ES2633098T3 - Inmunoterapia resistente a fármaco para el tratamiento de un cáncer - Google Patents

Inmunoterapia resistente a fármaco para el tratamiento de un cáncer Download PDF

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Abstract

Una composición aislada que comprende linfocitos citolíticos naturales, en la que más de aproximadamente el 50 % de los linfocitos citolíticos naturales expresa un polipéptido que confiere resistencia a un agente de quimioterapia.

Description

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DESCRIPCION
Inmunoterapia resistente a farmaco para el tratamiento de un cancer Referencia cruzada a solicitud relacionada
Esta solicitud reivindica la prioridad a la solicitud provisional americana N° 61/257.136, presentada el 2 de noviembre de 2009.
Declaracion en relacion con lo federalmente financiado Investigacion o desarrollo
Esta invencion se realiza con soporte del gobierno bajo la subvencion del NIH N° HL 087969-01A1 concedida por el “US National Institutes of Health” del gobierno de los Estados Unidos. El gobierno tiene ciertos derechos en la invencion.
Campo tecnico
La presente descripcion generalmente se refiere a metodos para combinar quimioterapia e inmunoterapia para el tratamiento de un cancer. Los metodos tambien se refieren a la generacion de una lmea celular inmune citotoxica resistente a farmaco y a sus usos junto con farmacos citotoxicos.
Antecedentes
Aunque se ha realizado un progreso destacado en los campos de la deteccion del cancer y la biologfa celular del tumor, el tratamiento del cancer en fase tardfa y metastasico sigue siendo un reto muy importante. Los agentes de quimioterapia citotoxicos siguen estando entre los tratamientos anticancerosos mas usados y empleados con exito. Sin embargo, no son uniformemente eficaces, y la introduccion de estos agentes con terapias novedosas, tales como inmunoterapias, es problematico. Por ejemplo, los agentes de quimioterapia pueden ser perjudiciales para el establecimiento de celulas inmunocompetentes antitumorales fuertes debido a los perfiles de toxicidad no espedfica de los agentes. Las terapias basadas en molecula pequena que se dirigen a las rutas de proliferacion celular tambien pueden dificultar el establecimiento de la inmunidad antitumoral. Sin embargo, si se pueden combinar los regfmenes de quimioterapia que son transitoriamente eficaces con novedosas terapias con celula inmunocompetente, entonces, se podna conseguir mejoramiento significativo en terapia antineoplasica.
Se han identificado varios genes resistentes a farmaco que se pueden usar potencialmente para conferir resistencia a farmaco a celulas dirigidas, y los avances en las tecnicas de terapia genica han hecho posible ensayar la viabilidad de usar estos genes en estudios de terapia genica de resistencia a farmaco (Sugimoto y col., (2003) J. Gene Med. 5:366-376; Spencer y col., (1996) Blood 87:2.579-2.587; Takebe y col., (2001) Mol. Ther. 3:88-96; Kushman y col., (2007) Carcinogenesis. 28:207-214; Nivens y col., (2004) Cancer Chemother. Pharmacol. 53:107-115; Bardenheuer y col., (2005) Leukemia 19:2.281-2.288; Zielske y col, (2003) J. Clin. Invest. 112:1.561-1.570). Por ejemplo, se uso una estrategia de ARN de horquilla pequena para disminuir los niveles de hipoxantina-guanina fosforriboxiltransferasa (HPRT), que configuro resistencia a 6-tioquanina (Porter & DeGregori (2008) Gene Ther. 112:4.466-4.474) Tambien, el gen resistente a farmaco MGMT codificante de la alquil guanina transferasa humana (AGTh) es una protema de reparacion de ADN que confiere resistencia a los efectos citotoxicos de los agentes alquilantes, tales como nitrosoureas y temozolomida (TMZ). 6-bencilguanina (6-BG) es un inhibidor de AGT que potencia la toxicidad de nitrosourea y se administra conjuntamente con TMZ para potenciar los efectos citotoxicos de este agente. Diversas formas mutantes de MGMT que codifican variantes de AGT son altamente resistentes a la inactivacion por 6-BG, pero conservan su capacidad de reparar el dano de ADN (Maze y col., (1999) J. Pharmacol. Exp. Ther. 290:1.467-1.474). Se ha mostrado que la terapia de gen resistente a farmaco basado en P140KMGMT confiere quimioproteccion a celulas de raton, perro, macacos rhesus y humano, espedficamente celulas hematopoyeticas (Zielske y col, (2003) J. Clin. Invest. 112:1.561-1.570; Pollok y col., (2003) Hum. Gene Ther. 14:1.703-1.714; Gerull y col, (2007) Hum. Gene Ther. 18:451-456; Neff y col., (2005) Blood 105:997-1002; Larochelle y col., (2009) J. Clin. Invest. 119:1.952-1.963; Sawai y col., (2001) Mol. Ther. 3:78-87).
El gliobastoma multiforme (GBM) es el tipo mas comun y agresivo de tumor cerebral primario en seres humanos, involucrando a las celulas gliales y representando el 52 % de todos los casos de tumor de parenquima cerebral y el 20 % de todos los tumores intracraneales. A pesar de ser la forma mas prevalente de tumor cerebral primario, los GBM se dan en solamente 2 a 3 casos por cada 100.000 personas en Europa y Norte de America. El nombre estandar para este tumor cerebral es “glioblastoma”; presenta dos variantes: glioblastoma de celula gigante y gliosarcoma. Los glioblastomas son tambien un importante tumor cerebral del perro, y la investigacion esta en curso para usar este como modelo para desarrollar tratamientos en humanos.
El glioblastoma tiene uno de los peores pronosticos entre los canceres. El tratamiento puede implicar quimioterapia, radiacion y cirugfa, solas o en combinacion, pero el resultado es todavfa generalmente desfavorable para el
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paciente. Por ejemplo, la supervivencia media con la radiacion de protocolo habitual y quimioterapia con temozolomida es justo de 15 meses. La supervivencia media sin tratamiento es aproximadamente de cuatro meses y medio. Por tanto, queda una necesidad urgente de metodos que aumenten, reemplacen o complementen los metodos actuales de tratamiento de tales canceres y, en particular, aquellos que presenten respuestas transitorias a quimioterapia. La inmunoterapia ofrece tal procedimiento complementario si se puede evitar la citotoxicidad del quimioagente.
Compendio
El establecimiento de la inmunidad antitumoral mediada por celulas inmunocompetentes con frecuencia se mitiga por los efectos mielosupresores durante la quimioterapia. La presente descripcion proporciona metodos para proteger a estas celulas inmunes de toxicidades inducidas por farmaco, permitiendo de ese modo la administracion combinada de inmuno- y quimioterapia, un tratamiento anticancengeno denominado “inmunoterapia resistente a farmaco”. Usando un sistema de lentivirus basado en VIS, el elemento genetico que confiere resistencia a farmaco se puede administrar en las lmeas celulares inmunocompetentes. Las celulas inmunocompetentes geneticamente modificadas desarrollaron resistencia significativa a un agente citotoxico quimioterapeutico espedfico en comparacion con las celulas no modificadas, y no afectaron a su capacidad de destruir celulas cancerosas diana en presencia o ausencia de un agente de quimioterapia. Modificar por ingeniena celulas inmunocompetentes para resistir exposiciones a quimioterapia puede aumentar la muerte de celula tumoral cuando se aplica quimioterapia junto con inmunoterapia basada en celula.
La presente invencion se refiere a composiciones aisladas que comprenden linfocitos citolfticos naturales en las que mas de aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o 95 % de los linfocitos citolfticos naturales expresan un polipeptido que confiere resistencia a un agente de quimioterapia o composiciones aisladas que comprenden linfocitos citolfticos naturales en las que mas de aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 % 80 %, 90 %, o 95 % de los linfocitos citolfticos naturales comprenden un acido nucleico que codifica un polipeptido que confiere resistencia a un agente de quimioterapia o composiciones aisladas que consisten basicamente en linfocitos citolfticos naturales que comprenden un acido nucleico que codifica un polipeptido que confiere resistencia a un agente de quimioterapia. En realizaciones adicionales, el polipeptido que confiere resistencia a un agente de quimioterapia es O6 metilguanina ADN metiltransferasa (MGMT), una variante resistente a farmaco de dihidrofolato reductasa (L22Y-DHFR), timidilato sintasa, y/o protema 1 de resistencia a multiples farmacos (MDR1).
Breve descripcion de los dibujos
Muchos aspectos de la descripcion se pueden entender mejor en referencia a los siguientes dibujos.
La Figura 1 compara esquematicamente un protocolo para combinar inmunoterapia y quimioterapia en el tratamiento de un cancer, en el que las celulas inmunes son sensibles (arriba) y resistentes (abajo) al agente quimioterapeutico. En el esquema no resistente, se proporciona una respuesta antitumoral por citoquinas tales como IL-2, IL-12, GM-CSF y similares.
Las Figuras 2A y 2B son graficos que muestran que celulas y§ destruyen lmeas celulares de glioblastoma de una manera de respuesta a dosis (Fig. 2A), y la capacidad de las celulas de glioblastoma disminuye con cantidades crecientes de celulas y§ (Fig. 2B).
La Figura 2C muestra una serie de imagenes digitales que muestran la muerte de celulas de glioblastoma.
La Figura 3 muestra un grafico de barras que ilustra la citoxicidad de linfocitos T y§ aislados frente a diversos aislados de celula de glioblastoma cultivada, incluyendo: celulas de glioblastoma primario cultivadas (GBM1 y GBM2) y las lmeas celulares cultivadas D54MG, U251MG, y U373.
La Figura 4 muestra un par de graficos de barras que ilustran que las celulas implicadas en la respuesta inmune adaptativa son sensibles a los actuales regfmenes de tratamiento de glioblastoma (izquierda). Las celulas y§ son igualmente sensibles (derecha).
La Figura 5 es un grafico que muestra la expresion de antfgenos de estres de superficie celular MICA/B inducida por el agente quimioterapeutico Temozolamida (TMZ).
La Figura 6 es un grafico que muestra que la expresion de los antfgenos de estres de superficie celular MICA/B inducida por el agente quimioterapeutico Temozolamida (TMZ) es transitoria.
La Figura 7 muestra una serie de imagenes digitales del desarrollo de glioblastomas en ratones inyectados con solucion salina (arriba) y linfocitos T y§ (abajo).
La Figura 8 es un grafico que muestra la densidad de imagen en ratones 1 a 3 semanas despues de la induccion de tumor y el tratamiento con solucion salina (drculos negros) o linfocitos T y§ (drculos claros).
La Figura 9 es un grafico que muestra la supervivencia incrementada de ratones que tienen glioblastomas inducidos despues del tratamiento con linfocito T y§ (drculos claros).
La Figura 10 compara esquematicamente un protocolo para combinar inmunoterapia usando linfocitos T y§ y quimioterapia en el tratamiento de un cancer, en el que las celulas inmunes y§ son sensibles (arriba) y resistentes (abajo) al agente quimioterapeutico.
La Figura 11 es un grafico que ilustra que la transduccion de fibroblastos con una secuencia de acidos nucleicos heterologa codificante de MGMT confiere resistencia al compuesto BCNU (bis-cloronitrosourea;
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CARMUSTINA™), un compuesto cloro-nitrosourea relacionado con el gas mostaza usado como un agente alquilantes en quimioterapia, particularmente para el tratamiento de glioblastomas.
