JPS58129973A - コレステロ−ルオキシダ−ゼの製造法 - Google Patents
コレステロ−ルオキシダ−ゼの製造法Info
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- JPS58129973A JPS58129973A JP57011303A JP1130382A JPS58129973A JP S58129973 A JPS58129973 A JP S58129973A JP 57011303 A JP57011303 A JP 57011303A JP 1130382 A JP1130382 A JP 1130382A JP S58129973 A JPS58129973 A JP S58129973A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、コレステロールオキシダーゼ（Ｃｈｏ−１ｅ
ｓｔｅｒｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ） の製造法に関す
る。
ｓｔｅｒｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ） の製造法に関す
る。
従来、コレステロールオキシダーゼ生産菌としては種々
知られている。
知られている。
本発明者らは、静岡県田方郡大仁町の苺畑の土壌から採
取したセルロモナス＋ Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｌ
属１こ属する細菌Ｂ−Ｏｇ／ＩＩが、その培養物中ｅこ
、少なくともコレステロールｔこ基質特異性を有し２、
かつ７モルのコレステロール１こ対シて７モルの酸素を
消費し、１モルのコレステノンおよび１モルの過酸化水
素を生成する反応を触媒する作用を有ｆ７＋コレステロ
ールオキシダーゼを生産する新規なコレステロールオキ
シダーゼ生産菌を見い出した０ 捷ず上記の細菌Ｂ−Ｏｇ／ＩＩの肉眼的および顕微鏡的
観察に基く各種培地上における培養の特徴は、次の記載
する通りである。
取したセルロモナス＋ Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｌ
属１こ属する細菌Ｂ−Ｏｇ／ＩＩが、その培養物中ｅこ
、少なくともコレステロールｔこ基質特異性を有し２、
かつ７モルのコレステロール１こ対シて７モルの酸素を
消費し、１モルのコレステノンおよび１モルの過酸化水
素を生成する反応を触媒する作用を有ｆ７＋コレステロ
ールオキシダーゼを生産する新規なコレステロールオキ
シダーゼ生産菌を見い出した０ 捷ず上記の細菌Ｂ−Ｏｇ／ＩＩの肉眼的および顕微鏡的
観察に基く各種培地上における培養の特徴は、次の記載
する通りである。
（Ａ）肉眼的観察
（１）肉汁寒天斜面培地（３０℃、ｌｌｏ時間）円形で
平らまたは丘状の集落を形成し１、周囲はなめらか、湿
潤半透明で、灰白色〜淡黄色を呈する０ 可溶性色素は産生じない。
平らまたは丘状の集落を形成し１、周囲はなめらか、湿
潤半透明で、灰白色〜淡黄色を呈する０ 可溶性色素は産生じない。
（２）肉汁寒天斜面培地（３０℃、９０時間）生育はや
や弱く、線状に生育し、湿潤半透明で灰白色〜淡黄色を
呈する。
や弱く、線状に生育し、湿潤半透明で灰白色〜淡黄色を
呈する。
可溶性色素は産生じない。
（５）肉汁液体培地（３０℃、ｌＩＯ時間）生育は弱い
が一様１こ混濁する。沈澱を生ずる。
が一様１こ混濁する。沈澱を生ずる。
（Ｂ）顕微鏡的観察
普通寒天培地ｔこて３０’Ｃ１７ｇ時間培養し友後その
形態的特徴を観察した。
形態的特徴を観察した。
（１）細胞の形・大きさ
単独、二連、たまに短連鎖する０端の丸く１つすぐな桿
状で、大きさはｏ、 ＩＩｘ ｏ、 ｇ〜／、Ｓμであ
る。
状で、大きさはｏ、 ＩＩｘ ｏ、 ｇ〜／、Ｓμであ
る。
（２）多形性の有無
なし。
（３）運動性および９毛
陰性。
（４）芽胞（形、位置、大きさ、菌体のふくらみ）なし
ｅ （Ｃ）生理的性質 硝酸塩還元 十脱窒反応
−ＭＲテスト
＋■Ｐテスト
−インドールの産生 −硫化水素
の産生（ＳＩＭ培地） −ゼラチンの加水分解
十デンプンの加水分解
十クエン酸の利用 （シモンズ培地） −（クリステン
ゼン培地） −硝酸塩の利用
十アンモニウム塩の利用
士可溶性色素の生成 −オキシダー
ゼ −カタラーゼ
＋ウレアーゼ（Ｓ Ｓ Ｒ培地）
−生育の範囲 生育ｐＨよ３− 、？、 ０ 生育温度 ７０〜３５℃ 酸素１こ対する態度 通性嫌気性ＯＦテ
スト （Ｈｕｇｈ Ｌｅｉｆａｏｎ培地）Ｆ１エスクリ
ンの分解 十セルロースの分解
十カゼインの分解
十グラム染色 陽性１次は
不定抗酸性染色 陰性酸・ガ
スの産生（Ｈｕｇｈ−Ｌｅｉｆｓｏｎ ’Ｂａ５ｅ Ｄ
ｉｆｃｏ ）Ｌ（十）アラビノース ＋
