JPS59198995A - Ｎａｄ合成酵素を用いる測定法 - Google Patents
Ｎａｄ合成酵素を用いる測定法Info
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- JPS59198995A JPS59198995A JP58071513A JP7151383A JPS59198995A JP S59198995 A JPS59198995 A JP S59198995A JP 58071513 A JP58071513 A JP 58071513A JP 7151383 A JP7151383 A JP 7151383A JP S59198995 A JPS59198995 A JP S59198995A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ＮＡＤ合成酵素を用いる測定法およびその製
造法に関する。更に詳しく云えば、本発明はＡＴＰ、デ
アミド−ＮＡＤおよびアミド供与体、例えばＮＨ３、Ｌ
−グルタミン〔以下Ｇｉｎと呼称する〕またはＬ−アス
パラギン〔以下Ａｓｎと呼称する〕のいずれか１つを含
有する被検液にＡＴＰ 。
造法に関する。更に詳しく云えば、本発明はＡＴＰ、デ
アミド−ＮＡＤおよびアミド供与体、例えばＮＨ３、Ｌ
−グルタミン〔以下Ｇｉｎと呼称する〕またはＬ−アス
パラギン〔以下Ａｓｎと呼称する〕のいずれか１つを含
有する被検液にＡＴＰ 。
デアミド−ＮＡＤ、アミド供与体およびＭ ｇ＋＋の存
在下ＮＡＤ合盛酵素を作用させる主反応を行い、主反応
によシ生成したＮＡＤを、ＮＡＤを補酵素とする酸化還
元反応系と還元型ＮＡＤを補酵素とする酸化還元反応系
との組合せによって補酵素サイクリング反応を行い、そ
のサイクリング反応によシ消費または生成された成分を
定量することを特徴とするＡＴＰ、デアミド−ＮＡＤお
よびアミド供与体のいずれか１つを含有する被検液中の
成分の測定法である。。
在下ＮＡＤ合盛酵素を作用させる主反応を行い、主反応
によシ生成したＮＡＤを、ＮＡＤを補酵素とする酸化還
元反応系と還元型ＮＡＤを補酵素とする酸化還元反応系
との組合せによって補酵素サイクリング反応を行い、そ
のサイクリング反応によシ消費または生成された成分を
定量することを特徴とするＡＴＰ、デアミド−ＮＡＤお
よびアミド供与体のいずれか１つを含有する被検液中の
成分の測定法である。。
従来、ＮＡＤ合成酵素（Ｎ Ａ Ｄ ５ｙｎｔｈｅｔ
ａｓｅ ）は、ラット肝臓（Ｊ 、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈ
ｅｍ、 、 ２８８ 、４９８−５００（１９５Ｂ））
、ブタ肝臓（Ｊ 、 Ｂｉ ｏｌ、 Ｃｈｅｍ 、 、
２８６．５２５〜５８０（１９６１））酵母（Ｊ、Ｂ
ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、 ２４７゜４７９４〜４８０２（
１９７２））、Ｅ、ｃｏｌｉ（Ｊ、 Ｂｉｏｌ。
ａｓｅ ）は、ラット肝臓（Ｊ 、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈ
ｅｍ、 、 ２８８ 、４９８−５００（１９５Ｂ））
、ブタ肝臓（Ｊ 、 Ｂｉ ｏｌ、 Ｃｈｅｍ 、 、
２８６．５２５〜５８０（１９６１））酵母（Ｊ、Ｂ
ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、 ２４７゜４７９４〜４８０２（
１９７２））、Ｅ、ｃｏｌｉ（Ｊ、 Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、 、罎３６．１４９４〜１４９７（１９６１
）、〕Ｊ。
）、〕Ｊ。
Ｂｉｏｌ。Ｃｈｅｍ、、２４２，８８５〜８９２（１９
６７）に夫々その存在が知られている。そして、酵素分
類上、Ｍｇ′＋ ＡＴＰ＋デアミド−ＮＡＤ＋ＮＨｓ（−巳ＡＭＰ−１−
ｐｐｉ ＋ＮＡＤの反応を触媒するＮＡＤ合成酵素（Ｅ
、 Ｃ，６，８゜ｐ ｐ １−１−ＮＡＤ−１−Ｌ−グ
ルタミン酸の反応を触媒するＮＡＤ合成酵素（Ｅ、 Ｃ
０６，８゜５．１）に分類されているが、いずれもＮＨ
３またはＧｉｎのアミドを利用でき、両者の相違はアザ
セリンで阻害されるか否かによって区別されている。
６７）に夫々その存在が知られている。そして、酵素分
類上、Ｍｇ′＋ ＡＴＰ＋デアミド−ＮＡＤ＋ＮＨｓ（−巳ＡＭＰ−１−
ｐｐｉ ＋ＮＡＤの反応を触媒するＮＡＤ合成酵素（Ｅ
、 Ｃ，６，８゜ｐ ｐ １−１−ＮＡＤ−１−Ｌ−グ
ルタミン酸の反応を触媒するＮＡＤ合成酵素（Ｅ、 Ｃ
０６，８゜５．１）に分類されているが、いずれもＮＨ
３またはＧｉｎのアミドを利用でき、両者の相違はアザ
セリンで阻害されるか否かによって区別されている。
本酵素の活性測定法は、反応にょシ生じた還元型ＮＡを
アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｅ、Ｃ，１゜１．１）で
還元し、生じたＮＡＤＨを８４０ｎｍにおける吸光度測
定する方法または生じたＮＡＤを螢光法で測定する方法
が報告されている。しかし、この活性測定法に基いてＡ
ＴＰ、デアミド−〜ΦまたはＮＨ３またはＧｌｎの定量
を試みようとしても、その感度が低く、従来由来の酵素
では測定用試薬としては著しく困難であった。
アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｅ、Ｃ，１゜１．１）で
還元し、生じたＮＡＤＨを８４０ｎｍにおける吸光度測
定する方法または生じたＮＡＤを螢光法で測定する方法
が報告されている。しかし、この活性測定法に基いてＡ
ＴＰ、デアミド−〜ΦまたはＮＨ３またはＧｌｎの定量
を試みようとしても、その感度が低く、従来由来の酵素
では測定用試薬としては著しく困難であった。
本発明者らは、前記のＮＡＤ合成酵素の反応によシ生じ
たＮＡＤを補酵素とする酸化還元反応系と還元型ＮＡＤ
を補酵素とする酸化還元反応系との絹合せによる補酵素
サイクリング反応により増幅反応させ、消費捷たは生成
される成分を定量することに着目した。
たＮＡＤを補酵素とする酸化還元反応系と還元型ＮＡＤ
を補酵素とする酸化還元反応系との絹合せによる補酵素
サイクリング反応により増幅反応させ、消費捷たは生成
される成分を定量することに着目した。
本発明は上記に基いて完成されたものであって、被検液
中のＡ’ｒＰ、デアミド−ＮＡＤおよび、ＮＨ３ＧＩｎ
４たけＡｓｎアミド供与体のいずれか１つを測定するに
当り、被検液にＡＴＰ、デアミド−ＮＡＤ。
中のＡ’ｒＰ、デアミド−ＮＡＤおよび、ＮＨ３ＧＩｎ
４たけＡｓｎアミド供与体のいずれか１つを測定するに
当り、被検液にＡＴＰ、デアミド−ＮＡＤ。
アミド供与体およびＭｇ＋＋の存在下ＮＡＤ合成酵素を
作用させる主反応を行い、主反応により生じたＮＡＤを
、ＮＡＤを補酵素とする酸化還元反応系と還元型ＮＡＤ
を補酵素とする酸化還元反応系との組合せによる補酵素
サイクリング反応を行い、そのサイクリング反応により
消費または生成された成分を定量することを特徴とする
Ａ、 Ｔ Ｐ 、デアミド−ＮＡＤおよびアミド供与体
のいずれが１つを含有する被検液中の成分の測定法であ
る。
作用させる主反応を行い、主反応により生じたＮＡＤを
、ＮＡＤを補酵素とする酸化還元反応系と還元型ＮＡＤ
を補酵素とする酸化還元反応系との組合せによる補酵素
サイクリング反応を行い、そのサイクリング反応により
消費または生成された成分を定量することを特徴とする
Ａ、 Ｔ Ｐ 、デアミド−ＮＡＤおよびアミド供与体
のいずれが１つを含有する被検液中の成分の測定法であ
る。
本発明における反応系を要約すると以下の通シである。
■主反応系
アミド供与体とｌ〜てＮ１−１３を利用する場合＋ｐ
ｐ ｉ ＋ＮＡＤ アミド供与体としてＧｉｎまたはＡｓｎを利用する場合
ＡＴＰ＋デアミド−ＮＡＤ＋０１ｎ （Ａｓｎ ）
＋ Ｈ２０■補酵素サイクリング反応系 ■ＮＡＤを補酵素とする酸化還元反応系；ＮＡＤ＋８１
−〉還元型Ｎ Ａ Ｄ −１−ＰｌＥ。
ｐ ｉ ＋ＮＡＤ アミド供与体としてＧｉｎまたはＡｓｎを利用する場合
ＡＴＰ＋デアミド−ＮＡＤ＋０１ｎ （Ａｓｎ ）
＋ Ｈ２０■補酵素サイクリング反応系 ■ＮＡＤを補酵素とする酸化還元反応系；ＮＡＤ＋８１
−〉還元型Ｎ Ａ Ｄ −１−ＰｌＥ。
■ＮＡＤＨを補酵素とする転移反応系；還元型ＮＡＤ＋
８２−−−）ＮＡＤ＋Ｐ２Ｅ鵞 ＮＨ３：アンモニアの正１価のアンモニライオンを包含
する。
８２−−−）ＮＡＤ＋Ｐ２Ｅ鵞 ＮＨ３：アンモニアの正１価のアンモニライオンを包含
する。
Ｅｌ：ＮＡＤおよびＳｌを基質として消費して、還元型
ＮＡＤおよびＰｌを生成する反応を触媒するデヒドロゲ
ナーゼ。
ＮＡＤおよびＰｌを生成する反応を触媒するデヒドロゲ
ナーゼ。
Ｅ２：還元型ＮＡＤおよびＳ２を消費して、ＮＡＤおよ
びＰＩＩを生成する反応を触媒する作用物質。
びＰＩＩを生成する反応を触媒する作用物質。
Ｓ、：Ｅｌの還元型基質。
Ｓ２： Ｅ２の酸化型基質。
ｐ、 ： ｓ、の酸化生成物
Ｐ２： Ｓ、の還元生成物。
ＮＨ３を利用する場合の反応系を式で示すと以下の通り
である。
である。
デアミド−ＮＡＤ ＋ ＮＨ３
本発明の被検液としては、少なくとも前記の主反応系の
基質であるＡＴＰ、デアミド−ＮＡＤまたはアミド供与
体のいずれか１つの成分を含有するものであればよく、
例えば該基質のうちの１つの成分を予め含有して々る被
検液、他の酵素反応系により生成捷たは消砦された該基
質を含有する被検液が挙げられる。
基質であるＡＴＰ、デアミド−ＮＡＤまたはアミド供与
体のいずれか１つの成分を含有するものであればよく、
例えば該基質のうちの１つの成分を予め含有して々る被
