JPS63309187A

JPS63309187A - 新規なビリルビン．オキシダーゼおよびその製造法

Info

Publication number: JPS63309187A
Application number: JP62144964A
Authority: JP
Inventors: Mamoru Takahashi; 守高橋; Shigeyuki Imamura; 茂行今村; Masaki Takada; 正樹高田
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1987-06-10
Filing date: 1987-06-10
Publication date: 1988-12-16
Anticipated expiration: 2012-02-05
Also published as: US4985360A; EP0295101A2; EP0295101A3; JP2578430B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、新規なビリルビン・オキシダーゼおよびその
製造法ならびにその使用法に関する。

〔従来の技術〕

ビリルビン・オキシダーゼは、ビリルビンおよび酸素か
らビリベルジンと水を生成する反応を触媒する酵素であ
り、従来より、ミロセシウム属（特開昭６０−１２０３
２号）、バチルス属（特開昭６１−２０９５８７号）、
スエヒロタケ属（特開昭５９−１３５８８６号）、コプ
リナス属、トラメテス属、コリオラマ属、フォリオタ属
、プロイロタス属、レンジデス属、フシドブシス属（特
開昭５９−１９８９７１号）、ナス科、バショウ科、ユ
リ科（特開昭６０−７８５８０号）などか由来する酵素
が知られている。

ビリルビンは、ヘモグロビンの分解によって血中に形成
される黄色物質であり、肝臓で作られる胆汁の主色素で
ある。血清中には抱合ビリルビン及び遊離ビリルビンが
存在し、血清中の抱合ビリルビンの増加から、肝ミクロ
ゾームにおける抱合から一二脂腸までのビリルビン運搬
系の障害をきたしたことから、また血清中の遊離ビリル
ビンの増加からは、種々の原因によって生ずる溶血性貧
血等を生じたことを示し、抱合及び／又は遊離ビリルビ
ンを定量することは臨床的に極めて重要である。

さらに、被検体サンプル中のビリルビンレベルを積極的
に低下させるために、ビリルビンオキシダーゼは非常に
有用である。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記したような従来公知のビリルビン・オキシダーゼは
、基質特異性が低く、そのために例えば臨床化学分野で
使用するには問題があった。即ち、上記した公知の微生
物由来のビリルビン・オキシダーゼは、全てビリベルジ
ンにも基質特異性を有しており、ビリルビンの分析には
適していなかった。また、植物由来の酵素は、原料に季
節的な要因をはじめとする種々の制約があり、工業的に
は有利とは言えないし、その基質特異性についてもナス
科のものは、ビリベルジン、ヘモグロビンには作用しな
いことを示している、と述べられているが、その他の基
質については何も開示されておらない。このように、公
知のビリルビン・オキシダーゼは、テトラピロール構造
を持つ物質あるいはフェノール系物質に作用するため、
臨床検査分野における血液生化学検査に用いる場合、夾
雑する他の組成物に大きく影響されるという欠点があっ
た。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、これら従来公知における酵素の欠点のな
いビリルビン・オキシダーゼにつき、種々の研究をした
結果、静岡県駿東郡長泉町の土壌より分離した不完全菌
でペニシリウム属に属する菌株Ｍ５６１３株が、ビリル
ビンおよび酸素からビリルビンと水を生ずる反応を触媒
するビリルビン・オキシダーゼを産生し、かつこのビリ
ルビン・オキシダーゼがビリルビンに基質特異性を示し
、ビリベルジン、カテコールおよびヘミン等には、基質
特異性を示さないという優れた特性を有する酵素である
ことを見い出した。

本発明は、上記知見に基づいて完成されたものであって
、ビリルビンに基質特異性を有し、少なくとも、ビリベ
ルジン、カテコールおよびヘミンに基質特異性を有さず
、２分子のビリルビンおよび１分子の酸素から、２分子
のビリベルジンと２分子の水を生ずる酵素反応を触媒す
るビリルビン・オキシダーゼおよびペニシリウム属に属
するビリルビン・オキシダーゼ生産菌を培地に培養し、
培養物よりビリルビン・オキシダーゼを採取することを
特徴とするビリルビン・オキシダーゼの製造法、ならび
に該ビリルビン・オキシダーゼの使用法に関するもので
ある。