−セロビオース 十 −ヅル
シトール −− メン−エリストール − −Ｄ（−１フラク
トース ＋ −Ｄ（＋）ガラクトース
＋ −Ｄ（＋）グルコース
＋ −グリセリン −− イノシトール −− イヌリン − −ラクトース
＋ −マルトース
十 −Ｄ−マンニトール − −
Ｄ−マンノース − −ラフイノース
十 −Ｌ（＋）ラムノース
十 −サリシン
十 −Ｌ−ソルボース −− ソルビトール −− スターチ ＋ −サッカロース
＋ −トレハロース
十 −Ｄ−キシロース 十
−上記の菌学的性質より、本菌Ｂ−Ｏｇ／ＩＩはダラ
ム陽性ま几は不定の桿菌でセルロースを分解すル％徴ヲ
有するもので、バーシース・マニュアルーオプ・デタミ
ネイティブ・バクテリオロジー（Ｂｅ＝ｒｇｅｙ’ｓ
Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｅ ）第５版（／り７Ｑ）ｔこ工
れば本菌株はセルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ
）属に属するもノド認メラレ＊。
ｅ （Ｃ）生理的性質 硝酸塩還元 十脱窒反応
−ＭＲテスト
＋■Ｐテスト
−インドールの産生 −硫化水素
の産生（ＳＩＭ培地） −ゼラチンの加水分解
十デンプンの加水分解
十クエン酸の利用 （シモンズ培地） −（クリステン
ゼン培地） −硝酸塩の利用
十アンモニウム塩の利用
士可溶性色素の生成 −オキシダー
ゼ −カタラーゼ
＋ウレアーゼ（Ｓ Ｓ Ｒ培地）
−生育の範囲 生育ｐＨよ３− 、？、 ０ 生育温度 ７０〜３５℃ 酸素１こ対する態度 通性嫌気性ＯＦテ
スト （Ｈｕｇｈ Ｌｅｉｆａｏｎ培地）Ｆ１エスクリ
ンの分解 十セルロースの分解
十カゼインの分解
十グラム染色 陽性１次は
不定抗酸性染色 陰性酸・ガ
スの産生（Ｈｕｇｈ−Ｌｅｉｆｓｏｎ ’Ｂａ５ｅ Ｄ
ｉｆｃｏ ）Ｌ（十）アラビノース ＋
−セロビオース 十 −ヅル
シトール −− メン−エリストール − −Ｄ（−１フラク
トース ＋ −Ｄ（＋）ガラクトース
＋ −Ｄ（＋）グルコース
＋ −グリセリン −− イノシトール −− イヌリン − −ラクトース
＋ −マルトース
十 −Ｄ−マンニトール − −
Ｄ−マンノース − −ラフイノース
十 −Ｌ（＋）ラムノース
十 −サリシン
十 −Ｌ−ソルボース −− ソルビトール −− スターチ ＋ −サッカロース
＋ −トレハロース
十 −Ｄ−キシロース 十
−上記の菌学的性質より、本菌Ｂ−Ｏｇ／ＩＩはダラ
ム陽性ま几は不定の桿菌でセルロースを分解すル％徴ヲ
有するもので、バーシース・マニュアルーオプ・デタミ
ネイティブ・バクテリオロジー（Ｂｅ＝ｒｇｅｙ’ｓ
Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｅ ）第５版（／り７Ｑ）ｔこ工
れば本菌株はセルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ
）属に属するもノド認メラレ＊。
さらｔこ本菌株の諸性状を、バーシース・マニュアル・
オプ・デタミネイテイプｅバクテリオロジー第７版、第
ざ版に対比したが、本菌株と性状がよく一致する菌種の
記載はなく、よって本−株をセルロモナス・ニス・ピー
・Ｂ −Ｏｇ ／ ’Ｉ （Ｃｅｌｌｕ −１ｏｍｏｎ
ａｓ ｓｐ、 Ｂ −Ｏｇ ／ ＩＩ ）と同定命名し
た。さらｔこ本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所
に「微工研菌寄第乙３／６号（Ｆ Ｅ ＲＭ Ｐ＆６
３／６）」として寄託した。
オプ・デタミネイテイプｅバクテリオロジー第７版、第
ざ版に対比したが、本菌株と性状がよく一致する菌種の
記載はなく、よって本−株をセルロモナス・ニス・ピー
・Ｂ −Ｏｇ ／ ’Ｉ （Ｃｅｌｌｕ −１ｏｍｏｎ
ａｓ ｓｐ、 Ｂ −Ｏｇ ／ ＩＩ ）と同定命名し
た。さらｔこ本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所
に「微工研菌寄第乙３／６号（Ｆ Ｅ ＲＭ Ｐ＆６
３／６）」として寄託した。
本発明は、上記の知見ｅこ基いて完成されたもので、セ
ルロモナス属ｅこ属するコレステロールオキシダーゼ生
産菌を培地に培養し、その培養物からコレステロールオ
キシダーゼを採取することを特徴とするコレステロール
オキシダーゼの製造法である〇 本発明Ｖこおける使用曲としては、上記のセルロモナス
・ニス・ピー・Ｂ−Ｏｇ／’Ｉはその一例であって、こ
の菌だけでなくセルロモナス属ｔこ属する菌でコレステ
ロールオキシダーゼ生産菌を生産する菌は、すべて本発
明ｔこおいて使用することができる。
ルロモナス属ｅこ属するコレステロールオキシダーゼ生
産菌を培地に培養し、その培養物からコレステロールオ
