DK147183B - Fremgangsmaade til fremstilling af l-alfa-glycerophosphatoxidase - Google Patents

Description

147183

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af l-a-glycerophosphatoxidase (I-a-glycero-3-phos-phat/02-oxidareduktans), L-a-glycerophosphatoxidase er et kendt enzym, som katalyserer en reaktion mellem I-a-glycero-3-phosphat og oxygen til dannelse af dihydroxyacetone-3-phosphat og hy-drogenperoxid, og stoffet er i forvejen blevet afledt fra en stamme af slægten Stretococous, slægten lactobacillus, slægten leuconostoc og slægten Pediococcns (japansk offentliggørelsesskrift nr. $7-30470).

Det har nu vist sig, at der kan fremstilles l-a-glycerophosphatoxidase ved dyrkning af de bakterielle stammer Aerococcus viridans IF0-12219 og IF0-12317.

Følgende skal anføres om reaktionsdygtighed og stabilitet :

Kjj værdien af et kendt enzym fra Streptococcus faecalis (tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.755.033) og det ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse fremstillede er som følger:

(St. faecalis ATCO 12755) =26 mM

K-. (A. viridans fremstillet ifølge opfindelsen) = 3»2 mM

Derfor er den enzymatiske virkning af enzymet, som fremstilles ifølge opfindelsen, ca. 6 gange bedre med hensyn til reaktionsdygtighed end for det kendte enzym (mindre Ifø-værdi betyder bedre reaktionsdygtighed).

Den inhiberende virkning af forskellige carbonhydrat- phosphater på de to enzymer er som følger: _Relativ aktivitet___

Ifølge opfindelsen St« Faecalis*^ ingen tilsætning 100 100 glueose-l-phosphat 113 112 glucose-6-phospbat 103 109 fructose-6-phosphat 105 0 fructose-l,6-diphosphat 100 133 fructose-l-phosphat 105 0 x) J. Biol, Chem., 254 (8), 2710-2715 (1979 ).

2 147183

Som vist ovenfor inhiberes det kendte enzym af fructose-l-phosphat og af fructose-6-phosphat. Derimod in-biberes enzymet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen ikke, hvilket viser god stabilitet af enzymet fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse i sammenligning med den kendte teknik, I betragtning af dette har enzymet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen bedre reaktionsdygtighed til udførelse af enzymatiske analyser.

Måling af E^-værdien foretages således (identiske foarøøg for stammerne):

Reaktions bland ing: 0,2 M Tris-HCl-stødpude (pH 8,0) 0,2 ml peroxidase (45 enheder/ml) 0,1 ml 0,3# (vægt/rumfang) 4-aminoantipyrin 0,1 ml 0*2#'(rumfang/rumfang) N,N-dimethylanilin 0,2 ml glycerophosphatoxidase (0,1 enheder/ml) 0,1 ml

Total 0,9 ml

Reaktionsstoffe r: 0,25# (vægt/rumfang) natriumlaurylbenzensulfonat 0,2 ml Arbejdsmåde:

Ovenstående reaktionsblanding (0,9 ml) i små reagensglas holdes ved 37°C, I-glyeero-3-pbosphatopløsning (0,1 ml) (0,5, 0,75, 1,0, 3,0, 5,0, 7,5, 10 og 20 mM) tilsættes de respektive glas, og man inkuberer ved 37°C i præcis 10 minutter. Der tilsættes reaktionsstopper (2,0 ml) til standsning af reaktioner, og man måler den optiske tæthed ved 565 nm.

Den endelige substratkoncentration og enzymaktivitet afsættes i et koordinatsystem efter lineweaver-Burks· metode, så at man kan tegne den retlinede kurve.

Kjj-værdien bestemmes ved den reciprokke af værdien af skæringspunktet mellem X-aksen og den nævnte retlinede kurve,

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af I-a-glycerophosphatoxidase er i overensstemmelse hermed ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del anførte.

Enzymet Ι-α-glycerophosphatoxidase benyttes til kvantitativ bestemmelse af Ι-α-glycerophosphat, glycerol, 3 147183 glycerid, phosphatidsyre og andre phospholipider og til måling af enzymaktiviteten af glycerokinase og andre enzymer i optimal kombination med de andre enzymer og chro-mogenreagens. ligeledes har enzymet 1-a-glyoerophoephat-oxidase anvendelighed til undersøgelsesreagenser og diagnose-reagenser.

Opfindelsen skal forklares nærmere i forbindelse med tegningen, hvor fig. 1 viser et pH-optimum for I-a-glycerophos-phatoxidase, fig, 2 varmestabiliteten for I-a-glycerophosphat- oxidase, fig· 3 pH-stabiliteten af I-a-glyoerophosphatoxi- dase, og fig. 4 resultaterne af analyse af glycero-3-phos-phat under anvendelse af I-a-glyceropbosphatoxidase.

