FR2567906A1 - Procede de dosage enzymatique tres sensible - Google Patents
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Abstract
PROCEDE DE DOSAGE ENZYMATIQUE QUANTITATIF TRES SENSIBLE POUR N'IMPORTE QUEL COMPOSANT QUI EST UN 3B-HYDROXYSTEROIDE OU UN 3-CETOSTEROIDE, DANS UN SPECIMEN A DOSER, DANS LEQUEL ON FAIT PRENDRE PART AUDIT COMPOSANT DU SPECIMEN A LA REACTION DE CYCLAGE: (CF DESSIN DANS BOPI) ET ON MESURE UN CHANGEMENT DETECTABLE DANS LE SYSTEME REACTIONNEL. CECI PROCURE DONC UNE REACTION DE CYCLAGE 3B-HYDROXYSTEROIDE-3-CETOSTEROIDE, UTILISANT UNE 3B-HYDROXYSTEROIDE OXYDASE, QUI CONSOMME O ET GENERE HO ET 3-CETOSTEROIDE, AVEC UN SUBSTRAT DE 3B-HYDROXYSTEROIDE, ET PLUS LOIN, UNE 3B-HYDROXY-STEROIDE DESHYDROGENASE QUI CONSOMME NAD (P) REDUIT ET GENERE NAD (P) ET 3B-HYDROXYSTEROIDE, AVEC UN SUBSTRAT DE 3-CETOSTEROIDE. DES EXEMPLES DE SPECIMENS SONT DES SPECIMENS QUI CONTIENNENT N'IMPORTE QUEL COMPOSANT QUI EST UN 3-HYDROXYSTEROIDE OU UN 3-CETOSTEROIDE, OU QUI LIBERENT OU GENERENT UN TEL COMPOSE EN PROCEDANT A 1 VITESSE DE PLUS DE 10 CYCLESPAR MINUTE, ET EN MESURANT LA QUANTITE DE CHANGEMENT DETECTABLE DANS LA REACTION, LE COMPOSE DANS UN SPECIMEN PEUT FACILEMENT ET SENSIBLEMENT ETRE DETECTE AVEC UNE BONNE PRECISION.
Description
La présente invention concerne un procédé de dosage quantitatif pour un
composant quelconque, dans un spécimen à doser, lequel composant peut être un 313-hydroxystéroïde ou un 3-cétostéroïde. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé de dosage enzymatique très sensible dans lequel on fait réagir un composant dans le spécimen avec les composants de la réaction de cyclage (I)
3B-hydroxystéroïde-
oxydase
O 0 H O
02 2 2
(I) 313-hydroxystéroïde 3-cétostéroïde NAD (P) NAD (P) réduit
313-hydroxystéroïde-
déshydrogénase
et on mesure la quantité de changement détectable dans le système réaction-
nel. On connaît jusqu'à présent des procédés de dosage enzymatique avec cyclage comme le cyclage du NAD, le cyclage du NADP ou le cyclage du CoA. Ainsi, on a soumis une alcool déshydrogénase à une réaction avec de l'éthanol comme substrat en présence de NAD pour former du NAD réduit qui est oxydé en NAD par l'action de la malico déshydrogénase sur un substrat d'oxalacétate pour constituer une réaction de cyclage NAD - NAD réduit (Japan Biochem. Soc. Ed. "Experimental Methods in Biochemistry", vol. 5, "Research Methods in Enzymology" p. 121-135, Tokyo Kagaku Dojin Publishing
Co., août 1975, Mori, A. dir. publ. "Manual of Assay Methods in Neurotrans-
mittance", p. 165-172, Ishiyaku Publishing Co., nov. 1979).
On connaît un autre procédé comme suit: Dans la réaction ci-dessus, on remplace la malico déshydrogénase par la NAD réduit-oxydase pour constituer une réaction de cyclage o de l'oxygène et du NAD réduit sont consommés et o H2 0 etNAD sont générés (Institute for Phys. and Chem. Sci. Ed.: "Present and Future of Life Sciences",
p. 30-32, K.K. Creative Life Sci. Res. Assn., mars 1981). On traite l'hydroxy-
stéroïde avec de l'hydroxystéroïde-déshydrogénase pour réduire le NAD en NAD réduit qui est transformé en NAD avec formation de formazane par
l'action d'une transférase comme la diaphorase en présence d'un sel de tétra-
zolium pour constituer la réaction de cyclage (demande de brevet japonais
non examiné publié_ sous le n 56-144096).
On traite du glutathion et du déshydroascorbate avec de la gluta-
thion déshydroascorbate oxydo-réductase, transformant ainsi le déshydro-
ascorbate en ascorbate, qui consomme de l'oxygène et génère H2 0 et du déshydroascorbate par l'action de l'ascorbate oxydase pour constituer une réaction de cyclage (demande de brevet japonais non examiné publié sous le N 56-151498). On connaît également le cyclage du NAD avec consommation d'oxygène et génération de peroxyde d'hydrogène par utilisation de NAD réduit oxydase (demande de brevet japonais non examiné, publié sous
le n 56-78599).
