JP4468578B2 - Il−6アンタゴニストペプチド - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明はgp130の細胞内ドメインに結合するその能力により2−ハイブリドシステムを通じてペプチドライブラリーから単離可能であり、且つ少なくとも5個のアミノ酸を含むIL−6アンタゴニストに関連する。詳しくは、かかるペプチドはSEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8、並びにその塩、機能性誘導体、前駆体及び類似体から成る群から選ばれるアミノ酸配列を含んで成る。
【0002】
本発明のその他の目的はIL−6活性阻害を要する病理における医薬組成物中で活性成分として利用するのに適当となるために実質的に純粋な形態においてペプチドを提供することにある。
【0003】
発明の背景
2−ハイブリドシステム(THS)はタンパク質−タンパク質相互作用を検出するために転写活性をシステムとして利用する方法である。酵母転写因子GAL4のDNA結合ドメインを任意のタンパク質「X」(通常は「つりえさ」結合標的である一定の哺乳動物タンパク質)とのハイブリドとしてコードするように構築される。X−Y相互作用が起こると、それは活性ドメインをGAL4 DNA結合ドメインにより認識されるDNA上の部位に近づけ、かくしてこのようなDNA部位により調節される隣接リポーター遺伝子の発現がもたらされる。一般に利用されるこのリポーター遺伝子は:1)X−GaLを含むプレート又はフィルター上に青色のコロニーを生成するlacZ;及び宿主酵母細胞の増殖のために必要なヒスチジン生合成に関与する酵母遺伝子His3;を含む。
【0004】
最近、Fields及びそのチームは網膜芽腫タンパク質(Rb)に結合できるペプチドを探すため、cDNAライブラリーの代わりに、ランダムペプチドのライブラリーをスクリーニングするのにTHSを使用した(Yangら、1995)。
【0005】
インターロイキン−6(IL−6)のためのレセプターシステムはgp80及びgp130と称される2つの異なるレポーター「サブユニット」から成る(Hiranoら、1994)。
【0006】
IL−6型サイトカインはgp130タンパク質を共有するレセプターを通じてそのシグナルを誘導する。リガンドの結合によりgp130はLIF及びOSMレセプターとホモ−又はヘテロ−二量化し、かくして集合したJAKチロシンキナーゼを活性化する。JAKはSTATファミリーのシグナルトランスデューサー(gp130)及び潜伏転写因子(シグナルトランスデューサー及び転写アクチベーター)、例えばIL−6の場合はSTAT1及びSTAT3をホスホリル化する。STAT因子は二量化し、核へと転位し、そしてIL−6応答遺伝子のエンハンサー要素に結合する(Luttikenら、1993)。
【0007】
gp130の細胞内ドメインの欠失分析は分裂促進活性及びJAKタンパク質の結合の双方に衝撃を及ぼすのに十分なbox1及びbox2として知られる規定の短いアミノ酸ストレッチを有する(Vanderkuurら、1994)。これらの活性はSTATの結合部位が欠失しているときにも観察された。従って、2つの機能がJAKキナーゼに寄与しうる:1)STAT−媒介遺伝子発現の活性化;2)少なくとも一部の造血細胞におけるSTAT−非依存性分裂促進活性の活性化。
【0008】
更なるキナーゼ、例えばHck,Fes,Btk及びTecがgp130の細胞内部に結合することで知られている(Matsuda ら、1995)。しかしながら、これらの相互作用は分子レベルでは明らかにされていない。更に、Tannerらはサイトカインレセプターのbox1ドメインがJAKキナーゼとの相互作用のために必要ではあるが、十分ではないことを実証し、そしてbox1配列はJAKキナーゼ会合を及ぼすのにその他のサイトプラズマドメイン配列と協力し合うことが示唆される(Tannerら、1995)。box1及びbox2のJAKキナーゼに対する分子カウンターパートでさえも特定されていない。
【0009】
IL−6活性を阻害する合成ペプチドは国際特許出願WO97/13781(YEDA)に記載され、それはgp80タンパク質に由来するペプチドに関連する。