La Figura 12 muestra esquematicamente la region de un lentivirus que incluye dos repeticiones terminales largas (RTL) y una secuencia de acidos nucleicos heterologa codificante de una protema verde fluorescente (GFP) o variante P104K de MGMT.
La Figura 13 es una serie de fotograffas digitales que ilustran la transduccion de linfocitos T y§ con construcciones VIS-GFP o VIS-MGMT. Los paneles superiores muestran alta eficacia de transduccion usando una construccion codificante de GFP. Tal como se espera, no se observa fluorescencia con MGMT (panel inferior).
La Figura 14 es un grafico que muestra que la administracion de un agente quimioterapeutico a un regimen anticancengeno, lo cual tambien requiere expansion del linfocito T, disminuye la eficacia del tratamiento basado en celula. Esta disminucion es muy pronunciada cuando los ratones se han sometido a un procedimiento de trasplante de medula osea, el cual es un procedimiento comun para pacientes que se someten a tratamiento para diversos tipos de cancer.
La Figura 15 muestra esquematicamente un protocolo experimental para tratar un cancer con celulas inmunes resistentes a farmaco. En este protocolo, se extirpo medula osea de ratones y se sometio a transduccion con un vector de lentivirus recombinante que comprendfa la secuencia de acidos nucleicos heterologa codificante de la variante L22YDHFR. Las celulas sometidas a transduccion se trasplantaron en ratones receptores irradiados. Despues de 4 semanas se trasplantaron celulas de sarcoma AG104. Dos semanas despues los ratones recibinan inmunoterapia que comprendfa anticuerpos anti-CD137 seguido de quimioterapia (TMTX).
La Figura 16 muestra un par de graficos que ilustran el efecto del tratamiento con quimioterapia (TMTX) solo o inmunoterapia sola (estimulacion del anticuerpo anti-CD137 de linfocitos citotoxicos). En cada caso se siguio el esquema protocolo mostrado en la Fig. 15.
La Figura 17 muestra un grafico que ilustra la reduccion rapida y prolongada en el tamano del tumor AG104 con la combinacion de inmunoterapia-quimioterapia en la que el sistema inmune de los ratones portadores de tumor se vuelve resistente a TMTX mediante la transduccion con L22YDHFR.
La Figura 18 muestra una grafica de supervivencia para ratones portadores de DHFR trasplantados con celulas del sarcoma AG104 y tratados con TMTX y/o inmunoterapia anti-CD137.
La Figura 19 muestra una grafica de supervivencia para ratones que reciben esplenocitos aislados de ratones portadores de tumor y curados con DHFR y, a continuacion, expuestos a celulas de sarcoma AG104.
La Figura 20A y la Figura 20B muestran datos que sugieren que linfocitos T y§ geneticamente modificados destruyeron tanto celulas GBM resistentes a TMZ como de tipo natural en presencia de agente. Los linfocitos T Y5 no modificados no son activos en presencia de TMZ. Em son linfocitos T y§ gen-modificados. E son linfocitos T y6 no modificados. D es SB19 resistente a TMZ.
La Figura 21 muestra datos que sugieren que la modificacion genetica de linfocitos T y§ confiere resistencia a TMZ. Los linfocitos T y§ se sometieron a transduccion (MDI=20) con VIS-MGMT-DHFR el dfa 8 de expansion y la viabilidad celular se midio el dfa 14. La viabilidad se calculo por el consumo de yoduro ToPro.
La Figura 22 muestra datos que sugieren que los linfocitos T y§ geneticamente modificados conservaron sus citotoxicidades hacia las celulas GBM. E son linfocitos T y§ de tipo natural; Em son linfocitos T y§ gen- modificados.
D son lmeas celulares SB19 (GBM); (ensayo de citotoxicidad de cuatro horas).
La Figura 23 muestra un modelo molecular de DHFR y las localizaciones de sitios variantes. Tambien se muestra un grafico que muestra la eficacia de las variantes en conferir resistencia a farmaco a celulas sometidas a transfeccion y expresar los polipeptidos variantes.
Las Figuras 24A a 24 D son una serie de graficos que ilustran la determinacion de las eficacias de transduccion para celulas diana inmunocompetentes y experimentales.
La Figura 24A ilustra esquemas de construcciones de vector de VIS codificantes de eGFP (arriba) y P140KMGMT (abajo).
La Figura 24B es una imagen de un analisis de citometna de flujo de celulas NK-92 sometidas a transduccion con lentivirus VIS-eGFP.
La Figura 24C es una imagen de un analisis de citometna de flujo de celulas TALL-104 sometidas a transduccion con lentivirus VIS-eGFP.
La Figura 24D es una imagen de un analisis de citometna de flujo de celulas K562 sometidas a transduccion con lentivirus VIS-eGFP.
La Figura 25A es una serie de graficos que muestran los analisis de la curva de supervivencia de celulas NK-92 (panel de la izquierda) modificadas por P140KMGMT (drculos claros) y no modificadas (drculos negros), celulas TALL-104 (panel en el medio) y celulas K562 (panel derecho) despues del tratamiento con 6-BG/TMZ. Las celulas se trataron con 6-BG 25 pM y concentraciones crecientes de TMZ. Cuarenta y ocho horas despues, se midieron las viabilidades celulares mediante un metodo de azul de tripan. Cada punto de datos en todos los graficos representa la media de los valores por triplicado.
La Figura 25B es un par de graficos que muestran las actividades citotoxicas de las celulas NK-92 inmunoefectoras (panel izquierdo) y celulas TALL-104 (panel derecho) frente a celulas diana K562 a diferentes relaciones celulares efector:diana (E:D). Las diferentes concentraciones de celulas modificadas por P140KMGMT (drculos claros), las celulas gen-modificadas despues de la seleccion con 6-BG 25 pM/TMZ 200 pM (triangulo inverso), o celulas no modificadas (drculos negros) se mezclaron con una concentracion fijada de las celulas
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diana y se realizaron ensayos de liberacion de LDH despues de 4 horas. Cada puto de datos en todos los graficos representa la media de los valores por triplicado.
La Figura 26 es un par de graficos que muestran lisis mediada por celula inmunoefectora no modificada por ingeniena de las celulas K562 diana. Las celulas efectoras no modificadas (E), y las celulas K562 diana no modificadas (D) o gen-modificadas (Dm) se trataron con 6-BG 25 pM/TMZ 2O0 pM durante la noche. A continuacion, se mezclaron las celulas efectoras no modificadas (E) con celulas K562 diana no modificadas (D) o gen-modificadas (Dm) a una relacion E:D de 10:1. A continuacion, se midieron las actividades citotoxicas de las celulas efectoras. El Panel A representa lisis mediada por celula NK-92; el Panel B representa lisis mediada por celula TALL-104.
Las Figuras 27A a 27D son una serie de graficos que ilustran lisis mediada por celula inmunoefectora geneticamente modificada de las celulas K562 diana en presencia de 6-BG/TMZ. Las celulas efectoras no modificadas (E) y gen-modificadas (Em), y las celulas diana no modificadas (D) o gen-modificadas (Dm) se trataron con 6-BG 25 pM/TMZ 200 pM durante la noche. Las celulas efectoras no modificadas o modificadas se incubaron con celulas diana gen-modificadas a una relacion E:D de 10:1, y se midieron las actividades citotoxicas de las celulas efectoras. Diferentes combinaciones de celulas efectoras o bien no modificadas o gen- modificadas se mezclaron con celulas diana o bien no modificadas o gen-modificadas en una relacion E:D de 10:1. Se midieron las citotoxicidades de las celulas efectoras.
La Figura 28 muestra las secuencias de nucleotidos codificantes del codon MGMT y DHFR optimizado para la expresion en celulas mairnferas.
Descripcion detallada
Antes de que la presente descripcion se describa a mas detalle, hay que entender que esta descripcion no esta limitada a las realizaciones particulares descritas, ya que, por supuesto, tales pueden variar. Tambien hay que entender que la terminologfa usada en el presente documento es con el fin de describir solamente realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, puesto que el alcance de la presente descripcion estara limitado solamente por las reivindicaciones adjuntas.
Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor que interviene, al decimal de la unidad del lfmite inferior (a menos que el contexto dicte claramente lo contrario), entre el lfmite superior e inferior de ese intervalo, y cualquier otro valor senalado o que intervenga en ese intervalo senalado, esta incluido dentro de la descripcion. Los lfmites superiores e inferiores de estos rangos mas pequenos pueden estar incluidos independientemente en los intervalos mas pequenos y tambien estan incluidos dentro de la descripcion, sujeto a cualquier lfmite espedficamente excluido en el intervalo senalado. Cuando el intervalo senalado incluye uno o ambos de los lfmites, los intervalos que excluyen o bien uno o ambos de esos lfmites incluidos tambien estan incluidos en la descripcion.
A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comunmente es entendido por un experto en la tecnica a la que pertenece esta descripcion. Aunque tambien se pueden usar cualquier metodo y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la practica o prueba de la presente descripcion, a continuacion, se describen los metodos y materiales preferidos.
La citacion de cualquier publicacion es por su descripcion previa de la fecha de presentacion y no se debena construir como una admision de que la presente descripcion no tiene derecho a preceder tal publicacion en virtud de la descripcion anterior. Ademas, las fechas de publicacion proporcionadas podnan ser diferentes de las fechas reales de publicacion que pueden necesitar ser confirmadas independientemente.
Como sera aparente para los expertos en la tecnica tras la lectura de la descripcion, cada una de las realizaciones individuales descritas e ilustradas en el presente documento tiene componentes y caractensticas distintas que facilmente se pueden separar de o combinar con las caractensticas de cualquiera de las otras diversas realizaciones sin apartarse del alcance o espmtu de la presente descripcion. Cualquier metodo citado se puede llevar a cabo en el orden de sucesos citados o en cualquier otro orden que sea logicamente posible.
Las realizaciones de la presente descripcion emplearan, a menos que se indique lo contrario, tecnicas de qmmica, qmmica organica sintetica, bioqmmica, biologfa, biologfa molecular, realizacion de imagen molecular y similares, que estan dentro de las tecnicas de la tecnica. Tales tecnicas estan completamente explicadas en la bibliograffa.
Los siguientes ejemplos se sugieren para proporcionar a los expertos en la tecnica una descripcion completa y descripcion de como realizar los metodos y el uso de las composiciones y compuestos descritos y reivindicados en el presente documento. Se han realizado esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los numeros (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero algunos errores y desviaciones se debenan tomar en cuenta. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, la temperatura esta en °C, y la presion esta en o cerca de la atmosferica. La temperatura y la presion patron se definen como 20 °C y 1 atmosfera.
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Antes de que de las realizaciones de la presente descripcion se describan en detalle, hay que entender que, a menos que se indique lo contrario, la presente descripcion no se limita a materiales, reactivos, materiales de reaccion, procesos de fabricacion particulares, o similares, ya que tales pueden variar. Tambien hay que entender que la terminologfa usada en el presente documento es con el fin de describir solamente realizaciones particulares, y no pretende ser limitante. Tambien es posible en la presente descripcion que las etapas se puedan ejecutar en diferente secuencia en la que esto es logicamente posible.