Comme on l'a mentionné ci-dessus, on a signalé plusieurs types de systèmes de réaction de cyclage; cependant, le plus employé, l'oxydase NAD réduit, qui génère du peroxyde, ne peut être obtenue sous forme purifiée à cause de difficultés de purification, et on peut donc s'attendre à aucune exactitude dans le dosage. En outre, dans un procédé de cyclage du NAD, Il faut des procédés compliqués o l'on doit décomposer un excès de NAD en chauffant dans des conditions alcalines, et ladite base doit être neutralisée. La concentration de l'hormone stéroïde dans le spécimen vital est généralement faible et le dosage direct en spectrophotométrie générale est jusqu'ici difficile. Dans un procédé de dosage de la technique
antérieure, on traite un hydroxystéroïde avec de la 3-hydroxystéroïde dés-
hydrogénase et du NAD pour générer du NAD réduit que l'on mesure par colorimétrie à 340 nm. Ledit procédé est peu sensible et on ne peut donc pas
mesurer des traces d'hormone stéroYde dans le sérum sauf le cholestérol.
On a maintenant découvert une réaction de cyclage 313-hydroxy-
stéroïde-3-cétostéroïde utilisant la 3B-hydroxystéroïde oxydase, qui consomme
de 1'O2 et génère H et un 3-cétostéroYde, avec un substrat de 313hydroxy-
stéroïde, et en outre la 3B-hydroxystéroïde déshydrogénase, qui consomme du NAD(P) réduit et génère du NAD(P) et un 3B-hydroxystéroïde, avec un
- substrat de 3-cétostéroïde.
Ces réactifs peuvent être fournis à bas coût et avec une bonne qualité, et de plus on peut obtenir une réaction de cyclage efficace en dépit de la coexistence de H 02 actif comme oxydant et deNAD réduit actif comme réducteur. En outre, on a trouvé que dans la réaction de cyclage, on fait réagir le 313-hydroxystéro de ou le 3-cétostéroïde dans un spécimen avec le reste des autres composants dans le système de réaction de cyclage constitué de 3r3-hydroxystéroïde, 3-cétostéroïde, 3B-hydroxystéroïde oxydase, 3B-hydroxystéroïde déshydrogénase, NAD(P), NAD(P) réduit, O 2 ou H 202 et cela en procédant à une vitesse de plus de 10 cycles par minute et en mesurant la quantité d'un changement détectable dans la réaction, le composant dans un spécimen peut facilement et de façon sensible être détecté avec
une bonne précision.
Un objet de l'invention est de fournir un procédé de dosage enzy-
matique simple et très sensible ne nécessitant pas le pré-traitement compliqué
dans un procédé de dosage antérieur pour le 3B-hydroxystéroYde ou 3-céto-
stéroïde dans un spécimen par application d'une réaction de cyclage à coenzyme.
Ces objets sont atteints, selon l'invention, par le procédé qui a maintenant été découvert, dans lequel on fait réagir un composant dans le spécimen avec les composants de la réaction de cyclage (I) 3Bhydroxystéroïde oxydase LH
I)
3r3-hydroxystéroïde <______y_____ 3-cétostéroïde NAD(P) | NAD(P) réduit 3B-hydroxystéroïde déshydrogénase
et on mesure la quantité d'un changement détectable dans le système réac-
tionnel.
Comme exemples de spécimens on peut citer les spécimens qui contien-
nent un 3B-hydroxystéroïde ou 3-cétostéroïde, ou qui libèrent ou génèrent un tel composant. Dans ce dernier cas, on peut mentionner les systèmes métaboliques et les systèmes biosynthétiques de diverses hormones stéroïdes,
qui se répartissent, p. ex., en androgènes chez les animaux mâles, oestro-
gènes ou gestagènes chez les animaux femelles et corticoïdes chez les deux sexes. On peut déterminere une activité enzymatique qui participe à ces systèmes ou la quantité de 3B-hydroxystéro'ide ou de 3-cétostéroide. On
en trouve des exemples ci-dessous.
3B-hydroxystérolde: (1) Androgène: pregnenolone, 17>k-hydroxypregnenolone, déshydroépiandrostérone,
androstène-3B,17B-diol, androstane-3B,17B-diol, &5-androstérone-
313,17 o-diol, androstane-3B,1 1B-diol-17-one.
(2) Oestrogène:
oestradiol, oestrone, oestriol, équiline, équilénine, éthynyloestra-
diol.
3-cétostéroïde: (1) Androgène:
progestérone, 17"-hydroxyprogestérone, testostérone, androstène-
dione. (2) Corticoide:
corticostérone, cortisol, cortisone.
