JP2003517005A - キメラ性ナトリウム利尿性ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 デンドロアスピスのペプチド、例えばそのキメラペプチド、及びナトリウム排泄増加剤、利尿剤及び/又は血管拡張剤としてのペプチドの使用方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景： 心房ナトリウム利尿性ペプチド（ANP）は、体液恒常性を調節するホルモンの
ファミリーにおいて最初に記載されたペプチドである（Brennerなど., 1990を参
照のこと）。Boldなど. (1981)による、心房抽出物の可能性ある利尿及びナトリ
ウム排泄性質の記載は、心臓が内分泌器官であり得る最初の証拠であった。Flyn
nなと. (1981) を含むグループによるこの活性の続く単離及び特徴化は、最初の
分泌された心臓ホルモンとしてANPを特徴づけた。ANPは、高められた血管内体積
に応答して心房筋細胞により分泌される。それが循環にいったん存在すると、そ
の効果は主に心臓、血管組織及び副腎に対してであり、ここでその作用は、腎臓
によるナトリウム及び水の排泄、及び血管内体積及び血圧の低下を導く（Atlas
など., 1987）。

【０００２】 Matsuo及び彼の共同研究者は、２種の他のナトリウム排泄増加製ペプチドを単
離した。脳ナトリウム利尿性ペプチド（BNP）及びC−型ナトリウム利尿性ペプチ
ド（CNP）は、ニワトリ直腸に対するそれらの可能性ある弛緩効果に基づいて、
ブタ脳抽出物から単離された（Sudehなど., 1988; Sudehなど., 1990）。BNPは
心筋細胞起原のものであり、そしてANPのように、ヒト血漿において循環する（d
e Bold など., 1981; Burnettなど., 1984）。

【０００３】 BNPは、ナトリウム排泄増加、レニン妨害、血管拡張性である（Mukoyamaなど.
, 1991; Yamamotoなど., 1996; Granthamなど., 1996）。CNPは、内皮細胞起原
のものであり、そして血管拡張及び成長−阻害ペプチドとして機能する（Sugaな
ど., 1992; Stingoなど., 1992; Kollerなど., 1991）。ANP及びBNPは、ヒトに
おけるうっ血性心不全（CHF）の間、血漿及び心臓において高められ、そしてそ
れらは、心室機能不全のための血清マーカーとしての作用の他に、重要な心臓保
護作用を発揮する（Stevensなど., 1995; Yamamotoなど., 1997; McDonaghなど.
, 1988）。

【０００４】 ANP, BNP及びCNPは、大きな前駆体タンパク質から合成され、そして成熟活性
ペプチドは、分子内ジスルフィド結合により形成される17個のアミノ酸のループ
を有する。ヒトペプチドにおいては、それらのアミノ酸のうち11個はANP、BNP及
びCNPにおいて同一であり、ところがそのN−及びC−末端は長さ及び組成の両者
において異なる（Kambayashiなど., 1990; 及びTawaragiなど., 1991）。CNPはC
−末端を有さず、そしてCNPについて遺伝子の構造の研究は、翻訳が、mRNAにお
ける最終システインコドンの直後の停止コドンにより終結されることを示した。

【０００５】 種の中で、ANP及びCNPの両者のアミノ酸配列は高く保存され、ところがBNPの
構造は非常に変化する。例えば、成熟の28個のアミノ酸のヒト及びブタANPは同
一であり、そしてラットペプチドにおいて１つの置換のみが存在する。ナトリウ
ム利尿性ペプチドに対して特異的な少なくとも３種のタイプの受容体の存在によ
りカップリングされるこの構造変動の存在は、体液恒常性の生理学的制御は複雑
であることを示唆する。ANP及びCNPの両者は、心臓前負荷を低める。しかしなが
ら、ANPとは異なって、CNPはナトリウム利尿性ではない（Stingoなど., 1992）
。

【０００６】 心血管系及び腎臓の両者に対するANP, BNP及びCNPの種々の作用、病理生理学
的状態、例えば心不全、高血圧及び腎疾患におけるそれらの役割は、天然のペプ
チド及びそれらの類似する分子を、臨床学的及び基礎的な科学者に対して非常に
興味あるものにした。例えば、Lewickiなど.（アメリカ特許第5,114,923号、第4
,804,650号及び第4,757,048号）、Johnsoなど., (アメリカ特許第5,047,397号)
、Johnsonなど. (アメリカ特許第4,935,492号)及びWeiなど. (アメリカ特許第5,
583,108号) を参照のこと。アメリカ特許第5,583,108号は、バソナトリンペプチ
ド（VNP）と称する、ANP及びCNPのキメラを言及する。CNPの22個のアミノ酸、及
びANPのカルボキシ−末端での５個のアミノ酸を含むVNPは、動脈及び静脈血管拡
張及びナトリウム排泄増加効果を有する。

【０００７】 第４のナトリウム排泄増加製ペプチド（NP）、すなわちデンドロアスピスナト
リウム排泄増加ペプチド（DNP）は、ANP、BNP及びCNPに対しての構造的類似性を
有する。デンドロアスピス・アングスチセプス（Dendroaspos angusticeps）又
はグリーンマンバ（ヘビ）の毒素から単離されるDNPは、それらのすべてが特定
のグアニリルシクラーゼ受容体を通しての生物学的作用、及びサイクリックグア
ノシン一リン酸の生成を介在する、ANP、BNP及びCNP（図１）の構造に類似する1
7個のアミノ酸ジスルフィド環構造を含む、38個のアミノ酸のペプチドである（S
chweitzなど., 1992）。

【０００８】 DNPは、囓歯動物の大動脈、及びANPの能力に相当する能力を有する単離された
イヌ冠状動脈を血管弛緩する（Schweitzなど., 1992; Wennbergなど., 1997）。
さらに、DNPは、大動脈内皮細胞におけるcGMP、すなわち他のナトリウム利尿性
ペプチドのための第２メッセンジャーの形成を実質的に増大する（Schweitzなど
., 1992）。 従って、心血管障害、例えば、うっ血性心不全を妨げるか又は処理するのに有
用であるナトリウム利尿性ペプチドの性質を有するペプチドを同定するための連
続した必要性がある。

【０００９】 発明の要約： 本発明は、哺乳類において、ナトリウム利尿、レニン−制御、利尿及び/又は
血管拡張活性を有する、単離され、そして精製されたペプチド化合物を提供する
。好ましくは、前記ペプチドは、下記式（I）： X₀-Cys-Pro-X₁-A₅-A₁-A₃-Pro-A₁-Pro-A₅-Pro-A₁-A₅-Pro-X₁-X₁-X₁-A₄ ［式中、A₁はLeu, Lys, Arg, His, Orn, Asn又はGlnであり；A₃はAsp又はGluで
あり；A₄はLys, Arg, Orn, Ala, Thr, Asn又はGlnであり；A₅はGly, Ala, Val,
Met, Leu, ノルロイシン又はIleであり；X₀は不在であるか、又は１〜35個のア
ミノ酸残基、好ましくは１〜25個のアミノ酸残基及びより好ましくは、BNP又はC
NPのN−末端からの残基のペプチドであり；そしてX₁はSer又はThrである］で表
される化合物を含んで成る。

【００１０】 X₀は、存在するなら、好ましくはヒトBNPのN−末端、すなわちSer-Pro-Lys-Me
t-Val-Gln-Glu-Ser-Gly-Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Ser-Ser-Se
r-Gly-Leu-Gly（配列番号７）、又はヒトCNPのN−末端、すなわちGly-Leu-Ser-L
ys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Met-Ser-Gly-Leu-Gly（
配列番号８）である。

【００１１】 発明の好ましいペプチドは、DNPのC−末端とBNPのコア環構造とを組合す41個
のアミノ酸ペプチドであるキメラペプチドを包含する。従って、式（I）の好ま
しい化合物は、Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Me
t-Asp-Arg-Ile-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Pro-Ser-Leu-Arg-Asp-Pro-Ar
g-Pro-Asn-Ala-Pro-Ser-Thr-Ser-Ala（配列番号１；BD−NP；図４を参照のこと
）を含んで成るキメラペプチド、又はその生物学的活性変異体はフラグメントで
ある。好ましくは、キメラペプチドは、Cys（10）とCys（26）との間にジスルフ
ィド架橋を有する。

【００１２】 本発明の他の好ましいペプチドは、CNPのコア環構造とDNPのC−末端とを組合
す、37個のアミノ酸ペプチドを包含する。従って、式（I）のもう１つの好まし
い化合物は、Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-
Ser-Met-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Pro-Ser-Leu-Arg-Asp-Pro-Arg-Pro-Asn-Ala-Pro-
Ser-Thr-Ser-Ala（配列番号２；CD−NP；図４を参照のこと）を含んで成るキメ
ラペプチド、又はその生物学的活性変異体又はフラグメントである。好ましくは
、キメラペプチドは、Cys(6)とCys(22) との間にジスルフィド架橋を有する。

【００１３】 さらにもう１つの好ましいペプチドは、好ましくない、カルボキシ−末端の15
個のアミノ酸（配列番号３；図４を参照のこと）を含む、DNPのカルボキシー末
端の一部、又はその生物学的活性変異体又はフラグメントを包含する。本明細書
において使用される場合、用語“生物学的活性”とは、本発明のペプチドが生来
のナトリウム利尿性ペプチドの活性の少なくとも１つを有することを意味する。

【００１４】 下記に記載されるように、BD−NPは、肺血管拡張に対して向けられる可能性あ
る血管拡張、ナトリウム排泄増加及びレニンの抑制を包含する、インビボでの組
み合わされた効果を有する。例えば、正常な哺乳類においては、BD−NPの投与は
、DNPの投与に比較して、糸球体濾過速度（GFR）を有意に高め、ナトリウムの近
位分別再吸収（PFRNa）を低め、そして血漿レニン活性をより強く抑制する。さ
らに、正常な哺乳類においては、BD−NPの投与（例えば、50ng/kg/分での）は、
BNPの投与に比較して、腎血流（RBF）に対して効果を有さず、尿cGMP排泄（UcGM
PV）を高め、効果的なレニン抑制効果を有し、より効果的には、平均動脈圧（MA
P）を下げ、そしてより効果的には、右心房圧（RAP）及び効果的な肺血管拡張を
伴なっての肺毛管圧（PCWP）を低める。

【００１５】 また下記に記載されるように、DNP−様免疫反応性（DNP−LI）は、ヒト血漿及
び心房心筋、並びにヒト尿に存在する。さらに、DNP−LIは、CHFを有する患者の
ヒト血漿において高められた。DNPはまた、他の哺乳類種、例えばイヌ血漿、尿
及び心筋にも存在する。インビボで、DNPは、血漿及び尿cGMP生成の非常に協力
な刺激物であり、そして効果的なナトリウム排泄増加、利尿、血管拡張及びレニ
ン−抑制性質を有する（Lisyなど., 1999b）。さらに、DNPは正常なイヌにおい
て（Lisyなど., 1999b）、及び実験的な心不全のイヌモデルにおいて（Lisyなど
., 1999a）、治療効能を示す。

【００１６】 さらに下記に記載されるように、弱いか又は明白なうっ血性心不全を有するイ
ヌへのDNPの外因性投与は、心臓充填圧及び平均動脈圧の低下、心臓出力の保持
、糸球体濾過速度の上昇をもたらした。従って、本発明は、DNP又はその生物学
的活性部分、DNAのキメラ性ナトリウム利尿性ペプチドであるペプチド又はその
生物学的活性変異体又はフラグメントの投与を含んで成る、うっ血性心不全の処
理方法を提供する。

【００１７】 従って、本発明はまた、ナトリウム排泄増加剤、レニン−抑制剤、利尿剤及び
/又は血管拡張剤として有用な組成物も提供する。前記組成物は、医薬的に許容
できるキャリヤーと共に、治療的有効量の少なくとも１つの本発明のペプチドを
含んで成る。従って、本発明はさらに、哺乳類において、ナトリウム排泄増加、
利尿又は血管拡張を誘発するための方法を提供する。前記方法は、医薬的有効量
の本発明の化合物又は組成物を、哺乳類に投与することを含んで成る。本発明の
ペプチドは、多くの病理学的状態、例えばうっ血性心不全、急性又は慢性腎不全
、高血圧、肝硬変、ネフローゼ症候群及び他の水腫状態を処理するために（改良
するか又は妨げる）、単独で又は組合して有用である。

【００１８】 発明の特定の記載：定義 ： 本明細書において使用される場合、用語“ナトリウム利尿性ペプチド”又は“
NP”は、天然のNP、例えばANP, BNP, CNP又はDNP, NPの一部、NPの変異体又はそ
れらのキメラを包含する。好ましくは、キメラNPの成熟形からの部分のみを包含
する。

【００１９】 本明細書において使用される場合、“単離された及び/又は精製された”とは
、その天然の細胞環境から、及び細胞の他の成分、例えば核酸又はポリペプチド
との結合からの核酸、例えばDNA又はポリペプチド分子のインビトロ調製、単離
及び/又は精製を言及し、すなわちそれはインビボ物質により結合されていない
。従って、ゲノム、cDNA又は合成起原のポリヌクレオチド又はそのいくつかの組
み合わせを包含する、“単離された核酸分子”に関しては、“単離された核酸分
子”は、（１）“単離された核酸分子”が天然において見出されるポリヌクレオ
チドのすべて又は一部に結合されず、（２）天然において結合されないポリヌク
レオチドに操作可能的に連結され、又は（３）大きな配列の一部として天然にお
いては存在しない。

【００２０】 単離された核酸分子は、少なくとも10個の長さの塩基のヌクレオチドのポリマ
ー形、すなわちリボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチド、又はいずれかのタ
イプのヌクレオチドの修飾された形を意味する。用語“オリゴヌクレオチド”と
は、本明細書において言及される場合、天然に存在するヌクレオチド、及び天然
に存在し、及び天然に存在しないオリゴヌクレオチド結合により一緒に結合され
た、修飾されたヌクレオチドを包含する。オリゴヌクレオチドは、200個又はそ
れよりも少ない長さの塩基を有するポリヌクレオチドサブセットである。

【００２１】 好ましくは、オリゴヌクレオチドは、10〜60個の長さの塩基、及び最も好まし
くは、12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19又は20〜40個の長さの塩基である。オリ
ゴヌクレオチドは通常、例えばプローブのためには一本差であるが、但し、オリ
ゴヌクレオチドは、変異体核酸配列の構成への使用のためには二本鎖であり得る
。本発明のオリゴヌクレオチドは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド
であり得る。用語“天然に存在するヌクレオチド”とは、本明細書において言及
される場合、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを包含する。

【００２２】 用語“修飾されたヌクレオチド”とは、本明細書において言及される場合、修
飾された又は置換された糖基及び同様のものを有するヌクレオチドを包含する。
用語“オリゴヌクレオチド連鎖”とは、本明細書において言及される場合、オリ
ゴヌクレオチド連鎖、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホス
ホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホス
ホロラニラデート、ホスホロアミダート及び同様のものを包含する。オリゴヌク
レオチドは、所望には、検出のためのラベルを包含することができる。

【００２３】 例えば、“単離されたDNP核酸”は、当業界において、例えばSambrookなど. (
1989) において良く知られている方法により定義されるように、DNAの少なくと
も一部をコードする、９個以上の、好ましくは36個及びより好ましくは45個又は
それ以上の連続ヌクレオチド塩基を含むRNA又はDNA、又はDNPをコードするRNA又
はDNAに対して、それぞれ相補的であるか、又はそれに対してハイブリダイズし
、そして緊縮条件下で安定して結合されたまま存続するRNA又はDNAである。

【００２４】 従って、RNA又はDNAは、それが通常、RNA又はDNAの天然源に関連する少なくと
も１つの汚染性核酸を有さず、そして好ましくは、いずれか他の細胞性、例えば
真核生物又は哺乳類RNA又はDNAを実質的に有さないことにおいて“単離される”
。用語“それが通常、関連する少なくとも１つの汚染性核酸を有さない”とは、
核酸がその源又は天然細胞中に再導入されるが、しかし異なった染色体位置に存
在するか、又は他方では、その細胞源に通常見出されない核酸配列を両端に有す
る場合を包含する。

