＤＮＡの３'−末端側の配列を決定した（表１および図３）。（１）で製造した２μｇのポリＡが付加されたＲＮＡをアダプターオリゴ（ｄＴ）１５プライミング：
【化１０】
５'−ＧＧＣＡＧＴＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３'
【００４１】
とスーパースクリプト・モロニー・ミューリン・ロイケミア・ウイルス（ Superscript Moloney Murine Leukemia Virus）の逆転写酵素（Life Technologies, Inc. 社製）を用いて逆転写した。各々の５'−末端の遺伝子に特異的なプライマーとして、次のプライマーを用いた。
【００４２】
１）ＥＰ3-V およびＥＰ3-VI受容体のｃＤＮＡ用として
【化１１】
５'−ＧＡＧＡＴＧＧＧＧＣＣＴＧＡＴＧＧＡＡＧ−３'、
【００４３】
２）ＥＰ3-I （ｐＥＰＲ−Ｉａ）受容体のｃＤＮＡ用として
【化１２】
５'−ＣＡＴＴＴＣＡＴＧＡＴＡＧＣＴＴＧＣ−３'、
【００４４】
３）ＥＰ3-I （ｐＥＰＲ−Ｉｂ）、ＥＰ3-III 、ＥＰ3-IVおよびＥＰ3f受容体のｃＤＮＡ用として
【化１３】
５'−ＣＡＣＡＧＡＡＡＣＡＣＣＣＡＣＣＴＣＣ−３'、
【００４５】
４）ＥＰ3-II受容体のｃＤＮＡ用として
【化１４】
５'−ＧＴＡＣＡＧＡＧＡＣＴＡＧＡＧＣＧＧＴＧ−３'、
【００４６】
５）ＥＰ3e受容体のｃＤＮＡ用として
【化１５】
５'−ＴＴＧＣＧＡＡＣＴＣＴＣＡＧＡＴＡＣＡＧ−３
を用いた（表１）。各遺伝子に特異的なセンスプライマーとアダプターオリゴヌクレオチド（３'−末端上の１３ｄＴヌクレオチドは除く）を用いてＰＣＲを行なった。
増幅は、まず、４℃で２分間変性した後、９４℃で３０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング、７２℃で１分間イクステンションの１サイクルを３５回行ない、そして最後に７２℃で１０分間イクステンションを行なった。
１）のＥＰ3-V およびＥＰ3-VI受容体のｃＤＮＡは、この一度のＰＣＲでそして、２）から５）の他のＥＰ3 受容体各異性体については、各々の反応の後、下流の各遺伝子に特異的なセンスプライマーとして、２）ＥＰ3-I （ｐＥＰＲ−Ｉａ）受容体のｃＤＮＡ用として
【化１６】
５'−ＣＴＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＣＴＴＡＡＴＴＧ−３'、
【００４７】
３）ＥＰ3-I （ｐＥＰＲ−Ｉｂ）、ＥＰ3-III 、ＥＰ3-IVおよびＥＰ3f受容体のｃＤＮＡ用として
【化１７】
５'−ＣＣＡＧＡＡＧＣＴＧＴＴＡＴＧＴＣＣＴＧ−３'、
【００４８】
４）ＥＰ3-II受容体のｃＤＮＡ用として
【化１８】
５'−ＣＣＡＴＡＣＡＴＡＴＧＴＣＴＡＡＴＣＡＧ−３'、
【００４９】
５）ＥＰ3e受容体のｃＤＮＡ用として
【化１９】
５'−ＡＴＡＡＣＴＡＣＡＧＧＡＧＴＧＣＴＧＴＧ−３'（表１）
【００５０】
およびアンチセンスアダプタープライマーを用いてさらにＰＣＲを行なった。増幅は、一度目のＰＣＲと同じ条件で行なった。３'−ＲＡＣＥ産物を 1.5％アガロースゲルで分析し、増幅させたＤＮＡをｐＣＲＴＭＩＩベクターにサブクローンした後、配列決定に供した。
【００５１】
（７）ＤＮＡ配列決定
核酸の塩基配列は、ダイデオキシ・ターミネーター・サイクル・シクエンシング・キット（DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit）（Applied Biosystems Inc. 製）を用いて決定した。配列に特異的なプライマーをモデル３８１Ａ ＤＮＡシンセサイゼー（Model 381A DNA synthesizer）（Applied Biosystems Inc. 製）を用いて合成した。新たに単離した２種類のｃＤＮＡ（ｐＥＰＲ−ＶおよびｐＥＰＲ−ＶＩ）の全長の塩基配列を、配列番号３および７に示す。また、転写解読枠より推定されるアミノ酸配列を配列番号１および５に示す。
【００５２】
実施例２：ＣＨＯ細胞による発現とリガンドとのバインディングアッセイ
（１）ＣＨＯ細胞による発現
