WO1997004101A2 - Enzym geeignet zur oxidation von cyclitolen und ihren derivaten - Google Patents

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Josef Wissler
Klaus-Wilhelm Freivogel
Wolfgang Wiesner
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Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V.
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    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes

Definitions

  • the invention relates to an enzyme suitable for the oxidation of cycloalkane polyols and derivatives thereof, a process for the preparation of the enzyme and its use.
  • Cycloalkane polyols are natural carbohydrates (C n H 2n O n ). They are epimeric polyols with a stable cycloalkane backbone (Fig.1), some of which have a chiral structure; The most important representatives of the cyclitols are the 1,2,3,4,5,6-cyclohexane hexols
  • Myo-inositol is the most common isomer of cyclitols. It can be found in all living things. The isomeric scyllo-, D- and L-chiro, neo- and muco-inositols have already been detected in biological material. However, the majority of the inositols occurring are not free, but are in a derivatized form, e.g. Phytin (inositol hexaphosphate) or in phosphoinositides as a component of all cell membranes. These relationships result in various aspects of their conversion to the production of valuable products, which include areas of chemistry, biochemistry, biology, medicine and process and bioprocess engineering.
  • Ketocyclites are valuable products as bio-organic derivatives of cyclohexanone: they are extremely versatile reagents. In addition to their possible use as dietetics and sugar substitutes in diabetes, galactosemia and neuropathies, they can be used as reactive starting materials for the bioorganic synthesis of a hexuronic acid biomass. They can also be used as chiral synthesis building blocks and intermediates for other reactive organic compounds, e.g. for aromatics (polyhydroxybenzenes), heterocycles (e.g. fused tetrazoles), cycloalkanes and dye syntheses (e.g. trimethine dyes) from renewable carbohydrate biomass.
  • aromatics polyhydroxybenzenes
  • heterocycles e.g. fused tetrazoles
  • dye syntheses e.g. trimethine dyes
  • inososis is a derivative of petrochemical cyclohexanone.
  • Cyclohexanone is the starting material for large-scale syntheses, such as nylon, pharmaceuticals, dyes, etc.
  • the inososes can therefore, if they were inexpensively available in large quantities, serve as substitutes for petrochemical raw materials.
  • One goal must therefore be to make inososes from renewable raw materials accessible on an industrial scale by enzyme technology.
  • the object of the present invention is therefore to provide an enzyme which can convert cyclitols and their derivatives. Another object is to provide a method for producing this enzyme.
  • the inventors have found that it is possible to oxidize cyclitols by means of the enzyme according to the invention using a coenzyme and hydrogen acceptor.
  • the electron acceptor is preferably ubiquinone and derivatives thereof.
  • the enzyme according to the invention is a reaction-selective protein catalyst for the redox reaction on cyclitols and ketocyclitols.
  • the enzyme according to the invention is characterized in that it has a hydrodynamic equivalent of a molecular mass of about 87,000 Da and contains, inter alia, the following amino acid sequence: -FRVHPTIAPQNTTHPQE-
  • one or more amino acids can also be changed or deleted.
  • amino acids listed in the amino acid sequences are given in the usual one-letter code.
  • the invention also relates to the following DNA sequences:
  • the DNA can also have differences of one or more base pairs.
  • the invention also includes DNA hybridizing with the above DNA sequences or a DNA related to the said DNA via the degenerate genetic code.
  • the enzyme according to the invention is further characterized by the following properties: Oxidation of cyclitol [cycloalkane polyol], in particular of inositol 1,2,3,4,5,6 cyclohexane hexol, C 6 H 12 O 6 ] and derivatives thereof, in vivo and in vitro using ubiquinone derivatives as coenzyme type and hydrogen acceptor;
  • the native protein consists of only one peptide unit (protomer); - electrophoretic migration at pH 7.40 in
  • Acrylamide matrices are anodic; - soluble in aqueous media including 20% ethanol at pH 4.0-10.0; - It has a constant temperature coefficient of solubility in ammonium sulfate solutions between -10 ° C and +50 ° C; - It is insoluble in chloroform, benzene, xylene and other apolar, non-aqueous and water-immiscible solvents; - it denatures in chloroform, benzene and xylene;
  • the enzyme As a protein, the enzyme is a macromolecule and, like all biological macromolecules, a polymer.
  • the distinctive property of any polymer is its construction from a repetition of a single or multiple structural units called monomers.
  • the monomers are a group of about 20 amino acids.
  • these amino acid building blocks are described in detail above. These are mutually defined in the protein by a peptide bond (R-CO-NH-X) and Order (sequence) linked. They are also reflected in the stated hydrodynamic equivalent of the molecular mass ("molecular weight").
  • the enzyme can also be physico-chemically produced by the specific poly- or monoclonal type of the invention which is produced with the molecularly uniform enzyme protein ti-enzyme antibody serum or its anti-enzyme immunoglobulin fractions can be determined quantitatively according to the various customary immunochemical and immunobiological methods (eg immunodiffusion, immunoelectrophoresis, RIA, Elisa, etc.).
  • the enzyme is kept ready for use in the forms customary for proteins; these are sterile, concentrated, buffered solutions of the enzyme in the range of 0.01-10 mg / ml, in particular 0.5-10 mg / ml, preferably 5 mg / ml. All customary mixtures in the pH range between 4, 5 and 11 can be used as buffers, in particular between 6 and 9; a HEPES buffer is preferably used which contains 5 mM MgCl 2 and 0.5 N-dodecyl-N, N-dimethyl-ammonio-3-propanesulfonate.