【００２５】 本明細書において使用される場合、用語“組換え核酸”又は“予備選択された
核酸”、例えば“組換えDNA配列又はセグメント”又は“予備選択されたDNA配列
又はセグメント”とは、続いて化学的にインビトロで変更され得、その結果、そ
の配列は天然に存在しないか、又はそれらの配列が外因性DNAにより形質転換さ
れていないゲノムに位置するように位置決定されていない天然に存在する配列に
対応する、いずれか適切な組織源に由来するか又はそれから単離された核酸、例
えばDNAを言及する。

【００２６】 １つの源に“由来する”予備選択されたDNAの例は、所定の生物内で有用なフ
ラグメントとして同定され、そして次に、実質的に純粋な形で化学的に合成され
るDNA配列である。1つの源から“単離された”そのようなDNAの例は、化学的手
段により、例えば遺伝子工学の方法により、本発明への使用のためにさらに操作
され得、例えば増幅され得るよう制限エンドヌクレアーゼの使用により、前記源
から切除されるか又は除去される有用なDNA配列である。

【００２７】 従って、制限消化物からのDNAの所定のフラグメントの回収又は単離は、電気
泳動によるポリアクリルアミド又はアガロースゲル上での消化物の分離、その移
動度と既知の分子量のマーカーDNAフラグメントの移動度との比較による興味あ
るフラグメントの同定、所望するフラグメントを含むゲル断片の除去、及びDNA
からのゲルの分離を用いることができる。Lawnなど. (1981) 及びGoeddelなど.
(1980) を参照のこと。従って、“予備選択されたDNA”は、完全な合成DNA配列
、半合成DNA配列、生物学的源から単離されたDNA配列、及びRNAに由来するDNA配
列、並びにそれらの混合物を包含する。

【００２８】 本発明書において使用される場合、RNA分子に関する用語“由来する”とは、R
NA分子が特定のDNA分子に対して相補的配列同一性を有することを意味する。 用語“単離されたポリペプチド又はペプチド”とは、DNA又はRNA、例えば合成
DNA又はRNA、又はそのいくらかの組み合わせによりコードされるポリペプチド又
はペプチドを意味し、この単離されたポリペプチド又はペプチドは、（１）天然
において見出されるタンパク質に関連せず、（２）同じ源からの他のタンパク質
を有さず、例えばヒトタンパク質を有さず、（３）異なった種からの細胞により
発現され、又は（４）天然において生じない。“単離された”ペプチドは、３個
よりも多くの、好ましくは６個よりも多くの、及びより好ましくは12個又はそれ
よりも多くのアミノ酸残基を含む。

【００２９】 用語“配列相同性”とは、２種の核酸配列間の塩基適合の割合、又は２種のア
ミノ酸配列間のアミノ酸適合の割合を意味する。配列相同性が％、例えば50％と
して表される場合、その百分率は、いくつかの他の配列に比較される配列の長さ
にわたっての適合性割合を示す。ギャップ（２種の配列のいずれかにおける）は
、適合性の最大化を可能にし；15個又はそれ以下の長さの塩基のギャップが通常
使用され、６個又はそれ以下の塩基が好ましく、そして２個又はそれ以下の塩基
が好ましい。プローブ又は処理としてオリゴヌクレオチドを用いる場合、標的核
酸とオリゴヌクレオチド配列との間の配列相同性は、一般的に20の可能なオリゴ
ヌクレオチド塩基対適合のうち17以上の標的塩基適合（85％）；好ましくは10の
可能な塩基対適合のうち９以上の適合（90％）；及びより好ましくは、20の可能
な塩基対適合のうち19以上の適合（95％）である。

【００３０】 用語“選択的にハイブリダイズする”とは、検出可能的に及び特異的に結合す
ることを意味する。本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びフラグ
メントは、非特異的に核酸への適切な量の検出可能結合を最少にするハイブリダ
イゼーション及び選択条件下で、核酸鎖に選択的にハイブリダイズする。高い緊
縮条件は、当業界において知られており、そして本明細書において論じられるよ
うな選択的ハイブリダイゼーション条件を達成するために使用され得る。一般的
に、本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びフラグメントと興味あ
る核酸配列との間の核酸配列相同性は、少なくとも65％であり、そしてより典型
的には、好ましくは、少なくとも約70％、約90％、約95％、約98％及び100％の
相同性に上昇する。

【００３１】 本発明の範囲内の核酸分子は、本発明のNPをコードする核酸分子、例えば配列
番号１，２又は３をコードする核酸分子に対して、緊縮ハイブリダイゼーション
条件下でハイブリダイするそれらの分子を包含する。中位の緊縮ハイブリダイゼ
ーション条件は、当業界において良く知られている（例えば、Sambrookなど. (1
989) のセクション9.47−9.51を参照のこと）。

【００３２】 例えば、緊縮条件は、（１）洗浄のための低いイオン強度及び高い温度、例え
ば0.015MのNaCl/0.0015Mのクエン酸ナトリウム（SSC）；50℃での0.1％ラウリル
硫酸ナトリウムを用いるか、又は（２）ハイブリダイゼーションの間、変性剤、
例えばホルムアミド、例えば50％ホルムアミド及び0.1％ウシ血清アルブミン/0.
1％Ficoll/0.1％ポリビニルピロリドン/pH6.5での50mMのリン酸ナトリウム緩衝
液及び750mMのNaCl、75mMのクエン酸ナトリウムを42℃で用いるそれらの条件で
ある。もう１つの例は、50％ホルムアミド、５×SSC（0.75MのNaCl、0.075Mのク
エン酸ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム（pH6.8）、0.1％リン酸ナトリウ
ム、５×Denhardt溶液、音波処理されたサケ精子DNA（50μg/ml）、0.1％ドデシ
ル硫酸ナトリウム（SDS）、及び10％硫酸テキストランの42℃での使用、及び0.2
×SSC及び0.1％SDSにおける42℃での洗浄である。

【００３３】 ２種のアミノ酸配列は、それらの配列間に部分的な又は完全な同一性が存在す
る場合、相同である。例えば、85％の相同性は、85％のアミノ酸が、２種の配列
が最大の適合性のために一列整列される場合、同一であることを意味する。ギャ
ップ（適合される２種の配列のいずれかにおける）は、適合の最大化を可能にし
：５又はそれ以下のギャップの長さが好ましく、そして２又はそれ以下のギャッ
プの長さがより好ましい。

【００３４】 他方では、及び好ましくは、２種のタンパク質配列（又は、少なくとも30個の
長さのアミノ酸配列に由来するポリペプチド配列）は、それらが、突然変異デー
タマトリックス及び６又はそれ以上のギャップペナルティーを伴なって、プログ
ラムALIGNを用いて、５（標準偏差単位）以上の整列評点を有する場合、相同で
ある。Dayhoff, M. O., Atlas of Protein Sequence and Structure, 1972, Vol
ume 5, National Biomedical Research Foundation, pp. 101-110, 及びSupplem
ent 2, pp.1-10を参照のこと。２種の配列又はその一部は、より好ましくは、そ
れらのアミノ酸が、ALIGNプログラムを用いて最適に整列される場合、50％以上
か又は等しい同一性を有する場合、相同である。

【００３５】 用語“〜に対応する”とは、ポリヌクレオチド配列が対照のポリヌクレオチド
配列のすべて又は一部に対して相同であるか（すなわち、同一であり、厳密には
関連しない）、又はポリペプチド配列が対照ポリペプチド配列に対して同一であ
ることを意味する。対照的に、用語“〜に対して相補的な”とは、相補的配列が
対照のポリヌクレオチド配列のすべて又は一部に対して相同であることを意味す
る。例示的には、ヌクレオチド配列“TATAC”は、対照配列“TATAC”に対応し、
そして対照配列“GTATA”に対して相補的である。

【００３６】 次の用語は、複数のポリヌクレオチド間の配列関係を説明するために使用され
る：“対照配列”、“比較窓”“配列同一性”、“配列同一性の百分率”、及び
“実質的な同一性”。“対照配列”は、配列比較のための基礎として使用される
定義された配列であり；対照配列は、例えば配列の列挙に与えられる十分な長さ
のcDNA又は遺伝子配列のセグメントとしての大きな配列のサブセットであり得、
又は完全なcDNA又は遺伝子配列を含んで成ることができる。一般的に、対照配列
は、少なくとも20個の長さのヌクレオチド、ときおり少なくとも25個の長さのヌ
クレオチド、及びしばしば、少なくとも50個の長さのヌクレオチドである。

【００３７】 ２種のポリヌクレオチドはそれぞれ、（１）それらの２種のポリヌクレオチド
間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部）を含んで成
ることができ、そして（２）さらに、それらの２種のポリヌクレオチド間でお互
い異なる配列を含んで成ることができるので、２種（又はより多くの）のポリヌ
クレオチド間の配列比較は典型的には、配列類似性の局部領域を同定し、そして
比較するために、“比較窓”に対して２種のポリヌクレオチドの配列を比較する
ことによって行われる。

【００３８】 “比較窓”とは、本明細書において使用される場合、少なくとも20個の連続し
たヌクレオチドの概念的なセグメントを言及し、そして前記比較窓におけるポリ
ヌクレオチド配列の一部は、２種の配列の最適な整列のために対照配列（付加又
は欠失を包含しない）に比較される場合、20％又はそれ以下の付加又は欠失（す
なわち、ギャップ）を包含することができる。

【００３９】 比較窓を整列するための配列の最適な整列は、Smith and Waterman (1981) の
局部相同アルゴリズムにより、Needleman and Wunsch (1970) の相同整列アルゴ
リズムにより、Pearson and Lipman (1982) の類似性方法についての調査により
、それらのアルゴリズムのコンピューター処理された実施（Wisconsin Genetics
Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr.,
Madison, Wis. におけるGAP、BESTFIT、FASTA及びTFASTA）により、又は視覚的
及び/又は手動的観察により行われ得、そして種々の方法により生成される最良
の整列（すなわち、比較窓に対して最高の相同％をもたらす）が選択される。

【００４０】 用語“配列同一性”とは、２種のポリヌクレオチド配列が比較窓に対して同一
である（すなわち、ヌクレオチド対ヌクレオチドに基づいて）ことを意味する。
用語“配列同一性の％”とは、２種のポリヌクレオチド配列が比較窓に対して同
一である（すなわち、ヌクレオチド対ヌクレオチドに基づいて）ことを意味する
。用語“配列同一性の％”は、比較窓に対して２種の最適に整列された配列を比
較し、同一の核酸塩基（例えば、A, T, C, G, U又はI）が、適合された位置の数
を得るために、両配列において存在する位置の数を決定し、比較窓（すなわち、
窓サイズ）における位置の合計数により、適合された位置の数を割り算し、そし
て配列同一性の％を得るために、前記結果に100を掛け算することによって計算
される。

【００４１】 用語“実質的な同一性”とは、本明細書において使用される場合、ポリヌクレ
オチド配列の特徴を示し、ここでポリヌクレオチドは、少なくとも20個のヌクレ
オチド位置の比較窓、ときおり、少なくとも20〜50個のヌクレオチド位置の比較
窓に対しての対照配列に比較される場合、少なくとも85％の配列同一性、好まし
くは少なくとも90〜95％の配列同一性、より通常には少なくとも99％の配列同一
性を有する配列を含んで成り、ここで配列同一性の％は、比較窓上で対照配列の
合計20％又はそれ以下の欠失又は付加を包含することができるポリヌクレオチド
配列に対して対照配列を比較することによって計算される。

【００４２】 ポリペプチドに適用される場合、用語“実質的な同一性”とは、２種のペプチ
ド配列が、例えばデフォールトギャップ（default gap）重量を用いてプログラ
ムGAP又はBESTEITにより最適に整列される場合、少なくとも約80％の配列同一性
、好ましくは少なくとも約90％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約95％
の配列同一性、及び最も好ましくは、すくなくとも99％の配列同一性を共有する
ことを意味する。

【００４３】 I．本発明の核酸分子： A．本発明の核酸分子の源： 本発明のNPをコードする核酸分子、又はその核酸補体が得られるヌクレオチド
配列の源は、いずれかの真核生物、好ましくは爬虫類、例えばヘビ、又は哺乳類
、例えばヒト、ラット、マウス、イヌ、ウシ、ウマ、羊、ヤギ、ネコ、より好ま
しくは霊長類、例えばヒト細胞源（cDNAが当業界において知られている方法によ
り誘導され得る）からの全又はポリA⁺ RNAを包含する。本発明のDNA分子の他の
源は、真核生物、好ましくは哺乳類細胞源、例えば上記に例示されるそれらの源
に由来するゲノムライブラリーを包含する。

【００４４】 B．NPをコードする遺伝子の単離： 生来のNPをコードする核酸分子は、Sambrookなど. (1989) により記載のよう
にして、標準方法を用いて同定され、そして単離され得る。例えば、逆転写酵素
PCR（RT−PCR）は、NP cDNAを単離し、そしてクローン化するために使用され得
る。オリゴ−dTは、興味あるRNA配列を含む単離されたRNA、例えばヒト組織から
単離された全RNAから第１鎖cDNAを調製するために、逆転写酵素反応においてプ
ライマーとして使用され得る。RNAは、例えばTRIZOL^TM 試薬（GIBCO−BRL/Life
Technologies, Gaithersburg, MD）を用いて、当業者において知られている方法
により単離され得る。次に、得られる第１鎖cDNAが、PCR反応において増幅され
る。

【００４５】 “ポリメラーゼ鎖反応”又は“PCR”は、核酸、RNA及び/又はDNAの予備選択さ
れたフラグメントの量が、アメリカ特許第4,683,195号に記載のようにして増幅
される方法又は技法を言及する。一般的に、興味ある又はそれ以外の領域の末端
からの配列情報が、少なくとも７〜８個のヌクレオチドを含んで成るオリゴヌク
レオチドプライマーを企画するために使用される。それらのプライマーは、増幅
されるべき鋳型の反対の鎖に対して、配列において同一であるか又は類似するで
あろう。PCRは、特定のRNA配列、全ゲノムDNAからの特定のDNA配列、及び全細胞
RNAから転写されるcDNA、バクテリオファージ又はプラスミド配列、及び同様の
ものを増幅するために使用され得る。一般的には、Mullisなど., 1987; Erlich,
1989を参照のこと。PCRに基づくクローニングアプローチは、関連する遺伝子又
はポリペプチド配列の整列から推定される保存された配列に依存する。

【００４６】 プライマーは、例えば他の真核NPの配列比較により、プライマーを生成するた
めに同定され、そして比較されたポリペプチド又はヌクレオチド配列の高く保存
された領域に対応するよう製造される。例えばヒトDNA−様免疫反応性ポリペプ
チド（例えば、DNP−LI）をコードするDNA分子の、アンチセンス鎖にアニーリン
グすることが予測される１つのプライマーが調製され、そして前記センス鎖にア
ニーリングすることが予測されるもう１つのプライマーが調製される。 個々のPCR反応の生成物は、アガロースゲルにより分離され、そしてすべての
一貫して増幅された生成物は、ゲル精製され、そして適切なベクター、例えば既
知のプラスミドベクター中に直接的にクローン化される。その得られるプラスミ
ドは、制限エンドヌクレアーゼ、及び二本鎖プラスミドDNAのジデオキシ配列決
定にゆだねられる。

【００４７】 NPをコードするcDNAを同定し、単離し、そしてクローン化するためのもう１つ
のアプローチは、cDNAライブラリーをスクリーンすることである。NPをコードす
るcDNAのすべて又は一部をコードするDNAフラグメントについてのスクリーニン
グは、NP、例えば異なった種からの特定のNPの相同体に関連すると思われる遺伝
子間に高く依存される配列を有するプローブによりライブラリーをプローブする
ことにより、又はNPを特異的に認識する抗体に対する結合についてプラークをス
クリーニングすることにより達成され得る。NPに関連するか、又はNPに対する抗
体と免疫反応性である配列を有するプローブに結合するDNAフラグメントが、適
切なベクター中にサブクローン化され、そして配列決定され、そして/又はNPの
すべて又は一部をコードする他のcDNAを同定するためにプローブとして使用され
る。