検液、他の酵素反応系により生成捷たは消砦された該基
質を含有する被検液が挙げられる。
上記の酵素反応系の好捷しい例としては、ＡＴＰ。
ＮＨ３、ＧｉｎまたはＡｓｎのアミド供与体を消費また
は生成し、ＮＡＤ、還元型ＮＡＤなどの補酵素の関係し
ない酵素反応系のもの、例えば下記の酵素反応系が例示
されるが、何ら本発明の対象を限定するものではない。
は生成し、ＮＡＤ、還元型ＮＡＤなどの補酵素の関係し
ない酵素反応系のもの、例えば下記の酵素反応系が例示
されるが、何ら本発明の対象を限定するものではない。
（１）ＡＴＰを生成する酵素反応系
（２）クレアチンキナーゼ（Ｅ、 Ｃ，２，７，８，２
）クレアチンホスフェ−）＋ＡＤＰ− 還元剤、Ｍ、＋ｈ クレアチン＋ＡＴＰ 還元剤：β−メルカプトエタノール、還元型グルタチオ
ン、システィン、Ｎ−ア セチルシスティン、ジチオスレイト ールなど。
）クレアチンホスフェ−）＋ＡＤＰ− 還元剤、Ｍ、＋ｈ クレアチン＋ＡＴＰ 還元剤：β−メルカプトエタノール、還元型グルタチオ
ン、システィン、Ｎ−ア セチルシスティン、ジチオスレイト ールなど。
■ピルベートキナーゼ（Ｅ、 Ｃ，２，７，１，４０）
ホスホエノルビルビン酸＋ＡＤＰ− Ｇ）アセテートキナーゼ（Ｅ、 Ｃ０２，７，２，１）
アセチルホスフェート＋ＡＤＰ− Ｍ ｇ＋１− 、たはＭｎ廿 酢酸＋ＡＴＰ ■カルバメートキナーゼ（Ｅ、Ｃ，２，７，２，２）カ
ルバモイルホスフェ−）＋ＡＤＰ− ■アスパルテートキナーゼ（Ｅ、 Ｃ，２，７，２，４
）４−ホスホ−Ｌ−アスパラギン酸＋Ａ Ｄ Ｐ −（
θ）ホスホグリセレイトキナーゼ（Ｅ、 Ｃ１２，７，
２，８）１．８−ジホスホーＤ−グリセレイト＋ＡＤＰ
−Ｍｇ＋またはＭｎ＋ ８−ホスホ−Ｄ−グリセレイト→−ＡＴＰ（ロ）アルギ
ニンキナ ゼ（Ｅ、Ｃ，２，７，８，８）アルギニンホ
スフェート＋ＡＤＰ− Ｍｇ−Ｈ−捷たはＭ。廿 Ｌ−アルギニン＋ＡＴＰ （２１ＮＩ−１３を放出し得る水溶性アンモニウム塩オ
たはＮ ｌ−１３を利用する酵素反応系 ■水溶性アンモニウム塩としては、塩化アンモニウム、
アンモニア水、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、
酢酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムナトのアンモ
ニウムイオンを放出できる無機または有機アンモニウム
塩が例示される。
ホスホエノルビルビン酸＋ＡＤＰ− Ｇ）アセテートキナーゼ（Ｅ、 Ｃ０２，７，２，１）
アセチルホスフェート＋ＡＤＰ− Ｍ ｇ＋１− 、たはＭｎ廿 酢酸＋ＡＴＰ ■カルバメートキナーゼ（Ｅ、Ｃ，２，７，２，２）カ
ルバモイルホスフェ−）＋ＡＤＰ− ■アスパルテートキナーゼ（Ｅ、 Ｃ，２，７，２，４
）４−ホスホ−Ｌ−アスパラギン酸＋Ａ Ｄ Ｐ −（
θ）ホスホグリセレイトキナーゼ（Ｅ、 Ｃ１２，７，
２，８）１．８−ジホスホーＤ−グリセレイト＋ＡＤＰ
−Ｍｇ＋またはＭｎ＋ ８−ホスホ−Ｄ−グリセレイト→−ＡＴＰ（ロ）アルギ
ニンキナ ゼ（Ｅ、Ｃ，２，７，８，８）アルギニンホ
スフェート＋ＡＤＰ− Ｍｇ−Ｈ−捷たはＭ。廿 Ｌ−アルギニン＋ＡＴＰ （２１ＮＩ−１３を放出し得る水溶性アンモニウム塩オ
たはＮ ｌ−１３を利用する酵素反応系 ■水溶性アンモニウム塩としては、塩化アンモニウム、
アンモニア水、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、
酢酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムナトのアンモ
ニウムイオンを放出できる無機または有機アンモニウム
塩が例示される。
■ニコチンアミダーゼ（Ｅ、 Ｃ，８，５，１，１９）
ニコチンアミド＋Ｈ２０→ニコチン酸＋ Ｎ Ｈ３＋
Ｈ”■グルタミルーペプチドーグルタミナーゼ（Ｅ、
Ｃ，８，５，１，４４） Ｌ−グルタミニルーペプチド十Ｈ２Ｏ−〉Ｌ−グルタミ
ニルーペプチド十ＮＨ３ ■アルギニンデアミナーゼ（Ｅ、 Ｃ，８，５，８，６
）Ｌ−アルギニン十Ｈ２０→シトルリン十ＮＨ３−）−
Ｈ十〇グアニンデアミナーゼ（Ｅ、 Ｃ，８，５，４，
８）グア＝ン＋Ｈ，Ｏ→キサンチン＋ＮＨ３−４−Ｈ＋
■アデノシンデアミナーゼ（Ｅ、 Ｃ１８，５，４，４
）アデノシン十Ｈ，Ｏ→イノシン十ＮＨ，−１−鹸■ク
レアチニンデアミナーゼ（Ｅ、 Ｃ０８，５，４，２１
１クレアチニン＋Ｈ２０→Ｎ−メチルヒダントイン十Ｎ
Ｈ３＋Ｈ＋ ■スレオニンデヒドラターゼ（Ｅ、 Ｃ，４，２，１，
１６）Ｌ−スレオニン十Ｈ２０〜ン２−オキソ酪酸十Ｃ
ｏ２＋Ｎｉ−１３＋Ｈ＋ ■アスパラギン酸アンモニアーリアーゼ（Ｅ、 Ｃ０４
，８，１，１） Ｌ−アスパラギン酸→フマル酸十ＮＨ３−１−Ｈ”■Ｌ
−メチオニンγ−リアーゼ（Ｅ、Ｃ，４，４，１，１１
１Ｌ−メチオニン十［Ｉ２０−シ２−オキソ酪酸十メタ
ンチオール＋ＮＨ３−１−Ｈ十 ６ｉ１メチルアミングルタミン酸メチルトランスフェラ
ーゼ（Ｅ、Ｃ，２，１，１，２１）十−〉 Ｎ−メチルグルタミン酸＋ＮＨ３−１−Ｈっ−グルタミ
ン酸＋メチルアミン （３）Ｌ −Ｇｉｎを利用する酵素反応系（］）グルタ
ミントランスアミナーゼ（Ｅ、Ｃ０２，６，１，１５）
Ｌ−Ｇｌｎ ＋ ２−オ＊シ酸−）２−ｙＦ＊ツク＃タ
ミン酸＋Ｌ−アミノ酸 ■カルバモイルーホスフェートシンターゼの、Ｃ，６，
８，５，５） Ｌ−Ｇｌｎ−１−ＨＣＯ３＋２ＡＴＰ＋）（２０→カル
バモイル−ホスフェート＋２ＡＤＰ＋ｐ １−）−Ｌ−
グルタミン酸■ヘキソースホスフェートアミノトランス
フェラーゼ（Ｅ、 Ｃ９５，８，１，１９）Ｄ−フラク
トース−６−ホスフェート＋Ｌ−Ｇｉｎ→２−アミノ−
２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−ホスフェート＋Ｌ
−グルタミン酸■グルタミン−ジローイノソースアミノ
トランスフェラーゼ（Ｅ、 Ｃ，２，６，１，５０１２
−オキソグルタミン酸＋１−アミノ−１−デオキシ−ジ
ローイノシトール−？Ｌ −Ｇｌｎ−１−２，４，６７
８，５−ペンタデヒドロキシシクロヘキサノン （４） Ｌ −Ａｓｎを利用する酵素反応系■アスパラ
ギントランスアミナーゼ（Ｅ、Ｃ，２゜６．１．１４） Ｌ −Ａｓｎ −１−２−オキシ酸７２−オキソコハク
酸十し−アミノ酸 （２）８−シアノアラニンヒドラターゼ（Ｅ、 Ｃ，４
゜２．１．６５） ８−シアノアラニｙ−）−Ｈ２０→Ｌ −Ａｓｎ上記の
ように、本発明においては、前記に例示した酵素反応系
で消費捷たけ生成されたＡ Ｔ Ｐ。
ニコチンアミド＋Ｈ２０→ニコチン酸＋ Ｎ Ｈ３＋
Ｈ”■グルタミルーペプチドーグルタミナーゼ（Ｅ、
Ｃ，８，５，１，４４） Ｌ−グルタミニルーペプチド十Ｈ２Ｏ−〉Ｌ−グルタミ
ニルーペプチド十ＮＨ３ ■アルギニンデアミナーゼ（Ｅ、 Ｃ，８，５，８，６
）Ｌ−アルギニン十Ｈ２０→シトルリン十ＮＨ３−）−
Ｈ十〇グアニンデアミナーゼ（Ｅ、 Ｃ，８，５，４，
８）グア＝ン＋Ｈ，Ｏ→キサンチン＋ＮＨ３−４−Ｈ＋
■アデノシンデアミナーゼ（Ｅ、 Ｃ１８，５，４，４
）アデノシン十Ｈ，Ｏ→イノシン十ＮＨ，−１−鹸■ク
レアチニンデアミナーゼ（Ｅ、 Ｃ０８，５，４，２１
１クレアチニン＋Ｈ２０→Ｎ−メチルヒダントイン十Ｎ
Ｈ３＋Ｈ＋ ■スレオニンデヒドラターゼ（Ｅ、 Ｃ，４，２，１，
１６）Ｌ−スレオニン十Ｈ２０〜ン２−オキソ酪酸十Ｃ
ｏ２＋Ｎｉ−１３＋Ｈ＋ ■アスパラギン酸アンモニアーリアーゼ（Ｅ、 Ｃ０４
，８，１，１） Ｌ−アスパラギン酸→フマル酸十ＮＨ３−１−Ｈ”■Ｌ
−メチオニンγ−リアーゼ（Ｅ、Ｃ，４，４，１，１１
１Ｌ−メチオニン十［Ｉ２０−シ２−オキソ酪酸十メタ
ンチオール＋ＮＨ３−１−Ｈ十 ６ｉ１メチルアミングルタミン酸メチルトランスフェラ
ーゼ（Ｅ、Ｃ，２，１，１，２１）十−〉 Ｎ−メチルグルタミン酸＋ＮＨ３−１−Ｈっ−グルタミ
ン酸＋メチルアミン （３）Ｌ −Ｇｉｎを利用する酵素反応系（］）グルタ
ミントランスアミナーゼ（Ｅ、Ｃ０２，６，１，１５）
Ｌ−Ｇｌｎ ＋ ２−オ＊シ酸−）２−ｙＦ＊ツク＃タ
ミン酸＋Ｌ−アミノ酸 ■カルバモイルーホスフェートシンターゼの、Ｃ，６，
８，５，５） Ｌ−Ｇｌｎ−１−ＨＣＯ３＋２ＡＴＰ＋）（２０→カル
バモイル−ホスフェート＋２ＡＤＰ＋ｐ １−）−Ｌ−
グルタミン酸■ヘキソースホスフェートアミノトランス
フェラーゼ（Ｅ、 Ｃ９５，８，１，１９）Ｄ−フラク
トース−６−ホスフェート＋Ｌ−Ｇｉｎ→２−アミノ−
２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−ホスフェート＋Ｌ
−グルタミン酸■グルタミン−ジローイノソースアミノ
トランスフェラーゼ（Ｅ、 Ｃ，２，６，１，５０１２
−オキソグルタミン酸＋１−アミノ−１−デオキシ−ジ
ローイノシトール−？Ｌ −Ｇｌｎ−１−２，４，６７
８，５−ペンタデヒドロキシシクロヘキサノン （４） Ｌ −Ａｓｎを利用する酵素反応系■アスパラ
ギントランスアミナーゼ（Ｅ、Ｃ，２゜６．１．１４） Ｌ −Ａｓｎ −１−２−オキシ酸７２−オキソコハク
酸十し−アミノ酸 （２）８−シアノアラニンヒドラターゼ（Ｅ、 Ｃ，４
゜２．１．６５） ８−シアノアラニｙ−）−Ｈ２０→Ｌ −Ａｓｎ上記の
ように、本発明においては、前記に例示した酵素反応系
で消費捷たけ生成されたＡ Ｔ Ｐ。
ＮＨ８、Ｌ−グルタミンまたはＬ−アスパラギンを含有
する反応液に限らず、上記酵素反応系で用いた酵素の活
性測定、消費された基質オたは生成された生成物を定量
するための反応液も被検液として使用し得る。。
する反応液に限らず、上記酵素反応系で用いた酵素の活
性測定、消費された基質オたは生成された生成物を定量
