JPH02200179A

JPH02200179A - Ｎａｄ合成酵素の製造法

Info

Publication number: JPH02200179A
Application number: JP1312574A
Authority: JP
Inventors: Hideo Misaki; 美崎　英生; Hidehiko Ishikawa; 英彦石川; Kazuo Matsuura; 松浦　一男
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1983-04-25
Filing date: 1989-12-01
Publication date: 1990-08-08
Also published as: JPH0467954B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、ＮＡＤ合成酵素の製造法に関する。

〔従来の技術〕

従来、ＮＡＤ合成酵素（ＮＡＤ”　ｓ　ｙｎ　ｔ　ｈｅ
　ｔａｓｓ）は、ラット肝臓（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、、２３３．４９３〜５００　　（１９５８））、ブタ
肝臓（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２３６．’５２５〜
５３０　（１９６１））酵母（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、、２４７．４７９４〜４８０２　（１９７２））、Ｅ
、Ｃｏ１ｔ　　（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２３亙、
１４９４〜１４９７　　（１９６１））　、Ｊ、Ｂｉｏ
ｌ、Ｃｈｅｍ、、　　２４２．　３８５〜３９２　　（
１９６７）に夫々その存在が知られている。そして、酵
素分類上、Ｍｇ’″０ＡＴＰ＋デアミド−ＮＡＤ＋ＮＨ３□ＡＭＰ＋ｐｐｉ＋
ＮＡＤの反応を触媒するＮＡＤ合成酵素（Ｅ、Ｃ，６，３゜１
．５）とＭｇ” ＡＴＰ＋デアミド−Ｎ　Ａ　Ｄ　＋　Ｇ　１　ｎ　＋　
Ｈｚ　Ｏ←−ＡＰＭ＋ｐｐ　ｉ　＋ＮＡＤ＋Ｌ−グルタ
ミン酸の反応を触媒するＮＡＤ合成酵素（Ｅ、Ｃ，６，
８５，１）に分類されているが、いずれもＮＨ３または
Ｇｉｎのアミドを利用でき、両者の相違はアザセリンで
阻害されるか否かによって区別されている。

本酵素の活性測定法は、反応により生じた還元型ＮＡＤ
をアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｅ、Ｃ，１゜１．１）
で還元し、生じたＮＡＤＨを３４０ｎｍにおける吸光度
測定する方法または生じたＮＡＤを蛍光法で測定する方
法が報告されている。しかし、この活性測定法に基いて
ＡＴＰ、デアミド−ＮＡＤまたはＮＨ，または（、Ｉｎ
の定量を試みようとしても、その感度が低く、従来由来
の酵素では測定用試薬としては著しく困難であった。

本発明者らは、前記のＮＡＤ合成酵素の反応により生じ
たＮＡＤを補酵素とする酸化還元反応系と還元型ＮＡＤ
を補酵素とする酸化還元反応系との組み合わせによる補
酵素サイクリング反応により増幅反応させ、消費また生
成される成分を定量することに着目した。

本発明のＮＡＤ合成酵素において、バチルス・リケニホ
ルミスＢ−０８４４の産生ずる酵素は、本発明者らが新
たに見出したものであり、従来公知のＮＡＤ合成酵素よ
り安定であり、診断用酵素として有用であり、本発明は
、バチルス属に属するＮＡＤ合成酵素生産菌を培地に培
養し、その培養物からＮＡＤ合成酵素を採取することを
特徴とするＮＡＤ合成酵素の製造法である。

まず、本バチルス・リケニホルミスＢ−０８４４菌株は
、静岡田方郡修善寺町大野の堆肥より分離された菌株で
あって、その菌学的性質は次の通りである。

ａ、形態的特徴普通寒天斜面培地を用いて、３０℃で１８〜２４時間培
養して顕微鏡観察を行った。

（１）形および配列；端は丸く、まっすぐ又はやや曲がった桿菌で単独又は二
連たまに短連類する。

（２）大きさ；０．６〜０．８Ｘ１．５〜３．０μｍ（３）運動性；周毛で運動する（４）芽胞；中央又は端に近いところに形成する。大きさは０．８Ｘ
１．５μｍ細胞は膨張する時もある。

