WO2009043960A1 - Agentes anti-tumorales basados en la proteína viral a238l. - Google Patents

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WO2009043960A1
WO2009043960A1 PCT/ES2008/070183 ES2008070183W WO2009043960A1 WO 2009043960 A1 WO2009043960 A1 WO 2009043960A1 ES 2008070183 W ES2008070183 W ES 2008070183W WO 2009043960 A1 WO2009043960 A1 WO 2009043960A1
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polynucleotide
seq
tumor
pharmaceutical composition
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PCT/ES2008/070183
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Manuel Fresno Escudero
Yolanda Revilla Novella
Aitor GONZÁLEZ GRANJA
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Universidad Autónoma de Madrid
Consejo Superior De Investigaciones Científicas
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    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/12011—Asfarviridae
    • C12N2710/12022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the invention relates, in general, to the use of polynucleotides and proteins related to the A238L viral gene and its expression product, the A238L viral protein, as antitumor agents, useful for the treatment of tumors and cancers, and with pharmaceutical compositions containing said polynucleotides and proteins.
  • Endostatins are inhibitors of endothelial cell migration and angiogenesis and have been shown to reduce tumor growth in animal models.
  • Boehm et al. Boehm T, Folkman J, Browder T, O'Reilly MS. Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance. Nature. 1997 Nov 27; 390 (6658): 404-7) describe the use, as an experimental model, of mice that had various tumors implanted. In mice not treated with ES, said tumors grew rapidly, causing the death of the animal. In contrast, mice treated with ES after tumor development, a reduction of tumor volume to an almost microscopic size.
  • the A238L protein of the African swine fever virus can be used as an antitumor agent, whereby said protein can serve as a basis for the development of new anti-tumor agents.
  • the African swine fever virus is a double-stranded DNA virus that encodes a potent immunosuppressive protein, the A238L protein.
  • the A238L protein of ASFV inhibits the activation of the transcription factor NF-kB as well as the activity of calcineurin, a phosphatase regulated by calcium and calmodulin.
  • the mechanism by which the inhibition of the transcription factor NF-kB is carried out is still unknown, although it is believed that it may be through the binding of the viral protein to the p65 subunit of the transcription factor.
  • the A238L protein of ASFV is expressed as two different molecular weight forms, one of 28 kDa and another of 32 kDa. Both forms of the A238L protein are produced from a single complementary DNA (cDNA), which suggests that said difference in molecular weight is due to a post-translational modification of the protein. However, the nature of said modification is not known. Both forms occur after the infection and the one with the highest molecular weight, 32 kDa, accumulates in the cell nucleus for long periods after the infection. The virus then has the potential to inhibit the transcriptional activation of immunomodulatory genes dependent on these signaling pathways in infected cells, such as macrophages.
  • cDNA complementary DNA
  • A238L as an inhibitor of the calcineurin phosphatase activity is mediated by the direct binding to the catalytic subunit of the calcineurin. Said protein is activated producing a release of calcium and the binding of calmodulin.
  • the invention is based on the fact that the inventors, surprisingly, have observed that the expression of a polynucleotide that encodes a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, related to the AFSV A238L protein, inhibits cell proliferation and / or the migration of tumor cells in vitro.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a product selected from (i) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or a functionally equivalent variant or fragment of Ia same; (ii) a polynucleotide encoding said functionally equivalent protein, variant or fragment, (iii) a gene construct comprising said polynucleotide, (iv) a vector comprising said polynucleotide or said gene construct, and (v) a host cell comprising said polynucleotide, gene construct or said vector; and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • said protein is the A238L viral protein of ASFV.
  • said polynucleotide comprises, or is constituted by, the A238L gene encoding the A238L protein.
  • the invention relates to the use of the product previously identified in the preparation of an anti-tumor pharmaceutical composition.
  • the invention in another aspect, relates to an in vitro method to inhibit cell proliferation or to inhibit cell migration that comprises contacting a cell culture with a composition comprising said previously identified product.
  • Figure 1A is a diagram showing the inhibition of the activity of the promoter of the inducible enzyme COX-2 by the effect of the A238L protein after stimulation of the cells (Caco-pcDNA and Caco-A238L) with PMA 15 ng / mL plus ionophore of 1 ⁇ M calcium (PMA / lon).
  • Figure 1 B shows an RT-PCR electrophoresis gel carried out to detect the COX-2 specific mRNA. In the Figure, the inhibition induced on the expression of COX-2 mRNA can be observed by the presence of A238L.
  • Figure 2 is a graphic representation showing the synthesis of prostaglandin E 2 (PGE2) in cell lines derived from Caco-2 cells (Caco-pcDNA and Caco-A238L). In said graphic representation it can be seen how the synthesis of PGE2 is inhibited in Caco-A238L cells (a cell line that expresses the viral protein A238L stably).
  • PGE2 prostaglandin E 2
  • Figure 3 is a photograph showing the result of an in vitro cell proliferation assay in cells that stably express the A238L protein (Caco-A238L) against Caco-pcDNA control cells.
  • Figure 4 is a graphical representation showing the migration rate of the Caco-pcDNA and Caco-A238L cells under resting conditions (baseline) and after stimulation with PMA / lon. The graphs show how the expression of A238L inhibits the migration of tumor cells in vitro.
  • Figure 5 is an illustrative bar diagram that the expression of the A238L viral protein in Jurkat-A238L cells inhibits basal cell migration, at rest, with respect to control Jurkat cells (Jurkat-pcDNA) that do not express said protein viral.
  • Figure 6 is an illustrative bar diagram that the expression of the A238L viral protein in Jurkat cells (Jurkat-A238L) inhibits the migration induced by tumor-promoting agents and pharmacological activators of the expression of COX-2 PMA and Ion.
  • Figure 7 is an illustrative bar diagram that the expression of the A238L viral protein in Caco-A238L cells inhibits basal migration, at rest.
  • Figure 8 is an illustrative bar diagram that the expression of the A238L viral protein in Caco-A238L cells inhibits the migration induced by stimulators of the COX-2 (Ion) expression.
  • Figure 9 is an illustrative bar diagram that the expression of the A238L viral protein in Caco-A238L cells inhibits the migration induced by tumor promoting agents (PMA).
  • PMA tumor promoting agents
  • Figure 10 is an illustrative bar diagram that the expression of the A238L viral protein in Caco-A238L cells enhances the apoptosis induced by the pharmacological activators of the COX-2 expression (PMA / lon).
  • Figure 11 is a graph showing the growth of HT29 colon carcinoma cells transfected in vivo in "nude" mice, either with a construct encoding the fusion protein
  • mice were kept in sterile conditions and adequate feeding on the days indicated in the graph, and the size of the tumor developed in both cases was evaluated in each of the points.
  • the invention is based, in general, on the fact that the inventors have observed that the expression of a polynucleotide encoding a protein with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 inhibits cell proliferation and the migration of tumor cells in vitro, as well as tumor growth in vivo in mice xenotransplanted with tumor cells expressing said protein, such that said protein, or a functionally equivalent variant or fragment thereof, as well as a polynucleotide encoding said protein, variant or functionally fragment equivalent, they can be used as therapeutic agents, in particular, as anti-tumor agents, in the treatment and / or prevention of the development of tumor processes and, therefore, in the preparation of pharmaceutical anti-tumor compositions.
  • Said polynucleotide may be contained in a gene construct, in a vector or in a host cell that contains it. Therefore, in one aspect, the invention relates to a product selected from:
  • a host cell comprising said polynucleotide (ii), said gene construct (iii) or said vector (iv); as a therapeutic agent, in particular, as an anti-tumor agent.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition, hereinafter pharmaceutical composition of the invention, comprising a product selected from: (i) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO : 1, or a functionally equivalent variant or fragment thereof;
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or a functionally equivalent variant or fragment thereof, hereinafter, "protein of the invention", and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • protein of the invention comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or a functionally equivalent variant or fragment thereof, that is, with anti activity - tumor.
  • protein includes both the post-translationally unmodified form and all forms of post-translational modifications, for example glycosylation, phosphorylation or acetylation.
  • the protein of the invention comprises, or is constituted by, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and presents, at least, inhibitory activity of the proliferation and / or cellular migration of tumor cells, by What can be used as a therapeutic agent, in particular as an antitumor agent.
  • the inhibitory activity of the proliferation and / or cellular migration of tumor cells of said protein of the invention both in vitro and in vivo has been demonstrated by the assays described in Example 1.
  • the protein of the invention is the so-called A238L protein of the African swine fever virus (ASFV).
  • variant refers to a peptide substantially homologous and functionally equivalent to the protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • a peptide is
  • substantially homologous to said protein when its sequence of amino acids have a degree of identity with respect to the amino acid sequence of said protein, of at least 60%, advantageously of at least 70%, preferably of at least 85%, and, more preferably of, at least 95%.
  • the expression “functionally equivalent”, as used herein, means that the peptide or protein in question maintains, at least, one of the functions of the protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, preferably, at least, a function related to the inhibition of cell proliferation and / or migration, in particular, with the inhibition of tumor cell proliferation and migration, and to develop an anti-tumor activity.
  • the inhibitory activity of the cell proliferation or migration of tumor cells in vitro as well as the inhibitory activity of tumor growth or proliferation in vivo in animals expressing said protein can be determined by conventional methods such as the assays described in Example 1 (see section on Materials and Methods).
  • said variant is a mutant form of the protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 that maintains the inhibitory activity of the proliferation and / or migration of tumor cells.
  • Said mutant form may present insertions, deletions or modifications of one or more amino acids with respect to the protein which comprises SEQ ID NO: 1, with the condition that it retains at least one of said proliferative and / or migration inhibitory activities.
  • Cellular cell line also, in the sense used in this description, the term
  • fragmentation refers to a peptide that comprises a portion of said protein which comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, that is, a sequence of congenital amino acids comprised within said SEQ ID NO: 1.
  • fragmentation must be functionally equivalent to said protein which comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, is That is, it must have inhibitory activity of the proliferation and / or migration of tumor cells.
  • the protein of the invention can be obtained by conventional methods known to those skilled in the art, for example, from an organism producing it, either natively or recombinantly, by a method comprising culturing said organism under appropriate conditions. for the expression of said protein and recover it.
  • the producing organism is the African swine fever virus (ASFV).
  • ASFV African swine fever virus
  • Example 1 the production, isolation and purification of a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, specifically ASFV A238L protein, is described.
  • said protein of the invention can be obtained by conventional methods of chemical synthesis of proteins known to those skilled in the art.
  • the protein of the invention can be part of a fusion protein.
  • said fusion protein may contain a region A constituted by a first peptide comprising the protein of the invention linked to a region B comprising a second peptide.
  • Said second peptide may be any suitable peptide, for example, a peptide with anti-tumor activity.
  • said second peptide can also be a protein of the invention.
  • Said region B may be linked to the amino-terminal region of said region A, or alternatively, said region B may be linked to the carboxyl-terminal region of said region A. Both regions A and B may be directly or through of a spacer peptide (linker) between said regions A and B.
  • the fusion protein can be obtained by conventional methods known to those skilled in the art, for example, by the gene expression of the nucleotide sequence encoding said fusion protein in appropriate host cells.
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises a polynucleotide that encodes the protein of the invention, hereinafter, "polynucleotide of the invention", and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • polynucleotide of the invention a polynucleotide that encodes the protein of the invention
  • the invention “includes the polynucleotide comprising the nucleotide sequence encoding the protein of the invention, that is, the protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, as well as a polynucleotide encoding a variant or a functionally equivalent fragment of said protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the polynucleotide of the invention comprises, or is constituted by, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, which encodes the protein whose amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 1, a protein that it presents, at least, inhibitory activity of the proliferation and / or migration of tumor cells, whereby said polynucleotide of the invention that encodes said protein can be used as an anti-tumor agent.