【0010】
発明の説明
THSにおける標的として、我々はヒトIL−6レセプターの細胞内部分(gp130−ICD)を分析した。このTHSスクリーニングは従ってホスホリル化非依存式にgp130−ICDと直接相互作用できるペプチド候補を同定するであろう。gp130−ICDとのホスホリル化非依存相互作用はIL−6型サイトカインにより誘導されるシグナルの変換において起こることが知られている。このタイプのgp130−ICD相互作用カウンターパートにはJAKファミリーのタンパク質キナーゼが挙げられる(Darnell ら、1994)。
【0011】
従って、本発明の主要目的はgp130の細胞内ドメインに結合する能力により2−ハイブリドシステムを通じてペプチドライブラリーから単離可能であり、且つ少なくとも5個のアミノ酸を含むIL−6アンタゴニストペプチドにある。本発明の好適な態様によれば、かかるペプチドは30個までのアミノ酸、より好ましくは5〜20個、最も好ましくは8〜16個のアミノ酸を含む。
【0012】
本発明によれば、THSスクリーニングにおいて利用する「つりえさ」(「X」)はgp130タンパク質の細胞内ドメイン(ICD)である。かかるドメインはIL6−R(gp130)の642位のアミノ酸から918位のアミノ酸に至る領域に対応する(Yamasaki K. ら、1988)。THSスクリーニングにおける[魚」はランダムペプチドのライブラリーである。かかるライブラリーは任意の慣用のライブラリーであるか、又は公知の方法により「イン・ハウス」で製造できる。
【0013】
上記のスクリーニングに由来する偽陽性は論文に記載の通りにして排除されうる(Bartelら、1993)。
【0014】
更なる好適な態様に従うと、かかるペプチドはSEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8、並びにその塩、機能性誘導体、前駆体及び及び類似体から成る群から選ばれる。
【0015】
SEQ ID NO:1で、Xaa3 がGly、そしてXaa4 がLeuのとき、本発明のペプチドはSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含んで成る。
【0016】
本明細書において用いる「類似体」とは、上記の配列における1又は複数個のアミノ酸がIL−6アンタゴニスト活性に実質的な影響を及ぼすことなく変えられているペプチドを意味する。詳しくは、本発明に係る類似体についての好適な改変は「保存]置換として知られるものである。保存アミノ酸置換には同一のグループ内の同義アミノ酸であって同グループの構成員間での置換が分子の生物学的機能を保持せしめるのに十分似ている物理化学特性を有するアミノ酸によるアミノ酸変換が含まれる。 Grantham, Science, Vol. 185, pp.862-864 (1974)。
【0017】
同義アミノ酸のグループは表Iに規定のものである。より好ましくは、同義アミノ酸のグループは表IIに規定のものである;そして最も好ましくは、同義アミノ酸は表III に規定のものである。
【0018】
【表1】
【0019】
【表2】
【0020】
【表3】
【0021】
本明細書における用語「塩」とは、本発明のペプチド又はその類似体のカルボキシル基の塩及びアミノ基の酸付加塩の双方を意味する。カルボキシル基の塩は当業界において公知の手段により形成され得、そして無機塩、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、第二鉄又は亜鉛塩等、並びに例えばアミン、例えばトリエタノールアミン、アルギニン又はリジン、ピペリジン、プロカイン等とで形成されるような有機塩基との塩が挙げられる。酸塩には例えば鉱酸、例えば塩酸又は硫酸との塩、有機酸、例えば酢酸又はシュウ酸との塩が挙げられる。むろん、任意のかかる塩は本発明のペプチド又はその類似体と実質的に類似の活性を有さねばならない。
【0022】
本明細書で用いる定義「機能性誘導体」とは、公知の方法に従ってアミノ酸成分の側鎖又は末端N−もしくはC−基上に存在する官能基から調製でき、そしてそれらが医薬的に許容されるとき、即ち、それらがタンパク質活性を破壊しない又はそれらを含む医薬組成物に毒性を授けないときに本発明に包含される。かかる誘導体には例えばカルボキシル基のエステルもしくは脂肪族アミド及び遊離アミノ基のN−アシル誘導体又は遊離ヒドロキシル基のO−アシル誘導体が挙げられ、そして例えばアルカノイル−又はアロイル−基としてアシル基で形成される。