ｂ、各培地における生育状態（５０℃）（１１普通寒天
平板培地灰白色で円形周縁は波状で平らな集落を形成する。表面
にしわを生ずる時がある。可溶性色素は産生じない。

（２）普通寒天斜面培地圧伏（Ｅｃｈｎｕｌａｔｅ）で良好に生育する。

灰白色を呈する。可溶性色素は産生じない。

（３）ブイヨン培地一様に混濁良好に生育する。後に菌膜を形成し柔毛状沈
澱を生ずる。

（４１Ｂ　ＣＰミルク１〜２週間後凝固し一部ペプトン化する。

Ｃ１生理的性質（＋；陽性、−；陰性）ダラム染色　　
　　　　　　　　　　十カタラーゼ産生　　　　　　　
　　　十オキシダーゼ産生　　　　　　　　　十ウレア
ーゼ産生（Ｓ　Ｓ　Ｒ培地）〃　　　（Ｃｈｒｉｓ、培地）ゲラチン加水分解　　　　　　　　　十デンプン加水分
解　　　　　　　　　十カゼイン加水分解　　　　　　
　　　−（３日目）エスタリン加水分解　　　　　　　
　十セルロース加水分解インドール産生硫化水素産生　　　　　　　　　　　十アセトイン産生
　　　　　　　　　　十ＭＲテスト　　　　　　　　　
　　　　＋（弱）硝酸塩の還元　　　　　　　　　　　
十脱窒反応クエン酸塩の利用　　　　　　　　　十７．０％ＮａＣ
β添加培地での生育　＋５０℃での生育　　　　　　　
　　　＋２０℃での生育　　　　　　　　　　十糖より
酸の産生水（ガス非産生）アドニトールＬ（＋）アラビノース　　　　　　　＋セロビオース　
　　　　　　　　　　＋ヅルシトールｍｅｓｏ−エリスリトールフラクトース　　　　　　　　　　　　＋フコースガラクトース　　　　　　　　　　　　＋グルコース　
　　　　　　　　　　　　＋グリセリンイノシトールイヌリンラクトースマルトースマンニトールマンノースメレジトースメリビオースラフィノースＬ（＋）ラムノースサリシンＬソルボースソルビトールデンプンサッカローストレハロースキシロースＯＦテスト（Ｈｕｃｋｅｒの方法）ＮＴ＋＋ＯＦテスト（変法）糸 ※基礎培地（Ｎ　Ｈａ　）　ｚ　ＨＰ　ＯａＣｌＭｇ５Ｏｎ　７Ｈｚ　０Ｙｅａｓｔ　　ｅｘｇａ　ｒＴＢ（醗酵）ｇｇｇｇｇ２ｇＤｉｓｔｉｌｌｅｄ　　　ｗａｔｅｒｌ　　０００　ｍ　ｌ利用性テスト（炭素源として）ＤアラニンＬアラニンフラクトースプロパノールエタノールエチルアミンラフティト αアミノブチレイトグルコースｐＨ７，０＋＋＋イノシトールシュークロース　　　　　　　　　　＋セロビオースＬ（＋）アラビノース　　　　　　　−マンノース　　
　　　　　　　　　　　＋マンニトール　　　　　　　
　　　　　＋ラムノーストレハロース　　　　　　　　　　　　＋アセチイトプロピオネイト　　　　　　　　　　　＋ＤＮＡのシト
シン　グアニン含！（％）４５．６％（Ｔｍ変法）上記の菌学的性質から、零Ｂ−０８４４菌株は５０℃で
生育でき、端の丸いまっすぐまたはやや曲がった桿菌で
、ダラム陽性、芽胞を形成し、糖を醗酵的に分解する細
菌であるとの特徴を有する。このような諸性状を有する
本国の分類学上の位置をＢｅｒｇｅｙ’ｓ　　Ｍａｎｕ
ａｌ　　８版、１９７４、医学細菌同定の手引き２版、
１９７４およびＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　　Ｈａｎｄｂ
ｏｏｋ、４２７．Ｔｈｅｇｅｎｕｓ　　Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓを参照して検討すると、本国は芽胞を形成し、好気条
件で生育できることからバチルス属に属するものと判定
される。そこで、５０℃で生育できる菌種として、（イ
）バチルス・コアギユランス、（ロ）バチルス・リケニ
ホルミス、（ハ）バチルス・ズブチリス、（ニ）バチル
ス・プレビスおよび（ホ）バチルス・ステア−サーモフ
ィラスが挙げられる。これらの性状を比較対比すると次
の通りである〔十；陽性、−；陰性、ｄ；菌株によって
反応が異なる〕本面　イ　　ロ　　ハ　　ニ　　ホ５０℃での生育　　　　　＋　＋＋＋＋＋２０℃での生
育　　　　　＋　＋＋＋＋嫌気での生育　　　　　　＋
　＋十− プロビオン酸の利用　　　＋　−＋７％食塩培地での生育　　十　−＋＋５％食塩培地での生育　　＋　＋＋＋−ｄクエン酸塩の
利用　　　　＋　ｄ＋＋ｄｄ以上の比較対比から、本菌
株はバチルス・リケニホルミスとよく一致しており、そ
の他の諸性状について比較検討した結果でもバチルス・
リケニホルミスとよく一致した。よって零Ｂ−０８４４
菌株をバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｔｌｌｌｕｓ
　　ｌｉｃｈｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｂ−０８４４と同定命
名した。なお、本菌株は工業技術院微生物工業技術院研
究所に「微工研菌寄第６８０９号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ　
　６０１ｊとして寄託されている。

