JPS58107175A - コレステロ−ルオキシダ−ゼの製造法 - Google Patents
コレステロ−ルオキシダ−ゼの製造法Info
- Publication number
- JPS58107175A JPS58107175A JP56205720A JP20572081A JPS58107175A JP S58107175 A JPS58107175 A JP S58107175A JP 56205720 A JP56205720 A JP 56205720A JP 20572081 A JP20572081 A JP 20572081A JP S58107175 A JPS58107175 A JP S58107175A
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- JP
- Japan
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- streptomyces
- cholesterol oxidase
- ifo
- cholesterol
- producing
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はストレプトマイセス属に属するコレステロール
オキシダーゼ（以下００と略する）生産能を有する特定
菌株を培養し、培養物からＣＯを採取することからなる
コレステロールオキシタ゛−ゼの製造法に関するもので
ある。
オキシダーゼ（以下００と略する）生産能を有する特定
菌株を培養し、培養物からＣＯを採取することからなる
コレステロールオキシタ゛−ゼの製造法に関するもので
ある。
コレステロールは、ヒト体液特に血清中では遊離もしく
はエステル型で存在しており、これら血清中のコレステ
ロール量の把握が医学的、特に臨床医学的に、動脈硬化
症、脳出血症に関連して重要視されている。
はエステル型で存在しており、これら血清中のコレステ
ロール量の把握が医学的、特に臨床医学的に、動脈硬化
症、脳出血症に関連して重要視されている。
従来コレステロールの定量は化学的な方法で行われてい
たが、近年−切の前処理を省略して直接に血清を試薬に
投じて発色させ比色定置する酵素法が開発され、簡便か
つ鋭敏で精度が高く、シかも直接的な方法である利点が
あって従来の化学法に代わって著しい普及をみている。
たが、近年−切の前処理を省略して直接に血清を試薬に
投じて発色させ比色定置する酵素法が開発され、簡便か
つ鋭敏で精度が高く、シかも直接的な方法である利点が
あって従来の化学法に代わって著しい普及をみている。
係る酵素法で中心的役割を果たす酵素、ＣＯは、これ迄
種々の微生物から得られているが、その生産性は他の酵
素に比べて比較的低く、更に高い生産性を有する微生物
でより安価なＣＯの製造が強く望まれている０ 本発明者らは、安価に工業的規模で、ＣＯを得るため′
に、Ｃ゛０生産菌を検索し、その菌株の中から、ストレ
プトマイセスに属する特定微生物が、短時間で強力な０
０生産性を示すことを款め、本発明を完成するに到った
。すなわち本発明はストレブトマイセス・フラボペルシ
クス エＦ Ｏ１２７６９゜ストレプトマイセスーアス
ペルギロイデス エＦ０１３４６１１ストレプトマイセ
ス・カプエンシスエＦＯ１３０２４またはストレプトマ
イセス中グリセオラベンダスエＦＯ１３０４５を培養し
、培養物からコレステロールオキシダーゼを採取するこ
とを特徴とするコレステロールオキシダーゼの製造法で
ある。
種々の微生物から得られているが、その生産性は他の酵
素に比べて比較的低く、更に高い生産性を有する微生物
でより安価なＣＯの製造が強く望まれている０ 本発明者らは、安価に工業的規模で、ＣＯを得るため′
に、Ｃ゛０生産菌を検索し、その菌株の中から、ストレ
プトマイセスに属する特定微生物が、短時間で強力な０
０生産性を示すことを款め、本発明を完成するに到った
。すなわち本発明はストレブトマイセス・フラボペルシ
クス エＦ Ｏ１２７６９゜ストレプトマイセスーアス
ペルギロイデス エＦ０１３４６１１ストレプトマイセ
ス・カプエンシスエＦＯ１３０２４またはストレプトマ
イセス中グリセオラベンダスエＦＯ１３０４５を培養し
、培養物からコレステロールオキシダーゼを採取するこ
とを特徴とするコレステロールオキシダーゼの製造法で
ある。
ＣＯを生産するストレプトマイセス属に属する微生物と
しては、従来ストレプトマイセス・ビオラセンス〔ケミ
カル・ファルマソイテカル・ブリティン（Ｏｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｅ
ｉｎ ）第２１巻、２０５７頁、１９７３年〕及びスト
レプトマイセス拳グリセオフスクスＤＳＭ ４０１９１
．ストレプトマイセス書ハイグロスコピクスＤＳＭ ４
０７７１゜ストレプトマイセスやアシドマイセテイクス
ＤＳＭ４０７９８ （特開昭５６−５０９４号）等が報