本発明の新規なビリルビン・オキシダーゼ生産菌の分類
学的性状は以下の通りである。

■、各培地における生育状態１、ツアペック寒天培地（ＣＺ）２５°Ｃの場合、生育は普通で、７日間で直径３６〜４
０ｍｍ。菌叢は平坦で綿毛状。淡黄色（ｐａ−１ｅ　ｙ
ｅｌｌｏｗ　（Ｍｅｔｈｕｅｎ　３Ａ３　）　）　ｏ浸
出液は出さないか、出しても僅かで無色。拡散性色素は
出さない。裏面は灰黄色（ｇｒｅｙｉｓｈ　ｙｅｌｌｏ
ｗ　（４Ｃ５））。

２、酵母エキス添加ツアペック寒天培地（ＣＹＡ）２５℃の場合、生育は速く、７日間で直径４５〜４９ｍ
ｍ、菌叢やや厚く綿毛状。放射状に４〜５条の皺を持ち
、淡赤色（ｐａｌｅ　ｒｅｄ　（９Ａ３　）　）−緑灰
色（ｇｒｅｅｎｉｓｈ　ｇｒｅｙ　（２７Ａ３　）　）
が混合した状態。周辺部は金縁。浸出液は大粒で淡赤色
（ｐａｌｅ　ｒｅｄ　（９Ａ３　））−拡散性色素は淡
赤色（ｐａｌｅ　ｒｅｄ　（９Ａ３　））　−５面は紫
褐色（ｖｉｏｌｅｔｂｒｏｗｎ　（１１Ｅ８　））。

３、麦芽汁寒天培地（ＨＡ）２５℃の場合、生育は速（，７日間で直径４８〜５１ｍ
ｍ、菌叢は平坦で綿毛状。灰緑色（Ｂｒｅｙｉｓｈ　ｇ
ｒｅｅｎ　（２９Ｃ３）　）　、周辺部は金縁。浸出液
および拡散性色素は出さない。裏面はオリーブ褐色（ｏ
ｌｉｖｅ　ｂｒｏｗｎ　（４Ｄ７　））。

Ｉｌ、生理的諸性状生育し得るｐＨ１，５〜１０．５最適ｐ　Ｈ３，５〜８．５生育し得る温度　１７〜３７℃ 最適生育温度　　２８〜３４℃ ＩＩｌ、顕微鏡下における形態的特徴有性世代は認められず、分生子により増殖。分生子柄は
、気中菌糸ないし気中菌糸から生じ、比較的長く、１０
０〜２５０　ｘ　２．０〜２．８μｍ、壁は滑面ないし
僅かに粗面。分生子形成様式はフィアロフォラ型。ペニ
シリンは単輪化ないし散開型。

メトレは広角度に散開、１１〜１５　Ｘ　２．５〜２．
８μｍ、２〜３本輪生、滑面ないし僅かに粗面。フィア
リドはトフクリ型、７〜１０×２〜２．５　　μｍ、４
〜７本輪生。分生子は亜球形ないし楕円形で僅かに洋梨
型が混在、２．３〜３．Ｏｘ　２．０〜２．５μｍ、滑
面ないし僅かに粗面。

外生的な分生子を形成することから、Ｍ５６１３株は不
完全菌に属する。分生子形成様式はフィアロフォラ型で
、フィアリドの先端から分生子を形成することからペニ
シリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　）属に属する。そ
こで、”　Ｔｈｅ　ｇｅｎｕｓ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕ
ｍ″Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｌｏｎｄｏｎ　
ｐ　４３４　（１９７９）および”　Ａ　ｍａｎｕａｌ
　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｅｎ１ｃｉｌｌｉａ”Ｔｈｅ　ｗｉ
ｌｌｉａｍｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｋｉｎｓ、　Ｂａ１ｔｉ
ｎ＋ｏｒｅ＋　ｐ　８７５　（１９４９）を参照とし、
さらに、ペニシリウムは単輪化ないし散開状、各培地で
の生育が速く、ＣＹＡにおいて裏面が著しく紫褐色とな
る等の特色から、ペニシリウム・ジャンシネラム（Ｐｅ
ｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　Ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ　）お
よびペニシリウム・シンプリシシウム（Ｐｅｎｉｃｉｌ
ｌｉｕｍｕ　ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｕｍｕ　）が挙げ
られるが、ペニシリウム・シンプリシシウムは、分生子
柄が４００〜８００μｍと長い、分生子柄の壁が粗面、
裏面が紫褐色とはならない等から区別でき、Ｍ５６１３
株＆：！、ペニシリウム・ジャンシネラム（Ｐ−０ｊａ
ｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ）と同定された。