Dans un dosage, on ajoute de la 313-hydroxystéroide oxydase, de la 3Bhydroxystéroide déshydrogénase et du NAD(P) réduit à un spécimen
qui contient un composant quelconque à doser ci-dessus. -
On peut éventuellement ajuster la concentration de substrat, c'est-
à-dire de 3B-hydroxystéroïde ou de 3-cétostéroïde à 5 nM - 30 eM/5-20 uil.
La température de la réaction peut être une température pour laquelle la
réaction de cyclage se déroule régulièrement, et est de préférence à 37"C.
La durée de réaction varie selon la concentration de substrat, la concentration d'enzyme et la température de la réaction, et est généralement supérieure
à 1 minute, de préférence 2-10 minutes.
Un exemple de 3B-hydroxystéro'ide déshydrogénase est un produit du commerce obtenu à partir de Pseudomonas testeroni (SIGMA CHEM. CO., EtatsUnis). La quantité à utiliser est supérieure à 0,05 unité/ml dans une
réaction, de préférence 2-4 unités/ml.
Un exemple de 3B-hydroxystéro'ide oxydase est une enzyme du commerce, la cholestérol oxydase généralement connue (EC 1.1.3.6), qui est produite à partir d'un microorganisme Streptococcus, Brevibacterium, Schizophylum,
Corynebacterium, Cellulomonas, Arthrobacter, Nocardia ou Mvcobacterium.
Une quantité de l'enzymeutilisée est supérieure à O,2 unité/ml, de préférence
-30 unités/ml.
La quantité de NAD(P) réduit à ajouter est généralement un excès
stoechiométrique par comparaison avec le substrat à doser, et est de préfé-
rence de 0,1-2,0 mM.
On peut le cas échéant faire varier sans limitation les concentrations
de substrat, d'enzyme et d'autre composant nécessaire dans le système réac-
tionnel. La réaction de cyclage (I) de l'invention peut être précisée dans le schéma réactionnel (I) ci-dessous o
composant constituant de 33-hydroxystéroïde, 3-cétostéroïde, 313-hydroxy-
stéroïde déshydrogénase, 3B-hydroxystéroïde oxydase, NAD(P), NAD(P) réduit, 0 2 et H2 2 3B-hydroxystéroïde oxydase 02 |H20c2
I (I)
313-hydroxystéroïde 3-cétostéroïde NAD(P) L |NAD(P) réduit 313hydroxystéroïde déshydrogénase Dans la réaction (I), une mole de 313hydroxystéroYde est transformée avec consommation d'une mole d'O2, généralement de l'oxygène dissous, en une mole de 3-cétostéroïde avec génération d'une mole d'H202 par l'action de la 3B-hydroxystéroïde oxydase pour constituer le système réactionnel de la 313-hydroxystéroide oxydase. Ensuite on transforme alors plus avant
une mole de 3-cétostéroide par l'action de la 313-hydroxystéroïde déshydro-
génase en présence d'une mole de NAD(P) réduit en une mole de 313-hydroxy-
stéroïde avec génération d'une mole de NAD(P), pour constituer le système
réactionnel de la 313-hydroxystéroïde déshydrogénase. En outre le 313hydroxy-
stéroïde ainsi généré est transformé en 3-cétostéroide pour constituer le système réactionnel de la 313-hydroxystéroïde oxydase, constituant ainsi le système de cyclage 3B-hvdroxystéroïde-3-cétostéroîde. Ladite réaction decyclage (I) procède en présence des six composants, le 313hydroxystéroide, le 3-cétostéroYde, la 3]-hydroxystéroïde oxydase, la 313hydroxystéroide déshydrogénase, le NAD(P) réduit et 02; cependant, le 3Bhydroxystéroide et le 3-cétostéroïde peuvent être formés l'un à partir de l'autre par une réaction de cyclage, et donc on peut utiliser l'un ou l'autre selon ce qu'on désire. En outre, dans la réaction de cyclage (I), H2 2 et le NAD réduit peuvent être liés pour former NAD, o une mole de H 202 et une mole de 2 2 NAD réduit sont consommées pour former deux moles de I20 et une mole de NAD par l'action de la NAD peroxydase (EC 1.11.1.1) (J.Biol. Chem., 225:
557, 1957) comme on le voit parla réaction (II).
33-hydroxystéroïde oxydase O 2 H O NAD(P) peroxydase e 2 22 3B-hydroxy- 3cé-, stéroïde stéroïde (II) NAD(P). NAD(P) réduit 2H2 O+NAD(P) 3BhydroxystéroYde déshydrogénase Dans la réaction de cyclage (II), H202 générée dans la réaction de cyclage (I) est consommée avec du NAD(P) réduit pour former du NAD(P), et ainsi deux moles de NAD(P) réduit sont consommées en un cycle de réaction de cyclage (II), qui donne des changements deux fois plus rapides dans la
quantité de NAD(P) réduit et un procédé de dosage plus sensible.