  • the temperature of the dissolved, ready-to-use enzyme according to the invention can be between -180 ° C and +50 ° C, in particular between -40 ° C and +40 ° C; Long-term storage at -80 ° C is preferred, and for the
  • the enzyme or its fragments can be used for preparative, synthetic process engineering, immunological, diagnostic and analytical, chemical and biological processes in vivo and in vitro, for example - as bioorganic synthesis building blocks, in particular in peptide and protein synthesis; as a catalyst for the synthesis of chiral ketocyclitol epimers, in particular of inosose epimes ren, preferably with coenzyme Q and derivatives as coenzyme; - As an antigen, especially for antibody production or analysis and for immunological analysis methods (RIA, Elisa, etc.); - As a test pack for the determination of cyclitols, preferably inositols of the myo- and epi-configuration, in particular with coenzyme Q and derivatives as coenzyme.
  • a test pack for the determination of cyclitols, preferably inositols of the myo- and epi-configuration, in particular with coenzyme Q and derivatives as coenzyme.
  • inositols in particular the myo, epi and D-chiro configuration in the pH range between 4 and 12, in particular between pH 6 and 8, preferably at pH 7.
  • the invention also relates to a process for producing and obtaining the enzyme.
  • the enzyme can also be obtained by chemical protein synthesis of the partial amino acid sequences or parts and homologous sequences thereof according to claim 1.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the extraction of the enzyme is further possible by using chromatography, adsorption and / or salt-out fractionation methods from the above Sources is isolated, in particular by single or as a result of chromatographies on hydrophobic phases, ion exchangers, molecular sieves, hydroxylapatite and / or on immunoadsorptive matrices with affinity for that given in claim 1 or 5
  • the enzyme is obtained from cells, tissues, their cultures or culture supernatant solutions after it has been separated from other accompanying proteins. Pro and eukaryotes come into consideration as cells.
  • Cells and cultures and culture supernatants of acetic acid bacteria are particularly suitable as a natural enzyme source. They not only contain the enzyme in sufficient quantity, but it can also be separated from it from the many different accompanying protein substances and accompanying enzymes relatively easily and isolated in a molecularly uniform, crystallizable, ready-to-use state.
  • cleaning processes for protein bodies (proteins) and other natural products consist of a sequence of combined separation processes which take advantage of differences in molecular size, charge, shape, affinity, structural stability and molecular surface properties between the natural product and the accompanying foreign substances for the separation. Accordingly, numerous combinations of different separation processes for the purification of a protein can be developed. For your own handling Shafts, technical feasibility, automatability and economy of a cleaning process as well as for the quality of the natural product sought is therefore not only the type of separation steps used, but in particular their optimized design and their meaningful combination in a cleaning sequence within the framework of the structural stability and the other structural parameters of the searched substance. This also means that even the use of the same or similar separation principles (e.g.
  • 1st step culture of microorganisms.
  • the enzyme formation was examined depending on the culture period. After inoculation, a Main culture 5 ml samples are taken sterile and frozen at daily intervals. After the end of the experiment, all samples were thawed at the same time. To determine the cell density, a small sample was diluted 1:10 with phosphate buffer (4 mM, pH 7) and the absorption was measured at 600 nm.
  • the washed cells are suspended in 20 mM phosphate buffer +2 mM MgCl 2 , pH 7.0, 1 mg / ml lysozyme is added and the mixture is incubated at 4 ° C. overnight.
  • the cell suspension was then digested three times with the French press, the same volume of 20 mM phosphate buffer +2 mM MgCl 2 +1 M NaCl was added, and the membrane fragments were centrifuged at 30,000 rpm for 60 min.
  • the membrane fragments were washed again with 20 mM phosphate buffer + 2 mM MgCl 2 +500 mM NaCl, suspended in phosphate buffer without sodium chloride and the protein content adjusted to about 30 mg / ml.
  • the membrane fraction thus produced was either immediately used again or frozen at -80 ° C.
  • the membrane preparation was mixed 1: 1 with 20 mM phosphate buffer, so that the protein content at 15 mg / ml.
  • the diluted protein solution was mixed with n-octylglucoside (2% w / v), incubated for 60 min with gentle shaking and centrifuged at 20,000 rpm for 60 min. The clear reddish supernatant was used as a solubilized protein solution.
  • the solubilized enzyme preparation was mixed with 15% (w / v) PEG-6000, incubated for 1 h at 4 ° C. and then centrifuged for 30 min at 10000 rpm.
  • the reddish-brown precipitate was in 20 mM Tris-HCl buffer +2 mM MgCl 2 +0.5% N-dodecyl-N, N-dimethyl-ammonio-3-propanesulfonate, pH 7.6, overnight with gentle shaking dissolved and centrifuged at 20,000 rpm for 30 min.
  • the clear supernatant was filtered through a 0.22mm filter and reused.
  • Anion exchangers (Mono Q ® ) The anion exchange column converted to chloride was equilibrated with the following buffer: 10 mM Tris +10 mM Bis-Tris +10 mM MES +2 mM MgCL 2 +0.5% N-dodecyl-N, N- dimethyl ammonio 3-3 propane sulfonate; pH 7.6 (focusing buffer A). Then it was out
  • Protein solution obtained in step 4 was applied to the column and the unabsorbed proteins were washed out with focusing buffer A.
  • focusing buffer A 10 mM Tris +10 mM Bis-Tris +10 mM MES +2 mM MgCl 2 +0.5% N-dodecyl-N, N-dimethyl-ammonio-3 propane sulfonate; pH 5.7).
  • the enzyme eluted at the maximum of the protein distribution curve at the end of the gradient and was enriched about 17 times.
  • the active protein solution obtained from step 5 was 1: 1 with 50 mM HEPES buffer + 2mM MgCl 2 + 0.5%
  • Step 7 activity tests of the enzyme
  • dehydrogenases Spectroscopic methods are available for this in the case of dehydrogenases.
  • the cofactors involved in the dehydrogenase reaction in particular have different absorption spectra depending on their redox state. Therefore, dehydrogenase reactions can be followed directly by measuring the UV absorption at defined wavelengths.
  • dehydrogenases Another possibility for the detection of dehydrogenases is to couple the redox equivalents to other acceptors (dyes).
