DE3931399A1 - N-acetylhexosamin-dehydrogenase, verfahren zu deren herstellung, verfahren zur quantitativen analyse von n-acetylglucosamin oder n-acetylgalactosamin unter verwendung derselben, sowie kit fuer die quantitative analyse - Google Patents

N-acetylhexosamin-dehydrogenase, verfahren zu deren herstellung, verfahren zur quantitativen analyse von n-acetylglucosamin oder n-acetylgalactosamin unter verwendung derselben, sowie kit fuer die quantitative analyse

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Tatsuo Horiuchi
Toshiko Kurokawa
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue N-Acetylhexosamin-Dehydrogenase (nachfolgend bezeichnet als N-AHDH), die auf N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin einwirkt, um diese N-Acetylglucosaminolacton oder N-Acetylgalactosaminolacton zu überführen und gleichzeitig die oxidierte Form von Nikotinamidadenindinucleotid (NAD⁺) zur reduzierten Form von Nikotinamidadenindinucleotid (NADH) zu reduzieren. Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Erzeugung der genannten N-AHDH, ein enzymatisches Verfahren zur quantitativen Analyse von N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin durch die Verwendung von N-AHDH sowie einen Kit für die quantitative Analyse.
Seit der Entdeckung des Sachverhaltes, daß komplexe Zucker oder Glycokonjugate, die in der Oberflächenschicht von Zellen und Körperflüssigkeiten in Kombination mit Protein oder dergleichen vorliegen, die Informationen zur Steuerung lebender Organismen tragen, haben die Untersuchungen von komplexen Zuckern oder Glycokonjugaten schnelle Fortschritte gemacht. Als Ergebnis wurde die Beziehung zwischen abnormer Steuerung eines lebenden Organismus und struktureller Abnormität komplexer Zucker oder Glycokonjugate schrittweise aufgeklärt.
Andererseits werden Mucopolysaccharide wegen der metabolischen Abnormität von Mucopolysacchariden oder komplexen Zuckern manchmal in den Urin in starkem Maße abgesondert oder in Geweben angereichert, so daß es wichtig ist, die Struktur dieser Zucker zu untersuchen, um die Ursachen zu spezifizieren.
In klinischen Tests wird die enzymatische Aktivität des metabolischen Systems von N-Acetylglucosamin, d. h. die Aktivitäten von β-N-Actylglucosaminidase und Lysozym, ermittelt, um Ausmaß und Ort von Nierenstörungen zu spezifizieren.
Bei diesen Untersuchungen und Messungen von Enzymaktivitäten spielt die quantitative Analyse von N-Acetylglucosamin eine wichtige Rolle. Somit ist ein ausgezeichnetes Bestimmungsverfahren von den Fachleuten angestrebt worden.
Im allgemeinen wird die quantitative Analyse von N-Acetylglucosamin durch chemische Verfahren, wie die Morgan-Elson-Methode usw., durchgeführt. Verfahren unter Einsatz eines Enzyms sind jedoch hinsichtlich Genauigkeit und Einfachheit überlegen. Als ein Beispiel kann auf das Verfahren gemäß JP-OS 59-1 56 299 verwiesen werden. Gemäß diesem Verfahren wird N-Acetylhexosamin quantitativ analysiert, indem man N-Acetylhexosamin mit N-Acetylhexosamin-Oxidase zur Reaktion bringt und das entstehende Produkt, wie Wasserstoffperoxid und dergleichen, oder die mit fortlaufender Reaktion absorbierte Sauerstoffmenge ermittelt.
Da jedoch N-Acetylhexosamin-Oxidase eine relativ breite Substratspezifität aufweist, übt sie auch eine Wirkung auf N,N′-Diacetylchitobiose und dergleichen aus. Da dieser Zucker zwei Moleküle von N-Acetylglucosamin auf eine Reaktion mit β-N-Acetylglucosaminidase bildet, ist er als ausgezeichnetes Substrat zur hochempfindlichen Messung von Enzymaktivitäten geeignet. Er war jedoch aus oben genanntem Grund nicht einsetzbar als ein Substrat für die Messung von β-N-Acetylglucosaminidase in Urin.
Es ist auch bekannt, daß die in Urin vorhandenen reduzierenden Substanzen einen Einfluß auf das quantitative Analysesystem von Wasserstoffperoxid ausüben, und die Genauigkeit der Messung wird dadurch etwas eingeschränkt. Bekannt ist jedoch, daß diese Substanzen im Falle des quantitativen Analysensystems von NADH einen solchen Einfluß kaum ausüben. Demzufolge kann die Vorbehandlung von Probe und Vorrichtung im Meßsystem minimiert und eine Messung höherer Genauigkeit durchgeführt werden.