（各培地における生育状態の色の表示はＫｏｒｎｅｒｕ
ｐ。

Ａ、　ａｎｄ　Ｊ、　Ｈ，Ｗａｎｓｃｈｅｒ、　１９７
８．　Ｍｅｔｈｕｅｎ　ｈａｎｄｂｏ。

ｋ　ｏｆ　ｃｏｌｏｕｒ、　３ｒｄ　ｅｄ、　Ｅｙｒｅ
　Ｍｅｔｈｕｅｎ、　Ｌｏｎｄｏｎの表示法に従った）
。

なお、本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所にペニ
シリウム　ジャンシネラムＭ５６１３（Ｐｅｎｉｃｉｌ
ｌｉｕｍ　ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍｕ　Ｍ　５６１３
　）微工研菌寄第９１６７号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９１６
７）として寄託されている。

本発明のビリルビン・オキシダーゼを生産するに当たっ
ては、このビリルビン・オキシダーゼ生産菌を酵素など
を生産する通常の方法で培養する。

培養の形態は、液体培養でも固体培養でもよいが、工業
的にはビリルビン・オキシダーゼ生産菌の細胞をその生
産用培地に接種し、深部通気攪拌培養を行なうのが有利
である。ビリルビン・オキシダーゼを培養するための培
地組成は、微生物特にペニシリウムの培養に通常用いら
れるものが広く使用されれる。窒素源として利用可能な
窒素化合物であればよく、例えばコーン・スチープ・リ
カー、ペプトン、カゼイン、大豆粉、酵母エキス、種々
の肉エキスなどが使用される。炭素源としては資化可能
な炭素化合物であればよく、例えば糖蜜、グルコース１
、シュクロース、デキストリンなどが使用される。その
他馬鈴薯エキスも好適な培地成分であり、また食塩、塩
化カリウム、硫酸マグネシウム、第一リン酸カリウム、
第ニリン酸カリウムなどの種々の無機塩が必要に応じて
使用される。培養温度は菌が発育し、ビリルビン・オキ
シダーゼを生産する範囲内で適宜変更し得るが、２０〜
３７℃好ましくは、２５〜３０℃、特に２８℃である。

培養時間は、条件によって多少異なるが、通常２〜８日
、特に４日程度である。しかしながら、ビリルビン・オ
キシダーゼが最高力価に達する時期をみはからって適当
な時期に培養を終了するのは当然のことである。

培養終了後、該培養物より本酵素を採取するには通常の
酵素採取手段を用いることができる。なお、本酵素は、
菌体内および培養液相の両方に存在するが、採取効率等
の問題により、通常は、該培養物より菌体を分別除去し
た培養液相より得るが、菌体内より酵素を採取する通常
の手段を用いて酵素を採取、培養液相より得たものと合
わせて用いてもよい。このようにして得られた粗酵素液
は、さらに公知の蛋白質、酵素などの単離、精製手段を
用いて精製し、精製されたビリルビン・オキシダーゼが
得られる。例えば、粗製のビリルビン・オキシダーゼ含
有液に、アセトン、メタノールなどの有機溶媒による分
別沈澱法、硫安、食塩、硫酸アルミニウムなどによる塩
析法などを用い溶液から酵素を沈澱せしめ、粗酵素を回
収すればよい。

次いで、さらに必要に応じて精製するにあたって、この
沈澱物を、トリス−塩酸緩衝液などの溶媒に溶解し、こ
れをカルボキシメチル−セルロース、カルボキシメチル
−デキストランゲル、スルホプロピル−デキストランゲ
ルなどのイオン交換樹脂やデキストランゲルやポリアク
リルアマイドゲルなどのゲルろ過剤による吸着クロマト
グラフィーを適宜組み合わせて行って精製し、次いでこ
れを凍結乾燥等の手法を用い乾燥し、精製ビリルビン・
オキシダーゼを得る。

このようにして得られたビリルビン・オキシダーゼの理
化学的性質は以下に述べる通りである。

（１）活性測定法基質溶液の調製：非抱合非結合型ビリルビン（和光純薬製）６ｍｇを１０
０ｍｌビーカーに取り、５Ｎ　　ＮａＯＨ溶液０．５ｍ
ｌで湿らせ、１Ｍトリス−塩酸緩衝液１０ｍ１を添加し
てよく混合し、水７０ｍｌを加えてｐＨを８．４に調整
後、１００ｍｌにメスアップする。