  • the cofactor involved in the enzyme reaction is oxidized and the dye is reduced. Due to the reoxidation of the cofactor, it is not consumed by the reaction and is therefore only required in catalytic amounts.
  • the reduction of the dye causes a change in the absorption spectrum (color change) and can thus be followed quantitatively by measuring the change in absorption at defined wavelengths. At the same time, this coupling causes the reaction equilibrium to be shifted to the product side.
  • the inositol dehydrogenase investigated is a coenzyme Q-dependent enzyme.
  • Inositol dehydrogenase was characterized by one direct and several coupled activity tests.
  • the enzyme unit Unit (U) was used.
  • the standard activity test was used for all routine measurements of enzyme activity due to its simple feasibility.
  • a 5-methylphenazinium methysulfate (PMSD) -coupled reduction of dichlorophenolindophenol (DCIP) according to the prior art was used as the standard activity test.
  • PMSD 5-methylphenazinium methysulfate
  • DCIP dichlorophenolindophenol
  • the calculation of the enzyme activity was an extinction coefficient of the DCIP at pH 7.0
  • test buffer 100 mM MOPS, 5 mM MgCl 2 ; pH 7.0
  • test cuvette was heated to 30 ° C., the reaction was started with 100 ⁇ l of 200 mM myo-inositol solution and the absorbance curve was recorded for 2 minutes.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Enzym, geeignet zur Oxidation von Cycloalkanpolyolen und Derivaten davon, ein Verfahren zur Herstellung des Enzyms und dessen Verwendung.

Description

Cyclitol
Die Erfindung betrifft ein Enzym, geeignet zur Oxidation von Cycloalkanpolyolen und Derivaten davon, ein Verfahren zur Herstellung des Enzyms und dessen Verwendung.
Cycloalkanpolyole (Cyclitole) sind natürliche Kohlenhydrate (CnH2nOn) . Sie sind epimere Polyole mit stabilen Cycloalkan-Grundgerüst (Abb.1), von denen einige chirale Struktur haben; bedeutendste Vertreter der Cyclitole sind die 1,2,3,4,5,6-Cyclohexanhexole
(Inositole), von denen es 9 Epimere gibt (myo-, scyllo-, epi-, allo-, muco-, eis-, neo-, D- und L-chiroInositol). Desweiteren sind als Umwandlungsprodukte der Cyclitole 1,3,4,5,6-Pentahydroxycyclohexanon-2 (Inososen) zu nennen, von denen es auch eine Vielzahl von Epimeren mit und ohne chiraler Natur gibt [z.B. myo-, scyllo-, (+) epi-Inosose, usw. Letztere sind intermediäre Wertprodukte in der biologisch-chemi sehen Epimerisierung der Inositole untereinander. Sie können als Derivate des Cyclohexanons als regenerierbare, CO2-bilanzneutrale, reaktive bioorganische Synthesebausteine als Alternative zu petrochemischen Produkten dienen.
Myo-Inositol ist das am häufigsten auftretende Isomer der Cyclitole. Es ist in allen Lebewesen anzutreffen. Auch die isomeren scyllo-, D- und L-chiro, neo- und muco-Inositole wurden bereits in biologischem Material nachgewiesen. Der größte Teil der vorkommenden Inositole liegt jedoch nicht frei, sondern in derivatisierter Form vor, z.B. Phytin (Inositolhexaphosphat) oder in Phosphoinositiden als Bestandteil aller Zellmembranen. Aus diesen Verhältnissen ergeben sich verschiedene Aspekte ihrer Umwandlung zur Herstellung von Wertprodukten, die Bereiche der Chemie, Biochemie, Biologie, Medizin und Verfahrens- und Bioprozeßtechnik umfassen.
Ketocyclite stellen Wertprodukte als bioorganische Derivate des Cyclohexanons dar: Sie sind außerordentlich vielseitig verwendbare Reagentien. Neben ihrem möglichen Einsatz als Diätetika und Zuckeraustauschstoffe bei Diabetes, Galactosämie und Neuropathien sind sie als reaktive Ausgangsstoffe für die bioorganische Synthese einer Hexuronsäurebiomasse einsetzbar. Zudem kommen sie als chirale Synthesebausteine und Zwischenprodukte für andere reaktive organische Verbindungen, z.B. für Aromaten (Polyhydroxybenzole), Heterozyclen (z.B. annellierten Tetrazole), Cycloalkane und FarbstoffSynthesen (z.B. Trimethinfarbstoffe) aus nachwachsender Kohlenhydratbiomasse in Frage. Von der chemischen Struktur betrachtet, handelt es sich bei der Inosose um ein Derivat des petrochemischen Cyclohexanons. Cyclohexanon ist Ausgangsstoff für großtechnische Synthesen, wie z.B. Nylon, Pharmazeutika, Farbstoffe usw. Die Inososen können daher, wenn sie kostengünstig in großen Mengen zugänglich wären, als Ersatzstoffe von petrochemischen Grundstoffen dienen. Ein Ziel muß deshalb sein, Inososen aus nachwachsenden Rohstoffen in technischem Maßstab auf enzymtechnischem Weg zugänglich zu machen.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht deshalb darin, ein Enzym bereitzustellen, das Cyclitole und deren Derivate umwandeln kann. Eine weitere Aufgäbe besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung dieses Enzyms bereitzustellen.
Diese Aufgaben werden durch ein Enzym gemäß Anspruch 1, eine DNA gemäß Anspruch 6 bzw. durch ein Verfahren gemäß Anspruch 7 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Von den Erfindern wurde gefunden, daß es möglich ist, Cyclitole mittels des erfindungsgemäßen Enzyms unter Verwendung eines Coenzyms und Wasserstoffakzeptors zu oxidieren. Der Elektronenakzeptor ist dabei bevorzugt Ubiquinon und Derivate davon. Das erfindungsgemäße Enzym ist ein reaktionsselektiver Proteinkatalysator zur Redoxreaktion an Cyclitolen und Ketocyclitolen.
