DE19628873A1 - Cyclitol - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Enzym, geeignet zur Oxida­ tion von Cycloalkanpolyolen und Derivaten davon, ein Verfahren zur Herstellung des Enzyms und dessen Ver­ wendung.

Cycloalkanpolyole (Cyclitole) sind natürliche Kohlen­ hydrate (C_nH_2nOn). Sie sind epimere Polyole mit sta­ bilen Cycloalkan-Grundgerüst (Abb.1), von denen eini­ ge chirale Struktur haben; bedeutendste Vertreter der Cyclitole sind die 1,2,3,4,5,6-Cyclohexanhexole (Inositole), von denen es 9 Epimere gibt (myo-, scyl­ lo-, epi-, allo-, muco-, cis-, neo-, D- und L-chiro- Inositol). Desweiteren sind als Umwandlungsprodukte der Cyclitole 1,3,4,5,6-Pentahydroxycyclohexanon-2 (Inososen) zu nennen, von denen es auch eine Vielzahl von Epimeren mit und ohne chiraler Natur gibt [z. B. myo-, scyllo-, (+)epi-Inosose, usw. Letztere sind intermediäre Wertprodukte in der biologisch-chemi­ schen Epimerisierung der Inositole untereinander. Sie können als Derivate des Cyclohexanons als regenerier­ bare, CO₂-bilanzneutrale, reaktive bioorganische Syn­ thesebausteine als Alternative zu petrochemischen Produkten dienen.

Myo-Inositol ist das am häufigsten auftretende Isomer der Cyclitole. Es ist in allen Lebewesen anzutreffen. Auch die isomeren scyllo-, D- und L-chiro, neo- und muco-Inositole wurden bereits in biologischem Materi­ al nachgewiesen. Der größte Teil der vorkommenden Inositole liegt jedoch nicht frei, sondern in deriva­ tisierter Form vor, z. B. Phytin (Inositolhexa­ phosphat) oder in Phosphoinositiden als Bestandteil aller Zellmembranen. Aus diesen Verhältnissen ergeben sich verschiedene Aspekte ihrer Umwandlung zur Her­ stellung von Wertprodukten, die Bereiche der Chemie, Biochemie, Biologie, Medizin und Verfahrens- und Bio­ prozeßtechnik umfassen.

Ketocyclite stellen Wertprodukte als bioorganische Derivate des Cyclohexanons dar: Sie sind außer­ ordentlich vielseitig verwendbare Reagentien. Neben ihrem möglichen Einsatz als Diätetika und Zuckeraus­ tauschstoffe bei Diabetes, Galactosämie und Neuropa­ thien sind sie als reaktive Ausgangsstoffe für die bioorganische Synthese einer Hexuronsäurebiomasse einsetzbar. Zudem kommen sie als chirale Synthesebau­ steine und Zwischenprodukte für andere reaktive or­ ganische Verbindungen, z. B. für Aromaten (Polyhy­ droxybenzole), Heterozyclen (z. B. annellierten Tetra­ zole), Cycloalkane und Farbstoffsynthesen (z. B. Tri­ methinfarbstoffe) aus nachwachsender Kohlenhydratbio­ masse in Frage.

Von der chemischen Struktur betrachtet, handelt es sich bei der Inosose um ein Derivat des petrochemi­ schen Cyclohexanons. Cyclohexanon ist Ausgangsstoff für großtechnische Synthesen, wie z. B. Nylon, Pharma­ zeutika, Farbstoffe usw. Die Inososen können daher, wenn sie kostengünstig in großen Mengen zugänglich wären, als Ersatzstoffe von petrochemischen Grund­ stoffen dienen. Ein Ziel muß deshalb sein, Inososen aus nachwachsenden Rohstoffen in technischem Maßstab auf enzymtechnischem Weg zugänglich zu machen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht des­ halb darin, ein Enzym bereitzustellen, das Cyclitole und deren Derivate umwandeln kann. Eine weitere Auf­ gabe besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung dieses Enzyms bereitzustellen.

Diese Aufgaben werden durch ein Enzym gemäß Anspruch 1, eine DNA gemäß Anspruch 6 bzw. durch ein Verfahren gemäß Anspruch 7 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Von den Erfindern wurde gefunden, daß es möglich ist, Cyclitole mittels des erfindungsgemäßen Enzyms unter Verwendung eines Coenzyms und Wasserstoffakzeptors zu oxidieren. Der Elektronenakzeptor ist dabei bevorzugt Ubiquinon und Derivate davon. Das erfindungsgemäße Enzym ist ein reaktionsselektiver Proteinkatalysator zur Redoxreaktion an Cyclitolen und Ketocyclitolen.