【００４８】 C．本発明の核酸分子によりコードされる変異体又はキメラNP： 生来のNPのアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当業者において知ら
れている種々の方法により調製される。それらの方法は、天然源からの単離（天
然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）、又はオリゴヌクレオチド−介在性（
又は特定部位）突然変異誘発、PCR突然変異誘発、及び初期に調製された変異体
又はNPの非変異体バージョンのカセット突然変異誘発による、又は化学的合成（
下記参照のこと）による調製を包含するが、但し、それらだけには限定されない
。

【００４９】 キメラNPは、例えば方法論、又は化学合成に基づいて組換えDNAを用いること
によって調製され得る。例えば、キメラNPは、オーバーラッピングオリゴヌクレ
オチド及びPCRを用いて調製され得る。１つのNPのアミノ末端残基の一部及び第
２NPの一部をコードするセンスオリゴヌクレオチドが、センスオリゴヌクレオチ
ドの3’側での配列に対して相補的な配列、及びキメラNPのカルボキシ末端をコ
ードするそれらの配列に対して相補的な他の配列を有するアンチセンスオリゴヌ
クレオチドにアニーリングされる。次に、PCRが、十分な長さのキメラNPをコー
ドする二本鎖のDNAを調製するために使用される。

【００５０】 NPのアミノ酸置換変異体に関しては、前記変異体を調製するための好ましい方
法は、オリゴヌクレオチド−介在性突然変異誘発である。この技法は、Adelman
など．（1983）により記載されるように、当業者において良く知られている。手
短には、例えば、DNP DNAは、DNA鋳型に対して、所得する突然変異をコードする
オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることによって変更され、ここで前記鋳
型はDNPの変更されていないか又は生来のDNA配列を含むプラスミド又はバクテリ
オファージの一本鎖形である。ハイブリダイゼーションの後、DNAポリメラーゼ
が、オリゴヌクレオチドプライマーを組み込み、そしてDNP DNAにおける選択さ
れた変更をコードするであろう鋳型の完全な第２相補的鎖を合成するために使用
される。

【００５１】 一般的に、少なくとも25個の長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが使用
される。適切なオリゴヌクレオチドは、突然変異をコードするヌクレオチドのい
ずれかの側上の鋳型に対して完全に相補的である12〜15個のヌクレオチドを有す
るであろう。これは、オリゴヌクレオチドが一本鎖DNA鋳型分子に対して正しく
ハイブリダイズするであろうことを確かにする。オリゴヌクレオチドは、当業界
において知られている技法、例えばCreaなど. (1978) により記載される方法を
用いて容易に合成される。

【００５２】 DNA鋳型は、バクテリオファージM13ベクター（市販のM13mp18及びM13mp19ベク
ターが適切である）に由来するそれらのベクター、又はVieraなど. (1987)によ
り記載されるような複製の一本鎖ファージ起点を含むそれらのベクターにより生
成され得る。従って、突然変異誘発されるべきDNAが、一本鎖鋳型を生成するた
めに、それらのベクターの1つに挿入され得る。一本鎖鋳型の生成は、Sambrook
など. (1989) のセクション4.21−4.41に記載されている。 他方では、一本鎖DNA鋳型は、標準技法を用いて、二本鎖プラスミド（又は他
の）DNAを変性することによって生成され得る。

【００５３】 生来のDNA配列の変更に関しては（例えば、アミノ酸配列変更体を生成するた
めの）、オリゴヌクレオチドは、適切なハイブリダイゼーション条件下で一本鎖
鋳型にハイブリダイズされる。次に、DNA重合化酵素、通常、DNAポリメラーゼI
のクレノウフラグメントが、合成のためのプライマーとしてオリゴヌクレオチド
を用いて鋳型の相補的鎖を合成するために付加される。従って、ヘテロ二重鎖分
子が、DNAの1つの鎖が例えばDNPの突然変異誘発された形をコードし、そして他
の鎖（元の鋳型）がDNAの生来の変更されていない配列をコードするよう形成さ
れる。

【００５４】 次に、このヘテロ二重鎖分子が、適切な宿主細胞、通常、原核生物、例えばE
．コリJM101中に形質転換される。細胞が増殖された後、それらはアガロースプ
レート上にプレートされ、そして突然変異誘発されたDNAを含む細胞コロニーを
同定するために、³²Pにより放射性ラベルされたオリゴヌクレオチドプライマー
を用いて、スクリーンされる。次に、突然変異誘発された領域が除去され、そし
てペプチド又はポリペプチド生成のために、適切なベクターに、一般的には、適
切な宿主の形質転換のために典型的には使用されるタイプの発現ベクターに配置
される。

【００５５】 上記に記載される方法は、プラスミドの両鎖が突然変異を含むホモ二重鎖分子
が創造されるように改良され得る。改良は次の通りである：一本鎖オリゴヌクレ
オチドが上記のように一本鎖鋳型にアニーリングされる。３種のデオキシリボヌ
クレオチド、すなわちデオキシリボアデノシン（dATP）、デオキシリボグアノシ
ン（dGTP）及びデオキシリボチミジン（dTTP）の混合物が、dCTP−（αS）（Ame
rsham Corporation から得られる）と呼ばれる修飾されたチオデオキシリボシト
シンにより組合される。この混合物は、鋳型−オリゴヌクレオチド複合体に添加
される。この混合物へのDNAポリメラーゼの添加に基づいて、突然変異誘発され
た塩基を除いて鋳型に対して同一のDNAの鎖が生成される。さらに、このDNAの新
規鎖は、dCTPの代わりにdCTP−（αS）を含み、これは制限エンドヌクレアーゼ
消化からそれを保護するよう作用する。

【００５６】 二本鎖ヘテロ二重鎖の鋳型鎖が適切な制限酵素によりニック化された後、鋳型
鎖がExoIIIヌクレアーゼ、又は突然変異誘発されるべき部位を含む領域の向こう
側のもう１つの適切なヌクレアーゼにより消化され得る。次に、反応が停止され
、単に部分的に一本鎖である分子が残される。次に、完全な二本鎖DNAホモ二重
鎖が、すべての４重のデオキシリボヌクレアーゼ、ATP及びDNAリガーゼの存在下
でDNAポリメラーゼを用いて形成される。次に、このホモ二重鎖分子が、適切な
宿主、例えばE．コリJM101中に形質転換され得る。

【００５７】 例えば、本発明の１つの態様は、DNPのカルボキシ末端の15個のアミノ酸（配
列番号３）をコードするDNAセグメントを含んで成る、単離され、そして精製さ
れたDNA分子であり、前記アミノ酸は、そのアミノ酸をコードするいずれかのコ
ドンによりコードされ得る（図８、及びSambrookなど. (1989) におけるAppendi
x DのページD1を参照のこと）。

【００５８】 本発明の核酸分子によりコードされるペプチドの１又は複数の残基は、ペプチ
ド変異体が生物学的活性を有する限り、変更され得ることがまた想定される。好
ましくは、変異体は、本発明のペプチド、例えば配列番号１，２又は３を有する
ペプチドの少なくとも約10％の生物学的活性を有する。本発明のペプチドの生物
学的活性は、当業界において良く知られている方法、例えばイムノアッセイ及び
インビボ研究、例えば下記に記載されるそれらの研究を用いて決定され得る。

【００５９】 II．本発明の範囲内の剤の調製： A．キメラ性発現カセット： 形質転換のための発現カセットを調製するために、組換え又は予備選択された
DNA配列又はセグメントは、環状又は線状、二本鎖又は一本鎖であり得る。NPを
コードするmRNA配列、例えばBNP及びDNPを含んで成るキメラNPをコードするDNA
に対して実質的に相補的であるRNA配列をコードする予備選択されたDNA配列は、
典型的には、反対の配向（すなわち、5’→3’よりもむしろ3’→5’）に、カセ
ット中にクローン化された“センス”DNA配列である。一般的に、予備選択され
るDNA配列又はセグメントは、キメラDNA、例えば得られる細胞系に存在する予備
選択されたDNAの発現を促進する対象配列を端に有するコード領域をまた含むこ
とができるプラスミドDNAの形で存在する。

【００６０】 カセット又はベクターに関して本明細書において使用される場合、“キメラ”
とは、ベクターが、種の“生来”又は野生型で存在しない態様で連結されるか又
は関連される、少なくとも２種の異なった種からのDNAを含んで成るか、又は同
じ種からのDNAを含んで成ることを意味する。

【００６１】 NP又はその一部のための転写単位として作用する予備選択されたDNA配列の他
に、予備選択されたDNAの一部は末転写であり、調節又は構造機能の役に立つこ
とができる。例えば、予備選択されたDNAは、哺乳類細胞において活性的である
プロモーターをそれ自体、含んで成り、又は形質転換標的物であるゲノムにすで
に存在するプロモーターを利用することができる。そのようなプロモーターは、
CMVプロモーター、及びSV40後期プロモーター及びレトロウィルスLTR（長い末端
反復要素）を包含するが、但し当業者において良く知られている多くの他のプロ
モーターが本発明の実施において使用され得る。

【００６２】 宿主細胞において機能的な他の要素、例えばインビトロ、エンハンサー、ポリ
アデニル化配列及び同様のものはまた、予備選択されたDNAの一部であり得る。
そのような要素は、DNAの機能のために必要であっても又はなくても良いが、し
かし転写、mRNAの安定性又は同様のものに影響を及ぼすことによってDNAの改良
された発現を提供することができる。そのような要素は、細胞における形質転換
DNAの最適な性能を得るために、所望によりDNAに包含され得る。 “対照配列”とは、特定の宿主生成物における操作可能的に連結されたコード
配列の発現のために必要なDNA配列を意味する。例えば、原核細胞のために適切
である対照配列は、プロモーター、及び任意には、オペレーター配列及びリボソ
ーム結合部位を包含する。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル
及びエンハンサーを利用することが知られている。

【００６３】 “作用可能に連結される”とは、核酸がもう１つの核酸配列と共に機能的関係
で配置されることを意味する。例えば、分泌リーダーのプレ配列のためのDNAは
、それがペプチド又はポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現
される場合、ペプチド又はポリペプチドのためのDNAに操作可能的に連結され；
プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コー
ド配列に操作可能的に連結され；又はリボドーム結合部位は、それが翻訳を促進
するために配置される場合、コード配列に作用可能に連結される。一般的に、“
作用可能に連結される”とは、連結されるDNA配列が連続的であり、そして分泌
リーダーの場合、連続的であることを意味する。しかしながら、エンハンサーは
連続的であるべきではない。連結は、便利な制限部位での連結により達成される
。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリ
ンカーは、従来の実施に従って使用される。

【００６４】 細胞中に導入されるべき予備選択されたDNAはさらに一般的に、形質転換され
るかについて調べられる細胞集団からの形質転換された細胞の同定及び選択を促
進するために、選択マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子のいずれかを含むであ
ろう。他方では、選択マーカーは、DNAの別の断片上に担持され、そして同時形
質転換方法に使用され得る。選択マーカー及びレポーター遺伝子の両者は、宿主
細胞における発現を可能にするために適切な調節を端に有することができる。有
用な選択マーカーは当業者において良く知られており、そして例えば抗生物質及
び除草剤−耐性遺伝子、例えばneo, hpt, dhfr, bar, aroA, dapA及び同様のも
のを包含する。また、Lundquistなど. (アメリカ特許第5,848,956号)の表１に列
挙される遺伝子を参照のこと。

【００６５】 レポーター遺伝子は、可能性ある形質転換された細胞を同定するために、及び
調節配列の官能性を評価するために使用される。容易にアッセイできるタンパク
質をコードするレポーター遺伝子は、当業界において良く知られている。一般的
に、レポーター遺伝子は、受容体生物又は組織に存在しないか、又はそれにより
発現され、そしてその発現がある容易に検出できる性質、例えば酵素活性により
明示されるタンパク質をコードする遺伝子である。好ましい遺伝子は、E．コリ
のTn9からのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（cat）、
E．コリのuidA遺伝子座のβ−グルクロニダーゼ遺伝子（gus）、及びホタルポチ
ナス・ピラリス（Photinus pyralis）からのルシフェラーゼ遺伝子を包含する。
レポーター遺伝子の発現は、DNAが受容体細胞中に導入された後、適切な時間で
アッセイされる。

【００６６】 標的細胞を形質転換できる組換えDNAを構成するための一般的な方法は、当業
者に良く知られており、そして構成の同じ組成及び方法が、本明細書において有
用なDNAを生成するために使用され得る。例えば、Sambrookなど. (1989)は、構
成の適切な方法を提供する。

【００６７】 B．宿主細胞中への形質転換： 組換えDNAは、本発明のDNA分子、配列又はセグメントが宿主細胞により発現さ
れるように、そのゲノム中に安定して組み込まれた組換えDNAを有する、形質転
換された細胞を生成するために、特定に細胞中への導入のために有用ないずれか
の方法、例えば物理的又は生物学的方法を用いての、NPをコードするDNA、その
変異体、そのキメラ又はその補体を含んで成る発現ベクターによるトランスフェ
クトにより、宿主細胞、例えば哺乳類、細胞、酵母又は昆虫細胞中に容易に導入
され得る。

【００６８】 宿主細胞中に予備選択されたDNAを導入するための物理的方法は、リン酸カル
シウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレク
トロポレーション及び同様のものを包含する。宿主細胞中に興味あるDNAを導入
するための生物学的方法は、DNA及びRNAウィルスベクターの使用を包含する。物
理的方法の主な利点は、それらがウィルスの病理学的又は腫瘍形成工程に関係し
ないことである。

【００６９】 しかしながら、それらは精度が低く、しばしば複数のコピー挿入、ランダム組
み込み、外来性及び内因性遺伝子配列の破壊、及び予測できない発現をもたらす
。哺乳類遺伝子療法に関しては、ウィルスベクターが、哺乳類、例えばヒト細胞
中への遺伝子の導入のための最も広く使用される方法になって来た。ウィルスベ
クターは、ポックスウィルス、ヘルペス単純ウィルスI、アデノウィルス及びア
デノ関連ウィルス、レトロウィルス、レンチウィルス及び同様のものから誘導さ
れ得る。

【００７０】 本明細書において使用される場合、用語“細胞系”又は“宿主細胞”とは、十
分に特徴づけられ、均質の、生物学的に純粋な細胞集団を意味する。それらの細
胞は、腫瘍性であるか、又は当業界において知られている方法によりインビトロ
で“不滅化された”真核細胞、及び一次細胞又は原核細胞であり得る。細胞系は
宿主細胞は好ましくは、哺乳類起原のものであるが、しかし非哺乳類起原、例え
ば植物、昆虫、酵母、菌類又は細菌原の細胞系又は宿主細胞が使用され得る。一
般的に、予備選択されたDNA配列は、宿主細胞のゲノムに存在するが、しかし発
現されず、又は高く発現されず、又は他方では、過剰発現されないDNA配列を言
及する。

【００７１】 “トランスフェクトされた”又は“形質転換された”とは、そのゲノムが少な
くとも１つの予備選択されたDNA配列の存在により変更されるか又は増大されて
いるいずれかの宿主細胞又は細胞系を包含するために本明細書において使用され
、ここで前記DNAはまた、遺伝子工学の業界においては、“異種DNA”、“組換え
DNA”、“外因性DNA”，“遺伝子的に構築された”、“非生来の”又は“外来性
DNA”としても言及され、そして前記DNAは遺伝子工学の方法により、単離され、
そして宿主細胞又は細胞系のゲノム中に導入されている。

【００７２】 本発明の宿主細胞は典型的には、プラスミド発現ベクター、ウィルス発現ベク
ターにおけるDNA配列により、又は単離された線状DNA配列として、トランスフェ
クションにより生成される。好ましくは、トランスフェクトされたDNAは、NPを
コードする遺伝子又はその補体を含んで成る、染色体的に組み込まれた組換えDN
A配列であり、ここで宿主細胞は、有意なレベルの自己由来の又は“生来の”NP
を発現しても又はしなくても良い。

