ES2325718B1

ES2325718B1 - Agentes anti-tumorales basados en la proteina viral a238l.

Info

Publication number: ES2325718B1
Application number: ES200702594A
Authority: ES
Inventors: Manuel Fresno Escudero; Yolanda Revilla Novella; Aitor Gonzalez Granja
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad Autonoma de Madrid
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad Autonoma de Madrid
Priority date: 2007-10-03
Filing date: 2007-10-03
Publication date: 2010-06-07
Anticipated expiration: 2027-10-03
Also published as: WO2009043960A1; ES2325718A1

Abstract

Agentes anti-tumorales basados en la proteína viral
A238L.

Se describe el empleo de un producto seleccionado entre (i) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, relacionada con la proteína viral A238L, o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de la misma; (ii) un polinucleótido que codifica dicha proteína, variante o fragmento, (iii) una construcción génica que comprende dicho polinucleótido, (iv) un vector que comprende dicho polinucleótido o dicha construcción génica, y (v) una célula hospedadora que comprende dicho polinucleótido, construcción génica o dicho vector, en la elaboración de una composición farmacéutica anti-tumoral para el tratamiento y/o prevención de tumores y cáncer.

Description

Agentes anti-tumorales basados en la proteína viral A238L.

Campo de la invención

La invención se relaciona, en general, con el empleo de polinucleótidos y proteínas relacionados con el gen viral A238L y su producto de expresión, la proteína viral A238L, como agentes antitumorales, útiles para el tratamiento de tumores y cánceres, y con composiciones farmacéuticas que contienen dichos polinucleótidos y proteínas.

Antecedentes de la invención Tratamiento tumoral

El procedimiento más común para el tratamiento de enfermedades tumorales se basa en el uso de agentes químicos, es decir, la quimioterapia. Estos tratamientos, sin embargo, no actúan de manera selectiva, de forma que no sólo atacan a las células tumorales sino también al tejido sano, el cual queda muy dañado. Por consiguiente, seria muy deseable disponer de nuevos agentes anti-tumorales que reduzcan o eliminen estos efectos y con los cuales se pueda tratar el tumor selectivamente.

Las endostatinas (ES) son inhibidores de la migración de células endoteliales y de la angiogénesis y se ha demostrado que reducen el crecimiento tumoral en modelos animales. Boehm et al. (Boehm T, Folkman J, Browder T, O'Reilly MS. Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance. Nature. 1997 Nov 27; 390 (6658): 404-7) describen el empleo, como modelo experimental, de ratones a los que se les habían implantado diversos tumores. En los ratones no tratados con ES, dichos tumores crecieron rápidamente, provocando la muerte del animal. En cambio, los ratones tratados con ES después del desarrollo de tumores, se observó una reducción del volumen tumoral hasta alcanzar un tamaño casi microscópico. El tratamiento cíclico con ES de ratones portadores de tumor produjo una regresión completa de los tumores en modelos animales. Sin embargo, ensayos clínicos que se están llevando a cabo con ES no han reportado una inhibición significativa del crecimiento tumoral y raras veces se ha observado regresión tumoral. Desgraciadamente, este no es un ejemplo aislado y otros ensayos clínicos que incluyen diferentes moléculas anti-tumorales también son decepcionantes, a pesar de lo notables que fueron los efectos anti-tumorales en los modelos animales. En este contexto, parece lógico combinar varios agentes anti-tumorales para el tratamiento de tumores.

A pesar de los esfuerzos realizados hasta la fecha, sigue existiendo la necesidad de desarrollar nuevos agentes anti-tumorales útiles como agentes terapéuticos para el tratamiento o prevención de patologías que cursan con el desarrollo de tumores.

Ahora se ha encontrado, que la proteína A238L del virus de la peste porcina africana puede ser utilizada como agente anti-tumoral, por lo que dicha proteína puede servir de base para el desarrollo de nuevos agentes anti-tumorales.

Proteína A238L

Muchos virus de ADN codifican proteínas que ayudan al virus a evadir el sistema inmune del hospedador. El virus de la peste porcina africana (ASFV, del inglés African swine fever virus) es un virus de ADN bicatenario que codifica una potente proteína inmunosupresora, la proteína A238L. La proteína A238L de ASFV inhibe la activación del factor de transcripción NF-\kappaB así como la actividad de la calcineurina, una fosfatasa regulada por calcio y calmodulina. El mecanismo por el cual se lleva a cabo la inhibición del factor de transcripción NF-\kappaB es aún desconocido, aunque se cree que puede ser mediante la unión de la proteína viral a la subunidad p65 del factor de transcripción.

Durante la infección viral, la proteína A238L de ASFV se expresa como dos formas de peso molecular distinto, una de 28 kDa y otra de 32 kDa. Ambas formas de la proteína A238L se producen a partir de un único ADN complementario (ADNc), lo que sugiere que dicha diferencia en el peso molecular se debe a una modificación post-traduccional de la proteína. Sin embargo, la naturaleza de dicha modificación no es conocida. Ambas formas se producen tras la infección y la de mayor peso molecular, 32 kDa, se acumula en el núcleo celular a largos periodos tras la infección. El virus tiene entonces el potencial de inhibir la activación transcripcional de genes inmunomoduladores dependientes de estas rutas de señalización en células infectadas, tales como macrófagos.

La función de A238L como inhibidora de la actividad fosfatasa de la calcineurina está mediada por la unión directa a la subunidad catalítica de la calcineurina. Dicha proteína se activa produciéndose una liberación de calcio y la unión de la calmodulina.

Compendio de la invención

La invención se basa en que los inventores, han observado que la expresión de un polinucleótido que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, relacionada con la proteína A238L de AFSV, inhibe la proliferación celular y/o la migración de células tumorales in vitro. Asimismo, en experimentos in vivo se ha observado que la expresión de dicha proteína en ratones xenotrasplantados con células tumorales que expresan dicha proteína inhibe el crecimiento tumoral, por lo que dicha proteína, o una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de la misma, así como un polinucleótido que codifica dicha proteína, variante o fragmento funcionalmente equivalente, pueden ser utilizados como agente terapéutico, en particular, como agente anti-tumoral, en el tratamiento y/o prevención de tumores y cáncer.

Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende un producto seleccionado entre (i) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de la misma; (ii) un polinucleótido que codifica dicha proteína, variante o fragmento funcionalmente equivalente, (iii) una construcción génica que comprende dicho polinucleótido, (iv) un vector que comprende dicho polinucleótido o dicha construcción génica, y (v) una célula hospedadora que comprende dicho polinucleótido, construcción génica o dicho vector; y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización particular, dicha proteína es la proteína viral A238L de ASFV. En otra realización particular, dicho polinucleótido comprende, o está constituido por, el gen A238L que codifica la proteína A238L.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo del producto previamente identificado en la elaboración de una composición farmacéutica anti-tumoral.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para inhibir la proliferación celular o para inhibir la migración celular que comprende poner en contacto un cultivo celular con una composición que comprende dicho producto previamente identificado.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1A es una diagrama que muestra la inhibición de la actividad del promotor de la enzima inducible COX-2 por efecto de la proteína A238L tras estimulación de las células (Caco-pcDNA y Caco-A238L) con PMA 15 ng/mL más ionóforo de calcio 1 \muM (PMA/Ion). La Figura 1B muestra un gel de electroforesis de la RT-PCR llevada a cabo para detectar el ARNm de específico de COX-2. En la Figura puede observarse la inhibición inducida sobre la expresión del ARNm de COX-2 por la presencia de A238L.

La Figura 2 es una representación gráfica que muestra la síntesis de prostaglandina E_{2} (PGE2) en líneas celulares derivadas de células Caco-2 (Caco-pcDNA y Caco-A238L). En dicha representación gráfica puede observarse cómo la síntesis de PGE2 está inhibida en células Caco-A238L (una línea celular que expresa la proteína viral A238L de forma estable).

La Figura 3 es una fotografía que muestra el resultado de un ensayo de proliferación celular in vitro en células que expresan de forma estable la proteína A238L (Caco-A238L) frente a células control Caco-pcDNA.

La Figura 4 es una representación gráfica que muestra la tasa de migración de las células Caco-pcDNA y Caco-A238L en condiciones de reposo (basal) y tras estimulación con PMA/Ion. En las gráficas puede observarse cómo la expresión de A238L inhibe la migración de células tumorales in vitro.

La Figura 5 es un diagrama de barras ilustrativo de que la expresión de la proteína viral A238L en células Jurkat-A238L inhibe la migración celular basal, en condiciones de reposo, con respecto a células Jurkat control (Jurkat-pcDNA) que no expresan dicha proteína viral.

La Figura 6 es un diagrama de barras ilustrativo de que la expresión de la proteína viral A238L en células Jurkat (Jurkat-A238L) inhibe la migración inducida por los agentes promotores de tumores y activadores farmacológicos de la expresión de COX-2 PMA e Ion.

La Figura 7 es un diagrama de barras ilustrativo de que la expresión de la proteína viral A238L en células Caco-A238L inhibe la migración basal, en condiciones de reposo.

La Figura 8 es un diagrama de barras ilustrativo de que la expresión de la proteína viral A238L en células Caco-A238L inhibe la migración inducida por estimuladores de la expresión de COX-2 (Ion).

La Figura 9 es un diagrama de barras ilustrativo de que la expresión de la proteína viral A238L en células Caco-A238L inhibe la migración inducida por agentes promotores de tumores (PMA).

La Figura 10 es un diagrama de barras ilustrativo de que la expresión de la proteína viral A238L en células Caco-A238L potencia la apoptosis inducida por los activadores farmacológicos de la expresión de COX-2 (PMA/Ion).

La Figura 11 es una gráfica que muestra el crecimiento de células de carcinoma de colon HT29 transfectadas in vivo en ratones "nude" (desnudos), bien con una construcción que codifica la proteína de fusión GFP-COX-2 o con dicha construcción más un plásmido de expresión pcDNA-A238L. Tras el transplante, los ratones fueron mantenidos en condiciones de esterilidad y de alimentación adecuadas los días señalados en la gráfica, y el tamaño del tumor desarrollado en ambos casos fue evaluado en cada uno de los puntos.

Descripción detallada de la invención

La invención se basa, en general, en que los inventores han observado que la expresión de un polinucleótido que codifica una proteína con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 inhibe la proliferación celular y la migración de células tumorales in vitro, así como el crecimiento tumoral in vivo en ratones xenotrasplantados con células tumorales que expresan dicha proteína, por lo que dicha proteína, o una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de la misma, así como un polinucleótido que codifica para dicha proteína, variante o fragmento funcionalmente equivalente, pueden ser utilizados como agentes terapéuticos, en particular, como agentes anti-tumorales, en el tratamiento y/o prevención del desarrollo de procesos tumorales y, por tanto, en la elaboración de composiciones farmacéuticas anti-tumorales. Dicho polinucleótido puede estar contenido en una construcción génica, en un vector o en una célula hospedadora que lo contiene.

Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con un producto seleccionado entre:

(i): una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de la misma;

(ii): un polinucleótido que codifica dicha proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de la misma;

(iii): una construcción génica que comprende dicho polinucleótido (ii);

(iv): un vector que comprende dicho polinucleótido (ii) o dicha construcción génica (iii); y

(v): una célula hospedadora que comprende dicho polinucleótido (ii), dicha construcción génica (iii) o dicho vector (iv);

como agente terapéutico, en particular, como agente anti-tumoral.

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De forma más concreta, en un aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica, en adelante composición farmacéutica de la invención, que comprende un producto seleccionado entre:

(iii): una construcción génica que comprende dicho polinucleótido (ii);

(v): una célula hospedadora que comprende dicho polinucleótido (ii), dicha construcción génica (iii) o dicho vector (iv); y

un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

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En una realización particular, la composición farmacéutica de la invención comprende una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de la misma, en adelante, "proteína de la invención", y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Por razones de simplicidad, bajo la denominación "proteína de la invención" se incluyen dicha proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de la misma, es decir, con actividad anti-tumoral. El término "proteína", tal como aquí se utiliza, incluye tanto la forma no modificada post-traduccionalmente como todas las formas de modificaciones post-traduccionales, por ejemplo glicosilación, fosforilación o acetilación.

En una realización particular, la proteína de la invención comprende, o está constituida por, la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 y presenta, al menos, actividad inhibitoria de la proliferación y/o migración celular de células tumorales, por lo que puede ser utilizada como agente terapéutico, en particular, como agente anti- tumoral. La actividad inhibitoria de la proliferación y/o migración celular de células tumorales de dicha proteína de la invención tanto in vitro como in vivo se ha puesto de manifiesto mediante los ensayos descritos en el Ejemplo 1. En una realización concreta, la proteína de la invención es la denominada proteína A238L del virus de la peste porcina africana (ASFV).

