PT1078001E

PT1078001E - Peptidos antagonistas de il-6

Info

Publication number: PT1078001E
Application number: PT99926326T
Authority: PT
Inventors: Ottaviano Serlupi-Crescenzi; Linda Della Pietra; Alessandro Bressan; Anna Rita Pezzotti
Original assignee: Applied Research Systems
Priority date: 1998-05-18
Filing date: 1999-05-18
Publication date: 2007-01-31
Also published as: WO1999060013A2; EP1078001B1; EP0972780A1; US20030186876A1; CA2690399A1; DE69934308T2; AU749616B2; JP4468578B2; US6838433B2; DE69934308D1; ES2273492T3; CA2690399C; US6599875B1; WO1999060013A3; ATE347563T1; CY1105865T1; CA2332817C; DK1078001T3; SI1078001T1; IL139575A0

Description

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DESCRIÇÃO "PÉPTIDOS ANTAGONISTAS DE IL-6"

AREA DA INVENÇÃO A presente invenção relaciona-se com péptidos antagonistas de IL-β, que podem ser isolados a partir de uma biblioteca de péptidos através do sistema de duplo híbrido pela sua aptidão para se ligar ao domínio intracelular da gpl30 e que contêm pelo menos 5 aminoácidos. Em particular, estes péptidos compreendem uma sequência de aminoácidos, a qual é seleccionada do grupo constituído por: SEQ ID NO: 6, assim como os sais, derivados funcionais, precursores e análogos destes.

Um outro objectivo da presente invenção é proporcionar o péptido numa forma consideravelmente purificada, para ser adequado para ser utilizado em composições farmacêuticas, como substância activa, em patologias que requerem a inibição da actividade da IL-6.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 Sistema de Duplo-Híbrido (THS) é um método que utiliza a actividade transcricional como um sistema para detectar interacções proteína-proteína. Constrói-se uma fusão de genes para codificar do domínio de ligação ao ADN do factor de transcrição da levedura GAL4 como um híbrido com qualquer proteína JX' (sendo habitualmente uma proteína de mamífero definida o alvo de ligação ao "isco"). Uma construção adicional de fusão de genes codificará o domínio de activação da transcrição do GAL4 fundido com qualquer 2 proteína Ύ' (habitualmente uma biblioteca de várias proteínas, o "peixe") (Fields et al., 1994). Sempre que ocorra uma interacção X-Y, ela trará o domínio de activação para próximo de sítios no ADN que são reconhecidos pelo domínio de ligação ao ADN GAL4, resultando, deste modo, na expressão de um gene repórter flanqueante regulado por estes sítios no ADN. Os genes repórteres geralmente utilizados incluem: 1) lacZ, o qual produz colónias azuis em placas ou filtros que contêm X-Gal; e 2) His3, um gene de levedura envolvido na biossíntese de histidina, necessário para o crescimento de células de levedura hospedeiras.

Recentemente, Fields e o seu grupo utilizaram o THS para rastrear uma biblioteca aleatória de péptidos, em vez de uma biblioteca de ADNc, para encontrar péptidos capazes de se ligar à proteína retinoblastoma (Rb) (Yang et al., 1995) . 0 sistema receptor para a Interleucina-6 (IL-6) é constituído por duas "subunidades" receptoras distintas designadas gp80 e gpl30 (ver Hirano et al., 1994).

As citocinas de tipo IL-β induzem o seu sinal através de receptores que partilham a proteína gpl30. Após ligação ao ligando a gpl30 homo- ou heterodimeriza com o LIF e o receptor OSM activando, desse modo, as JAK tirosina-cinases associadas. As JAK fosforilam o transdutor de sinal (gpl30) e os factores de transcrição latentes da família STAT (Transdutor de Sinal e Activador da Transcrição), como os STATI e STAT3 no caso da IL-6. Os factores STAT dimerizam, transferem-se para o núcleo e ligam-se a elementos 3 intensif icadores de genes reactivos à IL-6 (Luttiken et al., 1993) . A análise por delecção do domínio intracelular da gpl30 definiu alongamentos curtos de aminoácidos conhecidos como boxl e box2 suficientes para conferir actividade mitogénica e a ligação de proteínas JAK (Vanderkuur et al., 1994) : estas actividades foram também observadas quando se eliminou os sítios de ligação dos STAT. Por conseguinte, pode atribuir-se duas funções às JAK cinases: 1) activação da expressão de genes mediada pela STAT; 2) activação da actividade mitogénica independente da STAT pelo menos em algumas células hematopoiéticas.

Conhece-se outras cinases que se associam à parte intracelular da gpl30, tais como as Hck, Fes, Btk e Tec (Matsuda et al., 1995). No entanto estas interacções não foram esclarecidas ao nível molecular. Além disso, Tanner et al. demonstraram que o domínio boxl dos receptores de citocina é necessário, mas não suficiente, para interacção com as JAK cinases e sugeriram que as sequências boxl cooperam com outras sequências de domínios citoplásmicos para levar a cabo a associação à JAK cinase (Tanner et al., 1995) . Até mesmo o parceiro molecular das boxl e box2 nas JAK cinases não foi identificado.