酵素溶液の調整：後述の実施例に基づき得られたビリルビン・オキシダー
ゼ凍結乾燥品５　Ｑｍｇを正確に秤り取り、蒸溜水６５
ｍ１で溶解し、３７℃に調整した。

活性測定基質溶液３ｍβを小試験管に取り３７℃、水浴中に２分
間静置した後、酵素溶液を０．１ｍｌ添加し反応を開始
した。正確に１０分間、３７℃で反応した後に６８０　
ｎｍにおける吸光度を分光光度計を用いて測定した（Ａ
Ｉ）、酵素溶液０．１ｍＡの代わりに水０，１ｒｒｊ！
を添加したものを対照として測定した（Ａ２）。

ビリルビン・オキシダーゼ活性（Ｕ／ｍＡ’）ＡＩ　−
Ａ２　　　　１　　　　　３．０１１０（分）　　　　
１１．９＊’　　　　０．１×希釈率１１．９＊’　　：ビリベルジン２塩酸塩（シグマ社製１ｏｔ、４３　Ｆ−
８０２０）　８．３　ｍｇをＬＭ）リス−塩酸緩衝液Ｉ
　Ｑ＋ｎｌで溶解し、水７０ｍｊ！を添加して５Ｎ　　
ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを８．４に調整し、１００ｍ
［にメスアップした。これを０．１Ｍ）リス−塩酸緩衝
液（ｐＨ８，４）を用いて２．５．１０倍に希釈し、７
５０〜３５０ｎｍの全吸収を分光皮糸〔島津製作所（株
）製ＵＶ−２１０Ａ）を用いて測定した。第５図に示し
たように、２倍に希釈したビリベルジン溶液の６８０ｎ
ｍの吸光度は０．７３．５倍に希釈したものは０．３．
１０倍に希釈したものは０．１５５の値を示した。これ
らの結果からビリベルジンの１ｍＭ溶液の６８０ｎｍに
おける吸光度を１１．９とした。

（２）基質特異性：酸素電極針を用いて各基質に対する特異性を酸素消費速
度から検討した。この時基質溶液には０゜１ｍＭになる
ようにＨｇ　Ｃｌ　２を添加した。基質は、０．１ｍＭ
、酵素は前述の活性測定に用いた酵素液Ｑ、１ｍｆを用
いて行った結果、第１表に示す通り、ビリルビン以外の
基質は反応を示さなかった。それ故、本発明のビリルビ
ン・オキシダーゼはビリルビンに特異性が非常に高い。

第１表（３）酵素作用　：次の反応を触媒する。

ビリルビン＋１／２０！→ビリベルジン＋Ｈ２Ｏ（４）
熱安定性　：０．２Ｍリン酸カリウム塩緩衝液（ｐＨ６，５）０．５
ｍｌに前述の酵素溶液Ｑ、５ｍｊ＋を添加したものを４
０〜８０℃各温度で３０分間ずつ加熱し、活性測定法に
基づいて残存活性を測定した。その結果、第１図に示す
通り５０℃まで安定であった。

（５）至適温度　：活性測定法における基質溶液を用いて４０〜７０℃の各
温度における本発明のビリルビン・オキシダーゼの活性
を測定した結果は、第２図に示す通りで、至適温度は５
５〜６０℃であった。

（６）ｐＩ（安定性：前述の酵素溶液Ｑ、５ｍｌに０．２　Ｍの各ｐＨ緩衝液
を０．５ｍｊｔずつ添加し、７０℃３０分間加温した後
、この反応液をＯ’、１ｍｊ２を活性測定法に基づいて
残存活性を測定し、ｐ　Ｈの影響をしらべた。

その結果は第３図に示す通りであり、〔図中：緩衝液と
して酢酸緩衝液（ｐ　Ｈ４〜６）・−・、リン酸カリウ
ム塩緩衝液（ｐＨ６〜７）△−へ　、トリス−塩酸緩衝
液（ｐ　Ｈ７〜８）〇−〇　を示ス〕、本発明のビリル
ビン・オキシダーゼのｐＨ安定性はｐＨ４，０〜４．５
付近と認められた。

（７）至適ｐＨ：活性測定法で作成した基質溶液を５Ｎ　　ＨＣＩあるい
は５Ｎ　　ＮａＯＨを用いてｐ　Ｈ７，５，８，０，８
，５，９，０，９，５，１０に調整し、これを用いて至
適ｐＨの測定を行った。ただし、ｐＨの変動によってビ
リベルジンの吸光度が変化しないと仮定した。その結果
は第４図に示す通りで、ｐＨ８，５〜９．０に至適ｐＨ
を有していた。