キシダーゼを採取することを特徴とするコレステロール
オキシダーゼの製造法である〇 本発明Ｖこおける使用曲としては、上記のセルロモナス
・ニス・ピー・Ｂ−Ｏｇ／’Ｉはその一例であって、こ
の菌だけでなくセルロモナス属ｔこ属する菌でコレステ
ロールオキシダーゼ生産菌を生産する菌は、すべて本発
明ｔこおいて使用することができる。
本発明を実施するに当っては、セルロモナス属Ｖこ属す
るコレステロールオキシダーゼ生産菌を酵素を生産する
通常の方法で培養する。培養の形態は液体培養でも固体
培養でもよく、工業的１こはコレステロールオキシダー
ゼ生産菌の細胞をその生が有利である。
るコレステロールオキシダーゼ生産菌を酵素を生産する
通常の方法で培養する。培養の形態は液体培養でも固体
培養でもよく、工業的１こはコレステロールオキシダー
ゼ生産菌の細胞をその生が有利である。
培地の栄養源としては、微生轡の培養１こ通常用いられ
るものが広く使用され得る。炭素源と【では同化可能な
炭素化合物であればよく、例えばブドウ糖、ショ糖、乳
糖、麦芽糖、スターチ、デキストリン、抛蜜、廃糖蜜、
グリセリンなどが挙られる。窒素源とし、では利用可能
な窒゛素化合物であればよ＜、例えばコーン・スチープ
・リカー、大豆粉、綿実粉、小麦グルテン、ペプトン、
肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物などが使用
される。その他、リン酸塩、マグネシウム、カルシウム
、カリウム、ナトリウム、能鉛、鉄、マンガン、ハロゲ
ンなどの塩類が必要ｔこ応じて使用される。さらｅこ培
地に、コレステロールオキシダーゼの産生を誘導せしめ
るために、コレステロールを誘導物質として培地中に０
． ／〜／Ｓ％程電添加せしめることが好まし、い。
るものが広く使用され得る。炭素源と【では同化可能な
炭素化合物であればよく、例えばブドウ糖、ショ糖、乳
糖、麦芽糖、スターチ、デキストリン、抛蜜、廃糖蜜、
グリセリンなどが挙られる。窒素源とし、では利用可能
な窒゛素化合物であればよ＜、例えばコーン・スチープ
・リカー、大豆粉、綿実粉、小麦グルテン、ペプトン、
肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物などが使用
される。その他、リン酸塩、マグネシウム、カルシウム
、カリウム、ナトリウム、能鉛、鉄、マンガン、ハロゲ
ンなどの塩類が必要ｔこ応じて使用される。さらｅこ培
地に、コレステロールオキシダーゼの産生を誘導せしめ
るために、コレステロールを誘導物質として培地中に０
． ／〜／Ｓ％程電添加せしめることが好まし、い。
培養温度は、萌が発育し、コレステロールオキシダーゼ
を生産する範囲内で適宜変更し得るが、好まし、くは２
Ｓ〜３０℃、特゛ｔこ２乙℃程度が好ましい。培養時間
は、条件Ｖこよって多少異なるが、通常７２〜ＳＯ時間
程度行なえばよく、さらｅこ２００〜’Ｉ ＯＯｒｐｍ
の条件ｔこて攪拌しつつ通気せしめればよく、コレステ
ロールオキシダーゼが最高力価に達する時期をみはから
って適当な時期ｔこ培養を終了すればよい。
を生産する範囲内で適宜変更し得るが、好まし、くは２
Ｓ〜３０℃、特゛ｔこ２乙℃程度が好ましい。培養時間
は、条件Ｖこよって多少異なるが、通常７２〜ＳＯ時間
程度行なえばよく、さらｅこ２００〜’Ｉ ＯＯｒｐｍ
の条件ｔこて攪拌しつつ通気せしめればよく、コレステ
ロールオキシダーゼが最高力価に達する時期をみはから
って適当な時期ｔこ培養を終了すればよい。
このよウケこして得られ友コレステロールオキシダーゼ
生産菌の培養物ｔこおいて、コレステロールオキシダー
ゼは主をこその菌体内に含有される。
生産菌の培養物ｔこおいて、コレステロールオキシダー
ゼは主をこその菌体内に含有される。
本酵素を採取する１こ当って例示すれば、まず得られた
培養物を一過または遠心分離などの手段によりその陶体
を採取し、次いでこの飾体を超音波処理、フレンチプレ
ス処理やガラスピーズ処理などの機械的破壊手段やリゾ
チームなどの酵素的破壊手段ｅこで破壊し、ま几必要１
こ応じてトリトンＸ−／ ＯＯ（ＴｒｉｔｏｎＸ −／
ＯＯ：商品名）、アデカトールＳｏ−／２０’（商品
名）などの界面活性剤を添加してもよい。次いでこのよ
うｅこして得られ友コレステロールオキシダーゼ含有液
は、濃縮するか、または濃縮することなく、可溶性塩類
、例えば硫安などを用いて塩析せしめるが、親水性有機
溶媒、例、ｔばメタノール、エタノール、アセトン、イ
ンプロパツールなどを用いて本酵素を沈澱せしめればよ
い。さら１ここの沈澱物は、水１之は緩衝液ｔｒ−溶解
後、必要に応じて半透膜１こて透析せしめ、さらｔこＤ
ＥＡＥ−セファデックス、ＤＥＡＥ−セファロースやＤ
ＥＡＥ−セルロースナトやカルボキシメチル−セルロー
ス、カルボキシメチル−セファロース、カルボキシメチ