Autre solution, on peut transformer NAD(P) par une autre déshydro-
génase (appelée ici seconde déshydrogénase) et son substrat en NAD(P) réduit pour constituer une réaction de cyclage de NAD(P) constituée de NAD(P), de la seconde déshydrogénase et de son substrat. Ledit cyclage de NAD(P) peut être lié avec la réaction de cyclage (I) comme il est précisé par la
réaction (III).
3B-hydroxystéroïde oxydase
O2- H
2>
3B-hydroxy- 3-céto-
stéroide stéroïde NAD(P) NAD(P) réduit- (]) 3B-hydroxy-stéroïde déshydrogénase substrat pour la seconde substrat seconde déshydrodéshydro- oxydé génase génase
Ainsi, un composant dans le spécimen (présenté par -) et un compo-
sant qui constitue la réaction de cyclage (I) (présenté par Q) peuvent être précisés comme suit: (a) Compcent dans le spécimen; 3Bhydroxystéro'ide: p33hydroxystéro'de - 3B-hydroy- 3-céto- (a) stéroïde a-, ,stéroide NAD(P) INAD(P) ri 13-hydroxystéroYd| déshydrogénaseJ Dans la réaction de cyclage (Ia), o le composant dans le spécimen
est 3B-hydroxystéroXde, puis la 313-hydroxystérolde oxydase, la 3Bhydroxy-
stéroïde déshydrogénase, on utilise 02 et NAD(P) réduit pour les composants qui constituent la réaction de cyclage. La 313-hydroxystéroîde déshydrogénase est le substrat, qui consomme une mole de 313hydroxystéroîde et de O2et
génère une mole d'Hà 02 et de 3-cétostéroîde. En outre, la 3B-hydroxysté-
roide déshydrogénase agit sur un substrat de 3-cétostérodde pour consommer
une mole de 3-cétostéroïde et de NAD(P) réduit et générer une mole de 38-
hydroxystéroTde et de NAD(P), pour compléter ainsi la réaction de cyclage 3B-hydroxystéroide-3-cétostéroYde. Dans la réaction, 02 peut être fourni par de l'oxygène dissous dans le système et ainsi la 3B-hydroxystéroide oxydase, la 3B-hydroxystéroïde déshydrogénase et le NAD(P) réduit doivent
être fournis en excès comme réactifs pour le dosage. La quantité de 3B-
hydroxystérolde dans le spécimen n'est pas limitée et est naturellement
diluée à forte concentration.
La quantité de 313-hydroxystéro'de oxydase et de 3B-hydroxystérodie déshydrogénase dépend de la quantité de 313-hydroxystéroïde dans le spécimen et est généralement supérieure à 0,2 unité/ml pour un test, de préférence -30 unités/ml pour la 313-hydroxystéroïde oxydase et plus de 0, 05 unité/ml
pour un test, de préférence 2-4 unités/ml pour la 313-hydroxystéroïde déshydro-
génase. La quantité de NAD(P) réduit peut être supérieure au produit de la quantité de 3B-hydroxystéroîde dans le spécimen par le nombre de cycles
et est généralement en excès stoechiométrique de la quantité de 3Bhydroxy-
stéroYde, p. ex. plus de 50 fois, de préférence 100-10 000 fois. L'amplitude du changement détectable lorsque la réaction de cyclage est terminée peut être déterminée par la quantité d'O2 ou de NAD(P) réduit consommée ou d'H O2 générée. Comme on le voit dans la réaction de cyclage (II) ci-dessus, 2 2 l'H O générée et le NAD(P) réduit consommé peuvent être liés pour un dosage 2 2 très sensible. Dans cette réaction liée, la NAD(P) peroxydase est utilisée, en général, en une quantité de plus de 0, 5 unité pour un test, de préférence 1-20 unités. L'amplitude du changement détectable peut être de préférence
déterminée en mesurant le NAD(P) réduit consommé.