【0023】
「前駆体」はヒト又は動物の体内で本発明のペプチドへと変換される化合物をいう。
【0024】
「IL−6アンタゴニスト活性」はIL−6のそのレセプターに対する結合と拮抗することにより及び/又はIL−6依存性細胞、例えばミエローマ細胞における遺伝子活性化に結びつく分子シグナルを細胞内的に変換するレセプターシステムの機能を妨害する能力を意味する。従って、かかる活性は当業界公知の任意のアッセイにより測定できうる。かかるアッセイにはネズミプラスマ細胞腫T1165細胞の増殖、マウスM1骨髄様白血病細胞の増殖阻害、又は肝癌細胞からの急性期タンパク質の生産が挙げられる。
【0025】
本発明のペプチドは当業界における任意の周知の手順、例えば固相合成又は液相合成に調製できうる。固相合成としては、例えば合成すべきペプチドのC末端に対応するアミノ酸を有機溶媒中で不溶性である支持体に結合させ、そして反応の交互反復により、アミノ酸におけるそのα−アミノ基及び側鎖官能基が適当な保護基で保護されているものを一つずつC末端からN末端へと順々に縮合させ、そしてアミノ酸が樹脂に結合しているものか又はペプチドのα−アミノ基の保護基を遊離させ、ペプチドをかのようにして伸長させる。固相合成法は使用する保護基のタイプに依存し、tBoc法及びFmoc法に大きく分類される。
【0026】
典型的に利用される保護基には、アミノ基の場合にはtBoc(t−ブトキシカルボニル)、CL−Z(2−クロロベンジルオキシカルボニル)、Br−Z(2−ブロモベンジルオキシカルボニル)、BzL(ベンジル)、Fmoc(9−フルオレニルメトキシカルボニル)、Mbh(4,4’−ジメトキシジベンズヒドリル)、Mtr(4−メトキシ−2,3,6−トリメチルベンゼンスルホニル)、Trt(トリチル)、Tos(トシル)、Z(ベンジルオキシカルボニル)及びCl2 −Bzl(2,6−ジクロロベンジル);グルアニジノ基の場合にはNO2 (ニトロ)及びPmc(2,2,5,7,8−ペンタメチルクロマン−6−スルホニル);そしてヒドロキシル基の場合にはtBu(t−ブチル)が挙げられる。
【0027】
所望のペプチドの合成後、それを脱保護反応にかけ、そして固相支持体から切断する。かかるペプチド切断反応はBoc法の場合はフッ化水素又はトリフルオロメタンスルホン酸で実施し、そしてFmoc法の場合はTFAで実施してよい。
【0028】
このようにして得られた粗ペプチドを精製にかける。精製はこの目的のために知られている任意の方法のいずれか、即ち、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動等を包含する任意の慣用の手順により実施する。例えば、HPLC(高性能液体クロマトグラフィー)を利用してよい。この溶出はタンパク質精製のために一般に利用されている水−アセトニトリル系溶媒を利用して実施してよい。
【0029】
従って、本発明の別の目的はIL−6活性阻害を要する病理における医薬組成物において活性成分として利用するのに適当となるために実質的に純粋な形態においてペプチドを提供することにある。
【0030】
本発明に係る新規のペプチドが予防、治療又は診断用途のために好適に利用される病理には、血液疾患、免疫系疾患、骨疾患、腫瘍及び自己免疫疾患、並びに固体器官及び細胞の移植等の移植のための治療が挙げられる。
【0031】
上記のカテゴリーの特定の例には、以下の疾患が挙げられる:慢性リンパ球白血病(CLL)、プラスマ細胞腫/多発性骨髄腫、Castleman病(CD)、骨粗しょう症、乾癬、多発性硬化症、エリテマトーデス、糖尿病、リウマチ様関節炎、並びに慢性疾患における貧血及びるいそうが挙げられる。
【0032】
本発明の更なる目的及び利点は下記の説明で明らかとなるであろう。
【0033】
本発明の態様はIL−6活性阻害を要する病理の発症のおそれのある被検体又はかかる病理を既に示している被検体に本発明のペプチドを医薬的に活性な量で投与することにある。
【0034】