Das erfindungsgemäße Enzym ist dadurch gekennzeichnet, daß es ein hydrodynamisches Äquivalent der Molekularmasse von etwa 87000 Da aufweist und u.a. folgende Aminosäuresequenz enthält: -F-R-V-H-P-T-I-A-P-Q-N-T-T-H-P-Q-E-
Weitere Sequenzabschnitte des erfindungsgemäßen Enzyms sind:
Figure imgf000007_0001
Es können erfindungsgemäß auch eine oder mehrere Aminosäuren verändert oder deletiert sein.
Die in den Aminosäuresequenzen aufgezählten Aminosäuren sind im üblichen Einbuchstabencode angegeben.
Die Erfindung betrifft auch folgende DNA-Sequenzen:
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000011_0001
Erfindungsgemäß kann die DNA auch Unterschiede von einem oder mehreren Basenpaaren aufweisen. Unter die Erfindung fällt auch mit den obigen DNA-Sequenzen hybridisierende DNA oder eine mit der genannten DNA über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.
Weiter ist das erfindungsgemäße Enzym durch folgende Eigenschaften charakterisiert: - Oxidation von Cyclitol [Cycloalkanpolyol], insbesondere von Inositolf1,2,3,4,5,6 Cyclohexanhe- xol, C6H12O6] und Derivaten davon, in vivo und in vitro unter Benutzung von Ubiquinon-Derivaten als Coenzymtyp und Wasserstoffakzeptor;
- Biokatalyse genannter Reaktionen dadurch, daß Ubiquinon und seine Derivate als Coenzymtypen bevorzugt werden;
- typische Proteineigenschaften und Proteinreaktionen (Folin- und Biuretreaktionen);
- Schmelzpunkt: etwa 200 °C (Zersetzung unter
Luft- und Sauerstoffausschluß);
- hydrodynamisches Äquivalent der Molekularmasse:
87 '000 Dalton; - das native Protein besteht aus nur einer Peptid- einheit (Protomer); - elektrophoretische Wanderung bei pH 7.40 in
Acrylamidmatrizen ist anodisch; - löslich in wäßrigen Medien einschließlich 20 % Ethanol bei einem pH-Wert von 4,0 bis 10,0; - es hat einen konstanten Temperaturkoeffizienten der Löslichkeit in Ammoniumsulfatlösungen zwischen -10 °C und +50 °C; - es ist unlöslich in Chloroform, Benzol, Xylol und anderen apolaren nicht wäßrigen und mit Was- ser nicht mischbaren Lösungsmitteln; - es denaturiert in Chloroform, Benzol und Xylol;
Zerstörung der Konformationsstruktur und der Bioaktivität;
- es hat ein typisches Proteinabsorptionsspektrum im sichtbaren und ultravioletten Frequenzbereich mit einem Verhältnis der Extinktionskoeffizienten ∈ 280 nm / ∈ 260 nm = 1,5, ein Maximum bei 280 nm und ein Minimum bei 252 nm;
- es adsorbiert reversibel an Anionen- und Kationenaustauschern und kann nativ der Volumenver- teilungs-Chromatographie unterworfen werden.
Als Protein ist das Enzym ein Makromolekül und, wie alle biologischen Makromoleküle, ein Polymer. Die kennzeichnende Eigenschaft eines jeden Polymers ist sein Aufbau aus einer Wiederholung von einer einzigen oder mehreren Struktureinheiten, genannt Monomere. Im Falle der Proteine sind die Monomere eine Gruppe von etwa 20 Aminosäuren. Für das Enzym der Erfindung sind diese Aminosäurebausteine oben im einzelnen beschrieben. Diese sind untereinander im Protein durch eine Peptidbindung (R-CO-NH-X) in definierter Zahl und Reihenfolge (Sequenz) verknüpft. Sie spiegeln sich auch im angegebenen hydrodynamischen Äquivalent der Molekularmasse ("Molekulargewicht") wieder. Da man schon bei der Verknüpfung von nur zwei Aminosäuren aus einem Bausatz von 20 verschiedenen Aminosäuren 400 (=202) verschiedene Strukturen aufbauen kann, ergibt dies bei z.B. 17 Aminosäuren die extrem große Zahl von 2017 = 1,3·1022 verschiedenen Verbindungen. Zum Vergleich sei erwähnt, daß nach dem heutigen Stand der Technik nur etwa 104 Enzyme und etwa 5·104 Proteine überhaupt bekannt sind. Daraus wird ersichtlich, daß bei weitem noch nicht alle möglichen Proteine bekannt sind. Die Maßgabe der ermittelten oben dargestellten Sequenz der 17 Aminosäuren als Teil des Protomers kennzeichnet das Enzym der Erfindung als eine absolute Neuheit aus einer außerordentlich großen Vielzahl von 1,3«1022 möglichen chemischen Verbindungen mit Proteinnatur. Sie ergibt sich durch nur eine einzige, bestimmte Kombination des für alle Proteine üblichen Aminosäure-Bausatzes aus der extrem großen Zahl von 1,3·1022 möglichen Stoffen.