【００７３】 宿主細胞における予備選択されたDNA配列の存在を確かめるために、種々のア
ッセイが行われ得る。そのようなアッセイは、例えば当業者に良く知られている
“分子生物学”アッセイ、例えばサザン及びノザンブロット、RT−PCR及びPCR；
“生物学的”アッセイ、例えば免疫学的手段（イムノアッセイ、例えばELISA及
びウェスターンブロット）により、又は本発明の範囲内の剤を同定するために本
明細書に記載されるアッセイにより、特定のNPの存在又は不在を検出するアッセ
イを包含する。

【００７４】 導入された、予備選択されたDNAセグメントから生成されるRNAを検出し、そし
て定量化するために、RT−PCRが使用され得る。PCRのこの用途においては、酵素
、例えば逆転写酵素を用いて、及び次に、DNAを増幅する従来のPCR技法の使用を
通して、RNAをDNA中に逆転写することがまず必要である。ほとんどの場合、PCR
技法は、有用であるが、RNA生成物の統合性は示さないであろう。RNA生成物の性
質についてのさらなる情報は、ノザンブロットにより得ることができる。この技
法は、RNA種の存在を示し、そしてそのRNAの統合性についての情報を与える。RN
A種の存在又は不在はまた、ドット又はスロットブロットノザンハイブリダイゼ
ーションを用いて決定され得る。それらの技法は、ノザンブロットの改良であり
、そしてRNA種の存在又は不在を単に示す。

【００７５】 サザンブロット及びPCRは問題の予備選択されたDNAセグメントを検出するため
に使用され得るが、それらは、その予備選択されたDNAセグメントが発現される
かどうかについての情報を提供しない。発現は、導入され、予備選択されたDNA
配列のペプチド生成物を特異的に同定するか、又は宿主又は宿主細胞における導
入され、予備選択されたDNAセグメントの発現によりもたらされる表現型変化を
評価することによって評価され得る。

【００７６】 III．本発明のペプチド： 本発明のペプチドは、固相ペプチド合成（又はMerrifield）方法により合成さ
れ得る。実験方法を包含する、この確立され、そして広く使用される方法は次の
文献に記載される：Stewartなど., 1969; Merrifield, 1963; Meienhofer, 1973
; 及びBarany and Merrifield, 1980。合成は、αアミノ酸保護されたアミノ酸
を用いて、ペプチドのカルボキシ末端から開始される。フルオレニルメチルオキ
シカルボニル（Fmoc）又はｔ−ブチルオキシカルボニル（Boc）保護基は、たと
え他の保護基が適切であっても、すべてのアミノ基のために使用され得る。

【００７７】 例えば、Boc−Asn−OH、Boc−Ser−OH、Boc−Phe−OH、Boc−Arg−OH又はBoc
−Tyr−OH（すなわち、選択されたANP類似体カルボキシ末端アミノ酸）は、クロ
ロメチル化されたポリスチレン樹脂支持体にエステル化され得る。ポリスチレン
樹脂支持体は好ましくは、一定の有機溶媒に対してポリスチレンポリマーを不溶
性にする架橋剤としてのジビニルベンゼン約0.5〜２％とスチレンとのコポリマ
ーである。Carpinoなど., 1972; Meinhofer, 1978; 及びMerrifield, 1963を参
照のこと。ペプチド合成のそれらの及び他の方法はまた、アメリカ特許第3,862,
925号；第3,842,067号、第3,972,859号；第4,105,602号及び第4,757,048号によ
り例示される。

【００７８】 次に、固定されたペプチドがN−保護解除され、そして保護されたアミノ基を
有する他のアミノ酸が、固定されたペプチドに段階的態様で付加される。工程の
最後で、最終ペプチドが樹脂から分離され、そしていずれかの残存する保護基が
、酸性条件下で、臭酸及びトリフルオロ酢酸の混合物により、又は弗化水素によ
り処理することにより除去され、又は樹脂からの分離は、塩基性条件下で、トリ
エチルアミンによりもたらされ、次に、保護基が酸性条件下で除去される。 分離されたペプチドは、当業界において良く知られている手段、例えば凍結乾
燥、続いて多糖ゲル媒体、例えばSephadex G-25上での排除又は分配クロマトグ
ラフィー、又は向流分布により単離され、そして精製される。最終ペプチドの組
成は、標準手段によるペプチドの分解の後、アミノ酸分析により確かめられ得る
。

【００７９】 ペプチドのカルボキシル基の塩は、所望する塩基、例えば金属水酸化物塩基、
例えば水酸化ナトリウム；金属炭酸塩又は炭酸水素塩の塩基、例えば炭酸ナトリ
ウム又は炭酸水素ナトリウム；又はアミン塩基、例えばトリエチルアミン、トリ
エタノールアミン及び同様のものの１又は複数の同等物とペプチドとを接触せし
めることによって、通常の手段で調製され得る。 ポリペプチドの酸付加塩は、所望する無機又は有機酸の１又は複数の同等物、
例えば塩酸とポリペプチドとを接触することによって調製され得る。

【００８０】 ポリペプチドのカルボキシル基のエステルは、カルボン酸又は前駆体をエステ
ルに転換するための当業界において知られている通常の手段のいずれかにより調
製され得る。本発明のポリペプチドのエステルを調製するための１つの好ましい
方法は、上記Merrifield合成技法を用いる場合、樹脂に依存して、塩基性又は酸
性条件下で、所望するアルコールの存在下で樹脂から完結されたポリペプチドを
分離することである。従って、ペプチドのC−末端は、樹脂から開放される場合
、遊離酸の単離を伴なわないで、直接的にエステル化する。

【００８１】 本発明のポリペプチドのアミドはまた、カルボン酸基又は前駆体をアミドに転
換するための当業界において良く知られている技法により調製され得る。C−末
端カルボキシル基でのアミド形成のための好ましい方法は、適切なアミンにより
固体支持体からポリペプチドを分離することであり、又はエステルを生成するア
ルコールの存在下で分離し、続いて所望するアミンによりアミノ分解することで
ある。

【００８２】 本発明のポリペプチドのアミノ基のN−アシル誘導体は、最終縮合のためのN−
アシル保護基を用いることにより、又は保護されているか、又は保護されていな
いペプチドをアシル化することにより調製され得る。O−アシル誘導体は、遊離
ヒドロキシペプチド又はペプチド樹脂のアシル化により調製され得る。アシル化
は、標準のアシル化試薬、例えばアシルハロゲン化物、無水物、アシルイミダゾ
ール及び同様のものを用いて行われ得る。N−及びO−アシル化の両者は、所望に
より、一緒に行われ得る。

【００８３】 合成は、手動的技法を用いることができるか、又は例えば説明書に示される指
針及び製造業者により供給される試薬にしたがって、Applied BioSystems 431A
Peptide Synthesizer (Foster City, Calif.) 又はBiosearch SAMII自動ペプチ
ド合成機（Biosearch, Inc., San Rafael, Calif.）を用いて、完全に自動化さ
れ得る。Cys残基間のジスルフィド結合は、アメリカ特許第4,757,048号（第10頁
右欄）に教授されるように、線状ペプチドのKCNによる緩酸化により導入され得
る。

【００８４】 本発明の変異体ペプチド、例えば生来のNPに関して１又は複数のアミノ酸置換
を有するそれらのペプチドは、上記のようにして調製され、そして修飾され得る
。好ましい変異体ペプチドは、保存性アミノ酸置換を有するそれらのペプチドで
ある。保存性アミノ酸置換は、酸性アミノ酸としてアスパラギン酸−グルタミン
酸；塩基性アミノ酸としてリシン/アルギニン/ヒスチジン；疎水性アミノ酸とし
てロイシン/イソロイシン、メチオニン/バリン、アラニン/バリン；親水性アミ
ノ酸としてセリン/グリシン/アラニン/トレオニンである。保存性アミノ酸置換
はまた、側鎖に基づいてのグループ分けを包含する。

【００８５】 例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バ
リン、ロイシン、及びイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有する
アミノ酸のグループは、セリン及びトレオニンであり；アミド包含側鎖を有する
アミノ酸のグループはアスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有する
アミノ酸グループはフェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンであり；塩
基性側鎖を有するアミノ酸のグループはリシン、アルギニン及びヒスチジンであ
り；そして硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループはシステイン及びメチオニ
ンである。

【００８６】 例えば、バリンによるロイシン、グルタミン酸によるアスパラギンサン、セリ
ンによるトレオニンの置換、又は構造的に関連するアミノ酸による１つのアミノ
酸の類似する置換は、得られる変異体ポリペプチドの性質に対して主要効果を有
さないであろうことを予測することは道理に合っている。アミノ酸変化が機能的
ペプチドをもたらすかどうかは、ペプチド変異体の比活性をアッセイすることに
よって容易に決定され得る。保存性置換は、典型的な置換の見出し下で図９に示
される。より好ましい置換は、好ましい置換の見出し下にある。置換が導入され
た後、変異体は、生物学的に活性についてスクリーンされる。

【００８７】 本発明の範囲内のアミノ酸置換は一般的に、（ａ）置換の領域におけるペプチ
ド主鎖の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の大
きさの維持に対するそれらの効果において有意には異ならない置換を選択するこ
とによって達成される。天然に存在する残基は、共通する側鎖性質に基づいてグ
ループ分けされる： （１）疎水性：ノルロイシン、met, ala, val, leu, ile; （２）中性親水性：cys, ser, thr; （３）酸性：asp, glu; （４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg: （５）鎖配向に影響を及ぼす残基：gly, pro; 及び （６）芳香族：Trp, tyr, phe。

【００８８】 本発明はまた、非保存性置換を有するペプチド変異体にも関する。非保存性置
換は、上記種類の１つのメンバーのもう１つのメンバーによる交換を包含する。
そのような生成は、多量の又は他の態様のそのような化合物を供給するために所
望される。 本発明の環状化合物は、システイン残基を結合することによって供給され得る
が、しかしながら、システイン残基上のスルフヒドリル基、例えば−CH₂−CH₂−
による置換が構想される。例えば、スルフヒドリル基上を−CH₂−基により置換
するためには、システイン残基が類似するα−アミノ酪酸により置換される。そ
れらの環状類似ペプチドは、例えばM. Lebl and Hruby (1984) の方法論に従っ
て、又はアメリカ特許第4,161,521号に開示される方法を用いることによって形
成され得る。

【００８９】 エステル又はアミド架橋はまた、構造体−CH₂−CO₂CH₂−の架橋を生成するた
めに、セリン又はトレオニンのOH、及びアスパラギン酸又はグルタミン酸のカル
ボキシルを反応せしめることによって形成され得る。同様に、アミドは、構造体
−CH₂−C(O)NH−(CH₂)₄−の架橋を生成するために、リシンの側鎖及びアスパラ
ギン酸又はグルタミン酸を反応せしめることによって得られる。それらの架橋の
合成方法は、Schillerなど. (1985a) 及びSchillerなど. (1985b) に見出される
。他の架橋形成アミノ酸残基及び反応は、アメリカ特許第4,935,492号に提供さ
れる。

【００９０】 次の文献は、アミン酸残基を連結するために非ペプチド結合を包含するペプチ
ド類似体の調製を記載する：Spatola, 1983a; Spatola, 1983b; Morley, 1980;
Hudsonなど., 1979; Spatolaなど., 1986; Hann, 1982; Almquistなど., 1980;
Jonnings-Whiteなど., 1982; Szelkeなど., ヨーロッパ特許出願第45665号（198
2）; Holladayなど., 1983; 及びHruby, 1982。

【００９１】 IV．本発明の剤の投与の用量、配合物及び経路： 本発明の核酸分子及びペプチドは好ましくは、哺乳類、例えばヒト又は非ヒト
哺乳類、例えば家畜動物に、少なくとも約0.01〜約100mg/kg、より好ましくは約
0.05〜約50mg/kg及びさらにより好ましくは約0.1〜約30mg/kg体重（イヌにおい
ては、約10〜約50mg/kg）の用量で投与されるが、但し他の用量でも効果的な結
果をもたらす。投与される量は、種々の要因、例えば選択される剤、疾病、及び
予防又は処理が達成されるかどうか（但し、それらだけには限定されない）に依
存して変化するであろう。局部及び全身性投与が想定される。全身性投与が好ま
しい。

【００９２】 従って、本発明の治療剤の投与は、例えば受容体の生理学的状態、投与の目的
が治療的であるか又は予防的であるか、及び当業者に知られている他の要因に依
存して、連続的であっても又は断続的であっても良い。本発明の剤の投与は、予
備選択された期間にわたって、実質的に連続的であり得、又は一定の間隔あけら
れた一連の用量であり得る。

【００９３】 センス又はアンチセンス核酸分子の投与は、核酸分子を含んで成る発現カッセ
トにより形質転換された細胞の導入（例えば、WO93/02556号を参照のこと）、又
は核酸分子の投与（例えば、Felgnerなど., アメリカ特許第5,580,859号；Pardo
llなど., 1995; Stevensonなど., 1995; Molling, 1997; Donnellyなど., 1995;
Yangなど., 1995; Abdallahなど., 1995; Wolffなど., 1990; Tripathyなど.,
1994; Tripathy など., 1996a; Tripathyなど., 1996b; Tsurumiなど., 1996; B
aumgartnerなど., 1997; Linなど., 1990を参照のこと）を通して達成され得る
。核酸のための医薬配合物、用量及び投与路は一般的に、例えばFelgnerなど.,
前記に開示される。

【００９４】 ペプチド化合物は、中性又は塩形として組成物中に配合され得る。医薬的に許
容できる非毒性塩は、酸付加塩（遊離アミノ基により形成される）を包含し、そ
して無機酸、例えば塩酸、硫酸又はリン酸、又は有機酸、例えば酢酸、蓚酸、酒
石酸、マンデル酸、クエン酸、リンゴ酸、及び同様のものとの反応により形成さ
れる。遊離カルボキシル基により形成される塩は、無機塩基、例えばナトリウム
、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は第III鉄水酸化物、及びそのような
有機塩基、例えばアミン、すなわちイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２
−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン及び同様のものにより誘導
され得る。

【００９５】 下記で論じられるように、任意には、持効性のために配合され得る、本発明の
核酸分子又はペプチドを含んで成る、１又は複数の適切な単位用量形は、種々の
経路、例えば経口又は非経口、例えば直腸、頬、膣及び舌下、経皮、皮下、静脈
内、筋肉内、腹腔内、胸腔内、歯冠内、肺内及び鼻腔内路により投与され得る。
配合物は、適切な場合、便利には、別々の単位用量形で提供され得、そして当業
界において良く知られているいずれかの方法により調製され得る。そのような方
法は、治療剤を、液体キャリヤー、固体キャリヤー、半固体キャリヤー、細かく
分割された固体キャリヤー又はそれらの組み合わせと共に結合せしめ、そして次
に、必要なら、生成物を所望する供給システムに導入するか又は形状化する段階
を包含することを含んで成る。

【００９６】 本発明の核酸分子又はペプチドが経口投与のために調製される場合、それは好
ましくは、医薬製剤又は単位用量形成するために、医薬的に許容できるキャリヤ
ー、希釈剤又は賦形剤と共に組合される。そのような製剤における合計の活性成
分は、製剤の0.1〜99.9重量％である。“医薬的に許容できる”とは、キャリヤ
ー、希釈剤、賦形剤を意味し、そして/又は塩は、製剤の他の成分と適合できる
べきであり、そしてその受容体に有害であるべきではない。経口投与のための活
性成分は、粉末又は顆粒として；溶液、懸濁液又はエマルジョンとして；又は達
成できる塩基、例えばチューインガムからの活性成分の摂取のための合成樹脂に
おいて存在することができる。活性成分はまた、ボーラス、舐剤又はペーストと
して提供され得る。

【００９７】 本発明の核酸分子又はペプチドを含む医薬製剤は、良く知られており、そして
容易に入手できる成分を用いて、当業界において知られている方法により調製さ
れ得る。例えば、核酸分子又はペプチドは、通常の賦形剤、希釈剤又はキャリヤ
ーと共に配合され、そして錠剤、カプセル、懸濁液、粉末及び同様のものに形成
され得る。