(b) Composant dans le spécimen: 3-cétostéroïde: Le schéma est présenté dans la réaction (lb) 313-hydroxystéroide J dahyrogéax NAD(P) réduit Idéshvdroésnase J NAD(P) - 3-cétostéroïde 313-hydroxy (lb) - T stéroïde H2O 313-hydrhroxystrode oxydase
L'un quelconque des corps 313-hydroxystéroïde oxydase, 3B3-hydroxy-
stéroïde déshydrogénase, Gz et NAD(P) réduit peut être le composant qui complète la réaction de cyclage (lb). Dans cette réaction, le cyclage 3cétostéroïde - 313-hydroxystéroïde est caractérisé par la consommation d'une mole de 3-cétostéroïde et de NAD(P) réduit pour générer une mole de NAD(P)
et de 3B3-hydroxystéroïde, puis par la consommation d'une mole de 3Bhydroxy-
stéroïde et d'O2 pour générerune mole d'H2 02 et de 3-cétostéroïde. 2 peut être fourni par de l'oxygène dissous et ainsi la 3B3-hydroxystéroïde oxydase, la 313-hydroxystéroïde déshydrogénase et le NAD(P) réduit sont
simplement ajoutés en excès stoechiométrique. La quantité de 3B-hydroxy-
stéroïde déshydrogénase et de 313-hydroxystéroïde oxydase est généralement de plus de 0,05 unité/ml pour la première, et de plus de 0,2 unité/ml pour
la dernière, de préférence 10-30 unités/ml pour la 313-hydroxystéroïde déshydro-
génase et 2-4 unités/ml pour la 3B-hydroxystéroïde oxydase. La quantité de NAD(P) réduit à utiliser est déterminée par le produit de la quantité de 3-cétostéroïde dans le spécimen par le nombre de cycles, et est en général
en excès stoechiométrique par comparaison avec la quantité de 3-cétosté-
roïde, p. ex. plus de 50 fois, de préférence 100-10 000 fois. L'amplitude du changement détectable après la fin de la réaction de cyclage peut être
déterminée par l'oxygène ou le NAD(P) réduit consommé ou l'H2 2 généré.
On peut obtenir une haute sensibilité de dosage en utilisant la NAD(P) peroxydase
comme il est dit ci-dessus.
25. On trouvera ci-dessous un procédé de dosage utilisant une seconde
déshydrogénase et son substrat comme présenté en (III) ci-dessus.
La réactio de cyclage est précisée par la réaction (IIIa).
3 -céostérYde substrat NAD(P) réduit H O oxydé 2 Isec nde5 / 33-hydroxy- \ 3-hydroxystérode déshvdro- stéroïde 4 oxydase génse -> \déshydrogénase (Ixydase substrat pour / \ la seconde shydrognas NAD(P) 3_B-hydroxy istrïde |
On utilise l'un quelconque des corps 3-cétostéroide ou 3B-hydroxy-
stéro-de déshydrogénase, 313-hydroxystéroïde oxydase, O2 l'un ou l'autre de NAD(P) ou NAD(P) réduit, la seconde déshydrogénase et le substrat pour la seconde déshydrogénase comme composants qui complètent la réaction de cyclage (IIIa). Dans cette réaction, la seconde déshydrogénase agit sur NAD(P), et une mole de NAD(P) et du substrat pour la seconde déshydrogénase sont consommées pour générer une mole de produit oxydant et de NAD(P)
réduit, puis on utilise le NAD(P) réduit dans la réaction de cyclage 3céto-
stéroide - 3B-hydroxystéroïde.
La 3B-hydroxystéroïde déshydrogénase agit sur le NAD(P) réduit généré et un rapport équimolaire de 3-cétostéroïde pour générer une mole de NAD(P) et de 3B3-hydroxystéroide, puis une mole de 3B-hydroxystéroîde et d'O2 sont consommées par l'action de la 3B-hydroxystéroïde oxydase pour tormer une mole d'H 202 et de 3-cétostéroiïde. Dans cette réaction, 2 peut être fourni à partir de l'oxygène dissous dans le mélange, et ainsi la 313hydroxystéroide oxydase, la 313-hydroxystéroïde déshydrogénase, le NAD(P) (ou NAD(P) réduit), la seconde déshydrogénase et son substrat doivent être fournis en excès comme réactifs pour le dosage. L'amplitude du changement détectable peut être déterminée en mesurant l'O2 consommé ou l'H2- 2 générée. 2 2 générée. La seconde déshydrogénase utilisée dans la réaction de cyclage (Illa) peut être une enzyme qui catalyse une réaction sur un substrat pour ladite déshydrogénase et NAD(P) pour former des produits oxydants dudit
substrat et du NAD(P) réduit, et ceci est présenté ci-dessous.
(a) Déshydrogénase; D-arabitol déshydrogénase (A Dase) (EC 1.1.1.11) et son substrat: D-arabitol: D-arabitol + NAD -> D-xylose + NAD réduit A Dase (b) Lactate déshydrogénase (LDH) (EC 1.1.1.27) et L-lactate: L- lactate + NAD -> pyruvate + NAD réduit LDH (c) Malate déshydrogénase (décaboxylante) (MDH) (EC 1.1.1.28) et L-malate: L-malate + NAD -> pyruvate + CO2 + NAD réduit MDH (d) Glucose déshydrogénase (GDH) (EC 1.1. 1.47) et glucose: 13-D-glucose + NAD ->) D-glucono- (-lactone + NAD réduit GDH (e) Formiate déshydrogénase (FDH) (EC 1.2.1.2) et formiate: Formiate + NAD -> CO2 + NAD réduit
- FDH 2
(f) Galactose déshydrogénase (Gal DH) (EC 1.1.1.48) et D-galactose: 0Dgalactose -> D-galactose-r-lactone + NAD réduit Gal DH Dans la réaction de cyclage (Id), NAD dans le spécimen est transformé en NAD réduit par l'action de la seconde déshydrogénase en présence d'un substrat approprié pour prendre part à la réaction de cyclage de NAD, puis le NAD réduit ainsi généré participe à la même réaction de cyclage que dans
(Ic) ci-dessus.
