ES2291047T3 - Factor de crecimiento del endotelio vascular-x. - Google Patents
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Abstract
Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido con dominio CUB que comprende la parte N-terminal de la proteína VEGF-X de la SEC ID Nº 2, y donde dicho polipéptido puede inhibir la estimulación de la proliferación de HUVEC inducida bien por VEGF o bFGF.
Description
Factor de crecimiento del endotelio
vascular-X.
La presente invención se refiere a un nuevo
factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) denominado en
este documento "VEGF-X", y a la caracterización
de las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de
VEGF-X.
La angiogénesis implica la formación y
proliferación de nuevos vasos sanguíneos, y es un proceso
fisiológico esencial para el crecimiento y el desarrollo normal de
tejidos, por ejemplo, en el desarrollo embrionario, la regeneración
tisular y la reparación de órganos y tejidos. La angiogénesis
también aparece en el crecimiento de cánceres humanos que requieren
una estimulación continua del crecimiento de vasos sanguíneos. La
angiogénesis anómala está asociada con otras enfermedades tales
como artritis reumatoide, psoriasis y retinopatía diabética.
Los vasos capilares constan de células
endoteliales que llevan la información genética necesaria para
proliferar y formar redes capilares. Las moléculas angiogénicas que
pueden iniciar este proceso se han caracterizado previamente. Un
mitógeno muy selectivo para las células del endotelio vascular es el
factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) (Ferrara y
cols., "Vascular Endotelial Growth Factor: Basic Biology and
Clinical Implications". Regulation of angiogenesis, por I.D.
Golberg y E.M. Rosen 1997 Birkhauser Verlag Basilea/Suiza). El VEGF
es una potente proteína vasoactiva que comprende un dímero catiónico
glicosilado de 46-49 kd que tiene dos subunidades
de 24 kd. Se inactiva por agentes reductores de sulfhidrilo y es
resistente al pH ácido y al calentamiento y se une a heparina
inmovilizada.
El VEGF-A tiene cuatro formas
diferentes de 121, 165, 189 y 206 aminoácidos respectivamente debido
al corte y empalme alternativo. VEGF121 y VEGF165 son solubles y
pueden promover la angiogénesis, mientras que VEGF189 y VEGF206 se
unen a heparina que contiene proteoglicanos en la superficie
celular. La expresión temporal y espacial de VEGF se ha
correlacionado con la proliferación fisiológica de los vasos
sanguíneos (Gajdusek, C.M., y Carbon, S.J., Cell Physiol.,
139:570-579, (1989); McNeil, P.L., Muthukrishnan,
L., Warder, E., D'Amore, P.A., J., Cell. Biol,
109:811-822, (1989)). Sus sitios de unión de alta
afinidad se localizan sólo en células endoteliales en secciones
titulares (Jakeman, L.B., y cols., Clin. Invest. 89:
244-253 (1989)). El factor de crecimiento puede
aislarse a partir de células de la pituitaria y varias líneas de
células tumorales, y se hay implicado en algunos gliomas humanos
(Plate, K.H. Nature 359: 845-848, (1992)). Se
demostró que la inhibición de la función de VEGF por anticuerpos
monoclonales anti-VEGF inhibía el crecimiento
tumoral en ratones inmunodeficientes (Kim, K. J., Nature 362:
841-844,
(1993)).
(1993)).
Se han descrito proteínas VEGF en las siguientes
patentes y solicitudes de patente, incorporándose todas ellas como
referencia en el presente documento: EP-0.506.477,
WO-95/24473, WO-98/28621,
WO-90/13649, EP-0.476.983,
EP-0.550.296, WO-90/13649,
WO-96/26736, WO-96/27007,
WO-98/49300, WO-98/36075,
WO-98/840124, WO-90/11084,
WO-98/24811, WO-98/10071,
WO-98/07832, WO-98/02543,
WO-97/05250, WO-91/02058,
WO-96/
39421, WO-96/39515 y WO-98/16551.
39421, WO-96/39515 y WO-98/16551.
Se descubrió que un nuevo miembro de la familia
VEGF conocido como VEGF-R en el documento
EP-0.984.063, como VEGF-D en el
documento WO-98/07832 y como VEGF-X
en la presente solicitud tiene ventajas potencialmente
significativas para el tratamiento de tumores y otras afecciones
mediadas por una actividad angiogénica inapropiada.
En la presente solicitud se proporciona la
secuencia de un dominio CUB presente en la secuencia de
VEGF-X, previniendo dicho dominio por sí mismo la
angiogénesis y usándose para tratar enfermedades asociadas con una
vascularización o angiogénesis inapropiada.
Los presentes inventores han identificado en la
secuencia que codifica la proteína VEGF-X un dominio
CUB, que hasta ahora no se había identificado previamente en
factores de crecimiento de tipo VEGF. Por lo tanto, la proteína
VEGF-X puede ejercer efectos reguladores dobles por
medio de la interacción con los receptores tirosina quinasa de VEGF
o con receptores conocidos como neuropilinas, mediados por el
dominio CUB. De esta manera, la secuencia que codifica dicho
dominio CUB puede incluirse en un vector de expresión para la
posterior transformación de una célula hospedadora, tejido u
organismo.
El VEGF-X o fragmentos del mismo
pueden modular los efectos de factores de crecimiento
pro-angiogénicos tales como VEGF, como se indica en
los descubrimientos presentados en los ejemplos que se proporcionan
más delante de que la parte N-terminal de la
proteína VEGF-X, un dominio de tipo CUB, puede
inhibir la proliferación de células HUVEC estimulada por VEGF. Por
lo tanto, el VEGF-X o fragmentos del mismo pueden
ser útiles en terapia de afecciones que implican una angiogénesis
inapropiada. La inhibición de la actividad angiogénica de VEGF se
ha asociado con la inhibición del crecimiento tumoral en varios
modelos, por ejemplo, Kim K. J. y cols., Nature
362:841-844, (1993). Además, sería de esperar que
los agentes que pueden inhibir la angiogénesis fueran útiles en el
tratamiento de otras enfermedades dependientes de la angiogénesis
tales como retinopatía, osteoartritis y psoriasis (Folkman, J.,
Nature Medicine 1: 27-31, (1995).
Como se identifica con más detalle en los
ejemplos descritos en este documento, los presentes inventores han
identificado que, sorprendentemente, el dominio CUB de
VEGF-X puede inhibir la estimulación de la
proliferación de células HUVEC inducida por VEGF o bFGF. Por lo
tanto, el dominio CUB puede utilizarse como agente terapéutico para
la inhibición de la angiogénesis y para el tratamiento de afecciones
asociadas con una vascularización o angiogénesis inapropiada.
Por lo tanto, de acuerdo con otro aspecto de la
invención se proporciona un método para inhibir la actividad
angiogénica y la vascularización inapropiada, incluyendo la
formación y proliferación de nuevos vasos sanguíneos, crecimiento y
desarrollo de tejidos, regeneración de tejidos y reparación de
órganos y tejidos en un sujeto, comprendiendo dicho método la
administración a dicho sujeto de una cantidad de un polipéptido que
tiene una secuencia de aminoácidos desde la posición 40 a la 150
del la secuencia ilustrada en la Figura 10 o una molécula de ácido
nucleico que codifica el dominio CUB de acuerdo con la invención, en
una concentración suficiente para reducir o prevenir dicha
actividad angiogénica.
Además, también se proporciona un método para
tratar o prevenir cualquiera de las siguientes afecciones: cáncer,
artritis reumatoide, psoriasis y retinopatía diabética,
comprendiendo dicho método administrar a dicho sujeto una cantidad
de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos desde la
posición 40 a la 150 de la secuencia ilustrada en la Figura 10 o
una molécula de ácido nucleico que codifica el dominio CUB de
acuerdo con la invención, en una concentración suficiente para
tratar o prevenir dichos trastornos.
El dominio CUB también puede usarse para
identificar compuestos que inhiben o aumentan la actividad
angiogénica, tal como una vascularización inapropiada, en un método
que comprende poner en contacto una célula que expresa un receptor
de VEGF y/o un receptor de tipo neuropilina 1 ó 2 con dicho
compuesto en presencia de una proteína VEGF-X de
acuerdo con la invención y controlar el efecto de dicho compuesto o
dicha célula en comparación con una célula que no se ha puesto en
contacto con dicho compuesto. Estos compuestos después pueden usarse
como apropiados para prevenir o inhibir la actividad angiogénica
para tratar los trastornos o afecciones descritas en este
documento, o en una composición farmacéutica. Un anticuerpo contra
dicho domino CUB también puede ser útil para identificar otras
proteínas que tienen dichas secuencias.
Este aspecto de la presente invención también se
proporciona una molécula de ácido nucleico tal como una molécula
antisentido que puede hibridar con las moléculas de ácido nucleico
de acuerdo con la invención en condiciones muy rigurosas, siendo
estas condiciones bien conocidas por los especialistas en la
técnica.
La rigurosidad de la hibridación, como se usa en
este documento, se refiere a condiciones bajo las cuales son
estables los ácidos polinucleicos. La estabilidad de los híbridos se
refleja en la temperatura de fusión (Tm) de los híbridos. La Tm
puede calcularse por la fórmula:
81,5^{o}C +
16,6 \ (log_{10}[Na^{+}] + 0,4l \ (%G&C) -
600/1
donde l es la longitud de los
híbridos en nucleótidos. La Tm se reduce aproximadamente
1-1,5ºC con cada reducción del 1% en la homologa de
las
secuencias.
El término "rigurosidad" se refiere a las
condiciones de hibridación donde un ácido nucleico monocatenario se
une con una cadena complementaria cuando las bases de purina o
pirimidina se emparejan con sus bases correspondientes por medio de
la formación de puentes de hidrógeno. Las condiciones de alta
rigurosidad favorecen el emparejamiento de bases homólogas,
mientras que las condiciones de baja rigurosidad favorecen el
emparejamiento de bases no homólogas.
