ES2256885T3 - Nuevas quimiocinas del tipo cc. - Google Patents

Abstract

LAS QUIMIOQUINAS DEL TIPO CC PERTENECEN A UNA FAMILIA DE POLIPEPTIDOS, QUE SE HA DEMOSTRADO QUE SON MEDIADORES DE REACCIONES INMUNOLOGICAS, Y ULTIMAMENTE HAN ATRAIDO LA ATENCION A CAUSA DE SU ACTIVIDAD ANTIVIRAL EN RELACION CON EL HIV. SE DESCRIBE UNA CLONACION Y CARACTERIZACION MOLECULAR DE UN GEN HUMANO DE EQUIPO, QUE CONTIENE LAS PARTES CODIFICANTES UNIDAS UNAS CON OTRAS PARA DOS NUEVAS QUIMIOQUINAS DEL TIPO CC, CUYAS SECUENCIAS SON IDENTICAS EN LA MEDIDA CON LA DE MIP - 1 AL . LA TRANSCRIPCION DEL GEN DE CONJUNTO LLEVA A UNA TRANSCRIPCION MADURA BICISTRONICA, QUE CONTIENE LAS PARTES DE LECTURA ABIERTA QUE NO COINCIDEN PARA EL FACTOR HCC - 1 ESCRITO RECIENTEMENTE, Y PARA UNA QUIMIOQUINA DE TIPO CC HASTA AHORA DESCONOCIDA, LLAMADA CC - 2. MEDIANTE DIVISION ALTERNATIVA DE LA TRANSCRIPCION PRIMARIA, SE OBTIENE AL MENOS UNA QUIMIOQUINA DEL TIPO CC, QUE ES LA CITOQUINA CC - 3. DENTRO DEL GEN DE CONJUNTO SE PUEDEN IDENTIFICAR DOS LUGARES DE PROMOTOR FUNCIONAL. LOS DATOS DESCRITOS DAN UNA INFORMACION FUNDAMENTAL SOBRE LA ESTRUCTURA Y EXPRESION DEL NUEVO GEN HUMANO DE CONJUNTO CC - 2/HCC - 1, Y DESCRIBE UN MECANISMO QUE SE PODRIA UTILIZAR PARA REGULAR LA COEXPRESION DE GENES MUY UNIDOS EN EUCARIONTES SUPERIORES.

Description

Nuevas quimiocinas del tipo CC.

Es objeto de la presente invención el ácido nucleico de un gen en tándem, que codifica dos polipéptidos de la clase de las citocinas, las citocinas CC-2 y CC-3, así como sus fragmentos y/o derivados biológicamente activos, un medicamento que contiene los péptidos según la invención, un agente de diagnóstico, así como el uso de las citocinas CC-2 y CC-3 para indicaciones médicas.

Las quimiocinas del tipo CC pertenecen a una familia de polipéptidos que han demostrado ser mediadores de reacciones inmunes y que últimamente despiertan interés debido a su efecto antiviral en relación con el VIH.

Las quimiocinas son polipéptidos básicos pequeños, que se unen a heparina, y que participan en la producción de reacciones inmunes y en los procesos inflamatorios (1, 2). Los primeros miembros de esta familia se clonaron a mitad de los años 80 a partir de linfocitos tonsilares o macrófagos estimulados (3, 4). La familia se subdivide en función de la posición relativa de los dos primeros restos de cisteína en quimiocinas CXC y quimiocinas CC. La mayoría de las quimiocinas CXC y quimiocinas CC son quimiotácticas con respecto a células que participan en reacciones inmunes. Algunas quimiocinas CC muestran actividades biológicas múltiples, como el control de la proliferación y diferenciación de células precursoras hematopoyéticas (5, 6, 7, 8, 9), la activación y atracción de una amplia gama de células inmunes (10, 11) y la postulada participación en el control de la replicación de VIH-1 y VIH-2 en linfocitos T CD-4 positivos (12). Al grupo de las quimiocinas CC más frecuentemente descritas y mejor investigadas en relación con lo descrito anteriormente pertenecen MIP-1\alpha, MIP-1\beta y RANTES. La subdivisión de las quimiocinas en quimiocinas CC y quimiocinas CXC se refleja también en la estructura y la posición de sus genes en los cromosomas (14, 15, 16 y 17). En general, los genes para las quimiocinas CXC humanas se encuentran en el cromosoma 4 y constan de cuatro exones y tres intrones, mientras que los genes para las quimiocinas CC se encuentran en el cromosoma 17 en humanos y muestran una estructura conservada con tres exones y dos intrones (18, 19). En el año 1995 se descubrió un nuevo tipo de quimiocinas, la denominada familia C, que está representada por la linfotactina de ratón (20). Este descubrimiento muestra que las quimiocinas no se limitan a sólo dos subfamilias.