するための反応液も被検液として使用し得る。。
これらの酵素反応系におけるＡ Ｔ Ｐ ＸＮＨ３、Ｇ
ｉｎまたはＡｓｎの定量目的は、酵素反応における酵素
の活性測定や用いられる他の成分のいずれか１つの成分
の測定のために行われるものである。この酵素反応系に
おいては、測定すべき成分以外は試薬として一定量用い
ればよい。この場合における測定されるべき被検液や試
薬の量は、測定すべき目的や選択する条件によって適宜
設定変更すればよく、特に限定されるものでは力い。反
応条件としては、通常８７℃で少なくとも１分以上行え
ばよい。
ｉｎまたはＡｓｎの定量目的は、酵素反応における酵素
の活性測定や用いられる他の成分のいずれか１つの成分
の測定のために行われるものである。この酵素反応系に
おいては、測定すべき成分以外は試薬として一定量用い
ればよい。この場合における測定されるべき被検液や試
薬の量は、測定すべき目的や選択する条件によって適宜
設定変更すればよく、特に限定されるものでは力い。反
応条件としては、通常８７℃で少なくとも１分以上行え
ばよい。
本発明に用いられるＮＡＤ合成酵素としては、微生物由
来、例えばエツシエリヒアφコリ、バチルス・リケンホ
ルミス等の酵素が診断用酵素としての安定性の点で好ま
しい。特に本発明者らが見出シたバチルス・リヶンホル
ミスＢ−０８４４の産生ずる酵素が好ましい、。
来、例えばエツシエリヒアφコリ、バチルス・リケンホ
ルミス等の酵素が診断用酵素としての安定性の点で好ま
しい。特に本発明者らが見出シたバチルス・リヶンホル
ミスＢ−０８４４の産生ずる酵素が好ましい、。
上記のＮＡＤ合成酵素は、
＋ｐ１）ｉ＋ＮＡＤ
の反応または
ＡＴＰ＋デアミド−Ｎ Ａ Ｄ −１−Ｇｌｎ （また
はＡｓｎ ）Ｇｌｕ；Ｌ−グルタミン酸、Ａｓｐ ；
Ｌ−アスパラギン酸の反応を触媒する酵素であシ、従っ
て主反応を行わせるに際しては、ＡＴＰ、デアミド−Ｎ
ＡＤおよびＮＨ３、ＧｌｎまたはＡｓ ｎのアミド供与
体のいずれか１つの成分を含有する被検液とＡＴＰ。
はＡｓｎ ）Ｇｌｕ；Ｌ−グルタミン酸、Ａｓｐ ；
Ｌ−アスパラギン酸の反応を触媒する酵素であシ、従っ
て主反応を行わせるに際しては、ＡＴＰ、デアミド−Ｎ
ＡＤおよびＮＨ３、ＧｌｎまたはＡｓ ｎのアミド供与
体のいずれか１つの成分を含有する被検液とＡＴＰ。
デアミド−ＮＡＤおよびＮＨ３、ＧｉｎまたはＡｓｎの
アミド供与体のうち被検されない基質にＭｇ＋の存在下
ＮＡＤ合成酵素を作用させる酵素反応を行わせればよい
。
アミド供与体のうち被検されない基質にＭｇ＋の存在下
ＮＡＤ合成酵素を作用させる酵素反応を行わせればよい
。
上記の酵素反応は、通常１テスト当り１０μｌから８
ｍｌの範囲の容量で反応し得る。ＮＡＤ合成酵素は反応
時間等によゆ異なるが、通常１テスト当り０．５〜１０
０単位で作用し得る。また使用する基質量は、少々くと
も被検すべき成分の量以上に用いればよい。この主反応
により被検液中のＡＴＰ。
ｍｌの範囲の容量で反応し得る。ＮＡＤ合成酵素は反応
時間等によゆ異なるが、通常１テスト当り０．５〜１０
０単位で作用し得る。また使用する基質量は、少々くと
も被検すべき成分の量以上に用いればよい。この主反応
により被検液中のＡＴＰ。
デアミード−ＮＡＤ−＄たはアミド供与体の量に相応し
＊、 Ｎ Ａ Ｄが生成される。。
＊、 Ｎ Ａ Ｄが生成される。。
次に、補酵素サイクリングによシ増幅反応させるわけで
あるが、本発明は、主反応系において被検液中のＡＴＰ
、デアミド−ＮＡＤｔたはアミド供与体量に相応して変
換され、生成したＮＡＤを、ＮＡＤを補酵素とする酸化
還元反応系と還元型ＮＡＤを補酵素とする酸化還元反応
系との組合せによって補酵素サイクリング反応を行い、
次いで上記反応において消費または生成される成分を定
量すればよい。
あるが、本発明は、主反応系において被検液中のＡＴＰ
、デアミド−ＮＡＤｔたはアミド供与体量に相応して変
換され、生成したＮＡＤを、ＮＡＤを補酵素とする酸化
還元反応系と還元型ＮＡＤを補酵素とする酸化還元反応
系との組合せによって補酵素サイクリング反応を行い、
次いで上記反応において消費または生成される成分を定
量すればよい。
ＮＡＤを補酵素とする酸化還元反応系としては、例えば
ＮＡＤを消費して還元型ＮＡＤを生成する反応を形成す
るデヒドロゲナーゼ（Ｅｌ）およびその基質（Ｓ＋）に
よる反応系や、ＮＡＤとＮＡＤＰの両方を補酵素とする
ことのできるデヒドロゲナーゼ（Ｅｌ）およびその基質
（Ｓｌ）による反応系を用いることができる。上記のデ
ヒドロゲナーゼは、特に限定されることはないが、少な
くともＮＡＤを補酵素として消費するものであればよく
、かつ過剰量用いる特定の基質に作用して還元型ＮＡＤ
を生成すればデヒドロゲナーゼであればいかなる起源の
酵素であってもよい。これらの酵素およびその基質の例
としては「酵素ハンドブック」に記載されている。例え
ば、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ，１，１，１，
２７）およびＬ−ラクテート、アルコールデヒドロゲナ
ーゼ（ＥＣ６１，１，１，６）およびグリセロール、グ
リセロール−８−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ
８１，１，１，８）およヒクリセロールー８−ホスフェ
ート、クルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ，１，１，４
７）およびグルコース、マレートデヒドロゲナーゼ（Ｅ
Ｃ，１，１，１゜８７）およびＬ−マレート、グルタメ
イトデヒドロゲナーゼ（ＥＣ，１，４，１，２）および
Ｌ−グルタメイト、８−α−ヒドロキシステロイドデヒ
ドｏ ケｆ−−ｈ’ （ＥＣ，１゜１．１．５０） オ
ｘヒ８− ａ −ヒドロキシステロイドが挙げられる。
ＮＡＤを消費して還元型ＮＡＤを生成する反応を形成す
るデヒドロゲナーゼ（Ｅｌ）およびその基質（Ｓ＋）に
よる反応系や、ＮＡＤとＮＡＤＰの両方を補酵素とする
ことのできるデヒドロゲナーゼ（Ｅｌ）およびその基質
（Ｓｌ）による反応系を用いることができる。上記のデ
ヒドロゲナーゼは、特に限定されることはないが、少な
くともＮＡＤを補酵素として消費するものであればよく
、かつ過剰量用いる特定の基質に作用して還元型ＮＡＤ
を生成すればデヒドロゲナーゼであればいかなる起源の
酵素であってもよい。これらの酵素およびその基質の例
としては「酵素ハンドブック」に記載されている。例え
ば、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ，１，１，１，
２７）およびＬ−ラクテート、アルコールデヒドロゲナ
ーゼ（ＥＣ６１，１，１，６）およびグリセロール、グ
リセロール−８−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ
８１，１，１，８）およヒクリセロールー８−ホスフェ
ート、クルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ，１，１，４
７）およびグルコース、マレートデヒドロゲナーゼ（Ｅ
Ｃ，１，１，１゜８７）およびＬ−マレート、グルタメ
イトデヒドロゲナーゼ（ＥＣ，１，４，１，２）および
Ｌ−グルタメイト、８−α−ヒドロキシステロイドデヒ
ドｏ ケｆ−−ｈ’ （ＥＣ，１゜１．１．５０） オ
ｘヒ８− ａ −ヒドロキシステロイドが挙げられる。
これらの酸化還元反応に使用する酵素量は、酵素力価、
基質の種類および補酵素サイクリング率によって異なる
。基質量は、１サイクル毎に１モル比の基質を消費して
なるもので、サイクリングする補酵素よシ比較に々らな
い程はるかに多いモル量が使用されるので、通常単位時
間当りのサイクル数および反応時間に基いて決定すれば
よい。
基質の種類および補酵素サイクリング率によって異なる
。基質量は、１サイクル毎に１モル比の基質を消費して
なるもので、サイクリングする補酵素よシ比較に々らな
い程はるかに多いモル量が使用されるので、通常単位時
間当りのサイクル数および反応時間に基いて決定すれば
よい。
また、その酸化還元酵素の反応速度が最大を示すようが
濃度以上であればよい。通常０．１ｍＭないし１００ｍ
Ｍの濃度範囲で存在し得る。
濃度以上であればよい。通常０．１ｍＭないし１００ｍ
Ｍの濃度範囲で存在し得る。
還元型ＮＡＤを補酵素とする反応系としては、少なくと
も還元型ＮＡＤを消費してＮＡＤを生成する作用物質（
Ｅ２）およびその基質（Ｓ２）の反応系が挙げられ、そ
の作用物質の反応系としては、少なくとも還元型ＮＡＤ
を消費してＮＡＤＩ生成する酸化還元酵素およびその基
質の反応系や、電子伝達物質およびテトラゾリウム塩の
反応系が挙げられる。
も還元型ＮＡＤを消費してＮＡＤを生成する作用物質（
Ｅ２）およびその基質（Ｓ２）の反応系が挙げられ、そ
の作用物質の反応系としては、少なくとも還元型ＮＡＤ
を消費してＮＡＤＩ生成する酸化還元酵素およびその基
質の反応系や、電子伝達物質およびテトラゾリウム塩の
反応系が挙げられる。
還元型ＮＡＤを消費してＮＡＤを生成する酸化還元酵素
としては、少なくとも還元型ＮＡＤを補酵素とし、過剰
量用いる特定の基質（Ｓ２）に作用してＮＡＤおよびＳ
２の還元型生成物（Ｐ２）を生成するデヒドロゲナーゼ
、または少なくとも還元型ＮＡＤを補酵素とし、チトク
ローム、ジスルフィド化合物、キノンおよびその類縁体
等を受容体とする還元型ＮＡＤ：受容体酸化還元酵素で
あればそのいずれでも良く、その起源も限定されること
はない。これらの酵素およびその基質または受容体の例
としては、「酵素ハンドブック−１に記載されている。
としては、少なくとも還元型ＮＡＤを補酵素とし、過剰