ル−セファデックスなどのイオン交換樹脂を用いるクロ
マトグラフィーやセファデックスＧ２００、セファロー
スＣＬ−ＡＢ、七フアクリルＳ−，２００などの分子篩
剤などのゲル濾過剤を用いるクロマトグラフィーｅこて
精製せしめ、その後凍結乾燥などの処理により、精製さ
れたコレステロールオキシダーゼを得るＱ 次に本発明のコレステロールオキシダーゼの活性態定法
および性質について述べる。
培養物を一過または遠心分離などの手段によりその陶体
を採取し、次いでこの飾体を超音波処理、フレンチプレ
ス処理やガラスピーズ処理などの機械的破壊手段やリゾ
チームなどの酵素的破壊手段ｅこで破壊し、ま几必要１
こ応じてトリトンＸ−／ ＯＯ（ＴｒｉｔｏｎＸ −／
ＯＯ：商品名）、アデカトールＳｏ−／２０’（商品
名）などの界面活性剤を添加してもよい。次いでこのよ
うｅこして得られ友コレステロールオキシダーゼ含有液
は、濃縮するか、または濃縮することなく、可溶性塩類
、例えば硫安などを用いて塩析せしめるが、親水性有機
溶媒、例、ｔばメタノール、エタノール、アセトン、イ
ンプロパツールなどを用いて本酵素を沈澱せしめればよ
い。さら１ここの沈澱物は、水１之は緩衝液ｔｒ−溶解
後、必要に応じて半透膜１こて透析せしめ、さらｔこＤ
ＥＡＥ−セファデックス、ＤＥＡＥ−セファロースやＤ
ＥＡＥ−セルロースナトやカルボキシメチル−セルロー
ス、カルボキシメチル−セファロース、カルボキシメチ
ル−セファデックスなどのイオン交換樹脂を用いるクロ
マトグラフィーやセファデックスＧ２００、セファロー
スＣＬ−ＡＢ、七フアクリルＳ−，２００などの分子篩
剤などのゲル濾過剤を用いるクロマトグラフィーｅこて
精製せしめ、その後凍結乾燥などの処理により、精製さ
れたコレステロールオキシダーゼを得るＱ 次に本発明のコレステロールオキシダーゼの活性態定法
および性質について述べる。
■ 活性測定法
０．２Ｍ リン酸緩衝液（ｐ Ｈｆ、 ０ ）
０．２３扉ｇθ、３チ グーアミノアンチピリン ０
．／ｍｅＱ、 ２％ フェノール Ｑ、
７ｍ１７９６ ト リ ト ７ Ｘ −／
０ ０ Ｑ、 ３ ｍｌ（
！；□Ｕ／ｍ１Ｖ）ペルオキシダーゼ Ｑ７ｍｌ／ｍ
Ｍ コレステロール Ｑ、７ｍ１Ｍ 留水
０．０３ ｍｌ 計 ／、Ｏｍｌ 上記の各組成を有する反応液／、 ＯＬｎｌを３７℃ｅ
こ予備加温し、次いでこれに酵素液２０μｅを加えて３
７℃で正確に７０分間反応せしめる。反応後、エタノー
ル２．０ ｍｌ ′１ｒ７ＪＤえて反応を停止せしめ、
次いでその呈色を波長１１９０ｎｍにて吸光度測定する
。酵素活性は、／分間ｔこ／μｍｏｌｅの過酸化水素を
生ずる活性を／単位（／ ｕｎｉｔ 、 ／ ＩＵ
）とするＯまた力価の算出は、次式ｔこ従う。
０．２３扉ｇθ、３チ グーアミノアンチピリン ０
．／ｍｅＱ、 ２％ フェノール Ｑ、
７ｍ１７９６ ト リ ト ７ Ｘ −／
０ ０ Ｑ、 ３ ｍｌ（
！；□Ｕ／ｍ１Ｖ）ペルオキシダーゼ Ｑ７ｍｌ／ｍ
Ｍ コレステロール Ｑ、７ｍ１Ｍ 留水
０．０３ ｍｌ 計 ／、Ｏｍｌ 上記の各組成を有する反応液／、 ＯＬｎｌを３７℃ｅ
こ予備加温し、次いでこれに酵素液２０μｅを加えて３
７℃で正確に７０分間反応せしめる。反応後、エタノー
ル２．０ ｍｌ ′１ｒ７ＪＤえて反応を停止せしめ、
次いでその呈色を波長１１９０ｎｍにて吸光度測定する
。酵素活性は、／分間ｔこ／μｍｏｌｅの過酸化水素を
生ずる活性を／単位（／ ｕｎｉｔ 、 ／ ＩＵ
）とするＯまた力価の算出は、次式ｔこ従う。
（ただし、△Ａ ４９０は、波長４ｔ９０ｎｍｔこおけ
る吸光値を示す） ０作用 コレステロール１モルｅこ対して、１モルの酸素全消費
して、１モルのコレステノンおよび過酸化水素を生成す
る反応を触媒する作用を有する。
る吸光値を示す） ０作用 コレステロール１モルｅこ対して、１モルの酸素全消費
して、１モルのコレステノンおよび過酸化水素を生成す
る反応を触媒する作用を有する。
■ 基質特異性
前記の活性測定法ｔこおいて、コレステロールの基
代りｔこ、下記の種々の抗質を用いて、その活性を測定
し友。その結果、艷／表に示す通りであった。
し友。その結果、艷／表に示す通りであった。
■ 至適ｐＨ
前記の活性測定法Ｖこおける緩衝液Ｖこおいて、ｐＨ１
＋−タＳの酢酸緩衝液（を慢）、ｐ）（左Ｓ〜ｆ、 ３
のリン酸緩衝液（ｏ−ｏ ）、ｐ Ｈｇ、 ３〜１０の
ホウ酸緩衝ｔＬ＜ ｔ−ｔ−＞を用いて、その酵素活性
を測定した。
＋−タＳの酢酸緩衝液（を慢）、ｐ）（左Ｓ〜ｆ、 ３
のリン酸緩衝液（ｏ−ｏ ）、ｐ Ｈｇ、 ３〜１０の
ホウ酸緩衝ｔＬ＜ ｔ−ｔ−＞を用いて、その酵素活性
を測定した。
その結果、第１図に示す通りで、本酵素はｐＨ７付近に
至適ｐｌ（を有すると認められる〇■ ｐＨ安定性 コレステロールオキシダーゼ含有酵素液を、各種の緩衝