La invención se refiere, entre otros aspectos, a la clonación de un gen humano en tándem, así como a los correspondientes ARNm bicistrónicos maduros que contienen los marcos de lectura abiertos (ORF) para una nueva quimiocina CC con seis restos de cisteína, CC-2, así como para el factor HCC-1, descrito previamente. Este factor se aisló a partir de hemofiltrado humano y se ha demostrado que circula a altas concentraciones en el plasma humano de individuos sanos (1-5 nM), así como de pacientes con deficiencias renales (5-80 nM) (21). A diferencia de las otras quimiocinas CC relacionadas, HCC-1 no muestra ninguna actividad quimiotáctica frente a monocitos y sólo estimula ligeramente la movilización de Ca^{2+} intracelular, así como la liberación de enzimas en estas células. Además, se ha publicado que HCC-1 potencia la proliferación de las células madre de médula ósea CD-34 positivas en forma dependiente de la dosis (21). A pesar de los efectos descritos de HCC-1, su principal función biológica aún no está clara.

El ácido nucleico de un gen humano en tándem según la invención codifica dos nuevas quimiocinas del tipo CC, cuyas secuencias, erróneamente, son en cierta medida homólogas a la de MIP-1\alpha.

Por tanto, es objeto de la presente invención el ácido nucleico del gen en tándem con las secuencias siguientes:

Secuencia 925 PB; 240 A; 296 C; 199 G; 190 T;

1

y

Secuencia 973 PB; 257 A; 301 C; 215 G, 200 T;

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que codifica las citocinas humanas CC-2 y CC-3 con las siguientes secuencias de aminoácidos:

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La transcripción del gen en tándem genera un transcripto maduro bicistrónico que contiene los marcos de lectura abierta no superpuestos para el recientemente descrito factor HCC-1 y para CC-2. Mediante corte y empalme alternativo del transcripto primario se produce, además, al menos otra quimiocina del tipo CC, la citocina CC-3. Estas nuevas citocinas del tipo CC son igualmente objeto de la invención, así como sus derivados amidados, acetilados, fosforilados y/o glicosilados, biológicamente activos.

Dentro del gen en tándem, se pudieron identificar dos regiones promotoras funcionales. Se investigó su capacidad para inducir la expresión del gen en tándem. Los datos reseñados proporcionan conocimientos básicos sobre la estructura y la expresión del nuevo gen humano en tándem CC-2/HCC-1, y describen un mecanismo por el que podría regularse la coexpresión de genes estrechamente ligados entre sí en eucariotas superiores.

Según la invención, se reivindica un medicamento que contiene citocina CC-2 y/o CC-3, así como sus derivados amidados, acetilados, fosforilados y/o glicosilados, biológicamente activos, como componente activo. El medicamento se administra en la forma galénica correspondiente, adaptada y adecuada a su forma de administración. Así, el medicamento según la invención puede administrarse en la forma habitual para péptidos, por vía parenteral, intravenosa o intramuscular, intranasal o bucal. La cantidad de péptido que se administra está entre 10 y 3.000 \mug por unidad de administración.

El agente de diagnóstico según la invención contiene anticuerpos poli- o monoclonales contra el péptido según la invención, dado el caso en forma marcada por fluorescencia o radiactivamente para su empleo en los ensayos ya conocidos ELISA o RIA.

Los péptidos según la invención, citocina CC-2 y/o CC-3, pueden usarse para la preparación de un medicamento para el tratamiento de alteraciones en la migración celular, enfermedades del sistema inmune, tumores, así como disfunción de las funciones reguladoras del crecimiento.