  • the polynucleotide of the invention comprises or is constituted by the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) that encodes the so-called A238L protein of the African swine fever virus (ASFV).
  • the polynucleotide of the invention may have variations in its sequence with respect to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:
  • polynucleotide substantially homologous and functionally equivalent to the polynucleotide SEQ ID NO: 2, that is, any polynucleotide that encodes a protein of the invention.
  • a polynucleotide is "substantially homologous" to the polynucleotide of SEQ ID NO: 2 when its nucleotide sequence has a degree of identity with respect to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 of, at less, 60%, advantageously of at least 70%, preferably of at least 85%, and more preferably of at least 95%.
  • a polynucleotide substantially homologous to the polynucleotide of SEQ ID NO: 2 can be isolated from an organism producing the protein of the invention based on the information contained in said SEQ ID NO: 2, or is constructed based on the sequence of DNA shown in SEQ ID NO: 2, for example, by the introduction of conservative or non-conservative substitutions.
  • Other examples of possible modifications include the insertion of one or more nucleotides in the sequence, the addition of one or more nucleotides at any of the ends of the sequence, or the deletion of one or more nucleotides at any end or inside the Ia sequence.
  • polynucleotide eg, the polynucleotide defined in SEQ ID NO: 2
  • SEQ ID NO: 2 which comprises the nucleotide sequence encoding a functionally equivalent fragment of the protein whose amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 1 that maintains at least one of the functions of the protein comprising Ia amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, in particular, at least one function related to the inhibition of cell proliferation and / or migration, in particular of tumor cells, which allows it to develop its anti-tumor function.
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises a gene construct comprising a polynucleotide of the invention, hereinafter, "gene construct of the invention", and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • the gene construct of the invention can incorporate, operably linked, a regulatory sequence of the expression of the polynucleotide of the invention, thus constituting an expression cassette.
  • the expression "operably linked” means that the protein of the invention, encoded by the polynucleotide of the invention, is expressed in the correct reading frame under the control of the control or regulatory expression sequences. .
  • control sequences are sequences that control and regulate the transcription and, where appropriate, the translation of the protein of the invention, and include promoter sequences, coding sequences for transcriptional regulators, ribosome binding sequences (RBS) and / or sequences transcription terminators.
  • said expression control sequence is functional in prokaryotic cells and organisms, for example, bacteria, etc.
  • said expression control sequence is functional in eukaryotic cells and organisms, for example. , mammalian cells, mammalian tumor cell lines, etc.
  • the invention provides a gene construct in which the polynucleotide of the invention is under the control of the early cytomegalovirus (CMV) promoter.
  • the construction of the invention also comprises a marker or gene that encodes a motif or a phenotype that allows the selection of the host cell transformed with said construction.
  • the gene construction of the invention can be obtained through the use of techniques widely known in the state of the art [Sambrook et al., "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2 nd ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989 VoI 1-3] and, if desired, can be inserted into an appropriate vector.
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises a vector comprising a polynucleotide of the invention, or a gene construct of the invention, hereinafter "vector of the invention", and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • vector of the invention is an expression vector and the polynucleotide of the invention is under the control of the CMV early promoter.
  • the vector where said polynucleotide of the invention is introduced can be a plasmid that, when introduced into a host cell, is integrated or not into the genome of said cell.
  • vectors in which the polynucleotide of the invention or the gene construct of the invention can be inserted include the pRc / CMV vector marketed by Invitrogen.
  • the vector of the invention can be obtained by conventional methods known to those skilled in the art [Sambrook et al., "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2 nd ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989 VoI 1 -3].
  • said vector is a vector useful for transforming eukaryotic cells, eg, animal cells and mammalian tumor cell lines.
  • the vector of the invention can be used to transform, transfect or infect cells capable of being transformed, transfected or infected by said vector.
  • Said cells can be prokaryotic or eukaryotic.
  • the vector of the invention can be used to transform eukaryotic or prokaryotic cells.
  • Illustrative, non-limiting examples of cells capable of being transformed, transfected or infected by the vector of the invention include adenocarcinoma cell lines of human colon Caco-2 and HT29, Jurkat cells, C6 murine glioma cells, etc. (see Example 1).
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises a host cell comprising a polynucleotide of the invention, or a gene construct of the invention, or a vector of the invention, hereinafter referred to as "host cell of the invention” , and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • host cell of the invention is capable of expressing the protein of the invention and can be obtained by transformation, transfection or infection with a vector of the invention.
  • the cell of the invention can be a eukaryotic or prokaryotic cell.
  • Illustrative, non-limiting examples of cells that can be used to obtain host cells of the invention include Caco-2 and HT29 cell lines, Jurkat cells, C6 murine glioma cells, etc.
  • the cells of the invention can be obtained by conventional methods known to those skilled in the art [Sambrok et al., 1989, cited supra].
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises one or more pharmaceutically acceptable carriers or excipients, in addition, of said product (active principle) selected from: (i) a protein of the invention, (ii) a polynucleotide of the invention, (iii) a gene construct of the invention, (iv) a vector of the invention and (v) a host cell of the invention, for administration to a subject in need of treatment.
  • product active principle selected from: (i) a protein of the invention, (ii) a polynucleotide of the invention, (iii) a gene construct of the invention, (iv) a vector of the invention and (v) a host cell of the invention, for administration to a subject in need of treatment.
  • subject refers to a member of a mammalian species, and includes, but is not limited to, pets, primates and humans; preferably, the subject is a human being, male or female, of any age or race.
  • pharmaceutical composition for administration to a subject, the pharmaceutical composition of
  • the invention will be presented in a pharmaceutical form suitable for its administration to a subject by any appropriate administration route.
  • the pharmaceutical composition of the invention will include the pharmaceutically acceptable vehicles and excipients necessary for the preparation of the pharmaceutical form of administration chosen.
  • the pharmaceutical form of administration of the active ingredient (product) can vary within a wide range of possibilities known to those skilled in the art, depending on the nature of said active ingredient (protein, nucleic acid or cell).
  • the pharmaceutical composition of the invention will be formulated in a pharmaceutical form of solid administration (eg, tablets, capsules, dragees, granules, suppositories, etc.) or liquid (eg, solutions, suspensions, emulsions, etc.) for administration by any appropriate route of administration, for example, orally, parenterally (eg, intramuscularly, subcutaneously, intravenously, etc.), etc.
  • This pharmaceutical form of administration of the active ingredient is especially suitable when the active ingredient is a protein of the invention.
  • the pharmaceutically acceptable vehicles and excipients appropriate for the pharmaceutical form of administration and route of administration chosen will be chosen.
  • the pharmaceutical composition of the invention can be formulated in the form of a composition intended for use in gene therapy; by way of illustration, not limitation, in this case, the pharmaceutical composition of the invention may contain a vector, viral or non-viral, which comprises a polynucleotide of the invention or a gene construct of the invention.
  • said vectors may be viral vectors, for example, based on retroviruses, adenoviruses, etc., or non-viral such as DNA-liposome, DNA-polymer, DNA-polymer-liposome complexes, etc.
  • Said vectors which contain a polynucleotide or a gene construct of the invention can be administered directly to the human or animal body by conventional methods.
  • said vectors can be used to transform, transfect or infect cells, for example, mammalian cells, including man, ex vivo, and then implant them in the human or animal body to obtain the desired therapeutic effect.
  • said cells will be formulated in a suitable medium that does not adversely affect the viability of said cells.
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises at least one product (active ingredient) selected from: (i) a protein of the invention, (ii) a polynucleotide of the invention, (iii) a gene construct of the invention, (iv ) a vector of the invention and (v) a host cell of the invention, in a therapeutically efficient amount.
  • product (active ingredient) selected from: (i) a protein of the invention, (ii) a polynucleotide of the invention, (iii) a gene construct of the invention, (iv ) a vector of the invention and (v) a host cell of the invention, in a therapeutically efficient amount.
  • therapeutically efficient amount refers to the amount of product (active ingredient) calculated to produce the desired effect and, in general, will be determined, among other causes, by the characteristics of protein and the therapeutic effect to be achieved.
  • the pharmaceutical composition of the invention may contain only one of said products (active ingredients), or, if desired, a combination of two or more of said different
  • the dose of active ingredient to be administered to a subject will be a therapeutically efficient amount and may vary within a wide range.
  • the pharmaceutical composition of the invention is You can administer one or more times a day for preventive or therapeutic purposes.
  • the dose of active ingredient to be administered will depend on numerous factors, including the characteristics of the product to be administered, such as, for example, its activity and biological half-life, the concentration of the product in the pharmaceutical composition, the clinical situation of the subject, the severity of the pathology, the pharmaceutical form of administration chosen, etc. For this reason, the doses mentioned in this invention should be considered only as guidelines for the person skilled in the art, and the latter must adjust the doses according to the variables mentioned above.
  • the pharmaceutical composition of the invention can be administered one or more times a day, in a typical amount between 2x10 9 and 2x10 11 particles of the viral vector / tumor (parenteral route / 20 ⁇ L / tumor), preferably, 1x10 10 - 1x10 13 particles of the viral vector / tumor, which is equivalent to approximately 1x10 12 -1x10 16 particles of the viral vector / kg body weight of the subject.
  • the pharmaceutical composition of the invention is used as an anti-tumor composition, for example, to inhibit the proliferation and / or migration of tumor cells, so that it can be used in the treatment and / or prevention of tumors and cancers
  • Virtually any type of cancer and tumor can be treated with the pharmaceutical composition of the invention.
  • Illustrative, non-limiting examples of the pathologies that can potentially be treated with the pharmaceutical composition of the invention include colon carcinomas, hepatocarcinomas, gliomas, lymphatic cancers, etc.
  • the pharmaceutical composition of the invention can be used with other drugs, for example, additional anti-tumor drugs, in order to increase the anti-tumor efficiency of the pharmaceutical composition of the invention, thereby generating a therapy of combination.
  • additional drugs may be part of the same pharmaceutical composition or, alternatively, can be provided as a separate pharmaceutical composition for administration at the same time (simultaneous administration) as the pharmaceutical composition of the invention or at different times (sequential administration) with respect to the administration of the pharmaceutical composition of The invention
  • additional anti-tumor drugs that can be administered together with the pharmaceutical composition of the invention, include, but are not limited to, 5-fluorouracil, taxol, etc.
  • the invention relates to the use of a product selected from:
  • Said pharmaceutical composition may be formulated in accordance with the aforementioned in relation to the pharmaceutical composition of the invention.
  • the invention relates to a method for the treatment of a tumor or a cancer, or to inhibit the proliferation and / or migration of tumor cells, which comprises administering to a subject in need of treatment, a therapeutically efficient amount. of a product selected from:
  • said product for administration to said subject, will be formulated in the form of a pharmaceutical composition, such as the pharmaceutical composition of the invention previously described.
  • the invention in another aspect, relates to an in vitro method for inhibiting cell proliferation or cell migration comprising contacting a cell culture with a composition comprising a product selected from: (i) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or a functionally equivalent variant or fragment thereof;
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 1, or a functionally equivalent variant or fragment thereof; (iii) a gene construct comprising said polynucleotide (ii); (iv) a vector comprising said polynucleotide (ii) or said gene construct (iii); Y
  • a host cell comprising said polynucleotide (ii), said gene construct (iii) or said vector (iv).