Angesichts dieses Sachverhaltes haben die hier auftretenden Erfinder ein Enzym aufgesucht, das in der quantitativen Analyse von N-Acetylglucosamin einsetzbar ist, und zwar mit dem Ziel, eine verbesserte enzymatische Messung von N-Acetylhexosamin zu entwickeln. Als Ergebnis ist herausgefunden worden, daß ein zum Genus Pseudomonas gehörendes Bakterium, das aus dem Boden isoliert wird, ein neues Enzym N-AHDH enthält, das auf N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin einwirkt, um diese in N-Acetylglucosaminolacton oder N-Acetylgalactosaminolacton zu überführen, und gleichzeitig das im System vorliegende NAD⁺ zu NADH reduziert. Es wurde festgestellt, daß dieses Enzym nicht auf Acetylchitobiose einwirkt und in einem neuen Verfahren zur enzymatischen quantitativen Analyse von N-Acetylglucosamin und N-Acetylgalactosamin verwendet werden kann. Auf der Grundlage dieser Erkenntnis ist die vorliegende Erfindung vollbracht worden.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein neues Enzym N-AHDH, das auf N-Acetylglucosamin und N-Acetylgalactosamin einwirkt, um diese in N-Acetylglucosaminolacton bzw. N-Acetylgalactosaminolacton zu überführen, und gleichzeitig NAD⁺ zu NADH reduziert. Die Erfindung betrifft ebenso ein Verfahren zur Erzeugung von N-AHDH, wobei man einen Stamm, der zum Genus Pseudomonas gehört und die Fähigkeit zur Erzeugung von N-AHDH besitzt, in einem Medium züchtet und N-AHDH aus dem gezüchteten Produkt gewinnt.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur quantitativen Analyse von N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin, wobei man NADH auf eine N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin enthaltende Probe einwirken läßt und das entstehende NADH mißt. Schließlich betrifft die Erfindung auch einen quantitativen Analysekit, enthaltend mindestens N-AHDH, NAD⁺ und Pufferlösung.
Fig. 1 ist eine grafische Darstellung, die den optimalen pH des Enzyms der vorliegenden Erfindung aufzeigt;
Fig. 2 ist eine grafische Darstellung, die seinen stabilen pH aufzeigt;
Fig. 3 ist eine grafische Darstellung, die den optimalen Temperaturbereich der Einwirkung des Enzyms aufzeigt;
Fig. 4 ist eine grafische Darstellung, die die Wärmestabilität des Enzyms aufzeigt;
Fig. 5 ist ein Diagramm, das seine Elektrophoresebande zeigt; und
Fig. 6 ist eine Kalibrationskurve in Beispiel 3.
Es gilt die Voraussetzung, daß die in Fig. 1 und 2 verwendeten Pufferlösungen Kaliumphosphatpuffer (○-○), Tris-Salzsäure-Puffer (∆-∆) und Glycin-Natriumhydroxid-Puffer (⚫-⚫) sind.
Als nächstes wird die Erfindung konkreter dargelegt.
Die physiko-chemischen Eigenschaften des neuen Enzyms N-AHDH der vorliegenden Erfindung werden nachstehend aufgeführt.
(1) Wirkung und Substratspezifität
Wie im folgenden Reaktionsschema gezeigt, oxidiert das Enzym N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin zu N-Acetylglucosaminolacton oder N-Acetylgalactosaminolacton in Gegenwart von NAD⁺ und reduziert gleichzeitig das NAD⁺ zu NADH.
Es ist überhaupt nicht oder kaum irgendeine Wirkung auf N,N-Diacetylchitobiose, Hexosamin und neutrale Zucker aus, ausgenommen, daß es nur eine leichte Wirkung auf N-Acetylmannosamin ausübt.
(2) Optimaler pH und stabiler pH-Bereich
Fig. 1 zeigt die Ergebnisse der Messung der Enzymaktivität unter Verwendung von Phosphatpuffer, Tris-Salzsäure-Puffer und Glycin-Natriumhydroxid-Puffern. Wie in Fig. 1 gezeigt, beträgt der optimale pH 8,0 bis 10,5.
Wie in Fig. 2 gezeigt, beträgt der stabile pH-Bereich 8,0 bis 11,5.
Die in Fig. 2 verwendeten Puffer waren Kaliumphosphatpuffer, Tris-Salzsäure-Puffer und Glycin-Natriumhydroxid-Puffer.
(3) Bereich der optimalen Einwirkungstemperatur
Wie in Fig. 3 gezeigt, beträgt sie 30 bis 60°C.
(4) Inaktivierungsbedingungen durch pH, Temperatur usw.
Wenn über einen Zeitraum von 10 Minuten in 0,1 M Glycin-Natriumhydroxid-Puffer (pH 9,5) erwärmt wird, bleibt das Enzym bis zu einer Temperatur von 55°C stabil, während es seine Aktivität bei 65°C rasch verliert. Wenn über eine Zeitdauer von 10 Minuten bei 45°C erwärmt wird, ist es bei einem pH-Wert von 8,0 bis 11,5 stabil, während es insbesondere instabil bei einem pH-Wert von 6,0 oder darunter ist (Fig. 4).