この活性物質に適合する任意の投与ルートが利用されうるが、特に好適なのは非経口投与であり、なぜならそれは短時間で全身作用を奏することを可能にするからである。
【0035】
投与するペプチドの用量は患者の年令、体重及び個別の応答に従って医療処方せんを基準に依存する。
【0036】
非経口利用のための医薬組成物は活性物質及び適当なビヒクルを含んで成る注射形態で調製できる。非経口投与のためのビヒクルは当業界において周知であり、そして例えば水、食塩水溶液及び生理学的バッファーを含んで成る。このビヒクルは溶液の安定性及び等張性を保つために少量の賦形剤を含んでよい。
【0037】
記載の溶液の調製は通常の手段に従って実施できる。
【0038】
実施例
実施例1:ペプチドライブラリーのスクリーニング
16−merランダムペプチドライブラリーを2−ハイブリドシステム(THS)でスクリーニングした。酵母GAL4活性化ドメイン(AD)コード配列をイン・フレームでかかるペプチドをコードする合成オリゴヌクレオチドのランダムライブラリーにライゲーションした。使用したベクターpGADGHはADH1プロモーター及び選択マーカーとして酵母Leu2遺伝子を担持するセントロマープラスミドである(図1)。このランダムペプチドライブラリーは約107 通りの独立クローンを含むものと推定された(材料及び方法を参照のこと)。
【0039】
RT−PCRを、ヒトgp130の細胞内部分を単離するためにHepG2細胞の中で実施した。対応のcDNAをイン・フレームでプラスミドpAS2−1内の酵母GAL4結合ドメイン(BD)コード配列でクローニングした。これはADH1プロモーター及び選択マーカーとして酵母TRP1遺伝子を担持するセントロマープラスミドである。
融合タンパク質の発現はウェスタンブロッティングにより確認した(図2)。
【0040】
我々の実験において、我々は2つのリポーター遺伝子lacZ及びHis3を担持する酵母株CG−1945を利用した(Estojak ら、1995)。
【0041】
我々は融合タンパク質gp130ic−GAL4BDをコードするプラスミドで予め形質転換された受容酵母細胞の各形質転換体について60μgのペプチドライブラリーを使用した。ADライブラリーにおいて所望の相互作用クローンを探すため、我々は約2×106 のクローンをスクリーニングした。
【0042】
我々は5通りの形質転換を実施し、そしてこれらの形質転換体全ての結果を以下に表にまとめる:
【0043】
スクリーニングした総クローン数 1.8×106
形質転換効率 1×104
(細胞/DNAのμg)
His3選択だけで得た総クローン数 250
lacZによる2回のスクリーニング後に
得た総クローン数 26
【0044】
ヒスチジン栄養要件についての選択(即ち、His3リポーター遺伝子とのTHS相互作用)についての選択の後、全部で250のクローンが1.8×106 個の形質転換クローンから生存した。第二リポーター遺伝子lac−Zについてのスクリーニングにより、我々は26の陽性クローンを見つけるのに成功した(図3)。
【0045】
実施例2:真性陽性クローンの単離
残っている偽陽性の大半を排除するため、当該ペプチドライブラリーをコードするTHS選択プラスミドを下記の条件でもとのスクリーニング株CG−1945へともどし形質転換した:1)追加のプラスミドなしで;2)GAL4 DNA結合ドメインのみをコードするプラスミドで(pAS2−1);3)完全「つりえさ」プラスミドで、又は4)無関係の融合タンパク質で(GAL4−BDに融合したヒトラミニン−Cの如き)(Bartelら、1993)。
【0046】
真性陽性クローンは上記の第三の条件でのみ陽性シグナルを生成する。
【0047】
上記の研究を完成させるため、我々は陽性「魚」プラスミドを均質とするまで単離し、そしてそれらをE.コリ(E.coli)に形質転換した。これらのAD/ライブラリープラスミドをそのLEU2マーカーを用いてE.コリ内で選択的に増幅させ、株HB101のE.コリLeuB突然変異を補完した。
【0048】
これらのプラスミドを酵母株のもどし形質転換に用い、上記の通りにして偽陽性を排除した。これらの手順の後、我々は9つの陽性クローンを単離した(図4)。
【0049】