液（ｐＨ４’−タＳの酢酸緩衝液・ｐＨ５３−ｆ、 ３
のリン酸緩衝液、ｐ Ｈｆ、 ５〜１０ホウ酸緩衝液）
で３７℃、６０分間力ロ熱処理した後、その残存活性を
前記活性測定法ｔこ基いて測定した。
至適ｐｌ（を有すると認められる〇■ ｐＨ安定性 コレステロールオキシダーゼ含有酵素液を、各種の緩衝
液（ｐＨ４’−タＳの酢酸緩衝液・ｐＨ５３−ｆ、 ３
のリン酸緩衝液、ｐ Ｈｆ、 ５〜１０ホウ酸緩衝液）
で３７℃、６０分間力ロ熱処理した後、その残存活性を
前記活性測定法ｔこ基いて測定した。
その結果、第２図１こ示す通りで、本酵素はｐＨ６〜７
の範囲で安定と認められた。
の範囲で安定と認められた。
■ 熱安定性
コレステロールオキシダーゼ含有酵素液を、５０ｍＭ’
）７酸緩衝液（ｐ Ｈ’７ｏ） ｆ ／ Ｏ分ｈｎ、７
０〜７０℃にて加熱処理した後、その残存活性を前記活
性測定法に基いて測定した。その結果、第３図を示す通
りで、本酵素は５０℃まで安定と認められた〇 いた電気泳動法１こより測定した。） ■ 分子量 約３１ｒ０００ （七）ｌデックスＧ−／３０＞約５ざ
０００ （ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動） ■ｈ値 約Ｊｘ１０−５Ｍ（コレステロール） 以上の本酵素の性質より、本酵素をコレステロールオキ
シダーゼと認めたものである。
）７酸緩衝液（ｐ Ｈ’７ｏ） ｆ ／ Ｏ分ｈｎ、７
０〜７０℃にて加熱処理した後、その残存活性を前記活
性測定法に基いて測定した。その結果、第３図を示す通
りで、本酵素は５０℃まで安定と認められた〇 いた電気泳動法１こより測定した。） ■ 分子量 約３１ｒ０００ （七）ｌデックスＧ−／３０＞約５ざ
０００ （ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動） ■ｈ値 約Ｊｘ１０−５Ｍ（コレステロール） 以上の本酵素の性質より、本酵素をコレステロールオキ
シダーゼと認めたものである。
サラｔここのコレステロールオキシダーゼは、コレステ
ロールを遊離する試料やコレステロールを含有する試料
の定量に使用される。例えばコレスチロール含有試料に
、このコレステロールオキシダーゼを作用せしめること
により、このコレステロールオキシダーゼの酵素作用に
基いて消費される酵素、または生成される過酸化水素ま
たはコレに ステノンを定量すること鴎より、コレステロ−°ルの定
量をなＬ得るものである。また酸素や過酸化水素定量ｅ
こ当っては、酸素電極、過酸化水素電極などの目的とす
る成分に感応する電極ｅこよる電気的手段によって行な
ってもよく、ｆた酵素を公知の神々の手段ｅこよって固
定化酵素となして、電気的手段ｅこ用いられる電極面ｅ
こ固着せしめ几酵素電極となして行なってもよい。さＩ
−）ｅこ過酸化水素を測定するｔこ当っては、好ましく
は過酸化水素の存在下で色調変化を受ける７種もしくは
２種以上の呈色剤１こよるシステムｅこて比色測定する
。測桓する方法としては、例えば生成する過酸化水素と
反応して安定した赤色を形成するグ価のチタン化合物と
キシレノールオレンジｅこよって、生成した過酸化水素
の量をその呈色の強さ？こ工って測定するか、フェノー
ル、ｑ−アミノアンチピリンおよびペルオキシダーゼと
の反応Ｑこよって、その色調の変化を測定する方法など
が挙られる。またこのグーアミノアンチピリンの代りｔ
こ≠−アミノフェナゾーンを用いてもよい。さらｔこジ
エチル−ｍ−）ルイジン、グーアミノアンチピリン、ペ
ルオキシダーゼを含有する試薬を用いて、生成した過酸
化水素の量をその呈色の強さｅこよって測定してもよい
。ソノ他、２．Ａ−ジクロルフェノールインドフェノー
ルとペルオキシダーゼとの絹合せＶこよる過酸化水素の
定量測定、グアヤク脂とペルオキシダーゼの組合せによ
る過酸化水素の定量測定、ホモバニリン酸トベルオキシ
ダーゼの組合せによる過酸化水素の定量測定などのベル
４オキシダーゼを用いる定量法が簡便かつ正確な友めに
好まし７い。さらｅここの過酸化水素の定量用試薬を、
フィルムや洲紙などの担体面１こ塗布せしめた簡便な積
層一体型となしてもよい。
ロールを遊離する試料やコレステロールを含有する試料
の定量に使用される。例えばコレスチロール含有試料に
、このコレステロールオキシダーゼを作用せしめること
により、このコレステロールオキシダーゼの酵素作用に
基いて消費される酵素、または生成される過酸化水素ま
たはコレに ステノンを定量すること鴎より、コレステロ−°ルの定
量をなＬ得るものである。また酸素や過酸化水素定量ｅ
こ当っては、酸素電極、過酸化水素電極などの目的とす
る成分に感応する電極ｅこよる電気的手段によって行な
ってもよく、ｆた酵素を公知の神々の手段ｅこよって固
定化酵素となして、電気的手段ｅこ用いられる電極面ｅ
こ固着せしめ几酵素電極となして行なってもよい。さＩ