Las condiciones de "baja rigurosidad"
comprenden, por ejemplo, una temperatura de aproximadamente 37ºC o
menor, una concentración de formamida menor de aproximadamente el
50%, y una concentración de sal de moderada a baja (SSC); o, como
alternativa, una temperatura de aproximadamente de 50ºC o menor, y
una concentración de sal de moderada a alta (sspe), por ejemplo
NaCl 1 M.
Las condiciones de "alta rigurosidad"
comprenden, por ejemplo, una temperatura de aproximadamente 42ºC o
menor, una concentración de formamida menor de aproximadamente un
20% y una concentración de sal baja (SSC); o, como alternativa, una
temperatura de aproximadamente 65ºC o menor, y una concentración de
sal baja (SSPE). Por ejemplo, las condiciones de alta rigurosidad
comprenden hibridación en NaHPO_{4} 0,5 M, dodecil sulfato sódico
(SDS) al 7%, EDTA 1 mM a 65ºC (Ausubel, F.M y cols., Current
Protocols in Molecular Biology, Vol. I, 1989; Green Inc. Nez
Cork, en 2.10.3)
"SSC" comprende una solución de hibridación
y lavado. Una solución madre 20X SSC contiene cloruro sódico 3 M y
citrato sódico 0,3 M, pH 7,0.
\newpage
"SSPE" comprende una solución de
hibridación y lavado. Una solución 1X SSPE contienen NaCl 180 mM,
Na_{2}HPO 9 mM, y EDTA 1 mM, pH 7,4.
El ácido nucleico capaz de hibridar con las
moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención generalmente
tendrá una homología de al menos un 70%, preferiblemente de al
menos un 80% o un 90%, y más preferiblemente de al menos un 95% con
las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención.
La molécula antisentido capaz de hibridar con el
ácido nucleico de acuerdo con la invención puede usarse como una
sonda o como un medicamento o puede incluirse en una composición
farmacéutica con un vehículo, diluyente o excipiente
farmacéuticamente aceptable para dicha molécula.
El término "homólogo" describe la relación
entre diferentes moléculas de ácido nucleico o secuencias de
aminoácido, donde dichas secuencias o moléculas se relacionan por
una identidad parcial o similitud en uno o más bloques o regiones
dentro de dichas moléculas o secuencias.
La presente invención también comprende dentro
de su alcance proteínas o polipéptidos codificados por las
moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención o un
equivalente funcional, derivado o bioprecursor del mismo.
Las moléculas de ADN de acuerdo con la
invención, ventajosamente, pueden incluirse en un vector de
expresión adecuado para expresar un dominio CUB codificado por
dichas moléculas en un hospedador adecuado. La incorporación del
ADN clonado en un vector de expresión adecuado para la posterior
transformación de dicha célula y la posterior selección de las
células transformadas es bien conocida para los especialistas en la
técnica como se proporciona en Sambrook y cols., (1989), molecular
cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory
Press.
Press.
Un vector de expresión de acuerdo con la
invención incluye un vector que tiene un ácido nucleico de acuerdo
con la invención unido operativamente a secuencias reguladoras,
tales como regiones promotoras, que pueden realizar la expresión de
dichos fragmentos de ADN. La expresión "unido operativamente"
se refiere a una yuxtaposición donde los componentes descritos
están en una relación que permite que funcionen de la forma deseada.
Estos vectores pueden utilizarse para transformar una célula
hospedadora adecuada para proporcionar la expresión de un
polipéptido de acuerdo con la invención. De esta manera, en un
aspecto adicional, la invención proporciona un proceso para prepara
polipéptidos de acuerdo con la invención que comprende cultivar una
célula hospedadora, transformada o transfectada con un vector de
expresión como se ha descrito anteriormente, en condiciones para
proporcionar la expresión por el vector de una secuencia codificante
que codifica los polipéptidos, y recuperar los polipéptidos
expresados.
Los vectores pueden ser, por ejemplo, plásmidos,
virus o vectores de fagos que disponen de un origen de replicación
y opcionalmente un promotor para la expresión de dicho nucleótido, y
opcionalmente un regulador del promotor.
Los vectores pueden contener uno o más
marcadores selectivos tales como, por ejemplo, resistencia a
ampicilina.
Los elementos reguladores requeridos para la
expresión incluyen secuencias promotoras que se unen a la ARN
polimerasa y secuencias de iniciación de la transcripción para la
unión de ribosomas. Por ejemplo, un vector de expresión bacteriano
puede incluir un promotor tal como el promotor lac y, para el inicio
de la traducción, la secuencia Shine-Dalgarno y el
codón de inicio AUG. De forma similar, un vector de expresión
eucariótico puede incluir un promotor heterólogo u homólogo para la
ARN polimerasa II, una señal de poliadenilación cadena abajo, el
codón de inicio AUG, y un codón de terminación para separar el
ribosoma. Estos vectores pueden obtenerse en el mercado o
ensamblarse a partir de las secuencias descritas por métodos bien
conocidos en la técnica.
Las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con
la invención pueden insertarse en los vectores descritos en
cualquier orientación antisentido para proporcionar la producción de
ARN antisentido. El ARN antisentido u otros ácidos nucleicos
antisentido pueden producirse por medios sintéticos.
De acuerdo con la presente invención, un ácido
nucleico definido incluye no sólo el ácido nucleico idéntico, sino
también cualquier variación de bases minoritaria incluyendo, en
particular, sustituciones en casos que tienen como resultado un
codón sinónimo (un codón diferente que especifica el mismo resto
aminoacídico) debido a la degeneración del código en sustituciones
de aminoácidos conservativas. La expresión "secuencia de ácido
nucleico" también incluye la secuencia complementaria a cualquier
secuencia monocatenaria dada con respecto a las variaciones de
bases.
La presente invención también proporciona
ventajosamente secuencias de ácido nucleico de al menos
aproximadamente diez nucleótidos contiguos de un ácido nucleico de
acuerdo con la invención y, preferiblemente, de 10 a 50
nucleótidos, incluso más preferiblemente la secuencia de ácido
nucleico comprende las secuencias ilustradas en la Figura 26.
Ventajosamente, estas secuencias pueden usarse como sondas o
cebadores para iniciar la replicación, o como elementos similares.
Estas secuencias de ácido nucleico pueden producirse de acuerdo con
técnicas bien conocidas en la técnica, tal como por medios
recombinantes o sintéticos. También pueden usarse en kits de
diagnóstico o similares para detectar la presencia de un ácido
nucleico de acuerdo con la invención. Estos ensayos generalmente
comprenden poner en contacto la sonda con la muestra en condiciones
de hibridación y detectar la presencia de cualquier dúplex o
tríplex formado entre la sonda y cualquiera ácido nucleico presente
en la muestra.
De acuerdo con la presente invención, estas
sondas pueden anclarse a un soporte sólido. Preferiblemente, están
presentes en una matriza de forma que múltiples sondas pueden
hibridar simultáneamente con una sola muestra biológica. Las sondas
pueden aplicarse puntualmente sobre la matriz o sintetizarse in
situ sobre la matriz. (Véase Lockhart y cols., Nature
Biotechnology, vol. 14, Diciembre de 1996 "Expression monitoring
by hybridisation to high density oligonucleotide arrays". Una
sola matriz puede contener más de 100, 500 o incluso 1.000 sondas
diferentes en localizaciones discretas.
Las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con
la invención pueden producirse usando medios recombinantes o
sintéticos tales como, por ejemplo, el uso de mecanismos de
clonación por PCR que generalmente implican la obtención de un par
de cebadores, que pueden tener de aproximadamente 10 a 50
nucleótidos correspondientes a una región del gen que se desea
clonar, la puesta en contacto de los cebadores con ARNm, ADNc o ADN
genómico de una célula humana, la realización de una reacción en
cadena de la polimerasa en condiciones que producen la
amplificación de la región deseada, el aislamiento del fragmento o
la región amplificada y la recuperación del ADN amplificado.
Generalmente, estas técnicas son bien conocidas en la técnica, tal
como se describe en Sambrook y cols. (Molecular Cloning: a
Laboratory Manual, 1989).
Los ácidos nucleicos u oligonucleótidos de
acuerdo con la invención pueden llevar un marcador de revelado. Los
marcadores adecuados incluyen radioisótopos tales como ^{32}P o
^{35}S, marcadores enzimáticos u otros marcadores proteicos tales
como biotina o marcadores fluorescentes. Estos marcadores pueden
añadirse a los ácidos nucleicos u oligonucleótidos de la invención
y pueden detectarse usando técnicas en sí conocidas.
Ventajosamente, pueden identificarse variantes
alélicas o polimorfismos humanos de la molécula de ADN de acuerdo
con la invención, por ejemplo, sondeando bibliotecas de ADNc o
genómicas de una serie de individuos, por ejemplo, de diferentes
poblaciones. Además, pueden usarse ácidos nucleicos y sondas de
acuerdo con la invención para secuenciar el ADN genómico de
pacientes usando métodos bien conocidos en la técnica, tales como el
método de terminación de cadena Dideoxy de Sanger, que
ventajosamente puede averiguar cualquier predisposición de un
paciente a ciertos trastornos asociados con un factor de crecimiento
de acuerdo con la invención.