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El ADNc de longitud completa de la secuencia del ADNc bicistrónico CC-2/HCC-1 se obtuvo mediante PCR RACE-5', usando 5 \mug de ARN total de células T 84. El fragmento de PCR se secuenció y reamplificó directamente a partir de la primera cadena de ADNc de hígado de adultos, en lo que se usó un cebador oligo dT en combinación con un cebador específico (35 ciclos); después, siguió una segunda etapa de amplificación (30 ciclos) con cebadores anidados. Un análisis de secuencia asistido por ordenador confirmó dos marcos de lectura abiertos (ORF) dentro del ADNc. El ORF situado cadena arriba codifica un hipotético precursor, con una longitud de 113 aminoácidos (aa). De forma interesante, la traducción del primer ORF termina mediante tres codones de parada. Una representación gráfica de hidrofobicidad mostró una secuencia N-terminal hidrófoba de 20 aa, en la que podría tratarse de un péptido líder. La secuencia del péptido hipotético, al que denominamos CC-2, es homóloga al 46% a la de MIP-1\alpha, pero contiene dos restos de cisteína adicionales. La ORF situada cadena abajo codifica HCC-1. Un corte y empalme alternativo dentro del intrón 1 del transcripto primario conduce a una variante peptídica de HCC-1 que contiene 16 aminoácidos adicionales.

Se determinó la estructura del gen en tándem humano CC-2/HCC-1. El gen en tándem de 20 kpb, que se aisló de un fago \lambda-FIX-II, a su vez aislado de un banco génico humano, contiene siete exones, de los cuales, los exones \alpha-\delta codifican el péptido hipotético CC-2 y los exones 1-3 codifican HCC-1. La región completa se cartografió mediante análisis de restricción. El orden y orientación de los fragmentos de restricción SstI se determinó mediante secuenciación de las regiones flanqueantes de cada sitio de restricción SstI. La secuenciación se llevó a cabo mediante un secuenciador automático de fluorescencia. Los fragmentos de restricción que contenían el gen HCC-1 se identificaron por análisis de transferencia Southern, con el ADNc de HCC-1 como sonda radiactiva. Los quince pares de bases terminales del ADNc monocistrónico de HCC-1 no se encuentran en el ARNm bicistrónico; por tanto son al mismo tiempo parte del exón 1 y del intrón \delta. La secuencia génica de CC-2 se determinó mediante paseo con cebador. Todas las conexiones de corte y empalme exón/intrón coinciden bien con las secuencias consenso. Las secuencias de los cebadores se derivaron del ADNc bicistrónico de CC-2. La actividad de los dos promotores se investigó mediante un ensayo del gen indicador de la luciferasa. Los puntos de iniciación de la transcripción se determinaron previamente mediante extensión de cebador, PCR-TR semicuantitativa y RACE-5'.

La invención se ilustra con más detalle mediante los ejemplos siguientes.

Para investigar la regulación del gen HCC-1, se clonó el gen que codifica HCC-1 usando un ADNc parcial de HCC-1 como sonda de hibridación. El análisis de secuencia mostró que la organización de HCC-1 concuerda bien con la estructura descrita de tres exones y dos intrones, típica de un gen de quimiocina CC. Para obtener la localización cromosómica del gen, se llevó a cabo una reacción PCR, en la que se usó ADN de tres híbridos de células de ratón, cada uno de los cuales contenía una porción definida de cromosomas humanos. Los resultados indican que el gen HCC-1 se encuentra en el cromosoma 17 y, por tanto, puede clasificarse en la subfamilia de los genes de quimiocinas CC.

Para la investigación de la actividad del promotor de HCC-1 se procedió de la forma siguiente. Primeramente, se determinó el punto de iniciación de la transcripción mediante extensión de cebador y análisis de PCR-TI semicuantitativa (PCR con transcriptasa inversa), lo que mostró que en el hígado existía una iniciación alternativa de la transcripción, en contraste con la médula ósea y las amígdalas. Aproximadamente 700 pb de la región situada cadena arriba, que contenía elementos probablemente reguladores así como un motivo de caja TATA, se clonaron delante del gen indicador de la luciferasa en el vector pGL-2 básico. Los ensayos del gen indicador se llevaron a cabo transfectando tres líneas celulares diferentes, denominadas HUH-7, T 84 y RK 13, con la construcción denominada promotor de HCC-1/gen indicador, así como con cinco construcciones de eliminación acortadas en el extremo 5'. Las células HUH-7 y T 84 se ensayaron antes de la transfección en cuanto a la expresión del gen HCC-1, y ambas líneas celulares expresaron visiblemente el gen HCC-1. Sorprendentemente, en las células HUH-7 y T 84 sólo se pudo medir una débil actividad promotora (del doble al triple de la actividad de fondo) y en las células RK 13 se demostró una baja actividad (seis veces la actividad de fondo). Sin embargo, un análisis por transferencia Northern mostró señales intensas de ARNm de HCC-1 en el hígado y señales claramente identificables en el intestino grueso (21), lo que permite suponer que la actividad del promotor de HCC-1 in vivo depende de un elemento potenciador, que faltaba en las construcciones del gen indicador.