【００９８】 そのような配合のために適切である、賦形剤、希釈剤及びキャリヤーの例は、
次の充填剤及び増量剤、例えば澱粉、糖、マンニトール、及び珪酸誘導体；結合
剤、例えばカルボキシルメチルセルロース、HPMC及び他のセルロース誘導体、ア
ルギネート、ゼラチン及びポリビニル−ピロリドン；保湿剤、例えばグリセロー
ル；砕解剤、例えば炭酸カルシウム及び炭酸水素ナトリウム；溶解を遅延するた
めの剤、例えばパラフィン；吸収促進剤、例えば第四アンモニウム化合物；界面
活性剤、例えばセチルアルコール、グリセロール一ステアレート；吸着性キャリ
ヤー、例えばカオリン及びベントナイト；及び滑剤、例えばタルク、カルシウム
及びステアリン酸マグネシウム、及び固体ポリエチルグリコールを包含する。

【００９９】 例えば、本発明の核酸分子又はペプチドを含む錠剤又はカプセルは、緩衝剤、
例えば炭酸カルシウム、酸化マグネシウム及び炭酸マグネシウムを包含する。カ
プセル及び錠剤はまた、不活性成分、例えばセルロース、予備ゲル化された澱粉
、二酸化珪素、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウ
ム、微晶性セルロース、澱粉、タルク、二酸化チタン、安息香酸、クエン酸、ト
ウモロコシ澱粉、鉱油、ポリプロピレングリコール、リン酸ナトリウム、及びス
テアリン酸亜鉛、及び同様のものを包含する。

【０１００】 本発明の核酸分子又はペプチドを含む硬質又は軟質ゼラチンカプセルは、不活
性成分、例えばゼラチン、微晶性セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、澱粉、
タルク及び二酸化チタン、及び同様のもの、並びに液体ビークル、例えばポリエ
チレングリコール（PEG）及び植物油を含むことができる。さらに、本発明の核
酸分子又はペプチドを含む腸被覆されたカプセル又は錠剤は、胃における砕解に
耐え、そして十二指腸のより中性〜アルカリ性環境において溶解するよう企画さ
れる。

【０１０１】 本発明の核酸分子又はペプチドはまた、便利な経口投与のためのエリキシル又
は溶液として、又は筋肉内、皮下又は静脈内路により、非経路投与のために適切
な溶液としても配合され得る。 本発明の核酸分子又はペプチドの医薬製剤はまた、水性又は非水性溶液又は分
散体の形、又は他方では、エマルジョン又は懸濁液の形を取ることができる。

【０１０２】 従って、前記核酸分子又はペプチドは、非経口投与（例えば、注射、例えばボ
ーラス注射又は連続注入）のために配合され、そしてアンプル、プレ充填された
注射器、小体積注入容器又は添加される保存剤を含む複数容量容器において、単
位用量形で提供され得る。活性成分は、油性又は水性ビークル中、懸濁液、溶液
又はエマルジョンのような形を取ることができ、そして配合剤、例えば懸濁剤、
安定剤及び/又は分散剤を含むことができる。他方では、活性成分は、使用の前
、適切なビークル、例えば無菌の発熱物質を有さない水による構成のために、無
菌固体の無菌単離により、又は溶液からの凍結乾燥により得られる粉末形で存在
することができる。

【０１０３】 それらの製剤は、医薬的に許容できるビークル及び当業界において知られてい
るアジュバントを含むことができる。例えば、水の他に次の溶媒から選択された
、生理学的観点から許容できる１又は複数の有機溶媒を用いて、溶液を調製する
ことは可能である：アセトン、エタノール、イソプロピルアルコール、グリコー
ルエーテル、例えば名称“Dowanol”として市販されている製品、ポリグリコー
ル及びポリエチレングリコール、短鎖の酸のC₁−C₄アルキルエステル、好ましく
はエチル又はイソプロピルラクテート、脂肪酸トリグリセリド、例えば名称“Mi
glyol”として市販されている製品、イソプロピルミリステート、動物、鉱及び
植物油、及びポリシロキサン。

【０１０４】 本発明の組成物はまた、増粘剤、例えばセルロース及び/又はセルロース誘導
体を含むことができる。それらはまた、ガム、例えばキサンタン、グアー又はカ
ルボガム、又はアラビアゴム、又は他方では、ポリエチレングリコール、ベント
ン及びモントモリロニット（montmorillonites）、及び同様のものを含むことが
できる。 必要なら、酸化防止剤、界面活性剤、他の保存剤、フィルム形成、角質溶解又
はコメド溶解剤、香料及び着色剤から選択されたアジュバントを添加することが
可能である。また、他の活性成分が、記載される条件又はいくらかの他の条件の
ために添加され得る。

【０１０５】 例えば、酸化防止剤の中で、ｔ−ブチルヒドロキノン、ブチル化されたヒドロ
キシアニソール、ブチル化されたヒドロキシトルエン及びα−トコフェノール及
びその誘導体が言及され得る。局部適用のために主として条件づけられた生薬は
、クリーム、ミルク、ゲル、分散体又はマイクロエマルジョン、高いか又は低い
程度に増粘されたローション、含浸パッド、軟膏又はステックの形、又は他方で
は、スプレーにおけるエーロゾル配合物の形、又は発泡形、又は他方では、石鹸
のケーク形を取る。

【０１０６】 さらに、剤は、持効性用量形及び同様の形として配合するために十分に適合化
される。製剤は、それらが単に又は好ましくは、腸又は呼吸器官の特定部分に、
たぶん一定の期間にわたって、活性成分を開放するよう構成され得る。被膜、包
被及び保護マトリックスは例えば、ポリマー物質、例えばポリラクチド−グリコ
レート、リポソーム、マイクロエマルジョン、微粒子、超微粒子、又はワックス
から製造され得る。それらの被膜、包被及び保護マトリックスは、内在性装置、
例えばステント、カテーテル、腹膜透析管及び同様のものを被覆するために有用
である。

【０１０７】 本発明の核酸分子又はペプチドは、経皮投与のためのパッチを通して供給され
得る。治療剤の経皮投与のために適切なパッチの例については、アメリカ特許第
5,560,922号を参照のこと。経皮供給のためのパッチは、裏地層、及びそこに治
療剤及び１又は複数の皮膚透過エンハンサーを分散し、又は溶解しているポリマ
ーマトリックスを含んで成る。裏地層は、治療剤に対して不透過性であるいずれ
かの適切な材料から製造され得る。裏地層はマトリックス層のための保護被膜と
して作用し、そしてまた、支持機能も提供する。

【０１０８】 裏地は、それがポリマーマトリックスと実質的に同じサイズの層であるよう形
成され得るか、又はポリマーマトリックスのサイド以上に拡張するか、又はポリ
マーマトリックスのサイドをオーバーレイし、そして次に、裏地層の拡張の表面
が接着剤手段のためのベースであり得る態様で外側に拡張できるよう大きな寸法
のものであり得る。他方では、ポリマーマトリックスは、接着剤ポリマー、例え
ばポリアクリレート又はアクリレート/酢酸ビニルコポリマーを含むことができ
るか、又はそれから配合され得る。長期適用のためには、微晶性及び/又は呼吸
できる裏地ラミネートを使用することが所望され、その結果、皮膚の水和化又は
浸軟が最少化され得る。

【０１０９】 裏地層を製造するために適切な材料の例は、高い及び低い密度のポリエチレン
、ポリプロピレン、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、例えばポリ
（エチレンフタレート）、金属箔、そのような適切なポリマーフィルムの金属箔
ラミネート、及び同様のものフィルムである。好ましくは、裏地層のために使用
される材料は、そのようなポリマーフィルムと金属箔、例えばアルミ箔とのラミ
ネートである。そのようなラミネートにおいては、ラミネートのポリマーフィル
ムは通常、接着剤ポリマーマトリックスと接触されるであろう。 裏地層は、所望する保護及び支持機能を提供するであろういずれか適切な厚さ
であり得る。適切な厚さは、約10〜約200ミクロンであろう。

【０１１０】 一般的には、生物学的に許容できる接着剤ポリマー層を形成するために使用さ
れるそれらのポリマーは、治療剤が調節された速度で通過することができる、造
形体、薄壁又は被膜を形成できるそれらのポリマーである。適切なポリマーは、
生物学的及び医薬的に適合でき、非アレルギー性で且つ不溶性であり、そして装
置が接触する体液又は組織と適合できる。可溶性ポリマーの使用は、回避される
べきである。なぜならば、皮膚湿気によるマトリックスの溶解又は浸蝕が治療剤
の開放速度、及び除去の便利さのために所定の位置に存続する用量単位の可能性
に対して影響を及ぼすからである。

【０１１１】 接着剤ポリマー層を加工するための典型的な材料は次のものを包含する：ポリ
エチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、エチレン/プロピレンコポリマー、
エチレン/エチルアクリレートコポリマー、エチレン/酢酸ビニルコポリマー、シ
リコーンエラストマー、特に医薬品種のポリジメチルシクロキサン、ネオプレン
ゴム、ポリイソブチレン、ポリアクリレート、塩素化されたポリエチレン、ポリ
塩化ビニル、塩化ビニル−酢酸ビニルコポリマー、架橋されたポリメタクリレー
トポリマー（ヒドロゲル）、ポリ塩化ビニルデン、ポリ（エチレンテレフタレー
ト）、ブチルゴム、エピクロロヒドリンゴム、エチレンビニルアルコールコポリ
マー、エチレン−ビニルオキシエタノールコポリマー；

【０１１２】 シリコーンコポリマー、例えば、ポリシロキサン−ポリカーボネートコポリマ
ー、ポリシロキサン−ポリ酸化エチレンコポリマー、ポリシロキサン−ポリメタ
クリレートコポリマー、ポリシロキサン−アルキレンコポリマー（例えば、ポリ
シロキサン−エチレンコポリマー）、ポリシロキサン−アルキレンシランコポリ
マー（例えば、ポリシロキサン−エチレンシランコポリマー）、及び同様のもの
；セルロースポリマー、例えばメチル又はエチルセルロース、ヒドロキシプロピ
ルメチルセルロース、及びセルロースエステル；ポリカーボネート；ポリテトラ
フルオロエチレン；及び同様のもの。

【０１１３】 好ましくは、生物学的に許容できる接着剤ポリマーマトリックスは、室温より
も低いガラス転移温度を有するポリマーから選択されるべきである。ポリマーは
、必ずしも必要ではないが、室温で結晶化度を有することができる。架橋性モノ
マー単位又は部位が、そのようなポリマー中に組み込まれ得る。例えば、架橋性
モノマーが、ポリアクリレートポリマー中に組み込まれ、治療剤をポリマー中に
分散した後、マトリックスを架橋するための部位を提供する。ポリアクリレート
ポリマーのための既知の架橋モノマーは、ポリオールのポリメタクリル酸エステ
ル、例えばブチレンジアクリレート及びジメタクリレート、トリメチロールプロ
パントリメタクリレート及び同様のものを包含する。そのような部位を提供する
他のモノマーは、アリルアクリレート、アリルメタクリレート、ジアリルマレエ
ート及び同様のものを包含する。

【０１１４】 好ましくは、可塑剤及び/又は保湿剤は、接着剤ポリマーマトリックス内に分
散される。水溶性ポリオールは一般的に、この目的のために適切である。配合物
への保湿剤の組み込みは、皮膚刺激を減じ、そして供給システムの接着剤ポリマ
ーの破壊を妨げることを助ける、皮膚の表面上の湿気の用量単位による吸収を可
能にする。 経皮用供給システムから開放される治療剤は、皮膚の個々の層を侵入できるべ
きである。治療剤の透過速度を高めるために、経皮用薬剤供給システムは、特に
、皮膚の最も外側の層、すなわち分子の侵入に対して最も高い耐性を付与する角
質層の透過性を高めることができるべきである。治療剤の経皮供給のためのパッ
チの加工は、当業界において良く知られている。

【０１１５】 吸入による上部（鼻）又は下部吸収機関への投与のためには、本発明の核酸分
子又はペプチドは便利には、注入器、ネブライザー、又はエーロゾル噴霧を供給
する加圧されたパック又は他の便利な手段から供給される。加圧されたパックは
、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン
、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適切なガスを含んで成る
。加圧されたエーロゾルの場合、その用量単位は、計量された量を供給するため
に弁を供給することによって決定され得る。

【０１１６】 他方では、吸入又は注入による投与のためには、組成物は、乾燥粉末、例えば
治療剤及び適切な粉末基材、例えばラクトース又は澱粉の粉末混合物の形を取る
ことができる。粉末組成物は、例えばカプセル又はカートリッジ、又は粉末吸入
器、注入器又は計量された容量呼吸器の助けにより投与され得るゼラチン又はブ
リスターパックにおける単位用量形に提供される。 鼻腔内投与のためには、核酸分子又はペプチドは、鼻用ドロップ、液体噴霧、
例えばプラスチック製ボトル噴霧器、又は計量された用量呼吸器を通して投与さ
れ得る。典型的な噴霧器は、Mistometer（Wintrop）及びMedihaler（Riker）で
ある。

【０１１７】 本発明の核酸分子又はペプチドの局部供給はまた、疾病の部位で又はその近く
で剤を投与する種々の技法によってであり得る。部位−特異的又は標的化された
局部供給技法の例は、入手できる技法を包含するが、但しそれらだけには限定さ
れない。例として、次のものを包含する：局部供給カテーテル、例えば注入又は
内在性カテーテル、例えば針注入カテーテル、シャント及びステント又は他の移
植できる装置、部位特異的キャリヤー、直接的注入又は間接的適用。 局部投与のためには、核酸分子又はペプチドは、標的領域への直接的な適用の
ために、当業界において知られているようにして配合され得る。この目的のため
の従来の形は、創傷用包帯、被覆された包帯又は他のポリマー性皮膜、軟膏、ク
リーム、ローション、ペースト、ジェリー、噴霧及びエアロゾール、並びに歯磨
き及びマウスウォシュ、又は他の適切な形、例えばコーチングされたコンドーム
を包含する。

【０１１８】 軟膏及びクリームは、水性又は油性基材、及び適切な増粘剤及び/又はゲル化
剤と共に配合され得る。ローションは、水性又は油性基材と共に配合され得、そ
して一般的には、また１又は複数の乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤
、又は着色剤を含むであろう。活性成分はまた、アメリカ特許第4,140,122号；
第4,383,529号；又は第4,051,842号に開示されるように、イオン導入法により供
給され得る。局部配合物に存在する本発明の核酸分子又はペプチドの重量％は、
種々の要因に依存するが、しかし一般的には、配合物の合計重量の0.01〜95重量
％、及び典型的には、0.1〜25重量％であろう。

【０１１９】 所望される場合、上記配合物は、例えば天然のゲル、合成ポリマーゲル又はそ
の混合物を含んで成る一定の親水性ポリマーマトリックスと組合すことにより、
使用される活性成分の持効性を付与するよう適合され得る。 ドロップ、例えば眼用又は鼻量ドロップは、１又は複数の分散剤、溶解剤又は
懸濁剤を含んで成る水性又は非水性基材と共に配合され得る。ドロップは、単純
な眼用ドロッパーキャップ付きボトル、液体含有物を滴下するよう適合されたプ
ラスチック製ボトル、特別似形状化されたクロージャーを通して供給され得る。

【０１２０】 核酸分子又はペプチドはさらに、口腔又は咽喉への局部投与のために配合され
得る。例えば、活性成分は、さらに風味基材、通常スクロース及びアラビアゴム
又はトラガカントゴムを含んで成るロゼンジ；不活性基材、例えばゼラチン及び
グリセリン又はスクロース及びアラビアゴム中、本発明の組成物を含んで成る香
剤；適切な液体キャリヤー中、本発明の組成物を含んで成るマウスウォッシュ；
及び本発明の組成物を含んで成るペースト及びゲル、例えば歯磨き又はゲルとし
て配合され得る。 本明細書に記載される配合物及び組成物はまた、他の成分、例えば抗菌剤又は
保存剤を含むことができる。さらに、活性成分はまた、他の治療剤と組合しても
使用され得る。 本発明は、次の例によりさらに記載されるであろう。