Se debe indicar que, tal como se usa en la memoria y las reivindicaciones adjuntas, las formas del singular “un”, “uno/a” y “el/la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, referencia a “un soporte” incluye una pluralidad de soportes. En esta memoria y en las reivindicaciones que siguen, la referencia se hara a un numero de terminos que se definiran para tener los siguientes significados a menos que una intencion contraria sea aparente.
Definiciones
En la descripcion y reivindicacion del asunto a tratar descrito, se usara la siguiente terminologfa usada segun las definiciones explicadas mas adelante.
Por “administracion” se quiere decir introducir un compuesto, materiales biologicos que incluyen una poblacion celular, o una combinacion de los mismos, de la presente descripcion en un sujeto humano o animal. La via preferida de administracion de los compuestos es intravenosa. Sin embargo, se pueden usar cualquier via de administracion, tal como oral, topica, subcutanea, peritoneal, intraarterial, inhalacion, vaginal, rectal, nasal, introduccion dentro del fluido cerebroespinal, o instilacion dentro de los compartimentos corporales. Tambien se contempla la inyeccion directa en un sitio tisular diana tal como un tumor solido.
Los terminos “agente terapeutico”, “agente quimioterapeutico” o “farmaco” como se usan en el presente documento se refieren a un compuesto o un derivado del mismo que puede interactuar con una celula cancerosa, reduciendo de ese modo el estado proliferativo de la celula y/o destruyendo la celula. Ejemplos de agentes quimioterapeuticos incluyen, pero no se limitan a, agentes alquilantes (por ejemplo, ciclofosfamida, ifosamida), antagonistas metabolicos (por ejemplo, metotrexato (MTX), 5-fluorouracilo o derivados de los mismos), antibioticos antitumorales (por ejemplo, mitomicina, adriamicina), agentes antitumorales derivados de plantas (por ejemplo, vincristina, vindesina, Tasol), cisplatina, carboplatino, etoposido y similares. Tales agentes ademas pueden incluir, pero no se limitan a, los agentes anticancerosos TRIMETOTRIXATO™ (TMTX), TEMOZOLOMIDA™, RALTRITREXED™, S-(4-nitrobencil)- 6-tioinosina (NBMPR), 6-bencilguanidina (6-BG), bis-cloronitrosourea (BCNU) y CAMPTOTECINA™, o un derivado terapeutico de cualquiera de los mismos.
El termino “cantidad terapeuticamente eficaz” como se usa en el presente documento se refiere a esa cantidad del compuesto a administrar que aliviara hasta cierto punto uno o mas de los smtomas de una enfermedad, una afeccion, o un trastorno a tratar. En referencia a cancer o patologfas relacionadas con la division celular no regulada, una cantidad terapeuticamente eficaz se refiere a esa cantidad que tiene el efecto de (1) reducir el tamano de un tumor, (2) inhibir (es decir, retrasar hasta cierto punto, preferentemente parar) la division celular aberrante, por ejemplo, la division celular cancerosa, (3) prevenir o reducir la metastasis de celulas cancerosas, y/o, (4) aliviar hasta cierto punto (o, preferentemente, eliminar) uno o mas smtomas asociados con una patologfa relacionada con o causada en parte por division celular no regulada o aberrante, incluyendo, por ejemplo, cancer o angiogenesis.
Los terminos “tratar” o “tratamiento” de una enfermedad (o una afeccion o un trastorno) como se usan en el presente documento se refiere a evitar que la enfermedad se de en un animal que puede estar predispuesto a la enfermedad pero aun no experimenta ni presenta smtomas de la enfermedad (tratamiento profilactico), inhibir la enfermedad (retrasar o parar su desarrollo), proporcionar alivio de los smtomas o efectos secundarios de la enfermedad (incluyendo tratamiento paliativo), y aliviar la enfermedad (causando regresion de la enfermedad). Con respecto al cancer, estos terminos tambien significan que se puede incrementar la expectativa de vida de un individuo afectado con un cancer o que se reduciran uno o mas de los smtomas de la enfermedad.
Los terminos “sujeto” y “paciente” como se usa en el presente documento incluyen humanos, mairnferos (por ejemplo, gatos, perros, caballos, etc.), celulas vivas y otros organismos vivos. Un organismo vivo puede ser tan sencillo como, por ejemplo, un eucariota unicelular o tan complejo como un mamffero. Los hospedadores normales a los cuales se pueden administrar las realizaciones de la presente descripcion seran mamfferos, particularmente primates, especialmente humanos. Para aplicaciones veterinarias, sera adecuada una amplia diversidad de sujetos, por ejemplo, ganado tal como reses, ovejas, cabras, vacas, puercos y similares; aves de corral tales como pollos, patos, gansos, pavos y similares; y animales domesticados particularmente mascotas tales como perros y gatos. Para aplicaciones de diagnostico o investigacion, una amplia diversidad de mamfferos seran sujetos adecuados, incluyendo roedores (por ejemplo, ratas, ratones, hamsteres), conejos, primates y puercos tales como cerdos endogamicos y similares. En algunas realizaciones, un sistema incluye una muestra y un sujeto. El termino “hospedador vivo” se refiere a que el hospedador o los organismos anteriormente indicados estan vivos y no estan muertos. El termino “hospedador vivo” se refiere al hospedador u organismo entero y no justo a una parte extirpada (por ejemplo, un tngado u otro organo) del hospedador vivo.
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El termino “linfocitos T y8 (linfocitos T gama delta)” como se usa en el presente documento se refiere a un pequeno subconjunto de linfocitos T que se pueden unir espedficamente a receptor de linfocito T (RLT) diferente o su superficie. Una mayona de linfocitos T tienen un rLt compuesto de dos cadenas de glicoprotema denominadas cadenas a- y p de RLT. Por el contrario, en linfocitos T y8, el RLT esta compuesto de una cadena y y una cadena 8. Este grupo de linfocitos T normalmente es mucho menos comun que los linfocitos T ap, pero se encuentran en su mayor abundancia en la mucosa de la barriga, dentro de una poblacion de linfocitos conocidos como linfocitos intraepiteliales (LIE).
Las moleculas antigenicas que activan los linfocitos T y8 son aun en gran parte desconocidas. Sin embargo, los linfocitos T y8 son peculiares en que no parecen requerir procesamiento de antfgeno y presentacion de MHC de epttopos peptfdicos aunque alguno reconozca las moleculas MHC de clase IB. Ademas, se cree que los linfocitos T Y8 tienen un papel destacado en el reconocimiento de antigenos lipfdicos, y responden a antigenos relacionados con el estres tal como MIC-A y MIC-B.
El termino “cancer”, como se usa en el presente documento, se le dara su significado normal, como un termino general para enfermedades en las que las celulas anormales se dividen sin control. En particular, y en el contexto de las realizaciones de la presente descripcion, el cancer se refiere a cancer relacionado con angiogenesis. Las celulas cancerosas pueden invadir tejidos cercanos y pueden propagarse por la corriente sangumea y el sistema linfatico a otras partes del cuerpo. Hay varios tipos principales de cancer, por ejemplo, el carcinoma es cancer que comienza en la piel o en los tejidos que cubre o reviste organos internos. El sarcoma es cancer que comienza en los huesos, cartflago, grasa, musculo, vasos sangumeos u otro tejido conectivo o de soporte. La leucemia es cancer que comienza en el tejido formador de sangre tal como la medula osea, y provoca que se produzcan grandes numeros de celulas sangumeas anormales y entren en la corriente sangumea. El linfoma es cancer que comienza en las celulas del sistema inmune.
Cuando las celulas normales pierden su capacidad de comportarse como una unidad especificada, controlada y coordinada, se forma un tumor. Generalmente, un tumor solido es una masa anormal de tejido que normalmente no contiene areas de quistes o lfquido (algunos tumores cerebrales tienen quistes y areas necroticas centrales rellenas con lfquido). Un tumor sencillo puede tener incluso diferentes poblaciones de celulas dentro de el, con procesos de diferenciacion que han fracaso. Los tumores solidos pueden ser benignos (no cancerosos), o malignos (cancerosos). Los diferentes tipos de tumores solidos se denominan por el tipo de celulas que los forman. Son ejemplos de tumores solidos los sarcomas, los carcinomas y los linfomas. Las leucemias (canceres de la sangre) generalmente no forman tumores solidos.
Canceres representativos incluyen, pero no se limitan a, cancer de vejiga, cancer de mama, cancer colorrectal, cancer endometrial, cancer de cabeza y cuello, leucemia, cancer de pulmon, linfoma, melanoma, cancer de pulmon de no celula pequena, cancer de ovario, cancer de prostata, cancer testicular, cancer uterino, cancer cervical, cancer de tiroides, cancer gastrico, glioma del tallo cerebral, astrocitoma cerebelar, astrocitoma cerebral, glioblastoma, ependimoma, familia de tumores del sarcoma de Ewing, tumor de la celula germinal, cancer extracraneal, enfermedad de Hodgkin, leucemia, leucemia linfoblastica aguda, leucemia mieloide aguda, cancer de Idgado, meduloblastoma, neuroblastoma, tumores cerebrales generalmente, linfoma no Hodgkin, osteosarcoma, histiocitoma fibroso maligno de hueso, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcomas de tejido blando generalmente, tumores pineales y neuroectodermicos primitivos supratentoriales, glioma de la via visual e hipotalamico, tumor de Wilms, leucemia linfodtica aguda, leucemia mieloide aguda de adulto, linfoma no Hodgkin de adulto, leucemia linfodtica cronica, leucemia mieloide cronica, cancer esofagico, leucemia de celula vellosa, cancer de rinon, mieloma multiple, cancer oral, cancer pancreatico, linfoma del sistema nervioso central primario, cancer de piel, cancer de pulmon de celula pequena, entre otros.
Un tumor se puede clasificar como maligno o benigno. En ambos casos, hay una agregacion y proliferacion anormal de celulas. En el caso de un tumor maligno, estas celulas se comportan mas agresivamente, adquiriendo propiedades de invasividad incrementada. Finalmente, las celulas tumorales pueden incluso ganar la capacidad de separarse del ambiente microscopico en el cual se originan, de propagarse a otra area del cuerpo (con un ambiente muy diferente, no normalmente conducente a su crecimiento), y continuar su rapido crecimiento y division en esta nueva localizacion. Esto se denomina metastasis. Una vez que las celulas malignas hayan sufrido metastasis, conseguir una cura es muy diffcil. Los tumores benignos tienen menos tendencia a invadir y son menos probables de sufrir metastasis.
Los tumores cerebrales se propagan ampliamente dentro del cerebro, pero normalmente no sufren metastasis fuera del cerebro. Los gliomas son muy invasivos dentro del cerebro, incluso cruzan los hemisferios. Aunque, no se dividen de una manera descontrolada. Dependiendo de su localizacion, pueden ser justo tan potencialmente mortales como las lesiones malignas. Un ejemplo de esto sena un tumor benigno en el cerebro, el cual puede crecer y ocupar espacio dentro del craneo, llevando a presion incrementada sobre el cerebro.
El termino “reducir un cancer” como se usa en el presente documento se refiere a una reduccion en el tamano o volumen de una masa tumoral, un descenso en el numero de tumores que sufren metastasis en un sujeto, un
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descenso en el estado proliferativo (el grado al cual las celulas cancerosas se multiplican) de las celulas cancerosas, y similares.