  • Antitumor activity of the A238L viral gene and its expression product This example illustrates the antitumor activity of the A238L viral gene of
  • A238L expression plasmids The nucleotide sequence of the ASFV A238L gene was cloned under the control of the cytomegalovirus (CMV) early promoter into the pRc / CMV expression vector (Invitrogen). The sequence of said A238L gene was amplified by a polymerase chain reaction (PCR) using the following oligonucleotides (generated by Isogen):
  • the first oligonucleotide (SEQ ID NO: 3) contains a CGCGCG tail and a cutting site for Xba I, while the second oligonucleotide (SEQ ID NO: 4) was designed with a GCGCGC tail and a cutting site for Hind III.
  • the product of the PCR reaction was digested with Hind III and Xba I and cloned into the multiple restriction site of the pRc / CMV vector.
  • the generated construction was called pRc / CMV-A238L.
  • the plasmid (Invitrogen) was obtained.
  • Cell cultures are from human colon adenocarcinoma (Caco-2 and HT29 cells), human T lymphomas (Jurkat cells) and murine glioma cells (C6).
  • the cell lines used were obtained from the American Type Culture Collection with the ATCC codes: TIB-152 for Jurkat, HTB-37 for Caco-2, and HTB-38 for the HT-29 line. All cells were cultured in RPMI 1640 medium (Gibco, BRL) supplemented with 2 mM L-glutamine, 100 U / mL gentamicin, non-essential amino acids and fetal bovine serum (FBS) at a concentration of 10%.
  • RPMI 1640 medium Gibco, BRL
  • FBS fetal bovine serum
  • All cell lines were maintained in culture at 37 0 C temperature and under controlled atmosphere with 97% relative humidity and 7% CO2.
  • Caco-2 and Jurkat lines have been obtained that stably express the A238L protein, through a standard transfection protocol using the LipofectAMINE Plus Reagent (Invitrogen) system, following the manufacturer's instructions.
  • the plasmid constructs used in the transfection were pcDNA-A238L (expresses the viral protein A238L) and the empty plasmid pcDNA 3.1 (experimental control), at a concentration of 1 ⁇ g DNA / 10 6 cells, all mixed in Opti-MEM I ( Gibco BRL).
  • the cells were maintained in culture in the presence of agent G-418 (geneticin) for 15 days, and thus were selected.
  • agent G-418 geneeticin
  • the presence of the A238L gene in these cells was verified by Southern blot, and the resulting new cell lines were called Caco-pcDNA and Caco-A238L, HT29-pcDNA and HT29-A238L, Jurkat-pcDNA and Jurkat-A238L, C6-pcDNA and C6- A238L.
  • the stimuli used were the following:
  • PHA phytohemagglutinin
  • ConA concanavalin
  • IL-1 interleukin 1
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor alpha
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • TGF- ⁇ beta tumor stimulating factor
  • mice deficient in COX-2, COX-2 +/- were obtained from "The Jackson Laboratory” (Bar Harbor, ME, USA).
  • the detection of "wild type” animals (wild type), heterozygous and homozygous for the mutation was done by analysis of the genotype by PCR and Southern blotting of the offspring of the crossing of heterozygous couples from DNA extracted from the tails of these mice, with the use of specific oligonucleotides against murine COX-2, acquired from Isogen, whose nucleotide sequences are shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.
  • the treatment of the animals and the experimental conditions was carried out. in accordance with current legislation (Royal Decree 223/1988, Law 15/1994, Royal Decree 951/1997) in the animal facility of the Molecular Biology Center.
  • the gene expression by means of conventional techniques such as Northern blotting or RT-PCR using probes and / or oligonucleotides specific for the viral protein A238L, for the human cyclooxygenase-2 (COX-2) and for the ⁇ -actin (control), for Discard differences due to the amount of sample used or to amplification by PCR.
  • conventional techniques such as Northern blotting or RT-PCR using probes and / or oligonucleotides specific for the viral protein A238L, for the human cyclooxygenase-2 (COX-2) and for the ⁇ -actin (control), for Discard differences due to the amount of sample used or to amplification by PCR.
  • oligonucleotides were generated by Isogen, and their sequences were as follows: - A238L: forward ⁇ '-CGCGCGTCTAGATTACTTTCCATACTTGTT-S '(SEQ ID NO: 3) and reverse 5'-GCGCGCAAGCTTATGGAACACATGTTTCCA-
  • Apoptosis detection assays were carried out by flow cytometry using propidium iodide. Briefly, the cells to be analyzed (Caco-pcDNA and Caco-A238L, in this experiment) were collected after the corresponding stimulation (in this case PMA 15 ng / ml and 1 ⁇ M calcium phosphorus) in culture. The cells were washed twice with 1X PBS, fixed in 70% ethanol, at 4 0 C, and resuspended in cycle buffer (containing propidium iodide 50 ⁇ g / mL, 0.1% sodium citrate, 50 mg / mL of Ribonuclease A (Sigma), all in 1X PBS). After the dying with propidium iodide for 30 minutes in the dark, the samples were analyzed in the flow cytometer, to determine the number of living and dead cells by apoptosis in the studied cell population.
  • cycle buffer containing propidium iodide 50 ⁇ g / m
  • Caco-2 cells that stably express the viral protein A238L (Caco-A238L) or stably transfected with the empty pcDNA 3.1 plasmid have been used as control cells, described above.
  • Jurkat cells that stably express the A238L viral protein (Caco-A238L) or stably transfected with the empty pcDNA 3.1 plasmid were used as control cells, also described above.
  • the trypan blue exclusion technique has been used for the cell proliferation assays.
  • the cells were kept at rest in fresh medium and, at the times indicated in each experiment, were collected, washed with 1X PBS, and resuspended in a solution of trypan blue diluted 1: 10. After staining the cells, only living cells, in proliferation (not stained by trypan blue) were counted under an optical microscope, in special Neubauer counting chambers.
  • Cell migration assays were performed in special cell migration chambers covered with a Matrigel mesh, covered with type I collagen, with a pore of 0.8 microns wide (acquired from Corning).
  • Caco-2 cells that stably express the viral protein A238L (Caco-A238L) or stably transfected with the empty pcDNA 3.1 plasmid (Caco-pcDNA) have been used as control cells, described above.
  • Caco-A238L the viral protein A238L
  • Caco-pcDNA the empty pcDNA 3.1 plasmid
  • Jurkat-pcDNA and Jurkat-A238L cells also described above, were used. The cells were stimulated for 4 hours with PMA / lon (15 ng / mL PMA and 1 ⁇ M calcium ionophore) at the established doses ( Figure 4). Subsequently, fresh medium was added to the cells, and these were grown in the external chamber in RPMI 1640 medium containing 2% FBS.
  • RPMI 1640 medium containing 20% fetal serum was added, to generate a serum gradient.
  • cell migration was quantified through the 2% -20% fetal serum gradient, by direct observation under the microscope, or using ImageJ quantification software, comparing the differences between the lines pcDNA and A238L phones. Data were normalized with respect to cell proliferation values and basal migration values of unstimulated cell lines.
  • the concentration of PGE 2 was determined in supernatants of cultures of Caco-pcDNA and Caco-A238L cells, previously stimulated with 15 ng / ml PMA and 1 ⁇ M calcium phosphorus during the times indicated in Figure 2 by a competition ELISA test using the Prostaglandin E 2 EIA Kit-Monoclonal (Cayman Chemicals) system, following the manufacturer's instructions.
  • This technique allows the introduction of recombinant DNA vectors into eukaryotic cells, so that the expression of cloned proteins in them or the regulation of promoters can be studied. For the latter, it is also necessary to have a reporter gene that allows quantifying the activity of the promoter in question.
  • the functional role of several putative components of the signal transduction pathways was evaluated by means of the transfection of expression vectors with the luciferase reporter gene, their effect being analyzed by quantification in a luminometer. Transfection was carried out using the LipofectAMINE Plus Reagent system (Invitrogen), following the manufacturer's instructions, and adding 250 ng DNA / 10 6 cells from each reporter construct, all mixed in Opti-MEM I (Gibco BRL).
  • reporter constructs containing the Firefly luciferase reporter gene have been used under the control of the complete sequence of the human cyclooxygenase-2 (COX-2) promoter.
  • This construction is known as p2-1900-luc, and was generated in the laboratory of Dr. Manuel Fresno as described in (I ⁇ iguez, MA, Mart ⁇ nez-Mart ⁇ nez, S., Punzón, C, Redondo, JM and Fresno, M; 2000; J Biol Chem. 4, 275 (31): 23627-35).
  • the cells were cultured in the absence or presence of PMA / lon for 4 hours, and analyzed in luciferase activity assays.
  • Figure 1A shows the values of the arithmetic mean ⁇ standard deviation of the relative luminescence units (RLU) per microgram of protein, normalized with respect to the values obtained from the Renilla luciferase control reporter, from triplicate tests.
  • RLU relative luminescence units
  • DMEM medium DulbeccoA / ogt Modified Eagle's Minimal Essential Medium
  • fetal bovine serum 10% fetal bovine serum 10%.
  • the monolayer cells were washed with PBS and subsequently treated with 5% trypsin; After a new washing and centrifugation, the cells were counted, resuspended in RPMI 1640 and finally injected peritoneally and intravenously in the abdominal region of each of the animals under study, at a rate of 1x10 6 cells per mouse and inoculation.
  • mice After transplantation, the mice were kept in sterile and adequate feeding conditions for a period of approximately 40 days and the size of the tumor developed in both Cases were evaluated at different time periods.
  • tumors were measured every four days in their two perpendicular axes, using a vernier digital caliper; the tumor volume was calculated with the formula (a X b> 2 ) / 2, where a is the major axis and b is the minor axis of the tumor.
  • a human colon adenocarcinoma cell line (Caco-2), which stably expresses the viral protein A238L (Caco-A238L) by stable transfection of the expression plasmid pcDNA-A238L
  • the inventors have observed that the activity of the promoter of the inducible enzyme COX-2 is inhibited by the effect of the A238L protein after stimulation of the cells with PMA 15 ng / ml plus 1 ⁇ M calcium ionophore (PMA / lon) ( Figure 1A).
  • the activity of said promoter was analyzed using the reporter construction p2-1900-luc, which contains the luciferase reporter gene under the control of the complete sequence of the human promoter of COX-2, using standard transient transfection protocols.
  • Figure 1 B the inhibition can be observed induced on the expression of COX-2 mRNA by the presence of A238L.
  • PGE 2 prostaglandin 2
  • Figure 2 shows that the synthesis of PGE 2 , one of the factors involved in tumor development, is inhibited in Caco-A238L cells (Caco-2 cells that stably express the gene encoding the A238L protein), when compared with normal Caco-2 cells.
  • Caco-A238L cells Caco-2 cells that stably express the gene encoding the A238L protein
  • This result has been obtained in specific ELISA tests using the Prostaglandin E 2 Kit-Monoclonal (Cayman Chemicals) system that detect PGE 2 in the culture supernatants of said cells, after stimulation with PMA / lon.
  • A238L in Caco-A238L cells enhances the apoptosis induced by pharmacological activators of the expression of COX-2 such as forbol esters (PMA) and calcium ionophore (Ion) (Figure 10).
  • PMA forbol esters
  • Ion calcium ionophore
  • mice in which transfected HT29 colon carcinoma cells have been xenotransplanted, either with a construct that encodes the GFP-COX-2 fusion protein or with said construct plus a pcDNA-A238L expression plasmid.
  • the mice were kept in sterile and adequate feeding conditions on the days indicated in Ia graph ( Figure 11), and the size of the tumor developed in both cases was evaluated in each of the points, as described extensively in the Materials and Methods section.

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Abstract

Se describe el empleo de un producto seleccionado entre (i) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, relacionada con la proteína viral A238L, o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de la misma; (ii) un polinucleótido que codifica dicha proteína, variante o fragmento, (iii) una construcción génica que comprende dicho polinucleótido, (iv) un vector que comprende dicho polinucleótido o dicha construcción génica, y (v) una célula hospedadora que comprende dicho polinucleótido, construcción génica o dicho vector, en la elaboración de una composición farmacéutica anti-tumoral para el tratamiento y/o prevención de tumores y cáncer.