Das erfindungsgemäße Enzym ist dadurch gekennzeich­ net, daß es ein hydrodynamisches Äquivalent der Mole­ kularmasse von etwa 87000 Da aufweist und u. a. fol­ gende Aminosäuresequenz enthält:

-F-R-V-H-P-T-I -A-P-Q-N-T-T-H-P-Q-E-

Weitere Sequenzabschnitte des erfindungsgemäßen En­ zyms sind:

Es können erfindungsgemäß auch eine oder mehrere Ami­ nosäuren verändert oder deletiert sein.

Die in den Aminosäuresequenzen aufgezählten Aminosäu­ ren sind im üblichen Einbuchstabencode angegeben.

Die Erfindung betrifft auch folgende DNA-Sequenzen:

Erfindungsgemäß kann die DNA auch Unterschiede von einem oder mehreren Basenpaaren aufweisen. Unter die Erfindung fällt auch mit den obigen DNA-Sequenzen hybridisierende DNA oder eine mit der genannten DNA über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.

Weiter ist das erfindungsgemäße Enzym durch folgende Eigenschaften charakterisiert:

• - Oxidation von Cyclitol [Cycloalkanpolyol], ins­ besondere von Inositol[1,2,3,4,5,6 Cyclohexanhe­ xol, C₆H₁₂O₆) und Derivaten davon, in vivo und in vitro unter Benutzung von Ubiquinon-Derivaten als Coenzymtyp und Wasserstoffakzeptor;
• - Biokatalyse genannter Reaktionen dadurch, daß Ubiquinon und seine Derivate als Coenzymtypen bevorzugt werden;
• - typische Proteineigenschaften und Proteinreak­ tionen (Folin- und Biuretreaktionen);
• - Schmelzpunkt: etwa 200°C (Zersetzung unter Luft- und Sauerstoffausschluß);
• - hydrodynamisches Äquivalent der Molekularmasse: 87′000 Dalton;
• - das native Protein besteht aus nur einer Peptid­ einheit (Protomer);
• - elektrophoretische Wanderung bei pH 7.40 in Acrylamidmatrizen ist anodisch;
• - löslich in wäßrigen Medien einschließlich 20% Ethanol bei einem pH-Wert von 4,0 bis 10,0;
• - es hat einen konstanten Temperaturkoeffizienten der Löslichkeit in Ammoniumsulfatlösungen zwi­ schen -10°C und +50°C;
• - es ist unlöslich in Chloroform, Benzol, Xylol und anderen apolaren nicht wäßrigen und mit Was­ ser nicht mischbaren Lösungsmitteln;
• - es denaturiert in Chloroform, Benzol und Xylol; Zerstörung der Konformationsstruktur und der Bioaktivität;
• - es hat ein typisches Proteinabsorptionsspektrum im sichtbaren und ultravioletten Frequenzbereich mit einem Verhältnis der Extinktionskoeffizien­ ten ε 280 nm / ε 260 nm = 1,5, ein Maximum bei 280 nm und ein Minimum bei 252 nm;
• - es adsorbiert reversibel an Anionen- und Katio­ nenaustauschern und kann nativ der Volumenver­ teilungs-Chromatographie unterworfen werden.