La proteína de acuerdo con la invención incluye
todas las variantes de aminoácidos posibles codificadas por la
molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, incluyendo
un polipéptido codificado por dicha molécula y que tiene cambios de
aminoácidos conservativos. La sustitución de aminoácidos
conservativos se refiere al reemplazo de uno o más aminoácidos de
una proteína como se identifica en la Tabla 1. Las proteínas o
polipéptidos de acuerdo con la invención incluyen además variantes
de dichas secuencias, incluyendo variantes alélicas naturales que
son sustancialmente homólogas a dichas proteínas o polipéptidos. En
este contexto, homología sustancial se considera una secuencia que
tiene una homología de aminoácidos de al menos un 70%,
preferiblemente un 80 ó un 90% y preferiblemente un 95% con las
proteínas o polipéptidos codificados por las moléculas de ácido
nucleico de acuerdo con la invención. La proteína de acuerdo con la
invención puede ser recombinante, sintética o natural, pero
preferiblemente es recombinante.
El ácido nucleico o proteína de acuerdo con la
invención puede usarse como medicamento o en la preparación de un
medicamento para tratar cánceres u otras enfermedades o afecciones
asociadas con la expresión de la proteína
VEGF-X.
Ventajosamente, la molécula de ácido nucleico o
la proteína de acuerdo con la invención puede proporcionarse en una
composición farmacéutica junto con un vehículo, diluyente o
excipiente farmacéuticamente aceptable para dicha molécula.
Otro aspecto de la invención proporciona una
célula u organismo hospedador, transformado o transfectado con un
vector de expresión de acuerdo con la invención.
De acuerdo con otro aspecto de la invención,
también se proporciona una célula, tejido u organismo transgénico
que comprende un transgén capaz de expresar una proteína con un
dominio CUB de acuerdo con la invención. La expresión "transgén
con capacidad de expresión", como se usa en este documento,
significa una secuencia de ácido nucleico adecuada que lleva a la
expresión de proteínas que tienen la misma función y/o actividad. El
transgén puede incluir, por ejemplo, un ácido nucleico genómico
asilado a partir de células humanas o un ácido nucleico sintético,
incluyendo ADN integrado en el genoma o en un estado
extracromosómico. Preferiblemente, el transgén comprende la
secuencia de ácido nucleico que codifica las proteínas de acuerdo
con la invención como se describe en este documento.
Pueden prepararse, ventajosamente, anticuerpos
contra la proteína o polipéptido de la presente invención por
técnicas que se conocen en la técnica. Por ejemplo, pueden
prepararse anticuerpos policlonales por medio de la inoculación en
un animal hospedador, tal como un ratón o un conejo, del polipéptido
de acuerdo con la invención o un epítopo del mismo, y la
recuperación del suero inmune. Los anticuerpos monoclonales pueden
preparase de acuerdo con técnicas conocidas tales como las
descritas por Kohler R. y Milstein, C. Nature (1975) 256,
495-497. Ventajosamente, estos anticuerpos pueden
incluirse en un kit para identificar un polipéptido con dominio CUB
en una muestra, junto con medios para poner en contacto el
anticuerpo con la muestra.
La invención también proporciona además una
composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo junto con
un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable para
el mismo.
Las proteínas que interaccionan con el
polipéptido de la invención pueden identificarse investigando
interacciones de proteínas usando el sistema de vector doble
híbrido propuesto por primera vez por Chien y cols., (1991) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88: 9578-9582.
Esta técnica se basa en la reconstitución
funcional in vivo de un factor de transcripción que activa un
gen indicador. Mas particularmente, la técnica comprende
proporcionar una célula hospedadora apropiada con una construcción
de ADN que comprende un gen indicador bajo el control de un promotor
regulado por un factor de transcripción que tiene un dominio de
unión al ADN y un dominio de activación, expresar en la célula
hospedadora una primera secuencia de ADN hibrida que codifica una
primera fusión de un fragmento o una secuencia de ácido nucleico
entera de acuerdo con la invención y dicho dominio de unión al ADN o
dicho dominio de activación del factor de transcripción, expresar
en el hospedador al menos una segunda secuencia de ADN híbrido, tal
como una biblioteca o similar, que codifica supuestas proteínas de
unión a investigar junto con el dominio de unión al ADN o de
activación del factor de transcripción que no se incorpora en la
primera fusión; detectar cualquier unión de las proteínas a
investigar con una proteína de acuerdo con la invención detectando
la presencia de cualquier producto del gen indicador en la célula
hospedadora; y opcionalmente aislar las segundas secuencias de ADN
híbrido que codifican la proteína de unión.
Un ejemplo de esta técnica utiliza la proteína
GAL4 en levaduras. GAL4 es un activador de la transcripción del
metabolismo de la galactosa en levaduras y tiene un dominio separado
para la unión a activadores cadena arriba de los genes del
metabolismo de galactosa así como un dominio de unión a proteínas.
Pueden construirse vectores de nucleótidos, comprendiendo uno de
ellos los restos nucleotídicos que codifican el dominio de unión al
ADN de GAL4. Estos restos del dominio de unión pueden fusionarse a
una secuencia codificante de proteínas conocida tal como, por
ejemplo, los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención. El otro
vector comprende los restos que codifican el dominio de unión a
proteínas de GAL4. Estos restos se fusionan a restos que codifican
una proteína de ensayo. Cualquier interacción entre polipéptidos
codificados por el ácido nucleico de acuerdo con la invención y la
proteína a ensayar conduce a una activación de la transcripción de
una molécula indicadora en una célula de levadura deficiente en la
transcripción de GAL4 que se ha transformado con los vectores.
Preferiblemente, tras la restauración de la transcripción de los
genes del metabolismo de la galactosa en levaduras se activa una
molécula indicadora tal como
\beta-galactosidasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Los plásmidos anteriores se depositaron el las
Belgian Coordinate Collections of Microorganisms (BCCM) (Colecciones
Coordinadas de Microorganismos de Bélgica) en Laboratorium Voor
Moleculaire Biologie-Plasmidencollectie (LMBP)
B-9000, Ghent, Bélgica, de acuerdo con las
disposiciones del Tratado de Budapest del 28 de Abril de 1977.
La invención puede entenderse más claramente
haciendo referencia al ejemplo adjunto, que es simplemente
ilustrativo, y haciendo referencia a los dibujos adjuntos, en los
que:
La Figura 1: es una secuencia de ADN
identificada en la base de datos Incyte LifeSeq^{TM} que codifica
una nueva proteína VEGF-X.
La Figura 2: es una ilustración de la secuencia
de aminoácidos del ácido nucleico de la Figura 1.
La Figura 3: es una ilustración de secuencias de
cebadores de PCR utilizadas para identificar la proteína
VEGF-X de acuerdo con la invención.
La Figura 4: es una ilustración esquemática de
las relaciones espaciales de la secuencia de VEGF-X
de los clones identificados usando las secuencias de cebadores de
PCR de la Figura 3.
La Figura 5: es una ilustración de las
secuencias de nucleótidos de los cebadores 5' RACE usados para
identificar el extremo 5' de la fase de lectura abierta de
VEGF-X.
La Figura 6: es una ilustración de la secuencia
obtenida a partir del experimento RACE.
La Figura 7: es una ilustración de las
secuencias de nucleótidos obtenidas a partir de la búsqueda de la
base de datos LifeSeq^{TM} usando la secuencia de la Figura 6.
La Figura 8: es una ilustración de los cebadores
usados para clonar la secuencia codificante entera de
VEGF-X.
La Figura 9: es una ilustración de la secuencia
codificante entera de VEGF-X.
La Figura 10: es una ilustración de la secuencia
de aminoácidos prevista de la secuencia de nucleótidos de la Figura
9.
La Figura 11: es un alineamiento de la secuencia
de la Figura 10 con las secuencias de VEGF-A a
D.
La Figura 12: es una ilustración de secuencias
variantes de la proteína VEGF-X de acuerdo con la
invención.
La Figura 13: es una ilustración de los
cebadores oligonucleotídicos usados para la expresión en E.
coli de dominios de VEGF-X y para la expresión
de la secuencia de longitud completa de VEGF-X en un
sistema de expresión de baculovirus/células de insecto.
La Figura 14: representa secuencias de ácido
nucleico de 18 clones EST humanos obtenidos a partir de una búsqueda
BLAST de la base de datos LifeSeq^{TM} usada para identificar la
secuencia entera que codifica VEGF-X.
La Figura 15: representa las secuencias de
nucleótidos de 50 clones EST humanos obtenidos a partir de la base
de datos LifeSeq^{TM}
La Figura 16: es una ilustración de secuencias
de nucleótidos utilizadas como cebadores para identificar la
secuencia de nucleótidos que codifica VEGF-X.
La Figura 17: es una secuencia de nucleótidos
que codifica una proteína VEGF-X parcial de acuerdo
con la invención.
La figura 18: es una ilustración de una
secuencia de nucleótidos parcial que codifica la proteína
VEGF-X de acuerdo con la invención.
La Figura 19: es una ilustración de una
secuencia de ADN y polipeptídica usada para la expresión en células
de mamífero de VEGF-X. La secuencia señal prevista
de VEGF-X está en minúsculas. El epítopo V5
C-terminal y las secuencias His6 están
subrayadas.
La Figura 20: es una ilustración de una
secuencia de ADN y polipeptídica usada para la expresión en
baculovirus/células de insecto de VEGF-X. En la
secuencia polipeptídica, la secuencia señal se muestra en
minúsculas. La señal de péptido N-terminal añadida
a la secuencia de VEGF-X madura prevista está
subrayada.
La Figura 21: es una ilustración de una
secuencia de ADN y polipeptídica usada para la expresión en E.
coli de VEGF-X. Las secuencias polipeptídicas
en los extremos N y C derivados de la fusión MBP y la señal His6
respectivamente están subrayadas.