量用いる特定の基質（Ｓ２）に作用してＮＡＤおよびＳ
２の還元型生成物（Ｐ２）を生成するデヒドロゲナーゼ
、または少なくとも還元型ＮＡＤを補酵素とし、チトク
ローム、ジスルフィド化合物、キノンおよびその類縁体
等を受容体とする還元型ＮＡＤ：受容体酸化還元酵素で
あればそのいずれでも良く、その起源も限定されること
はない。これらの酵素およびその基質または受容体の例
としては、「酵素ハンドブック−１に記載されている。
デヒドロゲナーゼおよびその基質の例としては、ラクテ
ートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ，１゜１．１．２７）およ
びピルビン酸、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ，１
，１，１）およびアセトアルデヒド、グリセロールデヒ
ドロゲナーゼ（ＥＣ，１，１゜１．６）およびシトロキ
シアセトンが挙げら′れる。
ートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ，１゜１．１．２７）およ
びピルビン酸、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ，１
，１，１）およびアセトアルデヒド、グリセロールデヒ
ドロゲナーゼ（ＥＣ，１，１゜１．６）およびシトロキ
シアセトンが挙げら′れる。
またＮｋＤＨ：受容体酸化還元酵素としては、チトクロ
ームｂ５レダクターゼ（ＥＣ，１゜６．２．２１、ジア
ホラーゼ（ＥＣ０１，６，４，８）などが挙げられる。
ームｂ５レダクターゼ（ＥＣ，１゜６．２．２１、ジア
ホラーゼ（ＥＣ０１，６，４，８）などが挙げられる。
受容体と１−２では、メチレン・ブルー、フラビン類、
キノン類、２．６−シクロロフエノールインドフエノー
ルなどが挙げられる。
キノン類、２．６−シクロロフエノールインドフエノー
ルなどが挙げられる。
還元型ＮＡＤ：受容体酸化還元酵素および受容体の糾合
せは、還元型ＮＡＤを補酵素としてなる酵素および電子
受容体とかり得るものであれば特に限定されない。好捷
しい組合せとしては、ジアホラーゼ（ＥＣ，１，６，４
，８）およびテトラゾリウム塩、およびメチレン・ブル
ー、ＮＡＤデヒドロゲナーゼ（ＥＣ０１，６，９９，８
）およびチトクロームＣなどが挙げられる。使用濃度は
通常０．０５〜１００Ｕ／ｍ／の範囲で存在し得る。テ
トラゾリウム塩の使用濃度は、テトラゾリウム塩および
究極的に形成されるホルマザンの双方の水溶性がむしろ
限定されるが、通常は試薬／ ｍｌ当シ１μＶから１０
０μりの濃度範囲で存在し得る。
せは、還元型ＮＡＤを補酵素としてなる酵素および電子
受容体とかり得るものであれば特に限定されない。好捷
しい組合せとしては、ジアホラーゼ（ＥＣ，１，６，４
，８）およびテトラゾリウム塩、およびメチレン・ブル
ー、ＮＡＤデヒドロゲナーゼ（ＥＣ０１，６，９９，８
）およびチトクロームＣなどが挙げられる。使用濃度は
通常０．０５〜１００Ｕ／ｍ／の範囲で存在し得る。テ
トラゾリウム塩の使用濃度は、テトラゾリウム塩および
究極的に形成されるホルマザンの双方の水溶性がむしろ
限定されるが、通常は試薬／ ｍｌ当シ１μＶから１０
０μりの濃度範囲で存在し得る。
電子伝達物質としては、還元型ＮＡＤをＮＡＤに酸化す
る能力を有し、しかも補酵素サイクリング反応に悪影響
を及けさないような物質、例えばフェナジンメタルサル
フェート、メルドーラ拳ブルー、ピロシアニンなどが挙
げられる。使用濃度は、サイクリング率に応じて設定す
ればよいが、通常反応液／１ｍ／当り５μｍ〜０．５■
の濃度範囲で存在し得る。
る能力を有し、しかも補酵素サイクリング反応に悪影響
を及けさないような物質、例えばフェナジンメタルサル
フェート、メルドーラ拳ブルー、ピロシアニンなどが挙
げられる。使用濃度は、サイクリング率に応じて設定す
ればよいが、通常反応液／１ｍ／当り５μｍ〜０．５■
の濃度範囲で存在し得る。
上記のサイクリング反応は、通常室温ないし８７℃付近
の温度、好ましくけ８０〜８７℃の温度で行われる。反
応時間は、特に限定されるものでなく、通常１分以上、
好ましくは５分以上行なえばよい。予定された時間の終
りで反応を迅速に停止するには、酸例えば塩酸、リン酸
などを添加することにより行わわる。
の温度、好ましくけ８０〜８７℃の温度で行われる。反
応時間は、特に限定されるものでなく、通常１分以上、
好ましくは５分以上行なえばよい。予定された時間の終
りで反応を迅速に停止するには、酸例えば塩酸、リン酸
などを添加することにより行わわる。
サイクリング反応を行った後、このサイクリング反応に
おいて消費または生成される部分を定量するのであるが
、生成する成分としてはＥｌの還元型基質（Ｓｌ）の酸
化生成物（ＰＩ）またはＥ２の酸化型基質（Ｓ２）の還
元生成物（Ｐ２）を対象とすればよく、消費される成分
としてはＥｌの還元型基質（Ｓｌ）またはＥ２の酸化型
基質（Ｓｔ）を対象とすればよく、これらのＰＩＸＰ２
、Ｓｌ、Ｓ２のいずれか１つの成分の量を定量すればよ
い。簡単には、基質の状態では無色であり、生成物の状
態にて呈色または螢光を呈する吸光波長を変化する場合
の生成物の定量手段を用いることである１１例えばテト
ラゾリウム塩を基質（Ｓ２）とｌ〜で、生成するホルマ
ザンを還元生成物（Ｐ２）とせしめて、このホルマザン
を比色定量してなるものである。さらにフラピン類やキ
ノン類を基質（Ｓ２）として用いた場合には、それらの
基質（Ｓ２）の消費１をその特有の吸光波長に基いて吸
光度測定し７て定量すればよい。
おいて消費または生成される部分を定量するのであるが
、生成する成分としてはＥｌの還元型基質（Ｓｌ）の酸
化生成物（ＰＩ）またはＥ２の酸化型基質（Ｓ２）の還
元生成物（Ｐ２）を対象とすればよく、消費される成分
としてはＥｌの還元型基質（Ｓｌ）またはＥ２の酸化型
基質（Ｓｔ）を対象とすればよく、これらのＰＩＸＰ２
、Ｓｌ、Ｓ２のいずれか１つの成分の量を定量すればよ
い。簡単には、基質の状態では無色であり、生成物の状
態にて呈色または螢光を呈する吸光波長を変化する場合
の生成物の定量手段を用いることである１１例えばテト
ラゾリウム塩を基質（Ｓ２）とｌ〜で、生成するホルマ
ザンを還元生成物（Ｐ２）とせしめて、このホルマザン
を比色定量してなるものである。さらにフラピン類やキ
ノン類を基質（Ｓ２）として用いた場合には、それらの
基質（Ｓ２）の消費１をその特有の吸光波長に基いて吸
光度測定し７て定量すればよい。
−上記反応において、テトラゾリウム塩から形成される
ホルマザンの沈澱の防１１−をたすけるために界面活性
剤を添加することが好寸しい。界面活性剤としてハ、ト
ライトンＸ−１００、アデカトール８０−１．４５など
の非イオン界面活性剤が挙げられる。使用濃度は試薬に
対し、０．０１〜８チの濃度範囲で存在し得る。この界
面活性剤の添加により、測定値の感度の上昇とホルマザ
ンの色素の安定化をはかることができる。
ホルマザンの沈澱の防１１−をたすけるために界面活性
剤を添加することが好寸しい。界面活性剤としてハ、ト
ライトンＸ−１００、アデカトール８０−１．４５など
の非イオン界面活性剤が挙げられる。使用濃度は試薬に
対し、０．０１〜８チの濃度範囲で存在し得る。この界
面活性剤の添加により、測定値の感度の上昇とホルマザ
ンの色素の安定化をはかることができる。
生じたホルマザン色素の比色定量は、ホルマザンの特異
的吸光波長にて吸光度（ＯＤ）を測定すればよく、例え
ば５００〜５５０ｎｍの波長により吸光度を測定して、
被測定物質の定量を行うことができる。
的吸光波長にて吸光度（ＯＤ）を測定すればよく、例え
ば５００〜５５０ｎｍの波長により吸光度を測定して、
被測定物質の定量を行うことができる。
本発明によれば、エンド・ポイント法だけでなく、レイ
ト法、ドライケミカル法（フィルム法、固定化法）も可
能である。
ト法、ドライケミカル法（フィルム法、固定化法）も可
能である。
本発明はＡＴＰＯ高感度測定法として有用であり、被検
液中に遊離しているＡＴＰの定量や、キナーゼ、ＡＤＰ
およびキナーゼ基質用リン化合物の酵素反応によりＡＤ
Ｐがリン酸化されて生成されるＡＴＰの定量、ならびに
キナーゼ活性測定、ＡＤＰ、キナーゼ基質用リン化合物
およびそのキナーゼ反応生成物のいずれか１つの成分の
定量に利用できる。
液中に遊離しているＡＴＰの定量や、キナーゼ、ＡＤＰ
およびキナーゼ基質用リン化合物の酵素反応によりＡＤ
Ｐがリン酸化されて生成されるＡＴＰの定量、ならびに
キナーゼ活性測定、ＡＤＰ、キナーゼ基質用リン化合物
およびそのキナーゼ反応生成物のいずれか１つの成分の
定量に利用できる。
また、本発明はＮＨ３の高感度測定法として有用であり
、被検液中に遊離しているＮＨ３の定量、ＮＩ（３生成
酵素、ＮＨ３生成酵素基質の酵素反応によシ生成または
消費されたＮＨ３の定量、ならびにＮＨ３生成酵素活性
測定、ＮＨ３生成酵素基質およびＮＨ３生成酵素反応生
成物のいずれか１つの成分の定量に利用できる。
、被検液中に遊離しているＮＨ３の定量、ＮＩ（３生成
酵素、ＮＨ３生成酵素基質の酵素反応によシ生成または
消費されたＮＨ３の定量、ならびにＮＨ３生成酵素活性
測定、ＮＨ３生成酵素基質およびＮＨ３生成酵素反応生
成物のいずれか１つの成分の定量に利用できる。
更に、本発明はＧｌｎ（またはＡｓｎ ）の高感度測定
法として有用であり、被検液中に遊離しているＧｌｎ（
またはＡｓｎ ）の定量、Ｇｉｎ （またはＡｓｎ ）
生成酵素基質の酵素反応により生成捷たけ消費されたＧ
ｌｎ（ｔたはＡｓｎ ）の定量ガらびにＧｌｎ （また
はＡｓｎ ）生成酵素活性測定、Ｇｌｎ（ｉたは、Ａｓ
ｎ ）生成酵素基質およびＧｌｎ（またはＡｓｎ ）生