(5) Inhibitoreinfluß und Stabilisation
Inhibitor
Restaktivität
keiner|100%
HgCl₂ 35
CdSO₄ 92
ZnSO₄ 95
CaCl₂ 95
CuSO₄ 94
MnSO₄ 96
NaN₃ 89
SDS 62
KCN 103
EDTA 101
PCMB 97
Jodacetamid 104
alpha,alpha′-Dipyridyl 107
o-Phenanthrolin 104
8-Hydroxychinolin 110
In der obigen Tabelle wurde die Enzymaktivität in einer Lösung, enthaltend 2 mM Metallion oder Inhibitor, gemessen. Es ist keine Substanz bekannt, die zu Aktivierung und Stabilisation besonders beiträgt.
(6) Reinigungsverfahren
Das Enzym kann gemäß üblichen Verfahren isoliert und gereinigt werden. Beispielsweise werden Reinigungsverfahren, wie Säulenchromatografie unter Verwendung von DEAE-Zellulose, Fällung mit Ammoniumsulfat, Säulenchromatografie unter Verwendung von DEAE-Sephadex, Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex-G-200 usw., entweder allein oder in entsprechender Kombination angewandt.
(7) Molekulargewicht
Das durch Gelfiltration unter Verwendung von 0,05 M Tris-Salzsäure-Puffer (enthaltend 0,1 M Natriumchlorid) gemessene Molekulargewicht beträgt ca. 120 000 bis 130 000.
(8) Polyacrylamidgel-Elektrophorese
Wie in Fig. 5 dargelegt, zeigt die Substanz nahezu nur eine Bande bei üblicher Acrylamid-Elektrophorese unter Verwendung von 7,5%igem Polyacrylamidgel. Mit Bromphenolblau als Standard beträgt seine relative Beweglichkeit in 7,5%igem Acrylamidgel 0,41.
(9) Isoelektrischer Punkt
Gemessen durch Polyacrylamidgel-Isoelektrofokusieren beträgt sein isoelektrischer Punkt 4,7.
(10) Messung der Aktivität
Zu 1,8 ml 0,1 M Glycin-Natriumhydroxid-Puffer (pH 9,5) werden 0,1 ml 60 mM NDA⁺-Lösung gegeben. Nach 10minütigem Halten der Mischung bei 37°C werden 10 ml Enzymlösung zugefügt und anschließend 0,1 ml 0,3 M N-Acetylglucosamin- Lösung zugemischt, um die Reaktion zu starten. Die Reaktionsmischung wird sofort in eine bei 37°C gehaltene Absorptionsmeßzelle (1 cm Lichtweg) gegeben, und es wird die Absorption in Intervallen von 1 Minute bei einer Wellenlänge von 340 nm über eine Zeitdauer von 5 Minuten oder, falls erwünscht, über einen längeren Zeitraum gemessen. Die Enzymmenge, die 1 µMol NADH pro 1 Minute bildet, wird als "eine Einheit" genommen.
Wie oben erwähnt, ist das Enzym der vorliegenden Erfindung ein neues Enzym, von dem Wirkung und Substratspezifität bisher vollkommen unbekannt waren.
Als nächstes wird das Verfahren zur Erzeugung des neuen Enzyms N-AHDH der vorliegenden Erfindung dargelegt. Der verwendete Mikroorganismus ist ein Stamm, der zum Genus Pseudomonas gehört und die Fähigkeit zur Erzeugung von N-AHDH besitzt. Als sein konkretes Beispiel kann auf Pseudomonas sp. Nr. 53 verwiesen werden. Varianten und Mutanten dieses Stammes sind ebenfalls verwendbar. Pseudomonas sp. Nr. 53 ist ein Stamm, den die hier auftretenden Erfinder aus dem Boden isoliert haben, und seine bakteriologischen Eigenschaften sind wie folgt.
(a) Morphologie
Mikroskopische Betrachtungen (nach Züchtung bei 30°C über 18 Stunden in einer Glucose-Mediumbrühe, enthaltend 0,4% Hefeextrakt):
  • (1) Zellengröße: Stäbe mit einer Größe von 1,0 bis 1,1×1,4 bis 2,6 µm.
  • (2) Polymorphismus der Zelle: Die Zellenform schwankt von einer nahezu sphärischen zu relativ langen Stäben. Es sind zweigliedrige Ketten beobachtbar, die an den Enden verbunden sind, obwohl längere Ketten nicht beobachtet werden.
  • (3) Beweglichkeit: Schnelle lineare Bewegung (polare Flagellen).
  • (4) Sporen: nicht gebildet
  • (5) Gram-Färbung: negativ
  • (6) Acid-Fast: negativ
(b) Wachstumszustand in verschiedenen Medien
  • (1) Agar-Plattenkulturbrühe (3 Tage bei 30°C): Es werden weiß-braun gefärbte, vollständige, konvexe, halbdurchsichtigte Kolonien (1,5 mm Durchmeser) gebildet, und zwar ohne Pigmentbildung.
  • (2) Glucosebrühe-Agar-Plattenkultur mit 0,4% Hefeextrakt (3 Tage bei 30°C): Es werden weiß- braun gefärbte, vollständige, konvexe, halbdurchsichtige Kolonien (2,1 mm Durchmesser) gebildet.