Durante una investigación rutinaria de secuencias en un banco de datos con marcadores de secuencias expresadas (EST), se encontró una secuencia parcial de ADNc de HCC-1 extendida en el extremo 5'. La secuencia adicional 5'-terminal no se encontraba representada en la región reguladora cadena arriba de HCC-1 ensayada en cuanto a su actividad promotora, lo que permite por tanto suponer la existencia de al menos otro exón situado cadena arriba no traducido. De forma interesante, los quince nucleótidos 5'-terminales del ADNc de HCC-1 (21) no se encontraban representados en el ADNc extendido, lo que demuestra que el fragmento analizado en el ensayo del gen indicador es una parte del promotor de HCC-1. Estos descubrimientos indicaron sorprendentemente, que existía una segunda región promotora delante del primer exón no traducido. Para localizar el segundo promotor dentro del gen, primeramente se aisló el ADNc extendido de HCC-1 completo con ayuda del procedimiento de PCR RACE-5'. En ello se usó ADNc de la primera cadena sintetizada a partir del ARN total de células T 84. El producto obtenido contenía 441 nucleótidos adicionales en comparación con la secuencia publicada del ADNc de HCC-1. Es de destacar que en el banco de datos se pudo encontrar una EST que se ajusta a la terminación 5' del producto obtenido en el procedimiento PCR RACE. Esto aumenta la probabilidad de que el ADNc extendido corresponda a la longitud completa. Un análisis de la secuencia del ADNc mostró que el primer ORF 5'-terminal del ADNc no codifica HCC-1, sino una nueva quimiocina CC, CC-2. El propéptido derivado de esta secuencia de ADNc consta de 113 aminoácidos y contiene una secuencia N-terminal hidrófoba de 20 aminoácidos con las características típicas de un péptido líder. Una investigación comparativa de secuencias mostró que los precursores de CC-2 y MIP-1\alpha tienen una secuencia idéntica al 46%. Sin embargo, la hipotética CC-2 contiene seis restos de cisteína, lo que también ha sido descrito recientemente para dos nuevas quimiocinas CC de ratón, C 10 (22) y CCF 18 (23), que sólo muestran una reducida homología de secuencia frente a CC-2, pero que cuentan con el mismo patrón de cisteínas. La quimiocina CC humana I-309 (27) contiene asimismo seis restos de cisteína, pero no presenta la misma posición relativa en cuanto a los dos restos de cisteína adicionales. Por tanto, CC-2, C 10 y CCF 18 podrían formar un nuevo subgrupo de quimiocinas CC, que están conservadas en humanos y ratones y que contienen un hipotético enlace adicional por puentes disulfuro. Para demostrar que el transcripto bicistrónico se sintetiza también en células de tejido no transformadas, el ADNc de longitud completa se aisló a partir de la primera cadena del ADNc de hígado de adultos y se secuenció. Los marcos de lectura abiertos para CC-2 y HCC-1 no se solapan y se encuentran a 101 nucleótidos de distancia entre sí. Un clon de ADNc secuenciado contenía 48 nucleótidos adicionales en la región codificante situada cadena abajo, lo que conduce a una variante peptídica de HCC-1 que contiene 16 aminoácidos adicionales. Esta quimiocina CC se denominó CC-3. Una comparación con la secuencia genómica del gen HCC-1 mostró que el exón adicional se encuentra dentro del intrón 1 y que se genera por corte y empalme alternativo del transcripto primario.