En el sentido utilizado en esta descripción, el término "variante" se refiere a un péptido sustancialmente homólogo y funcionalmente equivalente a la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1. Tal como aquí se utiliza, un péptido es "sustancialmente homólogo" a dicha proteína cuando su secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos de dicha proteína, de, al menos, un 60%, ventajosamente de, al menos un 70%, preferentemente de, al menos, un 85%, y, más preferentemente de, al menos, un 95%. Asimismo, la expresión "funcionalmente equivalente", tal como aquí se utiliza, significa que el péptido o proteína en cuestión mantiene, al menos, una de las funciones de la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, preferentemente, al menos, una función relacionada con la inhibición de la proliferación y/o migración celular, en particular, con la inhibición de la proliferación y migración de células tumorales, y desarrollar una actividad anti-tumoral. La actividad inhibitoria de la proliferación o migración celular de células tumorales in vitro así como la actividad inhibitoria del crecimiento o proliferación tumoral in vivo en animales que expresan dicha proteína se puede determinar mediante métodos convencionales tales como los ensayos descritos en el Ejemplo 1 (véase el apartado relativo a los Materiales y Métodos).

En una realización particular, dicha variante es una forma mutante de la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 que mantiene la actividad inhibitoria de la proliferación y/o migración de células tumorales. Dicha forma mutante puede presentar inserciones, deleciones o modificaciones de uno o más aminoácidos respecto a la proteína que comprende la SEQ ID NO: 1, con la condición de que conserve, al menos, una de dichas actividades inhibitorias de la proliferación y/o migración celular de células tumorales.

Asimismo, en el sentido utilizado en esta descripción, el término "fragmento" se refiere a un péptido que comprende una porción de dicha proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, es decir, una secuencia de aminoácidos contiguos comprendida dentro de dicha SEQ ID NO: 1. Para su empleo en la presente invención dicho fragmento debe ser funcionalmente equivalente a dicha proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, es decir, debe tener actividad inhibitoria de la proliferación y/o migración de células tumorales.

La proteína de la invención se puede obtener por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, a partir de un organismo productor de la misma, bien de forma nativa o recombinante, mediante un procedimiento que comprende cultivar dicho organismo bajo condiciones apropiadas para la expresión de dicha proteína y recuperarla. En una realización particular de esta invención, el organismo productor es el virus de la peste porcina africana (ASFV). En el Ejemplo 1 se describe la producción, aislamiento y purificación de una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, en concreto la proteína A238L de ASFV. Alternativamente, dicha proteína de la invención puede ser obtenida por métodos convencionales de síntesis química de proteínas conocidos por los expertos en la materia.

Adicionalmente, la proteína de la invención puede formar parte de una proteína de fusión. En este sentido, a modo ilustrativo, no limitativo, dicha proteína de fusión puede contener una región A constituida por un primer péptido que comprende la proteína de la invención unida a una región B que comprende un segundo péptido. Dicho segundo péptido puede ser cualquier péptido apropiado, por ejemplo, un péptido con actividad anti-tumoral. En una realización particular, dicho segundo péptido puede ser, también, una proteína de la invención. Dicha región B puede estar unida a la región amino-terminal de dicha región A, o bien, alternativamente, dicha región B puede estar unida a la región carboxilo-terminal de dicha región A. Ambas regiones A y B pueden estar unidas directamente o a través de un péptido espaciador (linker) entre dichas regiones A y B. La proteína de fusión puede obtenerse por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, mediante la expresión génica de la secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína de fusión en células hospedadoras apropiadas.

En otra realización particular, la composición farmacéutica de la invención comprende un polinucleótido que codifica la proteína de la invención, en adelante, "polinucleótido de la invención", y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Por razones de simplicidad, bajo la denominación "polinucleótido de la invención" se incluyen el polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de la invención, es decir, la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, así como un polinucleótido que codifica una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de dicha proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

En una realización concreta, el polinucleótido de la invención comprende, o está constituido por, la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, que codifica la proteína cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 1, proteína que presenta, al menos, actividad inhibitoria de la proliferación y/o migración de células tumorales, por lo que dicho polinucleótido de la invención que codifica dicha proteína puede ser utilizado como agente anti-tumoral. En una realización concreta, el polinucleótido de la invención comprende o está constituido por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 2) que codifica la denominada proteína A238L del virus de la peste porcina africana (ASFV).

El polinucleótido de la invención puede presentar variaciones en su secuencia respecto a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, por ejemplo, sustituciones, inserciones y/o deleciones de uno o más nucleótidos, con la condición de que el polinucleótido resultante codifica una proteína de la invención, tal como una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1. Por tanto, dentro del ámbito de la presente invención se encuentra cualquier polinucleótido sustancialmente homólogo y funcionalmente equivalente al polinucleótido de SEQ ID NO: 2, es decir, cualquier polinucleótido que codifica una proteína de la invención.

En el sentido utilizado en esta descripción, un polinucleótido es "sustancialmente homólogo" al polinucleótido de SEQ ID NO: 2 cuando su secuencia de nucleótidos tiene un grado de identidad respecto a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 de, al menos, un 60%, ventajosamente de, al menos un 70%, preferentemente de, al menos, un 85%, y, más preferentemente de, al menos, un 95%. Típicamente un polinucleótido sustancialmente homólogo al polinucleótido de SEQ ID NO: 2 se puede aislar de un organismo productor de la proteína de la invención en base a la información contenida en dicha SEQ ID NO: 2, o bien se construye en base a la secuencia de ADN mostrada en la SEQ ID NO: 2, por ejemplo, mediante la introducción de sustituciones conservativas o no conservativas. Otros ejemplos de posibles modificaciones incluyen la inserción de uno o más nucleótidos en la secuencia, la adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los extremos de la secuencia, o la deleción de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de la secuencia.

Asimismo, tal como aquí se utiliza, "fragmento funcionalmente equivalente" aplicado a un polinucleótido dado, e.g., el polinucleótido definido en la SEQ ID NO: 2, se refiere, aunque no se limita, a un fragmento del polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos se muestra en la SEQ ID NO: 2 que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento funcionalmente equivalente de la proteína cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 1 que mantiene al menos una de las funciones de la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, en concreto, al menos una función relacionada con la inhibición de la proliferación y/o migración celular, en particular de células tumorales, que le permite desarrollar su función anti-tumoral.

En otra realización particular, la composición farmacéutica de la invención comprende una construcción génica que comprende un polinucleótido de la invención, en adelante, "construcción génica de la invención", y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

La construcción génica de la invención puede incorporar, operativamente unida, una secuencia reguladora de la expresión del polinucleótido de la invención, constituyendo de este modo un cassette de expresión. Tal como se utiliza en esta descripción, la expresión "operativamente unida" significa que la proteína de la invención, codificada por el polinucleótido de la invención, es expresada en el marco de lectura correcto bajo el control de las secuencias de control o reguladoras de expresión.