  • (3) Glucosebrühe-Agar-Schrägkultur mit 0,4% Hefeextrakt (24 Stunden bei 30°C): Gutes Wachstum, glatte Oberfläche, fettiger Glanz, halbdurchsichtig.
  • (4) Kultur in Glucosebrühe-Flüssigmedium mit 0,4% Hefeextrakt: In stehender Kultur (2 Tage bei 30°C) ist das Wachstum sehr schlecht. Eine membranähnliche Substanz wird an der Oberfläche leicht gebildet und fällt mit der Zeit aus. In Schüttelkultur (24 Stunden bei 30°C) wird einheitliches gutes Wachstum beobachtet.
  • (5) Gelatinebrühe-Stichkultur (3 Tage bei 24°C): Es wird ein leichtes Wachstum ohne Verflüssigung von Gelatine beobachtet.
  • (6) Lackmus-Milch (5 Tage bei 30°C): Leicht saure Reaktion mit einer schwachen Koagulation und Abtrennung einer transparenten Flüssigkeit an der Oberfläche.
(c) Physiologische Eigenschaften
  • (1) Reduktion von Nitraten: negativ
  • (2) Denitrifikation: negativ
  • (3) MR-Test: negativ
  • (4) VP-Test: negativ
  • (5) Bildung von Indol: negativ
  • (6) Bildung von Hydrogensulfid: positiv (Bleiacetat- Testpapier)
  • (7) Hydrolyse von Stärke: negativ
  • (8) Verwendung von Zitronensäure: negativ
  • (9) Verwendung von anorganischen Stickstoffquellen: negativ
  • (10) Pigmentbildung: negativ
  • (11) Urease: negativ
  • (12) Oxidase: positiv
  • (13) Katalase: positiv
  • (14) Bereich der Wachstumsbedingungen: 13 bis 36°C (optimale Temperatur 29°C); pH 4,6 bis 8,5 (optimaler pH: nahe Neutralität)
  • (15) Verhalten gegenüber Sauerstoff: sehr aerob
  • (16) O-F-Test: oxidativ
  • (17) Bildung von Säure und Gas aus Zucker:
(d) Andere Eigenschaften
  • (1) Keine Anreicherung von Poly-β-hydroxybuttersäureester.
  • (2) Keine Bildung fluoreszierenden Pigmentes.
  • (3) Kein Wachstum bei 40°C.
  • (4) Keine Verwendung von H₂ als Energiequelle.
  • (5) Keine Erzeugung von Alginin-Dihydrolase.
Bei Vergleich der obigen taxonomischen Eigenschaften dieses neuen Stammes mit der Fähigkeit zur Erzeugung von N-AHDH mit der Klassifikation gemäß "Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology (1984), Bd. 1" wird dieser Stamm als zum Genus Pseudomonas gehörend betrachtet, weil er ein gram-negativer, aerober, Katalase-positiver Bacillus mit polarem Flagellum ist und keine Sporen bildet. Er wird als eine verwandte Spezies von Pseudomonas stutzeri betrachtet, weil er kein Poly-β-hydroxybutyrat im Zellkörper anreichert, weder gelbes noch fluoreszierendes Pigment erzeugt, Glucose für sein Wachstum verwendet und bei 40°C nicht wächst. Er unterscheidet sich jedoch von Pseudomonas stutzeri hinsichtlich Denitrifikation, Stärkeabbau und Verwendung von Trehalose. Demzufolge wird er als neuer Stamm betrachtet, der bisher unbekannt war.
Aus obigen Gründen nannten die Erfinder diesen Stamm "Pseudomonas sp. Nr. 53". Pseudomonas sp. Nr. 53 ist im Fermentation Research Insititute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, unter dem Budapester Vertrag als FERM BP-2057 hinterlegt worden.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Kulturmedium kann jedes synthetische und natürliche Medium sein, solange sie in geeigneter Weise eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, anorganische und andere Nährstoffe enthalten. Als Kohlenstoffquelle kann Glucose, Galactose, Fructose und dergleichen verwendet werden. Als Stickstoffquelle können stickstoffhaltige organische Substanzen, wie Pepton, abgebautes Casein, Glutaminsäure, Hefeextrakte und dergleichen, erfolgreich eingesetzt werden. Als Anorganika können Salze von Natrium, Kalium, Magnesium, Mangan, Kalzium, Eisen und dergleichen verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung kann N-AHDH in hoher Ausbeute erhalten werden, wenn ein Stamm mit der Fähigkeit zur Erzeugung von N-AHDH in einem Medium, enthaltend N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin, gezüchtet wird. Als ein bevorzugtes Beispiel des Kulturmediums kann auf ein Medium verwiesen werden, das 0,5% N-Acetylglucosamin, 0,5% Hefeextrakt, 0,3% Pepton, 0,2% primäres Kaliumphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,01% Kalziumchlorid und 0,01% Eisensulfat (pH 7,0) enthält. Wenn eine Züchtung unter Bewegung und Belüftung in genanntem Medium bei 30°C 20 Stunden durchgeführt wird, liegt der erreichte Produktionstiter 10- bis 100mal so hoch wie derjenige, der erreichbar ist, wenn man das N-Acetylglucosamin durch andere Zucker als N-Acetylglucosamin ersetzt.