Os péptidos sintéticos que inibem a actividade da IL-6 foram descritos no Pedido de Patente Internacional WO 97/13781 (YEDA), o qual se relaciona com péptidos derivados da proteína gp80. 0 Pedido de Patente Internacional W097/48728 descreve nove péptidos derivados da IL-6 e do receptor da IL-6, possuindo alegadamente uma actividade antagonista ou agonista da IL-6. 4

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Como um alvo no THS, nós analisamos a parte intracelular do receptor da IL-6 humana (gpl30-ICD). Este rastreio pelo THS deveria, por conseguinte, identificar péptidos candidatos que sejam capazes de interactuar directamente com a gpl30-ICD de um modo independente da fosforilação. Sabe-se que as interacções independentes da fosforilação com o gpl30-ICD ocorrem na transdução de sinal despoletada por citocinas de tipo IL-6. Os parceiros de interacção com a gpl30-ICD deste tipo incluem as proteína-cinases da família da JAK (Darnell et al., 1994).

Por conseguinte, o objectivo principal da presente invenção é um péptido antagonista da IL-6, que possa ser isolado a partir de uma biblioteca de péptidos através do sistema de duplo-híbrido pela sua aptidão para se ligar ao domínio intracelular da gpl30 e que contém pelo menos 5 aminoácidos. De acordo com uma forma de realização preferida da invenção, estes péptidos contêm até 30, mais preferencialmente 5-20, muito preferencialmente 8-16, aminoácidos.

De acordo com a presente invenção o "isco" ("X") utilizado no rastreio com o THS é o domínio intracelular (ICD) da proteína gpl30. Este domínio corresponde à região desde o aminoácido na posição 642 até ao aminoácido na posição 918 (Yamasaki K. et al., 1988) do IL-6-R (gpl30). O "peixe" no rastreio com THS é uma biblioteca aleatória de péptidos. Esta biblioteca pode ser qualquer biblioteca comercial ou pode ser produzida "no laboratório" por métodos conhecidos. 5

Os falsos positivos provenientes do rastreio anterior podem ser eliminados como está descrito na literatura (Bartel et al., 1993).

De acordo com uma outra forma de realização preferida, estes péptidos incluem uma sequência de aminoácidos, a qual é seleccionada do grupo constituído por: SEQ ID NO: 6, assim como os sais e derivados funcionais destes. "Análogos", como utilizado no presente pedido, significa aqueles péptidos, nos quais um ou mais dos aminoácidos nas sequências anteriores são alterados sem afectar consideravelmente a actividade antagonista da IL-6. Em particular, as alterações preferidas para os análogos de acordo com a presente invenção são as que são conhecidas como substituições "conservativas". As substituições conservativas de aminoácidos incluem substituições de aminoácidos com aminoácidos sinónimos dentro do mesmo grupo, os quais têm propriedades físico-químicas suficientemente semelhantes para que a substituição entre membros do grupo conserve a função biológica da molécula, Grantham, Science, Vol. 185, pág. 862-864 (1974).

Os grupos de aminoácidos sinónimos são aqueles definidos no Quadro I. Mais preferencialmente, os grupos aminoácido sinónimos são os definidos no Quadro II; e muito preferencialmente os grupos aminoácido sinónimos são os definidos no Quadro III. 6 QUADRO I Grupos Preferidos de Aminoácidos Sinónimos tiinoácido Grupo Sinónimo Ser Ser, Thr, Gíy, Mn Arg Arg, Gla, Lys, Glu, íBs Leu He, Tf, Met, Vai, Leu Fr© Gly, Ala, Thr, Pro Thr Pro, Ser, Ala, Gíy, Hts, Gin, Thr Ala Gly, Thr, Pro, Ala Vai Mel, Tf, Phe, Ile, Leu, Vai Giy AJa, Thr, Pro, Ser, Gly Be Met, Tf, PH Vai, Leu, Ile Phe Trp, Meí, Tf, Be, Vai, Leu, Phe Tyr Trp, Met, Phe, He, Vai, Leu, Tf Cys Ser, Thr, Cys Bs Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, Hís Gin Glu, Lys, Asa, Hw, Thr, Arg, Gin Àsn Gin, Asp, Ser, Asn Lys Glu, Gin, His, Arg, Lys Asp Glu, Asn, Asp Glu Asp, Lys, Asa, Gin, His, Arg, Glu Mm Phe, Ile, Vai, Leu, Mel Trp Trp 7 QUADRO II Grupos mais Preferidos de Aminoácidos Sinónimos

Aminoácido

Grupo Sinónimo

Ser Ser Arg HIs, Lys, Afg Leu 1¾ Phe, Mets Leu Pro Ala, Pro Thr Tbr Aia Pro,Alt Vál Mel, lie, Vai % Gly le He, Mel, Phe, Vai, Leu Fbe Mel, Tyr, lis, Uu, Pbe Tyr Phe, Tyr Cp Ser, Cp Mis Arg, Gin, Bis Glíi Gíu, Hís, Gin Asn Âsp, Asn Ly» Arg, Lys Ãsp Asn, Ásp Gta Gin, Glu Mel Phe, He, Vai, Leu, Met Trp Trp 8 QUADRO III Grupos muito Preferidos de Aminoácidos Sinónimos Aminoácido Grupo Sinónimo