【０１２１】 実施例材料及び方法 ： VNPを、ABI431Aペプチド合成機（Applied Biosystems Inc., Foster City, Ca
lif.）上で、その製造業者により提供されるプロトコール及び試薬により、フル
オレニルメトキシ−カルボニル（FMOC）化学を用いて、Mayo Protein Core Faci
lity において合成した。ペプチドを、Vydoc C8カラム（The Separations Group
, Hesperia, Calif）を用いて、逆層高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）に
より精製した。合成は、アミノ酸分析及び血漿吸収質量分光計により確認された
。

【０１２２】 血漿及び尿からのサンプルを、Vydac C18カラム（4.6mm×250mm）（The Separ
ations Group, Hesperia, Calif.）を用いて逆相HPLCを用いて分析した。HPLCシ
ステムの成分は、２種のBeckman114ポンプ（Backman Instruments, San Ramon,
Calif.）、ABI 759A吸光度検出器（Applied Biosystems, Inc., Foster City, C
alif）、及びBeckman System Gold Chromatographソフトウェアを備えたIBM PS2
50Zコンピューターであった。A緩衝液は、0.1％トリフルオロ酢酸であり、そし
てB緩衝液は80％アセトニトリル/20％水/0.1％トリフルオロ酢酸であった。分離
は、5％〜70％のB緩衝液のグラジエントで60分間、行われた。

【０１２３】 得られる結果は、平均±SEMとして表される。器官チャンバー研究において、
ｎは、リングが採取されたイヌの数に等しい。内皮を有するリング及び有さない
リングを、同時に研究し、そして不対観察についてのスチューデントｔ−検定が
、内皮を有するリング及び有さないリングの応答、及び動脈と静脈との間の応答
内の統計学的有意性を決定するために使用された。ラット研究においては、デー
タは、反復された測定についてANOVAを用いて、続いてグループ内で適切な場合
、Fisherの最少有意差検定により分析された。グループ間のデータは、スチュー
デント不対ｔ−検定により分析された。統計学的有意性は、ｐ＜0.05で検定され
た。

【０１２４】 実験は、Animal Welfare Actに従って行われた。Wistarラット及び自発的高血
圧症ラット（SHR）（400g；Harlan Sprague-Dawley, Indianapolis, In.）を、
イナクチン（Inactin）（100mg/kg；腹腔内；BYK Gulden, Konstanz, Germany）
により麻酔した。体温は、加熱パッドにより36℃〜38℃に維持された。気管開口
を行い；しかしながら、動物は人工呼吸を行われなかった。ポリエチレンカテー
テル（PE−50; Becton Dickinson Co.,Parsippay, N.J.）を、塩溶液及び薬剤の
注入のために左頸静脈に、右心房圧をモニターするために右心房側の右頸静脈に
、及び血液サンプルを採取し、そして平均動脈圧をモニターするために頸動脈に
配置した。PE−90カテーテルを、尿採取のために膀胱に配置した。

【０１２５】 実験は、正常なラットの次の３種のグループにおいて行われた：ANPグループ
（ｎ＝４）、CNPグループ（ｎ＝４）及びVNPグループ（ｎ＝４）。VNPはまた、S
HRラット（ｎ＝４）においても研究された。塩溶液（0.9％NaCl）の静脈内注入
は、左頸静脈カテーテルを通して行われた（1ml/100g体重/時）。手術の完結の
後、ラットを30分間、安定化した。個々のグループにおいては、15分の基線期間
が続いた。基線期間の後、塩溶液（0.9％NaCl）がボーラス態様（0.1ml）で投与
され、そして続いて15分間の基線期間が存在した。

【０１２６】 塩溶液期間の後、ペプチド（ANP、CNP又はVNP）を、５μg/kgでボーラス態様
で投与し、続いて15分間の基線期間が伴なった。これに続いて、50μg/kgでの第
２ボーラス（0.1ml）及び15分間の期間が伴なった。30分の洗浄の後、15分間の
回収期間が続いた。個々の実験期間の間、平均動脈圧（MAP）、心拍（HR）及び
右心房圧（RAP）を測定した。基線、第２ボーラス態様（50μg/kg）及び回収期
間の中間点で、血液を、血漿cGMPのためにサンプリングした。個々の期間の最後
で、尿を体積について測定し（UV）、そしてサンプルを、電解質及びcGMP分析の
ために貯蔵した。

【０１２７】 血漿cGMP分析のための血液を、EDTA管に集め、すぐに氷上に配置し、そして2,
500rpmで4℃で遠心分離した。血漿を分離し、そしてアッセイまで−20℃で貯蔵
した。cGMP決定のための尿を、貯蔵の前、90℃以上に加熱した。血漿及び尿cGMP
を、A.L. Steinerなど., J. Hyportension, 5 (Suppl. 5), 551-553 (1987) に
より記載されるようにして、特定のRIAにより決定した。 第２表は、正常ラットにおけるANP、CNP及びVNP投与の心血管及び腎作用を要
約する。

【０１２８】 第２表におけるデータにより示されるように、塩溶液のボーラス投与（0.1ml
）は、心血管又は腎作用を有さなかった。高い用量（50μg/kg）のANP、CNP及び
VNPのボーラス投与（0.1ml）は、MAP及びRAPの有意な低下をもたらし、そして尿
の流れ、ナトリウム排泄、血漿cGMP及び尿cGMP体積を高めた。尿流、ナトリウム
排泄及び尿cGMP体積の上昇は、CNPよりもVNPに関して有意に高かったが、しかし
ANPよりも低かった。 第３表は、正常及びSHRラットにおけるVNPの心血管及び腎効果を報告する。

【０１２９】

【表１】

【０１３０】

【表２】

【０１３１】

【表３】

【０１３２】

【表４】

【０１３３】 第３表におけるデータにより示されるように、SHRの基線MAPは、正常ラットの
それよりも有意に高く、そしてSHRの基線尿体積は、正常ラットのそれよりも著
しく低かった。VNP, MAP及びRAPの高用量ボーラス注入が有意に低下する間、尿
の流れ、ナトリウム排泄、血漿cGMP及び尿cGMP体積は、正常及びSHRグループに
おいて有意に高められた。MAPからVNPへの低下は両グループにおいて類似したが
、VNPの腎作用及び尿cGMP効果は、正常ラットに比較して、SHRラットにおいて弱
められた。VNPは、ANP及びCNPに比較して、動脈及び静脈の両者において、より
有能な内皮無関係の血管弛緩性ペプチドである。VNPはまた、インビボで有能な
ナトリウム排泄増加効果を有する。

【０１３４】 例２：患者及び方法 ： この研究プロトコールは、Mayo Institutional Review Board of ガイドライ
ンと一致した。インフォームコンセントは、個々の患者及び彼らの家族から得ら
れた。

【０１３５】循環DNPについての研究対象 ： 循環CNPを、19人の正常なヒト志願者及び心不全を有する19人の患者において
評価した。心不全を有するすべての患者は、完全な身体的試験及び実験室評価を
受け、そして身体的試験の後、彼らの心臓症状に基づいて、New York Heart Ass
ociation (NYHA) 機能クラス基準により、クラスIII又はIVとして分類された。
心不全を有するそれらの患者における心室機能不全の原因は、特発性拡張型心筋
症及び虚血性心筋症を包含した。心不全を有するすべての患者は、標準の心血管
理を受けた。

【０１３６】血漿DNP濃度の安定化 ： DNPアッセイのための血液サンプルを、エチレンジアミン四酢酸を含む冷却さ
れた管に集め、そしてすぐに、氷上に配置した。2,500rpmで４℃での10分間の遠
心分離の後、血漿をデカントし、そして分析されるまで、−20℃で貯蔵した。血
漿（1ml）を、C-8 Bond Eluteカートリッジ上で抽出し、そしてメタノール及び
蒸留水により洗浄した。DNPを、１％トリフルオロ酢酸を含む95％メタノールを
溶離した。次に、濃縮された溶離物を、DNPのための特異的及び敏感なラジオイ
ムノアッセイによりアッセイした（Phoenix Pharmaceuticals, Mountain View,
California）。サンプル及び標準を、ウサギ抗−DNPと共に４℃で24時間インキ
ュベートした。

【０１３７】 ¹²⁵I−ラベルされたDNP（100μl）を添加し、そしてインキュベーションを、
さらに24時間、４℃で続けた。次に、遊離及び結合された画分を、第２抗体及び
正常なウサギ血清の添加により分離し、そして遠心分離した。結合された画分の
放射能を、γカウンターにより測定した。このアッセイについての最小検出可能
レベルは、0.5pg/管であり、そして標準曲線の50％阻害濃度は29.0pgであった。
回収率は83.1±1.8％であり、そしてアッセイ内変動性10.1±3.2％であった。DN
Pへの抗体の交差反応性は、ANP, BNP, CNP又はエンドセリンにより示されなかっ
た。

【０１３８】DNP免疫組織化学のための研究対象 ： 免疫組織化学研究についてのヒト心臓組織を、Mayo Clinic, Rochesterで心臓
移植を受けた最終−段階CHFを有する４人の患者の心房心筋から得た。CHFの原因
は、特発性拡張型心筋症及び虚血性心筋症を包含した。組織断片を、心房付属物
及び遊離壁から得た。正常な心房組織を、心臓移植の時点で、３人のドナー心臓
から得た。

【０１３９】免疫組織化学染色 ： 免疫組織化学研究を、Weiなど. (1993) により記載される間接的イムノペルオ
キシダーゼ方法により行った。組織をすぐに、10％緩衝化されたホルマリンによ
り固定し、そしてパラフィンに包埋し；６μmの厚さの断片を切断し、そしてシ
ラン化されたガラススライド上に積層した。フライドを60℃でインキュベートし
、そして徐々に変化する濃度のキシレン及びエタノールによりパラフィン除去し
た。内因性ペルオキシダーゼの活性を阻止するために、スライドを、メタノール
中、0.6％の過酸化水素と共に室温で20分間インキュベートした。

【０１４０】 洗浄の後、断片を、５％ヤギ血清（Dako Corp., Carpinteria, California）
において10分間、室温でインキュベートし、非特異的バックグラウンド染色を低
め、そして次に、それらを、室温で24時間、湿潤されたチャンバーにおいて、１
：500の希釈度での（正常ヤギ血清において）、ポリクローナルウサギ抗−DNP（
Phoenix Pharmaceuticals） と共にインキュベートした。すべてのスライドを、
第２抗体−ホースラディッシュペルオキシダーゼ接合体（BioScurce, Camarillo
, California）と共に30分間インキュベートした。

【０１４１】 反応を、断片と、ジメチルホルムアミド及び酢酸ナトリウム中、3’−アミノ
−9’−エチルカルバゾール（Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri）
を含む、新しく調製された試薬と共にインキュベートすることによって明視化し
た。断片を、ヘマトキシリンにより対比染色し、カバーガラスをかぶせ、そして
オリンパス顕微鏡の使用により再検査した。それらの組織が起因するそれぞれの
グループの知識を有さない６人の独立した観察者が、それらの断片を再検査した
。DNP−L1の存在を、次の染色の尺度に基づいて定量化した：０＝ナシ；１＝最
少密度；２＝低密度；３＝中位の密度；及び４＝最大密度。対照断片を、１％非
免疫ヤギ血清により染色した。

【０１４２】統計学的分析 ： データは、特にことわらない限り、平均値±平均の標準誤差として記録された
。グループ間の統計学的比較は、Graph Radプリズムソフトウェアを用いること
によって、スチューデントｔ検定の使用により行われた。0.05以下のP値は、統
計学的に有意であると見なされた。

【０１４３】結果 ：正常な被検体及びCHFを有する患者の血漿におけるDNP−LI ： 19人の正常な志願者の研究においては、DNP−LIは正常なヒト血漿に存在する
ことが見出された（平均、6.3±1.0pg/ml：メジアン、4.7；標準偏差、2.3）。
さらに、血漿DNP−LIは、正常な対照被検体に比較して、CHFを有する19人のヒト
患者において高められたことが示された（平均、37.3±15.0pg/ml；メジアン、1
7.0；標準偏差、58.9；p＜0.05）(図２)。

【０１４４】正常な被検体及びCHFを有する患者の心筋の免疫組織化学研究 ： 免疫組織化学研究は、正常及び疾患ヒト心臓の心房心筋におけるDNP−LIの存
在を示した（図３）。DNP−LIは、心房心筋の細胞質内に観察され、そして末梢
細胞質において広く分布された。DNP−LIはまた、核周囲領域にも位置した。心
房心筋におけるDNP−LIについての免疫組織化学評点は、正常（N＝３）及び疾患
（N＝４）ヒト心臓における有意に異ならなかった（1.8±0.5対2.2±0.7）。

【０１４５】議論 ： ANP, BNP又はCNPと交差反応性を有さないDNPに対するポリクローナルウサギ抗
体を用いる、DNPについての感受性ラジオイムノアッセイを用いて、DNP−LIを正
常なヒト血漿において検出した。示される濃度は、他のナトリウム利尿性ペプチ
ドについて報告されるそれらの濃度に類似した（Mukoyamaなど., 1991; Burnett
など., 1986; Weiなど., 1993）。さらに、DNPに対するこの抗体を用いて、ヒト
心房心筋におけるDNP−LIの存在及び分布を決定した。ANP及びBNPに類似するDNP
−LIは、心房心筋の末梢細胞質において、及びまた核周囲領域において、存在し
、そして広く分布することが観察された（Weiなど., 1993）。集合的には、ヒト
血漿及び心房心筋におけるDNP−LIの存在は、ANP及びBNPのようにDNPがヒト心臓
において生成され、そして分泌され得ることを示唆する。

【０１４６】 追加の主要発見は、血漿DNP−LIが、CHFを有するヒト、特にNYHAクラスIIIはI
Vに分類された患者において高められたことであった。DNP−LIの血漿濃度のこの
上昇は、高められた心臓充填圧及び心房拡張に付随する慢性CHFにおいて活性化
されるAND及びBNPにより見出されるその上昇に類似する（Bruneauなど．，1997;
Edwardsなど., 1988）。ラット大動脈及びイヌ冠動脈におけるDNPの血管弛緩性
質、及びインビトロでのDNPによるcGMPの相乗作用と共に、ヒトCHFにおけるDNP
−LIの高められた濃度は、ANP及びBNPのように、DNP−LIの上昇が、心血管恒常
性を維持するために機能不全心臓の補足的な神経体液の応答の一部であり得る（
Schweitzなど., 1992; Wennbergなど., 1997）。さらに、血漿におけるDNP−LI
の存在は、ANP及びBNPのように、左心室機能不全における診断能力を有する（St
evensなど., 1995; Yamanotoなど., 1997; McDonaghなど., 1998）。

【０１４７】 それらの研究において報告されるDNP−LI免疫組織化学染色の心房レベルは、
正常な心房と比較して、CHFにおいては異ならなかった。この発見は、CHFにおい
て高められた循環ANPを導く不全心筋による高められた生成及び分泌の結果とし
て、正常及び不全ヒト心房心筋において類似する濃度で存在する、ANPへの類似
性を示唆する（Bruneauなど., 1997）。ヒトCHFにおける心房心筋によるDNPの生
成及び分泌は、免疫組織化学研究により検出されるように、心房におけるDNP−L
Iのいずれかの変化の不在下でDNP−LIの高められた血漿濃度を説明することがで
きる。

【０１４８】 他方では、循環DNP−LIの上昇はまた、CHFを有するヒトにおいて障害肝及び腎
機能に寄与する低められた肝及び腎クリアランスを包含する。さらに、ヘビ毒素
から単離されたDNPアミノ酸配列に対するポリクローナル抗体（ANP, BNP, CNP又
はエンドセリンに対する交差反応性を有さない）を用いる現在の研究は、ヒトの
血漿及び心房におけるDNPの存在を示唆するが、さらなる研究が、ヒトDNPをより
特異的に特徴づけ、そしてその正確な種−特異的アミノ酸配列を合成するために
必要とされる。

【０１４９】 例３： 既知のナトリウム利尿性ANP, BNP及びCNPは、有能な生物学的作用、例えばナ
トリウム排泄増加、利尿、血管拡張及び抗−有糸分裂誘発作用を有する。キメラ
ペプチド、BD−NP及びCD−NP、及びDNPのC−末端は、ANP, BNP及びCNPのいくつ
かの性質、及びいくつかのユニーク特徴を共有することができるので、BD−NP,
CD−NP及びDNPのC−末端のインビボ性質を評価した。