Description

AGENTES ANTI-TUMORALES BASADOS EN LA PROTEINA VIRAL
A238L
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona, en general, con el empleo de polinucleótidos y proteínas relacionados con el gen viral A238L y su producto de expresión, Ia proteína viral A238L, como agentes antitumorales, útiles para el tratamiento de tumores y cánceres, y con composiciones farmacéuticas que contienen dichos polinucleótidos y proteínas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Tratamiento tumoral
El procedimiento más común para el tratamiento de enfermedades tumorales se basa en el uso de agentes químicos, es decir, Ia quimioterapia. Estos tratamientos, sin embargo, no actúan de manera selectiva, de forma que no sólo atacan a las células tumorales sino también al tejido sano, el cual queda muy dañado. Por consiguiente, sería muy deseable disponer de nuevos agentes anti-tumorales que reduzcan o eliminen estos efectos y con los cuales se pueda tratar el tumor selectivamente.
Las endostatinas (ES) son inhibidores de Ia migración de células endoteliales y de Ia angiogénesis y se ha demostrado que reducen el crecimiento tumoral en modelos animales. Boehm et al. (Boehm T, Folkman J, Browder T, O'Reilly MS. Antiangiogenic therapy of experimental cáncer does not induce acquired drug resistance. Nature. 1997 Nov 27; 390 (6658): 404-7) describen el empleo, como modelo experimental, de ratones a los que se les habían implantado diversos tumores. En los ratones no tratados con ES, dichos tumores crecieron rápidamente, provocando Ia muerte del animal. En cambio, los ratones tratados con ES después del desarrollo de tumores, se observó una reducción del volumen tumoral hasta alcanzar un tamaño casi microscópico. El tratamiento cíclico con ES de ratones portadores de tumor produjo una regresión completa de los tumores en modelos animales. Sin embargo, ensayos clínicos que se están llevando a cabo con ES no han reportado una inhibición significativa del crecimiento tumoral y raras veces se ha observado regresión tumoral. Desgraciadamente, este no es un ejemplo aislado y otros ensayos clínicos que incluyen diferentes moléculas anti-tumorales también son decepcionantes, a pesar de Io notables que fueron los efectos anti-tumorales en los modelos animales. En este contexto, parece lógico combinar varios agentes anti-tumorales para el tratamiento de tumores.
A pesar de los esfuerzos realizados hasta Ia fecha, sigue existiendo Ia necesidad de desarrollar nuevos agentes anti-tumorales útiles como agentes terapéuticos para el tratamiento o prevención de patologías que cursan con el desarrollo de tumores.
Ahora se ha encontrado, sorprendentemente, que Ia proteína A238L del virus de Ia peste porcina africana puede ser utilizada como agente anti- tumoral, por Io que dicha proteína puede servir de base para el desarrollo de nuevos agentes anti-tumorales.
Proteína A238L
Muchos virus de ADN codifican proteínas que ayudan al virus a evadir el sistema inmune del hospedador. El virus de Ia peste porcina africana (ASFV, del inglés Afrícan swine fever virus) es un virus de ADN bicatenario que codifica una potente proteína inmunosupresora, Ia proteína A238L. La proteína A238L de ASFV inhibe Ia activación del factor de transcripción NF-kB así como Ia actividad de Ia calcineurina, una fosfatasa regulada por calcio y calmodulina. El mecanismo por el cual se lleva a cabo Ia inhibición del factor de transcripción NF-kB es aún desconocido, aunque se cree que puede ser mediante Ia unión de Ia proteína viral a Ia subunidad p65 del factor de transcripción. Durante Ia infección viral, Ia proteína A238L de ASFV se expresa como dos formas de peso molecular distinto, una de 28 kDa y otra de 32 kDa. Ambas formas de Ia proteína A238L se producen a partir de un único ADN complementario (ADNc), Io que sugiere que dicha diferencia en el peso molecular se debe a una modificación post-traduccional de Ia proteína. Sin embargo, Ia naturaleza de dicha modificación no es conocida. Ambas formas se producen tras Ia infección y Ia de mayor peso molecular, 32 kDa, se acumula en el núcleo celular a largos periodos tras Ia infección. El virus tiene entonces el potencial de inhibir Ia activación transcripcional de genes inmunomoduladores dependientes de estas rutas de señalización en células infectadas, tales como macrófagos.
La función de A238L como inhibidora de Ia actividad fosfatasa de Ia calcineurina está mediada por Ia unión directa a Ia subunidad catalítica de Ia calcineurina. Dicha proteína se activa produciéndose una liberación de calcio y Ia unión de Ia calmodulina.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
La invención se basa en que los inventores, sorprendentemente, han observado que Ia expresión de un polinucleótido que codifica una proteína que comprende Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1 , relacionada con Ia proteína A238L de AFSV, inhibe Ia proliferación celular y/o Ia migración de células tumorales in vitro. Asimismo, en experimentos in vivo se ha observado que Ia expresión de dicha proteína en ratones xenotrasplantados con células tumorales que expresan dicha proteína inhibe el crecimiento tumoral, por Io que dicha proteína, o una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de Ia misma, así como un polinucleótido que codifica dicha proteína, variante o fragmento funcionalmente equivalente, pueden ser utilizados como agente terapéutico, en particular, como agente anti-tumoral, en el tratamiento y/o prevención de tumores y cáncer. Por tanto, en un aspecto, Ia invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende un producto seleccionado entre (i) una proteína que comprende Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1 , o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de Ia misma; (ii) un polinucleótido que codifica dicha proteína, variante o fragmento funcionalmente equivalente, (iii) una construcción génica que comprende dicho polinucleótido, (iv) un vector que comprende dicho polinucleótido o dicha construcción génica, y (v) una célula hospedadora que comprende dicho polinucleótido, construcción génica o dicho vector; y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización particular, dicha proteína es Ia proteína viral A238L de ASFV. En otra realización particular, dicho polinucleótido comprende, o está constituido por, el gen A238L que codifica Ia proteína A238L.
En otro aspecto, Ia invención se relaciona con el empleo del producto previamente identificado en Ia elaboración de una composición farmacéutica anti-tumoral.
En otro aspecto, Ia invención se relaciona con un método in vitro para inhibir Ia proliferación celular o para inhibir Ia migración celular que comprende poner en contacto un cultivo celular con una composición que comprende dicho producto previamente identificado.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1A es una diagrama que muestra Ia inhibición de Ia actividad del promotor de Ia enzima inducible COX-2 por efecto de Ia proteína A238L tras estimulación de las células (Caco-pcDNA y Caco- A238L) con PMA 15 ng/mL más ionóforo de calcio 1 μM (PMA/lon). La Figura 1 B muestra un gel de electroforesis de Ia RT-PCR llevada a cabo para detectar el ARNm de específico de COX-2. En Ia Figura puede observarse Ia inhibición inducida sobre Ia expresión del ARNm de COX-2 por Ia presencia de A238L. La Figura 2 es una representación gráfica que muestra Ia síntesis de prostaglandina E2 (PGE2) en líneas celulares derivadas de células Caco-2 (Caco-pcDNA y Caco-A238L). En dicha representación gráfica puede observarse cómo Ia síntesis de PGE2 está inhibida en células Caco-A238L (una línea celular que expresa Ia proteína viral A238L de forma estable).
La Figura 3 es una fotografía que muestra el resultado de un ensayo de proliferación celular in vitro en células que expresan de forma estable Ia proteína A238L (Caco-A238L) frente a células control Caco- pcDNA.
La Figura 4 es una representación gráfica que muestra Ia tasa de migración de las células Caco-pcDNA y Caco-A238L en condiciones de reposo (basal) y tras estimulación con PMA/lon. En las gráficas puede observarse cómo Ia expresión de A238L inhibe Ia migración de células tumorales in vitro.
La Figura 5 es un diagrama de barras ilustrativo de que Ia expresión de Ia proteína viral A238L en células Jurkat-A238L inhibe Ia migración celular basal, en condiciones de reposo, con respecto a células Jurkat control (Jurkat-pcDNA) que no expresan dicha proteína viral. La Figura 6 es un diagrama de barras ilustrativo de que Ia expresión de Ia proteína viral A238L en células Jurkat (Jurkat-A238L) inhibe Ia migración inducida por los agentes promotores de tumores y activadores farmacológicos de Ia expresión de COX-2 PMA e Ion.
La Figura 7 es un diagrama de barras ilustrativo de que Ia expresión de Ia proteína viral A238L en células Caco-A238L inhibe Ia migración basal, en condiciones de reposo.
La Figura 8 es un diagrama de barras ilustrativo de que Ia expresión de Ia proteína viral A238L en células Caco-A238L inhibe Ia migración inducida por estimuladores de Ia expresión de COX-2 (Ion). La Figura 9 es un diagrama de barras ilustrativo de que Ia expresión de Ia proteína viral A238L en células Caco-A238L inhibe Ia migración inducida por agentes promotores de tumores (PMA).
La Figura 10 es un diagrama de barras ilustrativo de que Ia expresión de Ia proteína viral A238L en células Caco-A238L potencia Ia apoptosis inducida por los activadores farmacológicos de Ia expresión de COX-2 (PMA/lon).
La Figura 11 es una gráfica que muestra el crecimiento de células de carcinoma de colon HT29 transfectadas in vivo en ratones "nude" (desnudos), bien con una construcción que codifica Ia proteína de fusión
GFP-COX-2 o con dicha construcción más un plásmido de expresión pcDNA-A238L. Tras el transplante, los ratones fueron mantenidos en condiciones de esterilidad y de alimentación adecuadas los días señalados en Ia gráfica, y el tamaño del tumor desarrollado en ambos casos fue evaluado en cada uno de los puntos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención se basa, en general, en que los inventores han observado que Ia expresión de un polinucleótido que codifica una proteína con Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1 inhibe Ia proliferación celular y Ia migración de células tumorales in vitro, así como el crecimiento tumoral in vivo en ratones xenotrasplantados con células tumorales que expresan dicha proteína, por Io que dicha proteína, o una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de Ia misma, así como un polinucleótido que codifica para dicha proteína, variante o fragmento funcionalmente equivalente, pueden ser utilizados como agentes terapéuticos, en particular, como agentes anti-tumorales, en el tratamiento y/o prevención del desarrollo de procesos tumorales y, por tanto, en Ia elaboración de composiciones farmacéuticas anti-tumorales. Dicho polinucleótido puede estar contenido en una construcción génica, en un vector o en una célula hospedadora que Io contiene. Por tanto, en un aspecto, Ia invención se relaciona con un producto seleccionado entre:
(i) una proteína que comprende Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1 , o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de Ia misma;
(ii) un polinucleótido que codifica dicha proteína que comprende
Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1 , o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de Ia misma; (iii) una construcción génica que comprende dicho polinucleótido
(¡i); (iv) un vector que comprende dicho polinucleótido (ii) o dicha construcción génica (iii); y
(v) una célula hospedadora que comprende dicho polinucleótido (ii), dicha construcción génica (iii) o dicho vector (iv); como agente terapéutico, en particular, como agente anti-tumoral.