Dies begründet hinreichend die hier erstmals offengelegten besonderen Stoffeigenschaften des neuen Enzyms der Erfindung. Als gekennzeichnet durch die neue Aminosäure-Sequenz als Unterscheidungsmerkmal von 1,3·1022 anderen möglichen Stoffen mit Proteinnatur wird verständlich, daß der erfindungsgemäße neue Proteinstoff auch die erwähnten neuen besonderen Eigen- Schäften hat, insbesondere in Form der katalytischen Reaktions- und Stereospezifität. Das Enzym ist deshalb auch frei von anderen biologischen und chemischen Wirkungen, die als Eigenschaften von anderen Proteinstoffen, aufgebaut aus demselben Aminosäure Bausatz, bekannt sind. Dies betrifft insbesondere folgende Eigenschaften bzw. Wirkungen: - keine Lyasewirkung auf C-C-, C-O-, und C-N-Bindüngen;
- keine Ligasewirkung; - keine Oxidoreduktasewirkung auf nichtzyklische Alkanale, Ketoalkanale, Ketoalkane, Polyole und
Hydroxyalkanale; - keine Xylit:NAD(P)-(1,2,4)-oxidoreduktaseaktivität (D-Xylose-, D- und L-Xylulose bildend), E.C.1.1.1.21; 1.1.1.09 und 1.1.1.10; keine Inosit:Sauerstoffoxidoreduktase-(Inositoxygenase-)aktivität, E.C.1.13.99.1; - keine L-Gulonat:NAD(P)-(3,6)-oxidoreduktaseaktivität, E.C.1.1.1.45 und 1.1.1.19;
- keine Glucose-6-phosphatcyclase-(L-myo-Inositol- 1-phosphatsynthase-) Aktivität, E.C.5.5.1.4; - keine Alkyl- und Aryl-Aldehyd:NAD(P)-oxidoreduktaseaktivität, E.C.1.2.1.3, E.1.2.1.5 und
1.2.1.7; keine Aldose-1-epimerase-(Mutarotase)aktivität, E.C.5.1.3.3; keine Karbonat-hydrolyase-(Carboanhydrase-)aktivität, E.C.4.2.1.1.
Das Enzym kann neben der erwähnten Aktivitätsbestimmung auch physikalisch-chemisch durch das erfindungsgemäße, mit dem molekular einheitlichen Enzymprotein hergestellte spezifische poly- oder monoklonalen An ti-Enzym-Antikörperserum oder dessen Anti-Enzym-Immunglobulinfraktionen nach den verschiedenen üblichen immunchemischen und immunbiologischen Methoden (z.B. Immunodiffusion, Immunoelektrophorese, RIA, Elisa, usw.) quantitativ bestimmt werden.
Das Enzym wird in den für Proteine üblichen Formen anwendungsbereit gehalten; dies sind sterile, konzentrierte, gepufferte Lösungen des Enzyms im Bereich von 0,01-10 mg/ml, insbesondere 0,5-10 mg/ml, vorzugsweise 5 mg/ml. Als Puffer können alle üblichen Mischungen im pH-Bereich zwischen 4 , 5 und 11 verwendet werden, insbesondere zwischen 6 und 9; vorzugsweise wird ein HEPES-Puffer verwendet, der 5 mM MgCl2 und 0,5 N-Dodecyl-N,N-dimethyl-ammonio-3-propansul- fonat enthält. Die Temperatur des gelösten, anwendungsbereit gehaltenen erfindungsgemäßen Enzyms kann zwischen -180 °C und +50 °C sein, insbesondere zwischen -40 °C und +40 °C; vorzugsweise findet eine Langzeitlagerung bei -80 °C statt, und das für den
Verbrauch bestimmte gelöste Enzym wird bei 0 °C steril gehalten.
Das Enzym bzw. dessen Fragmente kann zu präparativen, synthetischen prozeßtechnischen, immunologischen, diagnostischen und analytischen, chemischen und biologischen Verfahren in vivo und in vitro verwendet werden, z.B. - als bioorganische Synthesebausteine, insbesondere in der Peptid- und Proteinsynthese; - als Katalysator zur Synthese von chiralen Ketocyclitolepimeren, insbesondere von Inososeepime- ren, vorzugsweise mit Coenzym Q und Derivaten als Coenzym; - als Antigen, insbesondere zur Antikörperherstellung oder -analyse und zu immunologischen Analysenmethoden (RIA, Elisa, u.a.); - als Testpackung zur Bestimmung von Cyclitolen, vorzugsweise von Inositolen der myo- und epiKonfiguration, insbesondere mit Coenzym Q und Derivaten als Coenzym.
Erfindungsgemäßes Enzym
Figure imgf000017_0001
Ein weiterer Anwendungsbereich, in dem das erfindungsgemäße Enzym seinen großen Wert aufweist, ist die analytische Bestimmung von Inositen, insbesondere der myo-, epi- und D-chiro-Konfiguration im pH-Bereich zwischen 4 und 12 , insbesondere zwischen pH 6 und 8, bevorzugt bei pH 7.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung und Gewinnung des Enzyms. Die Gewinnung des Enzyms ist dadurch gekennzeichnet, daß man es aus Zellen, Geweben und deren Kulturen und Kulturüberstände nach Abtrennung von anderen Proteinen und Substanzen in molekular einheitlicher, kristallisierbarer und biologisch selektiv wirkender und auch in biologisch inaktiver (denaturierter) Form erhalten kann, insbesondere dadurch, daß man Kulturen von Prokaryoten und Eukaryonten, insbesondere Kulturen von Gluconobacter Oxidans, als Ausgangsmaterial verwendet; bevorzugt dadurch, daß man genbiologische Rekombinanten, deren Kulturen und Kulturüberstände als Ausgangsmaterial verwendet, welche eine natürliche, chemisch, synthetisierte oder molekularbiologisch oder aus natürlichen und anderen Zellen, Organellen und Geweben, deren Kulturen und Kulturüberständen isolierte Oligonucleotidsequenz mit mindestens 6·3 = 18 Basen oder Teilen und homologen Sequenzen davon enthalten, die die nach Anspruch 1 gegebene Aminosäureteilsequenzen codiert. Die Gewinnung des Enzyms kann auch durch chemische Proteinsynthese der nach Anspruch 1 gegebenen Aminosäure-Teilsequenzen oder Teilen und homologen Sequenzen davon geschehen. Die Gewinnung des Enzyms ist auch möglich durch chemische oder biologische Synthese der Oligonucleotid- oder Antisensenucleotid-Sequenzen in vivo und in vitro, welche die nach Anspruch 1 oder 5 gegebenen Aminosäure-Teilsequenzen codieren, mit mindestens 6·3 = 18 Basen (oder Teilen und homologen Sequenzen davon) und Anwendung dieser Strukturen durch in-vitrooder in-vivo-Methoden, insbesondere durch die Polymerase-Kettenreaktion ("PCR, Polymerase Chain Reaction") und/oder die Antisense-Bioprozeßtechnik. Die Gewinnung des Enzyms ist weiter dadurch möglich, daß es durch Chromatographie-, Adsorptions- und/oder Aussalzfraktionierungsmethoden aus den oben genannten Quellen isoliert wird, insbesonders durch einzelne oder als Folge von Chromatographien an hydrophoben Phasen, Ionenaustauschern, Molekularsieben, Hydroxylapatit und/oder an immunoadsorptiven Matrizen mit Affinität zu der nach Anspruch l oder 5 gegebenen
Aminosäure-Teilsequenz oder der sie codierenden Oligonucleotid-Sequenz oder Teilen und homologen Sequenzen davon. Im erfindungsgemäßen Verfahren wird das Enzym aus Zellen, Geweben, deren Kulturen oder Kulturüberstandslösungen erhalten, nachdem es von anderen Begleitproteinen abgetrennt wurde. Als Zellen kommen Pro- und Eukaryonten in Betracht.