Los terminos “aislado y poblacion aislada de celulas” como se usan en el presente documento se refieren a una celula o una pluralidad de celulas extrafdas del tejido o el estado en el cual se encuentran en un sujeto. Los terminos ademas pueden incluir celulas que se han separado segun tales parametros como, pero no se limitan a, marcadores de superficie celular, un marcador indicador tal como un colorante o etiqueta.
El termino “expresado” o “expresion” como se usa en el presente documento se refiere a la transcripcion a partir de un gen para dar una molecula de acidos nucleicos de aRn al menos complementaria en parte a una region de una de las dos cadenas de acidos nucleicos del gen. El termino “expresado” o “expresion” como se usa en el presente documento tambien se refiere a la traduccion a partir de dicha molecula de acidos nucleicos de ARN para dar una protema, un polipeptido, o una porcion o fragmento del mismo.
El termino “promotor” como se usa en el presente documento se refiere a la secuencia de ADN que determina el sitio de la iniciacion de la transcripcion a partir de una ARN polimerasa. Un “elemento proximal promotor” puede ser una secuencia reguladora dentro de aproximadamente 200 pares de bases del sitio de inicio de transcripcion.
El termino “celula recombinante” se refiere a una celula que tiene una nueva combinacion de segmentos de acidos nucleicos que no estan unidos covalentemente uno a otros en la naturaleza. Una nueva combinacion de segmentos de acidos nucleicos se puede introducir dentro de un organismo usando una amplia coleccion de tecnicas de manipulacion de acidos nucleicos disponibles a los expertos en la tecnica. Una celula recombinante puede ser un eucariota unicelular, o un procariota unicelular, o una celula de mairnfero. La celula recombinante puede albergar un vector que es extragenomico. Un vector de acidos nucleicos extragenomico no se inserta dentro del genoma de la celula. Una celula recombinante ademas puede albergar un vector o una porcion del mismo que es intragenomico. El termino “intragenomico” define una construccion de acidos nucleicos incorporada dentro del genoma de la celula recombinante.
Los terminos “acido nucleico recombinante” y “ADN recombinante” como se usan en el presente documento se refieren a combinaciones de al menos dos secuencias de acidos nucleicos que no se encuentran de manera natural en una celula eucariota o procariota. Las secuencias de acidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, vectores de acidos nucleicos, elementos reguladores de la expresion genica, ongenes de replicacion, secuencias genicas adecuadas que cuando se expresan confieren resistencia a antibiotico, secuencias codificantes de protema y similares. El termino “polipeptido recombinante” quiere decir que incluye un polipeptido producido por tecnicas de ADN recombinante de modo que es diferente de un polipeptido de origen natural o bien en su localizacion, pureza o estructura. Generalmente, tal polipeptido recombinante estara presente en una celula en una cantidad diferente de la normalmente observada en la naturaleza.
Los terminos “de manera operable” o “unido de manera operable” como se usan en el presente documento se refieren a la configuracion de las secuencias codificantes y control para realizar la funcion deseada. Por tanto, las secuencias control unidas de manera operable a una secuencia codificante son capaces de efectuar la expresion de la secuencia codificante. Una secuencia codificante se une de manera operable a o bajo el control de las regiones reguladoras transcripcionales en una celula cuando la ADN polimerasa unira la secuencia promotora y transcribira la secuencia codificante dentro del ARNm que se puede traducir a la protema codificada. Las secuencias control no necesitan ser contiguas con la secuencia codificante, siempre que funcionen para dirigir su expresion. Por tanto, por ejemplo, secuencias transcritas no traducidas aun intermedias pueden estar presentes entre una secuencia promotor y la secuencia codificante y la secuencia promotor puede aun considerarse “unida de manera operable” a la secuencia codificante.
Los terminos “heterologos” y “exogenos” cuando se refieren a secuencias de acidos nucleicos tales como secuencias codificantes y secuencias control, indican secuencias que no estan normalmente asociadas a una region de una construccion recombinante o a un locus cromosomico particular, y/o no estan normalmente asociadas a una celula particular. Por tanto, una region “heterologa” de una construccion de acidos nucleicos es un segmento identificable de acidos nucleicos dentro o unido a otra molecula de acidos nucleicos que se encuentra en asociacion con la otra molecula en la naturaleza. Por ejemplo, una region heterologa de una punta de construccion podna incluir una secuencia codificante flanqueada por secuencias no encontradas en asociacion con la secuencia codificante en la naturaleza. Otro ejemplo de una secuencia codificante heterologa es una construccion en la que la propia secuencia codificante no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, secuencias sinteticas que tienen codones diferentes del gen nativo). Igualmente, una celula hospedadora transformada con una construccion que no esta normalmente presente en la celula hospedadora se considerana heterologa para los fines de esta invencion.
En algunas realizaciones el promotor se modificara mediante la adicion o delecion de secuencias, o se reemplazara con secuencias alternativas, incluyendo secuencias naturales y sinteticas asf como secuencias que pueden ser una combinacion de secuencias sinteticas y naturales. Muchos promotores eucariotas contienen dos tipos de secuencias de reconocimiento: la caja TATA y los elementos promotores en direccion 5' (upstream). El primero, localizado en direccion 5' del sitio de iniciacion de transcripcion, esta implicado en dirigir la ARN polimerasa para iniciar la
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transcripcion en el sitio correcto, mientras que lo ultimo parece determinar la tasa de transcripcion y esta en direccion 5' de la caja TATA. Los elementos potenciadores tambien pueden estimular la transcripcion de promotores unidos, pero muchos funcionan exclusivamente en un tipo particular de celula. Muchos elementos potenciadores/promotores derivados de virus, por ejemplo, el SV40, el virus del sarcoma de Rous (VSR), y promotores de CMV son activos en una amplia coleccion de tipos celulares, y se denominan “constitutivos” o “ubicuos”. La secuencia de acidos nucleicos insertada en el sitio de clonacion puede tener cualquier marco de lectura abierto codificante de un polipeptido de interes, con la condicion de que donde la secuencia codificante codifica un polipeptido de interes, debena carecer de sitios de ayuste (splice) que puedan bloquear la produccion de moleculas de ARNm apropiadas y/o producir moleculas de ARNm sometidas de manera aberrante a ayuste o anormales.
La region de terminacion que se emplea principalmente sera una de conveniencia, puesto que las regiones de terminacion parecen ser relativamente intercambiables. La region de terminacion puede ser nativa a la secuencia de acidos nucleicos prevista de interes, o se puede derivar de otra fuente.
El termino “vector” como se usa en el presente documento se refiere a un polinucleotido comprendido de ADN de cadena sencilla, doble cadena, circular o superenrollado o ARN. Un vector normal puede estar comprendido de los siguientes elementos unidos de manera operativa a distancias apropiadas para permitir la expresion del gen funcional: origen de replicacion, promotor, potenciador, secuencia ftder de ARNm 5', sitio de union ribosomico, casete de acido nucleico, terminacion y sitios de poliadenilacion, y secuencias marcadoras seleccionables. Uno o mas de estos elementos se pueden omitir en aplicaciones espedficas. El casete de acido nucleico puede incluir un sitio de restriccion para la insercion de la secuencia de acidos nucleicos a expresar. En un vector funcional el casete de acido nucleico contiene la secuencia de acidos nucleicos a expresar incluyendo los sitios de iniciacion y terminacion de traduccion.
Un vector se construye de manera que la secuencia codificante particular este localizada en el vector con las secuencias reguladoras apropiadas, la posicion y la orientacion de la secuencia codificante con respecto a las secuencias control que son de tal modo que la secuencia codificante se transcribe bajo el “control” de las secuencias control o reguladoras. La modificacion de las secuencias codificantes de la protema particular de interes puede ser deseable para alcanzar este fin. Por ejemplo, en algunos casos puede ser necesario modificar la secuencia de manera que se pueda unir a las secuencias control con la orientacion apropiada; o mantener el marco de lectura. Las secuencias control y otras secuencias reguladoras pueden estar ligadas a la secuencia codificante antes de la insercion en el vector. Alternativamente, la secuencia codificante se puede clonar directamente en un vector de expresion que contiene ya las secuencias control y un sitio de restriccion apropiado que esta en el marco de lectura con y bajo control regulador de las secuencias control.
El termino “vector basado en lentivirus” como se usa en el presente documento se refiere a un vector de lentivirus disenado para insertar de manera operable una secuencia de polinucleotido exogena dentro de un genoma hospedador de una manera espedfica a sitio. Los vectores grnas basados en lentivirus pueden estar basados en, pero no se limitan a, por ejemplo, VIH-1, VIH-2, virus de la inmunodeficiencia de simio (VIS), o virus de la inmunodeficiencia felina (VIF). En una realizacion preferida, el vector grna basado en lentivirus es un vector grna basado en VIH. Este vector puede comprender toda o una parte de la secuencia de polinucleotidos de VIH.
Los terminos “transformacion”, “transduccion” y “transduccion” todos indican la introduccion de un polinucleotido dentro de una celula o celulas receptoras
Analisis
Una limitacion muy importante a los tratamientos con quimioterapia para el cancer es la inmunotoxicidad inducida por farmaco. Esto da como resultado, tras la administracion del agente terapeutico, la muerte de celulas inmunocompetentes y la perdida de un sistema inmune eficaz que de lo contrario protegena de infecciones indeseables o proporcionana una defensa frente a celulas cancerosas. Una estrategia para combatir los efectos toxicos graves de la quimioterapia es modificar geneticamente celulas sangumeas o de medula mediante la introduccion de vectores retrovirales disenados para expresar las secuencias de ADNc que confieren resistencia a farmaco. La introduccion de genes resistentes a farmaco dentro de celulas madre hematopoyeticas (CMH) da como resultado la expresion transgenica por todo el sistema hematopoyetico hospedador, incluyendo celulas inmunocompetentes tales como linfocitos T y linfocitos citolfticos naturales, despues del trasplante de celulas gen- modificadas de vuelta dentro de un paciente receptor, como se describe por McMillin y col., (2006) Human Gene Therapy 17:798-806. Entonces, el paciente puede desarrollar un sistema inmune activo mientras que a la vez se somete a quimioterapia. Sin embargo, en el caso de la expresion transgenica de CMH, conforme pasa el tiempo no todos los linfocitos T y linfocitos citolfticos naturales en el sujeto expresan el gen resistente a farmaco. Por ejemplo, McMillin y col. (2005) describe que menos del 50 % de las celulas NK conteman un marcador de expresion 8 semanas despues del trasplante. Vease la Figura 3 de McMillin y col.
Una estrategia alternativa sena modificar geneticamente de manera selectiva celulas inmunocompetentes citotoxicas que pueden dirigir activamente aquellas celulas cancerosas capaces de resistir la administracion simultanea de un
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agente quimioterapeutico, eliminando de ese modo eficazmente la mayona si no todas las celulas cancerosas del paciente.
En ciertas realizaciones, la invencion se refiere a composiciones aisladas que comprenden linfocitos citolfticos naturales en las que mas de aproximadamente el 50 % de los linfocitos citolfticos naturales expresan un polipeptido que confiere resistencia a un agente de quimioterapia. En otras realizaciones, la invencion se refiere a composiciones aisladas que comprenden linfocitos T citolfticos naturales en las que mas de aproximadamente el 50 % de los linfocitos T citolfticos naturales comprenden un acido nucleico que codifica un polipeptido que confiere resistencia a un agente de quimioterapia. En otra realizacion la invencion se refiere a composiciones aisladas que consisten basicamente en linfocitos T citolfticos naturales que comprenden un acido nucleico que codifica un polipeptido que confiere resistencia a un agente de quimioterapia. En ciertas realizaciones el polipeptido que confiere resistencia a un agente de quimioterapia es O6 metilguanina ADN metiltransferasa (MGMT), una variante resistente de dihidrofolato reductasa (L22Y-DHFR), timidilato sintasa, protema 1 de resistencia a multiples farmacos (MDR1).