Ser Ser Arg Ari Leu He* Met, Lm Pro Pr© Thr Thr Ala AJa Vai Vai Q\y Giy Be Ile, Met, Leu Phe Phe lyr Tf €ys Ser, Cys m íBs Gin Gin Asa Asa Lyi Lys Âsp Asp Gkt Glu Mel íle, Lm, Met Τφ Trp 0 termo "sais" refere-se aqui a sais de grupos carboxilo e a sais de adição de ácido de grupos amino dos péptidos da invenção ou análogos destes. Os sais de um grupo carboxilo podem ser preparados por meios conhecidos na técnica e incluem sais inorgânicos, por exemplo, sódio, cálcio, amónio, sais de ferro ou zinco, e semelhantes, e sais com bases orgânicas como as preparadas, por exemplo, com aminas, tais como trietanolamina, arginina ou lisina, 9 piperidina, procaína e semelhantes. Os sais de ácidos incluem, por exemplo, sais com ácidos minerais tais como, por exemplo, ácido clorídrico ou ácido sulfúrico, e sais com ácidos orgânicos tais como, por exemplo, ácido acético ou ácido oxálico. Evidentemente, qualquer um destes sais tem de possuir uma actividade essencialmente semelhante aos péptidos da invenção ou seus análogos. A definição “derivados funcionais" como aqui utilizada refere-se a derivados que podem ser preparados a partir dos grupos funcionais presentes nas cadeias laterais das unidades de aminoácido ou nos grupos N- ou C-terminais segundo métodos conhecidos e que estão incluídos na invenção quando são farmaceuticamente aceitáveis, isto é, quando eles não destroem a actividade da proteína ou não conferem toxicidade às composições farmacêuticas que os contêm. Estes derivados incluem, por exemplo, ésteres ou amidas alifáticas dos grupos carboxilo e derivados N-acilo de grupos amino livres ou derivados O-acilo de grupos hidroxilo livres e são preparados com grupos acilo como, por exemplo, grupos alcanoílo ou aroílo.

Os "precursores" são compostos que são convertidos nos péptidos da invenção no organismo humano ou animal. A "actividade antagonista de IL-6" significa a aptidão para inibir a actividade da IL-6 por antagonismo da ligação da IL-6 ao seu receptor e/ou por interferência com o funcionamento do sistema receptor que transduz, intracelularmente, os sinais moleculares que conduzem à activação do gene em células dependentes de IL-6, tais como, por exemplo, as células de mieloma. Por conseguinte, esta actividade pode ser medida por quaisquer um dos 10 ensaios conhecidos na técnica. Estes ensaios incluem a proliferação de células do plasmocitoma T1165 murideo, a inibição do crescimento de células de leucemia mielóide Ml de ratinho ou a produção de proteínas da fase aguda de células de hepatoma.

Os péptidos da invenção podem ser preparados por qualquer procedimento bem conhecido na técnica, tal como síntese em fase sólida ou síntese em fase líquida. Como uma síntese em fase sólida, por exemplo, o aminoácido correspondente à extremidade C-terminal do péptido a ser sintetizado é ligado a um suporte que é insolúvel nos solventes orgânicos e, por repetição alternadas de reacções, uma em que os aminoácidos com os seus grupos amino α e grupos funcionais da cadeia lateral protegidos com grupos de protecção adequados são condensados um a um por ordem da extremidade C para a extremidade N e uma em que os aminoácidos ligados à resina ou o grupo de protecção dos grupos amino na posição α dos péptidos são libertados, prolongando-se deste modo a cadeia peptídica. Os métodos de síntese em fase sólida são classificados em termos latos no método tBoc e no método Fmoc, dependendo do tipo de grupo de protecção utilizado.

Os grupos de protecção tipicamente utilizados incluem tBoc (t-butoxicarbonilo) , Cl-Z (2-clorobenziloxicarbonilo) , Br-Z (2-bromobenziloxicarbonilo) , Bzl (benzilo), Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo), Mbh (4,4'-dimetoxidibenzidrilo), Mtr (4-metoxi-2,3,6-trimetilbenzenossulfonilo) , Trt (tritilo), Tos (tosilo), Z (benziloxicarbonilo) e Cl2-Bzl (2,β-diclorobenzilo) para os grupos amino; NO2 (nitro) e Pmc (2,2,5,7,8-pentametilcromano-6-sulfonilo) para os 11 grupos guanidino); e tBu (t-butilo) para os grupos hidroxilo).

Depois da síntese do péptido desejado, este é submetido à reacção de desprotecção e remoção do suporte sólido. Esta reacção de remoção do péptido pode ser realizada com fluoreto de hidrogénio ou ácido trifluorometanossulfónico para o método Boc e com TFA para o método Fmoc. 0 péptido em bruto assim obtido é depois submetido a purificação. A purificação é realizada por qualquer um dos métodos conhecidos para este efeito, isto é, qualquer procedimento convencional envolvendo extracção, precipitação, cromatografia, electroforese ou semelhantes. Por exemplo, pode utilizar-se HPLC (cromatografia líquida de alta eficiência) . A eluição pode ser realizada utilizando um solvente à base de água-acetonitrilo geralmente utilizado para purificação de proteínas.

Outro objectivo da presente invenção é, por conseguinte, proporcionar o péptido numa forma consideravelmente purificada, para ser adequada para ser utilizada em composições farmacêuticas, como substância activa, em patologias que requerem inibição da actividade da IL-6 .

As patologias nas quais os novos péptidos de acordo com a invenção são vantajosamente utilizados para utilizações profiláctica, terapêutica ou diagnóstica incluem doenças hematológicas, doenças do sistema imunitário, doenças ósseas, tumores e doenças auto-immunes, 12 assim como na terapia de transplantaçao incluindo transplantes de órgãos sólidos e celulares.

Exemplos específicos das categorias anteriores incluem as doenças seguintes: leucemia linfocitária crónica (CLL), plasmocitoma/mieloma múltiplo, doença de Castleman (CD) , osteoporose, psoríase, esclerose múltipla, lúpus eritematoso, diabetes, artrite reumatóide assim como anemia e enfraquecimento em doenças crónicas.

Outros objectos e vantagens da invenção serão evidentes na descrição que se segue.