La Figura 22: ilustra la dimerización por
enlaces disulfuro de VEGF-X. Se analizaron muestras
de proteínas por SDS-PAGE. Antes de cargar el gel,
las muestras se calentaron 95ºC durante 5 minutos en tampón de
muestra en presencia de (+) o ausencia (-) de agente reductor. (A)
Muestras de la expresión en células COS de una construcción con
señal de péptido V5/His6 C-terminal. El panel de la
izquierda es medio acondicionado total, el panel de la derecha es
material purificado en resina de níquel-agarosa. El
monómero reducido y el supuesto dímero no reducido unido con
enlaces disulfuro están indicados por flechas. Parece haber una
proteolisis de la proteína durante la purificación. Los geles se
transfirieron en membranas de nylon y la proteína se detectó con un
anticuerpo monoclonal anti-V5. (B) Muestras de
expresión en E. coli de una construcción de fusión doble de
proteína de unión a maltosa/His6. M indica los marcadores de peso
molecular (Benchmark, LifeTechnologies). El gen se tiñó con azul de
Coomassie por procedimientos convencionales. La proteína de fusión
tiene un peso molecular aparente de 80 kDA.
\newpage
La Figura 23: ilustra la glicosilación de
VEGF-X. VEGF-X se purificó a partir
del sobrenadante de cultivo de células COS transfectadas con la
construcción pcDNA6/V5-His. Los sobrenadantes se
recogieron 72 horas después de la transfección y se purificaron en
resina de níquel. Las muestras después se trataron con EndoH (+) o
no se trataron (-) antes de la SDS-PAGE y
transferencia, como se describe en la leyenda de la Figura 22.
La Figura 24: es una ilustración de la secuencia
de ADN y polipeptídica usada para la expresión en E. coli
del domino de tipo VEGF de VEGF-X. La secuencias
polipeptídicas en el extremo N de la proteína derivada del vector
están subrayadas.
La Figura 25: muestra la expresión del dominio
VEGF de VEGF-X en E. coli. Calle
1-10 \mul de marcador de amplio intervalo (New
England Biolabs), calle 2-10 \mul de muestra no
reducida, calle 3-10 \mul de muestra reducida. La
proteína con el dominio PDGF reducido (calle 3) tiene un peso
molecular aparente de 19 kDa por SDS-PAGE.
La Figura 26: ilustra una secuencia de ADN y
polipeptídica usada para la expresión en E. coli del dominio
de tipo CUB de VEGF-X. La secuencia polipeptídica en
el extremo N procedente de la señal codificada por el vector y la
señal His6 introducida están subrayadas.
La Figura 27: muestra la expresión del dominio
CUB de VEGF-X en E. coli. La proteína con el
dominio CUB se purificó en resina de quelato de níquel. La proteína
migra a aproximadamente 23 kDa en SDS-PAGE.
La Figura 28: ilustra el efecto de
VEGF-X truncado (domino CUB) sobre la proliferación
de células HUVEC. (A) Células endoteliales de vena umbilical humana
(tratamiento de un día). (B) Células endoteliales de vena umbilical
humana (privación de 24 horas seguido de tratamiento de un día). (C)
Efecto de VEGF-A_{165} y dominio CUB de
VEGF-X sobre la proliferación de células HUVEC
(tratamiento de dos días).
La Figura 29: representa la distribución tisular
del ARNm de VEGF-X analizado por transferencia de
Northern y RT-PCR en (A) tejidos normales y (B)
líneas celulares y tejido tumoral.
La Figura 30: representa la estructura parcial
de intrones/exones del gen VEGF-X. (A) Secuencias de
ADN genómico de 2 exones determinadas por secuenciación; la
secuencia del exón está en letras mayúsculas, la secuencia del
intrón está letras minúsculas. (B) Muestra la localización de sitios
de corte y empalme dentro de la secuencia de ADNc de
VEGF-X. La localización de los sucesos de corte y
empalme de ARNm esta indicada por líneas verticales. El sitio
donador/aceptor de corte y empalme críptico en el nt. 998/999
(líneas diagonales) da lugar a las formas variantes de corte y
empalme de VEGF-X. No se proporciona información del
sitio de corte y empalme para la región mostrada en cursiva.
La Figura 31: es una representación gráfica del
efecto de FL-VEGF-X sobre la
proliferación de células HUVEC: (privación de suero de 24 horas
seguido de tratamiento de un día).
La Figura 32: es una representación gráfica del
efecto combinado de VEGF-X truncado (dominio CUB) y
VEGF_{165} recombinante humano sobre la proliferación de células
HUVEC: (privación de suero de 24 horas seguido de dos días de
tratamiento).
La Figura 33: es una representación gráfica del
efecto combinado del dominio CUB y bFGF recombinante humana sobre
la proliferación de células HUVEC: (privación de suero de 24 horas
seguido de dos días de tratamiento).
La Figura 34: es una representación gráfica de
los resultados de un ensayo de LDH para ensayar la citotoxicidad
del dominio CUB o del dominio CUB con rhVEGF_{165}.
La Figura 35: es una representación gráfica de
los resultados obtenidos a partir de un ensayo de LDH para ensayar
la citotoxicidad del dominio CUB o el dominio CUB con
rh-bFGF.
Se realizo una búsqueda BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool; Altschul y cols., 1990 J. Mol. Biol. 215,
403-410) en la base de datos EST humana
LifeSeq^{TM} patentada (Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo alto,
CA, USA). BLAST produce alineamientos de secuencias de nucleótidos y
aminoácidos para determinar las similitudes de secuencias. Debido a
la naturaleza local de los alineamientos, BLAST es especialmente
útil para determinar emparejamientos exactos o para identificar
homólogos. Aunque es útil para emparejamientos que no contienen
huecos, es poco apropiado para realizar una búsqueda de tipo de
motivos. La unidad fundamental del resultado del algoritmo BLAST es
el par de segmentos de alta puntuación (HSP).
Se identificaron dieciocho clones humanos EST
(Figura 14) con alta similitud con las proteínas VEGF identificadas
previamente y además se identificaron cincuenta clones EST (Figura
15) usando estas secuencias como secuencias problema (query),
permitiendo deducir la supuesta secuencia para la nueva proteína
VEGF-X. Las secuencias obtenidas se compararon con
secuencias conocidas para determinar regiones de homología y para
identificar la secuencia como una nueva proteína de tipo VEGF.
Usando la información de secuencia de ADN en las bases de datos, se
pudieron preparar cebadores adecuados que tenían las secuencias de
VEGF-X 1-10 ilustradas en la Figura
3 para uso en los posteriores experimentos RACE para obtener la
secuencia de ADN completa para el gen de
VEGF-X.
Se creó un perfil basándose en el dominio de
tipo VEGF en secuencias de VEGF existentes (VEGF-A,
B, C y D). Este perfil se usó para investigar las bases de datos
públicas y la base de datos Incyte LifeSeq^{TM}. No se encontró
ninguna nueva secuencia correspondiente significativa en las bases
de datos públicas. Todas las secuencias correspondientes
encontradas en la base de datos LifeSeq^{TM} (\sim1000) se
ensamblaron proporcionando un número más pequeño de secuencias
(\sim30), que incluían los VEGF conocidos y un nuevo VEGF
potencial (Figuras 1 y 2). Está secuencia se denominó
VEGF-X.
Se diseñaron oligonucleótidos para amplificar la
secuencia de VEGF-X a partir del ADNc (Figura 3).
Los EST encontrados en LifeSeq^{TM} procedían de una serie de
tejidos, con una ligera predominancia de secuencias de ovario,
testículos, placenta y pulmón (Figuras 14 y 15). Por consiguiente,
los oligonucleótidos se usaron para amplificar el ADNc derivado de
pulmón y placenta. Se encontraron productos de PCR de primera vuelta
con tamaños \sim200 pb mayores que los esperados, mientras que
después de una segunda vuelta de amplificación por PCR aparecieron
tres especies principales, de las que la más pequeña tenía el tamaño
esperado. Estos fragmentos se clonaron y secuenciaron. El fragmento
más pequeño efectivamente tenía la secuencia identificada
originalmente en la base de datos LifeSeq^{TM}, mientras que los
otros contenían inserciones (Figura 4).
Como la primera vuelta de amplificación sugirió
que la especie principal encontrada en el ADNc de ovario y placenta
no era la identificada originalmente en la base de datos
LifeSeq^{TM}, el objetivo de los esfuerzos cambió a las supuestas
especies principales (parecía probable que los clones 57,
25-27 y los clones de 2,1 kb 1-3 de
la Fig. 4 representaran las especies de ARNm principales). La
traducción conceptual de las secuencias de ADN de estos fragmentos
de PCR clonados indicó que la fase de lectura abierta completa no
estaba presente en los clones o en la secuencia de LifeSeq^{TM}.
Mientras que todos los clones contenían la misma secuencia en la
sección del codón de terminación de la traducción, que indicaba que
se había identificado el extremo de la fase de lectura abierta, no
se había clonado el extremo 5' de la fase de lectura abierta. Por lo
tanto, se realizaron experimentos 5' RACE para encontrar el inicio
de la fase de lectura. En la Figura 5 se muestran cebadores de PCR
diseñados para experimentos RACE. Los productos de PCR de RACE se
secuenciaron directamente. Pudo obtenerse una secuencia a partir
del extremo 3' de estos productos de RACE, pero no a partir del
extremo 5'; probablemente porque los productos no se clonaron y por
lo tanto eran heterogéneos en el extremo 5'. Esta nueva secuencia
se ensambló con la secuencia clonada existente para dar la secuencia
mostrada en la Figura 6. La búsqueda en la base de datos
LifeSeq^{TM} con esta secuencia identifica EST que extienden la
secuencia 140 pb adicionales en la dirección 5' y 160 pb
adicionales en la dirección 3' (Figura 7). Este contig más largo se
usó para diseñar cebadores oligonucleotídicos para amplificar la
secuencia codificante entera (estas recuentas cebadoras se muestran
en la Figura 8). La PCR se realizó usando los cebadores
5'-1 y vegfX10 (par clonar un ADNc de "longitud
completa"), y con cebadores 5'-1 vegfX6 (para
clonar la región codificante entera, véanse las secuencias de
vegfX10 y vegfX6 de la Figura 3). Para el fragmento más corto se
obtuvieron varios clones, de los que los clones 4 y 7 no contienen
errores de PCR (secuencia de los clones 4 y 7 en la Figura 9). Se
obtuvo un solo clon para el fragmento más largo (clon 9), pero esta
secuencia parece contener 2 errores de PCR.