De forma más concreta, en un aspecto, Ia invención se relaciona con una composición farmacéutica, en adelante composición farmacéutica de Ia invención, que comprende un producto seleccionado entre: (i) una proteína que comprende Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1 , o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de Ia misma;
(ii) un polinucleótido que codifica dicha proteína que comprende
Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1 , o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de Ia misma; (iii) una construcción génica que comprende dicho polinucleótido
(¡i);
(iv) un vector que comprende dicho polinucleótido (ii) o dicha construcción génica (iii); y (v) una célula hospedadora que comprende dicho polinucleótido
(ii), dicha construcción génica (iii) o dicho vector (iv); y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En una realización particular, Ia composición farmacéutica de Ia invención comprende una proteína que comprende Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1 , o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de Ia misma, en adelante, "proteína de Ia invención", y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Por razones de simplicidad, bajo Ia denominación "proteína de Ia invención" se incluyen dicha proteína que comprende Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1 , o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de Ia misma, es decir, con actividad anti- tumoral. El término "proteína", tal como aquí se utiliza, incluye tanto Ia forma no modificada post-traduccionalmente como todas las formas de modificaciones post-traduccionales, por ejemplo glicosilación, fosforilación o acetilación.
En una realización particular, Ia proteína de Ia invención comprende, o está constituida por, Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1 y presenta, al menos, actividad inhibitoria de Ia proliferación y/o migración celular de células tumorales, por Io que puede ser utilizada como agente terapéutico, en particular, como agente anti- tumoral. La actividad inhibitoria de Ia proliferación y/o migración celular de células tumorales de dicha proteína de Ia invención tanto in vitro como in vivo se ha puesto de manifiesto mediante los ensayos descritos en el Ejemplo 1. En una realización concreta, Ia proteína de Ia invención es Ia denominada proteína A238L del virus de Ia peste porcina africana (ASFV).
En el sentido utilizado en esta descripción, el término "variante" se refiere a un péptido sustancialmente homólogo y funcionalmente equivalente a Ia proteína que comprende Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1. Tal como aquí se utiliza, un péptido es
"sustancialmente homólogo" a dicha proteína cuando su secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad respecto a Ia secuencia de aminoácidos de dicha proteína, de, al menos, un 60%, ventajosamente de, al menos un 70%, preferentemente de, al menos, un 85%, y, más preferentemente de, al menos, un 95%. Asimismo, Ia expresión "funcionalmente equivalente", tal como aquí se utiliza, significa que el péptido o proteína en cuestión mantiene, al menos, una de las funciones de Ia proteína que comprende Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1 , preferentemente, al menos, una función relacionada con Ia inhibición de Ia proliferación y/o migración celular, en particular, con Ia inhibición de Ia proliferación y migración de células tumorales, y desarrollar una actividad anti-tumoral. La actividad inhibitoria de Ia proliferación o migración celular de células tumorales in vitro así como Ia actividad inhibitoria del crecimiento o proliferación tumoral in vivo en animales que expresan dicha proteína se puede determinar mediante métodos convencionales tales como los ensayos descritos en el Ejemplo 1 (véase el apartado relativo a los Materiales y Métodos).
En una realización particular, dicha variante es una forma muíante de Ia proteína que comprende Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1 que mantiene Ia actividad inhibitoria de Ia proliferación y/o migración de células tumorales. Dicha forma muíante puede presentar inserciones, deleciones o modificaciones de uno o más aminoácidos respecío a Ia proíeína que comprende Ia SEQ ID NO: 1 , con Ia condición de que conserve, al menos, una de dichas acíividades inhibiíorias de Ia proliferación y/o migración celular de células íumorales. Asimismo, en el seníido uíilizado en esía descripción, el íérmino
"fragmenío" se refiere a un pépíido que comprende una porción de dicha proíeína que comprende Ia secuencia de aminoácidos mosírada en Ia SEQ ID NO: 1 , es decir, una secuencia de aminoácidos coníiguos comprendida deníro de dicha SEQ ID NO: 1. Para su empleo en Ia preseníe invención dicho fragmenío debe ser funcionalmeníe equivaleníe a dicha proíeína que comprende Ia secuencia de aminoácidos mosírada en Ia SEQ ID NO: 1 , es decir, debe tener actividad inhibitoria de Ia proliferación y/o migración de células tumorales.
La proteína de Ia invención se puede obtener por métodos convencionales conocidos por los expertos en Ia materia, por ejemplo, a partir de un organismo productor de Ia misma, bien de forma nativa o recombinante, mediante un procedimiento que comprende cultivar dicho organismo bajo condiciones apropiadas para Ia expresión de dicha proteína y recuperarla. En una realización particular de esta invención, el organismo productor es el virus de Ia peste porcina africana (ASFV). En el Ejemplo 1 se describe Ia producción, aislamiento y purificación de una proteína que comprende Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1 , en concreto Ia proteína A238L de ASFV. Alternativamente, dicha proteína de Ia invención puede ser obtenida por métodos convencionales de síntesis química de proteínas conocidos por los expertos en Ia materia. Adicionalmente, Ia proteína de Ia invención puede formar parte de una proteína de fusión. En este sentido, a modo ilustrativo, no limitativo, dicha proteína de fusión puede contener una región A constituida por un primer péptido que comprende Ia proteína de Ia invención unida a una región B que comprende un segundo péptido. Dicho segundo péptido puede ser cualquier péptido apropiado, por ejemplo, un péptido con actividad anti-tumoral. En una realización particular, dicho segundo péptido puede ser, también, una proteína de Ia invención. Dicha región B puede estar unida a Ia región amino-terminal de dicha región A, o bien, alternativamente, dicha región B puede estar unida a Ia región carboxilo- terminal de dicha región A. Ambas regiones A y B pueden estar unidas directamente o a través de un péptido espaciador (linker) entre dichas regiones A y B. La proteína de fusión puede obtenerse por métodos convencionales conocidos por los expertos en Ia materia, por ejemplo, mediante Ia expresión génica de Ia secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína de fusión en células hospedadoras apropiadas. En otra realización particular, Ia composición farmacéutica de Ia invención comprende un polinucleótido que codifica Ia proteína de Ia invención, en adelante, "polinucleótido de Ia invención", y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Por razones de simplicidad, bajo Ia denominación "polinucleótido de
Ia invención" se incluyen el polinucleótido que comprende Ia secuencia de nucleótidos que codifica Ia proteína de Ia invención, es decir, Ia proteína que comprende Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1 , así como un polinucleótido que codifica una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de dicha proteína que comprende Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1.
En una realización concreta, el polinucleótido de Ia invención comprende, o está constituido por, Ia secuencia de nucleótidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 2, que codifica Ia proteína cuya secuencia de aminoácidos se muestra en Ia SEQ ID NO: 1 , proteína que presenta, al menos, actividad inhibitoria de Ia proliferación y/o migración de células tumorales, por Io que dicho polinucleótido de Ia invención que codifica dicha proteína puede ser utilizado como agente anti-tumoral. En una realización concreta, el polinucleótido de Ia invención comprende o está constituido por Ia secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 2) que codifica Ia denominada proteína A238L del virus de Ia peste porcina africana (ASFV).
El polinucleótido de Ia invención puede presentar variaciones en su secuencia respecto a Ia secuencia de nucleótidos mostrada en Ia SEQ ID
NO: 2, por ejemplo, sustituciones, inserciones y/o deleciones de uno o más nucleótidos, con Ia condición de que el polinucleótido resultante codifica una proteína de Ia invención, tal como una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de Ia proteína que comprende Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1. Por tanto, dentro del ámbito de Ia presente invención se encuentra cualquier polinucleótido sustancialmente homólogo y funcionalmente equivalente al polinucleótido de SEQ ID NO: 2, es decir, cualquier polinucleótido que codifica una proteína de Ia invención.
En el sentido utilizado en esta descripción, un polinucleótido es "sustancialmente homólogo" al polinucleótido de SEQ ID NO: 2 cuando su secuencia de nucleótidos tiene un grado de identidad respecto a Ia secuencia de nucleótidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 2 de, al menos, un 60%, ventajosamente de, al menos un 70%, preferentemente de, al menos, un 85%, y, más preferentemente de, al menos, un 95%. Típicamente un polinucleótido sustancialmente homólogo al polinucleótido de SEQ ID NO: 2 se puede aislar de un organismo productor de Ia proteína de Ia invención en base a Ia información contenida en dicha SEQ ID NO: 2, o bien se construye en base a Ia secuencia de ADN mostrada en Ia SEQ ID NO: 2, por ejemplo, mediante Ia introducción de sustituciones conservativas o no conservativas. Otros ejemplos de posibles modificaciones incluyen Ia inserción de uno o más nucleótidos en Ia secuencia, Ia adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los extremos de Ia secuencia, o Ia deleción de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de Ia secuencia.
Asimismo, tal como aquí se utiliza, "fragmento funcionalmente equivalente" aplicado a un polinucleótido dado, e.g., el polinucleótido definido en Ia SEQ ID NO: 2, se refiere, aunque no se limita, a un fragmento del polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos se muestra en Ia SEQ ID NO: 2 que comprende Ia secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento funcionalmente equivalente de Ia proteína cuya secuencia de aminoácidos se muestra en Ia SEQ ID NO: 1 que mantiene al menos una de las funciones de Ia proteína que comprende Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1 , en concreto, al menos una función relacionada con Ia inhibición de Ia proliferación y/o migración celular, en particular de células tumorales, que Ie permite desarrollar su función anti-tumoral. En otra realización particular, Ia composición farmacéutica de Ia invención comprende una construcción génica que comprende un polinucleótido de Ia invención, en adelante, "construcción génica de Ia invención", y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. La construcción génica de Ia invención puede incorporar, operativamente unida, una secuencia reguladora de Ia expresión del polinucleótido de Ia invención, constituyendo de este modo un cassette de expresión. Tal como se utiliza en esta descripción, Ia expresión "operativamente unida" significa que Ia proteína de Ia invención, codificada por el polinucleótido de Ia invención, es expresada en el marco de lectura correcto bajo el control de las secuencias de control o reguladoras de expresión.
Las secuencias de control son secuencias que controlan y regulan Ia transcripción y, en su caso, Ia traducción de Ia proteína de Ia invención, e incluyen secuencias promotoras, secuencias codificantes para reguladores transcripcionales, secuencias de unión a ribosomas (RBS) y/o secuencias terminadoras de transcripción. En una realización particular, dicha secuencia de control de expresión es funcional en células y organismos procariotas, por ejemplo, bacterias, etc., mientras que en otra realización particular, dicha secuencia de control de expresión es funcional en células y organismos eucariotas, por ejemplo, células de mamífero, líneas celulares tumorales de mamífero, etc. En una realización concreta, Ia invención proporciona una construcción génica en Ia que el polinucleótido de Ia invención se encuentra bajo el control del promotor temprano de citomegalovirus (CMV). Ventajosamente, Ia construcción de Ia invención comprende, además, un marcador o gen que codifica un motivo o un fenotipo que permita Ia selección de Ia célula hospedadora transformada con dicha construcción.
La construcción génica de Ia invención puede obtenerse mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en el estado de Ia técnica [Sambrook et al., "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2nd ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989 VoI 1-3] y, si se desea, puede ser insertada en un vector apropiado.
Por tanto, en otra realización particular, Ia composición farmacéutica de Ia invención comprende un vector que comprende un polinucleótido de Ia invención, o una construcción génica de Ia invención, en adelante "vector de Ia invención", y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. La elección del vector dependerá de Ia célula hospedadora en Ia que se va a introducir posteriormente. En una realización particular, el vector de Ia invención es un vector de expresión y el polinucleótido de Ia invención se encuentra bajo el control del promotor temprano de CMV. A modo ilustrativo, el vector donde se introduce dicho polinucleótido de Ia invención puede ser un plásmido que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra o no en el genoma de dicha célula. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de vectores en los que puede insertarse el polinucleótido de Ia invención o Ia construcción génica de Ia invención incluyen el vector pRc/CMV comercializado por Invitrogen.
La obtención del vector de Ia invención puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en Ia materia [Sambrook et al., "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2nd ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989 VoI 1-3]. En una realización particular, dicho vector es un vector útil para transformar células eucariotas, e.g., células animales y líneas celulares tumorales de mamífero.