En el presente documento tambien se describe metodos de tratamiento de un sujeto diagnosticado con cancer que comprende: administrar un agente de quimioterapia al sujeto y administrar una composicion de linfocito citolftico natural resistente a quimioterapia al sujeto en el que la composicion de linfocito citolftico natural resistente a quimioterapia comprende linfocitos citolfticos naturales geneticamente modificadas para expresar un polipeptido que confiere resistencia al agente de quimioterapia.
La presente descripcion incluye metodos por los cuales se protegen selectivamente a las celulas inmunocompetentes de los efectos toxicos de la quimioterapia, permitiendo de ese modo la administracion conjunta de quimioterapia e inmunoterapia basada en celula y, por lo tanto, denominada inmunoterapia resistente a farmaco. Se ha mostrado la viabilidad de usar inmunoterapia resistente a farmaco en el contexto de celulas hematopoyeticas resistentes a farmaco (Cesano y col., (1998) Anticancer Res. 18:2.289-2.295). Se modificaron geneticamente celulas de medula osea de raton mediante la introduccion mediada por retrovirus de un ADNc codificante de una forma mutante de DHFR, es decir, L22Y-DHFR que confiere resistencia a trimetrexato (TMTX). Los ratones se trasplantaron con celulas de medula osea gen-modificadas que dieron como resultado la expresion transgenica en todos los linajes hematopoyeticos. A continuacion, los ratones se trataron con el agente inmunoterapeutico anti- CD137, TMTX solo, o una combinacion de anti-CD137 y TMTX.
En ratones inoculados con celulas del sarcoma AG104, la quimioterapia con TMTX redujo la eficacia de un anticuerpo anti-CD137 en ratones trasplantados con celulas no modificadas que eran sensibles al TMTX. Sin embargo, cuando los ratones se protegieron frente a toxicidad inducida por quimioterapia por el trasplante de medula osea que expresa L22Y-DHFR, el tratamiento combinado con TMTX y anti-CD137 dio como resultado erradicacion completa de tumores en el 100 % de animales. La presente descripcion proporciona evidencia de que las celulas inmunocompetentes humanas geneticamente modificadas se pueden usar en el contexto de inmunoterapia de resistencia a farmaco, mas que modificar geneticamente el sistema hematopoyetico entero. La capacidad de proporcionar a un paciente una poblacion geneticamente modificada de celulas inmunocompetentes citotoxicas, y en particular si se administra localmente al sitio de un tumor, permitina la inmunoterapia junto con quimioterapia sin someterse necesariamente a trasplante de medula osea.
Las celulas NK-92 y TALL-104 son lmeas celulares inmunoefectoras representativas ya que ambos de estos tipos celulares reconocen y destruyen una amplia serie de celulas malignas, incluyendo celulas K562 (Sawai y col., (2001) Mol. Ther. 3:78-87; Tam y col., (1999) J. Hematother. 8:281-290). La lrnea de celula NK humana citotoxica altamente potente NK-92 es una lrnea de linfocito citolftico natural humano dependiente de interleuquina 2 (IL-2) con caractensticas funcionales y fenoftpicas de celulas NK activadas (Gong y col., (1994) Leukemia 8:652-658). Las celulas NK-92 son efectores del sistema inmune innato, el cual juega un importante papel en las respuestas del hospedador frente a virus y celulas tumorales. Debido a la alta citotoxicidad frente a un amplio espectro de celulas tumorales primarias y establecidas a bajas relaciones efector:diana y frente a leucemia primaria en ratones SCID (Gong y col., (1994) Leukemia 8:652-658; Yan y col., (1998) Clin. Cancer Res. 4:2.859-2.868; Tam y col., (1999) J. Hematother. 8:281-290) las hace un candidato razonable como celula inmunoefectora resistente a farmaco (Yan y col., (1998) Clin. Cancer Res. 4:2.859-2.868; Tam y col., (1999) J. Hematother. 8:281-290). Las celulas TaLl-104 son una lrnea de linfocito T leucemica dependiente de interleuquina 2 que tiene marcadores de superficie normales a los encontrados sobre tanto linfocitos T citotoxicos como linfocitos citolfticos naturales. Las celulas TALL-104 lisan las celulas tumorales de una manera no restringida a HLA (Tam y col., (1999) J. Hematother. 8:281-290). La inmunoterapia adoptiva con TALL-104 ha inducido remisiones completas o parciales a largo plazo en animales portadores de tumor (Tam y col., (1999) J. Hematother. 8:281-290; Geoerger y col., (2000) Neuro Oncol. 2:103-113). Igual que las celulas NK-92, usamos celulas TALL-104 como celulas inmunocompetentes para nuestros estudios de prueba de concepto puesto que estas celulas se pueden desarrollar en cultivo indefinidamente para proporcionar una fuente ilimitada de celulas efectoras con actividad tumoricida estable.
Las celulas NK-92 y TALL-104 geneticamente modificadas por P104K-MGMT eran resistentes a TMZ y teman actividades citotoxicas similares a las celulas no modificadas. Ademas, las celulas gen-modificadas mostraron
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actividades citolfticas similares a celulas no sometidas a transduccion despues de la seleccion del farmaco. Por lo tanto, la modificacion genetica de estas celulas no afecta a su actividad citotoxica.
Se evaluo la inmunoterapia resistente a farmaco en una serie de ensayos citotoxicos, en presencia y ausencia de un farmaco citotoxico. Dasqupta y col., (2010) Biochem. Biophys. Res. Comm. 391:170-175. De manera importante, las celulas inmunocompetentes gen-modificadas mostraron actividades citolfticas significativas hacia celulas tumorales resistentes a farmaco en presencia de farmaco. Por el contrario, las celulas inmunocompetentes no modificadas eran ineficaces en muerte tumoral cuando se administraba farmaco. Combinados, estos resultados demuestran que, en presencia de un farmaco quimioterapeutico citotoxico, las celulas efectoras gen-modificadas siguen activas, y se observo un mayor nivel de muerte de celula cancerosa diana despues de tratar con celulas efectoras gen- modificadas y celulas diana no modificadas en comparacion con celulas efectoras no modificadas y celulas diana resistentes a farmaco. Por consiguiente, las celulas inmunocompetentes resistentes a farmaco geneticamente modificadas se podnan modificar por ingeniena para sobrevivir a los efectos citotoxicos de agentes quimioterapeuticos y la eficacia de muerte tumoral incrementa significativamente durante una exposicion a quimioterapia.
La presente descripcion proporciona datos de que las celulas efectoras inmunocompetentes resistentes a farmaco son efectores citotoxicos superiores durante una exposicion a quimioterapia. Esto es un descubrimiento significativo que se puede combinar con actuales inmunoterapias basadas en celula y adoptivas. Se ha mostrado que la regresion de tumores vascularizados grandes se da en pacientes con melanoma metastasico refractario. Sin embargo, para maxima eficacia, generalmente es necesario un regimen de linfo-disminucion antes de la transferencia de linfocito autologo (Chinnasamy y col., (2004) Hum. Gene Ther. 8:758-769).
La generacion y expansion de linfocitos resistentes a farmaco (en lugar del sistema hematopoyetico entero) ex vivo puede permitir, en este marco, la administracion de terapia basada en celula inmunocompetente concurrentemente con la quimioterapia, mejorando potencialmente la eliminacion del tumor mientas se establece y se mantiene la inmunidad antitumoral. En este escenario, se pueden mermar los linfocitos no sometidos a transduccion usando un tratamiento con quimioterapia selectiva, la cual se podna aplicar continuamente durante la administracion de inmunoterapia adoptiva. La administracion conjunta de quimio- e inmunoterapias, a continuacion, conducinan a la eliminacion del tumor a largo plazo.
Sin embargo, se demostro que el crecimiento de celulas de LMC en ratones trasplantados con medula osea modificada por ingeniena para conferir resistencia a MTX se puede exacerbar mediante la administracion de quimioterapia (Rosenberg & Dudley (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. UsA. 101:14.639-14.645). Por tanto, el tratamiento con quimioterapia en el contexto de la proteccion de medula osea completa gen-modifica puede inducir efectos secundarios tales como inmunosupresion que permite a algunos canceres sobrevivir a una exposicion a farmaco. Sin embargo, basandose en los resultados de la presente descripcion en lugar de trasplantar celulas madre hematopoyeticas resistentes a farmaco, una estrategia mas eficaz implica el trasplante de linfocitos inmunocompetentes resistentes a farmaco.
Ademas, recientemente se mostro que las lmeas celulares de melanoma y glioma son sensibles a la combinacion de TMZ y antifolatos (Sweeney y col., (2002) J. Pharmacol. Exp. Ther. 300:1.075-1.084). Por lo tanto, en una realizacion de los metodos de la descripcion, la transferencia retroviral de vectores dobles que expresan conjuntamente variantes de DHFR resistentes a farmaco, tales como, L22Y-DHFR, junto con P140-MGMT incremental la muerte de celula tumoral permitiendo la inmunoterapia citotoxica eficaz mientras que se administra una combinacion de agentes quimioterapeuticos. La expresion de mutantes DHFR, por ejemplo, puede proporcionar resistencia a antifolatos tales como metotrexato y trimetrexato, mientras que la expresion de MGMT puede proporcionar resistencia a agentes de metilacion monofuncionales tales como dacarbazina y procarbazina asf como agentes de cloroetilacion bifuncionales tales como BCNU, ACNU o TMZ.
Por consiguiente, se realizo una serie de ensayos citotoxicos combinatorios con celulas diana y efectoras no modificadas y gen-modificadas. Para determinar los efectos de TMZ sobre celulas no modificadas, se realizaron ensayos de citotoxicidad por los que se mezclaron las celulas efectoras no modificadas con celulas diana gen- modificadas en o bien ausencia o presencia de 6-BG 200 pM/TMZ.
Se usaron celulas gen-modificadas para eliminar los efectos de la quimioterapia sobre las celulas diana (las celulas diana gen-modificadas eran resistentes a TMZ a esta concentracion de farmaco). Antes de que se iniciaran estos estudios, se determino la sensibilidad de las celulas K562 gen-modificadas a celulas NK-92 y TALL-104. Se condujo un ensayo de citotoxicidad de 4 horas en el que las celulas efectoras no modificadas (E) se incubaron con o bien celulas diana no modificadas (D) o diana gen-modificadas (Dm) en una relacion de efector y diana de 10:1, como se muestra en la Fig. 27, en ausencia de farmaco. Las citotoxicidades de ambas lmeas celulares efectoras no modificadas (NK92 y TALL-104) hacia o bien celulas diana no modificadas o gen-modificadas eran comparables (Pnk-92=0,8441, Ptall-014=0,6349). Por tanto, la modificacion genetica de las celulas diana no afecto a su lisis por las celulas inmunocompetentes.