Besonders Zellen und Kulturen und Kulturüberstände von Essigsäurebakterien, vorzugsweise von Gluconobacter oxidans, eignen sich als natürliche Enzymquelle. Sie enthalten das Enzym nicht nur in hinreichender Menge, sondern es kann auch daraus relativ einfach von den vielen verschiedenen Begleitproteinstoffen und Begleitenzymen abgetrennt und in molekular einheitlichem, kristallisierbarem, anwendungsbereitem Zustand isoliert werden.
Allgemein bestehen Reinigungsverfahren für Eiweißkörper (Proteine) und andere Naturstoffe aus einer Sequenz kombinierter Trennungsverfahren, welche Molekülgrößen-, Ladungs-, Form-, Affinitäts-, Strukturstabilitäts- und Moleküloberflächen-Beschaffenheitsunterschiede zwischen dem Naturstoff und den begleitenden Fremdstoffen zur Trennung ausnutzen. Dementsprechend können zahlreiche Kombinationen verschiedenster Trennungsverfahren zur Reinigung eines Proteins erarbeitet werden. Für die Handhabungseigen Schäften, technische Ausführbarkeit, Automatisierbarkeit und Wirtschaftlichkeit eines Reinigungsverfahrens sowie für die Qualität des gesuchten Naturproduktes ist deshalb nicht allein die Art der verwendeten Trennungsschritte von Bedeutung, sondern insbesondere deren optimierte Gestaltung und deren sinnvolle Kombination in einer Reinigungssequenz innerhalb des Rahmens der Strukturstabilität und der anderen Strukturparameter des gesuchten Stoffes. Das heißt auch, daß selbst die Benutzung gleicher oder ähnlicher Trennungsprinzipien (z.B. Molekularsiebfiltration, Dialyse, Ionenaustauschadsorptionen usw.), aber in unterschiedlicher Kombination, für die Handhabungsfähigkeit und Wirtschaftlichkeit des Reinigungsverfahrens entscheidend sein können. In bestimmten Fällen ist die Benutzung oder Unterlassung einer einzigen Technik an einer bestimmten Stelle der Reinigungssequenz oder innerhalb einer begrenzten Teilsequenz von ausschlaggebender Bedeutung für die Qualität des gesuchten Naturproduktes sowie für die
Handhabungsfähigkeit und die Wirtschaftlichkeit seines Reinigungsverfahrens. Klar aufgezeigt werden diese allgemeinen Zusammenhänge und Grundprinzipien der Naturstoffreinigung beispielsweise an der allgemein bekannten Tatsache, daß in einen wirtschaftlich vernünftigen und technisch handhabungsfähigen Naturstoff-Reinigungsverfahren ein Dialyse-Ultrafiltrations- oder Lyophilisierungsschritt nicht sinnvoll ist, bevor das Gesamtausgangsvolumen oder die Ausgangskonzentration der begleitenden Fremdbestandteile des Naturstoff-Rohextraktes nicht auf mindestens 1/500 bis 1/1000 durch andere Verfahrensschritte reduziert wurde. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Gewinnung des Enzyms in seiner nativen enzymatisch aktiven Form. Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Gewinnung wird nachstehend im einzelnen erläutert unter Verwendung von Bakterienkulturen von Gluconobacter oxidans als Enzymquelle. Beispiele
Allgemeines:
Alle Arbeiten werden in der Kälte bei 4 °C ausgeführt. Die pH-Werte der Puffer werden bei Raumtemperatur eingestellt.
1. Schritt: Kultur von Mikroorganismen Es wurde das Bakterium Gluconobacter oxidans DSM
50049 verwendet. Als Kulturmedium diente dazu eine Lösung von 5 g/1 Hefeextrakt, 2 g/1 Sorbitol und 30 g/1 myo-Inositol. Es wurden Vorkulturen von 50 ml mit der Impföse angeimpft und 2 Tage bei 30°C in 100 ml Schikanekolben bei 120 Upm im Dunkeln gezüchtet. Anschließend wurden die Hauptkulturen von 500 ml mit je 5 ml Vorkultur angeimpft und nach dreitägigem Schütteln bei 110 Upm in 1-1-Schikanekolben durch Zentrifugation geerntet. Die Zellen wurden noch zweimal mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und ausgewogen. Sie wurden entweder sofort weiterverwendet oder bei -20°C eingefroren.
Die Enzymbildung wurde in Abhängigkeit von der Kulturdauer untersucht. Dazu wurden nach Animpfung einer Hauptkultur in täglichem Abstand Proben von 5 ml steril entnommen und eingefroren. Nach Beendigung des Versuchs wurden alle Proben gleichzeitig aufgetaut. Zur Bestimmung der Zelldichte wurde eine kleine Probe 1 : 10 mit Phosphatpuffer (4 mM, pH 7) verdünnt und die Absorption bei 600 nm gemessen.