本発明においては、バチルス属に属するＮＡＤ合成酵素
生産菌としては、上記のバチルス・リケニホルミスＢ−
０８４４はその一例であって、この菌株に限らず、バチ
ルス属に属し、ＮＡＤ合成酵素を生産する菌はすべて本
発明において使用できる。

本発明は、先ずバチルス属に属するＮＡＤ生産菌を酵素
を生産する通常の方法で培養される。培養の形態は液体
培養でも固体培養でもよいが、工業的に深部通気攪拌培
養を行うのが望ましい。

培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられる
ものが広く使用される。炭素源としては同化可能な炭素
化合物であればよく、例えばブドウ糖、シー！糖、乳糖
、麦芽糖、スターチ、デキストリン、糖蜜、廃糖蜜、グ
リセリンなどが挙げられる。窒素源としては、利用可能
な窒素化合物であればよく、例えばコーン、スチーブ、
リカー、大豆粉、綿実粉、小麦グルテン、ペプトン、肉
エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物などが使用さ
れる。その他リン酸塩、マグネシウム、カルシウム、カ
リウム、ナトリウム、亜鉛、鉄、マンガン、ハロゲンな
どの塩類が必要に応じて使用される。

培養温度は、ＮＡＤ合成酵素生産菌が発育し、本酵素を
生産する範囲内で適宜変更し得るが、２６〜５０℃が好
ましい。培養時間は培養条件によって異なるが通常１５
〜４０時間程度行えばよい。本酵素が最高力価に達する
時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよい、
通気攪拌する場合には、２００〜４００ｒ、ｐ、ｍの条
件で充分である。