Aerococeus viridans ΙΙΌ-12219 og IFO-12317 er blevet indleveret i den permanente samling i Institute for Fermentation, Osaka, Japan, under disse numre.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen dyrkes ovennævnte Aerococeus viridans ΙΙΌ-12219 eller Aerococeus viridans IFO-12317 i et konventionelt medium til enzymproduk-tion. Dyrkningen kan udføres ved hjælp af konventionel flydende kultur. Submers luftningskultur foretrækkes til industriel produktion.

Der kan fortrinsvis benyttes et konventionelt medium til dyrkning af mikroorganismer. Som carbonkilder kan der benyttes assimilerbare carbonkilder såsom glueose, saccharose, lactose, maltose, fructose, melasse, glycerol, pyrodrue-syre og lignende. Assimilerbare nitrogenkilder såsom pepton, polypepton, kødekstrakt, gærekstrakt, sojabønnepulver, case-inhydrolysat eller lignende kan endvidere tilsættes. Endelig kan der tilsættes forskellige uorganiske salte såsom phos-phater, carbonater, sulfater, salte af magnesium, calcium, kalium, natrium, divalent jern, mangan eller zink.

Dyrkningstemperaturen kan vælges inden for området for væksten af mikrobielle celler og produktion af L-a- 4 147183 -glycerophosphatoxidase, og den er fortrinsvis 25-37°C.

Dyrkningstiden kan ændres afhængende af betingelserne og afsluttes, når produktionen af l-a-glycerophosphatoxidase er praktisk taget fuldstændig, og den er normal 10-48 timer.

Til adskillelse af L-a-glycerophosphatoxidase fra kulturen filtreres eller centrifugeres den dyrkede masse til samling af cellerne, som iturives ved behandling med mekaniske midler eller enzymer såsom lysozym. Endvidere solubiliseres Ιι-α-glycerophosphatoxidase om fornødent ved tilsætning af ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og et . overfladeaktivt stof såsom Triton X-100 (indregistreret varemærke) eller Adecatol S'0-120 (indregistreret varemærke) til fraskillelse af enzymet« Den således opnåede opløsning af Ι-α-glycerophosphatoxidase behandles med eller uden inddampning, og derefter fældes enzymet ved udsaltning under tilsætning af et opløseligt salt såsom ammoniumsulfat, eller det udfældes ved tilsætning af et med vand blandbart organisk opløsningsmiddel såsom methanol, etha-nol, acetone eller isopropanol. lavmolekylære urenheder fjernes ved dialyse. Endvidere foretages rensning af L-a-glycerophosphatoxidase fortrinsvis ved adsorptions-chromatografi eller gelfiltrering. Den således opnåede enzymopløsning behandles ved vakuumkoncentration, ultrafiltreringskoncentration og lyofilisering til fremstilling af pulverformet l-a-glycerophosphatoxidase.

L-a-glycerophosphatoxidase fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen undersøges som følger og har følgende fysisk-kemiske egenskaber.

(1) Undersøgelsesmetode:

Reaktionsblanding (1,0 ml): 0,2 H Tris-HCl-stødpude (pH 8,0) 0,2 ml peroxidase (0,5 mg/ml, 45 enh,/ml) 0,1 ml 0,3$’s (vægt/rumfang) 4-aminoantipyrin 0,1 ml 0,1 M D,L-glyeero-3-phosphat 0,1 ml 0,2^*3 (rumfang/rumfang) U,N-dimethyl-anilin 0,2 ml destilleret vand 0,3 ml 5 147183

Ovenstående blanding for-inkuberes ved 37°C i 3 minutter.

Til ovenstående reaktionsblanding (1,0 ml) sættes D-a-glycerophosphatoxidaseopløsning (20 μΐ), og der inkuberes ved 37°C i 10 minutter. 0,259é's (vægt/rumfang) natriumlaurylbenzensulfonat (2,0 ml) tilsættes til standsning af reaktionen. Den dannede farve måles kolo-rimetrisk ved 565 nm.

Enzymaktiviteten beregnes ved følgende ligning; enzymaktivitet (enh./ml) = (ΔΑ/6,0) x (^) hvor ΔΑ betegner absorbensændring ved 565 nm pr. 10 minutter.

(2) Enzymvirknings

Enzymet katalyserer den oxidative reaktion mellem L-oc-glycero-3-phosphat og oxygen til dannelse af dihydroxyacetone-3-phosphat og hydrogenperoxid.