La quantité de réactifs utilisée dans la réaction de cyclage (Ilia) peut être en excès stoechiométrique de la quantité de NAD(P) ou de NAD(P) réduit. En outre, ladite réaction de cyclage de NAD(P) peut être liée par l'action de la NAD(P) peroxydase comme il est présenté dans la réaction
de cyclage (II).
On mesure alors n'importe lequel des composants 313-hydroxystéroïde ou 3cétostéroïde dans le spécimen ou un spécimen qui libère ou génère ledit composant et on peut doser ledit composant ou spécimen sur la base de la réaction de cyclage (Ia), (lb) ou (III), ou (Illa), ou (II) ci-dessus. Dans la réaction, le nombre de cycles est supérieur à 10, et ainsi la quantité
de réactifs utilisée est de préférence en excès molaire du nombre de cycles.
En outre, il est intéressant d'utiliser des traces de spécimen ou de spécimen dilué. Le milieu réactionnel peut être une solution de tampon de pH stable, généralement faiblement acide à faiblement alcaline. Ainsi, on peut utiliser
un tampon phosphaté de pH 6,5 - 8,5, un tampon tris-HCl, un tampon imidazole-
HCl, un tampon diméthylglutarate-NaOH ou un tampon PIPES-NaOH. La réaction
procède généralement à 37 C pendant plus d'une minute.
La réaction de cyclage (I) procède généralement à une vitesse de plus de 50 cycles par minute, bien que cette valeur varie selon la quantité d'enzyme utilisée ou sa valeur de Km, et ainsi la quantité d'enzyme et de réactifs peut être fournie de préférence pour plus de 60 cycles/minute
de réaction.
Ensuite, on mesure l'amplitude d'un changement détectable dans la réactionaprès le déroulement de la réaction, et ledit changement détectable est la quantité d'un composant qui consomme ou génère un rapport molaire du composant, dans un cycle réactionnel o une mole de 313-hydroxystéroïde ou de 3-cétostéroïde est consommée ou générée pendant la réaction de cyclage (I). Le composant préféré à mesurer est l'O2 consommé, le NAD(P) réduit
ou l' 02 générée.
La quantité d'O2 consommée peut généralement être déterminée par la valeur des changements électro-chimiques en utilisant une électrode à oxygène. La quantité de NAD(P) réduit consommée peut être déterminée en soustrayant la quantité de NAD(P) réduit restant à la fin de la réaction, de la quantité initiale de NAD(P) réduit. La mesure de.ces quantités de NAD(P) réduit peut s'effectuer par divers procédés de dosage connus. Ainsi, on peut mesurer la capacité d'absorption spécifique du NAD(P) réduit et la capacité d'absorption non spécifique du NAD(P). Comme le NAD(P) a son maximum d'absorption spécifique à 260 nm et le NAD(P) réduit à 260 nm et 340 nm, on mesure la capacité d'absorption à 320-360 nm, de préférence à 340 nm
pour doser le NAD(P) réduit.
Z5667906
Un autre procédé de dosage pour le NAD(P) réduit est un dosage colorimétrique utilisant un chromogène transporteur d'électrons ayant un accepteur d'électrons à partir du NAD(P) réduit. Comme exemples de chromogènes transporteurs d'électrons on peut citer les sels de tétrazolium comme le chlorure de 3-(p-iodophényl)-2-(p-nitrophényl)-5phényl-2H-tétrazolium, le
bromure de 3-(4,5-diméthyl-2-thiazolyl)-2,5-diphényl-2H-tétrazolium, le 3, 3'-
(4,4'-biphénylène)-bis (chlorure de 2,5-diphényl-2H-tétrazolium; le 3,3'(3,3'-
diméthoxy-4,4'-biphénylène)-bis /chlorure de 2-(p-nitrophényl)-5-phényl-
2H-tétrazolium/ (=nitro-tétrazolium: NTB), le 3,3'-(3,3'-diméthoxy-4,4'biphénylène)-
bis /chlorure de 2,5-bis (p-nitrophényl)-2H-tétrazolium/, le 3,3'-(3,3'diméthoxy-
4,4'-biphénylène)-bis (chlorure de 2,5-diphényl-2H-tétrazolium), et le 2, 6-
dichlorophénol-indophénol. Un exemple préféré est une combinaison d'un
sel de tétrazolium soluble dans l'eau et de diaphorase ou de phénazinemétho-
sulfate. Ces chromogènes transporteurs d'électrons sont des accepteurs d'électrons pour le NAD(P) réduit pour former un pigment de formazane coloré,
et le pigment ainsi formé est mesuré par colorimétrie à son maximum d'absorp-
tion à 500-550 nm.