Als Protein ist das Enzym ein Makromolekül und, wie alle biologischen Makromoleküle, ein Polymer. Die kennzeichnende Eigenschaft eines jeden Polymers ist sein Aufbau aus einer Wiederholung von einer einzigen oder mehreren Struktureinheiten, genannt Monomere. Im Falle der Proteine sind die Monomere eine Gruppe von etwa 20 Aminosäuren. Für das Enzym der Erfindung sind diese Aminosäurebausteine oben im einzelnen beschrie­ ben. Diese sind untereinander im Protein durch eine Peptidbindung (R-CO-NH-X) in definierter Zahl und Reihenfolge (Sequenz) verknüpft. Sie spiegeln sich auch im angegebenen hydrodynamischen Äquivalent der Molekularmasse ("Molekulargewicht") wieder. Da man schon bei der Verknüpfung von nur zwei Aminosäuren aus einem Bausatz von 20 verschiedenen Aminosäuren 400 (=20²) verschiedene Strukturen aufbauen kann, ergibt dies bei z. B. 17 Aminosäuren die extrem große Zahl von 20¹⁷ = 1,3·10²² verschiedenen Verbindungen. Zum Vergleich sei erwähnt, daß nach dem heutigen Stand der Technik nur etwa 10⁴ Enzyme und etwa 5·10⁴ Proteine überhaupt bekannt sind. Daraus wird er­ sichtlich, daß bei weitem noch nicht alle möglichen Proteine bekannt sind. Die Maßgabe der ermittelten oben dargestellten Sequenz der 17 Aminosäuren als Teil des Protomers kennzeichnet das Enzym der Erfin­ dung als eine absolute Neuheit aus einer außerordent­ lich großen Vielzahl von 1,3·10²² möglichen chemisch­ en Verbindungen mit Proteinnatur. Sie ergibt sich durch nur eine einzige, bestimmte Kombination des für alle Proteine üblichen Aminosäure-Bausatzes aus der extrem großen Zahl von 1,3·10²² möglichen Stoffen.

Dies begründet hinreichend die hier erstmals offenge­ legten besonderen Stoffeigenschaften des neuen Enzyms der Erfindung. Als gekennzeichnet durch die neue Aminosäure-Sequenz als Unterscheidungsmerkmal von 1,3·10²² anderen möglichen Stoffen mit Proteinnatur wird verständlich, daß der erfindungsgemäße neue Pro­ teinstoff auch die erwähnten neuen besonderen Eigen­ schaften hat, insbesondere in Form der katalytischen Reaktions- und Stereospezifität. Das Enzym ist des­ halb auch frei von anderen biologischen und chemi­ schen Wirkungen, die als Eigenschaften von anderen Proteinstoffen, aufgebaut aus demselben Aminosäure- Bausatz, bekannt sind. Dies betrifft insbesondere folgende Eigenschaften bzw. Wirkungen:

• - keine Lyasewirkung auf C-C-, C-O-, und C-N-Bin­ dungen;
• - keine Ligasewirkung;
• - keine Oxidoreduktasewirkung auf nichtzyklische Alkanale, Ketoalkanale, Ketoalkane, Polyole und Hydroxyalkanale;
• - keine Xylit:NAD(P)-(1,2,4)-oxidoreduktaseaktivi­ tät (D-Xylose-, D- und L-Xylulose bildend), E.C.1.1.1.21; 1.1.1.09 und 1.1.1.10;
• - keine Inosit: Sauerstoffoxidoreduktase-(Inosit­ oxygenase-)aktivität, E.C.1.13.99.1;
• - keine L-Gulonat:NAD(P)-(3,6)-oxidoreduktaseakti­ vität, E.C.1.1.1.45 und 1.1.1.19;
• - keine Glucose-6-phosphatcyclase-(L-myo-Inositol- 1-phosphatsynthase-) Aktivität, E.C. 5.5.1.4;
• - keine Alkyl- und Aryl-Aldehyd:NAD(P)-oxidoreduk­ taseaktivität, E.C.1.2.1.3, E.1.2.1.5 und 1.2.1.7; keine Aldose-1-epimerase-(Mutarotase)­ aktivität, E.C. 5.1.3.3; keine Karbonat-hydro­ lyase-(Carboanhydrase-)aktivität, E.C. 4.2.1.1.

Das Enzym kann neben der erwähnten Aktivitätsbestim­ mung auch physikalisch-chemisch durch das erfindungs­ gemäße, mit dem molekular einheitlichen Enzymprotein hergestellte spezifische poly- oder monoklonalen An­ ti-Enzym-Antikörperserum oder dessen Anti-Enzym- Immunglobulinfraktionen nach den verschiedenen übli­ chen immunchemischen und immunbiologischen Methoden (z. B. Immunodiffusion, Immunoelektrophorese, RIA, Elisa, usw.) quantitativ bestimmt werden.