Uma forma de realização da invenção é a administração de uma quantidade farmacologicamente activa do péptido da invenção a indivíduos em risco de desenvolver patologias que requerem a inibição da actividade da IL-6 ou a indivíduos que já apresentam tais patologias.

Pode utilizar-se qualquer via de administração compatível com o princípio activo, mas é particularmente preferida a administração parentérica porque ela permite ter, em pouco tempo, efeitos sistémicos. A dose de péptido a ser administrada depende com base na prescrição médica de acordo com a idade, peso e a resposta individual do doente. A composição farmacêutica para utilização parentérica pode ser preparada na forma injectável compreendendo o princípio activo e um veículo adequado. Os veículos para administração parentérica são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, água, soro fisiológico e tampões 13 fisiológicos. 0 veiculo pode conter quantidades menores de excipientes para manter a estabilidade e isotonicidade da solução. A preparação das soluções citadas pode ser realizada de acordo com modalidades correntes. A presente invenção foi descrita relativamente a formas de realização especifica, mas o conteúdo da descrição inclui todas as modificações e substituições que possam ser efectuadas por um especialista na técnica sem se alargar para além do significado e objectivo das reivindicações. A invenção será agora descrita através dos Exemplos seguintes, os quais não deverão ser interpretados como limitando a presente invenção, seja de que forma for. Os Exemplos farão referência às Figuras especificadas a seguir.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: Vectores utilizados na selecção de péptidos de ligação à gpl30. 0 plasmideo pASgpl30 codifica o domínio de ligação ao ADN GAL4 (resíduos 1-147 a.a.) fundido com a gpl30-ICD; o plasmideo, pGADGH codifica uma biblioteca aleatória de péptidos com 16 unidades estruturais básicas (NNK) i6 fundida com o domínio de activação de GAL4 (resíduos 768-881 a.a.).

Figura 2: Transferência de Western de extractos de levedura. A CG-1945 (pistas 1 e 2) foi transformada com pAS2-l, que codifica a GAL4BD (pista 3) ou com pASgpl30, 14 que codifica a gpl30-GAL4BD (pista 4). Separou-se os extractos proteicos num gel de acrilamida a 15%-SDS e analisou-se por um sistema de detecção de quimioluminiscência. São indicados os pesos moleculares (quilodaltons). A seta preta denota gpl30-GAL4BD; a seta cinzenta denota GAL4BD.

Figura 3: Transformação da biblioteca de péptidos. A estirpe de levedura CG-1945 foi transformada com 60 μρ de plasmideos de biblioteca. Multiplicou-se as células em meio agar de SD/-Trp/-Leu/-His/+3-AT 10 mM a 30 °C. Após 4 dias, surgiram algumas colónias His+ nas placas. Na primeira transformação, nós isolamos 20 clones His+; apenas 9 deles, numerados na figura, eram também lacZ+.

Figura 4: Péptidos. Os péptidos isolados por THS: eles são agrupados em cinco grupos de homologia.

Figura 5: Actividade β-galactosidase (LacZ) em ensaio liquido. A combinação do clone E e gpl30-ICD em células de leveduras gerou cerca de 3 unidades/ml de actividade LacZ. O valor é obtido a partir de três experiências independentes.

Figura 6: Homologias relevantes. Alinhamento da sequência dos péptidos D, E (Ei) e C com várias tirosina cinases associadas à gpl30. As identidades são indicadas em itálico; os aminoácidos básicos são marcados com (*); os aminoácidos ácidos estão sublinhados. 15

EXEMPLOS

Exemplo 1: Rastreio da biblioteca de péptidos

Uma biblioteca aleatória de péptidos com 16 unidades estruturais básicas foi rastreada com o Sistema de Duplo-Híbrido (THS). A sequência de codificação do domínio de activação de GAL4 da levedura (AD) foi ligada em grelha a uma biblioteca aleatória de oligonucleótidos sintéticos que codificam os péptidos. 0 vector utilizado, PGADGH, é um plasmídeo centromérico portador do promotor ADHl e do gene Leu2 de levedura como um marcador seleccionável (Fig. 1). Estima-se que a biblioteca aleatória de péptidos possua cerca de 107 clones independentes (ver Materiais e Métodos).

Realizou-se RT-PCR em células HepG2, para isolar a parte intracelular da gpl30 humana. 0 ADNc correspondente foi clonado em grelha com a sequência de codificação do domínio de ligação ao GAL4 (BD) no plasmídeo pAS2-l. Este é um plasmídeo centromérico portador do promotor ADHl e do gene TRP1 de levedura como um marcador seleccionável. A expressão da proteína de fusão foi verificada por transferência de Western (Fig. 2).

Nas nossas experiências, nós utilizamos a estirpe CG-1945 de levedura, a qual é portadora dos genes repórteres, lac Z e His3 (Estojak et al., 1995). Nós utilizamos 60 μρ da biblioteca de péptidos para cada transformação das células de levedura receptoras anteriormente transformadas com o plasmídeo que codifica a 16 proteína de fusão gpl30ic-GAL4BD. Para encontrar o clone de interacção desejado na biblioteca AD, nós rastreamos cerca de 2 x 106 clones. Nós efectuamos cinco transformações e os resultados de todas estas transformações estão delineadas no quadro abaixo: Número total de clones rastreados 1,8 x 106 Eficiência de transformação (células^g de ADN) 1 x 104 Número total de clones obtidos apenas com a selecção de His-3 250 Número total de clones obtidos após segundo rastreio com lacZ 26

Após selecção pelo requisito nutricional de histidina (isto é, selecção para interacções de THS com o gene repórter His3), sobreviveu um total de 250 clones dos 1,8 x 106 clones transformados. Sucessivamente, ao rastrear para o segundo gene repórter lac-Z, nós encontramos 26 clones de levedura positivos (Fig. 3).