Die Temperatur der Kultur liegt üblicherweise im Bereich von 20 bis 35°C, und vorzugsweise bei ca. 30°C. Bei Beginn der Züchtung liegt der pH üblicherweise im Bereich von 6 bis 8, und vorzugsweise bei ca. 7. Wenn eine Schüttelkultur oder eine bewegte Tauchkultur unter den obigen Bedingungen 20 bis 30 Stunden lang durchgeführt werden, wird N-AHDH gebildet und in dem gezüchteten Produkt angereichert.
Da N-AHDH üblicherweise in der Bakterienzelle vorkommt, ist es bevorzugt, die Bakterienzelle nur durch Zentrifugation oder Filtration zu isolieren. Dann wird die isolierte Bakterienzelle gebrochen und in einer geeigneten Pufferlösung solubilisiert, um das Enzym in die Lösung freizusetzen.
Zum Brechen der Bakterienzellen können physikalische Verfahren, wie Dynomill, French Press, Ultraschall und dergleichen, chemische Verfahren, wie Triton-X-100, Natriumlaurylsulfat, EDTA und dergleichen, sowie enzymatische Verfahren, wie Lysozym und dergleichen, entweder allein oder in Kombination angewandt werden. Nach Brechen der Bakterienzellen werden Nucleinsäure aus der Flüssigkeit auf übliche Weise und unlösliches Material durch Filtration oder Zentrifugation entfernt. Auf diese Weise wird N-AHDH erhalten.
Falls gewünscht, kann das N-AHDH durch übliche Verfahren zur Isolation und Reinigung von Enzym gereinigt werden, wie (1) Säulenchromatografie unter Einsatz einer DEAE-Zellulose-Säule, (2) fraktionierte Fällung unter Verwendung von Ammoniumsulfat, (3) Säulenchromatografie unter Einsatz einer DEAE-Sephadex-Säule, (4) Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex oder andere Verfahren, welche gegebenenfalls kombiniert werden können.
Als nächstes werden das Verfahren zur quantitativen Analyse von N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin gemäß der vorliegenden Erfindung sowie der Kit zur quantitativen Analyse konkret erklärt.
Der erfindungsgemäßen Messung liegt das folgende Prinzip zugrunde:
Das heißt, N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin werden in der Probe mit N-AHDH zur Reaktion gebracht und das gebildete NADH gemäß bekannter Verfahren bestimmt, wie der Messung der UV-Absorption bei 340 nm usw.
Alternativ dazu werden die Probe mit N-AHDH, die auf einem Feststoff gehalten wird, in Kontakt gebracht und das entstehende NADH auf ähnliche Weise bestimmt. Gewünschtenfalls kann eine geeignete Menge an Inhibitor, wie Oxaminsäure, Oxalsäure und dergleichen, zugefügt werden, um den Einfluß der ebenfalls vorhandenen Lactat-Dehydrogenase (LDH) zu verhindern.
Als die in der Erfindung verwendete N-AHDH kann N-AHDH eines jeden Ursprungs verwendet werden. Es ist jedoch bevorzugt, eine N-AHDH zu verwenden, die durch Züchtung eines Stammes erhalten wird, der aus Bakterien ausgewählt ist, die zum Genus Pseudomonas gehören.
Als Beispiele der Enzym erzeugenden Bakterien, die zum Genus Pseudomonas gehören, kann auf Pseudomonas sp. Nr. 53 (FERM BP-2057) und dergleichen verwiesen werden.
Bei Einwirkung der N-AHDH auf N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin in der Probe wird die Reaktion bei einer Temperatur von 60°C oder darunter bei einem pH-Wert von 7 bis 11 und vorzugsweise bei einer Temperatur von 30 bis 55°C bei einem pH-Wert von 8 bis 10,5 durchgeführt, und zwar üblicherweise über einen Zeitraum von ca. 10 bis 20 Minuten. Zur Einstellung des pH-Wertes wird eine beliebig ausgewählte Pufferlösung verwendet, die den obigen pH-Bereich einhalten kann und die Enzymreaktion nicht stört. Zum Beispiel werden Kaliumphosphatpuffer, Tris-Salzsäure-Puffer, Glycin-Natriumhydroxid-Puffer und dergleichen, vorzugsweise verwendet.