En la Figura 10 se muestra el polipéptido
previsto de estos contig más largos. Se predice que los aminoácidos
1-22 codifican una secuencia señal (von Heijne,
1986, Nucleic Acids Res. 14, 4683-4690). La
Figura 11 muestra un alineamiento de la secuencia de la proteína
con los VEGF A-D. La región homóloga a los otros
VEGF está localizada hacia el extremo C de la proteína. Como es de
esperar que el dominio de homología de VEGF pertenezca a la
superfamilia de factores de crecimiento TGF-beta y
comprenda un dímero que contiene enlaces disulfuro tanto intra-
como intermoleculares, los alineamientos iniciales se centraron en
las cisteínas. Sin embargo, la localización en el mapa de la
secuencia sobre la estructura de rayos-x conocida
del dominio de unión al receptor de VEGF-A (Muller
et al (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94,
7192-7197) sugiere que es posible el alineamiento
de la Figura 11, ya que los cuatro restos de cisteína extra dentro
de la región de homología con VEGF de VEGF-X (en
comparación con esta región de VEGF-A) corresponden
a restos que están espacialmente próximos en
VEGF-A, y por lo tanto pueden formar enlaces
disulfuro.
Una búsqueda en la base de datos PFAM de
dominios de proteínas con la secuencia polipeptídica de longitud
completa de la Figura 10 identifica dos secuencias consenso de
dominio dentro del polipéptido. El dominio más
C-terminal es un domino de tipo "VEGF": (todos
los VEGF conocidos contienen este dominio y la estructura de esta
región de VEGF-A es similar a la de PDGF). Además,
hacia el extremo N del polipéptido hay un dominio CUB (aminoácidos
\sim40-150). El dominio CUB es un dominio
extracelular de 100-110 aminoácidos que se encuentra
en varias proteínas reguladas durante el desarrollo. Cuando se usa
la proteína de longitud completa para investigar las bases de datos
de proteínas usando el algoritmo BLAST 2, las puntuaciones para las
correspondencias con las proteínas que contienen el dominio CUB son
más significativas que las de los otros VEGF. De manera interesante,
las correspondencias más significativas son con los dominios CUB de
neuropilinas, y la neuropilina-1 se identificó
recientemente como un receptor de una de las isoformas del
VEGF-A, VEGF-A_{165} (Soker y
cols. (1998) Cell 92, 735-745).
Suponiendo que las secuencias variantes aisladas
por PCR (es decir, los fragmentos de PCR más pequeños) usan el
mismo sitio de inicio de la traducción que la secuencia de longitud
completa, darían como resultado la producción de las proteínas
variantes mostradas en la Figura 12. Puede ser significativo que
estas dos proteínas variantes retengan el dominio CUB y delecionen
todo o parte del dominio de tipo VEGF. La producción de estas
secuencias variantes puede explicarse por el uso de un sitio
donador/aceptor de corte y empalme críptico dentro de la secuencia
VEGF-X (Figura 30 B, entre las posiciones nt. 998 y
999): una variante se produce por corte y empalme de la región
entre las posiciones nt. 729 y 998, y la otra por corte y empalme
entre la región entre las posiciones nt. 999 y 1187.
Se usó el clon 4 que contenía la CDS completa de
VEGF-X (véase la Figura 9), para generar
construcciones para la expresión de la proteína de longitud
completa. La secuencia se amplificó por PCR y se clonó en el vector
pCDNA/V5-His para añadir una señal de epítopo V5
C-terminal y una señal His_{6}. La secuencia de
ADN y polipeptídica en este vector se muestra en la Figura 19. La
expresión transitoria en células COS seguida de transferencia de
Western y detección a través de un mAb anti-V5
demuestra la secreción de una proteína de \sim50 K en el medio
sólo de las células transfectadas (Figura 22). Esta construcción
también puede usarse para generar líneas celulares CHO estables que
expresan VEGF-X.
Para la expresión en el sistema de
baculovirus/células de insecto, el ADN que codificaba la secuencia
polipeptídica de VEGF-X madura prevista se fusionó
a una secuencia que codificaba una señal derivada de melitina, una
proteína de insecto secretada. También se añadió una señal 6His
N-terminal para facilitar la purificación. El
inserto después se clonó en el vector de expresión de baculovirus
pFASTBAC. La secuencia de ADN y polipeptídica de esta construcción
se muestra en la Figura 20. La infección de células de
Trichoplusia ni Hi5 con este baculovirus recombinante
produce la secreción de una proteína de aproximadamente 45 K en el
medio (datos no mostrados).
La región codificante de VEGF-X
se ha clonado de una diversidad de formas para la expresión como una
proteína secretada en E. coli. Un clon de expresión
particularmente útil lleva una fusión N-terminal en
la proteína de unión a maltosa de E. coli (MBP- derivada del
vector de expresión pMAL-p2, New England Biolabs) y
una fusión C-terminal con una señal 6His. La
secuencia de ADN y polipeptídica de este vector se muestra en la
Figura 21. La purificación secuencial de fracciones celulares en
resina Ni-NTA y resina de amilosa permite el
aislamiento de la proteína expresada (véase la Figura 22B).
El dominio VEGF de VEGF-X se ha
expresado en E. coli. Se ha demostrado que dominios similares
de VEGF-A (Christinger y cols. (1996) PROTEINS:
Function and Genetics 26, 353-357) y
VEGF-D (Achen et al (1998) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 95, 548-553) son capaces de
unirse a los receptores respectivos. La expresión de estos dominios
se realizó usando la bacteria E. coli. Además, la proteína de
longitud completa se expresó usando el sistema de expresión en
baculovirus/células de insecto. Los cebadores oligonucleotídicos que
se han obtenido para estos experimentos se muestran en la Figura
13. La construcción dirigió la expresión en el citoplasma
bacteriano y, como era de esperar, la proteína se produjo en forma
insoluble en cuerpos de inclusión (la secuencia de ADN y
polipeptídica usada para la expresión del dominio PDGF se muestra en
la Figura 24). Los cuerpos de inclusión se lavaron, se
solubilizaron con urea y la proteína se purificó usando condiciones
desnaturalizantes, antes del replegamiento por diálisis para retirar
la urea. Se obtuvo proteína soluble, pero muestra pocos indicios de
los dímeros unidos por enlaces disulfuro vistos con el material
obtenido a partir de células animales (Figura 25, en comparación
con la Figura 22A y B). Por lo tanto, no está claro si esta
proteína está plegada correctamente.
El dominio CUB se ha expresado como una proteína
secretada soluble en E. coli (Figura 26). La proteína se
purificó por unión a la resina Ni-NTA (Figura 27) y
se ensayó con respecto a la actividad en células HUVEC en un ensayo
de proliferación in vitro.
El sistema de expresión de células de mamífero
transitorio descrito anteriormente se ha usado para generar la
proteína VEGF-X de longitud completa como se muestra
por la detección de anticuerpos después de una transferencia de
Western (véase la Figura 22A).
Los otros miembros de la familia PDGF de
factores de crecimiento, los PDGF y VEGF, existen como dímeros en
los que los dos monómeros que constituyen el dímero están unidos por
enlaces disulfuro intercatenarios. Se conocen las estructuras de
rayos-x de PDGF-BB (Oefner et
al, 1992) y VEGF-A (Muller et al, 1997) e
indican que al menos estos dos miembros de la familia contienen dos
enlaces disulfuro intercatenarios. Prácticamente esto significa que
en el análisis de SDS-PAGE de estos factores de
crecimiento, la presencia de enlaces disulfuro intercatenarios se
demuestra por una gran reducción en la movilidad en ausencia de
agente reductor (es decir, el dímero no reducido migra más
lentamente a través del gel que el monómero reducido). Este efecto
también se esperaba para VEGF-X y se ha demostrado
para el material obtenido a partir de la expresión transitoria en
células de mamífero (Figura 22A). En el caso del material de
longitud completa producido en E. coli, sólo aproximadamente
un 10% de la proteína VEGF-X total parece estar
presente en forma de dímeros unidos por enlaces disulfuro (Figura
22B). Sin embargo, estos resultados proporcionan indicios de que la
proteína derivada de células de mamífero está plegada
correctamente, y de que también lo está una parte de la proteína
derivada de E. coli.
Hay tres sitios de glicosilación unidos a N
potenciales previstos dentro de la proteína VEGF-X:
en los restos 25, 55 y 254 de la secuencia polipeptídica. La masa
molecular prevista de la proteína VEGF-X madura es
40 kDa, pero el análisis por SDS-PAGE y
transferencia de Western (detección a través de una señal de epítopo
C-terminal introducida, véase la Figura 19) de la
proteína de longitud completa expresada en células COS proporciona
una banda con un tamaño ligeramente mayor que el esperado
(45-50 kDa) así como una a 25 kDa (Figura 22A). Se
supone que esta banda más pequeña es un fragmento de proteolisis
C-terminal derivado de la molécula de longitud
completa (los controles procedentes de células no infectadas no
muestran esta banda), que probablemente corresponde a una escisión
entre los dominios CUB y VEGF. El tratamiento con EndoH de la
preparación proporciona un ligero cambio de movilidad para la
proteína de longitud completa (Figura 23), pero para el fragmento
del dominio VEGF más pequeño hay un claro cambio, que indica que el
sito de glicosilación previsto dentro del dominio de VEGF en el
resto 254 está efectivamente glicosilado.