Las secuencias de control son secuencias que controlan y regulan la transcripción y, en su caso, la traducción de la proteína de la invención, e incluyen secuencias promotoras, secuencias codificantes para reguladores transcripcionales, secuencias de unión a ribosomas (RBS) y/o secuencias terminadoras de transcripción. En una realización particular, dicha secuencia de control de expresión es funcional en células y organismos procariotas, por ejemplo, bacterias, etc., mientras que en otra realización particular, dicha secuencia de control de expresión es funcional en células y organismos eucariotas, por ejemplo, células de mamífero, líneas celulares tumorales de mamífero, etc. En una realización concreta, la invención proporciona una construcción génica en la que el polinucleótido de la invención se encuentra bajo el control del promotor temprano de citomegalovirus (CMV). Ventajosamente, la construcción de la invención comprende, además, un marcador o gen que codifica un motivo o un fenotipo que permita la selección de la célula hospedadora transformada con dicha construcción.

La construcción génica de la invención puede obtenerse mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica [Sambrook et al., "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2^{nd} ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989 Vol 1-3] y, si se desea, puede ser insertada en un vector apropiado.

Por tanto, en otra realización particular, la composición farmacéutica de la invención comprende un vector que comprende un polinucleótido de la invención, o una construcción génica de la invención, en adelante "vector de la invención", y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. La elección del vector dependerá de la célula hospedadora en la que se va a introducir posteriormente. En una realización particular, el vector de la invención es un vector de expresión y el polinucleótido de la invención se encuentra bajo el control del promotor temprano de CMV. A modo ilustrativo, el vector donde se introduce dicho polinucleótido de la invención puede ser un plásmido que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra o no en el genoma de dicha célula. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de vectores en los que puede insertarse el polinucleótido de la invención o la construcción génica de la invención incluyen el vector pRc/CMV comercializado por Invitrogen.

La obtención del vector de la invención puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia [Sambrook et al., "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2^{nd} ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989 Vol 1-3]. En una realización particular, dicho vector es un vector útil para transformar células eucariotas, e.g., células animales y líneas celulares tumorales de mamífero.

Dependiendo del tipo de vector y de la célula a manipular, el vector de la invención puede ser utilizado para transformar, transfectar o infectar células susceptibles de ser transformadas, transfectadas o infectadas por dicho vector. Dichas células pueden ser procariotas o eucariotas. A modo ilustrativo, el vector de la invención puede ser utilizado para transformar células eucariotas o procariotas. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de células susceptibles de ser transformadas, transfectadas o infectadas por el vector de la invención incluyen las líneas celulares de adenocarcinoma de colon humano Caco-2 y HT29, células de Jurkat, células de glioma murino C6, etc. (véase el Ejemplo 1).

Por tanto, en otra realización particular, la composición farmacéutica de la invención comprende una célula hospedadora que comprende un polinucleótido de la invención, o una construcción génica de la invención, o un vector de la invención, en adelante "célula hospedadora de la invención", y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicha célula hospedadora de la invención es capaz de expresar la proteína de la invención y puede ser obtenida mediante transformación, transfección o infección con un vector de la invención.

La célula de la invención puede ser una célula eucariota o procariota. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de células que pueden ser utilizadas para la obtención de células hospedadoras de la invención incluyen las líneas celulares Caco-2 y HT29, células de Jurkat, células de glioma murino C6, etc.

Las células de la invención pueden ser obtenidas por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia [Sambrok et al., 1989, citado supra].

Por otra parte, la composición farmacéutica de la invención comprende uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables, además, de dicho producto (principio activo) seleccionado entre: (i) una proteína de la invención, (ii) un polinucleótido de la invención, (iii) una construcción génica de la invención, (iv) un vector de la invención y (v) una célula hospedadora de la invención, para su administración a un sujeto en necesidad de tratamiento.

El término "sujeto", tal como aquí se utiliza, se refiere a un miembro de una especie de mamífero, e incluye, pero no se limita, animales domésticos, primates y humanos; preferentemente, el sujeto es un ser humano, masculino o femenino, de cualquier edad o raza.

Para su administración a un sujeto, la composición farmacéutica de la invención se presentará en una forma farmacéutica adecuada para su administración a un sujeto por cualquier vía de administración apropiada. Para ello, la composición farmacéutica de la invención incluirá los vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables necesarios para la elaboración de la forma farmacéutica de administración elegida. Evidentemente, la forma farmacéutica de administración del principio activo (producto) puede variar dentro de un amplio intervalo de posibilidades conocidas por los expertos en la materia, dependiendo de la naturaleza de dicho principio activo (proteína, ácido nucleico o célula).

En una realización particular, la composición farmacéutica de la invención se formulará en una forma farmacéutica de administración sólida (e.g., comprimidos, cápsulas, grageas, gránulos, supositorios, etc.) o líquida (e.g., soluciones, suspensiones, emulsiones, etc.) para su administración por cualquier vía de administración apropiada, por ejemplo, por vía oral, parenteral (e.g., intramuscular, subcutánea, intravenosa, etc.), etc. Esta forma farmacéutica de administración del principio activo resulta especialmente adecuada cuando el principio activo es una proteína de la invención. En cada caso se elegirán los vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables apropiados para la forma farmacéutica de administración y vía de administración elegida. Información sobre dichos vehículos y excipientes, así como sobre dichas formas farmacéuticas de administración de la proteína de la invención puede encontrarse en tratados de farmacia galénica. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de fármacos, en general, y de sus procedimientos de preparación puede encontrarse en el libro "Tratado de Farmacia Galénica", de C. Fauli i Trillo, 1ª Edición, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones.

En otra realización particular, cuando el principio activo comprende un polinucleótido de la invención, la composición farmacéutica de la invención puede formularse en forma de una composición destinada para su empleo en terapia génica; a modo ilustrativo, no limitativo, en este caso, la composición farmacéutica de la invención puede contener un vector, viral o no viral, que comprende un polinucleótido de la invención o una construcción génica de la invención. A modo ilustrativo, no limitativo, dichos vectores pueden ser vectores virales, por ejemplo, basados en retrovirus, adenovirus, etc., o no virales tales como los complejos ADN-liposoma, ADN-polímero, ADN-polímero-liposoma, etc. [véase "Nonviral Vectors for Gene Therapy", editado por Huang, Hung y Wagner, Academic Press (1999)]. Dichos vectores, que contienen un polinucleótido o una construcción génica de la invención pueden ser administrados directamente al cuerpo humano o animal por métodos convencionales. Alternativamente, dichos vectores pueden ser utilizados para transformar, transfectar o infectar células, por ejemplo, células de mamíferos, incluido el hombre, ex vivo, y, posteriormente implantarlas en el cuerpo humano o animal para obtener el efecto terapéutico deseado. Para su administración al cuerpo humano o animal dichas células se formularán en un medio adecuado que no afecte adversamente a la viabilidad de dichas células.