配列分析から得られるデーターは(i)スクリーニングしたクローン全てが−より多くの(NNK)16オリゴヌクレオチドを含むにもかかわらず、第一オリゴヌクレオチド配列だけが全てのオリゴヌクレオチドの末端にあるイン−フレーム停止コドンに基づきGAL4 AD/ペプチド融合体として発現される;(ii)単離したペプチドのほとんどが予想通り16個のアミノ酸の全長を有する;(iii )いくつかのペプチドは既知のgp130−ICD相互作用タンパク質との相同性を示す;ことを示唆した。
【0050】
gp130−ICD−ペプチド相互作用を確認するため、我々はライブラリーインサートをADからDNA−BDベクターへと移動させることにより及びその逆を行うことによりクローニングベクターをスイッチすることもした。ついで我々はTHSアッセイを繰り返した(Van Aelst ら、1993)。
【0051】
我々は更に転写活性を定量するために液体β−ガラクトシダーゼアッセイも実施した。図5に示す通り、gp130−ICD/GAL4ADの存在下で、融合タンパク質クローンE/GAL4BDはgp130−ICD/GAL4ADの非存在下でよりも約2〜3倍高くlacZ遺伝子の転写活性を供することができ、従って第一選択後に検出される相互作用が確認できた。
【0052】
相同性
タンパク質データーベースサーチは極めて興味深いものと示され、なぜならそれは単離されたペプチドと、gp130の細胞質内ドメインで構成的に結合したJAK1及びTecの如きタンパク質との間での相同性を示したからである。このような相同性が小ストレッチに限られたとしても、このような結果は我々の将来の研究の案内となるのに有用でありうる(図6)。
【0053】
我々はクローンEを2通りの独立の形質転換で選択した:このクローンはJAK1との相同性を示した。Harpur及び共同研究者はJAKキナーゼを7つのドメインに分類している。それらはJAK相同体(JH)ドメイン1〜7と命名されている(Harpurら、1992)。
【0054】
JH1はチロシンキナーゼドメインに相当し、そしてJH2は推定セリン−スレオニンキナーゼドメインに相当する。このドメインJH3〜JH7は非触媒性ドメインであり、そして既知の機能はもたない。クローンEはJAK1との相同性を有する領域をわずかにしかもたない:この相同性はJH4ドメイン内にある。
【0055】
Harpur及び共同研究者はJAK2とGHレセプターとの結合が非触媒ドメインJH3〜JH7により媒介されるにちがいないと示唆している。これらのドメインはJAKファミリーの構成員内で構造的及び機能的に保存されている。JH4はこれらのドメインの中で最も保存されている。従って、我々はデーターはペプチドEにより規定されるJAK1のストレッチが機能的な役割を果たしうることを示唆する。それはgp130上のJAK1結合部位を擬態しうる。また、クローンCはTyk2との興味深い相同性を示す。この相同性はJH7内にある。
【0056】
その他のクローンはその他のキナーゼ、例えばLTKR、又タンパク質ANK1であって、その機能が必須の膜タンパク質の細胞骨格要素への付加を含むものとの同一性を示す。
【0057】
考察
サイトカインシグナル生成経路の研究は、シグナルが小モジュラータンパク質ドメインと短く且つ特異的なアミノ酸配列との結合により媒介されるタンパク質−タンパク質相互作用により生ずることを示唆する。例えば、Src相同体2(SH2)及びSrc相同体3(SH3)ドメインはホスホリル化チロシン残基又はプロリンリッチ領域のそれぞれと相互作用する60〜100の領域である。
【0058】
従って、JAKキナーゼ又はこれらのレセプターの各々のドメインがJAKキナーゼの結合のために必要であり、そしてある場合にはそれらはかかる結合の特異性を決定しうる。
【0059】
公開データーはこのような相互作用のいくつかに関与するgp130−ICDの正確な部位を示唆する。例えば、gp130のbox1ドメインはプロリン残基に富む8個のアミノ酸のモチーフである。このドメインは、box1配列がJAKキナーゼとサイトカインレセプターとの相互作用のために必要な二次構造の構築において重要な役割を果たすおそれが高い場合でも、JAKキナーゼとの相互作用に直接関与するであろう(Murakamiら、1991)。タンパク質−タンパク質相互作用に関与するgp130のその他のドメインはSTAT3及びSTAT1活性化に関与する共通配列YXPQである(Gerhartzら、1996)。