Exemplo 2: Isolamento de clones positivos verdadeiros

Para eliminar a grande maioria dos falsos positivos residuais, os plasmídeos seleccionados pelo THS que codificam a biblioteca de péptidos foram retransformados na estirpe de rastreio original, CG-1945, nas condições seguintes: 1) sem plasmídeo adicional; 2) com um plasmídeo que codifica o domínio de ligação ao ADN GAL4 sozinho 17 (pAS2-l); 3) com o plasmídeo "isco" completo ou 4) com uma proteína de fusão não relacionada (como a lamina-C humana fundida com GAL4-BD) (Bartel et al., 1993).

Um clone positivo verdadeiro produz um sinal positivo apenas na terceira condição listada acima.

Para se levar a cabo a tarefa acima, nós isolamos até à homogeneidade plasmídeos "peixe" positivos e transformámo-los em E. coli. Estes AD/plasmídeos biblioteca foram selectivamente amplificados em E. Coli utilizando o seu marcador LEU2 para complementar a mutação leuB E. Coli da estirpe HB101.

Estes plasmídeos foram utilizados para retransformar a estirpe de levedura para eliminar falsos positivos como se descreve acima: depois destes procedimentos, nós seleccionamos nove clones positivos (Fig. 4).

Os dados obtidos a partir da análise da sequência indicaram que (i) embora todos os clones rastreados possuíssem mais do que um oligonucleótido (NNK) i6, apenas a primeira sequência oligonucleotídica é expressada como uma fusão GAL4 AD/péptido devido ao codão de paragem contido na grelha no final de cada oligonucleótido; (ii) a maior parte dos péptidos isolados têm o comprimento total esperado de 16 aminoácidos; (iii) alguns dos péptidos apresentam homologias com proteínas de interacção com a gpl30-ICD conhecidas.

Para confirmar a interacção gpl30-ICD-péptido, nós também trocamos de vectores de clonagem movendo a inserção 18 da biblioteca do AD para o vector DNA-BD e vice-versa. Depois nós repetimos o ensaio THS (Van Aelst et al., 1993). Nós também efectuamos doseamentos liquidos de β-galactosidase para quantificar a actividade transcricional: como se mostra na figura 5, na presença de gpl30-ICD/GAL4AD o clone da proteína de fusão E/GAL4BD foi capaz de produzir uma actividade transcricional do gene lacZ cerca de 2 até 3 vezes superior do que na ausência da gpl30-ICD/GAL4AD, confirmando, deste modo, a interacção detectada após a primeira selecção.

Homologias A pesquisa de bancos de dados de proteínas demonstrou ser muito interessante, porque tem revelado homologias entre os péptidos e proteínas isolados como a JAK1 e Tec as quais estão constitutivamente associadas ao domínio intracitoplasmático da gpl30. Mesmo no caso destas homologias se limitarem a pequenos alongamentos, estes resultados poderiam ser úteis para orientar as nossas investigações futuras (Fig. 6). Nós seleccionamos o clone E em duas transformações independentes: este clone apresenta uma homologia com a JAK1. Harpur e colaboradores propuseram que as JAK cinases fossem divididas em sete domínios designados por domínios de homologias JAK (JH) 1 até 7 (Harpur et al., 1992). A JH1 corresponde ao domínio tirosina-cinase e a JH2 corresponde ao domínio putativo serina-treonina cinase. Os domínios JH3 até JH7 são domínios não catalíticos e não possuem qualquer função conhecida. 0 clone E mostra uma 19 pequena região de homologia com a JAK1: esta homologia situa-se no domínio JH4.

Harpur e colaboradores sugeriram que a associação da JAK2 com o receptor GH tem de ser mediada pelos domínios não catalíticos, JH3 até JH7: estes domínios são estrutural e funcionalmente conservados nos membros da família JAK. 0 JH4 é o mais conservado entre estes domínios. Assim, os nossos dados sugerem que o alongamento de JAK1 definido pelo péptido E pode desempenhar um papel funcional: ele poderia mimetizar o sítio de ligação à JAK1 na gpl30. De igual modo, o clone C apresenta uma homologia interessante com a Tyk2: esta homologia situa-se no JH7.

Os outros clones mostram identidades com outras cinases como a LTKR ou com proteínas como a ANK1, cujas funções incluem a fixação de proteínas integrais da membrana a elementos do citoesqueleto.

Discussão

Estudos sobre os percursos de sinalização da citocina sugerem que os sinais são produzidos por interacções proteína-proteína mediadas pela associação de domínios proteicos modulares pequenos com sequências de aminoácidos curtas e específicas. Por exemplo, os domínios de homologia Src 2 (SH2) e homologia Src 3 (SH3) são regiões de 60-100 aminoácidos que interagem com resíduos de tirosina fosforilada ou regiões ricas em prolina, respectivamente.

Por conseguinte pode conceber-se que sejam necessários domínios discretos das JAK cinases ou dos receptores para a 20 ligaçao das JAK cinases e nalguns casos eles podem determinar a especificidade dessa ligação.