（８）阻害および活性化：活性測定法に基づいて基質溶液に金属イオン、ＥＤＴＡ
、界面活性剤をそれぞれ１ｍＭ、１ｍＭオヨび０．０５
％添加し、ビリルビン・オキシダーゼの活性を測定して
、無添加時の活性を１００としたときの相対活性を求め
た。その結果は第２表に示す通りであって、水銀イオン
、鉛イオン、セチルトリメチルアンモニウムクロライド
で著しく活性化され、銅イオン、コバルトイオンで著し
く阻害された。

（９）分子■　　：５００．０００　±５０，０００　　（セファデックス
Ｇ−２００によるゲル濾過法による。分子量マーカ；カ
タラーゼ、フェリチンおよびチログロブリンを使用）。

ａφ　　等電点　：焦点電気泳動装置により測定した結果は、ｐＨ４，７±
０．５に等電点を有する。

夏−１−表＊１　；セチルトリメチルアンモニウムクロリド＊２　；セチルトリメチルアンモニウムプロミド０Ｄ　Ｋｍ値　：ビリルビン標品（和光純薬製）を２．４．６．８．１０
．１５．２０ｍｇとり、活性測定法の基質溶液の調製に
基づいて溶解し、前述の活性測定に用いた酵素溶液Ｑ、
１ｍｊ！を用いてＫｍ値を測定した結果、本測定条件下
でビリルビンに対するＫｍ値は１．Ｉ　Ｘ　１０−５Ｍ
テあった。

以上の諸性質を公知のビリルビン・オキシダーゼと比較
すると、いずれの酵素とも異なることが判る。

本発明のビリルビン・オキシダーゼを用いて被検体中の
ビリルビン量を測定するには、公知のビリルビン測定法
が適応可能である。即ち被検体試料中のビリルビンを本
発明のビリルビン・オキシダーゼの作用によりビリルベ
ルジンに変換せしめ、生成するビリベルジン量または反
応において消費される酸素量を測定することによって、
被検体中のビリルビン量を測定することができる。

検体中のビリルビンの濃度を測定する場合において、用
いられる本発明ビリルビン・オキシダーゼの量は、ビリ
ルビン・オキシダーゼ活性として、０、Ｏ１〜１０単位
であるが、測定時間に応じて適宜調節すればよく、ドデ
シル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、フェリシア
ン化カリウム等の反応促進物質およびその他緩衝液、酵
素の安定化剤などは、必要に応じて加えればよい。

また、検体中の砲台型ビリルビンおよび非抱合型ビリル
ビンを分別測定する場合においても公知の方法に、本発
明ビリルビン・オキシダーゼを適用すればよく、例えば
砲台型ビリルビンはｐＨ６未満で分析を行うことによっ
て検出でき、総ビリルビン量は、ｐＨ６〜１０で分析を
行うことができ、非抱合型ビリルビンは、総ビリルビン
量から抱合型ビリルビン量を減じることによって求めら
れる。

さらに、本発明ビリルビン・オキシダーゼを適宜添加す
ることにより、臨床診断における検体中のビリルビン以
外の他の物質を測定する系、たとえばグルコース測定に
おいて、グルコースオキシダーゼ−パーオキシダーゼを
用いる系、コレステロール測定において、コレステロー
ルオキシダーゼ−パーオキシダーゼを用いる系等におい
て、測定阻害物質であるビリルビンを除去することがで
きる。

以下に本発明の実施例を挙げる。ただし、本発明はこれ
ら実施例に限定されるものでないことはいうまでもない
。

実施例　１馬鈴薯の皮むき薄切り２００ｇに薫留水１Ｎを添加し、
１時間煮沸後、布で濾過した上清にブドウ糖２０ｇ１酵
母エキス１．５　ｇ１ＫＨ２ＰＯ４２，０ｇ、　Ｍｇ　
ＳＯ４・７）（２００，５ｇを添加し、溶解後蒸溜水を
加え１１にした。本培養液１００ｍ１を５００ｍｊ！三
角フラスコに分注し、１２１℃、２０分間加熱滅菌した
。これにペニシリウムジャンシネラム　Ｍ５６１３　　
（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９１６７）の保存寒天斜面培地より
１白金耳を接種し、２８℃にて４日間振盪培養した。