Dependiendo del tipo de vector y de Ia célula a manipular, el vector de Ia invención puede ser utilizado para transformar, transfectar o infectar células susceptibles de ser transformadas, transfectadas o infectadas por dicho vector. Dichas células pueden ser procariotas o eucariotas. A modo ilustrativo, el vector de Ia invención puede ser utilizado para transformar células eucariotas o procariotas. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de células susceptibles de ser transformadas, transfectadas o infectadas por el vector de Ia invención incluyen las líneas celulares de adenocarcinoma de colon humano Caco-2 y HT29, células de Jurkat, células de glioma murino C6, etc. (véase el Ejemplo 1 ).
Por tanto, en otra realización particular, Ia composición farmacéutica de Ia invención comprende una célula hospedadora que comprende un polinucleótido de Ia invención, o una construcción génica de Ia invención, o un vector de Ia invención, en adelante "célula hospedadora de Ia invención", y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicha célula hospedadora de Ia invención es capaz de expresar Ia proteína de Ia invención y puede ser obtenida mediante transformación, transfección o infección con un vector de Ia invención.
La célula de Ia invención puede ser una célula eucariota o procariota. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de células que pueden ser utilizadas para Ia obtención de células hospedadoras de Ia invención incluyen las líneas celulares Caco-2 y HT29, células de Jurkat, células de glioma murino C6, etc.
Las células de Ia invención pueden ser obtenidas por métodos convencionales conocidos por los técnicos en Ia materia [Sambrok et al., 1989, citado supra].
Por otra parte, Ia composición farmacéutica de Ia invención comprende uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables, además, de dicho producto (principio activo) seleccionado entre: (i) una proteína de Ia invención, (ii) un polinucleótido de Ia invención, (iii) una construcción génica de Ia invención, (iv) un vector de Ia invención y (v) una célula hospedadora de Ia invención, para su administración a un sujeto en necesidad de tratamiento.
El término "sujeto", tal como aquí se utiliza, se refiere a un miembro de una especie de mamífero, e incluye, pero no se limita, animales domésticos, primates y humanos; preferentemente, el sujeto es un ser humano, masculino o femenino, de cualquier edad o raza. Para su administración a un sujeto, Ia composición farmacéutica de
Ia invención se presentará en una forma farmacéutica adecuada para su administración a un sujeto por cualquier vía de administración apropiada. Para ello, Ia composición farmacéutica de Ia invención incluirá los vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables necesarios para Ia elaboración de Ia forma farmacéutica de administración elegida. Evidentemente, Ia forma farmacéutica de administración del principio activo (producto) puede variar dentro de un amplio intervalo de posibilidades conocidas por los expertos en Ia materia, dependiendo de Ia naturaleza de dicho principio activo (proteína, ácido nucleico o célula).
En una realización particular, Ia composición farmacéutica de Ia invención se formulará en una forma farmacéutica de administración sólida (e.g., comprimidos, cápsulas, grageas, granulos, supositorios, etc.) o líquida (e.g., soluciones, suspensiones, emulsiones, etc.) para su administración por cualquier vía de administración apropiada, por ejemplo, por vía oral, parenteral (e.g., intramuscular, subcutánea, intravenosa, etc.), etc. Esta forma farmacéutica de administración del principio activo resulta especialmente adecuada cuando el principio activo es una proteína de Ia invención. En cada caso se elegirán los vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables apropiados para Ia forma farmacéutica de administración y vía de administración elegida. Información sobre dichos vehículos y excipientes, así como sobre dichas formas farmacéuticas de administración de Ia proteína de Ia invención puede encontrarse en tratados de farmacia galénica. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de fármacos, en general, y de sus procedimientos de preparación puede encontrarse en el libro "Tratado de Farmacia Galénica", de C. Faulí i Trillo, 1a Edición, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones.
En otra realización particular, cuando el principio activo comprende un polinucleótido de Ia invención, Ia composición farmacéutica de Ia invención puede formularse en forma de una composición destinada para su empleo en terapia génica; a modo ilustrativo, no limitativo, en este caso, Ia composición farmacéutica de Ia invención puede contener un vector, viral o no viral, que comprende un polinucleótido de Ia invención o una construcción génica de Ia invención. A modo ilustrativo, no limitativo, dichos vectores pueden ser vectores virales, por ejemplo, basados en retrovirus, adenovirus, etc., o no virales tales como los complejos ADN- liposoma, ADN-polímero, ADN-polímero-liposoma, etc. [véase "Nonviral Vectors for Gene Therapy", editado por Huang, Hung y Wagner, Academic Press (1999)]. Dichos vectores, que contienen un polinucleótido o una construcción génica de Ia invención pueden ser administrados directamente al cuerpo humano o animal por métodos convencionales. Alternativamente, dichos vectores pueden ser utilizados para transformar, transfectar o infectar células, por ejemplo, células de mamíferos, incluido el hombre, ex vivo, y, posteriormente implantarlas en el cuerpo humano o animal para obtener el efecto terapéutico deseado. Para su admistración al cuerpo humano o animal dichas células se formularán en un medio adecuado que no afecte adversamente a Ia viabilidad de dichas células.
La composición farmacéutica de Ia invención comprende, al menos, un producto (principio activo) seleccionado entre: (i) una proteína de Ia invención, (ii) un polinucleótido de Ia invención, (iii) una construcción génica de Ia invención, (iv) un vector de Ia invención y (v) una célula hospedadora de Ia invención, en una cantidad terapéuticamente eficiente. En el sentido utilizado en esta descripción, Ia expresión "cantidad terapéuticamente eficiente" se refiere a Ia cantidad de producto (principio activo) calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de proteína y el efecto terapéutico a conseguir. La composición farmacéutica de Ia invención puede contener uno solo de dichos productos (principios activos), o, si se desea, una combinación de dos o más de dichos productos diferentes.
A modo ilustrativo, Ia dosis de principio activo a administrar a un sujeto será una cantidad terapéuticamente eficiente y puede variar dentro de un amplio intervalo. La composición farmacéutica de Ia invención se puede administrar una o más veces al día con fines preventivos o terapéuticos. La dosis de principio activo a administrar dependerá de numerosos factores, entre los que se incluyen las características del producto a administrar, tales como, por ejemplo, su actividad y vida media biológica, Ia concentración del producto en Ia composición farmacéutica, Ia situación clínica del sujeto, Ia severidad de Ia patología, Ia forma farmacéutica de administración elegida, etc. Por este motivo, las dosis mencionadas en esta invención deben ser consideradas tan solo como guías para el experto en Ia materia, y éste debe ajustar las dosis en función de las variables citadas anteriormente. A modo simplemente ilustrativo, no limitativo, en una realización particular, Ia composición farmacéutica de Ia invención se puede administrar una o más veces al día, en una cantidad típica comprendida entre 2x109 y 2x1011 partículas del vector viral/tumor (vía parenteral/20 μL/tumor), preferentemente, 1x1010- 1x1013 partículas del vector viral/tumor, Io que equivale a, aproximadamente, 1x1012-1x1016 partículas del vector viral/kg de peso corporal del sujeto.
En una realización particular, Ia composición farmacéutica de Ia invención se utiliza como composición anti-tumoral, por ejemplo, para inhibir Ia proliferación y/o Ia migración de células tumorales, por Io que puede utilizarse en el tratamiento y/o prevención de tumores y cánceres. Prácticamente cualquier tipo de cáncer y tumor puede ser tratado con Ia composición farmacéutica de Ia invención. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de las patologías que pueden ser potencialmente tratadas con Ia composición farmacéutica de Ia invención incluyen carcinomas de colon, hepatocarcinomas, gliomas, cánceres linfáticos, etc.
La composición farmacéutica de Ia invención, si se desea, puede usarse con otros fármacos, por ejemplo, fármacos anti-tumorales adicionales, con el fin de aumentar Ia eficiencia anti-tumoral de Ia composición farmacéutica de Ia invención, generándose de este modo una terapia de combinación. Dichos fármacos adicionales pueden formar parte de Ia misma composición farmacéutica o, alternativamente, pueden facilitarse como una composición farmacéutica separada para su administración al mismo tiempo (administración simultánea) que Ia composición farmacéutica de Ia invención o en momentos diferentes (administración secuencial) respecto a Ia administración de Ia composición farmacéutica de Ia invención. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de fármacos anti-tumorales adicionales que pueden ser administrados junto con Ia composición farmacéutica de Ia invención, incluyen, aunque no se limitan a, 5-fluorouracilo, taxol, etc. En otro aspecto, Ia invención se relaciona con el empleo de un producto seleccionado entre:
(i) una proteína que comprende Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1 , o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de Ia misma; (ii) un polinucleótido que codifica dicha proteína que comprende
Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1 , o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de Ia misma;
(iii) una construcción génica que comprende dicho polinucleótido (ii);
(iv) un vector que comprende dicho polinucleótido (ii) o dicha construcción génica (iii); y (v) una célula hospedadora que comprende dicho polinucleótido
(ii), dicha construcción génica (iii) o dicho vector (iv); en Ia elaboración de una composición farmacéutica anti-tumoral, es decir, en Ia elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de tumores y/o cáncer.
Prácticamente cualquier tipo de cáncer y tumor puede ser tratado con dicha composición farmacéutica. Dicha composición farmacéutica puede formularse de acuerdo con Io mencionado previamente en relación con Ia composición farmacéutica de Ia invención.
En otro aspecto, Ia invención se relaciona con un método para el tratamiento de un tumor o de un cáncer, o para inhibir Ia proliferación y/o migración de células tumorales, que comprende administrar a un sujeto en necesidad de tratamiento, una cantidad terapéuticamente eficiente de un producto seleccionado entre:
(i) una proteína que comprende Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1 , o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de Ia misma;
(ii) un polinucleótido que codifica dicha proteína que comprende Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1 , o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de Ia misma;
(iii) una construcción génica que comprende dicho polinucleótido
(¡i);
(iv) un vector que comprende dicho polinucleótido (ii) o dicha construcción génica (iii); y (v) una célula hospedadora que comprende dicho polinucleótido
(ii), dicha construcción génica (iii) o dicho vector (iv). Prácticamente cualquier tipo de cáncer y tumores puede ser tratado de acuerdo con dicho método. Para su administración a dicho sujeto, dicho producto (principio activo) se formulará en forma de una composición farmacéutica, tal como Ia composición farmacéutica de Ia invención previamente descrita.
En otro aspecto, Ia invención se refiere a un método in vitro para inhibir Ia proliferación celular o Ia migración celular que comprende poner en contacto un cultivo celular con una composición que comprende un producto seleccionado entre: (i) una proteína que comprende Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1 , o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de Ia misma;
(ii) un polinucleótido que codifica dicha proteína que comprende Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia
SEQ ID NO: 1 , o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de Ia misma; (iii) una construcción génica que comprende dicho polinucleótido (ii); (iv) un vector que comprende dicho polinucleótido (ii) o dicha construcción génica (iii); y
(v) una célula hospedadora que comprende dicho polinucleótido (ii), dicha construcción génica (iii) o dicho vector (iv). Este método puede ser potencialmente útil en investigación para controlar el crecimiento y/o migración de células, tanto tumorales como no tumorales. Para su empleo, dicho producto estará mezclado o combinado con vehículos y compuestos que no afecten adversamente al producto.
El siguiente Ejemplo sirve para ilustrar Ia invención y no debe ser considerado como limitativo del alcance de Ia misma.