告されているが、生産性が低いかへ或いは最大酵素生産
を得るために長時間の培養（３〜４日間）を要する等の
欠点がある。本発明によるストレプトマイセス属の特定
微生物、すなわち、ストレプトマイセス・７ラボペルシ
クス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖｏｐｅｒｃ
ｉｃｕｓ）工Ｆ０１２７６９．ストレプトマイセス・ア
スペルギロイデス（５ｔｒｅｐｔｏｎｙｃｅｓ ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｏｉｄｅｓ ）工ＦＯ１３４６１゜ストレ
プトマイセス噛カブエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓｃａｐｕｎｓｉｓ ）工ＦＯｌ ３０２４．ストレプ
トマイセス０グリセオラベンダス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ｇｒ土５ｅｏｌａｖｅｎｄｕｓ ）工Ｆ０１３
０４５を用いれば、短時間（１〜２日間）の培養で著量
のＣＯが生産される特徴を有する。
しては、従来ストレプトマイセス・ビオラセンス〔ケミ
カル・ファルマソイテカル・ブリティン（Ｏｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｅ
ｉｎ ）第２１巻、２０５７頁、１９７３年〕及びスト
レプトマイセス拳グリセオフスクスＤＳＭ ４０１９１
．ストレプトマイセス書ハイグロスコピクスＤＳＭ ４
０７７１゜ストレプトマイセスやアシドマイセテイクス
ＤＳＭ４０７９８ （特開昭５６−５０９４号）等が報
告されているが、生産性が低いかへ或いは最大酵素生産
を得るために長時間の培養（３〜４日間）を要する等の
欠点がある。本発明によるストレプトマイセス属の特定
微生物、すなわち、ストレプトマイセス・７ラボペルシ
クス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖｏｐｅｒｃ
ｉｃｕｓ）工Ｆ０１２７６９．ストレプトマイセス・ア
スペルギロイデス（５ｔｒｅｐｔｏｎｙｃｅｓ ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｏｉｄｅｓ ）工ＦＯ１３４６１゜ストレ
プトマイセス噛カブエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓｃａｐｕｎｓｉｓ ）工ＦＯｌ ３０２４．ストレプ
トマイセス０グリセオラベンダス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ｇｒ土５ｅｏｌａｖｅｎｄｕｓ ）工Ｆ０１３
０４５を用いれば、短時間（１〜２日間）の培養で著量
のＣＯが生産される特徴を有する。
更に製造法を具体的に説明すると、本発明で使用する培
地は、窒紫源、炭素源、無機塩、その他の生育促進物質
を加えた栄養培地に酵素の生産性を高めるために、コレ
ステフール、米糠油あるいけ大豆油を添加して使用する
。蟹素源としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、
Ｏ８Ｌ等の窒素性有機化合、物の組合せが有効であり、
炭素源としては、特に可溶性澱粉が効果的である。無機
塩としては、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウムの添
加が効果的であり、また、炭酸カルシウムの添加はＰＨ
の低下を防止し生産性を高める効果がある。その低鉄、
マンガン、亜鉛の微飯金属イオンの共存も効果的な場合
もある。酵素生産に誘導的効果を示す添加物を除いた場
合の本発明に好適な培地成分を一例としてあげると、可
溶性澱粉１．５％、ペプトン０．４％Ｉ酵母エキス０．
４％、肉エキス０．２％、炭酸カルシウム０．２％、リ
ン酸二カｌＪウム０．１％、硫酸マグネシウム（７水塩
）０．０５％、 Ｆｅ５Ｏ４（７水塩）０．００２％（
ＰＨ７，２）である。該基本培地に酵素の生産に誘導的
効果を示す、コレステロール、米糠油あるいけ大豆油を
添加すれば、更に生産性が高められる。この場合夫々の
菌株により好適な添加物があり、それぞれ適した添加物
の選択が必要である。
地は、窒紫源、炭素源、無機塩、その他の生育促進物質
を加えた栄養培地に酵素の生産性を高めるために、コレ
ステフール、米糠油あるいけ大豆油を添加して使用する
。蟹素源としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、
Ｏ８Ｌ等の窒素性有機化合、物の組合せが有効であり、
炭素源としては、特に可溶性澱粉が効果的である。無機
塩としては、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウムの添
加が効果的であり、また、炭酸カルシウムの添加はＰＨ