培養液１０ｍ！！を２０分間、３℃、１５ＫＨｚの音波
処理を行い菌体を破壊した。これを５回繰り返し行い５
０ｍｌの粗酵素液を得た（２０　ｕ）。

これを２０分間、５℃、１５０００ｒ、ｐ、ｍで遠心分
離した上清をＩＮ塩酸を用いてｐＨ５，０に調整し、２
０分間、５℃、１５０００ｒ、ｐ、ｍで遠心分離した。

この沈澱を２０ｍＭリン酸カリウム塩緩衝液（ｐ　Ｈ６
，５）　５０ｍ！！で溶解し２０分間、５℃、１５００
０ｒ、ｐ８ｍで遠心分離し、上清を得た（１１．３ｕ）
。この５ｍｊ？を２０ｍＭリン酸カリウム塩緩衝液（ｐ
Ｈ６，５）で緩衝化した。セファデックスＧ−１００（
２，８Ｘ６０印）カラムを用いてゲル濾過を行った。こ
れを１０回繰り返し、５０ｍ１の酵素溶液を得た（７．
２Ｕ）。これに１００ｍｇのサッカロースを添加し、常
法に基づいて凍結乾燥し０．０１８　ｕ／ｍｇの凍結乾
燥品を３２０ｇを得た。

実施例　２前記活性測定法・基質溶液の調製に従って作成した基質
溶液３　ｍ　ＩＩを、３　ｍ　ｌ容石英セルに取り、１
０　ｍ　Ｍ　Ｈｇ　Ｃｌ　ｔを３０１！添加した。これ
に実施例１により得たビリルビン・オキシダーゼ凍結乾
燥品をｓ　Ｑｍｇ正確に秤り取り、蒸溜水６．５ｍｌで
溶解したビリルビン・オキシダーゼ溶液を５０μｌ、及
び１００μ！添加し分光光度計〔品性製作所（株）社製
　ＵＶ−２１０Ａ）にセットし、３７℃で６８０ｎｍに
おける吸光度の経時変化をチャートに描いた（第６図）
。第６図から明らかなように、５０μｌの酵素液を使用
すると６分でビリルビン・オキシダーゼの反応は終了し
、１００μｌの酵素液を使用すると３．５分で反応は終
了した。これから本条件下では短時間でビリルビンの測
定を、ビリベルジンの生成を測定することで可能であり
、またビリルビンの消去も基質特異性が高いことから他
の粗製物に影響を及ぼしにくい条件で可能である。

実施例　３人血清を０．１．０．２．０．３．０．４．０．５．０
．６、０．７ｍｊ！それぞれ分取し、ここに０．１Ｍ１
−リス−塩酸緩衝液を加えて３ｍｊ２とし、本発明ビリ
ルビン・オキシダーゼ０．Ｉ　Ｕを添加し、３７℃、３
０分間インキュベートし、その反応液について分光光度
計〔品性製作所（株）社製ＵＶ−２１ＯＡ〕にセットし
、３７℃で６８０ｎｍにおける吸光度を測定した。その
結果を第７図に示すが、種々の割合に希釈した血清溶液
において極めて良好な直線性が得られた。

参考例（検量線の作成）＋１１　　試液の調整：緩衝液：０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ８，４）酵
素反応液：Ｏ，１ＭトＩＪスー塩酸緩衝液（ｐＨ８，４
）に本発明ビリルビン・オキシダーゼを０．ＩＵ／テス
トの割合で添加して調整した。

（２）標準ビリルビン溶液の調整：非抱合型非結合型ビリルビン（和光純薬（株）製）５．
９ｍｇを正確に秤り取り、５Ｎ　　ＮａＯＨ溶液０．５
ｍｌで湿らせ、ＩＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，４）
１０ｍｌで溶かした後、１００ｍｆにメスアップしたも
のを、１００μＭビリルビン溶液とし、これを０．１Ｍ
）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，４）で希釈して、２．４
．６．８．１０．１４μＭの標準ビリルビン溶液を調整
した。

（３）上記の標準ビリルビン溶液をそれぞれ３ｍｌづつ
に、上記酵素反応液を添加し、３７℃、３０分間インキ
ュベートし、その反応液について、分光光度計〔品性製
作所（株）社製ＵＶ−２１ＯＡ〕にセントし、３７℃で
６８０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を第８
図に示すが、極めて良好な直線性を示した。