Das Enzym wird in den für Proteine üblichen Formen anwendungsbereit gehalten; dies sind sterile, konzen­ trierte, gepufferte Lösungen des Enzyms im Bereich von 0,01-10 mg/ml, insbesondere 0,5-10 mg/ml, vor­ zugsweise 5 mg/ml. Als Puffer können alle üblichen Mischungen im pH-Bereich zwischen 4,5 und 11 verwen­ det werden, insbesondere zwischen 6 und 9; vorzugs­ weise wird ein HEPES-Puffer verwendet, der 5 mM MgCl₂ und 0,5 N-Dodecyl-N,N-dimethyl-ammonio-3-propansul­ fonat enthält. Die Temperatur des gelösten, anwen­ dungsbereit gehaltenen erfindungsgemäßen Enzyms kann zwischen -180°C und +50°C sein, insbesondere zwi­ schen -40°C und +40°C; vorzugsweise findet eine Langzeitlagerung bei -80°C statt, und das für den Verbrauch bestimmte gelöste Enzym wird bei 0°C ste­ ril gehalten.

Das Enzym bzw. dessen Fragmente kann zu präparativen, synthetischen prozeßtechnischen, immunologischen, diagnostischen und analytischen, chemischen und bio­ logischen Verfahren in vivo und in vitro verwendet werden, z. B.

• - als bioorganische Synthesebausteine, insbesonde­ re in der Peptid- und Proteinsynthese;
• - als Katalysator zur Synthese von chiralen Keto­ cyclitolepimeren, insbesondere von Inososeepime­ ren, vorzugsweise mit Coenzym Q und Derivaten als Coenzym;
• - als Antigen, insbesondere zur Antikörperherstel­ lung oder -analyse und zu immunologischen Analy­ senmethoden (RIA, Elisa, u. a.);
• - als Testpackung zur Bestimmung von Cyclitolen, vorzugsweise von Inositolen der myo- und epi- Konfiguration, insbesondere mit Coenzym Q und Derivaten als Coenzym.

Abb. 1

Erfindungsgemäßes Enzym

Ein weiterer Anwendungsbereich, in dem das erfin­ dungsgemäße Enzym seinen großen Wert aufweist, ist die analytische Bestimmung von Inositen, insbesondere der myo-, epi- und D-chiro-Konfiguration im pH-Be­ reich zwischen 4 und 12, insbesondere zwischen pH 6 und 8, bevorzugt bei pH 7.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung und Gewinnung des Enzyms.

Die Gewinnung des Enzyms ist dadurch gekennzeichnet, daß man es aus Zellen, Geweben und deren Kulturen und Kulturüberstände nach Abtrennung von anderen Protei­ nen und Substanzen in molekular einheitlicher, kri­ stallisierbarer und biologisch selektiv wirkender und auch in biologisch inaktiver (denaturierter) Form erhalten kann, insbesondere dadurch, daß man Kulturen von Prokaryoten und Eukaryonten, insbesondere Kultu­ ren von Gluconobacter Oxidans, als Ausgangsmaterial verwendet; bevorzugt dadurch, daß man genbiologische Rekombinanten, deren Kulturen und Kulturüberstände als Ausgangsmaterial verwendet, welche eine natürli­ che, chemisch, synthetisierte oder molekularbiolo­ gisch oder aus natürlichen und anderen Zellen, Orga­ nellen und Geweben, deren Kulturen und Kulturüber­ ständen isolierte Oligonucleotidsequenz mit minde­ stens 6·3 = 18 Basen oder Teilen und homologen Se­ quenzen davon enthalten, die die nach Anspruch 1 ge­ gebene Aminosäureteilsequenzen codiert. Die Gewinnung des Enzyms kann auch durch chemische Proteinsynthese der nach Anspruch 1 gegebenen Aminosäure-Teilsequen­ zen oder Teilen und homologen Sequenzen davon gesche­ hen. Die Gewinnung des Enzyms ist auch möglich durch chemische oder biologische Synthese der Oligonucleo­ tid- oder Antisensenucleotid-Sequenzen in vivo und in vitro, welche die nach Anspruch 1 oder 5 gegebenen Aminosäure-Teilsequenzen codieren, mit mindestens 6·3 = 18 Basen (oder Teilen und homologen Sequenzen da­ von) und Anwendung dieser Strukturen durch in-vitro- oder in-vivo-Methoden, insbesondere durch die Polyme­ rase-Kettenreaktion ("PCR, Polymerase Chain Reac­ tion") und/oder die Antisense-Bioprozeßtechnik. Die Gewinnung des Enzyms ist weiter dadurch möglich, daß es durch Chromatographie-, Adsorptions- und/oder Aus­ salzfraktionierungsmethoden aus den oben genannten Quellen isoliert wird, insbesonders durch einzelne oder als Folge von Chromatographien an hydrophoben Phasen, Ionenaustauschern, Molekularsieben, Hydrox­ ylapatit und/oder an immunoadsorptiven Matrizen mit Affinität zu der nach Anspruch 1 oder 5 gegebenen Aminosäure-Teilsequenz oder der sie codierenden Oli­ gonucleotid-Sequenz oder Teilen und homologen Sequen­ zen davon.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird das Enzym aus Zellen, Geweben, deren Kulturen oder Kulturüber­ standslösungen erhalten, nachdem es von anderen Be­ gleitproteinen abgetrennt wurde. Als Zellen kommen Pro- und Eukaryonten in Betracht.