Además, se determinó la estructura de la secuencia genómica de CC-2 y se investigó la regulación del gen correspondiente. Para ello, se cartografió la inserción completa del fago \lambda-FIX-II, aislado originalmente durante el cribado del gen HCC-1. Se encontró un fragmento de restricción de 16 kpb que contiene la región 5'-cadena arriba del gen HCC-1. Un análisis de secuencia confirmó por completo la región codificante de la secuencia nucleotídica de CC-2 dentro de este fragmento. A diferencia de todos los otros genes de quimiocinas CC conocidos, que contienen tres exones separados entre sí por dos intrones, la región codificante del gen CC-2 consta de cuatro exones, separados entre sí por tres intrones. La distancia entre el extremo del exón \delta del gen CC-2 y el exón 1 del gen HCC-1 es de aproximadamente 12 kpb. La región cadena arriba del exón \alpha del gen en tándem contiene un motivo de caja TATA (TATAAAT) en la posición -32 respecto del punto de iniciación de la transcripción, pero ni motivos de cajas GC ni CCAAT. La actividad relativa de aproximadamente 900 pb del supuesto promotor, clonado en el vector pGL-2 básico, se analizó mediante transfección de células T 84. Se demostró que el promotor presentaba una actividad de 8 a 9 veces el nivel de fondo, lo que prueba que el gen en tándem se transcribe activamente. Si se toma en consideración la relativamente débil actividad de los dos promotores, se cae en la tentación de establecer suposiciones acerca de si ambas regiones promotoras interaccionan positivamente entre sí, lo que conduciría a la intensa expresión constitutiva del gen HCC-1 en el hígado y en otros tejidos diferentes. Sin embargo, la existencia de dos regiones promotoras dentro del complejo del gen en tándem permite suponer que las dos unidades de transcripción del gen en tándem también pueden activarse independientemente entre sí. Esto subraya la importancia de las regiones espaciadoras intergénicas, que al parecer pueden hacer de intrones y, por tanto, bajo determinadas circunstancias, quizá representen regiones importantes en el genoma de eucariotas para la conexión de genes estrechamente ligados entre sí. La existencia de ARNm maduros bicistrónicos en humanos y ratones se describió primeramente para GDF-1 y un segundo factor desconocido, que se denominó UOG-1 (28). El gen en tándem CC-2/HCC-1 representa por tanto el segundo ejemplo de un ARNm humano bicistrónico maduro, lo que apoya la hipótesis de que transcriptos maduros policistrónicos están probablemente más extendidos en eucariotas superiores. Como se ha demostrado recientemente para el factor de transcripción GATA-1 (24) y algunos otros factores (25, 26), el uso de codones de iniciación ATG internos no se limita a ARNm procarióticos, sino que se presenta también en células eucariotas. Aún queda por demostrar si la traducción de los ARNm maduros policistrónicos de eucariotas conduce a productos génicos múltiples. En cuanto a este aspecto, nuestro trabajo proporciona nuevos conocimientos básicos sobre la estructura y la regulación de genes estrechamente ligados entre sí y la formación de ARNm policistrónicos.

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28. Lee, S. J., Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 4250-4254 (1991)

Claims (6)

1. El ácido nucleico de un gen en tándem con las secuencias siguientes

Secuencia 925 PB; 240 A; 296 C; 199 G; 190 T;

5

y

Secuencia 973 PB; 257 A; 301 C; 215 G, 200 T;

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que codifican las citocinas humanas CC-2 y CC-3 con las siguientes secuencias de aminoácidos:

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2. Citocina CC-2 con la secuencia de aminoácidos indicada en la reivindicación 1, así como sus derivados amidados, acetilados, fosforilados y/o glicosilados, biológicamente activos.

3. Citocina CC-3 con la secuencia de aminoácidos indicada en la reivindicación 1, así como sus derivados amidados, acetilados, fosforilados y/o glicosilados, biológicamente activos.

4. Medicamento que contiene la citocina CC-2 y/o CC-3 según la reivindicación 2 y/o 3 como componente activo.

5. Agente de diagnóstico que contiene anticuerpos poli- o monoclonales contra la citocina CC-2 y/o CC-3 según la reivindicación 2 y/o 3, o los ácidos nucleicos que codifican las citocinas, ARNm, así como los ácidos nucleicos según la reivindicación 1.

6. Uso de la citocina CC-2 y/o CC-3 según la reivindicación 2 y/o 3 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de alteraciones en la migración celular, enfermedades del sistema inmune, tumores, así como disfunción de las funciones reguladoras del crecimiento.