DE3415436A1 - Assay-verfahren unter verwendung von nad-synthetase und ein verfahren zur herstellung des enzyms - Google Patents
Assay-verfahren unter verwendung von nad-synthetase und ein verfahren zur herstellung des enzymsInfo
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Abstract
Es wird ein Assay-Verfahren für eine Komponente in einer Probe, welche irgendeine der Verbindungen ATP, Deamid-NAD und/oder einen Amiddonor enthält, beschrieben. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man gemäß der Hauptreaktionsstufe die Probe mit NAD-Synthetase in Anwesenheit von ATP, Deamid-NAD, Amiddonor und Mg++ zur Erzeugung von NAD inkubiert, gemäß der Coenzymkreislauf-Reaktionsstufe die Coenzymkreislaufreaktion durchführt, indem man das Oxidations-Reduktions-Reaktionssystem mit Coenzym NAD kombiniert und das Oxidations-Reduktions-System mit coenzymreduzierter NAD kombiniert und die bei der Kreislaufreaktion verbrauchte oder erzeugte Komponente mißt. Weiterhin wird ein Verfahren zur Erzeugung von NAD-Synthetase, bei dem man einen NAD-Synthetase erzeugenden Mikroorganismus, der zum Genus Bacillus gehört, in einem Medium züchtet und NAD-Synthetase daraus isoliert, beschrieben.
Description
BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft ein Assay-Verfahren unter Verwendung von NAD-Synthetase und ein Verfahren zur Herstellung dieses
Enzyms. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Assay-Verfahren für eine Komponente oder einen Bestandteil in einer
Probe, welche irgendeine der Substanzen ATP, Deamid-NAD und einen Amiddonor enthält, welches dadurch gekennzeichnet ist,
daß man als Hauptreaktionsstufe die Probe, welche ATP, Deamid-NAD und/oder den Amiddonor, wie NH3, L-Glutamin (im
folgenden als L-GIn bezeichnet) oder L-Asparagin (im folgenden als L-Asn bezeichnet), enthält, mit NAD-Synthetase in
Anwesenheit von ATP, Deamid-NAD, des Amiddonors und Mg unter Bildung von NAD inkubiert, die Coenzymkreislaufreaktion
bzw. die cyclische Coenzymreaktion durchführt, indem man das Oxidations-Reduktions-Reaktionssystem mit Coenzym NAD
und das Oxidations-Reduktions-Reaktionssystem mit coenzymreduzierter
NAD kombiniert, und die bei dieser Kreislaufreaktion verbrauchte oder erzeugte Komponente mißt.
Es ist bekannt, daß NAD-Synthetase in Rattenleber [J. Biol.
Chem., 2^3, 493 - 500 (1958)], Schweineleber [ibid., 236,
525 - 530 (1961)], Hefe [ibid., 2A1_, 4794 - 4802 (1972)]
und E. coli [ibid., _23_6, 1494 - 1497 (1961) und _2_4_2, 385 392
(1967)] vorkommt.
Die genannte NAD-Synthetase wird als NAD-Synthetase (EC 6.3.1.5), welche die Reaktion:
ATP + Deamid-NAD + NH3 ^-—>
AMP + PPi + NAD
katalysiert, und NAD-Synthetase (EC 6.3.5.1), welche die Reaktion:
ATP + Deamid-NAD + Gin + H3O ^-—>
AMP + PPi + NAD +
L-Glutamat
katalysiert, klassifiziert. Diese NAD-Synthetase verbraucht
NH., oder das Amid von L-GIn und kann durch die Inhibitorwirkung von Azaserin differenziert werden.
Es wird ein Assay-Verfahren von NAD-Synthetase beschrieben,
bei dem die erzeugte NAD durch Alkoholdehydrogenase (EC 1.1.1) reduziert wird, und die Absorption der erzeugten reduzierten
NAD (im folgenden als NADH bezeichnet) wird spektrophotometrisch
bei 340 nm gemessen, oder die erzeugte NAD wird durch Fluorometrie gemessen. Jedoch können ATP, Deamid-NAD,
NH^ oder L-GIn wegen der niedrigen Empfindlichkeit der Enzymaktivität
nach dem bekannten Verfahren nicht gemessen werden.
Es wurde gefunden, daß die verbrauchte oder erzeugte Komponente mittels eines verstärkten Reaktionssystems gemessen
werden kann, bei dem eine Coenzymkreislaufreaktion abläuft, indem man das Oxidations-Reduktions-Reaktionssystem mit
erzeugter NAD als Coenzym aus der NAD-Synthetase-Reaktion oben mit dem Oxidations-Reduktions-Reaktionssystem mit NADH
als Coenzym kombiniert.
Die vorliegende Erfindung beruht auf dieser Erkenntnis, und sie betrifft ein Assay-Verfahren (oder Analyseverfahren;
diese Ausdrücke werden synonym verwendet) einer Komponente in einer Probe, die irgendeine Verbindung von ATP, Deamid-NAD
und Amiddonor enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Probe mit NAD-Synthetase in Anwesenheit von ATP,
Deamid-NAD, einem Amiddonor und Mg zur Erzeugung von NAD 0 inkubiert, die Coenzymkreislaufreaktion durchführt, indem
man das Oxidations-Reduktions-Reaktionssystem mit Coenzym NAD und das Oxidations-Reduktions-Reaktionssystem mit Coenzym
NADH kombiniert und die verbrauchte oder erzeugte Komponente in dem Kreislaufsystem mißt.
Das erfindungsgemäße Reaktionssystem kann wie folgt zusammengefaßt
werden.
(1) Hauptreaktionssystem:
5
5
Unter Verwendung von NH3 als Amiddonor:
Mg + +
ATP + Deamid-NAD + NH3 AMP + PPi + NAD
10 Unter Verwendung von L-GIn oder L-Asn als Amiddonor:
ATP + Deamid-NAD + L-GIn (L-Asn) + HnO
AMP + PPi + GIu (Asp) + NAD
15 'NAD-Synthetase
(2) Coenzymkreislauf-Reaktionssystem:
(a) Oxidations-Reduktions-Reaktionssystem mit Coenzym
20 NAD:
NAD + S1 NADH + P1
(b) Transferreaktionssystem mit Coenzym NADH:
25 NADH + S0 NAD + P0
2 E2 2
worin
NH-. ein monovalentes Ammoniumion von Ammoniak bedeutet
30 bzw. enthält;
E1 Dehydrogenase bedeutet, welche eine Reaktion katalysiert,
bei der Substrate NAD und S. verbraucht werden und NADH und P. erzeugt werden;
E0 ein aktives Substrat bedeutet, welches eine Reaktion
35 katalysiert, bei der NADH und S2 verbraucht und NAD
und P2 erzeugt werden;
51 ein reduziertes Substrat in E1 bedeutet;
52 ein oxidiertes Substrat in E„ bedeutet;
P1 Oxidationsprodukt von S1 bedeutet; und
P„ Reduktionsprodukt von S„ bedeutet.
Eine Reaktion, bei der NH-. verbraucht wird, wird wie folgt
erläutert.