Die restlichen Zellen wurden abzentrifugiert (30 min, 2000 g), mit 5 ml Phosphatpuffer gewaschen und in 0,5 ml Puffer aufgenommen. Diese Zellsuspension wurde ohne Aufschluß direkt mit dem Standardaktivitätstest auf Enzymaktivität untersucht. 2. Schritt: Zellaufschluß und Membranpräparation
Die gewaschenen Zellen werden in 20 mM Phosphatpuffer +2 mM MgCl2, pH 7.0 suspendiert, mit 1 mg/ml Lysozym versetzt und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurde die Zellsuspension dreimal mit der FrenchPresse aufgeschlossen, mit gleichem Volumen 20 mM Phosphatpuffer +2 mM MgCl2 +1 M NaCl versetzt und die Membranfragmente bei 30000 Upm 60 min abzentrifugiert. Die Membranfragmente wurden nochmals mit 20 mM Phosphatpuffer + 2 mM MgCl2 +500 mM NaCl gewaschen, in Phosphatpuffer ohne Kochsalz suspendiert und der Proteingehalt auf etwa 30 mg/ml eingestellt. Die so hergestellte Membranfraktion wurde entweder sofort weiterbenutzt oder bei -80 °C eingefroren.
3. Schritt: Solubilisierung
Die Membranpräparation wurde 1:1 mit 20 mM Phosphatpuffer versetzt, so daß der Proteingehalt bei ca. 15 mg/ml liegt. Die verdünnte Proteinlösung wurde mit n-Octylglucosid (2 % w/v) versetzt, 60 min unter schwachem Schütteln inkubiert und 60 min bei 20000 rpm zentrifugiert. Der klare rötliche Überstand wurde als solubilisierte Proteinlösung weiterverwendet.
4. Schritt: PEG-Fällung
Das solubilisierte Enzympräparat wurde mit 15 % (w/v) PEG-6000 versetzt, 1 h bei 4 °C inkubiert und anschließend 30 min bei 10000 rpm zentrifugiert. Der rötlich-braune Niederschlag wurde in 20 mM Tris-HCl-Puffer +2 mM MgCl2+0,5 % N-Dodecyl-N,N-dimethyl-ammonio-3-propansulfonat, pH 7,6, über Nacht unter schwachem Schütteln gelöst und bei 20000 Upm 30 min zentrifugiert. Der klare Überstand wurde durch ein 0,22mm-Filter filtriert und weiterverwendet.
5. Schritt: Chromatofokussierung an starken
Anionenaustauschern (Mono Q®) Die in Chloridform überführte Anionenaustauschersaule wurde mit folgendem Puffer äquilibriert: 10 mM Tris +10 mM Bis-Tris +10 mM MES +2 mM MgCL2 +0,5 % N-Dode- cyl-N,N-dimethyl-ammonio-3-3-propansulfonat; pH 7,6 (Fokussierpuffer A). Anschließend wurde die aus
Schritt 4 erhaltene Proteinlösung auf die Säule aufgetragen, und die nicht absorbierten Proteine wurden mit dem Fokussierpuffer A ausgewaschen. Nun wurde ein Gradient in 6 Säulenvolumen vom Fokussierpuffer A zum Fokussierpuffer B (10 mM Tris +10 mM Bis-Tris +10 mM MES +2 mM MgCl2 +0,5 % N-Dodecyl-N,N-dimethyl-ammonio-3-propansulfonat; pH 5,7) angelegt. Dabei eluierte das Enzym im Maximum der Proteinverteilungskurve am Ende des Gradienten und wurde dabei etwa 17-fach angereichert.
6. Schritt: Anionenaustauschchromatographie an
Mono Q®
Die aus Schritt 5 erhaltene aktive Proteinlösung wur- de 1:1 mit 50 mM HEPES-Puffer + 2mM MgCl2 + 0,5 %
Zwittergent 3-12, pH 8.0, versetzt und auf die mit 15 mM HEPES + 2 mM MgCl2 + 0,5 % N-Dodecyl-N,N-dimethylammonio-3-propansulfonat, pH 7.6, äquilibrierte Anionenaustauschersaule aufgetragen. Nun wurde ein Salz- gradient auf 200 mM LiCl in 15 Säulenvolumina angelegt. Dabei eluierte das aktive Enzym in einem sehr breiten Maximum der Proteinverteilungskurve, wobei mehrere Schultern und Maxima auftreten können. Dieses Enzympräparat zeigte in einer SDS-Gelelektrophorese (Gradient 10-15) eine Hauptbande bei ca. 85,000 Dal ton. Nach diesem Kriterium war das Enzympräparat als einheitlich anzusehen.
7. Schritt: Aktivitätstests des Enzyms
Allgemeines:
Um einen Wirkstoff isolieren und reinigen zu können, ist es erforderlich, seine biologische Aktivität detektieren zu können. Im Falle eines Enzyms wird dabei auf direktem oder indirektem Weg das Fortschreiten der enzymkatalysierten Umsetzung der an der Enzymreaktion beteiligten Stoffe (Substrate, Produkte, Coenzyme) erfaßt.
Bei den Dehydrogenasen bieten sich hierzu spektroskopische Methoden an. Insbesondere die an der Dehydrogenasereaktion beteiligten Cofaktoren haben in Abhängigkeit von ihrem Redoxzustand unterschiedliche Absorptionsspektren. Deshalb können Dehydrogenasereaktionen direkt durch Messung der UV-Absorption bei definierten Wellenlängen verfolgt werden.