Se ensayaron muestras de proteína con respecto a
la actividad en ensayos de proliferación celular, migración celular
y angiogénesis in-vitro. También pueden
ensayarse muestras activas en el modelo de angiogénesis en ratón de
Matrigel in vivo.
El medio acondicionado derivado de células COS
que expresan transitoriamente VEGF-X (véase la
Figura 22A) no presentó ninguna actividad detectable en ninguno de
los ensayos. Sin embargo, como la proteína VEGF-X
sólo pudo detectarse en esta preparación por transferencia de
Western, y no por tinción de los geles con Coomassie, está
claramente presente a niveles muy bajos y ésta puede ser la razón de
la ausencia observada de actividad en los ensayos de proliferación
celular, migración o angiogénesis in vitro.
La proteína con dominio de VEGF descrita
anteriormente se ha ensayado en ensayos de proliferación celular
(en una diversidad de tipos celulares), migración celular y
angiogénesis in vitro y no ha podido demostrar actividad en
ninguno de estos ensayos. Como se ha sugerido anteriormente, esto
puede deberse a un plegamiento incorrecto de esta proteína.
La proteína con el dominio CUB a la mayor dosis
ensayada (1 \mug/ml) parece inhibir la proliferación de células
HUVEC en ausencia de otra estimulación (Figura 28A y B). Este efecto
también se observa después de la estimulación con la menor dosis de
VEGF-A_{165} ensayada (1 ng/ml - Figura 28C). El
dominio CUB de VEGF-X, por lo tanto, parece mostrar
actividad antiproliferativa en HUVEC, incluso en presencia de bajas
dosis de VEGF-A_{165}.
Se ha demostrado que la expresión de ARNm de
VEGF-A está regulada positivamente en una amplia
diversidad de tumores humanos (pulmón, mama, ovario, colon,
estómago, hígado, páncreas, riñón, vejiga y próstata- Takahashi
et al, 1995). Se ha demostrado que la expresión de
VEGF-A en tumor se correlaciona con la velocidad de
crecimiento del tumor, la densidad microvascular y la metástasis
tumoral (Takahashi et al, 1995). De esta manera, era
interesante examinar los patrones de expresión de ARNm de
VEGF-X. Por consiguiente, se han realizado análisis
de transferencia de Northern de ARNm derivado de diferentes tejidos.
Los resultados indican que aunque el ARNm de VEGF-X
se expresa a bajos niveles, está presente en una amplia serie de
tejidos. La amplificación por PCR del ADNc de una serie de fuentes
de tejido confirma esta idea (Figura 29A). La mayor especie de ARNm
tiene un tamaño de aproximadamente 3,1 kb. No se ha observado
ninguna regulación positiva significativa en las líneas de células
tumorales o en los tejidos tumorales ensayados (Figura 29B), con la
posible excepción de las líneas celulares GI-117
(carcinoma de pulmón) y SaOS-2 (osteosarcoma). Los
resultados de estos estudios de distribución tisular iniciales, por
lo tanto, no proporcionan indicios de regulación positiva de
VEGF-X en el crecimiento tumoral, como se ve con
VEGF-A.
Se aisló un clon BAC genómico que cubría la
parte 3' del locus de VEGF-X por selección con
hibridación de filtros de nylon que contenían una biblioteca BAC
humana. La secuenciación directa de este clon usando cebadores
oligonucleotídicos basados en la secuencia de ADNc de
VEGF-X permitió la determinación de varios límites
intrón/exón (Figura 30). De manera interesante, la posición del
sitio de corte y empalme del ARNm dentro del dominio PDGF (nt.
1187/1188 en la Figura 30B) está conservada con respecto a las de
los genes de VEGF-A y VEGF-D
(Tischer et al, 1991; Rocchigiani et al, 1998).
Todos los cebadores se adquirieron en
Eurogentec, Seraing, Bélgica. Los cebadores de secuenciación con
especificidad de inserto (de 15 y 16 unidades) se diseñaron por
inspección visual de las secuencias de ADN. El ADN se preparó en
columnas Qiagen-tip-20 o en columnas
giratorias Qiaquick (Qiagen GmbH, Düsseldorf, Alemania) y se
recuperó de las columnas giratorias en 30 \mul de tampón
Tris/EDTA (TrisHCl 10 mM pH 7,5, EDTA (sal sódica) 1 mM). Las
reacciones de secuenciación se realizaron usando kits BigDye^{TM}
Terminador Cycle Sequencing Ready Reaction (Perkin Elmer, ABI
Division, Foster City, CA, USA) y se procesaron en un secuenciador
de ADN Applied Biosystems 377 (Perkin Elmer, ABI Division, Foster
City, CA, USA). Las reacciones en cadena de la polimerasa se
realizaron de acuerdo con procedimientos convencionales (Ausubel
et al, 1997). Los fragmentos de PCR se clonaron en vectores
pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA. USA) o pCR-TOPO
(Invitrogen, NL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Uno de estos vectores, el plásmido VEGFX/pCR2.1 1TOPO FL se depositó
el 1 de marzo de 1999 con el número de acceso LMBP 3925. Después de
la determinación de la secuencia, los insertos se clonaron en los
vectores de expresión deseados (véanse las Figuras 19, 20, 21, 24 y
26).
Se investigó una biblioteca genómica BAC humana
(Genome Systems, Inc., St Louis, MI, USA) por hibridación con
oligonucleótidos derivados de la secuencia de ADNc de
VEGF-X, de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Se preparó ADN de BAC usando un kit Plasmad Midi de
Qiagen (Qiagen GMBH, Düsseldorf, Alemania) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante con algunas modificaciones (después de
aclarar el lisado de ADN cromosómico, se reunieron sobrenadantes de
preparaciones individuales en una sola columna (tip 100), y después
del lavado con EtOH al 70%, el sedimento se resuspendió durante una
noche a 4ºC en 100 \mul de TE). Se diseñaron cebadores de
secuenciación de 20 unidades basándose en la secuencia de ADNc
conocida y la secuenciación se realizó como se ha descrito
anteriormente.
Para extender el clon de ADNc en una dirección
5', se realizaron reacciones RACE. Como se sabía que el ARNm está
presente en placenta y músculo esquelético, se adquirieron ADNc de
placenta y músculo esquelético Marathon-Ready^{tm}
en Clontech (Palo Alto CA, USA) y se usaron de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Se escindieron fragmentos de ADN de
geles de agarosa, se purificaron usando columnas de purificación de
PCR QiaQuick (Qiagen GmbH, Düsseldorf, Alemania), y se secuenciaron
directamente.
Se amplificaron fragmentos de ADN que
codificaban las secuencias proteicas deseadas por PCR y se clonaron
en sistemas de vectores de expresión apropiados.
Para la expresión en células de mamífero, la
secuencia codificante completa se clonó en el vector
pcDNA6/V5-his (Invetrogen Leek, NL, véase la
secuencia de la construcción en la Figura 19), para añadir una señal
de péptido C-terminal para ayudar a la detección y
la purificación.
Para la expresión en células de insecto, la
secuencia del polipéptido maduro previsto se amplificó inicialmente
para añadir un péptido 6His N-terminal y después se
clonó en el vector pMelBacB (Invitrogen, Leek, NL) para añadir una
secuencia señal de célula de insecto. El insecto entero después se
clonó por PCR en el vector pFASTBAC-1
(LifeTechnologies, Gaithersburg, MA, USA) para la construcción de un
baculovirus de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Para la expresión en E. coli, la región
codificante se amplificó por PCR para añadir una señal 6His
C-terminal y después se clonó en el vector
pMAL-p2 (New England Biolabs, Beverly, MA, USA). La
secuencia codificante de esta construcción se muestra en la Figura
21. La proteína se purificó primero en resina Ni-NTA
(Qiagen GmbH, Düsseldorf, Alemania) y después en resina de amilosa
(New England Biolabs, Beverly, MA, USA), de acuerdo con las
instrucciones de los fabricantes.
Las secuencias de ADN que codificaban los
fragmentos del dominio CUB y VEGF de VEGF-X se
amplificaron por PCR y se clonaron en pET22b y pET21a (Novagen,
Madison, WI, USA) respectivamente. La proteína con el dominio CUB
se preparó a partir del periplasma o medio de cultivos inducidos por
métodos convencionales (Ausubel et al, 1997). La proteína
inicialmente se purificó por precipitación con sulfato amónico al
20%. Después de una diálisis de una noche frente a Tris HCl 20 mM,
pH 7,5, NaCl 100 mM para retirar el sulfato amónico, la proteína se
purificó adicionalmente en resina Ni-NTA como se ha
descrito anteriormente. La proteína con el dominio de VEGF se
expresó en una forma insoluble y la preparación de los cuerpos de
inclusión se realizó usando procedimientos convencionales (Ausubel
et al, 1997). Los cuerpos de inclusión se disolvieron en
clorhidrato de guanidina 6 M, Tris HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl 200 mM,
2-mercaptoetanol 1 mM, y se purificó en resina
Ni-NTA (Qiagen GMBH, Düsseldorf, Alemania) de
acuerdo con las intrusiones del fabricante. La proteína se replegó
por diálisis frente a varios cambios de tampón que contenía
concentraciones decrecientes de desnaturalizante.