Das durch die Einwirkung von N-AHDH gebildete NADH kann durch jedes Verfahren bestimmt werden. Am meisten gebräuchlich wird es jedoch durch die Absorptionsmessung bei einer UV-Wellenlänge von 340 nm ermittelt. Als Verfahren zur Bestimmung von NADH nach Überführung in ein Pigment mit einer Absorption im sichtbaren Bereich kann auf ein Verfahren, wobei man NADH mit Phenazin-Methosulfat und Nitroblau-Tetrazolium zur Reaktion bringt und die Absorption des entstehenden Diformazan bei 570 nm mißt, sowie auf ein Verfahren verwiesen werden, wobei man NADH mit NADH-Oxidase (J. Biochem. 98, 1433 (1985)) oder Phenazin-Methosulfat oder einem wirkungsgleichen Elektronträger oder einem Metallion zur Reaktion bringt, um Wasserstoffperoxid zu bilden, eine Farbe aus dem Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Peroxidase und verschiedenen Chromogenen entwickelt und die Absorption bei den jeweiligen optimalen Wellenlängen mißt. Wenn NADH zu Wasserstoffperoxid umgesetzt wird, kann es auch durch Emissionsspektrometrie nach Behandlung mit Luminol nachgewiesen werden. Es ist auch möglich, es halbquantitativ nachzuweisen, indem man eine Reihe von entsprechend ausgewählten Redoxindikatoren und Elektronträgern zufügt und den Farbton des Systems beobachtet. Alle diese Verfahren können entsprechend ihrer charakteristischen Merkmale ausgewählt und angewandt werden.
Der Kit der vorliegenden Erfindung zur quantitativen Analyse von N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin ist zusammengesetzt aus N-AHDH, NAD⁺, Enzymen und Reagenzien zur Bestimmung des entstehenden NADH, sowie Pufferreagenzien für den glatten Ablauf der Reaktionen. Die Reagenzien und Enzyme liegen flüssig, fest oder gefriergetrocknet vor und werden kurz vor Gebrauch aufgelöst und eingemischt in eine Pufferlösung, um ein Reagens für die Messung herzustellen, und zwar in Übereinstimmung mit dem jeweiligen Bedarf.
Zur Ausführung der Messung läßt man den Kit direkt auf eine Probe, die N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin enthält, einwirken, um NADH zu bilden. Dann wird NADH in der Reaktionsmischung entweder direkt oder nach Zugabe eines NADH Bestimmungsreagens gemessen. Die Messung kann entweder durch Ein- oder Zwei- oder Multi-Reagenssysteme erfolgen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin durch die Verwendung einer neuen N-AHDH in hoher Genauigkeit quantitativ bestimmt und auf deren Grundlage die Aktivität von β-N-Acetylglucosaminidase usw. gemessen werden. Somit können Struktur komplexer Zucker analysiert und Nierenstörungen effektiv diagnostiziert werden. Demzufolge ist die vorliegende Erfindung für Fachleute sehr wertvoll.
Als nächstes wird die vorliegende Erfindung anhand der folgenden Beispiele verdeutlicht.
Beispiel 1
Pseudomonas sp. Nr. 53 (FERM BP-2057) wurde in einen 150 ml Erlenmeyer-Kolben mit 20 ml eines Keimmediums (pH 7,2) gespritzt, enthaltend 0,5% N-Acetylglucosamin, 0,5% Hefeextrakt, 0,3% Pepton, 0,2% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,01% Kalziumchlorid und 0,01% Eisensulfat. Nach Züchtung unter Schütteln über 24 Stunden bei 30°C wurde die Mischung in einen Kolbenfermenter (hergestellt von Iwashiya Seibutsukagaku K. K.) gegeben, enthaltend 2 l desselben Mediums wie oben, und unter Belüftung (2 l/Min.) sowie Rühren (500 Upm) 18 Stunden lang bei 30°C gezüchtet. Das so erzeugte N-AHDH wurde in der Bakteriumzelle angereichert.
Beispiel 2
5 l 0,02 M Tris-Salzsäure-Puffer (pH 8,0) (nachfolgend als "Standardpuffer" bezeichnet) wurden zu 0,96 kg lebenden Bakterienzellen gegeben, welche in derselben Weise wie in Beispiel 1 erhalten wurden. Dann wurden Triton-X-100 und EDTA zugefügt, so daß ihre Konzentrationen 0,5% bzw. 10 mM betrugen. Unter Rühren der Mischung bei niedriger Temperatur (5°C) über Nacht wurde eine einheitliche Suspension erhalten. Danach wurde sie bei 3000 Upm mittels einer Dynomill (hergestellt von Willey A. Beckohen Co., Schweiz) gebrochen. Durch Zentrifugieren bei 8000 Upm über 20 Minuten wurden 5,1 l eines Überstandes erhalten.
Danach wurden 3,5 kg nasse DEAE-Zellulose zugefügt und der pH der Mischung auf 8,0 eingestellt, worauf die Mischung 30 Minuten lang gerührt wurde, um das Enzym auf der DEAE-Zellulose adsorbieren zu lassen. Die DEAE-Zellulose wurde durch Filtration mit einem Buchner-Trichter gesammelt und mit 10 l Standardpuffer gewaschen, worauf sie mit 7 l Standardpuffer gewaschen wurde, enthaltend 0,3 M Natriumchlorid, und die Waschflüssigkeit wurde als eine beabsichtigte Fraktion herausgenommen. Die Fraktion wurde auf ein Volumen von 1,4 l mittels eines Hohlfaser-Ultrafilters (hergestellt von Asahi Kasei Kogyo K. K.) aufkonzentriert. Dann wurden 112 g pulveriges Ammoniumsulfat im Konzentrat aufgelöst und gründlich gerührt.