Dados publicados indicam os sítios precisos da gpl30-ICD envolvidos em algumas destas interacções: por exemplo, o domínio boxl da gpl30 é um motivo com oito aminoácidos ricos em resíduos de prolina. Este domínio deveria estar directamente envolvido na interacção com as JAK cinases, ainda mais se parece mais provável que a sequência boxl desempenha uma função crítica na geração de uma estrutura secundária que é necessária para a interacção entre as JAK cinases e os receptores de citocina (Murakami et al., 1991). Outro domínio da gpl30 envolvido nas interacções proteína-proteína é a sequência consenso YXPQ envolvida na activação das STAT3 e STAT1 (Gerhartz et al., 1996). Nós analisamos a associação da gpl30-ICD com uma biblioteca aleatória de péptidos pelo THS. Nós identificamos nove clones/péptidos independentes: estes péptidos apresentam homologias com proteínas presentes nos bancos de dados. Até mesmo no caso destas homologias estarem limitadas a pequenos alongamentos, estes resultados poderiam ser úteis para orientar as nossas investigações futuras.

Caso se confirmem estes dados preliminares, nós poderíamos identificar as regiões exactas das cinases, tal como JAK1, que se ligam à gpl30-ICD. Os nossos dados também poderiam sugerir que um rastreio de péptidos com o sistema de duplo-híbrido péptido é uma técnica adequada para alcançar resultados semelhantes. 21

Materiais e Métodos

Construção de plasmideos que codificam proteínas híbridas

Todas as construções híbridas foram criadas utilizando amplificação por RT-PCR.

As reacções de PCR continham 10 μΐ de ADNc de células HepG2, 50 pmoles de cada um dos iniciadores (ver abaixo) , 2,5 unidades de Pfu polimerase Stratagene, 0,2 mM de cada um dos quatro desoxinucleótidos trifosfatos, 10 μΐ de tampão Pfu, num volume reaccional de 100 μΐ, cobertas com 50 μΐ de óleo mineral. A amplificação foi realizada durante 30 ciclos com um perfil de temperatura de 45 segundos a 94 °C, 45 segundos a 60 °C e 6 minutos a 72 °C.

Todos os fragmentos de PCR foram digeridos com enzimas de restrição adequadas (EcoRI/BamEI para a hgpl30) dum dia para o outro a 37 °C.

Os produtos de PCR digeridos foram purificados por electroforese de gel em agarose de baixo ponto de fusão e por Microcon 100 (Amicon). Estes fragmentos foram ligados com o estojo Rapid DNA ligation (Boehringer Mannheim) a ambos os vectores, pAS2-l e pGADGH, e transformados em células competentes de E. coli ToplOF (Invitrogen). A biblioteca aleatória de péptidos MATCHMAKER (Clontech) é constituída por oligonucleótidos (NNK) 16 22 (N= A, G, C ou T; K= T ou G) , flanqueados por sítios Bamtil e EcoRI e que contêm um codão de paragem terminal, direccionalmente clonado no vector do domínio de activação (AD) GAL4 de elevada expressão, pGADGH. A partir do vector é produzida uma mistura de péptidos de 16 codãos fundidos ao GAL4AD.

Iniciadores de PCR

Upqpl30 : 5' CTG GAA TTC AAT AAG CGA GAC CTA ATT AAA AAA CAC ATC TGG CCT AAT GTT C 3' (SEQ ID NO: 9)

Logpl30 : 5' ACA CGG GAT CCT CAC TGA GGC ATG TAG CCG CCT TGC CGT ACA GTC 3' (SEQ ID NO: 10) O ADNc da gpl30-ICD humana foi amplificado em PCR utilizando Upgpl30 e Logpl30.

Sequenciação de AON A sequenciação de ADN foi realizada em ambas as cadeias utilizando o estojo de sequenciação de ADN, Dye Primer Cycle Sequencing (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA, USA) num sequenciador automático ABI modelo 373A, seguindo as instruções do fabricante. A pesquisa de homologia foi realizada contra os bancos de dados GenBank, EMBL e Swiss-Prot.

Iniciadores de sequenciação

Iniciador 1 (GAL4 BD): 5' TCA TCG GAA GAG TAG 3' (SEQ ID NO: 11)

Iniciador 2 (GAL4AD) : 5' TAC CAC TAC AATGGA TG 3' (SEQ ID NO: 12) 23

Estirpes de E. coli e Meio HB101: F', hsdS20 (r~b, m~b), recAl3f ara-14, pro A2, lacYl, galK2, rspL20 (Smr), xyl-5, mtl-1, supE44

ToplOF' : F', laclq, TnlO, Tetr, mcrA A (mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80 lacZ ΔΜ15 AlacX74 deo R recAl araD!39 A(ara-leu) 7697galU galK rpsL endAl nupG LB (11) : 10 g Bactotriptona 5 g Extracto de levedura 10 g NaCl LB agar (11): 10 g Bactotriptona 5 g Extracto de levedura 10 g NaCl 1,5% agar

Estirpe de levedura e Meio A estirpe CG-1945 de saccharomyces cerevisiae (Mat a, ura 3-52, his3-200, lys 2-801, ade 2-101, trp 1-901, leu2-3, 112, gal4~542, gal 80—538, cyhr 2, LYS: : GALIuas3~GAL1trtr~ HIS3, URA3: : GAL4 π-mero (x3) ~CyCl TATA-lacZ) (Clontech

Matchmaker) foi utilizada em todos os ensaios. A CG-1945 é portadora de dois genes repórteres sob o controlo de promotores diferentes: gene lacZ sob o controlo do promotor CYC1, o qual tem a sua própria sequência de activação a montante substituída por sítio de ligação ao GAL4, e o gene His3 sob o controlo do promotor Gall.

Assim, estes promotores partilham pouco mais do que os sítios de ligação ao GAL4 e o rastreio realizado com ambos os genes repórteres nas mesmas células de levedura deveriam 24 eliminar muitos falsos positivos. Multiplicou-se as culturas de leveduras a 30 °C quer em meio YPD (1% de extracto de levedura, 2% de peptona e 2% de glucose) ou meio mínimo SD (0,5% de base de azoto de levedura sem aminoácidos, 2% de glucose e 1% de solução deficitária no aminoácido desejado).