El análisis de la glicosilación de la proteína
se realizó usando EndoH (Roche Molecular Biochemicals, Bruselas,
BE) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Se tripsinizaron células endoteliales de vena
umbilical humana (HUVEC) (Clonetics, San Diego, CA.) con tripsina
al 0,05%/EDTA 0,53 mM (Gibco, Gaithersburg, MD.), se resuspendieron
en EGM-2 (Clonetics, San Diego, CA.), se contaron y
se distribuyeron en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos a
5.000 células/pocillo. Después de la unión de las células y la
formación de monocapas (16 horas), las células se estimularon con
diversas concentraciones de vegf-X truncado (dominio
CUB o dominio VEGF) o diluciones de sobrenadantes de cultivo del
VEGF-X de longitud completa (COS 7 o HEK293) en DMEM
(Gibco, Gaithersburg, MD.) que contenían FBS del 0,5% al 2%
(Hyclone, Logan, UT) según se indica. En el caso de los fibroblastos
dérmicos fetales humanos (American Type Culture Collection,
Rockville, MD.), el medio de crecimiento se reemplazó por DMEM que
contenía BSA al 0,1% (Sigma, ST. Louise, MO) con o sin diversas
concentraciones de proteínas VEGF-X truncadas. En
el caso de HCASMC (Clonetics, San Diego, CA.), el medio se reemplazó
por DMEM que contenía FBS al 0,5%. Las células se trataron durante
24-72 horas más. Para medir la proliferación, el
medio de cultivo se reemplazó por 100 \mul de DMEM que contenía
FBS al 5% y 3 \muCi/ml de [3H]-timidina (Amersham,
Arlington Heights, IL.). Después del marcaje con pulsos, las
células se fijaron con metanol/ácido acético (3:1, vol/vol) durante
una hora a temperatura ambiente. Las células se lavaron dos veces
con 250 \mul/pocillo de metanol al 80%. Las células se
solubilizaron en tripsina al 0,05% (100 \mul/pocillo) durante 30
minutos y después en SDS al 0,5% (100 \mul/pocillo) durante otros
treinta minutos. Se combinaron alícuotas de lisados celulares (180
\mul) con 2 ml de cóctel de centelleo (Fisher, Springfield, NJ) y
la radiactividad de los lisados celulares se midió usando un
contador de centelleo de líquidos (Wallac 1409). En todos los casos,
las muestras se realizaron por cuadruplicado.
La repuesta quimiotáctica de las células HUVEC
se ensayó usando una cámara Boyden modificada de 48 pocillos
(NeuroProbe, Cabin John, MD.) y un filtro de membrana de
policarbonato recubierto con colágeno (0,1 mg/ml de colágeno de
tipo I, Collaboratic Biomedical, Bedfor, MA) con un diámetro de poro
de 8 \mum (NeuroProbe, Cabin John, MD.). Se introdujeron
suspensiones celulares (15.000/pocillo) en la parte superior de la
cámara de quimiotaxis y se estimularon durante cuatro horas con
rhVEGF_{165} (0,1-10 ng/ml) (Calbiochem, San
Diego, CA.) o diversas concentraciones de VEGF-X
truncado (dominio PDGF). Se retiraron las células que quedaban en
la parte superior de la membrana. La migración se evaluó contando el
número de células que migraban al lado inferior de la membrana de
filtro. La membrana se fijó con formaldehído al 10% durante 15
minutos, seguido de tinción con hematoxilina de Gill III
(PolyScientific, Bay Shore, NY.). El ensayo se realizó por
triplicado y se contaron seis campos de alta potencia
independientes por pocillo usando un microscopio óptico a 250
aumentos. Los resultados se expresaron como el número de veces de
células no estimuladas (conteniendo EMG BSA al 0,1%).
La angiogénesis in vitro en geles de
fibrina se cuantificó usando esferoides de células endoteliales de
vena umbilical humana (Korff y cols., 1998). Para generar esferoides
de células endoteliales con el tamaño y el número de células
definido, se suspendió un número específico de células (\sim800
células por esferoide) en medio de cultivo EGM-2
que contenía metilcelulosa al 20% (Sigma, St. Louis, MO.), y se
sembraron en placas de 96 pocillos de fondo redondo no adherentes.
Todas las células suspendidas en un pocillo contribuyeron a la
formación de un solo esferoide de células endoteliales en 24 horas.
Se preparó una solución madre de gel de fibrina poco antes del uso
mezclando 3 mg/ml de fibrinógeno (Calbiochem, San Diego, CA.) en
medio 199 (Gibco, Gaithersburg, MD). Los ensayos se realizaron en
placas de cultivo de 24 pocillos. La solución madre de 1 ml de
fibrinógeno se mezclo con 50 esferoides HUVEC y la sustancia de
ensayo correspondiente incluyendo rh-VEGF_{165} o
diversas concentraciones de VEGF-X. El fibrinógeno
que contenía esferoides se trasfirió rápidamente a placas de 24
pocillos. Se añadieron cincuenta microlitros de trombina (solución
madre de 100 NIH U/ml, Sigma, St. Louis, MO.) al gel para la
formación del gel de fibrina. La formación del gel normalmente se
produjo en 30 segundos. Después de la formación del gel, se
añadieron 1 ml/pocillo de Medio 199 suplementado con FBS al 20%, 1
mg/ml de ácido \varepsilon-aminocaproico
(Calbiochem, San Diego, CA.) y antibióticos. El gel se incubó a
37ºC (5% de CO_{2}, 95% de aire, 100% de humedad). Después de tres
días, la angiogénesis in vitro se cuantificó midiendo la
longitud de los tres brotes capilares más largos que habían crecido
de cada esferoide (100 aumentos), analizando al menos 10 esferoides
por grupo experimental y experimento.
El ensayo de ratón de Matrigel se realiza como
se describe por Passanti et al (1992).
Se usaron cebadores oligonucleotídicos
VEGF-E2 y VEGF-X14 (Figura 16;
Figura 5) para la amplificación por PCR específica de un fragmento
de 350 pb de VEGF-X. Se realizaron amplificaciones
por PCR en múltiples paneles de ADNc de tejido humano (MTC^{TM})
(paneles MTC humanos Clontech I y II y panel MTC de tumor humano)
normalizados para los niveles de expresión de ARNm de seis genes
locales diferentes. Además se obtuvo ADNc de diferentes cultivos de
células tumorales (Adenocarcinoma colorrectal
Caco-2; carcinoma colorrectal T-84;
adenocarcinoma de mama MCF-7; carcinoma de glándula
ductal de mama T-47D; fibrosarcoma óseo HT1080;
osteosarcoma SaOS-2; neuroblastoma
SK-N-MC; hepatoblastoma HepG2;
leucemia de células T JURKAT y leucemia mielomonocítica
THP-1). Para la preparación del ADNc de las células
tumorales, las células se homogeneizaron y el ARN total se preparó
usando el kit RNeasy Mini (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) de acuerdo
con las instrucciones del fabricante. Se sometió a transcripción
inversa 1 \mug de ARN total usando oligo(dT)15 como
cebador y 50 U de transcriptasa inversa Expand^{TM} (Boehringer
Mannheim, Mannheim, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Después se realizaron reacciones de PCR con cebadores
específicos para VEGF-X o específicos para
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (G3PDH) sobre 1 \mul de este ADNc. Para todos los
ADNc, las reacciones de PCR con cebadores específicos para
VEGF-X se realizaron en un volumen total de 50
\mul, que contenía 5 \mul (\pm 1 ng) de ADNc, 1x por tampón
de reacción de PCR Advantage KlenTaq, dNTP 0,2 mM, una concentración
250 nM de cebadores VEGF-E2 y
VEGF-X14 y 1 \mul de mezcla de polimerasa
Advantage KlenTaq. Las muestras se calentaron a 95ºC durante 30
segundos y la ciclación se realizó durante 30 segundos a 95ºC y
durante 30 segundos a 68ºC, durante 25, 30 ó 35 ciclos. También se
realizaron reacciones de control usando cebadores específicos que
amplifican un fragmento de 1 kb del gen local G3PDH de acuerdo con
las instrucciones del fabricante.
Se hibridaron transferencias de Northern que
contenían 2 \mug de ARN rico en poli(A) derivado de
diferentes tejidos humanos (Clontech Laboratories, MTN^{TM} blot,
MTN^{TM} blot II y Cancer Cell Line MTN^{TM} blot) de acuerdo
con las instrucciones del fabricante con un fragmento de
VEGF-X específico de 293 pb marcado con cebado
aleatorio \alpha-[^{32}P]-dCTP (kit de marcaje
Multiprime, Roche Diagnostics) (fragmento PinAI-StuI
incluyendo 92 pb de la región codificante del extremo 3' y 201 pb de
la región no traducida 3' de VEGF-X). Las manchas
de transferencia se hibridaron durante una noche a 68ºC y los
lavados finales en condiciones de alta rigurosidad se realizaron a
68ºC en 0,1x SSC/SDS al 0,1%. Las membranas se autorradiografiaron
durante 1 a 3 días con filtros de intensificación.
El efecto de VEGF-X de longitud
completa sobre la proliferación de células HUVEC se determinó por el
ensayo de incorporación de ^{3}H-Timidina. Se
privaron de surero células HUVEC durante 24 horas antes del
tratamiento con el VEGF-X de longitud completa a un
intervalo de concentraciones de 100 pg/ml a 10 \mug/ml. No hubo
ningún efecto de VEGF-X a 100
pg/ml-10 ng/ml sobre la proliferación de las células
endoteliales. A las mayores concentraciones de
FL-VEGF-X (100 ng/ml y 1 \mug/ml)
hubo una notable inhibición de la proliferación de células
endoteliales. Esto probablemente se debe al extremadamente alto
nivel de endotoxina en las muestras. La muestra de
VEGF-X se purificó para reducir el nivel de
endotoxina y actualmente se ensaya en el ensayo de proliferación
celular.