EJEMPLO 1
Actividad antitumoral del gen viral A238L y de su producto de expresión Este ejemplo ilustra Ia actividad antitumoral del gen viral A238L de
ASFV y de su producto de expresión, Ia proteína viral A238L, en distintas presentaciones (plásmidos de expresión euroriótica, proteína recombinante y vectores adenovirales-A238L y retrovirales-A238L). I. MATERIALES Y MÉTODOS
Construcciones génicas
Plásmidos de expresión A238L: La secuencia de nucleótidos del gen A238L de ASFV fue clonada bajo el control del promotor temprano de citomegalovirus (CMV) en el vector de expresión pRc/CMV (Invitrogen). La secuencia de dicho gen A238L fue amplificada mediante una reacción en cadena de Ia polimerasa (PCR) utilizando los oligonucleótidos siguientes (generados por Isogen):
5'-CGCGCGTCTAGATTACTTTCCATACTTGTTC-3'(SEQ ID NO: 3) 5'-GCGCGCAAGCTTATGGAACACATGTTTCAAG-3'(SEQ ID NO: 4)
El primer oligonucleótido (SEQ ID NO: 3) contiene una cola CGCGCG y un sitio de corte para Xba I, mientras que el segundo oligonucleótido (SEQ ID NO: 4) fue diseñado con una cola GCGCGC y un sitio de corte para Hind III. El producto de Ia reacción PCR fue digerido con Hind III y Xba I y clonado dentro del sitio de restricción múltiple del vector pRc/CMV. La construcción generada fue llamada pRc/CMV-A238L. Siguiendo el mismo procedimiento pero clonando el producto de Ia reacción PCR en el vector de expresión en mamíferos pcDNA 3.1 (Invitrogen) se obtuvo el plásmido denominado pcDNA-A238L.
Cultivos celulares Las líneas celulares empleadas son de adenocarcinoma de colon humano (células Caco-2 y HT29), linfomas T humanos (células Jurkat) y células de glioma murino (C6). Las líneas celulares utilizadas fueron obtenidas de American Type Culture Collection con los códigos ATCC: TIB-152 para Jurkat, HTB-37 para Caco-2, y HTB-38 para Ia línea HT-29. Todas las células fueron cultivadas en medio RPMI 1640 (Gibco, BRL) suplementado con L-glutamina 2 mM, 100 U/mL de gentamicina, aminoácidos no esenciales y suero fetal bovino (FBS) a una concentración del 10%. Todas las líneas celulares fueron mantenidas en cultivo a 370C de temperatura y bajo atmósfera controlada con un 97% de humedad relativa y 7% de CO2. Además, se han obtenido líneas Caco-2 y Jurkat que expresan establemente Ia proteína A238L, mediante un protocolo de transfección estándar utilizando el sistema LipofectAMINE Plus Reagent (Invitrogen), siguiendo las indicaciones del fabricante. Las construcciones plasmídicas utilizadas en Ia transfección fueron pcDNA-A238L (expresa Ia proteína viral A238L) y el plásmido vacío pcDNA 3.1 (control experimental), a una concentración de 1 μg ADN/106 células, todo ello mezclado en Opti-MEM I (Gibco BRL). Tras Ia transfección, las células fueron mantenidas en cultivo en presencia del agente G-418 (geneticina) durante 15 días, y así fueron seleccionadas. La presencia del gen A238L en dichas células fue comprobada mediante Southern blot, y las nuevas líneas celulares resultantes fueron denominadas Caco-pcDNA y Caco-A238L, HT29- pcDNA y HT29-A238L, Jurkat-pcDNA y Jurkat-A238L, C6-pcDNA y C6- A238L.
React i vos/estí m u I os
Los estímulos empleados, dependiendo del tipo celular y del ensayo realizado, fueron los siguientes:
- Mitógenos: fitohemaglutinina (PHA), concanavalina (ConA).
- Agentes farmacológicos: esteres de forbol, forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), lonóforo de calcio (Ion).
- Citoquinas: interleuquina 1 (IL-1 ), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α).
- Factores proangiogénicos: factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), factor estimulador de tumores beta (TGF-β). Todos los reactivos utilizados fueron adquiridos a Sigma. Obtención de ratones genéticamente deficientes
Los ratones deficientes en COX-2, COX-2 +/- (B6, 129- Ptgs2tmUed), fueron obtenidos a partir de "The Jackson Laboratory" (Bar Harbor, ME, EEUU). La detección de animales "wild type" (tipo salvaje), heterocigotos y homocigotos para Ia mutación se hizo mediante el análisis del genotipo por PCR y Southern blotting de Ia descendencia del cruce de parejas heterocigotos a partir de ADN extraído de colas de estos ratones, con el uso de oligonucleótidos específicos frente a COX-2 murino, adquiridos a Isogen, cuyas secuencias de nucleótidos se muestran en SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6. El tratamiento de los animales y las condiciones de experimentación se llevó a cabo de acuerdo con Ia legislación vigente (Real Decreto 223/1988, Ley 15/1994, Real Decreto 951/1997) en el animalario del Centro de Biología Molecular.
Análisis de Ia expresión de ARNm
El ARN total se aisló de las distintas líneas celulares [e.g., Caco- pcDNA y Caco-A238L] tras tratamiento con diferentes estímulos [e.g.,
PMA/lon, a diferentes tiempos (0, 2, 4, 6, 12, 18 y 24 horas)], utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen), siguiendo las indicaciones de Ia casa comercial. Dicho ARN fue obtenido con el fin de determinar diferencias en
Ia expresión génica por medio de técnicas convencionales como Northern blotting o RT-PCR empleando sondas y/o oligonucleótidos específicos para Ia proteína viral A238L, para Ia ciclooxigenasa-2 (COX-2) humana y para Ia β-actina (control), para desechar diferencias debidas a Ia cantidad de muestra utilizada o a Ia amplificación por PCR.
Todos los oligonucleótidos fueron generados por Isogen, y sus secuencias eran las siguientes: - A238L: forward δ'-CGCGCGTCTAGATTACTTTCCATACTTGTT-S' (SEQ ID NO: 3) y reverse 5'-GCGCGCAAGCTTATGGAACACATGTTTCCA-
3' (SEQ ID NO: 4); - COX-2: forward δ'-TTCAAATGAGATTGTGGGAAAATTGCT-S' (SEQ ID NO: 5) y reverse δ'-AGATCATCTCTGCCTGAGTATCTT-S' (SEQ ID NO: 6); - β-actina: forward δ'-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-S' (SEQ ID NO: 7) y reverse δ'-GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA-S' (SEQ ID NO: 8).
Ensayos de detección de apoptosis Los ensayos de detección de apoptosis se llevaron a cabo mediante citometría de flujo utilizando ioduro de propidio. Brevemente, las células a analizar (Caco-pcDNA y Caco-A238L, en este experimento) se recogieron tras Ia estimulación correspondiente (en este caso PMA 15 ng/ml e lonóforo de calcio 1 μM) en cultivo. Las células fueron lavadas dos veces con PBS 1X, fijadas en etanol al 70%, a 40C, y resuspendidas en tampón de ciclo (conteniendo ioduro de propidio 50 μg/mL, citrato sódico 0,1 %, 50 mg/mL de ribonucleasa A (Sigma), todo en PBS 1X). Tras el mareaje con ioduro de propidio durante 30 minutos en oscuridad, las muestras fueron analizadas en el citómetro de flujo, para determinar el número de células vivas y muertas por apoptosis en Ia población celular estudiada.
Ensayos de proliferación celular
En estos ensayos se han utilizado células Caco-2 que expresan de forma estable Ia proteína viral A238L (Caco-A238L) o transfectadas de manera estable con el plásmido pcDNA 3.1 vacío (Caco-pcDNA) como células control, descritas anteriormente. Asimismo, se utilizaron células Jurkat que expresan de forma estable Ia proteína viral A238L (Caco- A238L) o transfectadas de manera estable con el plásmido pcDNA 3.1 vacío (Jurkat-pcDNA) como células control, también descritas anteriormente. Para los ensayos de proliferación celular se ha utilizado Ia técnica de exclusión por azul tripano. Brevemente, tras Ia correspondiente estimulación (en este caso PMA 15 ng/ml e lonóforo de calcio 1 μM), y utilizando DMSO como control experimental (disolvente de los reactivaos de estimulación) y ciclosporina A (CsA) como inhibidor de los activadores PMA/lon, las células se mantuvieron en reposo en medio fresco y, a los tiempos indicados en cada experimento, fueron recogidas, lavadas con PBS 1X, y resuspendidas en una solución de azul tripano diluido 1 :10. Tras Ia tinción de las células, se contaron solamente las células vivas, en proliferación (no teñidas por el azul tripano) bajo microscopio óptico, en cámaras especiales de contaje Neubauer.
Ensayos de migración celular
Los ensayos de migración celular se realizaron en cámaras especiales de migración celular recubiertas de una malla de Matrigel, cubiertas de colágeno tipo I, con un poro de 0,8 mieras de ancho (adquiridas a Corning).
En estos ensayos se han utilizado células Caco-2 que expresan de forma estable Ia proteína viral A238L (Caco-A238L) o transfectadas de manera estable con el plásmido pcDNA 3.1 vacío (Caco-pcDNA) como células control, descritas anteriormente. Asimismo, se utilizaron células Jurkat-pcDNA y Jurkat-A238L, también descritas anteriormente. Las células fueron estimuladas durante 4 horas con PMA/lon (PMA 15 ng/mL e ionóforo de calcio 1 μM) a las dosis establecidas (Figura 4). Posteriormente se añadió medio fresco a las células, y éstas se cultivaron en Ia cámara externa en medio RPMI 1640 conteniendo 2% de FBS. En Ia cámara interna se añadió medio RPMI 1640 conteniendo 20% suero fetal, para generar un gradiente de suero. Tres días después, se cuantificó Ia migración celular a través del gradiente de suero fetal del 2%-20%, mediante observación directa bajo el microscopio, o utilizando el software de cuantificación ImageJ, comparando las diferencias entre las líneas celulares pcDNA y A238L. Los datos fueron normalizados respecto a los valores de proliferación celular y a los valores de migración basal de las líneas celulares sin estimular.
Determinación de Ia síntesis de prostaglandina Eg (PGEg)
La concentración de PGE2 fue determinada en sobrenadantes de cultivos de células Caco-pcDNA y Caco-A238L, previamente estimuladas con PMA 15 ng/ml e lonóforo de calcio 1 μM durante los tiempos indicados en Ia Figura 2 mediante un ensayo de ELISA de competición utilizando el sistema Prostaglandin E2 EIA Kit-Monoclonal (Cayman Chemicals), siguiendo las instrucciones del fabricante.
Ensayos de transfección transitoria de células eucariotas
Esta técnica permite introducir vectores de ADN recombinante en células eucariotas, de modo que se puede estudiar Ia expresión de proteínas clonadas en ellos o Ia regulación de promotores. Para esto último es necesario, además, contar con un gen reportero que permita cuantificar Ia actividad del promotor en cuestión. En este caso, se evaluó el papel funcional de varios componentes putativos de las vías de transducción de señales mediante Ia transfección de vectores de expresión con el gen reportero luciferasa, analizándose su efecto mediante Ia cuantificación en un luminómetro. La transfección se llevó a cabo utilizando el sistema LipofectAMINE Plus Reagent (Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante, y añadiendo 250 ng ADN/106 células de cada construcción reportera, todo ello mezclado en Opti-MEM I (Gibco BRL).