Besonders Zellen und Kulturen und Kulturüberstände von Essigsäurebakterien, vorzugsweise von Gluconobac­ ter oxidans, eignen sich als natürliche Enzymquelle. Sie enthalten das Enzym nicht nur in hinreichender Menge, sondern es kann auch daraus relativ einfach von den vielen verschiedenen Begleitproteinstoffen und Begleitenzymen abgetrennt und in molekular ein­ heitlichem, kristallisierbarem, anwendungsbereitem Zustand isoliert werden.

Allgemein bestehen Reinigungsverfahren für Eiweißkör­ per (Proteine) und andere Naturstoffe aus einer Se­ quenz kombinierter Trennungsverfahren, welche Mole­ külgrößen-, Ladungs-, Form-, Affinitäts-, Struktur­ stabilitäts- und Moleküloberflächen-Beschaffenheits­ unterschiede zwischen dem Naturstoff und den beglei­ tenden Fremdstoffen zur Trennung ausnutzen. Dement­ sprechend können zahlreiche Kombinationen verschie­ denster Trennungsverfahren zur Reinigung eines Pro­ teins erarbeitet werden. Für die Handhabungseigen­ schaften, technische Ausführbarkeit, Automatisierbar­ keit und Wirtschaftlichkeit eines Reinigungsverfah­ rens sowie für die Qualität des gesuchten Naturpro­ duktes ist deshalb nicht allein die Art der verwende­ ten Trennungsschritte von Bedeutung, sondern insbe­ sondere deren optimierte Gestaltung und deren sinn­ volle Kombination in einer Reinigungssequenz inner­ halb des Rahmens der Strukturstabilität und der ande­ ren Strukturparameter des gesuchten Stoffes. Das heißt auch, daß selbst die Benutzung gleicher oder ähnlicher Trennungsprinzipien (z . B. Molekularsiebfil­ tration, Dialyse, Ionenaustauschadsorptionen usw.), aber in unterschiedlicher Kombination, für die Hand­ habungsfähigkeit und Wirtschaftlichkeit des Reini­ gungsverfahrens entscheidend sein können. In bestimm­ ten Fällen ist die Benutzung oder Unterlassung einer einzigen Technik an einer bestimmten Stelle der Rei­ nigungssequenz oder innerhalb einer begrenzten Teil­ sequenz von ausschlaggebender Bedeutung für die Qua­ lität des gesuchten Naturproduktes sowie für die Handhabungsfähigkeit und die Wirtschaftlichkeit sei­ nes Reinigungsverfahrens. Klar aufgezeigt werden die­ se allgemeinen Zusammenhänge und Grundprinzipien der Naturstoffreinigung beispielsweise an der allgemein bekannten Tatsache, daß in einen wirtschaftlich ver­ nünftigen und technisch handhabungsfähigen Natur­ stoff-Reinigungsverfahren ein Dialyse-Ultrafiltra­ tions- oder Lyophilisierungsschritt nicht sinnvoll ist, bevor das Gesamtausgangsvolumen oder die Aus­ gangskonzentration der begleitenden Fremdbestandteile des Naturstoff-Rohextraktes nicht auf mindestens 1/500 bis 1/1000 durch andere Verfahrensschritte re­ duziert wurde.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Gewin­ nung des Enzyms in seiner nativen enzymatisch aktiven Form.

Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Gewinnung wird nachstehend im einzelnen erläutert unter Verwen­ dung von Bakterienkulturen von Gluconobacter oxidans als Enzymquelle.

Beispiele Allgemeines

Alle Arbeiten werden in der Kälte bei 4°C ausge­ führt. Die pH-Werte der Puffer werden bei Raumtempe­ ratur eingestellt.