成酵素反応生成物のいずれか１つの成分の定量に利用で
きる。
法として有用であり、被検液中に遊離しているＧｌｎ（
またはＡｓｎ ）の定量、Ｇｉｎ （またはＡｓｎ ）
生成酵素基質の酵素反応により生成捷たけ消費されたＧ
ｌｎ（ｔたはＡｓｎ ）の定量ガらびにＧｌｎ （また
はＡｓｎ ）生成酵素活性測定、Ｇｌｎ（ｉたは、Ａｓ
ｎ ）生成酵素基質およびＧｌｎ（またはＡｓｎ ）生
成酵素反応生成物のいずれか１つの成分の定量に利用で
きる。
本発明で使用されるＮＡＤ合成酵素のうち、バチルス・
リケニホルミスＢ−０８４４の産生ずる酵素は、本発明
者らが新たに見出したものであり、従来公知のＮＡＤ合
成酵素より安定であり、診断用酵素として有用である。
リケニホルミスＢ−０８４４の産生ずる酵素は、本発明
者らが新たに見出したものであり、従来公知のＮＡＤ合
成酵素より安定であり、診断用酵素として有用である。
従って、本発明は、バチルス属に属するＮＡＤ合成酵素
生産菌を培地に培養し、その培養物からＮＡＤ合成酵素
を採取することを特徴とするＮＡＤ合成酵素の製造法も
包含される。
生産菌を培地に培養し、その培養物からＮＡＤ合成酵素
を採取することを特徴とするＮＡＤ合成酵素の製造法も
包含される。
本バチルス・リケニホルミスＢ−０８４４菌株ｉ’ｉ、
静岡県田方郡修善町大野の堆肥より分離された菌株であ
って、その菌学的性質は次の通りである。
静岡県田方郡修善町大野の堆肥より分離された菌株であ
って、その菌学的性質は次の通りである。
ａ１形態的特徴
普通寒天斜面培地を用いて、８０℃で１８〜２４時培養
して顕微鏡鑑察を行なった。
して顕微鏡鑑察を行なった。
（］）形および配列；
端は丸く、まっすぐ又はやや曲った桿菌で単独又は二連
たまに短連鎧する。
たまに短連鎧する。
（２）大きさ；
０．６〜０，８ Ｘ １．５〜３．０μｍ（３）運動性
； 周毛で運動する （４）芽胞； 中央又は端に近いところに形成する。大きさけ０．８
ｘ １．５μｍ細胞は膨張する時もある。
； 周毛で運動する （４）芽胞； 中央又は端に近いところに形成する。大きさけ０．８
ｘ １．５μｍ細胞は膨張する時もある。
ｂ１各培地における生育状態 （５０℃）（］）普通寒
天平板培地 灰白色で円形周縁は波状で平らな集落を形成する 表面
にしわを生ずる時がある。可溶性色素は産生Ｌ２ない。
天平板培地 灰白色で円形周縁は波状で平らな集落を形成する 表面
にしわを生ずる時がある。可溶性色素は産生Ｌ２ない。
（２）普通寒天斜面培地
症状（Ｅｃｈｎｕｌａｔｅ ）で良好に生育する。灰白
色を呈する。可溶性色素は産生しない（３）ブイヨン培
地 一様に混濁良好に生育する。後に菌膜を形成し柔毛状沈
澱を生ずる。。
色を呈する。可溶性色素は産生しない（３）ブイヨン培
地 一様に混濁良好に生育する。後に菌膜を形成し柔毛状沈
澱を生ずる。。
（４１Ｂ ＣＰミルク
１〜２週間後凝固し一部ペブトン化するＣ１生理的性質
（＋；陽性、−；陰性）ダラム染色 士 カタラーゼ産生 十 オキシダーゼ産生 十 ウレアーゼ産生（ＳＳＲ培地）− （Ｃｈ ｒ ｉ ｓ 、培地）− ゲラチン加水分解 士 デンプン加水分解 士 カゼイン加水分解 −（８８目）エスタリン加
水分解 士 セルロース加水分解 − インドール産生 − 硫化水素産生 十 アセトイン産生 十 ＭＲ，テスト ＋（弱）硝酸塩の
還元 十 脱窒反応 − クエン酸塩の利用 ＋ ７．０チＮａ Ｃ／添加培地での生育 十５０℃での生
育 十 ２０℃での生育 十 糖より酸の産生※（ガス非産生） アドニトール − Ｌ（＋）アラビノース ＋ セロビオース ＋ ヅルシトール − ｍｅｓｏ−エリスリトール − フラクトース ＋ フコース − ガラクトース ＋ グルコース ＋ グリセリン ＋ イノシトール ＋ イヌリン − ラクトース ＋ マルトース ＋ マンニトール ＋ マンノース ＋ フラクトース − メリビオース ＋ ラフィノース ＋ Ｌ（＋）ラムノース ＋ サリシン ＋ Ｌソルボース − ソルビトール ＋ デンプン ＋ サッカロース 士 トレハロース ＋ キシロース ＋ ※基礎培地 （ＮＨ４１２）ＴＰＯ４１、ＯＳ’ ＫＣｌ０．２
９ＭｇＳＯ４７Ｈ２００，２ＳＪ ｙｅａｓｔ ｅｘ
１．Ｏｆ！Ａｇａｒ ８．ＯＳ’ Ｂ
ＴＢ Ｏ，０２ｆＤｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ
１０００ｍ／ ｐＨ７，０利用性テスト（炭素源と
して） Ｄアラニン − Ｌアラニン ＋ フラクトース − プロパノール − エタノ−− エチルアミン − ラフティト ＋ αアミノブチレイト − グルコース ＋ イノシトール − シュークロース ＋ セロビオース − Ｌ（＋）アラビノース − マンノース ＋ マルトース ＋ ラムノース − トレハロース ＋ アセチイト − プロピオネイト ＋ ＤＮＡのシトシングアニン含量（％） ４５．６％
（Ｔｍ法）上記の菌学的性質から、本Ｂ−０８４４菌株
は５０℃で生育でき、端の丸い１つすぐまたはや＼曲っ
た桿菌で、ダラム陽性、芽胞を形成し、糖を発酵的に分
解する細菌であるとの特徴を有する。このような諸性状
を有する本漬の分類学上の位置をＢｅｒｇｅｙ’ ｓ
Ｍａｎｕａｌ ８版、１９７４、医学細菌同定の手引き
２版、１９７４およびＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｈａｎ
ｄｂｏｏｋ。
（＋；陽性、−；陰性）ダラム染色 士 カタラーゼ産生 十 オキシダーゼ産生 十 ウレアーゼ産生（ＳＳＲ培地）− （Ｃｈ ｒ ｉ ｓ 、培地）− ゲラチン加水分解 士 デンプン加水分解 士 カゼイン加水分解 −（８８目）エスタリン加
水分解 士 セルロース加水分解 − インドール産生 − 硫化水素産生 十 アセトイン産生 十 ＭＲ，テスト ＋（弱）硝酸塩の
還元 十 脱窒反応 − クエン酸塩の利用 ＋ ７．０チＮａ Ｃ／添加培地での生育 十５０℃での生
育 十 ２０℃での生育 十 糖より酸の産生※（ガス非産生） アドニトール − Ｌ（＋）アラビノース ＋ セロビオース ＋ ヅルシトール − ｍｅｓｏ−エリスリトール − フラクトース ＋ フコース − ガラクトース ＋ グルコース ＋ グリセリン ＋ イノシトール ＋ イヌリン − ラクトース ＋ マルトース ＋ マンニトール ＋ マンノース ＋ フラクトース − メリビオース ＋ ラフィノース ＋ Ｌ（＋）ラムノース ＋ サリシン ＋ Ｌソルボース − ソルビトール ＋ デンプン ＋ サッカロース 士 トレハロース ＋ キシロース ＋ ※基礎培地 （ＮＨ４１２）ＴＰＯ４１、ＯＳ’ ＫＣｌ０．２
９ＭｇＳＯ４７Ｈ２００，２ＳＪ ｙｅａｓｔ ｅｘ
１．Ｏｆ！Ａｇａｒ ８．ＯＳ’ Ｂ
ＴＢ Ｏ，０２ｆＤｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ
１０００ｍ／ ｐＨ７，０利用性テスト（炭素源と
して） Ｄアラニン − Ｌアラニン ＋ フラクトース − プロパノール − エタノ−− エチルアミン − ラフティト ＋ αアミノブチレイト − グルコース ＋ イノシトール − シュークロース ＋ セロビオース − Ｌ（＋）アラビノース − マンノース ＋ マルトース ＋ ラムノース − トレハロース ＋ アセチイト − プロピオネイト ＋ ＤＮＡのシトシングアニン含量（％） ４５．６％
（Ｔｍ法）上記の菌学的性質から、本Ｂ−０８４４菌株
は５０℃で生育でき、端の丸い１つすぐまたはや＼曲っ
た桿菌で、ダラム陽性、芽胞を形成し、糖を発酵的に分
解する細菌であるとの特徴を有する。このような諸性状
を有する本漬の分類学上の位置をＢｅｒｇｅｙ’ ｓ
Ｍａｎｕａｌ ８版、１９７４、医学細菌同定の手引き
２版、１９７４およびＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｈａｎ
ｄｂｏｏｋ。
４２７、 Ｔｈｅｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓを参照
して検討すると、本漬は芽胞を形成し、好気条件で生育
できることからバチルス属に属するものと判定される。
して検討すると、本漬は芽胞を形成し、好気条件で生育
できることからバチルス属に属するものと判定される。
そこで、５０℃で生育できる菌種として、（イ）バチル
ス・コアギユランス、（ロ）バチルス・リケニホルミス
、（ｌバチルス・ズブチリス、に）バチルス・プレビス
および（ホ）バチルス・ステア−サーモフィラスが挙げ
られる。これらの性状を比較対比すると次の辿りである
〔＋；陽性、−；陰性、ｄ；菌株によって反応が異なる
〕 本漬 （イ） ←） ｅう に） （ホ）５０℃での
生育 ＋ ＋＋＋＋＋２０℃での生育
＋ ＋＋＋＋−嫌気での生育 ＋
＋＋−−−プロピオン酸の利用 ＋−＋−−−７
Ｌｌ）食塩培地での生育 ＋−＋＋−−５％食塩培
地での生育 ＋ ＋＋＋−ｄクエン酸塩の利用
＋ ｄ−）−−１−ｄ ｄ以上の比較対比
から、本菌株はバチルス・リケニホルミスとよく一致し
ており、その他の諸性状について比較検討した結果でも
バチルス・リケニホルミスとよく一致した。よって本Ｂ
−０８４４菌株をバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉ
１１ｕｓ １ ｉｃｈ −ｎｉｆｏｒｍｉｓ） Ｂ−
０８４４と同定命名した。なお、本菌株は工業技術院微
生物１秦技術研究所に「微工研菌寄第６８０９号（Ｆ
ＥＢＭＰ−６８０９）Ｊとして寄託さねている。
ス・コアギユランス、（ロ）バチルス・リケニホルミス
、（ｌバチルス・ズブチリス、に）バチルス・プレビス
および（ホ）バチルス・ステア−サーモフィラスが挙げ