【0060】
我々はTHSによりgp130−ICDとランダムペプチドライブラリーとの結合を検討した。我々は、9つの独立のクローン/ペプチドを同定した。これらのペプチドはデーターバンクの中にあるタンパク質と相同性を示した。たとえこれらの相同性が小ストレッチに限定されようと、これらの結果は我々の将来の研究の案内のために有用でありうる。
【0061】
これらの予備データーが確認できたら、我々はgp130−ICDに結合するJAK1の如きキナーゼの正確な領域を同定できうる。我々のデーターは2−ハイブリドシステムペプチドスクリーニングが類似の結果を達成するための適当な技術であることも示唆する。
【0062】
材料及び方法
ハイブリドタンパク質をコードするプラスミドの構築
全てのハイブリド構築体をRT−PCRによる増幅を利用して作った。
【0063】
PCR反応は10μlのHepG2細胞のcDNA,50pmole づつの各プライマー(下記参照)、2.5ユニットのStratagene Pfuポリメラーゼ、0.2mMづつの4種のデオキシヌクレオチド三リン酸、10μlのPfuバッファーを100μlの反応容量の中に含み、50μlの鉱油をかぶせた。
【0064】
増幅は94℃で45秒、60℃で45秒、及び72℃で6分の温度プロファイルを30サイクル実施した。
【0065】
PCRフラグメント全てを適当な制限酵素(hgp130についてEcoRI/BamHI)で37℃で一夜かけて消化した。
【0066】
消化したPCR生成物を低融点アガロースゲル電気泳動及びMicrocon 100(Amicon)により精製した。これらのフラグメントをRapid DNAライゲーションキット(Boehringer Mannheim)によりpAS2−1及びpGADGHベクターの双方にライゲーションし、そしてE.コリTop10Fコンピテント細胞(Invitrogen)に形質転換した。
【0067】
MATCHMAKERランダムペプチドライブラリー(Clontech)は、BamHI及びEcoRI部位にはさまれ、末端停止コドンを含み、高発現性GAL4活性化ドメイン(AD)ベクターpGADGHに指向性クローニングされた合成(NNK)16オリゴヌクレオチド(N=A,G,C又はt;K=T又はG)から成る。GAL4ADに融合したランダム16−コドンペプチドの混合物をこのベクターから作った。
【0068】
【化1】
【0069】
ヒトGP130−ICD cDNAをUpgp130及びLogp130を用いてPCR増幅させた。
【0070】
DNA配列決定
DNA配列決定はABIモデル373A自動シーケンサーでDNA Sequencing Kit, Dye Primer Cycle Sequencing (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA, USA) を用い、製造者の仕様に従い、双方の鎖に対して実施した。
【0071】
相同性探索はGenBank,EMBL及びSwiss−Protデーターベースに対して実施した。
【0072】
【化2】
【0073】
LB(1L):10gのバクトトリプトン
5gの酵母抽出物
10gのNaCl
LBアガー(1L):10gのバクトトリプトン
5gの酵母抽出物
10gのNaCl
1.5gのアガー
【0074】
酵母株及び培地
アッセイ全てにサッカロマイセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)株CG−1945(Mat a,ura 3−52,his 3−200,Lys 2−801,ade 2−101,trp 1−901,Leu 2−3,112,gal 4−542,gal 80−538,cyhr 2,LYS::GAL1UASs−GAL1TATA−HIS3,URA3::GAL417-mer(x3)− CyC1TATA−lacZ)(Clontech Matchmaker)を使用した。CG−1945は種々のプロモーターのコントロール下にある2つのリポーター遺伝子を担持する:それ自体の上流活性化配列がGAL4結合部位で置き換えられたCYC1プロモーターのコントロール下にあるlacZ遺伝子及びGalIプロモーターのコントロール下にあるHis3遺伝子。