1. Schritt Kultur von Mikroorganismen

Es wurde das Bakterium Gluconobacter oxidans DSM 50049 verwendet. Als Kulturmedium diente dazu eine Lösung von 5 g/l Hefeextrakt, 2 g/l Sorbitol und 30 g/l myo-Inositol. Es wurden Vorkulturen von 50 ml mit der Impföse angeimpft und 2 Tage bei 30°C in 100 ml Schikanekolben bei 120 Upm im Dunkeln gezüchtet. An­ schließend wurden die Hauptkulturen von 500 ml mit je 5 ml Vorkultur angeimpft und nach dreitägigem Schüt­ teln bei 110 Upm in 1-l-Schikanekolben durch Zentri­ fugation geerntet. Die Zellen wurden noch zweimal mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und ausgewo­ gen. Sie wurden entweder sofort weiterverwendet oder bei -20°C eingefroren.

Die Enzymbildung wurde in Abhängigkeit von der Kul­ turdauer untersucht. Dazu wurden nach Animpfung einer Hauptkultur in täglichem Abstand Proben von 5 ml ste­ ril entnommen und eingefroren. Nach Beendigung des Versuchs wurden alle Proben gleichzeitig aufgetaut.

Zur Bestimmung der Zelldichte wurde eine kleine Probe 1 : 10 mit Phosphatpuffer (4 mM, pH 7) verdünnt und die Absorption bei 600 nm gemessen.

Die restlichen Zellen wurden abzentrifugiert (30 min, 2000 g), mit 5 ml Phosphatpuffer gewaschen und in 0,5 ml Puffer aufgenommen. Diese Zellsuspension wurde ohne Aufschluß direkt mit dem Standardaktivitätstest auf Enzymaktivität untersucht.

2. Schritt Zellaufschluß und Membranpräparation

Die gewaschenen Zellen werden in 20 mM Phosphatpuffer +2 mM MgCl₂, pH 7.0 suspendiert, mit 1 mg/ml Lysozym versetzt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Anschlie­ ßend wurde die Zellsuspension dreimal mit der French- Presse aufgeschlossen, mit gleichem Volumen 20 mM Phosphatpuffer +2 mM MgCl₂ +1 M NaCl versetzt und die Membranfragmente bei 30000 Upm 60 min abzentrifu­ giert. Die Membranfragmente wurden nochmals mit 20 mM Phosphatpuffer +2 mM MgCl₂ +500 mM NaCl gewaschen, in Phosphatpuffer ohne Kochsalz suspendiert und der Proteingehalt auf etwa 30 mg/ml eingestellt. Die so hergestellte Membranfraktion wurde entweder sofort weiterbenutzt oder bei -80°C eingefroren.

3. Schritt Solubilisierung

Die Membranpräparation wurde 1 : 1 mit 20 mM Phosphat­ puffer versetzt, so daß der Proteingehalt bei ca. 15 mg/ml liegt. Die verdünnte Proteinlösung wurde mit n-Octylglucosid (2% w/v) versetzt, 60 min unter schwachem Schütteln inkubiert und 60 min bei 20000 rpm zentrifugiert. Der klare rötliche Überstand wurde als solubilisierte Proteinlösung weiterverwendet.

4. Schritt PEG-Fällung

Das solubilisierte Enzympräparat wurde mit 15% (w/v) PEG-6000 versetzt, 1 h bei 4°C inkubiert und an­ schließend 30 min bei 10000 rpm zentrifugiert. Der rötlich-braune Niederschlag wurde in 20 mM Tris-HCl- Puffer +2 mM MgCl₂+0,5% N-Dodecyl-N,N-dimethyl-ammo­ nio-3-propansulfonat, pH 7,6, über Nacht unter schwa­ chem Schütteln gelöst und bei 20000 Upm 30 min zen­ trifugiert. Der klare Überstand wurde durch ein 0,22- mm-Filter filtriert und weiterverwendet.