−）ｅこ過酸化水素を測定するｔこ当っては、好ましく
は過酸化水素の存在下で色調変化を受ける７種もしくは
２種以上の呈色剤１こよるシステムｅこて比色測定する
。測桓する方法としては、例えば生成する過酸化水素と
反応して安定した赤色を形成するグ価のチタン化合物と
キシレノールオレンジｅこよって、生成した過酸化水素
の量をその呈色の強さ？こ工って測定するか、フェノー
ル、ｑ−アミノアンチピリンおよびペルオキシダーゼと
の反応Ｑこよって、その色調の変化を測定する方法など
が挙られる。またこのグーアミノアンチピリンの代りｔ
こ≠−アミノフェナゾーンを用いてもよい。さらｔこジ
エチル−ｍ−）ルイジン、グーアミノアンチピリン、ペ
ルオキシダーゼを含有する試薬を用いて、生成した過酸
化水素の量をその呈色の強さｅこよって測定してもよい
。ソノ他、２．Ａ−ジクロルフェノールインドフェノー
ルとペルオキシダーゼとの絹合せＶこよる過酸化水素の
定量測定、グアヤク脂とペルオキシダーゼの組合せによ
る過酸化水素の定量測定、ホモバニリン酸トベルオキシ
ダーゼの組合せによる過酸化水素の定量測定などのベル
４オキシダーゼを用いる定量法が簡便かつ正確な友めに
好まし７い。さらｅここの過酸化水素の定量用試薬を、
フィルムや洲紙などの担体面１こ塗布せしめた簡便な積
層一体型となしてもよい。
次いで本発明の実施例を挙げて具体的Ｖこ述べるが、本
発明はこれらｅこ工って伺んら限定されるものではない
。
発明はこれらｅこ工って伺んら限定されるものではない
。
実施例 ／
コレステロール７０％、肉エキス０．５％、 Ｋ２ＨＰ
ＯＯ，７％、 ＫＣＩ Ｏ，０３％、 ＭｇＳＯ４＠
７Ｈ２００，０３％含有培地１００ｍ１を３００ｍＢ
容三角フラスコｔことり、／２０ＣＸＯ分間滅菌後セル
ロモナス・ニス・ピー・Ｂ−Ｏｇ／ＩＩ菌体を白金耳で
接攬約２６℃でＪＩＩ時間振盪培養を行なった。
ＯＯ，７％、 ＫＣＩ Ｏ，０３％、 ＭｇＳＯ４＠
７Ｈ２００，０３％含有培地１００ｍ１を３００ｍＢ
容三角フラスコｔことり、／２０ＣＸＯ分間滅菌後セル
ロモナス・ニス・ピー・Ｂ−Ｏｇ／ＩＩ菌体を白金耳で
接攬約２６℃でＪＩＩ時間振盪培養を行なった。
次いで、この培養物２００ｍ１（２本分）を同一組成の
培地２０１を含む３０１容ジャーファーメンタ−に植菌
し、２６℃で、ＰＩ？速度２０ Ｏｒｐｍ。
培地２０１を含む３０１容ジャーファーメンタ−に植菌
し、２６℃で、ＰＩ？速度２０ Ｏｒｐｍ。
通気量２０ （１／ｍｉｎで培養を行ない、２≠時間後
ｍＭ＃ＥＤＴＡ含有２０ｍＭ・リン酸緩衝液（ｐＨ７、
！；）、！０１にこ分散させ、３７℃で３時間菌体を溶
解させ酵素を可溶化した。
ｍＭ＃ＥＤＴＡ含有２０ｍＭ・リン酸緩衝液（ｐＨ７、
！；）、！０１にこ分散させ、３７℃で３時間菌体を溶
解させ酵素を可溶化した。
可溶化後、不溶物を！；０００ｒｐｍで７５分間遠心し
て除去し、得られた上清’１． ｇ １１ ｔ３．３
ｕ／ｍｅ、／乙ＯＯＯπ）Ｖこつぃて硫安分画を行ない
、０．３グ〜０．７飽和画分を集めた。この沈澱画分を
２０ｒｎＭ・リン酸緩衝液（ｐ Ｈ７５） ｇ ＯＯｓ
ｌニ溶Ｈｆ１ｋ透析チューブに入れ、流水１こ対して透
析し、た。その後不溶物を／２００Ｏｒｐｍ 、７０分
間遠心分離して、上清７ＡＯｍｌを得た。（／７．２６
ｕ／ ｍｌ、／３／２０ｕ）。
て除去し、得られた上清’１． ｇ １１ ｔ３．３
ｕ／ｍｅ、／乙ＯＯＯπ）Ｖこつぃて硫安分画を行ない
、０．３グ〜０．７飽和画分を集めた。この沈澱画分を
２０ｒｎＭ・リン酸緩衝液（ｐ Ｈ７５） ｇ ＯＯｓ
ｌニ溶Ｈｆ１ｋ透析チューブに入れ、流水１こ対して透
析し、た。その後不溶物を／２００Ｏｒｐｍ 、７０分
間遠心分離して、上清７ＡＯｍｌを得た。（／７．２６
ｕ／ ｍｌ、／３／２０ｕ）。
さら１こ得られ炎上清液を、コｏｍＭｅリン酸緩衝液（
ｐＨ７５）で緩衝化しｆｃ Ｄ ＥＡ Ｅ −５ｅｐｈ
ａ−ｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ （ｊ Ｘ ７０ｃｍ１
ｔこチャージし、ＫＣＩ濃度Ｏ〜０．３Ｍの濃度勾
配で溶出を行ない、ＫＣＩ濃度濃度０子２ メｆｃ （Ｊ ７ ７ 、ｌ！ ’ｔｒ／ ｄ、／２０
７ｏｕ）。この両分ｔ ／ Ｏ ｍ Ｍ ＊ リン酸緩
衝液（ｐＨ７（１））１０ｉｌＶこ対して透析し、同じ
緩衝液で緩衝化したＤＥＡＥ−８ｅｐｈａｒｏｇｅ
ＣＬ−４Ｂ ＜３ Ｘ３ｏｍ）カラムｅこチャージしＫ
ＣＩ濃度Ｏ／〜０．５Ｍの濃度勾配で容出し、０． ２
７〜０３７Ｍ＠ＫＣ１で浴出された両分を集めた（７６
３２Ｆ／ｌｎｌ，１０３ｇ ｏｕ）。
ｐＨ７５）で緩衝化しｆｃ Ｄ ＥＡ Ｅ −５ｅｐｈ
ａ−ｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ （ｊ Ｘ ７０ｃｍ１