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A continuacion, se condujeron ensayos citotoxicos usando celulas efectoras no modificadas y celulas diana gen- modificadas en presencia de TMZ. Se observo un descenso significativo en la lisis mediada tanto por celula NK-92 como TALL-104 cuando se comparo con las celulas diana gen-modificadas en ausencia de tratamiento con farmaco (vease la Fig. 27; Pnk-92=0,0003, Ptall-o-m=0,0008). Por tanto, la eliminacion de celulas tumorales resistentes a farmaco mediante celulas inmunocompetentes no modificadas esta limitada seriamente despues de una exposicion a quimioterapia.
Para comparar la eficacia asesina de las celulas inmunoefectoras no modificadas y gen-modificadas durante los tratamientos con farmaco, se condujeron ensayos de citotoxicidad por los que se incubaron celulas efectoras no modificadas o modificadas por P140KMGMT (Em) con celulas diana gen-modificadas (Dm) y 6-BG 200 pM/TMZ.
Cuando se compararon con celulas efectoras no modificadas, las celulas NK-92 geneticamente modificadas lisaron celulas diana significativamente mejor despues de ser tratadas con 6-BG/TMZ, como se muestra en la Fig. 28A (Pnk- 92=0,0001). Por tanto, en presencia de farmaco, las celulas inmunocompetentes modificadas por P140KMGMT eran activas destruyendo celulas tumorales. En condiciones identicas, sin embargo, las celulas TALL-104 geneticamente modificadas teman solamente un incremento modesto en la actividad citotoxica. (Fig. 28B).
Para determinar la eficacia de las celulas tumorales resistentes a farmaco durante una exposicion a quimioterapia cuando las celulas diana son sensibles al tratamiento con farmaco, efectores gen-modificados, es decir, celulas P140KMGMT-NK-92 y P140KMGMT-TALL-104, se incubaron con celulas diana sensibles a farmaco no modificadas y 6-BG 200 pM/TMZ. A continuacion, se compararon las citotoxicidades de estas celulas inmunocompetentes resistentes a farmaco con las citotoxicidades alcanzadas usando celulas inmunocompetentes sensibles a farmaco, como se muestra en las Fig. 28C y 28D.
En comparacion con la muerte de celulas diana gen-modificadas por celulas efectoras no modificadas, habfa un incremento significativo de aproximadamente 4,5 veces y 2,5 veces la muerte de celulas diana no modificadas por las celulas NK-92 y TALL-104 geneticamente modificadas, respectivamente (Pnk-92=0,0012, Ptall-oi4= 0,0011). Estos datos demuestran que las celulas NK-92 y TALL-104 modificadas por P140KMGMT funcionan como efectores potentes en presencia de 6-BG/TMZ, y que las celulas inmunocompetentes resistentes a farmaco, cuando se usan concurrentemente con quimioterapia, pueden aumentar significativamente la muerte de celulas diana.
Realizaciones de la presente descripcion incluyen metodos de tratamiento de canceres, y en particular tumores cancerosos. Los metodos de la descripcion combinan el uso de agentes quimioterapeuticos que pueden destruir o reducir la proliferacion de celulas cancerosas, con inmunoterapia para eliminar eficazmente aquellas celulas cancerosas que desarrollan resistencia a farmaco o si no escapan del agente quimioterapeutico. Los metodos de la presente descripcion proporcionan aislamiento de celulas inmunes citotoxicas, que incluyen, pero no se limitan a, linfocitos T y6 o bien de un paciente a tratar o de otra fuente, como se describe, por ejemplo, por Lamb L.S. en el documento de Patente americana N° de serie 7.078.034. A continuacion, las celulas aisladas se pueden someter a transfeccion con un vector de acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos heterologa codificante de un polipeptido que confiere a la celula resistencia a un agente quimioterapeutico seleccionado. A continuacion, el paciente en necesidad de tratamiento para un cancer, y en particular un tumor, puede recibir una dosis, o dosis, de los linfocitos T sometidos a transfeccion antes, despues o con el agente quimioterapeutico. El propio agente, aunque se pretende que sea toxico a las celulas cancerosas dirigidas, y reducira la proliferacion y viabilidad de las celulas, tambien puede inducir la formacion sobre la superficie celular de las celulas cancerosas de protemas relacionadas con el estres. Los linfocitos T y§ sometidos a transfeccion, por ejemplo, tienen la caractenstica de ser capaces de reconocer y, por lo tanto, dirigir tales ligandos relacionados con el estres, dirigiendo espedficamente o preferentemente de ese modo las celulas cancerosas.
La transduccion de una poblacion de celulas inmunes citotoxicas, tales como linfocitos T y§ con un acido nucleico heterologo codificante de un polipeptido exogeno que confiere resistencia al agente quimioterapeutico puede asegurar que las celulas inmunoterapeuticas no esten negativamente afectadas por el agente (farmaco). El resultado es que la quimioterapia y la inmunoterapia cooperan para reducir eficazmente la masa tumoral o eliminar las celulas cancerosas. Los datos proporcionados en el presente documento indican que se puede conseguir un incremento en el resultado de supervivencia de un animal tratado.
Se contempla que las celulas inmunes citotoxicas geneticamente modificadas tales como los linfocitos T y§ se pueden administrar a tumor dirigido directamente mediante tal como, pero no se limita a, inyeccion directa en la masa tumoral, administracion a un vaso sangumeo que entra en la masa tumoral, o una combinacion de ambos. Por ejemplo, se contempla que las celulas se pueden administrar a una masa de glioblastoma en el cerebro de un paciente por implantacion directa a traves de una aguja canulada en la masa tumoral.
Los metodos de la descripcion se comparan con otros metodos que combinan enfoques quimioterapeuticos e inmunologicos para tratar canceres. Por ejemplo, como se muestra en la Fig. 1, las citoquinas y otros factores que pueden estimular el sistema inmune, incluyendo el sistema innato, se pueden administrar a un paciente sistemicamente, dando como resultado la expansion de muchas clases de celulas del sistema inmune entero de los pacientes. Sin embargo, cuando, a continuacion, se administra el agente quimioterapeutico, la toxicidad del agente
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puede reducir o destruir eficazmente las propias celulas del sistema inmune, eliminando de ese modo los beneficios potenciales de un sistema inmune desarrollado.
Un protocolo alternativo, como se muestra en la Fig. 17, comprende aislar celulas de la medula osea de un sujeto y someter a transduccion las celulas con un vector de acido nucleico, tal como, pero no se limita a, un vector de lentivirus, en el que el vector comprende una secuencia de acidos nucleicos heterologa codificante de un polipeptido que puede conferir resistencia al agente quimioterapeutico seleccionado para su uso en el tratamiento de un cancer, como se muestra en la Fig. 13, por ejemplo. En un sistema experimental, como se muestra en la Fig. 17, se pueden trasplantar celulas de la medula sometidas a transduccion en un sujeto receptor que ha tenido el sistema inmune destruido por radiacion de alto nivel. Si, a continuacion, estos sujetos reciben una inoculacion de celula tumoral desarrollaran un tumor(es), como se muestra en las Fig. 18 y 19, y como se discute en McMillin y col. (2006) Hum. Gene Therapy 17:798-806. Si, a continuacion, el sujeto recibe o bien el agente quimioterapeutico seleccionado o un inductor de celulas inmunes dirigidas a cancer (en este caso por administracion de anticuerpos anti-CD137), entonces se observan las reducciones en los tamanos de los tumores (en las Fig. 18 y 19, tumores de sarcoma AG104).
En algunos protocolos que combinan inmunoterapia y quimioterapia para tratar canceres en un paciente humano o paciente objeto, se pueden administrar citoquinas (IL-2, IL-12, GM-CSF, y similares) a un paciente para fomentar la formacion de linfocitos citotoxicos. En otros metodos, se puede emplear un anticuerpo espedfico anti-CD137. CD137 es un miembro de la familia del factor de necrosis tumoral (FNT)/factor de crecimiento nervioso (FCN) de receptores y se expresa por linfocitos T y B activados y monocitos; se ha encontrado que su ligando juega un importante papel en la regulacion de las respuestas inmunes. Un anticuerpo monoclonal anti-CD137 puede unirse espedficamente a celulas inmunes que expresan CD137 tales como linfocitos T activados y celulas dendnticas (CD) de raton recientemente aisladas, estimulando de ese modo una respuesta inmune, en particular de una respuesta de linfocito T citotoxico, frente a celulas tumorales.
Tambien se ha observado que la reduccion en tumores puede ser transitoria cuando se usa un agente quimioterapeutico (Fig. 18), y la reduccion inmunoterapeutica en el tamano del tumor tambien puede mostrar una recuperacion (Fig. 19). Por el contrario, si el agente quimioterapeutico y la inmunoterapia se administran juntos o secuencialmente al sujeto, entonces, se ve una reduccion significativa y prolongada en el tamano del tumor (Fig. 20). Tambien se incremento la supervivencia del sujeto animal tratado. La transferencia de esplenocitos desde tal sujeto tratado con exito a un sujeto inyectado con una poblacion de celula cancerosa dio como resultado supervivencia incrementada (Fig. 21) mostrando la prolongacion de celulas espedficas a cancer despues de la curacion de un cancer. Los experimentos, resumidos en la Fig. 22, muestran que la aplicacion de transduccion de una resistencia a farmaco a celulas del sistema inmune permite la aplicacion practica de una combinacion de quimioterapia e inmunoterapia para incrementar la supervivencia, y la destruccion de tumores. Este metodo tambien se ha aplicado a la regresion de tumores muy grandes, como se muestra en la Fig. 23.
Aunque los protocolos de tratamiento para su uso frente a tumores cancerosos han sido de algun exito, como se evidencia por los datos presentados en las Fig. 15 a 23, el exito de tales metodos con tumores de glioblastoma ha sido mmimo, con supervivencia prolongada del paciente no alargandose mas alla de 24 meses. Por consiguiente, los metodos de la presente descripcion proporcionan una etapa de inmunoterapia alternativa que emplea celulas inmunes citotoxicas aisladas, y particularmente la subpoblacion de linfocitos T y§ que pueden reconocer espedficamente, unirse a, y destruir celulas cancerosas que producen el antfgeno de estres de superficie celular MICA/B. Los linfocitos T y§ comprenden solamente aproximadamente el 5 % de los linfocitos T circulantes totales y forman un componente poderoso del sistema de defensa innato. En los metodos de la descripcion, las celulas CD4- CD8 se pueden aislar de las poblaciones de linfocitos T por tales metodos bien conocidos como FACS y se cultivan in vitro para ampliar el tamano de la poblacion.
Por consiguiente, los metodos de la presente descripcion proporcionan celulas inmunes citotoxicas, tales como linfocitos T y6, que estan geneticamente modificados para comprender un acido nucleico heterologo que, cuando se expresa en las celulas confiere sobre ellas resistencia al agente quimioterapeutico. Entonces, los linfocitos T modificados, son capaces de sobrevivir durante el suficiente tiempo para destruir eficazmente la mayona si no todas las celulas cancerosas diana.
A continuacion, se ha mostrado que los animales injertados con celulas de glioblastoma tienen un tiempo de supervivencia significativamente incrementado cuando se proporciona el tratamiento combinado de un agente quimioterapeutico y los linfocitos T y§ resistentes a agente geneticamente modificados apropiados que son resistentes al agente quimioterapeutico, en comparacion con los animales que han recibido solamente el agente.