5. Schritt Chromatofokussierung an starken Anionenaustauschern (Mono Q®)

Die in Chloridform überführte Anionenaustauschersäule wurde mit folgendem Puffer äquilibriert: 10 mM Tris +10 mM Bis-Tris +10 mM MES +2 mM MgCl₂ +0,5% N-Dode­ cyl-N,N-dimethyl-ammonio-3-3-propansulfonat; pH 7,6 (Fokussierpuffer A). Anschließend wurde die aus Schritt 4 erhaltene Proteinlösung auf die Säule auf­ getragen, und die nicht absorbierten Proteine wurden mit dem Fokussierpuffer A ausgewaschen. Nun wurde ein Gradient in 6 Säulenvolumen vom Fokussierpuffer A zum Fokussierpuffer B (10 mM Tris +10 mM Bis-Tris +10 mM MES +2 mM MgCl₂ +0,5% N-Dodecyl-N,N-dimethyl-ammo­ nio-3-propansulfonat; pH 5,7) angelegt. Dabei eluier­ te das Enzym im Maximum der Proteinverteilungskurve am Ende des Gradienten und wurde dabei etwa 17-fach angereichert.

6. Schritt Anionenaustauschchromatographie an Mono Q®

Die aus Schritt 5 erhaltene aktive Proteinlösung wur­ de 1 : 1 mit 50 mM HEPES-Puffer + 2mM MgCl₂ + 0,5% Zwittergent 3-12, pH 8.0, versetzt und auf die mit 15 mM HEPES + 2 mM MgCl₂ + 0,5% N-Dodecyl-N,N-dimethyl­ ammonio-3-propansulfonat, pH 7.6, äquilibrierte Anio­ nenaustauschersäule aufgetragen. Nun wurde ein Salz­ gradient auf 200 mM LiCl in 15 Säulenvolumina ange­ legt. Dabei eluierte das aktive Enzym in einem sehr breiten Maximum der Proteinverteilungskurve, wobei mehrere Schultern und Maxima auftreten können. Dieses Enzympräparat zeigte in einer SDS-Gelelektrophorese (Gradient 10-15) eine Hauptbande bei ca. 85′000 Dal­ ton. Nach diesem Kriterium war das Enzympräparat als einheitlich anzusehen.

7. Schritt Aktivitätstests des Enzyms Allgemeines

Um einen Wirkstoffisolieren und reinigen zu können, ist es erforderlich, seine biologische Aktivität de­ tektieren zu können. Im Falle eines Enzyms wird dabei auf direktem oder indirektem Weg das Fortschreiten der enzymkatalysierten Umsetzung der an der Enzymre­ aktion beteiligten Stoffe (Substrate, Produkte, Coen­ zyme) erfaßt.

Bei den Dehydrogenasen bieten sich hierzu spektrosko­ pische Methoden an. Insbesondere die an der Dehydro­ genasereaktion beteiligten Cofaktoren haben in Abhän­ gigkeit von ihrem Redoxzustand unterschiedliche Ab­ sorptionsspektren. Deshalb können Dehydrogenasereak­ tionen direkt durch Messung der UV-Absorption bei definierten Wellenlängen verfolgt werden.

Eine andere Möglichkeit zur Detektion von Dehydroge­ nasen ist die Kopplung der Redoxäquivalente an wei­ tere Akzeptoren (Farbstoffe). Dabei wird der an der Enzymreaktion beteiligte Cofaktor oxidiert und der Farbstoffreduziert. Durch die Reoxidation des Cofak­ tors wird dieser durch die Reaktion nicht verbraucht und wird deshalb nur in katalytischen Mengen benö­ tigt. Die Reduktion des Farbstoffes bewirkt eine Än­ derung des Absorptionsspektrums (Farbumschlag) und kann somit durch Messung der Absorptionsänderung bei definierten Wellenlängen quantitativ verfolgt werden.

Gleichzeitig bewirkt diese Kopplung, daß das Reak­ tionsgleichgewicht auf die Produktseite verschoben wird.

Bei der untersuchten Inositoldehydrogenase handelt es sich um ein Coenzym-Q-abhängiges Enzym.

Die Inositoldehydrogenase wurde durch einen direkten und mehrere gekoppelte Aktivitätstests charakteri­ siert.

Es wurde die Enzymeinheit Unit (U) verwendet. Eine Enzymeinheit (U) wurde als die Enzymmenge definiert, die ein µmol-Substab, z. B. Inositol, pro Minute um­ setzt. Folglich ergibt sich entsprechend der inter­ nationalen Definition (International Union of Pure and Applied Chemistry and the International Union of Biochemistry, 1973):

1 U = 16,6·10^-9 kat = 16,6·10^-9 mol/s

Der Standardaktivitätstest

Der Standard-Aktivitätstest wurde aufgrund seiner einfachen Durchführbarkeit für alle Routinemessungen der Enzymaktivität eingesetzt. Als Standard-Aktivi­ tätstest wurde eine 5-Methylphenaziniummethysul­ fat(PMSD)-gekoppelte Reduktion von Dichlorphenolindo­ phenol (DCIP) nach dem Stand der Technik verwendet.