ｔこチャージし、ＫＣＩ濃度Ｏ〜０．３Ｍの濃度勾
配で溶出を行ない、ＫＣＩ濃度濃度０子２ メｆｃ （Ｊ ７ ７ 、ｌ！ ’ｔｒ／ ｄ、／２０
７ｏｕ）。この両分ｔ ／ Ｏ ｍ Ｍ ＊ リン酸緩
衝液（ｐＨ７（１））１０ｉｌＶこ対して透析し、同じ
緩衝液で緩衝化したＤＥＡＥ−８ｅｐｈａｒｏｇｅ
ＣＬ−４Ｂ ＜３ Ｘ３ｏｍ）カラムｅこチャージしＫ
ＣＩ濃度Ｏ／〜０．５Ｍの濃度勾配で容出し、０． ２
７〜０３７Ｍ＠ＫＣ１で浴出された両分を集めた（７６
３２Ｆ／ｌｎｌ，１０３ｇ ｏｕ）。
この画分を即外口過膜（アミコン社＃）で濃縮し、セフ
ァデックスＧ−７００カラム（ｊＸ７０ｃｆｎ）１こチ
ャージし、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７３）で溶出を
行ない活性画分を集め、凍結乾燥し７’ｎ（２７６’９
．ｇｏ９乙１１ｕ、収率３０．６％、本標品の比活性は
３／、６ｔｉ／Ｗ蛋白質で電気泳動的に単一バンドであ
つ迄〇 実施例 ２ コレステロールオキシダーゼの至適量。
ァデックスＧ−７００カラム（ｊＸ７０ｃｆｎ）１こチ
ャージし、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７３）で溶出を
行ない活性画分を集め、凍結乾燥し７’ｎ（２７６’９
．ｇｏ９乙１１ｕ、収率３０．６％、本標品の比活性は
３／、６ｔｉ／Ｗ蛋白質で電気泳動的に単一バンドであ
つ迄〇 実施例 ２ コレステロールオキシダーゼの至適量。
３０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７５）０．０３％ ｑ
−アミノアンチピリン ０、０２チ フェノール リパーゼ（クロモバクテリウム属に楓する生産菌由来） ２００１１７ ｍｌ ペルオキシダーゼ ２ｕ／ｌｌｌ１ コレステロールオキシダー−ｔ／ （，２ｆｉ）※０〜
／、乙７ ｕ ／ ｍｅ （※コレステロールオキシダーゼは本発明−のものとス
トレプトマイセス属由来のものとの２種を比較し几。） 上記の組成液３ｍｌを小試験管ｔことり３７℃ｔこ予備
加温後、人血清２０μ４を添加後正確にＳ分間３７℃で
反応し、直ちに３００ ｎｍで比色定量を行なった。そ
の結果、第を図ｔこ示す通りで、図中（ハ）は本発明の
コレステロールオキシダーゼの場合を示し、１はストレ
プトマイセス属由来のコレステロールオキシダーゼの場
合を示すもので、ストレグトマイセス属の由来のコレス
テロールオキシダーゼが／テスト当り約Ｓπ必要なの１
０対し。
−アミノアンチピリン ０、０２チ フェノール リパーゼ（クロモバクテリウム属に楓する生産菌由来） ２００１１７ ｍｌ ペルオキシダーゼ ２ｕ／ｌｌｌ１ コレステロールオキシダー−ｔ／ （，２ｆｉ）※０〜
／、乙７ ｕ ／ ｍｅ （※コレステロールオキシダーゼは本発明−のものとス
トレプトマイセス属由来のものとの２種を比較し几。） 上記の組成液３ｍｌを小試験管ｔことり３７℃ｔこ予備
加温後、人血清２０μ４を添加後正確にＳ分間３７℃で
反応し、直ちに３００ ｎｍで比色定量を行なった。そ
の結果、第を図ｔこ示す通りで、図中（ハ）は本発明の
コレステロールオキシダーゼの場合を示し、１はストレ
プトマイセス属由来のコレステロールオキシダーゼの場
合を示すもので、ストレグトマイセス属の由来のコレス
テロールオキシダーゼが／テスト当り約Ｓπ必要なの１
０対し。
本発明のコレステロールオキシダーゼは０．３Ｍ／テス
ト有れば十分で非常１こ反応の速いことが確認されたＣ
ト有れば十分で非常１こ反応の速いことが確認されたＣ
第１図は、本発明のコレステロールオキシダーゼ至適ｐ
Ｈ曲線、第２図はｐＨ安定性曲線、第３図は熱安定性曲
線を示し、第を図はコレステロールオキシダーゼの至適
Ｉを示す曲線である。 特許出願人東洋醸造株式会社 代表者伊東富士馬 第１図 第２図 ４ ６ ８ １０ ｐＨ 第 ３ 図 ２０ ４０ ６０ ８０ 温 度 （０Ｃ） 第 ｑ 図 １ ２３４５ コレステロールオキシダーゼ （Ｕ／テスト） 手続補正書 昭和５７年６月グ日 昭和５７年特許願第１／３び３号 ２１発明の名称 コレステロールオキシダーゼの製造法 ３Ａ袖止をする者 事件との関係 特許出願人 昭和５７年Ｓ月７日手続補正指令書（方式）％式％） ５１袖止の対象 乙＼補正の内容 別紙添付の通り（タイプ印書による清書のため内容の変
更なし ワ、添付書類の目録
Ｈ曲線、第２図はｐＨ安定性曲線、第３図は熱安定性曲
線を示し、第を図はコレステロールオキシダーゼの至適
Ｉを示す曲線である。 特許出願人東洋醸造株式会社 代表者伊東富士馬 第１図 第２図 ４ ６ ８ １０ ｐＨ 第 ３ 図 ２０ ４０ ６０ ８０ 温 度 （０Ｃ） 第 ｑ 図 １ ２３４５ コレステロールオキシダーゼ （Ｕ／テスト） 手続補正書 昭和５７年６月グ日 昭和５７年特許願第１／３び３号 ２１発明の名称 コレステロールオキシダーゼの製造法 ３Ａ袖止をする者 事件との関係 特許出願人 昭和５７年Ｓ月７日手続補正指令書（方式）％式％） ５１袖止の対象 乙＼補正の内容 別紙添付の通り（タイプ印書による清書のため内容の変