Un autre procédé de dosage pour le NAD(P) réduit est la fluorométrie o le NAD(P) réduit est traité avec de la diaphorase en présence d'un réactif fluorescent comme la résazuline. Pour doser le NAD(P) réduit dans la réaction
de cyclage (I), H2 2 doit de préférence être décomposé et enlevé par catalase.
La NAD(P) peroxydase (EC 1.11.1.1) peut être ajoutée à la réaction de cyclage (I) pour un dosage doublement sensible comme il est présenté dans le système réactionnel (II) ci-dessus. L'H202 générée peut être mesurée sous la forme d'une modification électro-chimique en utilisant une électrode au peroxyde d'hydrogène, ou un produit détectable par réaction avec un indicateur et H2 2 ' Comme exemples d'indicateurs on peut citer les réactifs que l'on peut mesurer par des moyens spectrophotométriques, des indicateurs colorés,
des réactifs fluorescents ou des réactifs luminescents.
L'invention est ainsi un nouveau procédé de dosage pour un 3B-
hydroxystéroïde ou 3-cétostéroïde dans un spécimen au moyen d'une réaction de cyclage de 3B-hydroxystéroïde - 3-cétostéroïde, substrat pour un couplage de 3B-hydroxystéroYde déshydrogénase et de 3B-hydroxystéroïde oxydase, à une vitesse de plus de 10 cycles par minute, o l'on mesure un composant, à savoir le 3B-hydroxystéroïde ou le 3-cétostéroide dans un spécimen comme le sérum ou l'urine, avec une bonne exactitude et une haute sensibilité de
-1000 fois/10 minutes par comparaison avec leprocédé antérieur connu.
Les exemples suivants précisent l'invention mais ne doivent pas
être compris comme limitatifs.
Les résultats des exemples sont présentés dans les dessins joints, o: Les figures 1 et 2 sont la courbe de dosage quantitatif pour la prégnénolone; La figure 3 est la courbe de dosage quantitatif pour la testostérone; La figure 4 est la courbe de dosage quantitatif pour la prégnénolone; La figure 5 est la courbe de dosage quantitatif pour la prégnénolone, l'androstènedioné, la déshydroisoandrostérone et l'androstène-3B,17B-diol; et
La figure 6 est la courbe de dosage quantitatif pour la prégnénolone.
EXEMPLE 1
On utilise pour le dosage le mélange réactionnel suivant.
Tampon phosphaté 50 mM (pH 7,5) 33-hydroxystéroYde oxydase (Toyo Jozo Co., produit à partir de Streptomyces):
unités/ml.
3B-hydrostéroïde déshydrogénase (SIGMA CHEM. CO., produit à partir de Pseudomonas testosteroni): 2 unités/ml NAD réduit (NADH 2) 1,5 mM Triton X-100 à 0,1%; On introdui le mélange réactionel ci-dessus dans un petit tube à essais eet on fait préincuber à 37 C. On y ajoute le spécimen (10 ul) contenant de la prégnénolone (0, 5, 10, 15 et 20 eM, respectivement), et on fait incuber le mélange pendant exactement 10 minutes. On arrête la réaction en ajoutant du dodécylsulfate de sodium à 2% (SDS) (2,5 ml). On mesure les changements
d'absorption du mélange réactionnel à 340 nm.
Les résultats sont présentés dans la fig. 1 (e-*) avec un bon caractère
quantitatif. Le rapport de cyclage dans cet exemple est de 80 cycles/min.
Le NAD réduit dans le mélange réactionnel ci-dessus est remplacé par du NADP réduit, et les restes sont traités comme ci-dessus pour obtenir unbon résultat quantitatif comme on le voit dans la fig. 1 (A-a). En outre, on ajoute de la NADH2 peroxydase (9 unités/ml) au mélange réactionnel
en utilisant le NAD réduit ci-dessus, et on dose comme il est précisé ci-
dessus. Les résultats sont présentés danslafig. 1 ( o - o) avec deux fois
plus de changements d'absorption.
EXEMPLE 2
Mélange réactiomel: Tampon phosphaté 50 mM (pH 8,0) 3B-hydroxystéroïde oxydase: 20 unités/ml 3B-hydroxystéroïde déshydrogénase: 4 unités/ml NAD réduit (NADH 2) 0,2 mM
Triton X-100 à 0,1%.
On introduit le mélange réactionnel ci-dessus (1,0 ml) dans une cellule à quartz (1,0 ml) et on le met dans un spectrophotomètre assemblé avec un
porte-cellule à température constante à 37 C.