Deamid - NAD 4- NH3
ATP
ATP
PP i +AMP
NAD- Synthetase
Ein Beispiel für eine Probe enthält mindestens das Substrat des Hauptreaktionssystems, wie oben erwähnt, d.h. ATP, Deamid-NAD
oder einen Amiddonor, beispielsweise eine Probe, die zuvor die eine Komponente des Substrats enthält, oder
eine Probe, die das Substrat enthält, welches durch das andere Enzymreaktionssystem erzeugt oder verbraucht wird.
Ein bevorzugtes Beispiel für das obige Enzymreaktionssystem ist ein Reaktionssystem, welches ATP, NH-. oder einen Amiddonor
von L-GIn oder L-Asn verbraucht oder erzeugt, ohne die verwandten Coenzyme NAD und NADH, zum Beispiel die folgenden,
die jedoch keine Beschränkung sein sollen.
(1) Enzymatisehes Reaktionssystem, welches ATP erzeugt:
1. Creatinkinase (EC 2.7.3.2):
Creatinphosphat + ADP Creatin + ATP
Mg
Reduktionsmittel: ß-Mercaptoethanol, reduziertes
Glutathion, Cystein, N-Acetylcystein, Dithiothreit etc.
2. Pyruvatkinase (EC 2.7.1.40):
Phosphoenolpyruvat + ADP ^2
oder Mg , K
Pyruvat + ATP 10
3. Acetatkinase (EC 2.7.2.1):
Acetylphosphat + ADP ^2 ^ Acetat + ATP
4. Carbamatkinase (EC 2.7.2.2):
Carbamoylphosphat + ADP ^-—^ NH3 + CO3 + ATP
5. Aspartatkinase (EC 2.7.2.4):
4-Phospho-L-aspartat + ADP ^2 ^ L-Aspartat + ATP
6. Phosphoglyceratkinase (EC 2.7.2.3): 1,3-Diphospho-D-glycerat + ADP ^ >
3-Phospho-D-glycerat + ATP 7. Argininkinase (EC 2.7.3.3):
Argininphosphat + ADP ^ ^ l-Arginin + ATP
(2) Enzymatisches Reaktionssystem, welches Ammonium erzeugende
wasserlösliche Ammoniumsalze oder NH3 verbraucht bzw. bei dem diese verwendet werden:
1. Beispiele für wasserlösliche Ammoniumsalze sind anorganische
oder organische Ammoniumsalze, welche Ammoniumionen erzeugen, wie Ammoniumchlorid, wäßriger Ammoniak,
Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat, Ammoniumeitrat etc.
2. Nicotinamidase (EC 3.5.1.19):
Nicotinamid + H3O —>
Nicotinat + NH3 + H+
3. Glutamylpeptidglutaminase (EC 3.5.1.44):
L-Glutaminylpeptid + H3O —>
L-Glutamylpeptid + NH3
4. Arginindeaminase (EC 3.5.3.6):
L-Arginin + H3O —> Citrullin + NH3 + H+
L-Arginin + H3O —> Citrullin + NH3 + H+
5. Guanidindeaminase (EC 3.5.4.3):
Guanin + H3O —> Xanthin + NH3 + H+
Guanin + H3O —> Xanthin + NH3 + H+
6. Adenosindeaminase (EC 3.5.4.4):
Adenosin + H-O —> Inosin + NH3 + H
7. Creatinindeaminase (EC 3.5.4.21):
Creatinin + H3O —>
N-Methylhydantoin + NH3 + H+
8. Threonindehydratase (EC 4.2.1.16):
L-Threonin + H3O —>
2-Oxobutyrat + CO3 + NH3 + H+
9. Aspartatammoniumliase (EC 4.3.1.1):
L-Aspartat —> Fumarat + NH3 + H+
30
10. L-Methionin-Y-liase (EC 4.4.1.11):
L-Methionin + H3O —>
2-Oxobutyrat + Methanthiol
+ NH3 + H+
11. Methylaminoglutamatmethyltransferase (EC 2.1.1.21):
N-Methylglutamat + NH., + H —* Glutamat + Methylamin
(3) Enzymatisches Reaktionssystem, bei dem L-Gln verwendet
wird:
1. Glutamintransaminase (EC 2.6.1.15):
5 L-GIn + 2-Oxysäure —>
2-Oxoglutamat + L-Aminosäure
2. Carbamoylphosphatsynthetase (EC 6.3.5.5):
L-GIn + HCOl + 2 ATP + H„0 —>
Carbamoylphosphat
+ 2 ADP + Pi + L-glutamat 10
3. Hexosephosphataminotransferase (EC 5.3.1.19):
D-Fructose-6-phosphat + L-GIn —>
2-Amino-2-deoxy-
D-glucose-6-phosphat + L-Glutamat
15 4. Glutaminscylloinososeaminotransferase (EC 2.6.1.50):
2-Oxoglutaramat + 1-Amino-1-deoxyscylloinosit
L-GIn + 2,4,6/3,5-Pentahydroxycyclohexanon
(5) Enzymatisches Reaktionssystem, bei dem L-Asn verwendet
20 wird:
1. Asparagintransaminase (EC 2.6.1.14); L-Asn + 2-Oxysäure -r>
2-Oxosuccinat + L-Aminosäure
25 2. 3-Cyanoalaninhydratase (EC 4.2.1.65): 3-Cyanoalanin + H~O —>
L-Asn
Wie oben gezeigt wurde, kann nach der vorliegenden Erfindung nicht nur das Reaktionsgemisch, welches ATP, NH.,, L-GIn
30 oder L-Asn enthält, das in dem erläuterten enzymatischen Reaktionssystem verbraucht oder erzeugt wird, sondern auch das
Reaktionsgemisch zum Messen der enzymatischen Aktivität, welches in dem enzymatischen Reaktionssystem verwendet wird,
verbrauchtes Substrat oder erzeugtes Produkt, als zu analy-
35 sierende Probe verwendet werden.
• J? ■»· Λ fl *■ * β
* · · # *
In diesen enzymatischen Reaktionssystemen wird ATP, NH3,
L-GIn oder L-Asn analysiert, um die enzymatische Aktivität
in dem enzymatischen Reaktionssystem zu bestimmen oder um irgendeine der darin enthaltenen Komponenten zu messen.
Die Substanz bzw. Substanzen, ausgenommen die zu analysierende Komponente, wird bzw. werden in einer konstanten bzw.
abgewogenen Menge als Reagenz zugegeben. Die Menge an Probe oder Reagenz kann in Abhängigkeit vom Ziel und von den Bedingungen
variiert werden. Im allgemeinen läuft die Reaktion bei 37°C während mindestens einer Minute ab.
Bevorzugte NAD-Synthetase, die bei der vorliegenden Erfindung
verwendet wird, ist ein sich von Mikroorganismen, wie Escherichia coli oder Bacillus licheniformis ableitendes
Enzym, wegen der Stabilität als Enzym für die Diagnose. Besonders bevorzugt wird das Enzym von Bacillus licheniformis
B-O844 verwendet, welches von der Anmelderin gefunden wurde.