更なし ワ、添付書類の目録
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （＋１セルロモナスＭｅこ属するコレステロールオキシ
ダーゼ生産菌を培地ｔこ培養し、その培養物からコレス
テロールオキシダーゼを採取することを特徴とするコレ
ステロールオキシダーゼの製造法。 （２）セルロモナス属に属スるコレステロールオキシダ
ーゼ生産菌が、セルロモナス・ニス・ビー・Ｂ−Ｏｇ／
ＩＩ菌である特許請求の範囲第１項記載のコレステロー
ルオキシダーゼ生産菌の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57011303A JPS58129973A (ja) | 1982-01-26 | 1982-01-26 | コレステロ−ルオキシダ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57011303A JPS58129973A (ja) | 1982-01-26 | 1982-01-26 | コレステロ−ルオキシダ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58129973A true JPS58129973A (ja) | 1983-08-03 |
| JPH0147150B2 JPH0147150B2 (ja) | 1989-10-12 |
Family
ID=11774226
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57011303A Granted JPS58129973A (ja) | 1982-01-26 | 1982-01-26 | コレステロ−ルオキシダ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58129973A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2567906A1 (fr) * | 1984-07-23 | 1986-01-24 | Toyo Jozo Kk | Procede de dosage enzymatique tres sensible |
| US5171681A (en) * | 1989-07-24 | 1992-12-15 | Toyo Jozo Kabushiki Kaisha | Omega-carboxyalcohol oxidase |
| US5206148A (en) * | 1989-07-24 | 1993-04-27 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Method for assaying aliphatic alcohol, aliphatic aldehyde or ω-carboxylic acid derivatives thereof |
-
1982
- 1982-01-26 JP JP57011303A patent/JPS58129973A/ja active Granted
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2567906A1 (fr) * | 1984-07-23 | 1986-01-24 | Toyo Jozo Kk | Procede de dosage enzymatique tres sensible |
| US5171681A (en) * | 1989-07-24 | 1992-12-15 | Toyo Jozo Kabushiki Kaisha | Omega-carboxyalcohol oxidase |
| US5206148A (en) * | 1989-07-24 | 1993-04-27 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Method for assaying aliphatic alcohol, aliphatic aldehyde or ω-carboxylic acid derivatives thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0147150B2 (ja) | 1989-10-12 |
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