ｐＥＰＲ−ＶおよびｐＥＰＲ−ＶＩのｃＤＮＡ（実施例１で得た。）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩインサートを真核細胞発現ベクターであるｐＲＣ／ＲＳＶ（Invitrogen社製）にサブクローンし、得られたプラスミドＤＮＡをデアエデキストラン（DEAE-dextran）法（Mol. Cell. Biol., 4, 1641 (1984)に記載）によって、ＣＨＯ細胞に形質転換した。形質転換したＣＨＯ細胞を８００μｇ／ｍｌ antibiotic G418 (GIBCO-BRL 社製）含有のＨａｍｓ Ｆ−１２培地 (ICN Biomedicals 社製）で７２時間培養し、回収した後、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5)、0.25Ｍショ糖、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび 0.1ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライドからなる溶液中、ポッタ−エルベジェム（Potter-Elvehjem)ホモジナイザーを用いて、ホモジネートした。ホモジネート液は、８００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を取り置き、今回得られた上清を、１００、０００×ｇで３０分間、再度遠心分離した。得られたペレットを懸濁バッファー（２０ｍＭ ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸一水和物、ｐＨ6.0 ）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 および１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に懸濁させてクルードな膜組織として用いた。
【００５３】
（２）リガンドとのバインディングアッセイ
［3Ｈ］ＰＧＥ2 とのバインディングアッセイは、以下のようにして行なった 。すなわち、クルードな膜組織、４０μｇ膜蛋白と種々の濃度（ 0.5−１６ｎＭ）の［５，６，８，１１，１２，１４，１５−3Ｈ］ＰＧＥ2 （１５４Ｃｉ／ｍ ｍｏｌ）（Du Pont-New England Nuclear 社製、Scatchard 分析用）または４ｎＭ ［3Ｈ］ＰＧＥ2 （置き換え実験用）を全ボリューム１００μｌとなるよう に懸濁バッファー中に懸濁させて、３０℃で１時間培養した。培養は、氷冷した洗浄バッファー（１０ｍＭ ＫＨ2 Ｏ4 、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 および１ｍＭ ＥＤＴＡ）２ｍｌを加えることにより終結させた。混合物をすばやくワットマン（Whatman ）ＧＦ／Ｃフィルターでろ過した。フィルターは、氷冷した洗浄バッファー２ｍｌで４回洗浄した後、フィルター上の放射活性を常法により測定した。
【００５４】
（３）結果
このアッセイの結果、ＰＧＥ受容体に対するリガンドである［3Ｈ］ＰＧＥ2 、はｐＥＰＲ−ＶおよびｐＥＰＲ−ＶＩを発現したＣＨＯ細胞の細胞膜に特異的に結合することがわかった。それぞれの結合飽和曲線を図４および図５に示す。また、この結合のScatchard 分析の結果をそれぞれ、図６および図７に示す。この結合の解離常数は、それぞれ、3.87および1.37ｎＭ、最大結合は、それぞれ、4402.3および989.2 ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白であった。さらに［3Ｈ］ＰＧＥ2 特異的結合に対する種々のプロスタノイドの阻害活性をそれぞれ、図８および図９に示す。種々のプロスタノイドによる阻害活性は、ＥＰ３−Ｖでは、ＰＧＥ2 ＝Ｍ＆Ｂ28767 （ＥＰ3 アゴニスト）＝ＰＧＥ1 ＞＞iloprost（ＰＧＩ2 アゴニスト）＞ＰＧＦ2a＞ＰＧＤ2 であり、ＥＰ3-VIでは、ＰＧＥ2 ＝Ｍ＆Ｂ28767 （ＥＰ3 アゴニスト）＝ＰＧＥ1 ＞＞iloprost（ＰＧＩ2 アゴニスト）＝ＰＧＦ2a＝ＰＧＤ2 であった。
【００５５】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒトＥＰ3 受容体遺伝子のうちの単離したＤＮＡ断片の構造配置であり、制限地図および配列決定方法の説明図である。λＨＥＰＲ１、２、３、４、５およびＨＥＰＣＲ１、２のサイズはそれぞれ、15.5、14.0、14.5、15.0、12.0、10.0および0.5 ｋｂである。エクソンは、黒塗りしたボックスで示した。→は、得られた配列の程度を示す。