られる。これらの性状を比較対比すると次の辿りである
〔＋；陽性、−；陰性、ｄ；菌株によって反応が異なる
〕 本漬 （イ） ←） ｅう に） （ホ）５０℃での
生育 ＋ ＋＋＋＋＋２０℃での生育
＋ ＋＋＋＋−嫌気での生育 ＋
＋＋−−−プロピオン酸の利用 ＋−＋−−−７
Ｌｌ）食塩培地での生育 ＋−＋＋−−５％食塩培
地での生育 ＋ ＋＋＋−ｄクエン酸塩の利用
＋ ｄ−）−−１−ｄ ｄ以上の比較対比
から、本菌株はバチルス・リケニホルミスとよく一致し
ており、その他の諸性状について比較検討した結果でも
バチルス・リケニホルミスとよく一致した。よって本Ｂ
−０８４４菌株をバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉ
１１ｕｓ １ ｉｃｈ −ｎｉｆｏｒｍｉｓ） Ｂ−
０８４４と同定命名した。なお、本菌株は工業技術院微
生物１秦技術研究所に「微工研菌寄第６８０９号（Ｆ
ＥＢＭＰ−６８０９）Ｊとして寄託さねている。
本発明においては、バチルス属に属するＮＡＴ）合成酵
素生産菌としては、上記のバチルス・リケニホルミスＢ
−０８４４はその一例であって、この菌株に限らず、バ
チルス属に属し、Ｎ Ａ Ｉ）合成酵素を生産する菌は
すべて本発明において使用できる。
素生産菌としては、上記のバチルス・リケニホルミスＢ
−０８４４はその一例であって、この菌株に限らず、バ
チルス属に属し、Ｎ Ａ Ｉ）合成酵素を生産する菌は
すべて本発明において使用できる。
本発明は、先ずバチルス属に属するＮＡＤ生産菌を酵素
を生産する通常の方法で培養される。培養の形態は液体
培養でも固体培養でもよいが、工業的には深部通気攪拌
培養を行うのが望ましい。
を生産する通常の方法で培養される。培養の形態は液体
培養でも固体培養でもよいが、工業的には深部通気攪拌
培養を行うのが望ましい。
培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられる
ものが広く使用され得る。炭素源としては同化可能か炭
素化合物であればよく、例えばブドウ糖、ショ糖、乳糖
、麦芽糖、スターチ、デキストリン、糖蜜、廃糖蜜、グ
リセリンなどが挙られる。♀素源としては、利用可能な
窒素化合物であればよ（、例えばコーン、スチープ、リ
カー、大豆粉、綿実粉、小麦グルテン、ペプトン、肉工
キス、酵母エキス、カゼイン加水分解物などが使用され
る。その他リン酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリ
ウム、ナトリウム、亜鉛、鉄、マンガン、ハロゲンなど
の塩類が必要に応じて使用される。
ものが広く使用され得る。炭素源としては同化可能か炭
素化合物であればよく、例えばブドウ糖、ショ糖、乳糖
、麦芽糖、スターチ、デキストリン、糖蜜、廃糖蜜、グ
リセリンなどが挙られる。♀素源としては、利用可能な
窒素化合物であればよ（、例えばコーン、スチープ、リ
カー、大豆粉、綿実粉、小麦グルテン、ペプトン、肉工
キス、酵母エキス、カゼイン加水分解物などが使用され
る。その他リン酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリ
ウム、ナトリウム、亜鉛、鉄、マンガン、ハロゲンなど
の塩類が必要に応じて使用される。
培養温度は、ＮＡＤ合成酵素生産菌が発育し、本酵素を
生産する範囲内で適宜変更し得るが、２６〜５０℃が好
ましい。培養時間は培養条件によって異なるが、通常１
５〜４０時間程度行えばよい。
生産する範囲内で適宜変更し得るが、２６〜５０℃が好
ましい。培養時間は培養条件によって異なるが、通常１
５〜４０時間程度行えばよい。
本酵素が最高力価に達する時期を見計って適当な時期に
培養を終了すればよい。通気攪拌する場合には、２００
〜４０Ｏｒ、ｐ、ｍの条件で充分である。
培養を終了すればよい。通気攪拌する場合には、２００
〜４０Ｏｒ、ｐ、ｍの条件で充分である。
このようにして得られたＮＡＤ合成酵素生産菌の培養物
からＮＡＤ合成酵素を採取するのであるが、本酵素は主
にその菌体内に含有さするので、得られた培養物を濾過
捷たは遠心分離などの手段によυ集菌し、この菌体を超
音波処理、フレンチプレス処理やガラスピース処理など
の機械的破壊手段やリゾチームなどの酵素的破壊手段に
て破壊し、捷た必要に応じてトリトンＸ−１００（Ｔｒ
ｉ ｔｏｎＸ−１００：商品名）、アデカトール５ｏ−
１２０（商品名）などの界面活性剤を添加してもよい。
からＮＡＤ合成酵素を採取するのであるが、本酵素は主
にその菌体内に含有さするので、得られた培養物を濾過
捷たは遠心分離などの手段によυ集菌し、この菌体を超
音波処理、フレンチプレス処理やガラスピース処理など
の機械的破壊手段やリゾチームなどの酵素的破壊手段に
て破壊し、捷た必要に応じてトリトンＸ−１００（Ｔｒ
ｉ ｔｏｎＸ−１００：商品名）、アデカトール５ｏ−
１２０（商品名）などの界面活性剤を添加してもよい。
こうして得られたＮＡＤ合成酵素含有液は、濃縮するか
、または濃縮することなく、可溶性塩類、例えば硫安な
どを用いて塩析するか、親水性有機溶媒、例えばメタノ
ール、エタノール、アセトン、インプロパツールなどを
用いて本酵素を沈澱させればよい。この沈澱物は、水ま
たは緩衝液に溶解稜、必要に応じて半透膜にて透析し、
さらにＤＥＡＥ−セファデックス、ＤＥＡＥ−セファロ
ースやＤＥＡＥ−セルロースなどやカルボキシメチル−
セルロース、カルボキシメチル−セファロース、カルボ
キシメチル−セファデックスなどのイオン交換樹脂を用
いるクロマトグラフィーやセファデックスＧ２００、セ
ファロースＣＬ−６Ｂ、七フアクリル８−２００などの
分子篩剤などのゲル濾過剤を用いるクロマトグラフィー
にて精製せしめ、その後凍結乾燥などの処理により精製
されたＮＡＤ合成酵素を得ることができる。
、または濃縮することなく、可溶性塩類、例えば硫安な
どを用いて塩析するか、親水性有機溶媒、例えばメタノ
ール、エタノール、アセトン、インプロパツールなどを
用いて本酵素を沈澱させればよい。この沈澱物は、水ま
たは緩衝液に溶解稜、必要に応じて半透膜にて透析し、
さらにＤＥＡＥ−セファデックス、ＤＥＡＥ−セファロ
ースやＤＥＡＥ−セルロースなどやカルボキシメチル−
セルロース、カルボキシメチル−セファロース、カルボ
キシメチル−セファデックスなどのイオン交換樹脂を用
いるクロマトグラフィーやセファデックスＧ２００、セ
ファロースＣＬ−６Ｂ、七フアクリル８−２００などの
分子篩剤などのゲル濾過剤を用いるクロマトグラフィー
にて精製せしめ、その後凍結乾燥などの処理により精製
されたＮＡＤ合成酵素を得ることができる。
次に、本発明で得意ＮＡＤ合成酵素の性質について述べ
る。
る。
（］）分子量；約６２０００ （セファデックスＧ−１
５０ゲル濾過による。
５０ゲル濾過による。
（２） 等電点； ｐ Ｈ４，６付近（アンフオライ
トを用いた電気泳動法による） １−ＮＡＤ （４）基質特異性； ＮＨ３以外にＬ−Ｇｉｎ、 Ｌ−
ＡｓｎＡＭＰ＋Ｉ’） ｐｉ＋ＮＡＤ＋Ｇｌｕ （また
はＡｓＰ ）（５）至適ｐＨ 酵素活性測定法の反応液１の緩衝液を酢酸緩１ｊｉ（ｐ
Ｈ８，８〜６．６）、ジメチルグルタル酸−水酸化ナト
リウム緩衝液（ｐＨ５，１〜６．８）およびトリス塩酸
緩衝液（ｐ Ｈ６，５〜８．８）に加えて酵素活性を測
定した結果は第１図の通りである。ｐ Ｈ８，０〜８，
７付近に至適ｐＨを有する。
トを用いた電気泳動法による） １−ＮＡＤ （４）基質特異性； ＮＨ３以外にＬ−Ｇｉｎ、 Ｌ−
ＡｓｎＡＭＰ＋Ｉ’） ｐｉ＋ＮＡＤ＋Ｇｌｕ （また
はＡｓＰ ）（５）至適ｐＨ 酵素活性測定法の反応液１の緩衝液を酢酸緩１ｊｉ（ｐ
Ｈ８，８〜６．６）、ジメチルグルタル酸−水酸化ナト
リウム緩衝液（ｐＨ５，１〜６．８）およびトリス塩酸
緩衝液（ｐ Ｈ６，５〜８．８）に加えて酵素活性を測
定した結果は第１図の通りである。ｐ Ｈ８，０〜８，
７付近に至適ｐＨを有する。
（６） ｐＨ安定性
本酵素を５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐ Ｈ８，９〜６．８
）、ジメチルグルタル酸−水酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
４，１〜７．１）、リン酸緩衝液（ｐＨ６，８〜７．９
）およびトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６，４〜８．９）に溶
解し、８７℃で６０分間処理した後、その残存活性を酵
素活性測定法に従って測定した結果は、第２図の通りで
ある。ｐＨ５，５〜９．０の範囲で安定である。
）、ジメチルグルタル酸−水酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
４，１〜７．１）、リン酸緩衝液（ｐＨ６，８〜７．９
）およびトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６，４〜８．９）に溶
解し、８７℃で６０分間処理した後、その残存活性を酵
素活性測定法に従って測定した結果は、第２図の通りで
ある。ｐＨ５，５〜９．０の範囲で安定である。
（７）熱安定性
５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐ Ｈ６，８）に本酵素を
溶解し、各温度で１０分間加熱処理した後、その残存活
性を酵素活性測定法に従って測定した結果は、第８図の
通シである。４０℃まで安定である。
溶解し、各温度で１０分間加熱処理した後、その残存活
性を酵素活性測定法に従って測定した結果は、第８図の
通シである。４０℃まで安定である。