〔発明の効果〕

本発明のビリルビン・オキシダーゼはビリルビンに基質
特異性を有し、肝疾患の診断に有利であり、また、臨床
診断における検体中のビリルビンが他の物質の測定にお
ける阻害となる場合において、ビリルビンの消去に有用
であり、更に活性も非常に高いので尿尿処理水の脱色へ
の利用が期待される。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のビリルビン・オキシダーゼの熱安定性
を示し、第２図は本発明のビリルビン・オキシダーゼの至適温度
を示し、第３図は本発明のビリルビン・オキシダーゼのｐＨ安定
性を示し、第４図は本発明のビリルビン・オキシダーゼの至適ｐＨ
を示し、第５図はビリベルジンの吸収曲線を示し、第６図は本発
明のビリルビン・オキシダーゼの反応経過を示し、第７図は本発明の酵素を用いて血液試料量と活性の相関
図を示し、第８図はビリルビンの検量線である。温度（０Ｃ）４１度　（０Ｃ）第３図Ｈ第４図Ｈ０　０．１　．２　．３　．４　．５　．６　．７ノ（
）六３・シ躇罫液３ｍ／　　リ’Ｏｋ４　ｉ　（ｍｊ！
、）ｈ”ツルこン（〃Ｍ）手続補正書昭和６３年　４月１３日特許庁長官　　　　　殿　　　　　　・す１、事件の表
示昭和６２年特許願第１４４９６４号２、発明の名称新規なビリルビン・オキシダーゼおよびその製造法なら
びにその使用法３、補正をする者事件との関係　　特許出願人住所　静岡県田方郡大仁町三福６３２番地の１名称　東
洋醸造株式会社代表者高田哲男４、代理人〒１７０　電話（９１７）１９１７東京都豊島区北大塚２−２５−１５、補正命令の日付自発６、補正の対象（１１特許請求の範囲の欄（２）発明の詳細な説明の欄７、補正の内容（１１特許請求の範囲を別紙の通り訂正する。（２）明細書第１１ページ上から２行目および３行目と
の間に改行して成文を挿入する。「尚本菌株は、ブタペスト条約に基づく寄託に移管され
、微工研条寄第１６７４号（ＦＥＲＭＢＰ−１６７４）
として寄託されている。（３）明細書第２４ページ上から７行目「ビリルビンを
除去」とあるを「ビリルビンを消去」と訂正する。（４）明細書第２５ページ下から７行目「化した。セファデックス」とあるを「化したセファデックス」と
訂正する。（５）同ページ下から２行目ｒ３２０　ｇを得た。」と
あるをｒ３２０ｍｇを得た。」と訂正する。補正した特許請求の範囲「（１）ビリルビンに基質特異性を有し、少なくとも、
ビリベルジン、カテコールおよびヘミンに基質特異性を
有さず、２分子のビリルビンおよび１分子の酸素から２
分子のビリベルジンと２分子の水を生ずる酵素反応を触
媒するビリルビン・オキシダーゼ。（２）ビリルビン・オキシダーゼが下記の理化学的性状
を有する特許請求の範囲第１項記載のビリルビン・オキ
シダーゼ。（ａ）分子ｉｔ　　　　５００，０００±５０，０００
（ｂ）等電点　　　１）８４．７±０．５（ｃｌ　Ｋ　
ｍ値　　　１．１Ｘ１０−’±Ｉ　Ｘ　１０−’、Ｍ（
ｄ）至適ｐＨｐＨ８，５〜９．０（ｅ）ｐＨ安定性　ｐＨ４，０〜４．５（ｆ）至適温度
　　５５〜６０℃ ｆｇＪ熱安定性　　５０℃まで安定（３）ペニシリウム属より由来した酵素である特許請求
の範囲第１項記載のビリルビン・オキシダーゼ。（４）ペニシリウム属に属するビリルビン・オキシダー
ゼ生産菌を培地に培養し、培養物より該ビリルビン・オ
キシダーゼを採取することを特徴とするビリルビン・オ
キシダーゼの製造法。（５）ペニシリウム属に属するビリルビン・オキシダー
ゼ生産菌が、ペニシリウム・ジャンシネラムである特許
請求の範囲第４項記載の製造法。（６）ペニシリウム・ジャンシネラムに属するビリルビ
ン・オキシダーゼ生産菌が、ペニシリウム・ジャンシネ
ラムＭ５６１３株（ＦＥＲＭ　　Ｐ　　９１６７）であ
る特許請求の範囲第４項記載の製造法。（７）ビリルビン・オキシダーゼがビリルビンに基質特
異性を有し、少なくとも、ビリベルジン、カテコールお
よびヘミンに基質特異性を有さず、２分子のビリルビン
および１分子の酸素から２分子のビリベルジンと２分子
の水を生ずる酵素反応を触媒するビリルビン・オキシダ
ーゼである特許請求の範囲第４項記載の製造法。（８）被検体に、ビリルビンに基質特異性を有し、少な
くとも、ビリベルジン、カテコールおよびヘミンに基質
特異性を有さず、２分子のビリルビンおよび１分子の酸
素から２分子のビリベルジンと２分子の水を生ずる酵素
反応を触媒するビリルビン・オキシダーゼを作用せしめ
、被検体中のビリルビンを、ビルベルジンに変換し、生
成するビリベルジン、の量または消費される酸素の量を
測定してなる被検体中のビリルビン量の測定方法。（９）検体に、ビリルビンに基質特異性を有し、少なく
とも、ビリベルジン、カテコールおよびヘミンに基質特
異性を有さず、２分子のビリルビンおよび１分子の酸素
から２分子のビリベルジンと２分子の水を生ずる酵素反
応を触媒するビリルビン・オキシダーゼを作用せしめ、
検体中のビリルビンを組人する方法。以上受託番号変更届昭和６３年４月１３日