La composición farmacéutica de la invención comprende, al menos, un producto (principio activo) seleccionado entre: (i) una proteína de la invención, (ii) un polinucleótido de la invención, (iii) una construcción génica de la invención, (iv) un vector de la invención y (v) una célula hospedadora de la invención, en una cantidad terapéuticamente eficiente. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente eficiente" se refiere a la cantidad de producto (principio activo) calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de proteína y el efecto terapéutico a conseguir. La composición farmacéutica de la invención puede contener uno solo de dichos productos (principios activos), o, si se desea, una combinación de dos o más de dichos productos diferentes.

A modo ilustrativo, la dosis de principio activo a administrar a un sujeto será una cantidad terapéuticamente eficiente y puede variar dentro de un amplio intervalo. La composición farmacéutica de la invención se puede administrar una o más veces al día con fines preventivos o terapéuticos. La dosis de principio activo a administrar dependerá de numerosos factores, entre los que se incluyen las características del producto a administrar, tales como, por ejemplo, su actividad y vida media biológica, la concentración del producto en la composición farmacéutica, la situación clínica del sujeto, la severidad de la patología, la forma farmacéutica de administración elegida, etc. Por este motivo, las dosis mencionadas en esta invención deben ser consideradas tan solo como guías para el experto en la materia, y éste debe ajustar las dosis en función de las variables citadas anteriormente. A modo simplemente ilustrativo, no limitativo, en una realización particular, la composición farmacéutica de la invención se puede administrar una o más veces al día, en una cantidad típica comprendida entre 2x10^{9} y 2x10^{11} partículas del vector viral/tumor (vía parenteral/20 \muL/tumor), preferentemente, 1x10^{10}-1x10^{13} partículas del vector viral/tumor, lo que equivale a, aproximadamente, 1x10^{12}-1x10^{16} partículas del vector viral/kg de peso corporal del sujeto.

En una realización particular, la composición farmacéutica de la invención se utiliza como composición anti-tumoral, por ejemplo, para inhibir la proliferación y/o la migración de células tumorales, por lo que puede utilizarse en el tratamiento y/o prevención de tumores y cánceres. Prácticamente cualquier tipo de cáncer y tumor puede ser tratado con la composición farmacéutica de la invención. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de las patologías que pueden ser potencialmente tratadas con la composición farmacéutica de la invención incluyen carcinomas de colon, hepatocarcinomas, gliomas, cánceres linfáticos, etc.

La composición farmacéutica de la invención, si se desea, puede usarse con otros fármacos, por ejemplo, fármacos anti-tumorales adicionales, con el fin de aumentar la eficiencia anti-tumoral de la composición farmacéutica de la invención, generándose de este modo una terapia de combinación. Dichos fármacos adicionales pueden formar parte de la misma composición farmacéutica o, alternativamente, pueden facilitarse como una composición farmacéutica separada para su administración al mismo tiempo (administración simultánea) que la composición farmacéutica de la invención o en momentos diferentes (administración secuencial) respecto a la administración de la composición farmacéutica de la invención. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de fármacos anti-tumorales adicionales que pueden ser administrados junto con la composición farmacéutica de la invención, incluyen, aunque no se limitan a, 5- fluorouracilo, taxol, etc.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un producto seleccionado entre:

(iii): una construcción génica que comprende dicho polinucleótido (ii);

en la elaboración de una composición farmacéutica anti-tumoral, es decir, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de tumores y/o cáncer.

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Prácticamente cualquier tipo de cáncer y tumor puede ser tratado con dicha composición farmacéutica.

Dicha composición farmacéutica puede formularse de acuerdo con lo mencionado previamente en relación con la composición farmacéutica de la invención.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para el tratamiento de un tumor o de un cáncer, o para inhibir la proliferación y/o migración de células tumorales, que comprende administrar a un sujeto en necesidad de tratamiento, una cantidad terapéuticamente eficiente de un producto seleccionado entre:

(iii): una construcción génica que comprende dicho polinucleótido (ii);

(v): una célula hospedadora que comprende dicho polinucleótido (ii), dicha construcción génica (iii) o dicho vector (iv).

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Prácticamente cualquier tipo de cáncer y tumores puede ser tratado de acuerdo con dicho método. Para su administración a dicho sujeto, dicho producto (principio activo) se formulará en forma de una composición farmacéutica, tal como la composición farmacéutica de la invención previamente descrita.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para inhibir la proliferación celular o la migración celular que comprende poner en contacto un cultivo celular con una composición que comprende un producto seleccionado entre:

(iii): una construcción génica que comprende dicho polinucleótido (ii);

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Este método puede ser potencialmente útil en investigación para controlar el crecimiento y/o migración de células, tanto tumorales como no tumorales. Para su empleo, dicho producto estará mezclado o combinado con vehículos y compuestos que no afecten adversamente al producto.

El siguiente Ejemplo sirve para ilustrar la invención y no debe ser considerado como limitativo del alcance de la misma.

Ejemplo 1 Actividad antitumoral del gen viral A238L v de su producto de expresión

Este ejemplo ilustra la actividad antitumoral del gen viral A238L de ASFV y de su producto de expresión, la proteína viral A238L, en distintas presentaciones (plásmidos de expresión euroriótica, proteína recombinante y vectores adenovirales-A238L y retrovirales-A238L).

I. Materiales y métodos Construcciones génicas

Plásmidos de expresión A238L: La secuencia de nucleótidos del gen A238L de ASFV fue clonada bajo el control del promotor temprano de citomegalovirus (CMV) en el vector de expresión pRc/CMV (Invitrogen). La secuencia de dicho gen A238L fue amplificada mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los oligonucleótidos siguientes (generados por Isogen):

1

El primer oligonucleótido (SEQ ID NO: 3) contiene una cola CGCGCG y un sitio de corte para Xba I, mientras que el segundo oligonucleótido (SEQ ID NO: 4) fue diseñado con una cola GCGCGC y un sitio de corte para Hind III. El producto de la reacción PCR fue digerido con Hind III y Xba I y clonado dentro del sitio de restricción múltiple del vector pRc/CMV. La construcción generada fue llamada pRc/CMV-A238L.

Siguiendo el mismo procedimiento pero clonando el producto de la reacción PCR en el vector de expresión en mamíferos pcDNA 3.1 (Invitrogen) se obtuvo el plásmido denominado pcDNA-A238L.

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Cultivos celulares

Las líneas celulares empleadas son de adenocarcinoma de colon humano (células Caco-2 y HT29), linfomas T humanos (células Jurkat) y células de glioma murino (C6). Las líneas celulares utilizadas fueron obtenidas de American Type Culture Collection con los códigos ATCC: TIB-152 para Jurkat, HTB-37 para Caco-2, y HTB-38 para la línea HT-29. Todas las células fueron cultivadas en medio RPMI 1640 (Gibco, BRL) suplementado con L-glutamina 2 mM, 100 U/mL de gentamicina, aminoácidos no esenciales y suero fetal bovino (FBS) a una concentración del 10%. Todas las líneas celulares fueron mantenidas en cultivo a 37ºC de temperatura y bajo atmósfera controlada con un 97% de humedad relativa y 7% de CO_{2}.