Die obige NAD-Synthetase katalysiert die Reaktion:
ATP + Deamid-NAD + NH.,
amp + ppi + NAD oder
J C
ATP + Deamid-NAD + L-GIn (oder L-Asn) AMP + PPi
+ GIu (oder Asp) + NAD 25
worin GIu L-Glutamat und Asp L-Aspartat bedeuten. Bei der
Hauptreaktion werden die Probe, welche eins von ATP, Deamid-NAD, NH-. oder einen Amiddonor, wie L-GIn oder L-Asn, enthält,
und die verbleibenden Substrate, die nicht analysiert werden sollen, in Anwesenheit von Mg mit NAD-Synthetase
behandelt.
Die obige enzymatische Reaktion verläuft im allgemeinen in einem Volumen von 10 μΐ bis 3 ml pro Test. Die Menge an NAD-Synthetase,
die verwendet wird, wird in Abhängigkeit von der Reaktionszeit variieren und beträgt im allgemeinen pro
Test 0,5 bis 100 Einheiten. Die Menge der Substrate sollte
mindestens im Überschuß, verglichen mit der zu analysierenden Komponente, vorhanden sein. NAD wird bei der Hauptreaktion,
abhängig von der Menge an ATP, Deamid-NAD oder Amiddonor in einer Probe, gebildet.
Damit eine korrekte und genaue Bestimmung erfolgen kann, wird eine verstärkte Reaktion durch Coenzymkreislauf angewendet.
Bei der vorliegenden Erfindung wird NAD, welches abhängig von der Menge an ATP, Deamid-NAD oder Amiddonor in
einer Probe umgewandelt und erzeugt wird, einer Kreislaufreaktion durch Kombination eines Oxidations-Reduktions-Reaktionssystems
für Coenzym NAD und dem von NADH unterworfen, und bei der obigen Reaktion wird bevorzugt die verbrauchte
oder erzeugte Komponente gemessen.
Beispiele für Oxidations-Reduktions-Reaktionssysteme mit Coenzym NAD sind Reaktionssysteme, welche Dehydrogenase
(E1), die NAD unter Erzeugung von NADH verbraucht, und ihr
Substrat (S1) oder Dehydrogenase (E-) mit Coenzym NAD
oder NADH und ihr Substrat (S1) enthalten. Der Ursprung
der Dehydrogenase ist nicht beschränkt, und zumindest reagiert dieses Enzym mit dem spezifischen Substrat und verbraucht
Coenzym NAD unter Bildung von NADH.
Beispiele für diese Enzyme und Substrate werden in "Enzyme Handbook" beschrieben. Beispiele werden im folgenden näher
erläutert:
Lactat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.27) und L-Lactat;
Alkohol-Dehydrogenase (EC 1.1.1) und Ethanol; Glycerin-Dehydrogenase (EC 1.1.1.6) und Glycerin;
Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.8) und Glycerin-3-phosphat;
Glucose-Dehydrogenase (EC 1.1.47) und Glucose; Malat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.37) und L-Malat;
Glucose-Dehydrogenase (EC 1.1.47) und Glucose; Malat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.37) und L-Malat;
Glutamat-Dehydrogenase (EC 1.4.1.2) und L-Glutamat; 3-a-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (EC 1.1.1.50) und
3-a-Hydroxysteroid.
Die Menge an Enzym, die bei dieser Oxidations-Reduktions-Reaktion verwendet wird, hängt von der Enzymaktivität, der
Art des Substrats und dem Verhältnis des Coenzymkreislaufs
ab. Die Menge an Substrat sollte ein molarer Überschuß sein, verglichen mit dem Kreislaufcoenzym, da pro Zyklus
ein Molverhältnis bzw. ein 1-molares Verhältnis bzw. ein Mol des Substrats verbraucht wird, und sie wird durch
Kreislaufzahl pro Stunde und Reaktionszeit bestimmt. Die
weitere Konzentration des Substrats wird bevorzugt für eine maximale Reaktionsgeschwindigkeit der Oxidoreductase bestimmt
und beträgt 0,1 mM bis 100 mM.
Das Reaktionssystem für Coenzym NADH ist ein Reaktionssystem
der funktionellen Substanz (E2), welche mindestens
NADH verbraucht und NAD erzeugt, und ihres Substrats (S0).
Beispiele hierfür sind ein Reaktionssystem aus Oxidoreductase, welches mindestens NADH verbraucht und NAD erzeugt,
und ihrem Substrat und ein Reaktionssystem, welches aus einem
Material, das eine Elektronenübertragung erleidet, und einem Tetrazoliumsalz besteht.
Ein Beispiel für die zuvor erwähnte Oxidoreductase ist eine Dehydrogenase, welche, mindestens mit dem Coenzym NADH, eine
Reaktion katalysiert oder einem Überschuß des spezifischen Substrats (S-), um NAD und reduziertes Substrat (P0)
von Sp oder seine NADH: (Akzeptor) Oxidoreductase zu bilden,
worin zumindest NADH Coenzym ist und der Akzeptor Cytochrom, eine Disulfidverbindung, Chinon und seine Analogen
ist, wobei der Ursprung keine Beschränkung darstellt. Diese Enzyme, Substrate und Akzeptoren werden in "Enzyme Handbook"
beschrieben.
" 18 " 34Ϊ5436
Beispiele für Dehydrogenase und ihr Substrat sind:
Lactat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.27) und Pyruvat; Alkohol-Dehydrogenase (EC 1.1.1) und Acetaldehyd; und
Glycerin-Dehydrogenase (EC 1.1.1.6) und Dihydroxyaceton.
Beispiele für NADH: (Akzeptor) Oxidoreductase sind Cytochrom-bc-reductase
(EC 1.6.2,2) und Diaphorase.
Beispiele für Akzeptoren sind Methylen-Blau, Flavine, Chinone und 2,6-Dichlorphenolindophenol bzw. 2,6-Dichlorphenol, Indophenol.
Die Kombination von NADH: (Akzeptor) Oxidoreductase und Akzeptor ist für ein Enzym mit Coenzym NADH und Elektronenakzeptor
nicht beschränkt und ist bevorzugt Diaphorase (EC 1.6.4.3) und Tetrazoliumsalz und Methylen-Blau, NAD-Dehydrogenase
(EC 1.6.99.3) und Cytochrom C. Die Konzentration davon beträgt im allgemeinen 0,05 bis 100 E/ml. Die Konzentration
an Tetrazoliumsalz hängt von der Löslichkeit des Tetrazoliumsalzes und dem schließlich gebildeten Formazan ab,
und sie beträgt im allgemeinen 1 bis 100 μg pro ml Reagenz.
Ein Beispiel für die Substanz für einen Elektronentransfer ist eine Verbindung, die die Aktivität besitzt, NADH zu NAD
ohne nachteilige Wirkung auf den Coenzymkreislauf zu oxidieren, beispielsweise Phenazinmethosulfat, Meldola-Blau
oder Pyrocyanin. Die Konzentration davon hängt vom Kreislaufverhältnis
ab und beträgt 5 μg bis 0,5 mg pro ml Reaktionsgemisch.
Die obige Kreislaufreaktion wird normalerweise bei Raumtemperatur
bis 370C, vorzugsweise bei 30 bis 370C, durchgeführt.