El efecto del dominio CUB sobre la inhibición de
la proliferación de HUVEC estimulada por suero (2%),
rh-VEGF o bFGF, se evaluó por el ensayo de
incorporación de ^{3}H-Timidina. Las células se
privaron de suero seguido de tratamiento con el dominio CUB y
diversos factores de crecimiento. Los resultados demostraron que el
dominio CUB inhibía la proliferación de células endoteliales
estimulada por suero (2%), rh-VEGF o bFGF de una
manera dependiente de la dosis con una inhibición máxima a 10
\mug/ml. Hubo una inhibición de aproximadamente 2 veces de la
proliferación (a 10 \mug/ml) de las células estimuladas con VEGF y
bFGF y una inhibición de casi cinco veces de las células estimulas
con suero (2%). Los resultados con el ensayo LDH demostraron que no
había citotoxicidad asociada con la inhibición de la proliferación
celular por el dominio CUB.
Por lo tanto, se ha demostrado que el extremo N
del polipéptido de la Figura 10 posee un dominio CUB. Cuando se
realizan búsquedas de bases de datos usando la secuencia codificante
de longitud completa, se encuentran las mejores correspondencias
(es decir, para una búsqueda BLAST, las que tienen la menor
puntuación de probabilidad) con el dominio CUB en lugar de con el
dominio de tipo VEGF. La mejor correspondencia de la presentación 37
de búsqueda de la base de datos SWISSPROT (Febrero 1999) es para el
dominio CUB de una neuropilina de Xenopus laevis, y las
correspondencias con los dominios de las neuropilinas humanas 1 y 2
también son más significativas que las correspondencias con los
VEGF.
Esta similitud es provocativa, dada la
identificación de la neuropilina 1 y 2 como receptores celulares
para el VEGF-A 165 (Stoker y cols. 1998, revisado
en Neufeld y cols. 1999). Por lo tanto, es posible que
VEGF-X pueda ejercer efectos reguladores dobles: a
través de la interacción con los receptores tirosina quinasa de
VEGF mediados por el dominio de tipo de VEGF, así como a través de
la interacción con isoformas de VEGF o con los receptores de
neuropilina, mediada por el dominio CUB.
\newpage
Que sepan los presentes inventores, esto último
sería totalmente nuevo, y las búsquedas sobre las presentaciones
más recientes de la base de datos Incyte no revelan ninguna otra
proteína que contenga dominios tanto de tipo CUB como de tipo VEGF.
Esta disposición de dominios sugiere posibles modelos positivos o
negativos de regulación:
Positivo - El dominio de tipo VEGF puede
interaccionar de forma productiva con los receptores tirosina
quinasa de VEGF proporcionando activación, y el dominio CUB puede
interaccionar de forma productiva con el receptor neuropilina
proporcionando activación.
Negativo - El domino de tipo VEGF no
interacciona de forma productiva con los receptores tirosina quinasa
de VEGF, impidiendo la dimerización del receptor o bloqueando los
sitios de unión a VEGF. Además, el domino CUB no interacciona de
forma productiva con los receptores de neuropilina, impidiendo la
activación del receptor o bloqueando los sitios de unión a VEGF, o
efectivamente por unión a isoformas de VEGF e impidiendo su
interacción con receptores.
\vskip1.000000\baselineskip
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- Secuencia ID Nº 1
- corresponde a la secuencia de aminoácidos desde la posición 23 a 345 de la secuencia de aminoácidos ilustrada en la Figura 10.
- Secuencia ID Nº 2
- es la secuencia de aminoácidos ilustrada en la Figura 10.
- Secuencia ID Nº 3
- corresponde a la secuencia desde la posición de 257 a 1291 de la secuencia de nucleótidos ilustrada en la Figura 9.
- Secuencia ID Nº 4
- corresponde a la secuencia polinucleotídica de VEGFX1 ilustrada en la Figura 3.
- Secuencia ID Nº 5
- corresponde a la secuencia polinucleotídica de VEGFX2 ilustrada en la Figura 3.
- Secuencia ID Nº 6
- corresponde a la secuencia polinucleotídica de VEGFX3 ilustrada en la Figura 3.
- Secuencia ID Nº 7
- corresponde a la secuencia polinucleotídica de VEGFX4 ilustrada en la Figura 3.
- Secuencia ID Nº 8
- corresponde a la secuencia polinucleotídica de VEGFX5 ilustrada en la Figura 3.
- Secuencia ID Nº 9
- corresponde a la secuencia polinucleotídica de VEGFX6 ilustrada en la Figura 3.
- Secuencia ID Nº 10
- corresponde a la secuencia polinucleotídica de VEGFX7 ilustrada en la Figura 3.
- Secuencia ID Nº 11
- corresponde a la secuencia polinucleotídica de VEGFX8 ilustrada en la Figura 3.
- Secuencia ID Nº 12
- corresponde a la secuencia polinucleotídica de VEGFX9 ilustrada en la Figura 3.
- Secuencia ID Nº 13
- corresponde a la secuencia polinucleotídica de VEGFX10 ilustrada en la Figura 3.
- Secuencia ID Nº 14
- corresponde a la secuencia polinucleotídica de VEGFX11 ilustrada en la Figura 4.
- Secuencia ID Nº 15
- corresponde a la secuencia polinucleotídica de VEGFX12 ilustrada en la Figura 4.
- Secuencia ID Nº 16
- corresponde a la secuencia polinucleotídica de VEGFX13 ilustrada en la Figura 4.
- Secuencia ID Nº 17
- corresponde a la secuencia polinucleotídica de VEGFX14 ilustrada en la Figura 4.
- Secuencia ID Nº 18
- corresponde a la secuencia polinucleotídica 5'-1 de la Figura 8.
- Secuencia ID Nº 19
- corresponde a la secuencia polinucleotídica 5'-2 de la Figura 8.
- Secuencia ID Nº 20
- corresponde a la secuencia polinucleotídica de VEGFX6 ilustrada en la Figura 13.
- Secuencia ID Nº 21
- corresponde a la secuencia polinucleotídica de VEGFX7 ilustrada en la Figura 13.
- Secuencia ID Nº 22
- corresponde a la secuencia polinucleotídica de VEGFX8 ilustrada en la Figura 13.
- Secuencia ID Nº 23
- corresponde a la secuencia polinucleotídica de VEGX9 ilustrada en la Figura 13.
- Secuencia ID Nº 24
- corresponde a la secuencia polinucleotídica de VEGBAC1 ilustrada en la Figura 13.
- Secuencia ID Nº 25
- corresponde a la secuencia polinucleotídica de VEGBAC2 ilustrada en la Figura 13.
- Secuencia ID Nº 26
- corresponde a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos desde la posición de aminoácido 40 a 150 de la secuencia de la Figura 10.
- Secuencia ID Nº 27
- corresponde a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos ilustrada en la Figura 26.
- Secuencia ID Nº 28
- corresponde a la secuencia desde la posición 5 a 508 de la secuencia de nucleótidos ilustrada en la Figura 26.
- Secuencia ID Nº 29
- corresponde a la secuencia de nucleótidos desde la posición 5 a 508 de la secuencia de nucleótidos ilustrada en la Figura 26.
- Secuencia ID Nº 30
- corresponde a la secuencia desde la posición 214 a 345 de la secuencia de nucleótidos ilustrada en la Figura 10.
<110> Janssen Phamaceutica N.V. y
otros
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Factor de crecimiento del endotelio
vascular-x
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<141>
1999-12-21
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\vskip0.400000\baselineskip
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1998-12-22
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1999-03-18
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1999-11-08
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Artificial: Cebador
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Claims (17)
1. Una molécula de ácido nucleico que codifica
un polipéptido con dominio CUB que comprende la parte
N-terminal de la proteína VEGF-X de
la SEC ID Nº 2, y donde dicho polipéptido puede inhibir la
estimulación de la proliferación de HUVEC inducida bien por VEGF o
bFGF.
2. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con
la reivindicación 1, codificando dicha molécula de ácido nucleico
un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde la
posición 40 a 150 de la SEC ID Nº 2.
3. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con
las reivindicaciones 1 ó 2, codificando dicha molécula de ácido
nucleico un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de
la SEC ID Nº 27.
4. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende la
secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 28.
5. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende la
secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 29.
6. Un vector de expresión que comprende una
molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5.
7. Una célula hospedadora transformada o
transfectada con un vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 6.
8. Una proteína expresada por la célula de
acuerdo con la reivindicación 7.
9. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para uso como un
medicamento.
10. Uso de una molécula de ácido nucleico de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la
fabricación de un medicamento para el tratamiento de patologías
asociadas con una angiogénesis inapropiada tal como el crecimiento
de un tumor o cáncer, retinopatía, osteoartritis o psoriasis.
11. Un polipéptido codificado por una molécula
de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
1 a 5, para uso como un medicamento.
12. Un polipéptido que comprende la secuencia de
aminoácidos desde la posición 40 a 150 de la secuencia de la SEC ID
Nº 2, para uso como un medicamento.
13. Uso de un polipéptido que comprende la
secuencia de aminoácidos desde la posición 40 a 150 de la secuencia
de la SEC ID Nº 2, en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de patologías asociadas con una angiogénesis
inapropiada tales como el crecimiento tumoral, retinopatía,
osteoartritis o psoriasis.
14. Uso de un polipéptido codificado por una
molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de patologías asociadas con una angiogénesis
inapropiada tales como el crecimiento tumoral, retinopatía,
osteoartritis o psoriasis.
15. Una molécula antisentido que puede hibridar
con una molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
1 a 5 en conducciones muy rigurosas.
16. Un anticuerpo que puede unirse a una
proteína de acuerdo con la reivindicación 8 o un epítopo de la
misma.
17. Una composición farmacéutica que comprende
un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 16 junto con un
vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable para el
mismo.
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