（８） 界面活性剤の影響
酵素活性測定法において、反応液Ｉに第１表に記載の界
面活性剤を０．１チになるよう添加し、８７℃に加温稜
、酵素液５μｌを添加し、８７°Ｃで１０分間反応後、
０．８ＷＩ／の反応液■を加え、８７℃で正確に５分間
反応させた後、Ｏ，ＩＮ塩酸２．０鮮を加えてサイクリ
ング反応を停止し、５５０ｎｍで比色定量した。その結
果は第１表の通シである。非イオン性界面活性剤では影
響を受けなかったが、カチオンおよびアニオン界面活性
剤により阻害された。
面活性剤を０．１チになるよう添加し、８７℃に加温稜
、酵素液５μｌを添加し、８７°Ｃで１０分間反応後、
０．８ＷＩ／の反応液■を加え、８７℃で正確に５分間
反応させた後、Ｏ，ＩＮ塩酸２．０鮮を加えてサイクリ
ング反応を停止し、５５０ｎｍで比色定量した。その結
果は第１表の通シである。非イオン性界面活性剤では影
響を受けなかったが、カチオンおよびアニオン界面活性
剤により阻害された。
第 １ 表
（９） 金属イオンの影響
酵素活性測定法において反応液）（２０ｍＭＭｇＣ１，
含有）に最終濃度１ ｍｌになるように各種金属塩を添
加した後、酵素活性測定法に従って、そのときの酵素活
性を相対活性で示すと第２表の通りである。
含有）に最終濃度１ ｍｌになるように各種金属塩を添
加した後、酵素活性測定法に従って、そのときの酵素活
性を相対活性で示すと第２表の通りである。
第２表
■ 酵素活性測定法
活性測定法
反応液■
反応液■
反応液１０，２ｍＪを小試験管にとり、８７℃に加温後
酵素液５μｌを添加し、８７℃で正確に１ｏ分間反応を
行い、０．８ｍｌの反応液■を添加し、反応を停止する
とともにサイクリング反応を開始した。
酵素液５μｌを添加し、８７℃で正確に１ｏ分間反応を
行い、０．８ｍｌの反応液■を添加し、反応を停止する
とともにサイクリング反応を開始した。
サイクリング反応は３７℃で正確に５分間行い、０．１
ＮＨＣＪ ２．Ｏｍを添加によりサイクリング反応を停
市後５５０ｎｍにおける吸光度を測定してそのときの値
より酵素活性を求めた。なお活性の計算式は次の式に順
じた。１ △Ａ３５ｏ：検体の吸光度 ０．００５ ：検
体量（ｍｌ）△５５５０：標準液の吸光度（０，１ｍＭ
ＮＡＤ）１０：反応時間 ｆ：稀釈培率次
に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これに
より本発明を限定するものではかい。
ＮＨＣＪ ２．Ｏｍを添加によりサイクリング反応を停
市後５５０ｎｍにおける吸光度を測定してそのときの値
より酵素活性を求めた。なお活性の計算式は次の式に順
じた。１ △Ａ３５ｏ：検体の吸光度 ０．００５ ：検
体量（ｍｌ）△５５５０：標準液の吸光度（０，１ｍＭ
ＮＡＤ）１０：反応時間 ｆ：稀釈培率次
に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これに
より本発明を限定するものではかい。
実施例 １
８０１容ジヤーにペプトン１％、肉エキス１チ、酵母エ
キス０．２チ、ＮａＣ１０，８係を含む液体培地（ｐＨ
７，８）２０１を仕込み、１２０℃２０分間滅菌後、上
記と同一組成の培地で予備培養した種菌２００ｍ１を接
種し、５０℃で１６時間通気量２０１／１Ｔ′Ｉｉｎ攪
拌速度８００ ｒｐｍ ／ｍｉ ｎで通気培養した。培
養後遠心分離にて菌体を集め、集めた菌体を０．１係の
リゾチームを含有する１ ０ ｍ Ｍ Ｔｒ １ｓ−Ｈ
Ｃ１緩衝液（ｐＨ８，０）２１に分散させ、３７℃で３
０分間反応を行い溶菌した。この液を５００Ｏｒ、 ｐ
ｏｍｌ。
キス０．２チ、ＮａＣ１０，８係を含む液体培地（ｐＨ
７，８）２０１を仕込み、１２０℃２０分間滅菌後、上
記と同一組成の培地で予備培養した種菌２００ｍ１を接
種し、５０℃で１６時間通気量２０１／１Ｔ′Ｉｉｎ攪
拌速度８００ ｒｐｍ ／ｍｉ ｎで通気培養した。培
養後遠心分離にて菌体を集め、集めた菌体を０．１係の
リゾチームを含有する１ ０ ｍ Ｍ Ｔｒ １ｓ−Ｈ
Ｃ１緩衝液（ｐＨ８，０）２１に分散させ、３７℃で３
０分間反応を行い溶菌した。この液を５００Ｏｒ、 ｐ
ｏｍｌ。
分間遠心し、上清液１．９１を得た。この上清液に硫安
を添加し、硫安分画（０，４４〜０．５４飽和）を行い
、この沈澱を１０ｍＭ）リスーＨＣ１緩衝液２００１Ｒ
７！に溶解（４７８ＵＩ Ｌ、この緩衝液１２ｄに対し
て透析した。この透析物中に生じた不溶物を遠心分離（
１２０００ｒ、 ｐ、ｍ、 １０分間）にて除去した。
を添加し、硫安分画（０，４４〜０．５４飽和）を行い
、この沈澱を１０ｍＭ）リスーＨＣ１緩衝液２００１Ｒ
７！に溶解（４７８ＵＩ Ｌ、この緩衝液１２ｄに対し
て透析した。この透析物中に生じた不溶物を遠心分離（
１２０００ｒ、 ｐ、ｍ、 １０分間）にて除去した。
上清液（４６２０）を１０ ｍ Ｍ ）リスーＨＣ１緩
衝液ｐ Ｈ８，０で緩衝化したＤＥＡＥ−セファロース
ＣＬ−６Ｂカラム（５ｘ８０ ｃｍ）にチ’ｒ−ジ１、
．０〜０．５ＭＮａ（Ｊの濃度勾配法にて溶出した。
衝液ｐ Ｈ８，０で緩衝化したＤＥＡＥ−セファロース
ＣＬ−６Ｂカラム（５ｘ８０ ｃｍ）にチ’ｒ−ジ１、
．０〜０．５ＭＮａ（Ｊの濃度勾配法にて溶出した。
０．１５〜０．２ Ｍ ＮａＣ１１で溶出される両分を
集め（１２０罷／、８８８Ｕ）アミコン社製限外濾過膜
Ｐ Ｍ−１０を用い濃縮した後、セファデックスＧ
１５０（８，６ｘ ８０ｃｙ）にて精製を行い、その活
性画分を集め、精製標品（８６ｍｌ、８２４Ｕ）とした
。また、この標品に各々牛血清アルブミン、グルコース
、マルトース、マンニトール、シュクロース、果糖を１
チになるように添加し、凍結乾燥した。
集め（１２０罷／、８８８Ｕ）アミコン社製限外濾過膜
Ｐ Ｍ−１０を用い濃縮した後、セファデックスＧ
１５０（８，６ｘ ８０ｃｙ）にて精製を行い、その活
性画分を集め、精製標品（８６ｍｌ、８２４Ｕ）とした
。また、この標品に各々牛血清アルブミン、グルコース
、マルトース、マンニトール、シュクロース、果糖を１
チになるように添加し、凍結乾燥した。
無添加のものは活性収率８６％であったが、添加した−
ものはまったく活性の低下が見られず安定であった。
ものはまったく活性の低下が見られず安定であった。
実施例 ２
反応ＷＩ
５０ｍＭ ）リス−ＨＣｌ 緩衝液 ｐＨ８，０２
０ｍＭ ＫＣｌ ２０ｍＭ ＭｇＣ１ｔ ０．０５チ 牛血清アルブミン １ｍＭ デアミ／−ＮＡＤ ５０ｍＭ （ＮＨ４）、８０４ ４００ｍＵ ＮＡＤ−合成酵素／１ 反応液■ ５０ｍＭ）すＸ−ＨＣｌ 緩衝液（ｐＨ８，０＋２０
Ｕ ジアホラーゼ／ｍ１ ８％ エタノール ２０Ｕ アルコールデヒドロゲナーゼ／ｍ１０．０５
％ ＮＴＢ Ｏ，１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００反応液ｉｏ
、２ｍ／を小試験管にとシ８７℃に加温後０，５，１０
，２０，８０．４０μＭのＡＴＰ溶液をそれぞれ５μｌ
を添加し、８７℃で１０分間反応した後、反応液■を０
．８ｄ添加し、８７℃で正確に５分間反応したのち、０
．ｌＮＨＣｌ ２．ＯｍＡ’を加えて反応を停止し、５
５０ｎｍで吸光度測定ｌ〜た。
０ｍＭ ＫＣｌ ２０ｍＭ ＭｇＣ１ｔ ０．０５チ 牛血清アルブミン １ｍＭ デアミ／−ＮＡＤ ５０ｍＭ （ＮＨ４）、８０４ ４００ｍＵ ＮＡＤ−合成酵素／１ 反応液■ ５０ｍＭ）すＸ−ＨＣｌ 緩衝液（ｐＨ８，０＋２０
Ｕ ジアホラーゼ／ｍ１ ８％ エタノール ２０Ｕ アルコールデヒドロゲナーゼ／ｍ１０．０５
％ ＮＴＢ Ｏ，１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００反応液ｉｏ
、２ｍ／を小試験管にとシ８７℃に加温後０，５，１０
，２０，８０．４０μＭのＡＴＰ溶液をそれぞれ５μｌ
を添加し、８７℃で１０分間反応した後、反応液■を０
．８ｄ添加し、８７℃で正確に５分間反応したのち、０
．ｌＮＨＣｌ ２．ＯｍＡ’を加えて反応を停止し、５
５０ｎｍで吸光度測定ｌ〜た。
その結果は第４図に示す通りで良好な直線性が得られた
１、また本反応におけるサイクリング率は約４８００回
転／時であった。
１、また本反応におけるサイクリング率は約４８００回
転／時であった。
実施例 ８
実施例２に示した反応液Ｉと反応液■を等量ずつ混合し
、８７℃に加温する。この混合物１．Ｏｎ７！を３７℃
にセットされた分光光度計の石英セル（１，０ｍｌ用）
にとり、実施例１に用いたのと同濃度ＡＴＰ溶液５μｌ
を添加し、添加後５分から７分目捷での２分間の吸光度
変化を５５０ｎｍで測定した。
、８７℃に加温する。この混合物１．Ｏｎ７！を３７℃
にセットされた分光光度計の石英セル（１，０ｍｌ用）
にとり、実施例１に用いたのと同濃度ＡＴＰ溶液５μｌ
を添加し、添加後５分から７分目捷での２分間の吸光度
変化を５５０ｎｍで測定した。
その結果は第５図に示す通りでキネティクス法において
も高感度で良好な直線性が得られた。このときの回転率
は約２８００回転／時であった。
も高感度で良好な直線性が得られた。このときの回転率
は約２８００回転／時であった。
実施例 ４
実施例２に示［また反応液１９５０ｍＭ硫安の代シに５
ｍＭＡＴＰを添加した反応液に各種濃度の硫安、Ｌ−グ
ルタミン、Ｌ−アスパラギンを添加し、実施例２と同じ
操作を行った。その結果は第６図に示す通りで硫安、Ｌ
−グルタミン、Ｌ−アスパラギンと共に良好な直線性が
得られた。
ｍＭＡＴＰを添加した反応液に各種濃度の硫安、Ｌ−グ
ルタミン、Ｌ−アスパラギンを添加し、実施例２と同じ
操作を行った。その結果は第６図に示す通りで硫安、Ｌ
−グルタミン、Ｌ−アスパラギンと共に良好な直線性が
得られた。
０−○：硫安、・−・： Ｌ−１’ルタミン、△−△：
Ｌ−アスパラギン。