Die Reaktionszeit ist nicht beschränkt, und sie beträgt im allgemeinen mehr als eine Minute, bevorzugt mehr
als fünf Minuten. Die Reaktion kann beendet werden, indem man eine Säure, wie Chlorwasserstoffsäure oder Phospholsäure
(phospholic acid) hinzugibt.
Nach Beendigung der Kreislaufreaktion wird die während der Kreislaufreaktion verbrauchte oder erzeugte Substanz gemessen.
Beispiele hierfür sind das Reduktionsprodukt (P-) aus dem reduzierten Substrat (S1) von E1, oder das reduzierte
Produkt (P-) aus dem oxidierten Substrat (Sp) von E9 für
die erzeugte Komponente und das reduzierte Substrat (S1)
von E1 oder das oxidierte Substrat (S9) von E9, und eine
der Komponenten P1, P9, S1 oder S9 wird gemessen. Besonders
bevorzugt wird, -wenn das Produkt im Zustand des Substrats farblos ist und im Zustand des Produkts gefärbt oder fluoreszierend
ist, durch Absorptionsänderung kolorimetrisch gemessen. Beispielsweise wird Formazan, welches von dem
Substrat (S9), Tetrazolium, gebildet wird, unter Bildung eines
reduzierten Produkts (P9), welches kolorimetrisch gemessen
wird, reduziert. Weiterhin wird, wenn Flavine oder Chinone als Substrat (S9) verwendet werden, die verbrauchte
Menge an Substrat (S9) bevorzugt kolorimetrisch gemessen.
Bei der obigen Reaktion wird bevorzugt ein oberflächenaktives
Mittel zugegeben, um die Ausfällung von Formazan aus dem Tetrazoliumsalz zu verhindern. Beispiele für oberflächenaktive
Mittel sind nichtionische oberflächenaktive Mittel, wie Triton X-100 oder Adekatol SO-145 (Warenzeichen).
Ihre Konzentration beträgt 0,01 bis 3% für das Reagenz. Die Zugabe von oberflächenaktivem Mittel ergibt eine erhöhte
Empfindlichkeit bei der Messung und eine Stabilität des Formazanpigments.
Die kolorimetrische Analyse des gebildeten Formazanpigments kann durch Messung der optischen Dichte (OD) bei ihrer spezifischen
Absorptionswellenlänge, wie bei 500 bis 550 nm, erfolgen.
Bei der vorliegenden Erfindung kann ein Analyseverfahren, wie ein Endpunktverfahren, ein Geschwindigkeitsanalyseverfahren
oder trockenes Verfahren mit Chemikalien (Filmver-
fahren, Verfahren mit einem immobilisierten Feststoff) mit Vorteil angewendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist als hochempfindliches
Verfahren für ATP nützlich und kann zur Messung der freigesetzten ATP in Proben, zur Messung von gebildetem ATP aus
ADP bei einer enzymatischen Reaktion mit Kinase, zur Messung von ADP und einer Phosphorverbindung des Substrats für
Kinase, für die Analyse der Kinaseaktivität und für die Analyse von irgendwelchen Komponenten von ADP und einer phosphorhaltigen
Verbindung des Substrats für Kinase oder zur Messung der Produkte der Kinasereaktion verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist als hochempfindliches
Analyseverfahren für NH., nützlich und kann zur Messung von
freigesetztem NH3 in Proben, zur Messung von gebildetem
oder verbrauchtem NH3 bei enzymatischen Reaktionen in einem
Substrat, für die Messung der enzymatischen Aktivität bei der NH~-Erzeugung, für die Messung der enzymatischen Akti-0
vität eines NH- erzeugenden Enzyms und zur Messung von irgendeiner
Komponente eines Substrats bei der NH.,-Erzeugung
durch ein Enzym oder eines Produkts bei· der NH-. erzeugenden
enzymatischen Reaktion angewendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist weiterhin für die hochempfindliche
Analyse für L-GIn oder L-Asn nützlich und kann zur Messung von freigesetztem L-GIn oder L-Asn, gebildetem
oder verbrauchtem L-GIn oder L-Asn bei einer enzymatischen Reaktion mittels eines Substrats, zur Messung der Enzymwirkung
bei der Erzeugung von L-GIn oder L-Asn, zur Messung der enzymatischen Aktivität eines L-GIn oder L-Asn erzeugenden
Enzyms oder zur Messung von irgendeiner Komponente eines Substrats bei einem L-GIn oder L-Asn erzeugenden Enzym
oder Produkt davon angewendet werden.
- 21 - .»-♦♦♦-
Die NAD-Synthetase, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet
wird und aus Bacillus licheniformis B-0844 erhalten wird, wurde von der Anmelderin gefunden und ist stabiler
als die bekannte NAD-Synthetase und für ein klinisches diagnostisches Enzym nützlich.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von NAD-Synthetase, das dadurch gekennzeichnet ist,
daß man einen NAD-Synthetase erzeugenden Mikroorganismus, der zum Genus Bacillus gehört, in einem Medium züchtet und
die NAD-Synthetase aus dem Kulturmedium isoliert.
Ein Stamm von Bacillus licheniformis B-0844 wurde aus einer
in Ohno, Shuzenji-cho, Tagata-gun, Shizuoka-ken, Japan erhaltenen Bodenprobe isoliert, und die taxonomischen Eigenschaften
sind wie folgt.
(a) Morphologische Eigenschaften:
beobachtet mittels eines Mikroskops auf einem Agarnährschrägmedium
bei 300C während 18 bis 24 Stunden Züchtung.