Nach 2stündigem Stehen der Mischung wurde sie bei 9000 Upm 20 Minuten lang zentrifugiert, um 1,4 l Überstand zu erhalten. Dann wurden zusätzliche 364 g Ammoniumsulfat zugegeben und vollständig darin aufgelöst, und die entstehende Lösung wurde über Nacht bei niedriger Temperatur stehen gelassen.
Die entstehende Fällung wurde durch 20minütiges Zentrifugieren der Mischung bei 12 000 Upm gesammelt, und sie wurde in 1,4 l Standardpuffer aufgelöst, enthaltend 4% Ammoniumsulfat. Dann wurde sie auf eine Phenyl-Sepharose-CL-4B-Säule (9 cm Durchmesser, 40 cm hoch, hergestellt von Pharmacia, Schweden) gegeben, die vorher mit einem Standardpuffer equilibriert wurde, enthaltend 6% Ammoniumsulfat, um das Enzym an die Säule zu adsorbieren, und dann wurde sie mit 20 l Standardpuffer mit einem Konzentrationsgradienten von 0 bis 30% bezüglich Ethylenglykol und einem umgekehrten Konzentrationsgradienten von 4 bis 0% bezüglich Ammoniumsulfat eluiert.
Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt, vereinigt und auf 5 l mittels Ultrafiltration aufkonzentriert, worauf die Enzymlösung einer Filrationsdialyse gegen 3 l Standardpuffer, enthaltend 0,1 M Natriumchlorid, unterworfen wurde. Die dialysierte Lösung wurde auf eine DEAE-Sephadex-A-50-Säule (9 cm Durchmesser, 30 cm hoch) gegeben, die vorher mit Standardpuffer, enthaltend 0,1 M Natriumchlorid equilibriert wurde, um das Enzym an der Säule zu adsorbieren, und dann wurde sie mit 20 l Standardpuffer mit einem Natriumchlorid- Konzentrationsgradienten von 0,1 bis 0,3 M eluiert.
Die aktive Fraktion wurde durch Ultrafiltration auf 50 ml aufkonzentriert, und ein 5 ml-Anteil wurde einer präparativen Elektrophorose unter Einsatz einer Vorrichtung, hergestellt von Fuji Riken K. K., unterworfen, um Protein durch Polyacrylamid-Elektrophorese abzutrennen und zu gewinnen.
Das in diesem Verfahrensschritt verwendete Polyacrylamidgel war ein 7,5%iges Gel. Der Strom betrug 10 mA und der für die Gewinnung verwendete Puffer war 0,012 M Tris-0,1M Glycin-Puffer (pH 8,3).
Die auf diese Weise gewonnene aktive Fraktion wurde durch Ultrafiltration aufkonzentriert und mittels einer Collodion-Konzentrationsvorrichtung auf 1 ml zusätzlich aufkonzentriert. Das Konzentrat wurde einer Gelfiltration durch Verwendung einer Sephadex-G-200-Säule (2,5 cm Durchmesser, 95 cm hoch) unterworfen, enthaltend 0,1 M Natriumchlorid.
Alle rohen Enzymlösungen wurden durch ähnliche Behandlung gereinigt. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und aufkonzentriert, um 1,980 Einheiten gereinigten Enzyms zu erhalten. Wie in Fig. 5 gezeigt, handelte es sich um eine Enzymprobe, die nahezu eine Bande bei Polyacrylamidgel-Elektrophorese aufwies.
Beispiel 3
Die Konzentration von N-Acetylglucosamin in Lösung wurde durch das folgende Verfahren durch die Verwendung der folgenden Reagenzien bestimmt.
1. Reagenzien
0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4)|1,7 ml
NAD⁺ (60 mM) 0,1 ml
N-AHDH (250 Einheiten/ml) 0,1 ml
Probenlösung 0,1 ml
2. Quantitatives Analyseverfahren
Vorbestimmte Mengen der Reagenzien wurden in ein Teströhrchen gegeben und bei 37°C 10 Minuten lang zur Reaktion gebracht, worauf die Absorption bei 340 nm gemessen wurde. Die Nettoabsorption der Probenlösung wurde berechnet, indem man die Absorption eines Durchlaufs unter Verwendung derselben Menge an Wasser anstatt der Probenlösung abzog. Andererseits wurde eine Kalibrationskurve aufgestellt, indem man N-Acetylglucosaminlösungen bekannter Konzentrationen in derselben Weise wie oben behandelte. Unter Bezug auf die Kalibrationskurve wurde die Konzentration von N-Acetylglucosamin in der Probenlösung bestimmt. Fig. 6 zeigt die Kalibrationskurve.