La modificacion genetica de las celulas inmunes citotoxicas aisladas puede ser por cualquier metodo conocido en la tecnica. Por ejemplo, pero no se pretende que sea limitante, los linfocitos T y§ aislados se pueden someter a transfeccion con un vector de lentivirus tal como VIS que comprende una secuencia de acidos nucleicos heterologa codificante de una variante de la protema MGMT (por ejemplo, una variante P104K). La eficiencia de la transduccion puede ser mostrada por transfeccion conjunta de las celulas con un vector de lentivirus que comprende una secuencia de acidos nucleicos codificante de una protema indicadora tal como, pero no se limita a, protema verde
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fluorescente aumentada (EGFP) o similares. La transferencia de MGMT a celulas confiere sobre ellas resistencia a agente alquilantes de ADN, como se muestra, por ejemplo, en la Fig. 7. Igualmente, usando un vector de lentivirus de VIS recombinante, los linfocitos T y§ se pueden someter a transfeccion con por ejemplo MGMT, como se muestra en la Fig. 8.
Por lo tanto, un aspecto de la presente descripcion, incluye metodos para reducir un cancer en un paciente, comprendiendo las etapas de: obtener una poblacion de celulas inmunes citotoxicas aisladas, en la que las celulas inmunes citotoxicas aisladas han sido geneticamente modificadas para ser resistentes a un agente terapeutico; administrar a un paciente en necesidad de la misma, una cantidad eficaz del agente terapeutico; y administrar al paciente la poblacion de celulas inmunes citotoxicas geneticamente modificadas aisladas, con lo cual las celulas inmunes citotoxicas se administran al tumor, reduciendo de ese modo el cancer en el paciente.
En la presente descripcion, las celulas inmunes citotoxicas aisladas pueden ser linfocitos T y§.
En realizaciones de este aspecto de la descripcion, las celulas inmunes citotoxicas aisladas se pueden aislar del paciente que tiene el cancer.
En algunas realizaciones de este aspecto de la descripcion, las celulas inmunes citotoxicas aisladas se pueden aislar de una fuente distinta del paciente en necesidad de las mismas.
En realizaciones de este aspecto de la descripcion, el agente terapeutico puede tener la caractenstica de inducir una protema de estres en una celula cancerosa del paciente, en la que la protema de estres se reconoce por las celulas inmunes citotoxicas.
En realizaciones de este aspecto de la descripcion, el agente terapeutico puede ser un agente quimioterapeutico citotoxico caracterizado por una celula que desarrolla resistencia a dicho agente terapeutico cuando la celula recibe un acido nucleico heterologo, y en la que el acido nucleico heterologo se expresa en la celula.
En las realizaciones de este aspecto de la descripcion, el agente terapeutico puede ser un agente quimioterapeutico citotoxico seleccionado del grupo que consiste en: un agente alquilante, un antagonista metabolico, un antibiotico antitumor y un agente antitumoral derivado de planta.
En algunas realizaciones de este aspecto de la descripcion, el agente terapeutico puede ser un agente quimioterapeutico citotoxico seleccionado del grupo que consiste en: una ciclofosfamida, una fosfamida, un metotrexato, un nucleotido sustituido, un nucleosido sustituido, fluorouracilo, una mitomicina, adriamicina, vincristina, vindesina, Taxol, cisplatina, carboplatino y etoposido.
En realizaciones de este aspecto de la descripcion, el agente terapeutico se puede seleccionar del grupo que consiste en: TRIMETOTRIXATO™ (TMTX), metotrixato (MTX), TEMOZOLOMIDA™, RALTRITREXED™, S-(4- nitrobencil)-6-tioinosina (NBMPR), CAMPTOTECINA™, 6-bencilguanidina, y un derivado terapeutico de cualquiera de los mismos.
En realizaciones de este aspecto de la descripcion, la etapa de obtener una poblacion de celulas inmunes citotoxicas aisladas geneticamente modificadas para ser resistentes a un agente terapeutico puede comprender: aislar de un sujeto humano o animal una poblacion de celulas inmunes citotoxicas; cultivar la poblacion aislada de las celulas inmunes citotoxicas, incrementando de ese modo la poblacion de las celulas; sometiendo a transfeccion de manera estable la poblacion de las celulas inmunes citotoxicas con un vector que comprende una secuencia de acidos nucleicos heterologa unida de manera operable a un promotor, en el que la secuencia de acidos nucleicos heterologa codifica un polipeptido que confiere la resistencia celular al agente terapeutico.
En realizaciones de este aspecto de la descripcion, la poblacion de celulas inmunes citotoxicas sometidas a transfeccion de manera estable se puede conservar de manera viable.
En algunas realizaciones de este aspecto de la descripcion, el agente terapeutico puede ser TRIMETOTRIXATO™ o metotrexato, y la secuencia de acidos nucleicos heterologa codifica dihidrofolato reductasa, o un derivado de la misma.
En otras realizaciones de este aspecto de la descripcion, el agente terapeutico puede ser TEMOZOLOMIDA™, o un agente terapeuticamente derivado de la misma, y la secuencia de acidos nucleicos heterologa puede codificar O6 metilguanina ADN metiltransferasa, o un derivado de la misma.
En realizaciones de este aspecto de la descripcion, las celulas inmunes citotoxicas geneticamente modificadas aisladas y el agente terapeutico se pueden administrar conjuntamente al paciente.
En algunas realizaciones de este aspecto de la descripcion, las celulas inmunes citotoxicas geneticamente modificadas y el agente terapeutico se pueden administrar secuencialmente al paciente.
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En realizaciones de este aspecto de la descripcion, las celulas inmunes citotoxicas geneticamente modificadas se administran al paciente directamente dentro del tumor o a un vaso sangumeo proximal y que se dirige al interior del tumor.
En algunas realizaciones de este aspecto de la descripcion, el tumor es un glioblastoma.
Otro aspecto mas de la presente descripcion proporciona sistemas para tratar un cancer en un paciente que comprende un agente terapeutico citotoxico que tiene las caractensticas de inhibir la supervivencia de una celula cancerosa, y una poblacion aislada de celulas inmunes citotoxicas, en la que las celulas inmunes citotoxicas estan geneticamente modificadas para ser resistentes al agente terapeutico.
En la presente descripcion, las celulas inmunes citotoxicas pueden ser linfocitos T y§.
En realizaciones de este aspecto de la descripcion, la poblacion de celulas inmunes citotoxicas puede comprender una secuencia de acidos nucleicos heterologa unida de manera operable a un promotor, en la que la secuencia de acidos nucleicos heterologa codifica un polipeptido que cuando se expresa en una celula confiere resistencia al agente terapeutico a la celula.
En realizaciones de este aspecto de la descripcion, el agente terapeutico es un agente quimioterapeutico citotoxico seleccionado del grupo que consiste en: un agente alquilante, un antagonista metabolico, un antibiotico antitumoral y un agente antitumoral derivado de planta.
En algunas realizaciones de este aspecto de la descripcion, el agente terapeutico se selecciona del grupo que consiste en: TRIMETOTRIXATO™ (TMTX), metotrixato (MTX), TEMOZOLOMIDA™, RALTRITREXED™, S-(4- nitrobencil)-6-tioinosina (NBMPR), CAMPTOTECINA™, 6-bencilguanidina, y un derivado terapeutico de cualquiera de los mismos.
En ciertas realizaciones de este aspecto de la descripcion, el agente terapeutico es TRIMETOTRIXATO™ o metotrixato, y la secuencia de acidos nucleicos heterologa codifica dihidrofolato reductasa, o un derivado de la misma.
En algunas realizaciones de este aspecto de la descripcion, el agente terapeutico es TEMOZOLOMIDA™, o un agente terapeuticamente derivado de la misma, y la secuencia de acidos nucleicos heterologa puede codificar O6 metilguanina ADN metiltransferasa (MGMT), o un derivado de la misma.
Aun otro aspecto de la descripcion proporciona sistemas para tratar un glioblastoma en un paciente comprendiendo un agente terapeutico que tiene las caractensticas de inhibir la supervivencia de una celula cancerosa e inducir una protema de estres en la celula cancerosa, y una poblacion aislada de celulas inmunes citotoxicas, en la que las celulas inmunes citotoxicas son linfocitos T y§, y en la que dichos linfocitos T y§ se han modificado geneticamente para ser resistentes al agente terapeutico.
En la presente descripcion, la poblacion de linfocitos T y§ comprende una secuencia de acidos nucleicos heterologa unida de manera operable a un promotor, en la que la secuencia de acidos nucleicos heterologa codifica un polipeptido que cuando se expresa en una celula confiere resistencia al agente terapeutico a la celula.
En realizaciones de este aspecto de la descripcion, el agente terapeutico es un agente quimioterapeutico citotoxico seleccionado del grupo que consiste en: un agente alquilante, un antagonista metabolico, un antibiotico antitumoral, y un agente antitumoral derivado de planta.
En algunas realizaciones de este aspecto de la descripcion, el agente terapeutico se selecciona del grupo que consiste en: TRIMETOTRIXATO™ (TMTX), metotrixato (MTX), TEMOZOLOMIDA™, RALTRITREXED™, S-(4- nitrobencil)-6-tioinosina (NBMPR), CAMPTOTECINA™, 6-bencilguanidina, y un derivado terapeutico de cualquiera de los mismos.
En algunas realizaciones de este aspecto de la descripcion, el agente terapeutico es TRIMETOTRIXATO™ o metotrixato, y la secuencia de acidos nucleicos heterologa codifica dihidrofolato reductasa, o un derivado de la misma.
En otras realizaciones de este aspecto de la descripcion, el agente terapeutico es TEMOZOLOMIDA™, o un agente terapeuticamente derivado de la misma, y la secuencia de acidos nucleicos heterologa puede codificar O6 metilguanina ADN metiltransferasa (MGMT), o un derivado de la misma.
Se debena indicar que las relaciones, concentraciones, cantidades y otros datos numericos se pueden expresar en el presente documento en un formato de intervalo. Hay que entender que tal formato de intervalo se usa por conveniencia y brevedad y, por tanto, se debena interpretar, de una manera flexible, que incluye no solo los valores numericos explfcitamente citados como los lfmites del intervalo, sino tambien incluye todos los valores numericos
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individuals o subintervalos incluidos dentro de ese intervalo como si cada valor numerico y subintervalo estuvieran expUcitamente citados. Para ilustrar, un intervalo de concentracion de “aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 5 %” se debena interpretar que incluye no solo la concentracion explfcitamente citada de aproximadamente 0,1 % en peso a aproximadamente 5 % en peso, sino tambien incluye concentraciones individuales (por ejemplo, 1 %, 2 %, 3 % y 4 %) y los subintervalos (por ejemplo, 0,5 %, 1,1 %, 2,2 %, 3,3 %, y 4,4 %) dentro del intervalo indicado. El termino “aproximadamente” puede incluir ±1 %, ±2 %, ±3 %, ±4 %, ±5 %, ±6 %, ±7 %, ±8 %, ±9 % o ±10 %, o mas del(de los) valor(es) numerico(s) a modificar. Ademas, la frase “aproximadamente x a y” incluye “aproximadamente x a aproximadamente y”.