(1) Form und Anordnung:
runde Kanten, gerade oder leicht gekrümmte Bacilli, einfache oder binäre Ketten, relativ kurze Kette
(2) Größe: 0,6 bis 0,8 χ 1,5 bis 3,0 μπ\
(3) Beweglichkeit: beweglich durch peritrichale Flagelle 30
(4) Sporen: Formen rund oder subterminal, 0,8 χ 1,5 μΐη,
Quellen der Sporangia
(b) Wachstum auf verschiedenen Medien (bei 500C):
35
(1) Nähragarplatte: gräulich-weiße Kolonien, wellenförmig verlaufende, runde Kanten, eben, manchmal
gekräuselt, keine lösliche Pigmentbildung
(2) Nähragarschrägplatten: igelartig (echnulate), gutes Wachstum, gräulich weiß, keine Bildung von löslichem
Pigment
(3) Bouillonagar: einheitlich trüb, gutes Wachstum, bildet später Häutchen bzw. einen Belag, villöser
bzw. mit feinen Härchen besetzter Niederschlag
(4) BCP-Milch: koaguliert innerhalb von 1 bis 2 Wochen,
teilweise Peptonisierung
(c) Physiologische Eigenschaften (+: positiv, -: negativ):
15
Gram1s-Verfleckung +
Catalasebildung +
Oxidasebildung +
Urasebildung (SSR-Medium)
(Chris.-Medium)
(Chris.-Medium)
Gelatinehydrolyse +
Stärkehydrolyse +
Caseinhydrolyse - (3 Tage)
Esculinhydrolyse +
Cellulosehydrolyse -
Indolbildung
H2S-Bildung +
Acetoinbildung +
MR-Test + (schwach) 30
Nitratreduktion +
Denitrifikationsreaktion -
Citratverbrauch +
Wachstum auf 7,0% NACl zugegebenem Medium +
Wachstum bei 500C +
Wachstum bei 200C +
Säurebildung aus Zucker* (keine Gasbildung):
Adonit -
L(+)-Arabinose +
Cellobiose +
Dulcit
Mesoerythrit
Fructose +
Fucose
Galactose +
Glucose +
Glycerin +
Inosit +
Inulin
Lactose +
Maltose +
Mannit +
Mannose +
Melezitose -
Melibiose +
Raffinose +
L(+)-Rhamnose +
Salicin +
L-Sorbose
OF-Test (Hucker-Verfahren) OF-Test (modifiziert)* *) Grundmedium:
1,0 g Sorbit
Stärke
Saccharose Trehalose Xylose
(NH4J2HPO4
MgSO4 7H2O
Agar
MgSO4 7H2O
Agar
0,2 g 3,0 g NT (keine Änderung) F (Fermentierung)
KCl 0,2 g Hefe ex 1,0 g BTB 0,02 g
destilliertes Wasser 1000 ml pH 7,0
KohlenstoffVerbrauchstest:
D-Alanin
L-Alanin +
Saccharose Cellobiose
Fructose Propanol Ethanol Ethylamin Lactat a-Aminobutyrat
Glucose Inosit
L(+)-Arabinose Mannose Maltose Rhamnose
Treharose Acetat Propionat
Cytosin- und Guaningehalte von DNA (%): 45,6% (Tm-Verfahren)
Entsprechend den obigen taxonomischen Eigenschaften kann
der Stamm B-0844 bei 500C gezüchtet werden und ist ein Bakterium
mit den Eigenschaften: runde Kanten, gerade oder leicht gebogene Bacilli, grampositiv, sporenbildend und
fermentativer Abbau von Zucker. Unter Beachtung dieser taxonomischen
Eigenschaften ist der Stamm nach "Bergey's Manual", 8.
Aufl., 1974, "Manual of Medicinal Bacteriology", 2. Aufl.,
1974 und "Agriculture Handbook", Seite 427, "The Genus Bacillus" und aufgrund der Tatsache, daß der erfindungsgemäße
Stamm Sporen bildet und aerob wächst, als Genus Bacillus zu bezeichnen. Unter den Stämmen, die zum Genus
Bacillus gehören, die bei 5O0C wachsen können, können (a)
Bacillus coagulance, (b) Bacillus licheniformis, (c) Bacillus subtilis,
(d) Bacillus brevis und (e) Bacillus stearothermophilus erwähnt werden. Der Vergleich dieser Stämme
ist wie folgt (+: positiv, -: negativ, u: unterschiedlich im Stamm):
bei | B-0844 | 7%igem Na- | + | |
Wachstum | bei | 500C + | ||
Wachstum | 200C + | |||
anaerobes | Wachstum + | |||
Verbrauch | von Propionat + | |||
Wachstum | auf | |||
Cl-Medium |
Wachstum auf 5%igem Na-
Cl-Medium + + + + - u
Verbrauch von Citrat + u + + u u
Der erfindungsgemäße Stamm ähnelt dem Bacillus licheniformis
und wird als Bacillus licheniformis B-0844 bezeichnet. Der Stamm wurde beim Fermentation Institute, Agency of Industrial
Science and Technology, M.I.T.I., Japan hinterlegt und hat die Hinterlegungsnummer FERM P-6809, (^PRI BP-601) erhalten.
Der Stamm wurde am 30. November 1982 hinterlegt.
In der vorliegenden Erfindung ist unter den NAD-Synthetase
erzeugenden Mikroorganismen, die zum Genus Bacillus gehören, der obige Stamm ein Beispiel, und jeder Stamm, der zum Genus
Bacillus gehört und NAD-Synthetase bildet, kann verwendet werden.
Der NAD-Synthetase erzeugende Mikroorganismus, der zum Genus Bacillus gehört, wird in einem üblichen Medium für die
Enzymproduktion erzeugt. Die Züchtung erfolgt in einer flüssigen oder festen Kultur, und für die industrielle Produktion
ist eine submerse Belüftungskultur bevorzugt.
Die Nährstoffquellen des Mediums können bekannte Stoffe für
ein bekanntes Medium für die Züchtung von Mikroorganismen sein. Beispiele für Kohlenstoffquellen sind assimilierbare
Kohlenstoffverbindungen, wie Glucose, Saccharose, Lactose, Maltose, Stärke, Dextrin, Melassen oder Glycerin. Beispiele
für Stickstoffquellen sind assimilierbare Stickstoffquellen,
wie Maisquellwasser, Sojabohnenmehl bzw. -pulver, Baumwollsamenmehl
bzw. -pulver, Weizengluten, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt oder Caseinhydrolysat. Salze, wie solche
von Magnesium, Kalium, Natrium, Zink, Eisen, Mangan, und Phosphate oder Halogenide können verwendet werden.
35
Die Wachstumstemperatur wird für das Wachstum von NAD-Synthetase
erzeugenden Mikroorganismen und für die Produktion des Enzyms eingestellt und beträgt bevorzugt 26 bis 500C.
Die Züchtungszeit kann variiert werden, abhängig von den Züchtungsbedingungen, und beträgt im allgemeinen 15 bis 4 0
Stunden. Die Züchtung sollte natürlich bei der maximalen Produktion von Enzym beendet werden. Eine Bewegung unter Belüftung
wird durchgeführt, und sie beträgt im allgemeinen 200 bis 4 00 Upm.
Da das Enzym ein Endoenzym ist, werden die gezüchteten Zellen mittels Filtration oder Zentrifugieren gesammelt, und
die gesammelten Zellen werden mechanisch durch Ultrabeschallung, französisches Pressen bzw. durch Anwendung von
Druck oder durch Behandlung mit Glasperlen zerstört oder enzymatisch durch Lysozym, gegebenenfalls unter Zugabe von
oberflächenaktiven Mitteln, wie Triton X-100 oder Adekatol SO-120 (Warenzeichen), digeriert.
Die Enzymlösung wird, mit oder ohne Konzentrierung, dem Aussalzen
unterworfen, indem man lösliche Salze, wie Ammoniumsulfat, zugibt oder indem man mit mit Wasser mischbare organische
Lösungsmittel, wie Methanol, Ethanol, Aceton oder Isopropanol, zur Ausfällung des Enzyms behandelt. Der Niederschlag
wird in Wasser oder Pufferlösung gelöst, gegebenenfalls dialysiert, und mittels eines Ionenaustauschharzes,
wie DEAE-Sephadex, DEAE-Sepharose, Carboxymethylcellulose, Carboxymethylsepharose oder Carboxymethyl-Sephadex, chromatographiert
oder unter Verwendung von Molekularsieben, wie Sephadex G-200, Sephadex CL-6B oder Sephacryl S-200 (Warenzeichen)
, der Gelfiltration unterworfen.
Die biochemischen Eigenschaften der obigen NAD-Synthetase sind wie folgt.