Transformação em Levedura e Doseamento da β-galactosidase

Introduziu-se genes de fusão na estirpe CG-1945 pelo procedimento de transformação com acetato de litio (16). Nós espalhamos todas as células sobre meio de agar SD/-Trp-Leu-His+3AT 10 mM para realizar uma primeira selecção. Quando ocorre a interacção entre a gpl30-ICD e um péptido, os dois domínios funcionais GAL4 são presos, o que resulta na expressão de histidina. As células de levedura com proteínas híbridas de interacção podem, deste modo, crescer num meio que não possua este aminoácido.

Utiliza-se 3-AT (3-amino-l,2,4-triazole) , um inibidor competitivo da proteína HIS3 de levedura (imidazoleglicerol-fosfato desidratase), para inibir níveis baixos de His3p expressada por fuga em algumas estirpes repórter. Deixa-se que os transformantes cresçam a 30 °C, geralmente durante 2-4 dias, até as colónias serem suficientemente grandes para dosear a actividade da β-galactosidase.

Os transformantes foram replicados em filtro Whatman número 1 estéril que foi aplicado sobre meio de crescimento selectivo. Depois das colónias terem crescido, nós realizamos dois ou mais ciclos de congelação/descongelação, 25 colocando o filtro em azoto líquido e à temperatura ambiente durante 0,5-1 minuto.

Colocou-se o filtro em 5 ml de solução de tampão Z/X-gal numa placa de 100-mm limpa e incubou-se a 30 °C, tipicamente, desde 30 minutos até 8 horas. Secou-se o filtro e fotografou-se para registar os dados.

Sabe-se que a proteína p53 de ratinho e o antigénio T SV40 grande interagem com o THS.

Utilizou-se os plasmídeos seguintes, pVA3-l, o qual codifica o híbrido do domínio de ligação ao ADN GAL4-p53 murídeo, e pTDl-1, o qual codifica o híbrido do domínio de activação do GAL4-antigénio T SV40 grande, como um controlo positivo no doseamento da β-galactosidase.

Doseamento Líquido da β-galactosidase Nós preparamos 5 ml de cultura dum dia para o outro em meio de selecção SD líquido apropriado para plasmídeos. Nós transferimos 2 ml da cultura para 8 ml de YPD e incubou-se a 30 °C durante 3-5 horas até as células se encontrarem na fase de crescimento logarítmico (D.0.6oo=0,5-0,8) .

Centrifugou-se a cultura a 14.000 rpm durante 30 segundos: no passo seguinte, nós retiramos os sobrenadantes, lavamos as células com um volume de tampão Z e ressuspendemos o sedimento em 900 μΐ de tampão Z. 26

Realizou-se imediatamente dois ou mais ciclos de congelação/descongelação, colocando os tubos em azoto liquido e num banho-maria a 37 °C durante 0,5-1 minuto. Finalmente, nós adicionamos 0,7 ml de solução de β-mercaptoetanol-tampão Z e 160 μΐ de ONPG (o-nitrofenil β-galactopiranósido, Sigma) a 4 mg/ml dissolvido em tampão Z a cada um dos tubos: incubou-se os tubos a 30 °C até aparecer a cor amarela.

Parou-se a reacção pela adição de 0,4 ml de Na2C03 1 M: nós registamos o tempo necessário para se obter os resultados e a D.O.420 das amostras.

As unidades de β-galactosidase foram calculadas por esta fórmula:

Unidades de β-galactosidase =1, 000 χ D.O.420/(t χ V χ D. 0.600 )

Em que: t= tempo decorrido em min de incubação; V= 0,1 ml; D.0.6oo= A6oo de 1 ml de cultura.

Extracto proteico de levedura e Transferência de Western

Para cada estirpe de levedura transformada, nós preparamos 5 ml de culturas dum dia para o outro em meio de selecção SD apropriado para os nossos plasmideos; nós também preparamos uma cultura de 10 ml da CG-1945 não transformada em YPD como um controlo negativo. Para cada clone a ser doseado (e para o controlo negativo) 27 separadamente, nós transferimos culturas dum dia para o outro em 50 ml de meio apropriado. Nós incubamos a cultura a 30 °C sob agitação até a D.0.6oo atingir 0,4-0,6: a cultura foi rapidamente arrefecida vertendo-a para um tubo de centrífuga de 100 ml pré-congelado e imediatamente centrifugada a 1000xg durante 5 min a 4 °C. Nós rejeitamos o sobrenadante e ressuspendemos o sedimento celular em 50 ml de água gelada: Recuperou-se o sedimento por centrifugação a l.OOOxg durante 5 min a 4 °C. Nós ressuspendemos o sedimento celular com tampão Cracking (Ureia 8M, SDS a 5%, Tris-HCl 40 mM, EDTA 0,1 mM, azul bromofenol, solução de inibidor de protease); nós adicionamos 80 μΐ de pérolas de vidro (425-600 μηο, SIGMA) . Aqueceu-se as amostras a 70 °C durante 10 minutos e agitou-se em vórtice durante 1 minuto. Centrifugou-se os detritos dos sedimentos e as células não destruídas numa microcentrífuga a 14.000 rpm durante 5 minutos. Transferiu-se os sobrenadantes para tubos de 1,5 ml com tampa de rosca novos e levou-se por breves instantes à ebulição. As amostras foram imediatamente transferidas para um gel ou armazenadas a -70 °C. Nós realizamos a transferência de Western utilizando extractos proteicos solúveis dos transformantes transferidos para gel de acrilamida a 15%. Nós testamos as manchas com anticorpos monoclonais específicos para o domínio GAL4, tais como os mAbs dos GAL4 BD e AD da Clontech. Para a detecção, nós utilizamos um anticorpo secundário de IgG de cabra anti-ratinho conjugada com HRP (BIORAD). 28