On y ajoute le spécimen (20 fl1) contenant de la prégnénolone (0, , 10, 15, 20 et 25 ^M, respectivement) et on fait incuber chaque mélange à 37 C. On mesure à 340 nm les changements d'absorption toutes les 2 minutes à partir de 2 à 4 minutes après le début de la réaction. Les résultats sont présentés dans la fig. 2 ( o - o), o l'on observe une bonne linéarité entre la quantité de prégnénolone et l'absorption. Le rapport de cyclage dans
cet exemple est de 65 cycles/min.
On utilise pour le dosage du sérum humain, o la prégnénolone est ajoutée à la même concentration que ci-dessus, de lamême manière pour
obtenir le résultat présenté dans la fig. 2 ( a - a) avec une bonne quanti-
tativité.
EXEMPLE 3
On ajoute des solutions (10 il) contenant dela testostérone (0, , 10, 15 et 20 jm, respectivement) au mélange réactionnel (0,5 ml) de la même composition que dans l'exemple 1 et on traite de la même façon que dans l'exemple 1. Le résultat est présenté dans la fig 3 o l'on obtient une bonne
quantitativité avec la testostérone.
EXEMPLE 4
On introduit le mélange réactionnel (1,0 ml) de l'exemple 2 dans un vase à réaction assemblé avec une électrode à oxygène de type Galvani et on fait préincuber à 37 C. On y ajoute des solutions (10 I1) contenant de la prégnénolone (0, 5, 10, 15 et 20 ^M, respectivement) et on fait incuber à 37 C pendant 10 minutes. On mesure alors la consommation d'oxygène. Le
résultat est présenté dans la fig. 4 avec une sensibilité élevée.
EXEMPLE 5
On ajoute des spécimens (20 e1) contenant de la prégnénolone, de
l'androstérone, de la déshydroisoandrostérone ou de l'androstènedione-
3B,17B-dione (0, 5, 10, 15, 20 et 25 UM, respectivement) au mélange réactionnel de l'exemple 1, et on mesure les changements d'absorption après avoir traité de la même façon que dans l'exemple 1. Les résultats sont présentés dans
la fig. 5, o o - o: prégnénolone, - a: androstérone,,-A: déshydroiso-
androstérone et A-,i: androstérone-3B,17B-diol.
EXEMPLE 6
On prépare des spécimens de sérum humain en ajoutant de la pré-
gnénolone aux concentrations de 0, 5, 10, 15, 20 et 25,M, respectivement.
On ajoute les spécimens (20 Il) au mélange réactionnel de l'exemple 1, et
on traite de la même façon que dans l'exemple 1 pour mesurer la prégnénolone.
Le résultat est montré dans la fig. 6 avec une bonne récupération.
Claims (9)
1. Procédé de dosage enzymatique quantitatif très sensible pour n'importe quel composant qui est un 313-hydroxystéro de ou un 3-cétostéroïde, dans un spécimen à doser, dans lequel on fait prendre part audit composant du spécimen à la réacion de cyclage (I)
3B-hydroxystéroïde-
oxydase
O H 0
2 2 2
3B-hydroxystéroïde 3-cétostéroïde NAD (P) NAD (P) réduit
3B-hydroxystéroïde-
déshydrogénase
et on mesure un changement détectable dans le système réactionnel.
2. Procédé de dosage selon la revendication 1, ol'onfait réagir, dans ladite réaction de cyclage (I), de la NAD peroxydase, qui catalyse une réaction consommant une mole d'H2 et une mole-de NAD réduit et générant deux moles d'H 20 et une mole de NAD, et on mesure l'amplitude d'un dit changement
détectable.
3. Procédé de dosage selon la revendication 2, o ledit changement détectable
est la quantité de NAD réduit consommée.
4. Procédé de dosage selon la revendication 1, o l'on fait réagir le NAD(P) généré dans la réaction de cyclage avec une seconde déshydrogénase pour le substrat NAD(P) et un substrat pour ladite déshydrogénase, et on utilise
ledit NAD(P) généré dans la réaction de cyclage avec ledit NAD(P) réduit.
5. Procédé de dosage selon la revendication 1, o ledit changement détectable
est la quantité d'O2 consommée.
6. Procédé de dosage selon la revendication 1, o ledit changement détectable
est la quantité d'H2 O 2 générée.
7. Procédé de dosage selon la revendication 1, o ledit changement détectable
est la quantité de NAD(P) réduit consommée.
8. Procédé de dosage selon la revendication 1, o la 3B-hydroxystéroïde
déshydrogénase est une enzyme produite par Pseudomonas testosteroni.
9. Procédé de dosage selon la revendication 1, o la 313-hydroxystéroYde oxydase est une enzyme produite par un microorganisme de genre Streptomyces, de genre Brevibacterium, de genre Schizophylum, de genre Corynebacterium, de genre Cellulomonas, de genre Arthrobacter, de genre Mycobacterium ou
de genre Nocardia.
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