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ビリルビンに基質特異性を有し、少なくとも、ビ
リベルジン、カテコールおよびヘミンに基質特異性を有
さず、２分子のビリルビンおよび１分子の酸素から２分
子のビリベルジンと２分子の水を生ずる酵素反応を触媒
するビリルビン・オキシダーゼ。
（２）ビリルビン・オキシダーゼが下記の理化学的性状
を有する特許請求の範囲第１項記載のビリルビン・オキ
シダーゼ。（ａ）分子量　５００，０００±５０，０００（ｂ）等電点　ｐＨ４．７±０．５（ｃ）Ｋｍ値　１．１×１０＾−＾４±１×１０＾−＾
５Ｍ（ｄ）至適ｐＨ　ｐＨ８．５〜９．０（ｅ）ｐＨ安定性　ｐＨ４．０〜４．５（ｆ）至適温度　５５〜６０℃ （ｇ）熱安定性　５０℃まで安定
（３）ペニシリウム属より由来した酵素である特許請求
の範囲第１項記載のビリルビン・オキシダーゼ。
（４）ペニシリウム属に属するビリルビン・オキシダー
ゼ生産菌を培地に培養し、培養物より該ビリルビン・オ
キシダーゼを採取することを特徴とするビリルビン・オ
キシダーゼの製造法。
（５）ペニシリウム属に属するビリルビン・オキシダー
ゼ生産菌が、ペニシリウム・ジャンシネラムである特許
請求の範囲第４項記載の製造法。
（６）ペニシリウム・ジャンシネラムに属するビリルビ
ン・オキシダーゼ生産菌が、ペニシリウム・ジャンシネ
ラムＭ５６１３株（ＦＥＲＭ　Ｐ−９１６７）である特
許請求の範囲第４項記載の製造法。
（７）ビリルビン・オキシダーゼがビリルビンに基質特
異性を有し、少なくとも、ビリベルジン、カテコールお
よびヘミンに基質特異性を有さず、２分子のビリルビン
および１分子の酸素から２分子のビリベルジンと２分子
の水を生ずる酵素反応を触媒するビリルビン・オキシダ
ーゼである特許請求の範囲第４項記載の製造法。
（８）被検体に、ビリルビンに基質特異性を有し、少な
くとも、ビリベルジン、カテコールおよびヘミンに基質
特異性を有さず、２分子のビリルビンおよび１分子の酸
素から２分子のビリベルジンと２分子の水を生ずる酵素
反応を触媒するビリルビン・オキシダーゼを作用せしめ
、被検体中のビリルビンを、ビルベルジンに変換し、生
成するビリベルジンの量または消費される酸素の量を測
定してなる被検体中のビリルビン量の測定方法。
（９）検体に、ビリルビンに基質特異性を有し、少なく
とも、ビリベルジン、カテコールおよびヘミンに基質特
異性を有さず、２分子のビリルビンおよび１分子の酸素
から２分子のビリベルジンと２分子の水を生ずる酵素反
応を触媒するビリルビン・オキシダーゼを作用せしめ、
検体中のビリルビンを除去する方法。