En dichas transfecciones se han utilizado construcciones reporteras conteniendo el gen reportero luciferasa Firefly bajo el control de Ia secuencia completa del promotor de ciclooxigenasa-2 (COX-2) humano. Esta construcción se conoce como p2-1900-luc, y fue generada en el laboratorio del Dr. Manuel Fresno como se describe en (Iñiguez, M.A., Martínez-Martínez, S., Punzón, C, Redondo, J. M. y Fresno, M; 2000; J Biol Chem. 4, 275(31 ):23627-35). Dieciséis horas después de Ia transfección, las células fueron cultivadas en ausencia o presencia de PMA/lon durante 4 horas, y analizadas en ensayos de actividad luciferasa. La Figura 1A muestra los valores de Ia media aritmética ± desviación típica de las unidades relativas de luminiscencia (RLU) por microgramo de proteína, normalizados con respecto de los valores obtenidos del reportero control luciferasa Renilla, procedentes de ensayos realizados por triplicado.
Ensayos de formación de tumores "in vivo"
Estos ensayos han sido realizados en ratones "nude" (desnudos) en los cuales se han xenotransplantado células de carcinoma de colon HT-29 que expresan establemente Ia proteína viral A238L (HT29-A238L), o no (HT29 control), así como células HT-29 que sobreexpresan COX-2 wild type, o una proteína de fusión GFP-COX-2 mediante Ia transfección de un plásmido de expresión que contiene el ADNc correspondiente a Ia secuencia completa complementaria al ARNm del gen de COX-2 humano, clonado en el sitio de clonaje múltiple del plásmido pEGFP-C2 (Invitrogen), en posición carboxilo-terminal. Los cultivos celulares fueron mantenidos a 370C en atmósfera de CO2, utilizando medio DMEM (DulbeccoA/ogt Modified Eagle's Minimal Essential Médium) suplementado con suero fetal bovino al 10%. Cuando Ia confluencia celular fue cercana al 80%, las células en monocapa fueron lavadas con PBS y, posteriormente, tratadas con tripsina al 5%; después de un nuevo lavado y centrifugado, las células fueron contadas, resuspendidas en RPMI 1640 y finalmente inyectadas por vía peritoneal e intravenosa en Ia región abdominal de cada uno de los animales bajo estudio, a razón de 1x106 células por ratón e inoculación.
Tras el transplante, los ratones fueron mantenidos en condiciones de esterilidad y de alimentación adecuadas durante un periodo de aproximadamente 40 días y el tamaño del tumor desarrollado en ambos casos fue evaluado a distintos periodos de tiempo. Para evaluar el crecimiento tumoral, los tumores fueron medidos cada cuatro días en sus dos ejes perpendiculares, utilizando un calibrador digital tipo vernier; el volumen tumoral fue calculado con Ia fórmula (a X b>2)/2, en donde a es el eje mayor y b es el eje menor del tumor.
II. RESULTADOS
1. La presencia de Ia proteína viral A238L inhibe eficazmente Ia actividad del promotor de COX-2 y Ia expresión de ARN mensajero de
COX-2 en células de carcinoma de colon
Utilizando una línea de células de adenocarcinoma de colon humano (Caco-2), que expresa de manera estable Ia proteína viral A238L (Caco-A238L) por transfección estable del plásmido de expresión pcDNA- A238L, los inventores han observado que Ia actividad del promotor de Ia enzima inducible COX-2 se inhibe por efecto de Ia proteína A238L tras estimulación de las células con PMA 15 ng/ml más ionóforo de calcio 1 μM (PMA/lon) (Figura 1A). La actividad de dicho promotor fue analizada utilizando Ia construcción reportera p2-1900-luc, que contiene el gen reportero luciferasa bajo el control de Ia secuencia completa del promotor humano de COX-2, utilizando protocolos estándar de transfección transitoria.
También se obtuvo ARN total de células Caco-pcDNA y células Caco-A238L previamente estimuladas durante los tiempos indicados en Ia Figura 1 B, con PMA 15 ng/ml más ionóforo de calcio 1 μM (PMA/lon). El ARNm específico de COX-2 fue detectado mediante RT-PCR utilizando oligonucleótidos específicos para COX-2 humana. También se incluyó un control experimental con oligonucleótidos específicos frente a β-actina, para desechar diferencias debidas a Ia cantidad de muestra o a Ia amplificación por PCR. En Ia Figura 1 B puede observarse Ia inhibición inducida sobre Ia expresión del ARNm de COX-2 por Ia presencia de A238L.
2. La PGE2 (prostaglandina 2) producto de Ia actividad de Ia COX-2, es inhibida por efecto de A238L
La Figura 2 muestra que Ia síntesis de PGE2, uno de los factores implicados en el desarrollo tumoral, está inhibida en células Caco-A238L (células Caco-2 que expresan de forma estable el gen que codifica Ia proteína A238L), cuando se compara con células Caco-2 normales. Este resultado ha sido obtenido en ensayos de ELISA específicos utilizando el sistema Prostaglandin E2 EIA Kit-Monoclonal (Cayman Chemicals) que detectan PGE2 en los sobrenadantes de cultivo de dichas células, tras su estimulación con PMA/lon.
3. La presencia de A238L inhibe Ia proliferación celular "in vitro"
Utilizando el método de exclusión por tinción con azul tripano y posterior contaje de células en cámara Neubauer, se ha observado que las células que expresan de forma estable Ia proteína viral A238L (Caco- A238L) tienen una menor tasa de división frente a las células Caco-pcDNA control, Io que demuestra que Ia proteína A238L modula negativamente el crecimiento tumoral (Figura 3).
4. La presencia de A238L inhibe Ia migración de células tumorales "in vitro" Utilizando células Caco-2 transfectadas con el plásmido pcDNA
(Caco-pcDNA) y células Caco-2 transfectadas con el plásmido de expresión pcDNA-A238L (Caco-A238L), estimuladas durante 4 horas con PMA 15 ng/mL e ionóforo de calcio 1 μM (PMA/lon), se ha cuantificado Ia tasa de migración de dichas células frente a un gradiente de suero fetal del 2% al 20% en cámaras de matrigel de 0,8 mieras de ancho de poro, comparando las diferencias entre ambas líneas celulares. Los datos fueron normalizados respecto a Ia proliferación celular y a los valores de migración basal (sin estimular) para cada línea celular (Figura 4).
Asimismo, los resultados muestran que Ia expresión de A238L en células Jurkat-A238L inhibe Ia migración basal, en condiciones de reposo, con respecto a células Jurkat control (Jurkat-pcDNA) que no expresan dicha proteína viral (Figura 5). Por otra parte, se ha observado que Ia expresión de A238L en células Jurkat (Jurkat-A238L) inhibe Ia migración inducida por agentes promotores de tumores y activadores farmacológicos de Ia expresión de COX-2 tales como PMA e Ion (Figura 6). Los inventores también han observado que Ia expresión de A238L en células Caco-A238L inhibe Ia migración basal, en condiciones de reposo (Figura 7) así como Ia migración inducida por activadores farmacológicos de Ia expresión de COX-2 tales como Ion (Figura 8) y Ia migración inducida por agentes promotores de tumores como esteres de forbol (PMA) (Figura 9).
Por otro lado, Ia expresión de A238L en células Caco-A238L potencia Ia apoptosis inducida por activadores farmacológicos de Ia expresión de COX-2 tales como esteres de forbol (PMA) e ionóforo de calcio (Ion) (Figura 10). Aunque no se desea estar vinculado a ninguna teoría, esto puede ser debido a que A238L, al bloquear COX-2, inhiba directa o indirectamente las señales de supervivencia producidas por Ia prostaglandina E2 (PGE2).
5. Resultados "in vivo" Los experimentos "in vivo" han sido realizados en ratones "nude"
(desnudos) en los cuales se han xenotransplantado células de carcinoma de colon HT29 transfectadas, bien con una construcción que codifica para Ia proteína de fusión GFP-COX-2 o con dicha construcción más un plásmido de expresión pcDNA- A238L. Tras el transplante, los ratones fueron mantenidos en condiciones de esterilidad y de alimentación adecuadas los días señalados en Ia gráfica (Figura 11 ), y el tamaño del tumor desarrollado en ambos casos fue evaluado en cada uno de los puntos, como se describe ampliamente en el apartado Materiales y Métodos.
Como muestra Ia Figura 11 , el tamaño del tumor que se induce en presencia de A238L es mucho menor que el producido en ratones transplantados con Ia construcción GFP-COX-2.
Los datos presentados "in vivo" son consecuentes con el hecho de que Ia inhibición de COX-2 por A238L, ampliamente documentada "in vitro", previene Ia síntesis de prostaglandina E2 (PGE2), Ia cual actúa en el modelo de ratón de modo autocrino favoreciendo Ia migración, induciendo señales anti-apoptóticas y permitiendo en fin el mayor crecimiento in vivo del tumor, Io cual contrarresta Ia expresión de A238L en las células implantadas.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Una composición farmacéutica que comprende un producto seleccionado entre: (i) una proteína que comprende Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1 , o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de Ia misma;
(ii) un polinucleótido que codifica dicha proteína que comprende
Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1 , o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de Ia misma; (iii) una construcción génica que comprende dicho polinucleótido
(¡i);
(iv) un vector que comprende dicho polinucleótido (ii) o dicha construcción génica (iii); y
(v) una célula hospedadora que comprende dicho polinucleótido
(ii), dicha construcción génica (iii) o dicho vector (iv); y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
2. Composición farmacéutica según Ia reivindicación 1 , en el que dicha proteína comprende, o está constituida por, Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1.
3. Composición farmacéutica según Ia reivindicación 1 , en el que dicho polinucleótido comprende, o está constituido por, Ia secuencia de nucleótidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 2.
4. Empleo de un producto seleccionado entre:
(i) una proteína que comprende Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1 , o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de Ia misma; (ii) un polinucleótido que codifica dicha proteína que comprende
Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1 , o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de Ia misma; (iii) una construcción génica que comprende dicho polinucleótido
(¡i); (iv) un vector que comprende dicho polinucleótido (ii) o dicha construcción génica (iii); y
(v) una célula hospedadora que comprende dicho polinucleótido (ii), dicha construcción génica (iii) o dicho vector (iv); en Ia elaboración de una composición farmacéutica anti-tumoral.
5. Empleo según Ia reivindicación 4, en el que dicha proteína comprende, o está constituida por, Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1.
6. Empleo según Ia reivindicación 4, en el que dicho polinucleótido comprende, o está constituido por, Ia secuencia de nucleótidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 2.
7. Empleo según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que dicha composición farmacéutica anti-tumoral es una composición inhibidora de Ia proliferación de células tumorales.
8. Empleo según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que dicha composición farmacéutica anti-tumoral es una composición inhibidora de Ia migración de células tumorales.
9. Empleo según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en el que dicha composición farmacéutica es una composición farmacéutica destinada a su administración por vía oral o parenteral, preferentemente, subcutánea o intratumoral.
10. Empleo según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en el que dicha composición farmacéutica anti-tumoral se administra en combinación con otro fármaco adicional.
11. Empleo según Ia reivindicación 10, en el que dicho fármaco adicional es un fármaco para el tratamiento de un tumor o para el tratamiento del cáncer.
12. Empleo según Ia reivindicación 10 ú 11 , en el que dicho fármaco adicional se administra en forma de una composición farmacéutica separada para su administración simultánea o secuencial a Ia de dicha composición farmacéutica anti-tumoral.
13. Un método in vitro para inhibir Ia proliferación celular o para inhibir Ia migración celular que comprende poner en contacto un cultivo celular con una composición que comprende un producto seleccionado entre:
(i) una proteína que comprende Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1 , o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de Ia misma;
(ii) un polinucleótido que codifica dicha proteína que comprende Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia SEQ ID NO: 1 , o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de Ia misma;
(iii) una construcción génica que comprende dicho polinucleótido
(¡i); (iv) un vector que comprende dicho polinucleótido (ii) o dicha construcción génica (iii); y (v) una célula hospedadora que comprende dicho polinucleótido (ii), dicha construcción génica (iii) o dicho vector (iv).
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