35
35
(1) Molekulargewicht: ungefähr 62 000 (Gelfiltration mittels
Sephadex G-150)
(2) Isoelektrischer Punkt: ungefähr pH 4,6 (Elektrophorese unter Verwendung von Ampholit)
(3) Wirkung: ATP + Deamid-NAD + NH3 ^2 ^ Amp + PPi + NAD
(4) Substratspezifität:
sn,
Mg'
NH3, L-GIn, L-Asn, ++
ATP + Deamid-NAD + L-GIn (oder L-Asn)
AMP + PPi * NAD + GIu (oder Asp)
(5) Optimaler pH:
15
15
Das Reaktionsmedium I in dem Analyseverfahren für die
enzymatische Aktivität wird mit Acetatpuffer (pH 3,8 bis 6,6), Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (pH 5,1 bis 6,8)
und Tris-HCl-Puffer (pH 6,5 bis 8,8) gemischt, und die Enzymaktivität wird gemessen. Wie aus Figur 1 folgt, beträgt
der optimale pH-Wert 8,0 bis 8,7.
(6) pH-Stabilität:
Das Enzym wird in 50 mM Acetatpuffer (pH 3,9 bis 6,8),
Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (pH 4,1 bis 7,1), Phosphatpuffer (pH 6,3 bis 7,9) oder Tris-HCl-Puffer (pH 6,4
bis 8,9) gelöst und bei 370C während 60 Minuten inkubiert.
Die verbleibende Enzymaktivität wird mittels eines Assay-Verfahrens für die Enzymaktivität gemessen.
Das Ergebnis ist in Figur 2 dargestellt, und das Enzym ist bei pH 5,5 bis 9,0 stabil.
(7) Wärmestabilität:
35
35
Das Enzym wird in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 6,8) gelöst
und bei verschiedenen Temperaturen während 10 Minuten behandelt, und die verbleibende Enzymaktivität wird gemessen.
Das Ergebnis ist in Figur 3 dargestellt, und das Enzym ist bis zu 400C stabil.
(8) Einfluß von oberflächenaktiven Mitteln:
Bei der Enzymaktivitätsanalyse wird das in Tabelle I aufgeführte oberflächenaktive Mittel zu dem Reaktionsmedium I zugegeben, bei 370C erhitzt, und 5 μ,Ι Enzymlösung
werden zugegeben, dann wird bei 370C während 10
Minuten inkubiert, dann werden 0,8 ml des Reaktionsmediums II zugegeben, bei 370C während genau 5 Minuten inkubiert,
und 2,0 ml 0,1N HCl werden zugegeben, um die Kreislaufreaktion zu beenden, und es wird kolorimetrisch
gemessen. Das Ergebnis ist in Figur 1 dargestellt. Das Enzym wird durch kationische und anionische oberflächenaktive
Mittel inhibiert.
Oberflächenaktives Mittel | Brig 35 | Relative Aktivität (%) |
keine Zugabe | Kation DT-205 | 100 |
Adekatol SO-120 | FB | 108,2 |
SO-145 | Cetylpyridiniumchlorid | 106,9 |
Natriumdodecylsulfat | 107,5 | |
Tween-80 | 10,5 | |
Cholat | 11 ,8 | |
Cetyltrimethylammoniumchlorid | 1 ,6 | |
2,3 | ||
102,3 | ||
105,6 | ||
4,2 |
Span 85
Natriumlaurylbenzolsulfonat
Natriumlaurylbenzolsulfonat
104,6 6,5
(9) Einfluß von Metallionen:
Jedes der in der folgenden Tabelle II aufgeführten Metallsalze wird zu dem Reaktionsmedium I (20 mM, enthaltend
MgCl„) zugegeben, es wird auf 1 ml eingestellt, und die relative Aktivität wird gemessen. Das Ergebnis
ist in Tabelle II aufgeführt.
Metallsalz | Relative Aktivität (%) |
keine Zugabe | 100 |
NiCl2 | 1 ,06 |
BaCl2 | 106 |
SnCl0 Z |
99,3 |
AlCl3 | 94,96 |
CdSO4 | 2,4 |
MnCl2 | 18,2 |
CuCl2 | 3,6 |
ZnCl2 | 5,3 |
CoCl2 | 94,2 |
MgCl2 | 102 |
PCMB | 0,3 |
CaCl0 | 103 |
_ 7K-
(10) Analyseverfahren für die Enzymaktivität: Enzymaktivitätsanalyse:
Reaktionsmedium I
50 mM Tris-HCl-Puffer pH 8,0 20 mM KCl 2 0 mM MgCl2
0,05% Rinderserumalbumin 2 mM ATP
0,5 mM Deamid-NAD 25 mM (NH4)2SO.
Reaktionsmedium II 50 mM Tris-HCl-Puffer pH 8,0
10 E Diphorase (Toyo Jozo Co. von Genus Bacillus)
3% Ethanol
10 E Alkoholdehydrogenase/ml (Toyo Jozo, Hefe) 0,025% NTB (Nitrotetrazolium-Blau)
0,1% Triton X-100
10 mM EDTA
0,2 ml Reaktionsmedium I werden in einem Reagenzglas bei 370C präinkubiert, und 5 μΐ Enzymlösung werden zugegeben,
dann wird während genau 10 Minuten bei 37°C inkubiert.
Zur Beendigung der Reaktion werden 0,8 ml Reaktionsmedium II zugegeben, und gleichzeitig wird die Kreislaufreaktion bei
370C während genau 5 Minuten in Gang gesetzt. Nach Beendigung
der Kreislaufreaktion durch Zugabe von 2,0 ml 0,1N
HCl wird die Absorption bei 55 0 nm zur Berechnung der Enzymaktivität gemessen. Die Enzymaktivität wird durch die
folgende Gleichung berechnet.
NAD-Synthetase-Aktivität (mE/ml)= χ χ I7T
Ab 550 U,UUb IU
worin ΔΑ die Absorption der Probe,
AS die Absorption der Standardlösung (0,1 mM NAD), 0,005 Volumen der Probe (ml),
10 Reaktionszeit,
f Verdünnungsverhältnis
bedeuten.
10
f Verdünnungsverhältnis
bedeuten.
10
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Ein flüssiges Medium (pH 7,3, 20 1), welches 1% Pepton, 1% Fleischextrakt, 0,2% Hefeextrakt und 0,3% NaCl in einem 30-1-Fermentationsgefäß
enthält, wird bei 1200C während 20 Minuten sterilisiert. Eine zuvor in dem Medium gleicher Zusammensetzung
gezüchtete Samenkultur (200 ml) wird zum Inokulieren verwendet, und es wird bei 5 00C während 16 Stunden
mit einer Belüftung von 20 l/min und einer Bewegung von 300 Upm gezüchtet. Nach dem Züchten werden die Zellen durch
Zentrifugieren gesammelt, die Zellen in 10 mM Tris-HCl (pH
8,0, 2 1), welches 0,1% Lysozym enthält, suspendiert und bei 370C während 30 Minuten zur Lyse der Zellen inkubiert.
Die lysierte Lösung wird bei 5 000 Upm während 10 Minuten zentrifugiert, wobei man eine Überstandlösung (1,9 1) erhält.