【図２】 ヒトＥＰ3 受容体遺伝子の構造配置を示す。ヒトＥＰ3 受容体遺伝子のうち単離したＤＮＡ断片をヒトＥＰ3 受容体異性体のｃＤＮＡ配列にあわせて表示した。エクソンを黒塗りまたは点々をふったボックスで示した。エクソン２は、エクソン２ａ（黒塗り部分）とエクソン２ｂ（点々をふった部分）に分かれる。エクソン２の＊印は、選択的なスプライスドナー部位を示す。＃印は、ポリＡ付加部位を示す。
【図３】 ヒトＥＰ3 受容体遺伝子のエクソン（最上部）および選択的なｍＲＮＡスプライシング機構による本発明のＥＰ3-V およびＥＰ3-VI受容体を含む９種類のヒトＥＰ3 受容体異性体のｃＤＮＡのエクソンを示す。エクソンを黒塗りまたは白抜きのボックスで示した。白抜きのボックスは、すべての異性体に共通のエクソン部分であり、黒塗りしたボックスは、各異性体独自のエクソン部分である。高さが高いボックスは、翻訳領域を示し、低く圧縮したボックスは、非翻訳領域を示す。最上部に表示した遺伝子のエクソン２の＊印は、選択的なスプライスドナー部位を示す。＃印は、ポリＡ付加部位を示す。エクソン１および２ａのボックス中の白黒の縞模様は、膜貫通領域を示す。
【図４】 ［3Ｈ］ＰＧＥ2 の、ｐＥＰＲ−Ｖを発現したＣＨＯ細胞の細胞膜への特異的結合の飽和曲線を示す。
【図５】 ［3Ｈ］ＰＧＥ2 の、ｐＥＰＲ−ＶＩを発現したＣＨＯ細胞の細胞膜への特異的結合の飽和曲線を示す。
【図６】 ［3Ｈ］ＰＧＥ2 の、ｐＥＰＲ−Ｖを発現したＣＨＯ細胞の細胞膜への結合実験のScatchard 分析の結果を示す。
【図７】 ［3Ｈ］ＰＧＥ2 の、ｐＥＰＲ−ＶＩを発現したＣＨＯ細胞の細胞膜への結合実験のScatchard 分析の結果を示す。
【図８】 ［3Ｈ］ＰＧＥ2 の、ｐＥＰＲ−Ｖを発現したＣＨＯ細胞の細胞膜への結合に対する種々のリガンド（ＰＧＥ2 、Ｍ＆Ｂ28767 （ＥＰ3 アゴニスト）、ＰＧＥ1 、iloprost（安定なＰＧＩ2 アゴニスト）、ＰＧＦ2a、ＰＧＤ2 ）の阻害活性を示す。
【図９】 ［3Ｈ］ＰＧＥ2 の、ｐＥＰＲ−ＶＩを発現したＣＨＯ細胞の細胞膜への結合に対する種々のリガンド（ＰＧＥ2 、Ｍ＆Ｂ28767 （ＥＰ3 アゴニスト）、ＰＧＥ1 、iloprost（安定なＰＧＩ2 アゴニスト）、ＰＧＦ2a、ＰＧＤ2 ）の阻害活性を示す。
Claims (11)
- 配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
- 請求項１に記載されたポリペプチドをコードするＤＮＡ。
- 配列番号２で示される塩基配列を含む請求項２記載のＤＮＡ。
- 配列番号３で示される塩基配列を含む請求項２記載のＤＮＡ。
- 配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
- 請求項５に記載されたポリペプチドをコードするＤＮＡ。
- 配列番号６で示される塩基配列を含む請求項６記載のＤＮＡ。
- 配列番号７で示される塩基配列を含む請求項６記載のＤＮＡ。
- 請求項２から４あるいは６から８のいずれかの項に記載のＤＮＡからなる複製または発現ベクター。
- 請求項９記載の複製または発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
- 請求項１または５に記載されたポリペプチドを発現させるための条件下で請求項１０記載の宿主細胞を培養することからなる該ポリペプチドの製造方法。
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| JP29115096A JP3755555B2 (ja) | 1996-10-14 | 1996-10-14 | プロスタグランジンｅ２受容体、その製造方法、その受容体をコードするｄｎａ、そのｄｎａからなるベクターおよびそのベクターで形質転換された宿主細胞 |
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1996
- 1996-10-14 JP JP29115096A patent/JP3755555B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| JPH10113185A (ja) | 1998-05-06 |
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