の低下を防止し生産性を高める効果がある。その低鉄、
マンガン、亜鉛の微飯金属イオンの共存も効果的な場合
もある。酵素生産に誘導的効果を示す添加物を除いた場
合の本発明に好適な培地成分を一例としてあげると、可
溶性澱粉１．５％、ペプトン０．４％Ｉ酵母エキス０．
４％、肉エキス０．２％、炭酸カルシウム０．２％、リ
ン酸二カｌＪウム０．１％、硫酸マグネシウム（７水塩
）０．０５％、 Ｆｅ５Ｏ４（７水塩）０．００２％（
ＰＨ７，２）である。該基本培地に酵素の生産に誘導的
効果を示す、コレステロール、米糠油あるいけ大豆油を
添加すれば、更に生産性が高められる。この場合夫々の
菌株により好適な添加物があり、それぞれ適した添加物
の選択が必要である。
これら誘導的物質は培地中に０．５〜２％程度添加され
る。また、培養は３０℃で好気的に２０〜４０時間培養
される。
る。また、培養は３０℃で好気的に２０〜４０時間培養
される。
かくして培養するとＣＯは菌体中及び菌体外に生産され
、培養物から００を回収するにあたっては、培養液に界
面活性剤を添加して菌体内酵素を菌体外に溶出せしめ、
次いで遠心分離あるいけｐ過法で除菌したのち、除菌液
からアセトン或いはエタノール等の有機溶媒による沈澱
法、或いは硫安、その他の塩類による塩析法等の公知の
酵素精製法が用いられる。
、培養物から００を回収するにあたっては、培養液に界
面活性剤を添加して菌体内酵素を菌体外に溶出せしめ、
次いで遠心分離あるいけｐ過法で除菌したのち、除菌液
からアセトン或いはエタノール等の有機溶媒による沈澱
法、或いは硫安、その他の塩類による塩析法等の公知の
酵素精製法が用いられる。
次に本発明に用いるＣＯの活性測定法を示す。
コレステロールを基質として生成する過酸化水素をさら
に４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）とフェノールの
存在でペルオキシダーゼ（ｐｏ）で分解し、同時に４−
ＡＡとフェノールを定量的に酸化縮合せしめ、生成する
キノンイミン色素量を５００ ｕｍで定量することによ
り、ＣＯの酵素力価を求める。酵素反応液の組成および
反応条件は以下の通りである。
に４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）とフェノールの
存在でペルオキシダーゼ（ｐｏ）で分解し、同時に４−
ＡＡとフェノールを定量的に酸化縮合せしめ、生成する
キノンイミン色素量を５００ ｕｍで定量することによ
り、ＣＯの酵素力価を求める。酵素反応液の組成および
反応条件は以下の通りである。
反応液の組成
ｏｏ、ＩＭＫ−リン酸緩衝液（ＴＩＨ７，Ｏ） ２
．＋＋ｓ−ｏ １．７６％４−ＡＡ水溶液
０．０５′ｏ ６．０％フェノール水溶液
０．ｌＯａｇＯＰＯ溶液（１５０プルブロガ
リン単位／ａＺＯ，ＩＭＫ−リン酸緩衝液ｐＨ７，０）
Ｏ，１０ｍ０ コレステロール溶
液（１２，ｅｍＭ（５％トリトン−２，５％タウロコー
ル酸溶液）） ０．２０ｍ１０
酵素液（０，１−０゜５単位／ｍ） ０．
０５ｍ反応条件 ３７℃で反応せしめ、生成するキノンイミン色素量を５
００ ｎｍで測定し、１分間当りの生成量を定量する。
．＋＋ｓ−ｏ １．７６％４−ＡＡ水溶液
０．０５′ｏ ６．０％フェノール水溶液
０．ｌＯａｇＯＰＯ溶液（１５０プルブロガ
リン単位／ａＺＯ，ＩＭＫ−リン酸緩衝液ｐＨ７，０）
Ｏ，１０ｍ０ コレステロール溶
液（１２，ｅｍＭ（５％トリトン−２，５％タウロコー
ル酸溶液）） ０．２０ｍ１０
酵素液（０，１−０゜５単位／ｍ） ０．
０５ｍ反応条件 ３７℃で反応せしめ、生成するキノンイミン色素量を５
００ ｎｍで測定し、１分間当りの生成量を定量する。
酵素力価
１分間に１μモルの過酸化水素を生成する（１／ｚμモ
ルのキノンイミン色素の生成に相当）＃素置を１単位と
する。
ルのキノンイミン色素の生成に相当）＃素置を１単位と
する。
次に本発明を実施例を用いて説明する。
実施例 ｌ
可溶性澱粉１．５％、ペプトン０．４％、酵母エキス０
．４％、肉エキス０．２％、炭酸カルシウム０．２％、
リン酸二カリウム０．１％、硫酸マクネシウム（７水塩
）０．０５％、 Ｆｅ５Ｏ４（７水塩）０．００２％、
酵素誘導物質１．０％（１）Ｈ７，２）からなる培地１
４６を含む２０ｅ容ジャーファーメンタ−に予め同組成
培地で培養（培地５０−１５０〇−容、坂ロフラスコ、
３０℃、２Ｂ）しておいた夫々の菌株を植菌（１４０ｔ
ｄ）ｌ、、３０℃で通気（１４１１分）、攪拌（８，０
ＯＯｒ、ｐ、ｍ）培養した。次いで経時的に試料を取り
出し、ＣＯ活性を測定した。尚ＣＯ活性は、培養液１０
−にｌ Ｏ％ （ｗ／ｖ） ）リントンＸ−１００溶液
０．１５４添加し、室温で１５分間放置後、遠心分離し
て得られる上澄液について測定した。
．４％、肉エキス０．２％、炭酸カルシウム０．２％、
リン酸二カリウム０．１％、硫酸マクネシウム（７水塩
）０．０５％、 Ｆｅ５Ｏ４（７水塩）０．００２％、
酵素誘導物質１．０％（１）Ｈ７，２）からなる培地１