このようにして得られたＮＡＤ合成酵素生産菌の培養物
からＮＡＤ合成酵素を採取するのであるが、本酵素は主
にその菌体内に含有されるので、得られた培養物を濾過
または遠心分離などの手段により集菌し、この菌体を超
音波処理、フレンチプレス処理やガラスピーズ処理など
の機械的破壊手段やリゾチームなどの酵素的破壊手段に
て破壊し、また必要に応じてトリトンＸ−１００（Ｔｒ
ｉｔｏｎ　　Ｘ−１００＝商品名）、アデカトール５ｏ
−１２０（商品名）などの界面活性剤を添加してもよい
。こうして得られたＮＡＤ合成酵素含有液は、濃縮する
か、または濃縮することなく、可溶性塩類、例えば硫安
などを用いて塩析するか、親水性有機溶媒、例えばメタ
ノール、エタノール、アセトン、イソプロパツールなど
を用いて本酵素を沈澱させればよい。この沈澱物は、水
または緩衝液に溶解後、必要に応じて半透膜にて透析し
、さらにＤＥＡＥ−セファデックス、ＤＥＡＥ−セファ
ロースやＤＥＡＥ−セルロースなどやカルボキシメチル
−セルロース、カルボキシメチル−セファロース、カル
ポキシメチルーセフアデンクスなどのイオン交換樹脂を
用いるクロマトグラフィーやセファデックスＧ２００、
セファロースＣＬ　−６Ｂ、セファクリルＳ−２００な
どの分子篩荊などのゲル濾過剤を用いるクロマトグラフ
ィーにて精製せしめ、その後凍結乾燥などの処理により
生成されたＮＡＤ合成酵素を得ることができる。

次に、本発明で得たＮＡＤ合成酵素の性質について述べ
る。

（１）分子量；約６２０００　（セファデックスＧ−１
５０ゲル濾過による。

（２）等電点；ｐＨ４，６付近（アンフオライトを用い
た電気泳動法による）（３）作用　；Ｍｇ− ＡＴＰ＋デアミド−ＮＡＤ＋ＮＨ−ｘ→ＡＭＰ＋ｐｐｉ
＋ＮＡＤ（４）基質特異性；Ｎ　Ｈ３以外にＬ−Ｇ　Ｉ　ｎ、　Ｌ−Ａ　ｓ　ｎにも
作用して、次の反応を触媒する。

ＡＴＰ＋デアミノ−ＮＡＤ＋Ｇ１ｎ（またはＡＭｇ〜ｓ　ｎ）　→ＡＭＰ＋　ｐ　ｐ　ｉ　＋ＮＡＤ＋Ｇ　ｌ
　ｕ　　（またはＡｓｐ）（５）至摘ｐＨ酵素活性測定法の反応液１の緩衝液を酢酸緩衝液（ｐＨ
３，８〜６．６）、ジメチルグルタル酸−水酸化ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ５，１〜６．８）およびトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ６，５〜８．８）に加えて酵素活性を測定し
た結果は第１図の通りである。

ｐＨ８，０〜８．７付近に至適ｐＨを有する。

（６）　ｐ　Ｈ安定性本酵素を５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ３，９〜６．８）
、ジメチルグルタル酸−水酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４
，１〜７．１）、リン酸緩衝液（ｐＨ６，３〜７．９）
およびトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６４〜８．９）に溶解し
、３７℃で６０分間処理した後、その残存活性を酵素活
性測定法に従って測定した結果は、第２図の通りである
。ｐ）１５．５〜９０の範囲で安定である。

（７）熱安定性５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ６，８）に本酵素を溶
解し、各温度で１０分間加熱処理した後、その残存活性
を酵素活性測定法に従って測定した結果は、第３図の通
りである。４０℃まで安定である。

（８）界面活性剤の影響酵素活性測定法において、反応液Ｉに第１表に記載の界
面活性剤を０．１％になるように添加し、３７℃に加温
後、酵素液５μｌを添加し、３７℃で１０分間反応後、
０．８ｍｌの反応液■を加え、３７℃で正確に５分間反
応させた後、０．ＩＮＮ塩酸２舟Ｑｎｍで比色定量した。その結果は第１表の通りである
。非イオン性界面活性剤では影響を受けなかったが、カ
チオンおよびアニオン界面活性剤により阻害された。

第１表（９）金属イオンの影響酵素活性測定法において反応液１　　（２０ｍＭＭｇＯ
ｆｆ．含有）に最終濃度１ｍｌになるように各種金属塩
を添加した後、酵素活性測定法に従って、そのときの酵
素活性を相対活性で示すと第２表の通りである。