【０１５０】方法 ： 研究は、20〜25kgの体重の７匹の雄の雑種犬において行われた。イヌは、水道
水に自由に接近すると共に、標準のイヌ用食料（Lab Canine Diet 5006; Purina
Mills, St. Louis, MO）による正常なナトリウムダイエット下で維持された。
すべての研究は、American Physiological Societyのガイドラインに従い、そし
てMayo Clinic Animal Care and Use Committeeにより許可された。

【０１５１】 実験の前夜、300mgの炭酸リチウムを、腎細管機能の評価のために経口投与し
、そしてイヌは一晩、断食された。急性実験の日、すべてのイヌは、ペントバル
ビタールナトリウムを静脈内注射することにより（30mg/kg）、麻酔をかけた。
ペントバルビタールナトリウムの補充の非低血圧性用量を、実験の間、必要に応
じ与えた。気管挿管の後、イヌは、4L/分の補充酸素により機械的に人工呼吸さ
れた（Harvard Respirator, Harvard Apparatus, Millis, MA）。

【０１５２】 左側腹部切開を行い、そして左腎臓を、腹膜後方からのアプローチにより暴露
した。尿管にポリエチレン製カテーテル（PE−200）を挿入し、尿を集め、そし
て検量された非カニューレ性電磁気流動プローブを注意して、左腎動脈のまわり
に配置し、そして腎血流（RBF）の連続したモニターのために流量計（モデルFM5
010、（Caroline Medical Electronics, King, NC, USA）に連結した。最終的に
、左大腿静脈に、2つのポリエチレン製カテーテル（PE−240）を挿入し、ここで
１つはイヌムリンの注入のためであり、そして他の１つは本発明のペプチド、例
えばBD−NPの注入のためである。右大腿動脈に、ポリエチレン製カテーテル（PE
−240）を挿入し、直接的に動脈血圧を測定し、そして動脈血液をサンプリング
した。

【０１５３】 手術用意の完結の後、等張塩溶液に溶解されたプライミング用量のイヌリン（
INC Biomedicals, Cleveland, OH, USA）を注入し、続いて、1ml/分の一定の注
入を伴ない、40〜60mg/dlの定常状態血漿イヌリン濃度を達成した。イヌの背部
を、懸濁液に配置し、そして中断しないで６分間、平衡化した。体温は、外部を
暖めることにより（赤外加熱ランプ）、維持された。

【０１５４】 60分の平衡化期間の後、30分の基線クリアランス（基線）を行った。これに続
いて、15分の誘導部（Lead−in）が伴ない、この間、10ng/kg/分でのBD−NP注入
が静脈から開始され、この後、第２の30分間のクリアランスが行われた。第２ク
リアランスの期間の後、BD−NPの静脈内注入を、50ng/kg/分に変えた。BD−NPの
この用量による15分間の導入部期間の後、30分間のクリアランスを行った。第３
のクリアランスの最後で、注入を停止し、そして30分の洗浄期間、続いて40分の
回収クリアランス（回収）が伴なう。

【０１５５】分析方法 ： 電解質及びイヌリン測定のための血漿を、ヘパリン処理された管に集められた
血液から得た。リチウムを含む、血漿及び尿電解質を、火炎−発光分光計（IL94
3、Flame Photometer; Instrumentation Laboratory, Lexington, MA）により測
定した。血漿及び尿イヌリン濃度を、アントロン方法により測定し、そして糸球
体濾過速度（GFR）を、イヌリンのクリアランスにより測定された。リチウムク
リアランス技法が、ナトリウムの近位及び遠位分別再吸収性を評価するために使
用された。近位分別再吸収は、次の式：［１−（リチウムクリアランス/GFR）］
×100により計算された。ナトリウムの遠位分別再吸収は、次の式により計算さ
れた：［（リチウムクリアランス−ナトリウムクリアランス）/リチウムクリア
ランス］×100。 血漿及び尿cGMPを、Steinerなど. (1972) の方法を用いて、ラジオイムノアッ
セイにより測定した。cGMP測定のための尿を、−20℃での貯蔵の前、90℃に加熱
し、分解性酵素活性を阻害した。

【０１５６】結果 ： 最初の研究においては、BNPのコアー構造及びDNPのC−末端を有する、経口投
与されるBD−NPの心腎及び体液作用を評価した。心腎及び内分泌機能に対するBD
−NPの治療可能性を、７匹の正常な麻酔されたイヌにおいて決定した。静脈内BD
−NPは、10及び50ng/kg/分で、基線測定の後、注入された。

【０１５７】 BD−NPの投与は、MAP（133±５から123±４及び106±3^★mmHg;^★p＜0.05対基
線）、RAP（3.0±0.4から1.8±0.3^★及び1.2±0.3^★mmHg）、PAP（16.6±0.7か
ら15.1±0.5^★及び12.4±0.3^★mmHg）、及び肺毛細管ウェッジ圧力（PCWP）（5.
3±0.4から3.6±0.4^★及び2.0±0.4^★mmHg）の低化をもたらした。糸球体濾過速
度（GFR）は、腎血流（RBF）の変化を伴わないで、上昇した（30±2から45±4^★ 及び45±4^★ml/分）。

【０１５８】 従って、BD−NPは、有意な利尿効果（UV：0.24±0.1から1.12±0.3及び2.17±
0.5^★ml/分）、及びナトリウム排泄増加効果（UNaV：12.7±８から105.1±44^★
及び181.7±52^★mEg/分）、並びに、ナトリウムの近位分別再吸収（PFRNa） の
低下（84.9±4.3から66.5±3.8^★及び59.0±4.1±^★％）を有した。BD−NP投与
の間、血漿cGMP（11±1.5から26±2.5^★及び45±4.9^★pモル/ml）及び尿cGMP排
泄（1414±164から3044±269及び10840±1872^★Pモル/分）は、著しく増大した
。両用量のBD−NPは、血漿レニン活性を有意に低めた（8.9±１から3.9±0.6^★
及び5.1±1.1^★ng/ml/時）。

【０１５９】 従って、BD−NPは、心臓充填圧力を下げ、利尿及びナトリウム排泄増加を増大
し、そしてレニン−制御作用を有する。それらの発見は、CHFの処理において、
このキメラペプチドのための可能な役割を支持する。

【０１６０】 CNPのコア構造及びDNPのC−末端を共有する第２ペプチド、すなわちCD−NPを
、異なったグループのイヌにおいて、但し同じ実験条件下で試験した。同じ用量
（10及び50ng/kg/分）でのCD−NPの投与は、MAP（135から133及び125mmHg）, RA
P（3.0から2.8及び2.0mmHg）, PAP（13.5から13.0及び12.5mmHg）及びPCWP（8.0
から6.0及び5.0mmHg）の低下、及びSFRの上昇（38から47及び49ml/分）をもたら
した。それらの変化は、低用量のDNPの投与の間、全身性血管耐性の低下に関連
した（SVR：39から33mmHg/分）。

【０１６１】 CD−NPは利尿効果（UV：0.14から0.27及び1.01ml/分）及びナトリウム排泄増
加効果（UnaV：3.4から14.2及び63.8μEg/分）を有し、そしてPFRNaの低下（87
から73および61％）が伴った。CD−NP投与の間、血漿cGMP（11から15及び35pモ
ル/ml）及び尿cGMP排泄（1931から2844及び7551pモル/分）が著しく上昇した。
したがって、CD−NPの投与は、心臓充填圧力を効果的に下げ、そして利尿及びナ
トリウム排泄増加効果を増強する。それらの作用は、cGMPシステムの活性化に関
連する。

【０１６２】 第３ペプチド、すなわちDNPのC−末端を、正常の麻酔されたイヌのもう１つの
グループにおいてインビボ試験した。DNPのC−末端の投与（同じ用量）は、利尿
効果（UV：0.55から0.70及び1.83ml/分）及びナトリウム排泄増加（UNaV：64か
ら75及び123μEg/分）、及びPFRNaの低下（67から58及び56％）をもたらした。
高い用量の投与の間、GFRの上昇が存在した（36から36及び41ml/分）。DNPのC−
末端のそれらの効果は、血漿cGMP（７から11及び12pモル/ml）及び尿cGMP排泄（
1538から1842及び1786pモル/分）の上昇に関連するが、しかし心血管血行力学の
変化が観察された。しかしながら、両用量のDNPのC−末端は、血漿レニン活性を
低めた（4.0から1.8及び1.9ng/ml/時）。従って、C−末端DNPは、イヌに投与さ
れる場合、ナトリウム排泄増加、利尿及びレニン−抑制性質を有する。

【０１６３】 例４：方法 ： CHFにおける本発明のペプチドの心腎及び内分泌性質を決定するために、軽いC
HF及び明白なCHFについての動物モデルを用いた。研究は、雄の雑種犬の３種の
グループにおいて行われた。第１グループは、正常なイヌから成り（正常；ｎ＝
５）、第２グループは180bpmで10日間、急速な心室ペースにより誘発された軽い
心不全を有すイヌから成り（軽いCHF；ｎ＝７）、そして第３グループは、245bp
mで10日間、急速な心室ペースにより誘発された明白な心不全を有するイヌから
成る（明白なCHF；ｎ＝７）。イヌは、自由に水道水に近づけると共に、固定さ
れたナトリウムダイエットに基づいて維持される（Hill’s Prescription Diet,
イヌi/d）。すべての研究は、American Physiological Societyのガイドライン
に従い、そしてMaya Clinic Animal Care and Use Committeeにより許可された
。

【０１６４】 ペースマーカーの移植： 第２及び第３グループからのイヌはまず、プロトコールの２週間前、ペントバ
ルビタールナトリウム（30mg/kg, i.v.）を用いて麻酔をかけられる。気管挿管
の後、イヌは、4L/分の補充酸素によりHarvard Respirator (Harvard Apparatus
, Millis, MA) を用いて、機械的に換気される。心外膜誘導（Medtronic, Minne
apolis, MN）を、１〜２cmの心膜切開と共に左開胸を通して右の心室上に移植す
る。ペースマーカー誘導を、パルス発生機（Medtronic, Minneapolis, MN, モデ
ル8329）に連結し、次に胸壁に皮下移植する。

【０１６５】 ペースの捕獲は、胸腔を閉じる前、内部手術により確かめられる。心膜を、そ
の心膜の解剖を曲げないで、非常に注意して縫合する。次に胸腔、深い及び表面
の切開を、層ごとに閉じる。イヌは、225mgのクリンダマイシン（皮下）、及び4
00,000UのプロカインペニシリンG及び500mgのジヒドロストレプトマイシン（筋
肉内）（Combiotic, Pfizer, Inc., New York, NY）による前及び後手術予防抗
生物質を受ける。その予防抗生物質処理は、最初の２回の後手術日を通して続け
られる。

【０１６６】 14日間の後−手術回復期間の後、軽いCHFは、10日間の180kpmでの急速な心室
ペーシングにより生成される。明白なCHFは、10日間の245bpmでの急速な心室ペ
ーシングにより生成される。

【０１６７】急性プロトコール ： 次の急性プロトコールを、すべての３種のグループにおいて行う。急性実験の
前夜、動物は断食され、腎尿細管機能の評価のために300mgの炭酸リチウムを与
えられ、そして水には自由に接近される。急性実験の日（心不全グループにおけ
るペーシングの11日目）、すべてのイヌは、ペントバルビタールナトリウムの静
脈内投与（15mg/kg）により、麻酔される。補足の非低血圧用量のペントバルビ
タールナトリウムが、実験の間、必要により与えられる。気管挿管の後、イヌは
、4L/分の補充酸素により機械的に換気される（Harvard Respirator, Millis, M
A）。流れ−指図されたバルーン先端の熱希釈カテーテル（Ohmeda, Criticath,
Madison, WI）を、心臓血流力学測定のために外部頸静脈を通して肺動脈中に挿
入する。左側腹切開で行い、そして左腎臓を、腹膜後部からのアプローチにより
暴露する。

【０１６８】 尿管にポリエチレン製カテーテル（PE−240）を挿入し、尿を集め、そして検
量された非カニューレ性電磁気流動プローブを注意して、左腎動脈のまわりに配
置し、そして腎血流（RBF）の連続したモニターのために流量計（モデルFM5010
、（Caroline Medical Electronics, King, NC, USA）に連結した。最終的に、
左大腿静脈に、2つのポリエチレン製カテーテル（PE−240）を挿入し、ここで１
つはイヌムリンの注入のためであり、そして他の１つは本発明のペプチド−（NP
）の注入のためである。

【０１６９】 右大腿動脈に、ポリエチレン製カテーテル（PE−240）を挿入し、直接的に動
脈血圧を測定し、そして動脈血液をサンプリングした。手術用意の完結の後、等
張塩溶液に溶解されたプライミング用量のイヌリン（INC Biomedicals, Clevela
nd, OH, USA）を注入し、続いて、1ml/分の一定の注入を伴ない、40〜60mg/dlの
定常状態血漿イヌリン濃度を達成した。イヌの背部を、懸濁液に配置し、そして
中断しないで６分間、平衡化した。体温は、外部を暖めることにより（赤外加熱
ランプ）、維持された。

【０１７０】 60分の平衡化期間の後、30分の基線クリアランス（基線）を行った。これに続
いて、15分の誘導部（Lead−in）が伴ない、この間、10ng/kg/分でのNP注入が静
脈から開始され、この後、第２の30分間のクリアランスが行われた。第２クリア
ランスの期間の後、BD−NPの静脈内注入を、50ng/kg/分に変えた。NPのこの用量
による15分間の導入部期間の後、30分間のクリアランスを行った。第３のクリア
ランスの最後で、注入を停止し、そして30分の洗浄期間、続いて40分の回収クリ
アランス（回収）が伴なう。

【０１７１】解析方法 ： 急性実験の間に測定される心血管パラメーターは、平均動脈圧（MAP）、右心
房圧（RAP）、肺動脈圧（PAP）、心臓出力（CO）及び肺毛管圧（PCWP）を包含す
る。COは、熱希釈により三重反復して決定され、そして平均が取られる（Cardia
c Outputコンピューター、モデル9510−A、Amrican Edwards Laboratories, Irv
ine, CA）。MAPを、大腿動脈カテーテルからの直接的な測定により評価する。全
身性血管耐性（SVR）を、［SVR＝（MAP−RAP）/CO］として計算する。肺血管耐
性（PVR）を、［PVR＝（PAP−PCWP）/CO］として計算する。

【０１７２】 電解質及びイヌリン測定のための血漿を、ヘパリン処理された管に集められた
血液から得た。リチウムを含む、血漿及び尿電解質を、火炎−発光分光計（IL94
3、Flame Photometer; Instrumentation Laboratory, Lexington, MA）により測
定した。血漿及び尿イヌリン濃度を、アントロン方法により測定し、そして糸球
体濾過速度（GFR）を、イヌリンのクリアランスにより測定された。リチウムク
リアランス技法が、ナトリウムの遠位分別再吸収性を評価するために使用された
。

【０１７３】 近位分別再吸収は、次の式：［１−（リチウムクリアランス/GFR）］×100に
より計算された。ナトリウムの遠位分別再吸収は、次の式により計算された：［
（リチウムクリアランス−ナトリウムクリアランス）/リチウムクリアランス］
×100。腎血管耐性（RVR）は、［RVR＝（MAP−RAP）/RBF］として計算される。
血漿及び尿cGMPは、Steinerなど. (1972) を用いて、ラジオイムノアッセイによ
り測定される。cGMP測定のための尿を、分解性酵素活性を阻害するために−20℃
で貯蔵する前、90℃に加熱する。 血漿及び尿NPを、NP投与の前、間及び後、ラジオイムノアッセイを用いて決定
する（Lisyなど., 1999a及びSchirgerなど., 1999）。