【0075】
従って、これらのプロモーターはGAL4結合部位以外をわずかに共有し、そして同じ酵母細胞で両リポーター遺伝子により実施するスクリーニングは数多くの偽陽性を排除するであろう。酵母培養物を30℃においてYPD培地(1%の酵母抽出物、2%のペプトン及び2%のグルコース)又はSD最小培地(アミノ酸抜きの0.5%の酵母窒素ベース、2%のグルコース及び1%の所望のアミノ酸抜きの溶液)の中で増殖させた。
【0076】
酵母形質転換及びβ−ガラクトシダーゼアッセイ
融合遺伝子をCG−1945株の中に酢酸リチウム形質転換手順により導入した(16)。我々は全ての細胞の上にSD/−Trp−Leu−His+3AT 10mMアガー培地を第一選択の実施のためにまいた。gp130−ICDとペプチドとの間で相互作用が起こると、2つのGAL4機能性ドメインはつながり、ヒスチジン発現がもたらされる。相互作用ハイブリドタンパク質を有する酵母細胞はかくしてこのアミノ酸を欠如した培地の中で増殖できる。
【0077】
酵母HIS3タンパク質(イミダゾールグリセロールリン酸デヒドラターゼ)の競合阻害剤である3−AT(3−アミノ1,2,4−トリアゾール)をいくつかのリポーター株内で漏出発現する低レベルのHis3pを阻害するのに用いた。形質転換体を通常は2〜4日間30℃で増殖させ、コロニーがβ−ガラクトシダーゼ活性のアッセイのために十分大きくなるようにする。
【0078】
形質転換体を選択増殖培地の上に重ねた無菌Whatmanナンバー1フィルターの上にレプリケートさせた。コロニーを増殖させた後、我々は2回以上の凍結/融解サイクルを実施した。これはフィルターを液体窒素の中、次いで室温に0.5〜1分置くことから成る。
【0079】
このフィルターを清浄な100mmプレート中の5mlのZ−バッファー/X−gal溶液の中に入れ、そして30℃で一般に30分〜8時間インキュベーションした。このフィルターを乾かし、そして写真撮影してデーターを記録した。
【0080】
マウスp53タンパク質及びSV40大型T−抗原はTHSと相互作用することがわかっている。
【0081】
GAL4 DNA結合ドメイン−ネズミp53ハイブリドをコードするプラスミドpVA3−1及びGAL4活性化ドメイン−SV40大型T−抗原ハイブリドをコードするプラスミドpTD1−1をβ−ガラクトシダーゼアッセイにおける陽性コントロールとして用いた。
【0082】
液体β−ガラクトシダーゼアッセイ
我々はプラスミドのために適当な液体SD選択培地の中で5ml一夜培養物を調製した。
【0083】
我々はこの培養物2mlを8mlのYPDに移し、そして細胞が中対数増殖となるまで(O.D.600 =0.5〜0.8)30℃で3〜5時間インキュベーションした。
【0084】
この培養物を14,000rpm で30秒遠心分離した。次の工程において、我々は上清液を取り出し、所定容量のZ−バッファーで細胞を洗い、そして900mlのZ−バッファーの中でこのペレットを再懸濁した。
【0085】
その直後に2回以上の凍結/融解サイクルを実施し、それはチューブを液体窒素、次いで37℃の湯浴の中に0.5〜1分入れておくことから成る。最後に、我々は0.7mlのβ−メルカプトエタノール−Zバッファー溶液及びZバッファーの中に4mg/mlで溶解させたONPG(o−ニトロフェニルβ−ガラクトピラノシド、Sigma)160μlを各チューブに加えた。これらのチューブを30℃でインキュベーションし、黄色を発色させた。
【0086】
反応は0.4mlの1MのNa2 CO3 の添加により停止させた。我々は結果を得るのにかかる時間及びサンプルのO.D.420 を記録した。
【0087】
β−ガラクトシダーゼ単位は次式により計算した:
β−ガラクトシダーゼ単位=1,000×O.D.420 /(t×V×O.D.600 )
ここで、t=インキュベーションの経過分;V=0.1mL;O.D.600 =1mlの培養物のA600 。
【0088】
酵母タンパク質抽出物及びウェスタンブロッティング