Ｌ−アスパラギン。
第１図はバチルス・リケンホルミスＢ−０８４４の産生
ずるＮＡＤ合成酵素の至適ｐＨ曲線、第２図は同酵素の
ｐＨ安定曲線、第８図は同酵素の熱安定性向ＩＩＪを示
し、第４図は本発明におけるエンドポイント法によるＡ
ＴＰの定量曲線、第５図はキネティクス法によるＡＴＰ
の定量曲線、第６図はエンドポイント法によるＬ−グル
タミンおよびＬ−アスパラギンの定量曲線を示すもので
ある。 ｂｌ − キー １ ・ｏ４ （％）毒ヤ憂ξ千で口字 ・０４く◇ （％）制御昭狡口Ｙ
ずるＮＡＤ合成酵素の至適ｐＨ曲線、第２図は同酵素の
ｐＨ安定曲線、第８図は同酵素の熱安定性向ＩＩＪを示
し、第４図は本発明におけるエンドポイント法によるＡ
ＴＰの定量曲線、第５図はキネティクス法によるＡＴＰ
の定量曲線、第６図はエンドポイント法によるＬ−グル
タミンおよびＬ−アスパラギンの定量曲線を示すもので
ある。 ｂｌ − キー １ ・ｏ４ （％）毒ヤ憂ξ千で口字 ・０４く◇ （％）制御昭狡口Ｙ
Claims (9)
- （１）被検液中のＡＴＰ、デアミド−ＮＡＤおよびアミ
ド供与体のいずれか１つを測定するに当シ、被検液にＡ
ＴＰ、デアミド−ＮＡＤ、アミド供与体およびＭｇ＋の
存在下ＮＡＤ合成酵素を作用させる主反応を行い、主反
応により生成したＮＡＤを、ＮＡＤを補酵素とする酸化
還元反応系と還元型ＮＡＤを補酵素とする酸化還元反応
系との組合せによって補酵素サイクリング反応を行い、
そのサイクリング反応により消費または生成された成分
を定量することを特徴とするＡＴＰ、デアミド−ＮＡＤ
およびアミド供与体のいずれか１つを含有する被検液中
の成分の測定法。 - （２）ＡＴＰが次の酵素反応系によって生成されるＡＴ
Ｐである特許請求の範囲第１項記載の測定法。 （ａ）クレアチンキナーゼ クレアチン＋ＡＴＰ 還元剤；β−メルカプトエタノール、還元型グルタチオ
ン、システィン、Ｎ−アセチ ルシスティン、ジチオスレイトール （ｂ）ピルベートキナーゼ ホスホエノールピルビン酸＋ＡＤＰ− （Ｃ）アセテートキナーゼ アセチルホスフェート＋ＡＤＰ− Ｍｇ＋またはＭｎ廿 酢酸＋ＡＴＰ （ｄ）カルバメートキナーゼ ＮＨ３＋ｃｏ２＋Ａ Ｔ Ｐ Ｌ−アスパラギン酸十ＡＴＰ （０ホスホグリセレイトキナーゼ １，８ジホスホーＤ−グリセレイト＋ＡＤＰ−ト ＋Ａ
ＴＰ 倹）アルギニンキナーゼ Ｌ−アルギニン＋ＡＴＰ - （３） アミド供与体が、ＮＨ３、Ｌ−グルタミンま
たはＬ−アスパラギンである特許請求の範囲第１項記載
の測定法。 - （４） ＮＨ３がアンモニウム塩または次の酵素反応
によって生成されるＮＨ，である特許請求の範囲第３項
記載の測定法。 （ａ）ニコチンアミダーゼ ニコチンアミド＋Ｈ，０−）ニコチン酸＋ＮＨ３＋Ｈ”
（Ｉ））グルタミニルーペプチド−グルタミナーゼＬ−
グルタミニルーペブチドーＨ２０ Ｌ−グルタミル−ペプチド＋ＮＨ３ （Ｃ）アルギニンデアミナーゼ ■、−アルギニン＋１■９０→シトルニン＋ＮＨ３＋耐
（ｄ）グアニンデアミナーゼ グアニン＋Ｈ２ｏ→キサンチン＋ＮＨ３−１−Ｈ”（ｅ
）アデノシンデアミナーゼ アデノシン十Ｈ２０→イノシン十ＮＨ３−１−Ｈ”（０
クレアチニンデアミナーゼ クレアチニン→−Ｔ−１２０−全Ｎ−メチルヒダントイ
ン十ＮＨ３−１−Ｈ＋ （ｇ）スレオニンデヒドラターゼ Ｌ−スレオニン＋Ｈ２０−） ２−オキソ酪酸子ＣＯ□
＋ＮＨ３−１−Ｈ“ 山）アスパラギン酸アンモニア−リアーゼＬ−アスパラ
ギン酸→フマルＭ ＋ ＮＨ３＋Ｈ＋（ｉ）Ｌ−メチオ
ニンγ−リアーゼ Ｌ−メチオニン＋Ｉ］２０→２−オキソ酪酸子ＣＨ，Ｓ
Ｈ＋ＮＨ３＋Ｈ＋ （ｊ）メチルアミノ−グルタミン酸メチルトランスフェ
ラーゼＮ−メチルグルタミン酸＋Ｎｌ−ｌ３＋Ｈ＋４二
ぜグルタミン酸＋メチルアミン - （５）Ｌ−グルタミンが次の酵素反応によって消費また
は生成されるＬ−グルタミンである特許請求の範囲第８
項記載の測定法。 （ａ）グルタミン酸シンターゼ（フェレドキシン）Ｌ−
グルタミン＋２−オキソグルタミン酸＋２−還元型フェ
レドキシン→２− Ｌ −り＃ ｐ ミン酸＋２−酸化
型フニレトキシン （ｂ）グルタミントランスアミナーゼ Ｌ−グルタミン＋２−オキシ酸→２−オキソグルタミン
酸＋Ｌ−アミノ酸 （Ｃ）カルバモイル−ホスフェートシンターゼＬ−グル
タミン＋ＨＣＯ，−＋２ＡＴＰ＋Ｈ２０−〉カルバモイ
ル−ホスフェ−）＋２ＡＤＰ＋ｐｉ＋Ｌ−グルタミン酸 （ｄ）ヘキソーズホスフェートアミントランスフェラー
ゼＤ−７ラクトースー６−ホスフエート＋Ｌ−グルタミ
ン−令２−アミノー２−デオキシーＤ−グルコース−６
−ホスフエート＋Ｌ−グルタミン酸 （ｅ）グルタミンーシローイノソーズミノトランスフェ
ラーゼ２−オキソグルタミン酸＋１−アミノ−１−デオ
キシ−ジローイノシト−オー〉Ｌ−グルタミン＋２．４
，６／８，５−ペンタデヒドロキシシクロヘキサノン - （６） ＮＡＤ合成酵素がエッシェリヒア・コリ由来ま
たはバチルス属に属するＮＡＤ合成酵素生産菌由来の酵
素である特許請求の範囲第１項記載の測定法。 - （７）バチルス属に属するＮＡＤ合成酵素生産菌がバチ
ルス・リケニホルミスＢ −０８４４（ＦＥＲＭＰ−６
８０９）である特許請求の範囲第６項記載の測定法。 - （８）ＮＡＤを補酵素とする酸什還元反応系がＮＡＤを
消費して還元型ＮＡＤを生成するデヒドロゲナーゼおよ
びその基質による酵素反応系である特許請求の範囲第１
項記載の測定法、 - （９） デヒドロゲナーゼおよびその基質が、ラクテ
ートデヒドロゲナーゼおよびＬ−ラクテート、アルコー
ルデヒドロゲナーゼおよびエタノール、グリセロールデ
ヒドロゲナーゼおよびグリセロール、グリセロール−３
−ホスフエートデヒドロゲナーゼおよびグリ七ロールー
８−ホスフェート、グルコースデヒドロゲナーゼおよび
グルコース、マレートデヒドロゲナーゼおよびＬ−マレ
ート、グルタメートデヒドロゲナーゼおよびＬ−グルタ
ノート、８−α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナー
ゼおよび８−α−ヒドロキシステロイドのいずれかであ
る特許請求の範囲第８項記載の測定法。 Ｍ 還元型ＮＡＤを補酵素とする酸化還元反応系が、還
元型ＮＡＤを消費してＮＡＤＩ生成する酸化還元酵素お
よびその基質による酵素反応系である特許請求の範囲第
１項記載の測定法。 ０１） 酸化還元酵素およびその基質が、ラクテート
デヒドロゲナーゼおよびピルビン酸、アルコールデヒド
ロゲナーゼおよびアセトアルデヒド、グリセロールデヒ
ドロゲナーゼおよびジヒドロキシアセトン、グリセロー
ル−８−ホスフェートデヒドロゲナーゼおよびジヒドロ
キシアセトンホスフェート、マレートデヒドロゲナーゼ
およびオギザロ酢酸、８−α−ヒドロキシステロイドデ
ヒドロゲナーゼおよび８−ケトステロイドのいずれかで
ある特許請求の範囲第１０項記載の測定法。 ａ２ 酸化還元酵素およびその基質が還元型ＮＡＤ：
受容体酸化還元酵素およびその受容体である特許請求の
範囲第１０項記載の測定法。 （１３１還元型ＮＡＤ：受容体酸化還元酵素およびその
受容体が還元型ＮＡＤデヒドロゲナーゼおよびフラビン
類、キノン類、２，６−シクロロフエノールインドフエ
ノール、フェリシアン化塩、テトラゾリウム塩、チトク
ロームａｔたは酸素である特許請求の範囲第１２項記載
の測定法。 Ｑ４１ 酸化還元酵素およびその基質がジアホラーゼ
およびテトラゾリウム塩である特許請求の範囲第１０項
記載の測定法。 ０９ 還元型ＮＡＤを補酵素とする酸化還元反応系が
、電子伝達物質およびテトラゾリウム塩による反応系で
ある特許請求の範囲第１項記載の測定法 α６）電子伝達物質がフェナジン−メタサルフェート、
メルドーラ・ブルーまたはピロシアニンである特許請求
の範囲第１５項記載の測定法。 ａη サイクリング反応において、界面活性剤を添加す
ることからなる特許請求の範囲第１８項記載の測定法。 舖 界面活性剤が非イオン系界面活性剤である特許請求
の範囲第１７項記載の測定法。 ａｌ バチルス属に属するＮＡＤ合成酵素生産菌を培
地に培養し、その培養物からＮＡＤ合成酵素を採取する
ことを特徴とするＮＡＤ合成酵素の製造法。 ［ＮＡＤ合成酵素生産菌がバチルス・リケニホルミスＢ
−０８４４（ＦＥＢＭＰ−６８０９）である特許請求の
範囲第１９項記載の製造法。
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| DE3415436A DE3415436C2 (de) | 1983-04-25 | 1984-04-25 | Assay-Verfahren unter Verwendung von NAD-Synthetase |
| US06/603,710 US4767712A (en) | 1983-04-25 | 1984-04-25 | Assay method using nad synthetase and a process for production of the enzyme |
| JP1312574A JPH02200179A (ja) | 1983-04-25 | 1989-12-01 | Ｎａｄ合成酵素の製造法 |
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- 1984-04-25 FR FR8406496A patent/FR2545504B1/fr not_active Expired
- 1984-04-25 US US06/603,710 patent/US4767712A/en not_active Expired - Lifetime
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