４６を含む２０ｅ容ジャーファーメンタ−に予め同組成
培地で培養（培地５０−１５０〇−容、坂ロフラスコ、
３０℃、２Ｂ）しておいた夫々の菌株を植菌（１４０ｔ
ｄ）ｌ、、３０℃で通気（１４１１分）、攪拌（８，０
ＯＯｒ、ｐ、ｍ）培養した。次いで経時的に試料を取り
出し、ＣＯ活性を測定した。尚ＣＯ活性は、培養液１０
−にｌ Ｏ％ （ｗ／ｖ） ）リントンＸ−１００溶液
０．１５４添加し、室温で１５分間放置後、遠心分離し
て得られる上澄液について測定した。
得られた結果は第１表に示される。
第 １ 表
実施例 ２
溶液１５０＋７を加え、室温で１５分間攪拌後、遠心分
離で除菌し、得られた除菌液に先ず０．１５飽和に硫酸
アンモニウムを添加して生じた沈澱をｆ別し、このｐ液
に更に終濃度０．５飽和に硫酸アンモニウムを加え、生
じた沈澱物を沖取して、５０ｍＭＫ−リン酸緩衝液（Ｔ
ＩＨ７゜５）の約５００−で溶解した。この溶解液を次
いで予めｌ ＯｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で
平衡化したセファデックスＧ−２５を充填したカラム（
５ｅ容カラム）に通じて脱塩後、凍結乾燥して酵素標品
を得た。夫々の菌株の培養物から得られた酵素標品は第
２表に示される。
離で除菌し、得られた除菌液に先ず０．１５飽和に硫酸
アンモニウムを添加して生じた沈澱をｆ別し、このｐ液
に更に終濃度０．５飽和に硫酸アンモニウムを加え、生
じた沈澱物を沖取して、５０ｍＭＫ−リン酸緩衝液（Ｔ
ＩＨ７゜５）の約５００−で溶解した。この溶解液を次
いで予めｌ ＯｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で
平衡化したセファデックスＧ−２５を充填したカラム（
５ｅ容カラム）に通じて脱塩後、凍結乾燥して酵素標品
を得た。夫々の菌株の培養物から得られた酵素標品は第
２表に示される。
１工余白
第 ２ 表
特許出願人 東洋紡績株式会社
Claims (1)
- ストレプトマイセス・７ラボペルシクス エフ０１２７
６９、ストレプトマイセス番アスペルギロイデス エＦ
０ １３４６１．ストレプトマイセス ０カブエンシス
ＩＦｏ １３０２４またはストレプトマイセス・グ
リセオラベンダス エＦＯ１３０４５ヲ培養し、培養物
からコレステロールオキシタ゛−ゼを採取することを特
徴とするコレステロールオキシダーゼの製造法０
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56205720A JPS58107175A (ja) | 1981-12-18 | 1981-12-18 | コレステロ−ルオキシダ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56205720A JPS58107175A (ja) | 1981-12-18 | 1981-12-18 | コレステロ−ルオキシダ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58107175A true JPS58107175A (ja) | 1983-06-25 |
| JPS6121075B2 JPS6121075B2 (ja) | 1986-05-24 |
Family
ID=16511564
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56205720A Granted JPS58107175A (ja) | 1981-12-18 | 1981-12-18 | コレステロ−ルオキシダ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58107175A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5171681A (en) * | 1989-07-24 | 1992-12-15 | Toyo Jozo Kabushiki Kaisha | Omega-carboxyalcohol oxidase |
-
1981
- 1981-12-18 JP JP56205720A patent/JPS58107175A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5171681A (en) * | 1989-07-24 | 1992-12-15 | Toyo Jozo Kabushiki Kaisha | Omega-carboxyalcohol oxidase |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6121075B2 (ja) | 1986-05-24 |
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