各形質転換酵母株について、我々は我々のプラスミドのために適当なSD選択培地中の5mlの一夜培養物を調製した。我々は陰性コントロールとしての未形質転換CG−1945の10mlの培養物も調製した。アッセイすべき各クローン(及び陰性コントロール)について、各々50mlの適当な培地において一夜培養物に移し入れた。
【0089】
我々はこの培養物をO.D.600 が0.4〜0.6に達するまで30℃で振盪させながらインキュベーションした。この培養物を予備冷却した100mlの遠沈管に注ぎ入れることにより急冷し、そして直ちに1,000×gで5分、4℃で遠心分離した。我々は上清液を捨て、そして細胞ペレットを50mlの氷冷水に再懸濁した。我々は細胞ペレットをクラッキングバッファー(尿素 8M,SDS 5%,Tris−HCl 40mM,EDTA 0.1mM、ブロモフェノールブルー、プロテアーゼインヒビター溶液)で再懸濁した。我々は80mlのガラスビーズ(425−600μm,SIGMA)を加えた。これらのサンプルを70℃で10分加熱し、そして1分間ボルテックスにかけた。ペレット塊及びこわれていない細胞をマイクロ遠心器で14,000rpm にて5分間遠心した。その上清液を新しい1.5mlのスクリューキャップに移し、そして軽く煮沸した。サンプルを直ちにゲルに載せるか、又は−70℃で保存した。
【0090】
我々は15%のアクリルアミドゲルい載せた形質転換体からの可溶性タンパク質抽出物を用いてウェスタンブロッティングを実施した。我々はこれらのブロットをGAL4ドメイン特異的モノクローナル抗体、例えばClontech由来のGAL4 BD及びADmAbでブロッティングした。我々は二次抗体HRP接合ヤギ抗マウスIgG(BIORAD)を検出のために用いた。
【0091】
【表4】
【0092】
【表5】
【0093】
【表6】
【0094】
【表7】
【0095】
【表8】
【0096】
【表9】
【0097】
【表10】
【0098】
【表11】
【0099】
【表12】
【図面の簡単な説明】
【図1】 gp130結合ペプチドのスクリーニングに利用するためのベクター。このプラスミドpASgp130はgp130−ICDに融合されたGAL4
DNA結合ドメイン(残基1〜147a.a.)をコードする;プラスミドpGADGHはGAL4活性化ドメイン(残基768−881a.a.)に融合したランダム16−merペプチド(NNK)16のライブラリーをコードする。
【図2】 酵母抽出物のウェスタンブロッティング。CG−1945(レーン1及び2)はGAL4BDをコードするpAS2−1(レーン3)又はgp130−GAL4BDをコードするpASgp130(レーン4)で形質転換した。タンパク質抽出物を15%のアクリルアミド−SDSゲルで分離し、そしてケミルミネッセンス検出システムにより分析した。分子量を表示してある(キロダルトン)。黒矢印はgp130−GAL4BDを示す;灰矢印はGAL4BDを示す。
【図3】 ペプチドライブラリー形質転換。酵母株CG−1945は60μgのライブラリープラスミドで形質転換した。細胞をSD/−Trp/−Leu/−His/+10mMの3−ATアガー培地上で30℃で増殖させた。4日後、いくつかのHis+ コロニーがプレート上に出現した。第一形質転換において、我々は20のHis+ クローンを単離した。図の中で番号付けしたそのうちの9つだけがlacZ+ でもった。
【図4】 ペプチド。THSにより単離されたペプチドのこれらは5つのホモロジーグループにまとめた。
【図5】 液体アッセイにおけるβ−ガラクトシダーゼ(lacZ)活性。酵母細胞内でのクローンE及びgp130−ICDの組合せは約30ユニット/mlのLacZ活性を供した。この値は3通りの独立の実験から得た。
【図6】 関連ホモロジー。ペプチドE(E1 )及びCといくつかのgp130結合チロシンキナーゼとの配列アラインメント。同一性はイタリック文字で示す。塩基性アミノ酸は(* )で示す。酸性アミノ酸には下線を付した。
【配列表】
Claims (2)
- SEQ ID No:6及びその塩から選ばれるアミノ酸配列から成る、IL−6アンタゴニストペプチド。
- SEQ ID No:6のアミノ酸配列から成る請求項1記載のペプチド。
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