Referências

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Kallen, K.J. et al., (1997) The therapeutic potential of interleukin 6 hyperagonists and antagonists. Expert Opin. Invest. Drugs 6, 237-266;

Liitticken, C. et al., (1993) Association of transcription factor APRF and protein kinase JAK1 with the interleukin-6 signal transducer gpl30. Science 263, 89-92; 29

Matsuda, T. et al., (1995) Association and activation of Btk and Tec tyrosine kinases by gpl30, a signal transducer of the interleukin-6 family of cytokines. BLOOD 85, 627-633;

Murakami, N. et al., (1991) Criticai cytoplasmic region of the interleukin 6 signal transducer gpl30 is conserved in the cytokine receptor superfamily Proc. Nat. Acad. Sei. USA 88,11349-11353;

Tanner, J.W. et al., (1995) The conserved boxl motif of cytokine receptors is required for association with JAK cinases. Journal of Biological Chemistry 270, 6523-6530;

Van Aelst, L. et al., (1993). Complex formation between RAS and RAF and other protein kinases. Proc. Nat. Acad. Sei. USA 90, 6213-6217;

VanderKuur, J.A. et al., (1994) Domains of the growth hormone receptor required for association and activation of JAK2 tyrosine kinase. Journal Biological Chemistry 269, 21709-21717;

Yamasaki et al·., Science, 241, 825-828, 1988;

Yang M. et al., (1995) Protein-peptide interactions analyzed with the yeast two-hybrid system. Nucleic Acids Research 23,1152-1156;

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: (A) NOME: APPLIED RESEARCH ARS HOLDING N.V.

(B) RUA: 14 JOHN B. GORSIRAWEG

(C) CIDADE: CURAÇAO

(E) PAÍS: ANTILHAS HOLANDESAS

(F) CÓDIGO POSTAL: NENHUM (G) TELEFONE: 639300 (H) TELEFAX: 614129 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: PÉPTIDOS ANATAGONISTAS DA IL-6 (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 12 (iv) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete

(B) COMPUTADOR: compatível com PC IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1. (EPO) (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 1:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii)HIPOTÉTICO: NÃO 31

(iv) ANTIMENSAGEIRO: NÃO (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: sítio modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 3..4 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/nota= "Xaa é seleccionado de Gli, Leu e Ser" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: sítio modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 9..12 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/nota= "Xaa, se presente, é seleccionado de Gli, Arg, Asp e Ser" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1:

Met Giy Xaa Xaa Tbr Âxf Vai Gly Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 2:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTIMENSAGEIRO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

Mfet Giy ôly Leu Thr Ar* Vai Gly 1

S 32 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 3:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTIMENSAGEIRO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3: 11« 61 y Leu Ser Ser âltt Vai 61 y Arg Gly Asp 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 4:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTIMENSAGEIRO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4:

Ala Gly Pro Vai Lys Ala Hat Alã Vai Vai Arg Vai Sly Arg Arg Ser 1 5 10 IS 33 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 5:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTIMENSAGEIRO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5:

Th* &ttf se* wm His Qln Asn Asn Siâ Arf Ala Oiu Tb* Ser «et l $ 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 6:

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) ANTIMENSAGEIRO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6: 34

Txp Gly Α&ρ Asn Glu Trp Trp Mg Ser Glu Pxo Eis Lya Het Glu Leu

2 5 10 IS (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 7:

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTIMENSAGEIRO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7:

Ma Gly f rp Lya &ro Leu Ma Cys Arg Trp Thr Arg ser Gly Ile Ma

í 5 10 IS (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 8:

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTIMENSAGEIRO: NÃO 35 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 52 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTIMENSAGEIRO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9: CTSGAATTCA ATAÁGCSAG& CCTAATTAPA MACACATCT GGCCTAAIGT TC 52 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 10:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 45 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTIMENSAGEIRO: NÃO 45 36 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10: ACACGGGATC CTCACTGAGG CATGTAGCCG CCTTGCCGTA CAGTC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 11:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 15 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTIMENSAGEIRO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11:

TCATCGGAAC AGTAG IS (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 12:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTIMENSAGEIRO: NÃO 37 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12: 17

TACCACTACA ATGGATG

Lisboa, 11 de Dezembro de 2006

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Péptido antagonista de IL-6 compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID No: 6, assim como os seus sais e derivados funcionais.
2. Péptido de acordo com a reivindicação 1 que contém até 30 aminoácidos.
3. Péptido de acordo com a reivindicação 1, constituído pela sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6.
4. Péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes para ser utilizado como um medicamento.
5. Utilização de um péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3 para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma patologia seleccionada entre doenças hematológicas, doenças do sistema imunitário, doenças ósseas, tumores e doenças auto-imunes, assim como para a terapia de transplantações incluindo transplantes de órgãos sólidos e celulares.
6. Utilização do péptido de acordo com as reivindicações 1-3, para a preparação de composições farmacêuticas para o tratamento de patologias que requerem actividade antagonista de IL-6.
7. Composição farmacêutica que contém o péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3 em conjunto 2 2 e/ou excipientes com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Lisboa, 11 de Dezembro de 2006