Ammoniumsulfat wird zur Fraktionierung der Lösung (0,44 bis 0,54 Sättigung) zugegeben, und der erhaltene
Niederschlag wird in 10 mM Tris-HCl-Puffer (200 ml, 473 E)
gelöst und gegenüber dem gleichen Puffer (12 1) dialysiert. Die ausgefallenen unlöslichen Stoffe werden durch Zentrifugieren
(12 000 UpM, 10 min) entfernt. Die überstandslösung (462 E) wird auf eine Säule (5 χ 30 cm) aus DEAE-Sepharose
CL-6B, die mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) gepuffert ist,
gegeben und mit einem Gradienten von 0 bis 0,5 M NaCl eluiert.
Die Fraktionen, die mit 0,15 - 0,2 M NaCl eluieren, werden gesammelt (120 ml, 399 E), durch eine Ultrafiltrationsmembran
PM-10 (Amicon Co.) konzentriert, an Sephadex G-150 (3,6 χ 80 cm) chromatographiert, und die aktiven Fraktionen
werden gesammelt, wobei man 80 ml (324 E) gereinigte Lösung erhält.
Rinderserumalbumin, Glucose, Maltose, Mannit, Saccharose und Fructose werden jeweils bis zu 1 % Konzentration zugegeben,
und dann wird lyophilisiert. Das lyophilisierte Produkt ist bei Zugabe des obigen Stabilisators stabil, ohne
daß es seine Aktivität verliert, wohingegen das Enzym ohne Zugabe des Stabilisators einen Aktivitätsverlust auf 86% erleidet.
Reaktionsmedium I:
50 rtiM Tris-HCl-Puffer pH 8,0
20 mM KCl
20 mM MgCl2
0,05% Rinderserumalbumin
1 mM Deamid-NAD
1 mM Deamid-NAD
50 mM (NH4)2SO4
400 mE NAD-Synthetase/ml
Reaktionsmedium II:
50 mM Tris-HCl-Pu-fer (pH 8,o)
50 mM Tris-HCl-Pu-fer (pH 8,o)
20 E Diaphorase/ml
3% Ethanol
20 E Alkoholdehydrogenase/ml
0,05% NTB
0,1% Triton X-100
0,1% Triton X-100
0,2 ml Reaktionsgemisch I werden in einem Reagenzglas bei
370C inkubiert und 0, 5, 10 , 20, 30 und 40 μΜ ATP-Lösung
(50 μ.1) werden zugegeben, dann wird bei 370C während 10 Minuten
inkubiert. 0,3 ml Reaktionsmedium II werden zugegeben, dann wird bei 370C während genau 5 Minuten inkubiert, die
Reaktion durch Zugabe von 0,1 N HCl (2,0 ml) beendet und
die Absorption bei 550 nm gemessen. Das Ergebnis ist in Figur 4 angegeben. Wie aus der Figur folgt, erhält man eine gute Linearität. Das Kreislaufverhältnis beträgt 4 800 Uph. 10
die Absorption bei 550 nm gemessen. Das Ergebnis ist in Figur 4 angegeben. Wie aus der Figur folgt, erhält man eine gute Linearität. Das Kreislaufverhältnis beträgt 4 800 Uph. 10
Die Reaktionsmedien I und II werden mit gleichem Volumen
vermischt und bei 370C präinkubiert. 1,0 ml des Gemisches wird in eine Spektrophotometer-Quarzzelle (1,0 ml) gegeben, auf 370C eingestellt, und 5 μΐ ATP-Lösung der gleichen Konzentration wie in Beispiel 2 werden zugegeben. Die Absorption in 2 Minuten von 5 bis 7 Minuten nach der Zugabe von ATP wird bei 550 nm gemessen. Wie in Figur 5 gezeigt ist, erhält man eine gute Linearität mit hoher Empfindlichkeit mittels des kinetischen Analyseverfahrens. Das Kreislaufverhältnis beträgt ungefähr 2 800 üph.
vermischt und bei 370C präinkubiert. 1,0 ml des Gemisches wird in eine Spektrophotometer-Quarzzelle (1,0 ml) gegeben, auf 370C eingestellt, und 5 μΐ ATP-Lösung der gleichen Konzentration wie in Beispiel 2 werden zugegeben. Die Absorption in 2 Minuten von 5 bis 7 Minuten nach der Zugabe von ATP wird bei 550 nm gemessen. Wie in Figur 5 gezeigt ist, erhält man eine gute Linearität mit hoher Empfindlichkeit mittels des kinetischen Analyseverfahrens. Das Kreislaufverhältnis beträgt ungefähr 2 800 üph.
50 mM (NH.) ~>SO, im Reaktionsmedium I in Beispiel 2 werden
durch 5 mM ATP ersetzt, um ein Reaktionsmedium herzustellen. Verschiedene Konzentrationen von Ammoniumsulfat, L-GIn und
L-Asp werden zugegeben, und dann wird auf gleiche Weise, wie in Beispiel 2 beschrieben, behandelt. Wie aus Figur 6 folgt,
erhält man eine gute Linearität für Ammoniumsulfat, L-GIn
und L-Asp.
Kurze Erläuterung der Zeichnung:
Figur 1: optimaler pH von NAD-Synthetase aus Bacillus liche-
niformis B-0844 5
Figur 2: pH-Stabilität Figur 3: Wärmestabilität Figur 4: ATP-Analyse durch Endpunktverfahren
Figur 5: ATP-Analyse durch kinetisches Verfahren
Figur 6: L-Glutamin- und L-Asparagin-Analyse gemäß dem
Endpunktverfahren.
Claims (19)
1. Assay-Verfahren für eine Komponente in einer Probe,
welche irgendeine der Verbindungen ATP, Deamid-NAD und/oder einen Amiddonor enthält, dadurch gekennzeichnet,
daß man
gemäß der Hauptreaktionsstufe die Probe mit NAD-Synthetase in Anwesenheit von ATP, Deam.
Erzeugung von NAD inkubiert;
Erzeugung von NAD inkubiert;
in Anwesenheit von ATP, Deamid-NAD, Amiddonor und Mg zur
gemäß der Coenzymkreislauf-Reaktionsstufe die Coenzymkreislaufreaktion
durchführt, indem man das Oxidations-Reduktions-Reaktionssystem mit Coenzym NAD kombiniert und das Oxidations-Reduktions-System
mit coenzvmreduzierter NAD kombiniert; und
die bei der Kreislaufreaktion verbrauchte oder erzeugte Komponente
mißt.
2. Assay-Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e kennzeichnet,
daß ATP durch die folgende enzymatische Reaktion erzeugt wird:
(a) Creatinkinase:
-in η j. · u u χ. ,ητ, Reduktionsmittel .