Um die Enzymaktivität der erfindungsgemäßen Inositol­ dehydrogenase bestimmen zu können, war es erforder­ lich, dem Testsystem zusätzlich noch Coenzym Q2 und Phospholipide zuzusetzen, da diese für die Enzymak­ tivität notwendigen Substanzen bei der Enzymreinigung abgetrennt werden und ohne diesen Zusatz nach nahezu allen untersuchten chromatographischen Reinigungs­ schritten nur noch sehr geringe Aktivitätsmengen de­ tektiert werden konnten. Die Reaktion wurde durch Messung der Extinktionsabnahme bei 600 nm photome­ trisch bei pH 7,0 verfolgt.

Die Berechnung der Enzymaktivität wurde ein Extink­ tionskoeffizient des DCIP bei pH 7,0 von ε_600nm = 20,6 mM^-1 nach dem Stand der Technik verwen­ det.

Vorbereitung der phospholipidhaltigen Coenzym-Q₂-Lösung

1 mg Coenzym Q₂ (Decylubiquinon) wurde mit 10 mg Phosphatidylinositol (50%ig) in wenig Chloroform gelöst, im Vakuum getrocknet und in 0,5 ml 2%iger wäßriger n-Octylglukosid-Lösung im Ultraschallbad dispergiert. Das so dargestellte phospholipidhaltige Coenzym Q₂ wird im Folgenden PQ₂ genannt. Durch die Pipettierung in den Test wird das Detergens unter die kritische Myzellbildungskonzentration verdünnt, und es entstehen dadurch Coenzym-Q₂-haltige Liposomen.

Im einzelnen wurden zur Ausführung des Standard-Akti­ vitätstests folgende Lösungen nacheinander in die Küvette pipettiert.
750 µl Testpuffer (100 mM MOPS, 5 mM MgCl₂; pH 7,0
4 µl PQ₂
2 µl Enzymlösung
50 µl 1,5 mM DCIP-Lösung
100 µl 10 mM PMS-Lösung.

Die Testküvette wurde auf 30°C temperiert, die Reak­ tion mit 100 µl 200 mM myo-Inositollösung gestartet und der Extinktionsverlauf 2 min aufgezeichnet.

Claims (10)

1. Enzym, geeignet zur Oxidation von Cyclitolen und deren Derivaten, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym ein hydrodynamisches Äquivalent der Molekularmasse von etwa 87000 Da aufweist und folgende Aminosäuresequenz enthält: -F-R-V-H-P-T-I-A-P-Q-N-T-T-H-P-Q-E-

2. Enzym nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das native Enzym aus nur einer Peptideinheit (Protomer) besteht.

3. Enzym nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Schmelz­ punkt von etwa 200°C (Zersetzung unter Luft- und Sauerstoffausschluß) aufweist.

4. Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym eine Cyc­ litol-Ubiquinon-Oxidoreduktase ist.

5. Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym weiter folgende Sequenzabschnitte aufweist:

6. DNA, kodierend für das Enzym nach Anspruch 1, wobei die DNA umfaßt:

• (a) die folgenden DNA-Sequenzen oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA,
• (b) eine mit der DNA von (a) hybridisierende DNA, oder
• (c) eine mit der DNA von (a) oder (b) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.

7. Verfahren zur Herstellung des Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 5 durch

• a) Aufarbeitung von Zellen, Geweben, genbiolo­ gischen Rekombinanten, deren Kulturen und Kulturüberständen nach Abtrennung von ande­ ren Proteinen oder Substanzen in an sich bekannter Weise, oder
• b) chemische Proteinbiosynthese mittels Syn­ thesizer.

8. Verwendung des Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 5 als Katalysator zur Analytik und Synthese von Ketocyclitolepimeren, insbesondere von Ino­ soseepimeren, vorzugsweise mit Coenzym Q und Derivaten als Coenzym.

9. Verwendung des Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 5 als Antigen, insbesondere zur Antikörper­ herstellung oder -analyse und zu immunologischen Analysenmethoden (insbesondere RIA, ELISA).

10. Verwendung der Enzmystruktur als cDNA zur Analy­ se und Synthese entsprechender molekularbiologi­ scher Äquivalenzstrukturen und assoziierter Funktionen.