第２表Ｑａｌ酵素活性測定法活性測定法反応液　■ ５０ｍＭ　　）リスーＨＣｆ緩衝液ｐＨ８，０２０ｍＭ
　　ＫＣｌ２０　ｍＭ　　Ｍ　ｇ　Ｃ７！ｚ０．０５％　牛血清アルブミン２ｍＭ　　ＡＴＰ０．５ｍＭ　　デアミド−ＮＡＤ２５ｍＭ　　ＣＮＨ４）ｚ　ＳＯａ反応液　■ ５０ｍＭ　トリス−ＨＣｆ緩衝液ｐＨ８，０１０Ｕ　　
ジアホラーゼ／ｍβ（東洋醸造製、バチルス属生産菌由来）８％　エタノール１０Ｕ　　アルコールデヒドロケナーゼ／ｍｌ（東洋紡
績、イースト菌由来）０．０２５％　ＮＴＢ　にトロテトラゾリウムブルー）０、１％　　Ｔｒｉｔｏｎ　　　Ｘ−１００１０ｍＭ　
　　ＥＤＴＡ反応液１０．２ｍｊ！！を小試験管にとり、３７℃に加
温後酵素液５μｌを添加し、３７℃で正確に１０分間反
応を行い、０．８ｍｌの反応液■を添加し、反応を停止
するとともにサイクリング反応を開始した。サイクリン
グ反応は３７℃で正確に５分間行い一、０．ＩＮＨＣｊ
！２．０ｍｊ！を添加によりサイクリング反応を停止後
５５０ｎｍにおける吸光度を測定してそのときの値より
酵素活性を求めた。なお、活性の計算式は次の式に順じ
た。

ＮＡＤ合成酵素活性（ｍＵ／ｍｆ） Δ５５０　　１．Ｏｆ＝×× Δ５５０　０．００５　　１０ Δ５５０　：検体の吸光度 Δ５５０　：標準液の吸光度（０，１ｍＭＮＡＤ）０．
００５：検体１（ｍＡ）１０　　　：反応時間ｆ　　　　：希釈倍率次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これ
により本発明を限定するものではない。

実施例　１８０１容ジヤーにペプトン１％、肉エキス１％、酵母エ
キス０．２％、ＮａＣｊ！０．３％を含む液体培地（ｐ
Ｈ７゜３）２ＯＮを仕込み、１２０℃２０分間滅菌後、
上記と同一組成の培地で予備培養した種菌２００ｍｊ！
を接種し、５０℃で１６時間通気量２０ｊ！／ｍｉｎ攪
拌速度３００ｒｐｍ／ｍｉｎで通気培養した。培養後遠
心分離にて菌体を集め、集めた菌体を０．１％のりゾチ
ームを含有する１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ
８，０）２１に分散させ、３７℃で３０分間反応を行い
溶菌した。この液を５００Ｏｒ、　ｐ、ｍ１０分間遠心
し、上清液１９１を得た。この上清液に硫安を添加し、
硫安分画（０，４４〜０．５４飽和）を行い、この沈澱
を１０ｍＭ）リスーＨＣ１緩衝液２００ｍＪに溶解（４
７３Ｕ）Ｌ、この緩衝液１２１に対して透析した。

この透析物中に生じた不溶物を遠心分離（１２０００ｒ
、ｐｏｍ、１０分間）にて除去した。上清液（４６２Ｕ
）を１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８０で緩衝化し
たＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂカラム（５Ｘ３０
ｃｍ）にチャージし、θ〜０゜５　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃ１の
濃度勾配法にて溶出した。０．１５〜０．２ＭＮａＣ１
で溶出される両分を集め（１２０ｍ　！！、３８８　Ｕ
）アミコン社製限外濾過膜ＰＭ−１０を用い濃縮した後
、セファデックスＧ−１５０（３，６Ｘ８０ｃｍ）にて
精製を行い、その活性画分を集め、精製標品（８６ｍ１
１３２４Ｕ）とした。

また、この標品に各々牛血清アルブミン、グルコース、
マルトース、マンニトール、シュクロース、果糖を１％
になるように添加し、凍結乾燥した。無添加のものは活
性収率８６％であったが、添加したものはまったく活性
の低下が見られず、安定であった。