Creatmphosphat + ADP — >
Mg Creatin + ATP
Reduktionsmittel: ß-Mercaptoethanol, reduziertes Glutathion,
Cystein, N-Acetylcystein, Di-
thiothreitol
(b) Pyruvatkinase:
Phosphoenolpyruvat + ADP Mn+* oder Mg++, K+ ^
Pyruvat + ATP
(c) Acetatkinase:
oc ■* J.11- , , , 1ηπ Mg oder Mn Acetat + ATP
Acetylphosphat + ADP _^ ^
(d) Carbamatkinase:
Carbamylphosphat + ADP ^f___>
NH3 + CO3 + ATP (e) Aspartatkinase:
4-Phospho-L-aspartat + ADP ^2
> L-Aspartat + ATP
(f) Phosphoglyceratkinase:
M ++ oder Mn++
—2 >
1 ,3-Diphospho-D-glycerat + ADP
L-Arginin + ATP
3. Assay-Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß NH3 von einem Ammoniumsalz
stammt oder durch die folgende enzymatische Reaktion gebildet wird:
(aj Nicotinamidase:
Nicotinamid + H3O —>
Nicotinat + NH3 + H+
(b) Glutaminylpeptidglutaminase:
L-Glutaminylpeptid + H„0 —> L-Glutamylpeptid + NH3
L-Glutaminylpeptid + H„0 —> L-Glutamylpeptid + NH3
(c) Arginindeaminase:
L-Arginin + H3O —>
Citrullin + NH + H+
(d) Guanindeaminase:
Guanin + H3O —» Xanthin + NH3 + H+
(e) Adenosindeaminase:
Adenosin + H3O —^ Inosin + NH3 + H
(f) Creatinindeaminase:
Creatinin + H3O —>
N-Methylhydantoin + NH3 + H+
(g) Threonindehydratase:
L-Threonin + H3O —} 2-Oxobutyrat + CO3 + NH3 + H
25
(h) Aspartatammoniumlyase:
L-Aspartat —> Fumarat + NH3 + H+
(i) L-Methionin-y-lyase:
0 L-Methionin + H3O —> 2-Oxobutyrat + CH3SH + NH3 + H+
0 L-Methionin + H3O —> 2-Oxobutyrat + CH3SH + NH3 + H+
(j) Methylaminoglutamatmethy!transferase:
N-Methylglutamat + NH3 + H —*■ Glutamat + Methylamin
4. Assay-Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet , daß L-Glutamin durch die folgen-
de Reaktion gebildet wird:
(a) Glutamatsynthetase (Ferredoxin):
L-Glutainin + 2-0xoglutamat + 2-reduziertes Ferredoxin
—> 2-L-Glutamat + 2-oxidiertes Ferredoxin
(b) Glutamintransferase:
L-Glutamin + 2-Oxosäure —>
2-Oxoglutamat + L-Aminosäure
10
10
(c) Carbamylphosphatsynthetase:
L-Glutamin - HCO~ + 2 ATP + H3O
L-Glutamin - HCO~ + 2 ATP + H3O
***" —>
Carbamylphosphat + 2 ADP + Pi + L-Glutamat
(d) Hexosephosphataminotransferase:
D-Fructose-6-phosphat + L-Glutamin —} 2-Amino-2-deoxy-D-glucose-6-phosphat
+ L-Glutamat
(e) Glutaminscylloinososeaminotransferase:
2-Oxoglutaramat + 1-Amino-1-deoxyscylloinosit
—f L-Glutamin + 2,4,6/3,5-Pentahydroxycyclohexanon.
5. Assay-Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß sich die NAD-Synthetase von
w 25 Escherichia coli oder von einem NAD-Synthetase erzeugenden
Mikroorganismus, der zum Genus Bacillus gehört, ableitet.
6. Assay-Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß der NAD-Synthetase erzeugen-
de Mikroorganismus, der zum Genus Bacillus gehört, Bacillus licheniformis B-0844, FERM P-6809,(FRI BP-601) ist.
7. Assay-Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das Oxidations-Reduktions-
System mit dem Coenzym NAD ein enzymatisches Reaktionssystem
ist, welches Dehydrogenase, welche NAD verbraucht und reduzierte NAD erzeugt, und ein Substrat davon enthält.
8. Assay-Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß die Dehydrogenase und ihr
Substrat sind:
Lactatdehydrogenase und L-Lactat;
Alkoholdehydrogenase und Ethanol;
Glycerindehydrogenase und Glycerin; Glycerin-3-phosphatdehydrogenase und Glycerin-3-phosphat; Glucosedehydrogenase und Glucose;
Malatdehydrogenase und L-Malat;
Alkoholdehydrogenase und Ethanol;
Glycerindehydrogenase und Glycerin; Glycerin-3-phosphatdehydrogenase und Glycerin-3-phosphat; Glucosedehydrogenase und Glucose;
Malatdehydrogenase und L-Malat;
Glutamatdehydrogenase und L-Glutamat; oder
3-a-Hydroxysteroiddehydrogenase und 3-a-Hydroxysteroid.
9. Assay-Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e -
kennzeichnet, daß das Oxidations-Reduktions-System mit coenzymreduzierter NAD Oxidoreductase, welche
reduzierte NAD verbraucht und oxidierte NAD erzeugt, und ein Substrat davon ist.
10. Assay-Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , daß die Oxidoreductase und ihr
Substrat sind:
Lactatdehydrogenase und Pyruvat;
Alkoholdehydrogenase und Acetaldehyd; Glycerindehydrogenase und Hydroxyaceton; Glycerin-3-phosphatdehydrogenase und Dihydroxyacetonphosphat;
Alkoholdehydrogenase und Acetaldehyd; Glycerindehydrogenase und Hydroxyaceton; Glycerin-3-phosphatdehydrogenase und Dihydroxyacetonphosphat;
Malatdehydrogenase und Oxaloacetat; oder 3-a-Hydroxysteroiddehydrogenase und 3-Ketosteroid.
11. Assay-Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , daß die Oxidoreductase und ihr
Substrat reduzierte NAD: (Akzeptor) Oxidoreductase und ein Akzeptor davon sind.
— D —
12. Assay-Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet , daß die reduzierte NAD: (Akzeptor)
Oxidoreductase und ein Akzeptor davon reduzierte NAD-Dehydrogenase und Flavine, Chinone, 2,6-Dichlorphenolindophenol,
Eisen(III)-cyanidsalz, Tetrazoliumsalz , Cytochrom C
oder Sauerstoff sind.
13. Assay-Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , daß die Oxidoreductase und ihr
Substrat Diaphorase und Tetrazoliumsalz sind.
14. Assay-Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das Oxidations-Reduktions-Reaktionssystem
mit der coenzymreduzierten NAD ein Reaktionssystem ist, bei welchem ein Elektronentransfer stattfindet
und welches Tetrazolium enthält.
15. Assay-Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , daß die Verbindung für den Elek-
tronentransfer Phenazinmethosulfat, Meldola-Blau oder Pyrocyanin
ist.
16. Assay-Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , daß die Kreislaufreaktion unter
Zugabe eines oberflächenaktiven Mittels durchgeführt wird.
17. Assay-Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet , daß als oberflächenaktives Mittel
ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel verwendet wird.
18. Verfahren zur Erzeugung von NAD-Synthetase, dadurch
gekennzeichnet , daß man einen NAD-Synthetase erzeugenden Mikroorganismus, der zum Genus Bacillus gehört,
in einem Medium züchtet und NAD-Synthetase daraus isoliert.
" Τ'
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet , daß der NAD-Synthetase erzeugende Mikroorganismus
Bacillus licheniformis B-0844, FERM P-6809, (frI BP-6O1I ist.
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