Eine andere Möglichkeit zur Detektion von Dehydrogenasen ist die Kopplung der Redoxäquivalente an weitere Akzeptoren (Farbstoffe). Dabei wird der an der Enzymreaktion beteiligte Cofaktor oxidiert und der Farbstoff reduziert. Durch die Reoxidation des Cofaktors wird dieser durch die Reaktion nicht verbraucht und wird deshalb nur in katalytischen Mengen benötigt. Die Reduktion des Farbstoffes bewirkt eine Änderung des Absorptionsspektrums (Farbumschlag) und kann somit durch Messung der Absorptionsänderung bei definierten Wellenlängen quantitativ verfolgt werden. Gleichzeitig bewirkt diese Kopplung, daß das Reaktionsgleichgewicht auf die Produktseite verschoben wird. Bei der untersuchten Inositoldehydrogenase handelt es sich um ein Coenzym-Q-abhängiges Enzym.
Die Inositoldehydrogenase wurde durch einen direkten und mehrere gekoppelte Aktivitätstests charakterisiert.
Es wurde die Enzymeinheit Unit (U) verwendet. Eine Enzymeinheit (U) wurde als die Enzymmenge definiert, die ein μmol-Substab, z.B. Inositol, pro Minute umsetzt. Folglich ergibt sich entsprechend der internationalen Definition (International Union of Pure and Applied Chemistry and the International Union of Biochemistry, 1973) : 1 U = 16,6●10-9 kat = 16,6●10-9 mol/s
Der Standardaktivitätstest
Der Standard-Aktivitätstest wurde aufgrund seiner einfachen Durchführbarkeit für alle Routinemessungen der Enzymaktivität eingesetzt. Als Standard-Aktivitätstest wurde eine 5-Methylphenaziniummethysulfat(PMSD) -gekoppelte Reduktion von Dichlorphenolindophenol (DCIP) nach dem Stand der Technik verwendet. Um die Enzymaktivität der erfindungsgemäßen Inositoldehydrogenase bestimmen zu können, war es erforderlich, dem Testsystem zusätzlich noch Coenzym Q2 und Phospholipide zuzusetzen, da diese für die Enzymaktivität notwendigen Substanzen bei der Enzymreinigung abgetrennt werden und ohne diesen Zusatz nach nahezu allen untersuchten chromatographischen Reinigungsschritten nur noch sehr geringe Aktivitätsmengen detektiert werden konnten. Die Reaktion wurde durch Messung der Extinktionsabnahme bei 600 nm photometrisch bei pH 7,0 verfolgt.
Die Berechnung der Enzymaktivität wurde ein Extinktionskoeffizient des DCIP bei pH 7,0 von
∈600nm = 20,6 mM-1 nach dem Stand der Technik verwendet.
Vorbereitung der phospholipidhaltigen
Coenzym-Q2-Lösung:
1 mg Coenzym Q2 (Decylubiquinon) wurde mit 10 mg Phosphatidylinositol (50 %ig) in wenig Chloroform gelöst, im Vakuum getrocknet und in 0,5 ml 2 %iger wäßriger n-Octylglukosid-Lösung im Ultraschallbad dispergiert. Das so dargestellte phospholipidhaltige Coenzym Q2 wird im Folgenden PQ2 genannt. Durch die Pipettierung in den Test wird das Detergens unter die kritische Myzellbildungskonzentration verdünnt, und es entstehen dadurch Coenzym-Q2-haltige Liposomen.
Im einzelnen wurden zur Ausführung des Standard-Aktivitätstests folgende Lösungen nacheinander in die Küvette pipettiert. 750 μl Testpuffer (100 mM MOPS, 5 mM MgCl2; pH 7,0
4 μl PQ2
2 μl Enzymlösung
50 μl 1,5 mM DCIP-Lösung
100 μl 10 mM PMS-Lösung
Die Testküvette wurde auf 30°C temperiert, die Reaktion mit 100 μl 200 mM myo-Inositollösung gestartet und der Extinktionsverlauf 2 min aufgezeichnet.

Claims

Patentansprüche
1. Enzym, geeignet zur Oxidation von Cyclitolen und deren Derivaten,
dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß das Enzym ein hydrodynamisches Äquivalent der Molekularmasse von etwa 87000 Da aufweist und folgende Aminosäuresequenz enthält:
-F-R-V-H-P-T-I-A-P-Q-N-T-T-H-P-Q-E-
2. Enzym nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß das native Enzym aus nur einer Peptideinheit (Protomer) besteht.
3. Enzyn nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß es einen Schmelzpunkt von etwa 200°C (Zersetzung unter Luft- und Sauerstoffausschluß) aufweist.
4. Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 3 ,
dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym eine Cyclitol-Ubiquinon-Oxidoreduktase ist.
Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 4 ,
dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym weiter folgende Sequenzabschnitte aufweist:
Figure imgf000030_0001
6. DNA, kodierend für das Enzym nach Anspruch 1, wobei die DNA umfaßt:
(a) die folgenden DNA-Sequenzen
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000034_0001
oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA, (b) eine mit der DNA von (a) hybridisierende DNA, oder
(c) eine mit der DNA von (a) oder (b) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.
7. Verfahren zur Herstellung des Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 5 durch
a) Aufarbeitung von Zellen, Geweben, genbiologischen Rekombinanten, deren Kulturen und Kulturüberständen nach Abtrennung von anderen Proteinen oder Substanzen in an sich bekannter Weise, oder
b) chemische Proteinbiosynthese mittels Synthesizer.
8. Verwendung des Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 5 als Katalysator zur Analytik und Synthese von Ketocyclitolepimeren, insbesondere von Inososeepimeren, vorzugsweise mit Coenzym Q und Derivaten als Coenzym.
9. Verwendung des Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 5 als Antigen, insbesondere zur Antikörperherstellung oder -analyse und zu immunologischen Analysenmethoden (insbesondere RIA, ELISA).
10. Verwendung der Enzmystruktur als cDNA zur Analyse und Synthese entsprechender molekularbiologischer ÄquivalenzStrukturen und assoziierter Funktionen.
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