参考例　１反応液　■ ５０ｍＭ　　　）リス−ＨＣｌ緩衝液（ｐ　Ｈ８，０）
２０ｍＭ　　　ＫＣｌ２０ｍＭ　　　ＭｇＣｌ１ｔ０．０５％　牛血清アルブミン１ｍＭ　　　　デアミノ−ＮＡＤ５０ｍＭ　　　（ＮＨ４）ｚ　ＳＯＳＯ４４Ｏ０ＮＡＤ−合成酵素／　ｍ　１反応液　■ ５０ｍＭ　　　トリス−ＨＣＩＩＩ衝液（ｐＨ８，０＞
２０Ｕ　　　　ジアホラーゼ／　ｍ　１３％　　　　エ
タノール２０Ｕ　　　　アルコールデヒドロゲナーゼ／　ｍ　１
０．０５％　ＮＴＢ００１％　　Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ−１００反応液１０．
２ｍｆｆを試験管にとり３７℃に加温後、０．　５．　
１０．　２０．　３０．　４０μＭのＡＴＰ溶液をそれ
ぞれ５μｌを添加し、３７℃で１０分間反応した後、反
応液■をＱ、３ｍｌ添加し、３７℃で正確に５分間反応
したのち、０．１ＮＨＣｊ１２．０ｍｌを加えて反応を
停止し、５５０ｎｍで吸光度測定した。その結果は第４
図に示す通りで良好な直線性が得られた。

また本反応におけるサイクリング反応率は約４８００回
転／時であった。

参考例　２参考例１に示した反応液Ｉと反応液■を等量ずつ混合し
、３７℃に加温する。この混合物１．０ｍＪ＋を３７℃
にセットされた分光光度計の石英セル（１，０ｍｌ用）
にとり、実施例１に用いたのと同濃度ＡＴＰ溶液５μｌ
を添加し、添加後５分から７分目までの２分間の吸光度
変化を５５０　ｎｍで測定した。その結果は第５図に示
す通りでキネティクス法においても高怒度で良好な直線
性が得られた。このときの回転率は約２８００回転／時
であった。

参考例　３参考例１に示した反応液■中に５０ｍＭ硫安の代りに５
ｍＭＡＴＰを添加した反応液に各種濃度の硫安、Ｌ−グ
ルタミン、Ｌ−アスパラギンを添加し、実施例２と同じ
操作を行った。その結果は第６図に示す通りで硫安、Ｌ
−グルタミン、Ｌ−アスパラギンと共に良好な直線性が
得られた。

〇−〇＝硫安、・−・：Ｌ−グルタミン、Δ−Δ：Ｌ−
アスパラギン。

【図面の簡単な説明】

第１図はバチルス・リケンホルミスＢ−０８４４の産生
ずるＮＡＤ合成酵素の至適ｐＨｌ１１線、第２図は同酵
素のｐＨ安定曲線、第３図は同酵素の熱安定性曲線を示
し、第４図は本発明におけるエンドポイント法によるＡ
ＴＰの定量曲線、第５図はキネティクス法によるＡＴＰ
の定量曲線、第６図はエンドポイント法によるし一グル
タミンおよびＬ−アスパラギンの定量曲線を示すもので
ある。第３図餅処Ｓ監遥嵐第４図ｆｔイ＃’Ｐ　ｆ）ＡＴ　Ｐ　、１　度（）Ｌ　Ｍ　）
オイ鰍イ参中のｆｉ（＄λＭ） △ し−アスハ９ライン事針イ谷市のＡＴＰｉＬｋ（８Ｍ）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）バチルス属に属するＮＡＤ合成酵素生産菌を培地
に培養し、その培養物からＮＡＤ合成酵素を採取するこ
とを特徴とするＮＡＤ合成酵素の製造法。
（２）ＮＡＤ合成酵素生産菌がバチルス・リケニホルミ
スＢ−０８４４（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６０１）である特許
請求の範囲第１項記載の製造法。