(3) Optimal pH-værdi:

Effekten af pH-værdien på I-a-glycerophosphat-oxidaseaktiviteten, som fås fra Aerococcus viridans IEO-12219, måles i dimethylglutarat-RaOH-stødpude (pH 5,0-7,0) og Tris-HCl-stødpude (pH 7,0-9,0). Resultaterne fremgår af fig. 1, hvor det optimale pH-tal er 7,5-8,5.

(4) Varmestabilitet:

Varmestabiliteten af enzymet fremstillet fra Aerococcus viridans IFO-12219 bestemmes ved Inkubering i 0,1 M dimethylglutarat-NaOH-stødpude (pH 7,0) indeholdende enzymet 1-oc-glycerophosphatoxidase ved hver temperatur på 0-70°C i 10 minutter, hvorefter man afkøler med is. Resultatet fremgår af fig. 2.

(5) pH-stabilitet.

Til L-a-glycerophosphatoxidase opnået fra Aerococcus viridans IEO-12219 sættes 0,1 M dimethylglutarat-NaOH--stødpude til pH 5,0-7,0, hvorpå man lader henstå i 10 minutter ved 45°C og afkøler med is, hvorpå enzymaktivite- 6 147183 ten "bestemmes. Resultatet er vist i fig. 3. Det enzym, som fås fra Aerococcus viridans ΙϊΌ-12317, har samme karakteristikker.

Nedenstående eksempler illustrerer udførelsesformer for fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

7 147183

Eksempel 1-

To medier (pH 7,0) nemlig mediet· til dyrkning af stamme IFO 12,213 og mediet til dyrkling af stamme IPO 12,317, og hvert bestående af glycerol (1,0$), laetoee (2,0$), polypepton (1,0$), gærekstrakt (1,0$), kødekstrakt (0,5$), KH2P04 (0,1$), K2HP04 (0,1$), UaCl (0,2$) og MgS04, 7H20 (0,05$)* med tilsætning af silicone KS-66 (antiskum-middel, indregistreret varemærke for Shinetsu Chemical Co, ) i en 30 liter forgæringsbeholder steriliseres ved 120°0 i 20 minutter. Efter afkøling overføres dyrkningsvæske (200 ml) af Aerococcus viridans IEO-12219 og IF0-12317, som i forvejen er dyrket i 10 timer, dertil, separat, og dyrkes ved 30°C i 15 timer. De ved centrifugering ved 500 omdrejninger pr. minut i 10 minutter samlede bakterieceller vaskes med 10 mM phosphatstødpude (pH 7,0, 500 ml) og suspenderes derpå i lysozymopløsning (0,4 mg/ml, 400 ml) og inkuberes ved 37°C i 60 minutter. Den ved centrifugering ved 5000 omdrejninger pr. minut i 15 minutter opnåe.de overliggende væske har følgende I-a-glycerophosphatoxida?eaktivitet:

Stamme Enzymaktivitet (enh./ml) i _ overliggende vaske_

Aerococcus viridans IF0-12219 0,80

Aerococcus viridans IF0-12317 0,78

Eksempel 2.

Aerococcus viridans IP0-12219 dyrkes på samme måde som i eksempel 1, hvorved man får et dyrket medium indeholdende enzymet (420 ml, 16000 enheder). At der er *en forskel på de opnåede aktivitetsniveauer skyldes, at der her benyttes en lille mængde lysozym og en høj koncentration af bakterie-celler.

Til denne enzymopløsning sættes ammoniumsulfatop-løsning i en koncentration på 0,24 - 0,48 mætning. Det udfældede materiale samles ved centrifugering og opløses i 10 mM phosphatstødpude (pH 7,0, 50 ml). Opløsningen dialyseres mod 10 mM phosphatstødpude (pH 7,0) under anvendelse af et celluloseacetatdialyseglas og lyofiliseres til opnåelse af den rensede D-a-glycerophosphatoxidase.

Udbytte 83,6$.

8 147183

Referenceeksempel.

5 mM 1-a-glycerophosphat (0-50 μΐ) benyttes i stedet for DL-glyceropbosphat med den nævnte analysemetode, og man tilsætter yderligere “vand indtil 1,0 ml. Til reaktionsblandingen sættes den opløsning (220 enh,/ml) af enzymet, som er fremstillet i eksempel 2, og man inkuberer ved 37°C i 10 minutter, standser reaktionen ved den metode, som er beskrevet ovenfor under undersøgelsesmetoden, og måler derpå kolorimetrisk ved 565 nm. Resultatet er vist i fig. 4, hvor der opnås god linearitet omkring absorptionen ved 1,2. Resultaterne er sammenholdt med kontrollen under anvendelse af HgOg. I figuren betegner kurven med åbne cirkler 5 mM Ι-α-gly ce ro-3-ph o sphat, medens kurven med udfyldte cirkler betegner 2,5 mM hydrogenperoxid.