Ademas, se han obtenido líneas Caco-2 y Jurkat que expresan establemente la proteína A238L, mediante un protocolo de transfección estándar utilizando el sistema LipofectAMINE Plus Reagent (Invitrogen), siguiendo las indicaciones del fabricante. Las construcciones plasmídicas utilizadas en la transfección fueron pcDNA-A238L (expresa la proteína viral A238L) y el plásmido vacío pcDNA 3.1 (control experimental), a una concentración de 1 \mug ADN/10^{6} células, todo ello mezclado en Opti-MEM I (Gibco BRL). Tras la transfección, las células fueron mantenidas en cultivo en presencia del agente G-418 (geneticina) durante 15 días, y así fueron seleccionadas. La presencia del gen A238L en dichas células fue comprobada mediante Southern blot, y las nuevas líneas celulares resultantes fueron denominadas Caco-pcDNA y Caco-A238L, HT29-pcDNA y HT29-A238L, Jurkat-pcDNA y Jurkat-A238L, C6-pcDNA y C6-A238L.

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Reactivos/estímulos

Los estímulos empleados, dependiendo del tipo celular y del ensayo realizado, fueron los siguientes:

-: Mitógenos: fitohemaglutinina (PHA), concanavalina (ConA).

-: Agentes farmacológicos: ésteres de forbol, forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), Ionóforo de calcio (Ion).

-: Citoquinas: interleuquina 1 (IL-1), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-\alpha).

-: Factores proangiogénicos: factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), factor estimulador de tumores beta (TGF-\beta).

Todos los reactivos utilizados fueron adquiridos a Sigma.

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Obtención de ratones genéticamente deficientes

Los ratones deficientes en COX-2, COX-2 +/- (B6, 129-Ptgs2tm1Jed), fueron obtenidos a partir de "The Jackson Laboratory" (Bar Harbor, ME, EEUU). La detección de animales "wild type" (tipo salvaje), heterocigotos y homocigotos para la mutación se hizo mediante el análisis del genotipo por PCR y Southern blotting de la descendencia del cruce de parejas heterocigotos a partir de ADN extraído de colas de estos ratones, con el uso de oligonucleótidos específicos frente a COX-2 murino, adquiridos a Isogen, cuyas secuencias de nucleótidos se muestran en SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6. El tratamiento de los animales y las condiciones de experimentación se llevó a cabo de acuerdo con la legislación vigente (Real Decreto 223/1988, Ley 15/1994, Real Decreto 951/1997) en el animalario del Centro de Biología Molecular.

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Análisis de la expresión de ARNm

El ARN total se aisló de las distintas líneas celulares [e.g., Caco-pcDNA y Caco-A238L] tras tratamiento con diferentes estímulos [e.g., PMA/Ion, a diferentes tiempos (0, 2, 4, 6, 12, 18 y 24 horas)], utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen), siguiendo las indicaciones de la casa comercial. Dicho ARN fue obtenido con el fin de determinar diferencias en la expresión génica por medio de técnicas convencionales como Northern blotting o RT-PCR empleando sondas y/o oligonucleótidos específicos para la proteína viral A238L, para la ciclooxigenasa-2 (COX-2) humana y para la \beta-actina (control), para desechar diferencias debidas a la cantidad de muestra utilizada o a la amplificación por PCR.

\newpage

Todos los oligonucleótidos fueron generados por Isogen, y sus secuencias eran las siguientes:

2

Ensayos de detección de apoptosis

Los ensayos de detección de apoptosis se llevaron a cabo mediante citometria de flujo utilizando ioduro de propidio. Brevemente, las células a analizar (Caco-pcDNA y Caco-A238L, en este experimento) se recogieron tras la estimulación correspondiente (en este caso PMA 15 ng/ml e Ionóforo de calcio 1 \muM) en cultivo. Las células fueron lavadas dos veces con PBS 1X, fijadas en etanol al 70%, a 4ºC, y resuspendidas en tampón de ciclo (conteniendo ioduro de propidio 50 pg/mL, citrato sódico 0,1%, 50 mg/mL de ribonucleasa A (Sigma), todo en PBS 1X). Tras el marcaje con ioduro de propidio durante 30 minutos en oscuridad, las muestras fueron analizadas en el citómetro de flujo, para determinar el número de células vivas y muertas por apoptosis en la población celular estudiada.

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Ensayos de proliferación celular

En estos ensayos se han utilizado células Caco-2 que expresan de forma estable la proteína viral A238L (Caco-A238L) o transfectadas de manera estable con el plásmido pcDNA 3.1 vacío (Caco-pcDNA) como células control, descritas anteriormente. Asimismo, se utilizaron células Jurkat que expresan de forma estable la proteína viral A238L (Caco-A238L) o transfectadas de manera estable con el plásmido pcDNA 3.1 vacío (Jurkat-pcDNA) como células control, también descritas anteriormente.

Para los ensayos de proliferación celular se ha utilizado la técnica de exclusión por azul tripano. Brevemente, tras la correspondiente estimulación (en este caso PMA 15 ng/ml e Ionóforo de calcio 1 \muM), y utilizando DMSO como control experimental (disolvente de los reactivaos de estimulación) y ciclosporina A (CsA) como inhibidor de los activadores PMA/Ion, las células se mantuvieron en reposo en medio fresco y, a los tiempos indicados en cada experimento, fueron recogidas, lavadas con PBS 1X, y resuspendidas en una solución de azul tripano diluido 1:10. Tras la tinción de las células, se contaron solamente las células vivas, en proliferación (no teñidas por el azul tripano) bajo microscopio óptico, en cámaras especiales de contaje Neubauer.

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Ensayos de migración celular

Los ensayos de migración celular se realizaron en cámaras especiales de migración celular recubiertas de una malla de Matrigel, cubiertas de colágeno tipo I, con un poro de 0,8 micras de ancho (adquiridas a Corning).