Se debena hacer hincapie en que las realizaciones anteriormente descritas de la presente descripcion son meramente ejemplos posibles de aplicaciones, y se explican meramente para un entendimiento claro de los principios de esta descripcion. Se pueden realizar muchas variaciones y modificaciones a la(s) realizacion(es) anteriormente descrita(s) de la descripcion sin apartarse considerablemente del esprntu y los principios de la descripcion. Todas tales modificaciones y variaciones se pretenden que esten incluidas en el presente documento dentro del alcance de esta descripcion y protegidas por las siguientes reivindicaciones.
Ejemplos
Ejemplo 1
Generacion y titulacion de retrovirus recombinante: Los ADN codificantes de P140KMGMT y eGFP humanos se amplificaron por PCR usando cebadores apropiados (tales como, por ejemplo, para: MGMT: Directo: AAACTGGAGCTGTCTGGCTGTGAA, Inverso: AAACTCTCCTGCTGGAACACTGGA; y DHFR: Directo: CATGGGAATTGGCAAGAATGGCGA, Inverso: TGACCAGGTTCTGTTTCCCTTCCA) y se insertaron en el vector de expresion apropiado. Las secuencias, codon optimizado para la expresion en celulas de mairnfero, codificantes de MGMT y DHFR, estan representadas en la Fig. 29.
Se uso un sistema de cuatro plasmidos para generar lentivirus de VIS recombinante. La transduccion transitoria se llevo a cabo en celulas productoras 293T usando metodos anteriormente detallados (Cesano y col., (1998) Anticancer Res. 18:2.289-2.295). Los tttulos del virus codificante de eGFP y P140KMGMT se determinaron mediante metodos de citometna de flujo y reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real respectivamente (Cesano y col., (1998) Anticancer Res. 18:2.289-2.295; McMillin y col, (2006) Hum. Gene Ther. 17:798-806).
Ejemplo 2
Transduccion de lentivirus: Las transducciones de partmulas de lentivirus basadas en VIS se realizaron incubando celulas con virus en medios complementados con polibreno (8 mg/ml; Specialty Media, Phillipsburg, NJ). Veinticuatro horas despues de la transduccion, se reemplazo el medio que contema virus con medio fresco y las celulas sometidas a transduccion se cultivaron hasta alcanzar aproximadamente el 70 a 90 % de confluencia en el momento en que las celulas se usaron para aplicaciones posteriores.
Eficacias de transduccion de lentivirus de celulas NK-92, TALL-104 y K562: se evaluo inicialmente la eficacia de transduccion en celulas NK-92, TALL-104 y K562 usando un lentivirus de VIS recombinante de autoinactivacion (SIN), pseudotipado con la protema de la envoltura VSV-G, codificante de eGFP, cuyas construcciones se muestran esquematicamente en la Fig. 25A.
La expresion de eGFP en la construccion indicadora de lentivirus se condujo por el promotor del virus de celulas madre murino. Para medir las eficacias de transduccion, se inocularon todas las lmeas celulares con una MDI de 40 y la fluorescencia de GFP se analizo mediante citometna de flujo a 72 horas despues de la transduccion. La transduccion de cada lmea celular dio como resultado expresiones fuertes de eGFP (visualizadas por microscopfa de fluorescencia) que se cuantificaron como 90 %, 41 % y 99 % en las lmeas celulares NK-92, TALL-104 y K562, respectivamente, como se muestra en las Fig. 25B a 25D. Por tanto, se alcanzan altas eficacias de transduccion para tanto las lmeas celulares NK-92 como K562, y la lmea celular TALL-104 presentaba eficacia de transduccion moderada.
Ejemplo 3
Analisis de la curva de supervivencia: Se expusieron celulas no modificadas y modificadas por P104KMGMT 2 horas a 6-BG (25 |jM) seguido de exposicion a concentraciones crecientes de TMZ durante 48 horas. A continuacion, se accedio a la viabilidad celular mediante un metodo de exclusion de azul de tripan estandar. Todos los farmacos se prepararon recien el dfa del tratamiento con farmaco.
Para determinar la eficacia de P140KMGMT resistente a farmaco, se incubaron celulas inmunocompetentes no sometidas a transduccion y sometidas a transduccion con 6-BG durante 2 horas. Se anadio TMZ a concentraciones crecientes, y las celulas se incubaron durante 48 horas. Las curvas de supervivencia se generaron con respecto a las celulas no sometidas a transduccion.
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Las celulas NK-92, TALL-104 y K562 sometidas a transduccion con P140KMGMT eran resistentes a la combinacion de 6-BG/TMZ cuando se compararon con celulas control no sometidas a transduccion, como se muestra en la Fig. 26A). Tal resistencia se pronuncio hasta TMZ 200 jM, en el momento en que casi todas las celulas modificadas sobrevivieron a la exposicion a farmaco.
Los grados de resistencia alcanzados por modificacion genetica de cada una de las lmeas celulares se midieron calculando el valor CI50 de TMZ. El CI50 de 6-BG/TMZ basado en 48 horas de exposicion era de 360 ± 8 jM y 135 ± 4 jM, respectivamente, en las celulas NK-92 gen-modificadas y no modificadas; 385 ± 5 jM y 120 ± 6 jM, respectivamente, en las celulas TALL-104 gen-modificadas y no modificadas; y 550 ± 8 jM y 170 ± 10 jM, respectivamente, en las celulas K562 gen-modificadas y no modificadas. Cada una de las lmeas celulares, por lo tanto, mostraron aproximadamente una resistencia tres veces mayor a TMZ en un ensayo de viabilidad de 48 horas. Se han alcanzado niveles de resistencia similares en celulas madre hematopoyeticas y celulas K562, pero usando un ensayo de supervivencia de 7 a 10 dfas (Gangadharan y col., (2006) Blood. 107:3.859-3.864). La eleccion del presente periodo de ensayo de 48 horas se baso en los ensayos citotoxicos de procesamiento posteriores.
Ejemplo 4
Ensayo de citotoxicidad: Las celulas, crecidas en presencia de 100 U/ml de IL-2 humana recombinante, se expusieron a 6-BG 25 jM durante 2 horas seguido de la adicion de TMZ 200 jM e incubacion de ellas durante la noche. Para determinar la concentracion de celula efectora que daba como resultado la muerte maxima de las celulas diana, se colocaron 4.000 celulas (D) en placas de 96 pocillos y se mezclaron con las celulas efectoras (E) (NK-92 o TALL-104) en relaciones E:D de 2,5:1, 5:1 y 10:1 (por triplicado) seguido de una incubacion de 4 horas. La cantidad de LDH liberado al sobrenadante como resultado de la citolisis de las celulas diana se midio en un ensayo de liberacion de lactato deshidrogenasa (LDH) (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Las citotoxicidades se expresaron como % de actividad citotoxica de las celulas efectoras segun la siguiente formula:
% citotoxicidad=
(Liberacion experimental - Liberacion espontaneaefector) - Liberacion espontaneadiana
Liberacion maximadjana - Liberacion espontaneadjana ^
Para determinar la eficacia de las modificaciones genicas tenidas sobre las citotoxicidades de las celulas efectoras, las celulas efectoras no modificadas/gen-modificadas (E/Em) y diana (D/Dm) se expusieron a 6-BG/TMZ durante 24 horas y se realizaron ensayos citotoxicos como se detallo anteriormente.
Variantes resistentes a farmaco de lineas celulares NK-92 y TALL-104 median la muerte eficaz de celula diana: Se ha informado que las lmeas celulares NK-92 y TALL-104 pueden lisar eficazmente la lmea celular K562 leucemica. En el presente ejemplo, se determino si la modificacion genetica de estas lmeas celulares inmunoefectoras daba como resultado un cambio en sus capacidades citotoxicas hacia la lmea celular diana K562. Por consiguiente, las celulas efectoras gen-modificadas y no modificadas se mezclaron con un numero fijado de las celulas diana a diversas relaciones efector:diana de 2,5:1, 5:1 y 10:1. La eficacia de destruccion de cada una de las celulas efectoras resistentes a farmaco se comparo con la de las celulas control no modificadas en un ensayo de citotoxicidad de 4 horas. Cuando se comparo con la de las celulas no modificadas, ambas celulas inmunoefectoras resistentes a farmaco gen-modificadas, NK-92 y TALL-104, mostraron actividades citoliticas similares hacia la lmea celular diana, como se muestra en la Fig. 2B, estableciendo de ese modo que las modificaciones geneticas impartidas a las lmeas celulares sometidas a transduccion NK-92 y TALL-104, no paredan afectar a las propiedades de citotoxicidad de las celulas.
Retencion de la eficacia citotoxica de celulas inmunocompetentes gen-modificadas despues del desarrollo en presencia de TMZ 200yM. Como se muestra en la Fig. 2B, las citotoxicidades de las lmeas celulares efectoras gen modificadas seleccionadas a farmaco NK-92 y TALL-104, eran similares a las citotoxicidades de las celulas efectoras gen-modificadas no seleccionadas. Estos resultados muestran que las lmeas celulares inmunocompetentes resistentes a farmaco, despues de la modificacion con P140KMGMT, conservaban su capacidad de lisar eficazmente celulas diana.
Ejemplo 5
Generacion de lineas celulares efectoras y diana resistentes a farmaco por transduccion de lentivirus: Se inserto la secuencia de ADNc de P140KMGMT en el vector de expresion de VlS remplazando la secuencia codificante de eGFP (como se muestra en la Fig. 25A). Los tttulos de los virus, determinados usando celulas 293T como dianas, eran de 107-108 UT/ml. La transferencia de gen dentro de las celulas efectoras y diana se cuantifico mediante amplificacion por PCR a tiempo real usando ADN genomico aislado de celulas sometidas a transduccion con el virus recombinante a una MDI de 40.
Los numeros de copia de P140KMGMT para las celulas NK-92, TALL-104 y K562 sometidas a transduccion se determinaron para ser 3 ± 0,28, 1 ± 0,14, y 4 ± 0,41, respectivamente. Los niveles de ARNm de MGMT tambien se midieron en celulas K562 para confirmar que las celulas gen-modificadas expresan niveles incrementados de mensajero de MGMT. La expresion de ARNm de MGMT se detecto facilmente en las celulas K562 sometidas a 5 transduccion, mientras que los niveles de expresion de ARNm de MGMT en celulas K562 no sometidas a transduccion estaban por debajo del intervalo lineal de deteccion. Estudios anteriores (Gangadharan y col., (2006) Blood. 107:3.859-3.864) tambien informaron de niveles de protema MGMT extremadamente bajos en celulas K562 de tipo natural.

Claims (3)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una composicion aislada que comprende linfocitos citolfticos naturales, en la que mas de aproximadamente el 50 % de los linfocitos citolfticos naturales expresa un polipeptido que confiere resistencia a un agente de quimioterapia.
    5
  2. 2. Una composicion aislada que comprende linfocitos citolfticos naturales, en la que mas de aproximadamente el 50 % de los linfocitos citolfticos naturales comprende un acido nucleico que codifica un polipeptido que confiere resistencia a un agente de quimioterapia.
    10 3. Una composicion aislada que consiste basicamente en linfocitos citolfticos naturales, que comprende un acido
    nucleico que codifica un polipeptido que confiere resistencia a un agente de quimioterapia.
  3. 4. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el polipeptido que confiere resistencia a un agente de quimioterapia es O6 metilguanina ADN metiltransferasa (MGMT), una variante resistente a farmaco de 15 dihidrofolato reductasa (L22Y-DHFR), timidilato sintasa, o protema 1 de resistencia a multiples farmacos (MDR1).
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