Beispiel 4
Die Konzentration von N-Acetylgalactosamin in Lösung wurde durch das folgende Verfahren durch die Verwendung der folgenden Reagenzien bestimmt.
1. Reagenzien
0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0) (enthaltend 0,3% Triton-X-100)|115 µl
Phenazin-Methosulfat (1 mg/ml) 5 µl
Nitroblau-Tetrazolium (10 mg/ml) 5 µl
NAD⁺ (60 mM) 10 µl
N-AHDH (155 Einheiten/ml) 15 µl
Probenlösung 50 µl
2. Quantitatives Analyseverfahren
Vorbestimmte Mengen an Reagenzien wurden in ein Teströhrchen gegeben und bei 37°C 15 Minuten lang zur Reaktion gebracht. Dann wurden 2,0 ml 0,3 N Salzsäure zugegeben und gründlich gerührt. Die Absorption der entstehenden Farbe wurde bei 570 nm gemessen. Parallel dazu wurde dieselbe Menge wie oben an Wasser anstatt der Probenlösung ähnlich behandelt und diese Absorption wurde als Nullprobe genommen. Durch Abziehen der Nullprobe von der obigen Absorption der Probenlösung wurde die Nettoabsorption der Probenlösung berechnet. Andererseits wurde eine Kalibrationskurve aufgestellt, indem man N-Acetylgalactosaminlösungen bekannter Konzentrationen ähnlich behandelte. Unter Bezug auf die Kalibrationskurve wurde die Konzentration von N-Acetylgalactosamin in der Probenlösung bestimmt.
Beispiel 5
Die Aktivität von β-N-Acetylglucosaminidase, extrahiert aus Rindernieren, wurde durch das folgende Verfahren durch die Verwendung der folgenden Reagenzien bestimmt.
1. Reagenzien
(A) 0,1 M Natriumcitratpuffer (pH 4,4)|0,3 ml
N,N′-Diacetylchitobiose (50 mM) 0,1 ml
Probenlösung 0,1 ml
(B) 0,2 M Glycin-Natriumhydroxidpuffer (pH 10,0) 1,3 ml
NAD⁺ (60 mM) 0,1 ml
N-AHDH (250 Einheiten/ml) 0,1 ml
2. Quantitatives Analyseverfahren
Vorbestimmte Mengen der Reagenzien (A) wurden in ein Teströhrchen gegeben und bei 37°C 15 Minuten lang zur Reaktion gebracht. Dann wurden vorbestimmte Mengen der Reagenzien (B) vermischt, und die entstehende Mischung wurde dem Teströhrchen zugefügt und wiederum bei 37°C 10 Minuten lang zur Reaktion gebracht. Die Absorption wurde bei 340 nm gemessen, von der die Absorption eines Durchlaufs unter Verwendung von Wasser anstatt der Probenlösung abgezogen wurde, um die Nettoabsorption der Probenlösung zu ergeben. Die Enzymaktivität der Probenlösung wurde aus der folgenden Gleichung berechnet:

Claims (6)

1. N-Acetylhexosamin-Dehydrogenase, welche Wasserstoff von N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin wegnimmt, um diese in N-Acetylglucosaminolacton oder N-Acetylgalactosaminolacton zu überführen, und gleichzeitig Coenzym NAD⁺ zu NADH reduziert.
2. N-Acetylhexosamin-Dehydrogenase mit den folgenden physiko-chemischen Eigenschaften (1) bis (3):
  • (1) Wirkung und Substratspezifität:
    Sie nimmt Wasserstoff von N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin weg, um diese in N-Acetylglucosaminolacton oder N-Acetylgalactosaminolacton zu überführen, und reduziert gleichzeitig Coenzym NAD⁺ zu NADH;
  • (2) Optimaler pH: 8,0 bis 10,5;
  • (3) Stabiler pH: 8,0 bis 11,0.
3. Verfahren zur Erzeugung einer N-Acetylhexosamin-Dehydrogenase, wobei man einen Stamm, der zum Genus Pseudomonas gehört und eine Fähigkeit zur Erzeugung von N-Acetylhexosamin-Dehydrogenase besitzt, in einem Medium züchtet und N-Acetylhexosamin-Dehydrogenase aus dem gezüchteten Produkt gewinnt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der zum Genus Pseudomonas gehörende Stamm Pseudomonas sp. Nr. 53 (FERM BP-2057) ist.
5. Verfahren zur quantitativen Analyse von N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin, wobei man N-Acetylhexosamin-Dehydrogenase auf eine Probe, enthaltend N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin, einwirken läßt und die Menge des entstehenden NADH mißt.
6. Kit zur quantitativen Analyse von N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin, welcher N-Acetylhexosamin-Dehydrogenase, NAD⁺ und eine Pufferlösung enthält.
DE3931399A 1988-09-21 1989-09-20 N-acetylhexosamin-dehydrogenase, verfahren zu deren herstellung, verfahren zur quantitativen analyse von n-acetylglucosamin oder n-acetylgalactosamin unter verwendung derselben, sowie kit fuer die quantitative analyse Withdrawn DE3931399A1 (de)

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