En estos ensayos se han utilizado células Caco-2 que expresan de forma estable la proteína viral A238L (Caco-A238L) o transfectadas de manera estable con el plásmido pcDNA 3.1 vacío (Caco-pcDNA) como células control, descritas anteriormente. Asimismo, se utilizaron células Jurkat-pcDNA y Jurkat-A238L, también descritas anteriormente. Las células fueron estimuladas durante 4 horas con PMA/Ion (PMA 15 ng/mL e ionóforo de calcio 1 \muM) a las dosis establecidas (Figura 4). Posteriormente se añadió medio fresco a las células, y éstas se cultivaron en la cámara externa en medio RPMI 1640 conteniendo 2% de FBS. En la cámara interna se añadió medio RPMI 1640 conteniendo 20% suero fetal, para generar un gradiente de suero. Tres días después, se cuantificó la migración celular a través del gradiente de suero fetal del 2%-20%, mediante observación directa bajo el microscopio, o utilizando el software de cuantificación ImageJ, comparando las diferencias entre las líneas celulares pcDNA y A238L. Los datos fueron normalizados respecto a los valores de proliferación celular y a los valores de migración basal de las líneas celulares sin estimular.

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Determinación de la síntesis de prostaglandina E_{2} (PGE_{2})

La concentración de PGE_{2} fue determinada en sobrenadantes de cultivos de células Caco-pcDNA y Caco-A238L, previamente estimuladas con PMA 15 ng/ml e Ionóforo de calcio 1 \muM durante los tiempos indicados en la Figura 2 mediante un ensayo de ELISA de competición utilizando el sistema Prostaglandin E_{2} EM Kit-Monoclonal (Cayman Chemicals), siguiendo las instrucciones del fabricante.

Ensayos de transfección transitoria de células eucariotas

Esta técnica permite introducir vectores de ADN recombinante en células eucariotas, de modo que se puede estudiar la expresión de proteínas clonadas en ellos o la regulación de promotores. Para esto último es necesario, además, contar con un gen reportero que permita cuantificar la actividad del promotor en cuestión. En este caso, se evaluó el papel funcional de varios componentes putativos de las vías de transducción de señales mediante la transfección de vectores de expresión con el gen reportero luciferasa, analizándose su efecto mediante la cuantificación en un luminómetro. La transfección se llevó a cabo utilizando el sistema LipofectAMINE Plus Reagent (Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante, y añadiendo 250 ng ADN/10^{6} células de cada construcción reportera, todo ello mezclado en Opti-MEM I (Gibco BRL).

En dichas transfecciones se han utilizado construcciones reporteras conteniendo el gen reportero luciferasa Firefly bajo el control de la secuencia completa del promotor de ciclooxigenasa-2 (COX-2) humano. Esta construcción se conoce como p2-1900-luc, y fue generada en el laboratorio del Dr. Manuel Fresno como se describe en (Iñiguez, M.A., Martínez-Martínez, S., Punzón, C., Redondo, J.M. y Fresno, M; 2000; J Biol Chem. 4, 275(31):23627-35). Dieciséis horas después de la transfección, las células fueron cultivadas en ausencia o presencia de PMA/Ion durante 4 horas, y analizadas en ensayos de actividad luciferasa. La Figura I A muestra los valores de la media aritmética ± desviación típica de las unidades relativas de luminiscencia (RLU) por microgramo de proteína, normalizados con respecto de los valores obtenidos del reportero control luciferasa Renilla, procedentes de ensayos realizados por triplicado.

Ensayos de formación de tumores "in vivo"

Estos ensayos han sido realizados en ratones "nude" (desnudos) en los cuales se han xenotransplantado células de carcinoma de colon HT-29 que expresan establemente la proteína viral A238L (HT29-A238L), o no (HT29 control), así como células HT-29 que sobreexpresan COX-2 wild type, o una proteína de fusión GFP-COX-2 mediante la transfección de un plásmido de expresión que contiene el ADNc correspondiente a la secuencia completa complementaria al ARNm del gen de COX-2 humano, clonado en el sitio de clonaje múltiple del plásmido pEGFP-C2 (Invitrogen), en posición carboxilo-terminal. Los cultivos celulares fueron mantenidos a 37ºC en atmósfera de CO_{2}, utilizando medio DMEM (Dulbecco/Vogt Modified Eagle's Minimal Essential Medium) suplementado con suero fetal bovino al 10%. Cuando la confluencia celular fue cercana al 80%, las células en monocapa fueron lavadas con PBS y, posteriormente, tratadas con tripsina al 5%; después de un nuevo lavado y centrifugado, las células fueron contadas, resuspendidas en RPMI 1640 y finalmente inyectadas por vía peritoneal e intravenosa en la región abdominal de cada uno de los animales bajo estudio, a razón de 1x10^{6} células por ratón e inoculación.

Tras el transplante, los ratones fueron mantenidos en condiciones de esterilidad y de alimentación adecuadas durante un periodo de aproximadamente 40 días y el tamaño del tumor desarrollado en ambos casos fue evaluado a distintos periodos de tiempo. Para evaluar el crecimiento tumoral, los tumores fueron medidos cada cuatro días en sus dos ejes perpendiculares, utilizando un calibrador digital tipo vernier; el volumen tumoral fue calculado con la fórmula (a X b^{2})/2, en donde a es el eje mayor y b es el eje menor del tumor.

II. Resultados 1. La presencia de la proteína viral A238L inhibe eficazmente la actividad del promotor de COX-2 y la expresión de ARN mensajero de COX-2 en células de carcinoma de colon

Utilizando una línea de células de adenocarcinoma de colon humano (Caco-2), que expresa de manera estable la proteína viral A238L (Caco-A238L) por transfección estable del plásmido de expresión pcDNA-A238L, los inventores han observado que la actividad del promotor de la enzima inducible COX-2 se inhibe por efecto de la proteína A238L tras estimulación de las células con PMA 15 ng/ml más ionóforo de calcio 1 \muM (PMA/Ion) (Figura 1A). La actividad de dicho promotor fue analizada utilizando la construcción reportera p2-1900-luc, que contiene el gen reportero luciferasa bajo el control de la secuencia completa del promotor humano de COX-2, utilizando protocolos estándar de transfección transitoria.

También se obtuvo ARN total de células Caco-pcDNA y células Caco-A238L previamente estimuladas durante los tiempos indicados en la Figura 1B, con PMA 15 ng/ml más ionóforo de calcio 1 \muM (PMA/Ion). El ARNm específico de COX-2 fue detectado mediante RT-PCR utilizando oligonucleótidos específicos para COX-2 humana. También se incluyó un control experimental con oligonucleótidos específicos frente a \beta-actina, para desechar diferencias debidas a la cantidad de muestra o a la amplificación por PCR. En la Figura 1B puede observarse la inhibición inducida sobre la expresión del ARNm de COX-2 por la presencia de A238L.

2. La PGE_{2} (prostaglandina 2) producto de la actividad de la COX-2 es inhibida por efecto de A238L

La Figura 2 muestra que la síntesis de PGE_{2}, uno de los factores implicados en el desarrollo tumoral, está inhibida en células Caco-A238L (células Caco-2 que expresan de forma estable el gen que codifica la proteína A238L), cuando se compara con células Caco-2 normales. Este resultado ha sido obtenido en ensayos de ELISA específicos utilizando el sistema Prostaglandin E_{2} EIA Kit-Monoclonal (Cayman Chemicals) que detectan PGE_{2} en los sobrenadantes de cultivo de dichas células, tras su estimulación con PMA/Ion.

3. La presencia de A238L inhibe la proliferación celular "in vitro"

Utilizando el método de exclusión por tinción con azul tripano y posterior contaje de células en cámara Neubauer, se ha observado que las células que expresan de forma estable la proteína viral A238L (Caco-A238L) tienen una menor tasa de división frente a las células Caco-pcDNA control, lo que demuestra que la proteína A238L modula negativamente el crecimiento tumoral (Figura 3).

4. La presencia de A238L inhibe la migración de células tumorales "in vitro"

Utilizando células Caco-2 transfectadas con el plásmido pcDNA (Caco-pcDNA) y células Caco-2 transfectadas con el plásmido de expresión pcDNA-A238L (Caco-A238L), estimuladas durante 4 horas con PMA 15 ng/mL e ionóforo de calcio 1 \muM (PMA/Ion), se ha cuantificado la tasa de migración de dichas células frente a un gradiente de suero fetal del 2% al 20% en cámaras de matrigel de 0,8 micras de ancho de poro, comparando las diferencias entre ambas líneas celulares. Los datos fueron normalizados respecto a la proliferación celular y a los valores de migración basal (sin estimular) para cada línea celular (Figura 4).

Asimismo, los resultados muestran que la expresión de A238L en células Jurkat-A238L inhibe la migración basal, en condiciones de reposo, con respecto a células Jurkat control (Jurkat-pcDNA) que no expresan dicha proteína viral (Figura 5). Por otra parte, se ha observado que la expresión de A238L en células Jurkat (Jurkat-A238L) inhibe la migración inducida por agentes promotores de tumores y activadores farmacológicos de la expresión de COX-2 tales como PMA e Ion (Figura 6).

Los inventores también han observado que la expresión de A238L en células Caco-A238L inhibe la migración basal, en condiciones de reposo (Figura 7) así como la migración inducida por activadores farmacológicos de la expresión de COX-2 tales como Ion (Figura 8) y la migración inducida por agentes promotores de tumores como ésteres de forbol (PMA) (Figura 9).

Por otro lado, la expresión de A238L en células Caco-A238L potencia la apoptosis inducida por activadores farmacológicos de la expresión de COX-2 tales como ésteres de forbol (PMA) e ionóforo de calcio (Ion) (Figura 10). Aunque no se desea estar vinculado a ninguna teoría, esto puede ser debido a que A238L, al bloquear COX-2, inhiba directa o indirectamente las señales de supervivencia producidas por la prostaglandina E_{2} (PGE_{2}).

5. Resultados "in vivo"

Los experimentos "in vivo" han sido realizados en ratones "nude" (desnudos) en los cuales se han xenotransplantado células de carcinoma de colon HT29 transfectadas, bien con una construcción que codifica para la proteína de fusión GFP-COX-2 o con dicha construcción más un plásmido de expresión pcDNA- A238L.

Tras el transplante, los ratones fueron mantenidos en condiciones de esterilidad y de alimentación adecuadas los días señalados en la gráfica (Figura 11), y el tamaño del tumor desarrollado en ambos casos fue evaluado en cada uno de los puntos, como se describe ampliamente en el apartado Materiales y Métodos.

Como muestra la Figura 11, el tamaño del tumor que se induce en presencia de A238L es mucho menor que el producido en ratones transplantados con la construcción GFP-COX-2.

Los datos presentados "in vivo" son consecuentes con el hecho de que la inhibición de COX-2 por A238L, ampliamente documentada "in vitro", previene la síntesis de prostaglandina E_{2} (PGE_{2}), la cual actúa en el modelo de ratón de modo autocrino favoreciendo la migración, induciendo señales anti-apoptóticas y permitiendo en fin el mayor crecimiento in vivo del tumor, lo cual contrarresta la expresión de A238L en las células implantadas.

Claims

1. Una composición farmacéutica que comprende un producto seleccionado entre:

(i): una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, o

\quad: una variante funcionalmente equivalente de dicha proteína, en donde dicha variante es un péptido cuya secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en dicha SEQ ID NO: 1 de, al menos, un 70%, y mantiene, al menos, una de las funciones de dicha proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 relacionada con la inhibición de la proliferación y/o migración de células tumorales; o

\quad: un fragmento funcionalmente equivalente de dicha proteína, en donde dicho fragmento comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 que tiene actividad inhibitoria de la proliferación y/o migración de células tumorales;

(ii): un polinucleótido que codifica dicha proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, o dicha variante o fragmento funcionalmente equivalente de la misma tal como se define en el apartado (i);

(iii): una construcción génica que comprende dicho polinucleótido (ii);

un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

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2. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, en el que dicha proteína comprende, o está constituida por, la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

3. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, en el que dicho polinucleótido comprende, o está constituido por, la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 2.

4. Empleo de un producto seleccionado entre:

(ii): un polinucleótido que codifica dicha proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de la misma tal como se define en el apartado (i);

(iii): una construcción génica que comprende dicho polinucleótido (ii);

en la elaboración de una composición farmacéutica anti-tumoral.

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5. Empleo según la reivindicación 4, en el que dicha proteína comprende, o está constituida por, la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

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6. Empleo según la reivindicación 4, en el que dicho polinucleótido comprende, o está constituido por, la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 2.

7. Empleo según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que dicha composición farmacéutica anti-tumoral es una composición para el tratamiento de un tumor primario.

8. Empleo según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que dicha composición farmacéutica anti-tumoral es una composición para el tratamiento de la metástasis.

9. Empleo según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en el que dicha composición farmacéutica es una composición farmacéutica destinada a su administración por vía oral o parenteral, preferentemente, subcutánea o intratumoral.

10. Empleo según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en el que dicha composición farmacéutica anti-tumoral se administra en combinación con otro fármaco adicional.

11. Empleo según la reivindicación 10, en el que dicho fármaco adicional es un fármaco para el tratamiento de un tumor o para el tratamiento del cáncer.

12. Empleo según la reivindicación 10 ú 11, en el que dicho fármaco adicional se administra en forma de una composición farmacéutica separada para su administración simultánea o secuencial a la de dicha composición farmacéutica anti-tumoral.

13. Un método in vitro para inhibir la proliferación celular o para inhibir la migración celular que comprende poner en contacto un cultivo celular con una composición que comprende un producto seleccionado entre:

(i): una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1,o

(iii): una construcción génica que comprende dicho polinucleótido (ii);