【０１７４】合成DNP投与についての結果 ：基線特徴 ： すべての３種のグループの基線特徴は、第４表に報告されている。軽いCHFに
おいては、MAP及びCOは低められ、そしてRAP及びPCWPは高められた。GFR及びUNa
Vは低められたが、ところが血漿ANPは高められた。明白なCHFにおいては、それ
らのパラメーターは、RAP、PAP及びPCWPのさらなる上昇及びUNaVの著しい低下に
関連して、同様に変えられた。図10に示されるように、外因性DNPの注入の前、
軽い及び明白なCHFにおけるDNP−LIの基線レベルは、正常におけるDNPの血漿レ
ベルよりも高かった。

【０１７５】

【表５】

【０１７６】 MAPは平均動脈圧を意味し； COは心臓出力を意味し；SVRは全身性血管耐性を
意味し；RAPは右心房圧を意味し；PAPは肺動脈圧を意味し；PCWPは肺毛管圧を意
味し；GFRは糸球体濾過速度を意味し；UNaVは尿ナトリウム排泄を意味し；ANPは
心房ナトリウム利尿性ペプチドを意味し；PRAは血漿レニン活性を意味する。★
：P＜0.05対正常；†：P＜0.05対軽いCHF。

【０１７７】DNP投与の間の心血管血流力学 ： DNA投与の前及び間での心血管血流力学が、第５表に報告されている。

【表６】 PVR：肺血管耐性。★：P＜0.05対基線。

【０１７８】 DNP投与は、軽いCHFにおけるMAPの低下傾向を伴って、正常及び明白なCHFにお
ける高い用量のDNAの投与の間、MAPの低下をもたらした。明白なCHFにおいては
、DNPの低血圧作用が維持されたが、MAPは、正常及び明白なCHFにおけるDNPの投
与の後、基線に戻った。COは、DNP注入の間、正常においては低下し、ところが
軽い及び明白なCHFにおいては、COは保存された。RAP, PCWP及びPAPは、すべて
のグループにおいて、特に基線ですでに著しく高められている両CHFグループに
おいて低下した。DNP投与の間、両CHFグループにおいて、SVR及びPVRの低下する
傾向が存在した。

【０１７９】 DNPの投与の間、CO, SVR, RAP及びPCWPにおける最大変化が図11に示されてい
る。パネルAは、正常に比較して、両CHFグループにおけるCOの有意な上昇傾向を
報告する。パネルBは、軽い及び明白なCHFにおけるSRVの有意な下降傾向を示す
。DNPに応答してのすべての３種のグループにおける心臓充填圧力の低下が、パ
ネルC及びDに報告されている。

【０１８０】DNP投与の間の腎血流力学及び排泄機能 ： 第６表は、DNP投与の間の腎血流力学及び排泄機能を報告する。

【表７】 RBF：腎血流；RVR：腎血管耐性；UV：尿の流れ；PFRNa：ナトリウムの近位分別
再吸収；DFRNa：ナトリウムの遠位分別再吸収。★：P＜0.05対基線。

【０１８１】 軽い及び明白なCHFにおけるDNP投与は、RBFの変化の不在下で、正常において
観察されない作用GFRを高めた。DNPは、高い用量のDNPの間、正常、軽い及び明
白なDHFグループにおいて、UNaVを低めた。DNPのナトリウム排泄増加作用は明白
なCHFにおいて弱められたが、ナトリウム排泄の上昇が、明白なCHFにおけるMAP
の有意な低下にもかかわらず、生じた。高用量のDNPはまた、すべてのグループ
において有意な利尿応答をもたらした。軽い及び明白なCHFにおいては、DNPはPF
RNaを低めたが、ところがDFRNaは正常においては低下した。

【０１８２】DNP投与の間の体液機能 ： 第７表は、DNP投与に対する体液応答を報告する。

【表８】 UDNPV：尿DNP排泄；cGMP: サイクリックグアノシン一リン酸；UcGMPV：尿cGMP排
泄；ANP：心房ナトリウム利尿性ペプチド。★：P＜0.05対基線。

【０１８３】 血漿及び尿DNPは、すべてのグループにおいて、DNPの投与の間、上昇した。DN
Aはすべてのグループにおいて血漿cGMPを有意に高めたが、ところが尿cGMP排泄
の上昇は、高用量のDNPの投与の間のみ、有意であった。血漿ANP又はBNPは、３
種のグループのいずれにおいても、DNPの投与の間、上昇しなかった。低用量のD
NPは、正常及び明白なCHFにおいてPRAの有意な低下をもたらした。 さらに、高用量のDNPでの血漿cGMP/血漿DNPの比が、すべての３種のグループ
に関して計算された（図12）。その比は、CHFにおいてDNPによる増強されたcGMP
生成を支持する正常に比較して、CHFグループに関してより高かった。

【０１８４】議論 ： 現在の研究は、実験の軽い及び明白なCHFにおけるDNPの外因性投与が、有益な
心血管、腎及び体液作用を有することを示す。特に、軽い及び明白なCHFにおけ
るDNPは、著しく高められた心臓充填圧力及び保存された心臓出力を低めた。第
２に、DNPは、腎血流における変化の不在下でCHFにおける糸球体濾過速度を高め
た。さらに、DNAはナトリウム利尿性であるが、但し、この作用は明白なCHFにお
いて弱められた。ナトリウム排泄増加はまた、腎灌流圧を低めるにもかかわらず
、ナトリウムの近位尿細管再吸収の低下に関連していた。腎作用はさらに、明白
なCHFにおいて低用量血漿レニン活性の低下に関連していた。最終的に、DNPの作
用は、CHFにおいて血漿cGMPを高める増強された強力に関連していた。

【０１８５】 主要発見は、著しく高められた心臓充填圧力を低めるDNPの能力であった。こ
の作用は、心臓出力を高める傾向、及び正常において見出されない全身性血管耐
性を低める傾向に関連していた。そのような急性血流力学応答は、適度の末梢動
脈拡張に関連する前負荷の低下と最も一致する。心臓充填圧力の低下がすぐに生
じ、そして従って、たぶん、腎ナトリウム排泄増加応答に関係しない直接的な血
管作用のためであった。さらに、血漿ANPは低められた心房拡張に続く低められ
た分泌と一致して低下する傾向があったので、観察される血流力学作用は、ANP
における間接的上昇により仲介されなかった。

【０１８６】 軽い及び明白なCHFにおけるDNPの投与はGFRを独得に高められたが、その作用
は正常においては観察されなかった。腎血流の上昇の不在下で、DNPの糸球体作
用は、求心性細動脈拡張及び遠心性細動脈収縮、及び/又は濾過係数を高めるた
めの直接的な作用により説明され得る。高用量のDNPはすべてのグループにおい
て有意にナトリウム利尿性であった。DNPのナトリウム排泄増加作用は明白なCHF
において弱められたけれど、ナトリウム排泄の上昇が、平均動脈圧の有意な低下
にもかかわらず、生じた。

【０１８７】 さらに、ナトリウム排泄増加作用は、リチウムクリアランス技法により決定さ
れる場合、ナトリウム近位再吸収の低下と関連していた。特にGERにおけるこの
腎応答は、明白な実験的CHFの特徴が外因的に投与されたANPに対して腎低応答で
あるので、重要である（Caveroなど., 1990）。高用量のDNPはまた、すべてのグ
ループにおいて有意な利尿応答をもたらした。従って、CNPの腎作用は、腎灌流
圧のさらなる低下、GFR上昇、及びナトリウム排泄増加及び利尿の両者に関して
低められたナトリウム近位再吸収にもかかわらず、ユニークであると思われる。

【０１８８】 正常なヒト血漿におけるDNP−LIは、平均6pg/mlであり、そして2〜11pg/mlの
範囲である。ヒトCHF（NYHA III又はIV）においては、血漿DNP−LIは平均37pg/m
lであり、そして3〜200pg/mlの範囲である。特異的且つ敏感なラジオイムノアッ
セイを用いる場合、正常なイヌ血漿DNP−LIは平均6pg/mlであり、そして4〜7pg/
mlの範囲である。イヌ実験CHFにおいては、血漿DNP−LIは平均12pg/mlに高めら
れ、そして平均は9〜15pg/mlである。CHFにおけるDNPの血漿濃度は、ANP及びBNP
について報告されるそれらの濃度よりも低いが、しかしCNPについて報告される
それらの濃度よりも高い（Burnettなど., 1986; Weiなど., 1993）。

【０１８９】 DNA投与についての２種の異なった用量が、CHFにおけるDNFの効果的治療作用
を定義する広範囲の血漿濃度を確立するために選択される。重要なことには、10
ng/kg/分のより低い用量のDNPが、正常及びCHFグループにおいて約300pg/mlの循
環濃度を達成し、これはヒト心不全において観察される濃度の上限範囲近くであ
り、そして従って、病理生理学的であると思われ得る。50ng/kg/分のより高い用
量は、DNPの薬理学的作用を明確に確立する。

【０１９０】 この用量を用いる場合、DNPの血漿濃度は、正常において約3,000pg/mlを達成
したが、しかし両CHFグループにおいては、わずか1,000pg/mlである。CHFにおい
て注入の間に達成されるDNPの低められた血漿レベルは、注入されたDNPの半減期
が低められ、このことは、変更されたクリアランス機構に影響を及ぼすことを示
唆する。注入の間、CHFにおいて達成される低レベルのDNPにもかかわらず、DNP
に対する組織応答が、血漿cGMP：血漿DNPの比の上昇により示唆されるように、
保存され、そしてたぶん、増強される（図12）。

【０１９１】 ANPは、正常及びヒトCHFにおいてレニン−阻害性であることが報告されている
が、ところが心不全における阻害効果は弱められる（Richardsなど., 1988; Nic
holls, 1994）。DNPは、低用量のDNPのPRAを低める能力が正常及びまた、明白な
CHFにおいて観察されたので、この作用を共有する。対照的に、この作用は、正
常、及びBNPがPRAを抑制しないCHFイヌにおいて外因性BNPの短期投与の間、見出
されない（Clavellなど., 1993）。そのようなレニン阻害作用は、既知のレニン
刺激、例えば心房圧及び腎灌流圧力の低下の存在にもかかわらず、発生した。

【０１９２】 DNPの外因性投与の治療可能性がさらに、腎機能、特に糸球体濾過速度の保存
が重どのCHFを有する患者における生存性の最も重要な決定因子であった、CHFに
おける臨床試験の報告により支持される（Girbesなど., 1998）。さらに、このG
FR増強作用は、ナトリウム排泄増加、利尿及びレニン阻害性質に関して、著しく
高められた心臓充填圧力を低めるDNPの能力に関係した。それらの作用はさらに
、cGMP第２メッセンジャシステムを活性化するDNPの保存された能力に関係した
。

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【０１９９】 すべての出版物、特許及び特許出願は引用により本明細書に組み込まれる。前
述の記載において、本発明はその好ましい態様で記載され、そして多くの詳細が
例示目的のために示されて来たが、当業者は追加の態様が可能であり、そして本
発明の範囲内で相当に変更され得ることは、明らかであろう。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、心房（ANP、28個のアミノ酸）、脳（BNP、32個のアミノ酸）、C−型
（CNP、22個のアミノ酸）及びデンドロアスピス（38個のアミノ酸）のナトリウ
ム利尿性ペプチドのアミノ酸構造を示す。

【図２】 図２は、正常なヒト志願者（N＝19）及び心不全を有するヒト（N＝19）におけ
る血漿デンドロアスピス ナトリウム排泄増加ペプチド様免疫反応性のボックス
−ブロットである（クラスNYHA III及びIV；Schirgerなど., 1999）。中間の水
平線＝平均；垂直棒＝平均の標準誤差。

【図３】 図３は、デンドロアスピス ナトリウム利尿性ペプチドについての免疫染色を
示す。左：正常なヒト心臓。中央：うっ血性心不全（CHF）を有するヒト。右：
中央のパネルに示されるのと同じ心臓からの非免疫応答血清（NRS）による染色
（最初の倍率、400倍）。

【図４】 図４は、本発明の典型的なペプチドのアミノ酸配列（配列番号１−３）を示す
。

【図５】 図５は、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）によるBD−NPの検出を示す。

【図６】 図６は、HPLCによるCD−NPの検出を示す。

【図７】 図７は、HPLCによるDNPのC−末端の検出を示す。

【図８】 図８は、種々のアミノ酸についてのコドンを示す。

【図９】 図９は、典型的且つ好ましいアミノ酸置換を示す。

【図１０】 図10は、外因性DNPの注入の前、正常、軽いCHF及び明白なCHFイヌにおけるDNP
の基線血漿レベルを示す。開放棒は正常を表し、斜線棒は軽いCHFを表し、そし
て斜線に満たされた棒は明確なDHFを表す。値は、平均±SEMとして表される。★
：P＜0.05対正常。

【図１１】 図11は、DNPの投与の間、心臓出力−ΔCO（A）、全身性血管耐性−ΔRAP（C）
、及び肺毛管圧−ΔPCWP（D）における最大変化を示す。開放棒は正常を表し、
斜線の棒は軽いCHFを表し、そして斜線に満たされた棒は明白なCHFを表す。値は
平均±SEMとして表される。★：P＜0.05対正常。

【図１２】 図12は、正常、軽いDHF及び明白なCHFイヌにおける高用量DNPに関する、血漿c
GMP/血漿DNPの比を示す。開放棒は正常を表し、斜線の棒は軽いCHFを表し、そし
て斜線により満たされた棒は、明白なCHFを表す。値は、平均±SEMとして表され
る。★：P＜0.05対正常。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/08 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 7/08 Ｃ０７Ｋ 7/08 Ａ６１Ｋ 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 リシー，オンドレー アメリカ合衆国，ミネソタ 55901，ロチ ェスター，サーティエイス ストリート ノースウエスト 1857 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA07 BA01 BA08 BA18 BA19 BA23 BA26 CA18 CA28 DB02 MA01 NA14 ZA372 ZA392 ZA832 ZC202 ZC212 4H045 AA10 AA30 BA17 BA19 CA40 DA32 EA26 EA27 FA34 【要約の続き】

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 デンドロアスピスナトリウム利尿性ペプチドの生物学的活性
   部分を含んで成る単離され、そして精製されたペプチド、又はその変異体。
2. 【請求項２】 前記ペプチドが、血管拡張、ナトリウム排泄増加、利尿及び
   レニン−抑制活性から成る群から選択された少なくとも１つの活性を有する請求
   項１記載のペプチド。
3. 【請求項３】 デンドロアスピスナトリウム利尿性ペプチドではないナトリ
   ウム利尿性ペプチドの少なくとも一部をさらに含んで成る請求項１記載のペプチ
   ド。
4. 【請求項４】 デンドロアスピスナトリウム利尿性ペプチドを含んで成る前
   記ペプチドの一部が、そのペプチドのカルボキシ−末端で存在する請求項３記載
   のペプチド。
5. 【請求項５】 デンドロアスピスナトリウム利尿性ペプチドではない前記ナ
   トリウム排泄増加ペプチドが、脳ナトリウム利尿性ペプチドである請求項３記載
   のペプチド。
6. 【請求項６】 デンドロアスピスナトリウム利尿性ペプチドではない前記ナ
   トリウム排泄増加ペプチドが、C−型ナトリウム排泄性ペプチドである請求項３
   記載のペプチド。
7. 【請求項７】 配列番号３を含んで成る請求項１記載のペプチド。
8. 【請求項８】 配列番号１を含んで成る請求項３記載のペプチド。
9. 【請求項９】 配列番号２を含んで成る請求項３記載のペプチド。
10. 【請求項１０】 哺乳類における心不全を阻害するか又は予防する方法であ
    って、医薬的に許容できる供給ビークル中、有効量の請求項１記載のペプチドを
    前記哺乳類に投与することを含んで成る方法。
11. 【請求項１１】 前記ペプチドが非経口投与される請求項10記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記ペプチドが、配列番号１を含んで成る請求項10記載の
    方法。
13. 【請求項１３】 前記ペプチドが、配列番号２を含んで成る請求項10記載の
    方法。
14. 【請求項１４】 前記ペプチドが、配列番号３を含んで成る請求項10記載の
    方法。
15. 【請求項１５】 前記投与が局部的である請求項10記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記投与が全身的である請求項10記載の方法。
17. 【請求項１７】 式：(H)-Pro-Ser-Leu-Arg-Asp-Pro-Arg-Pro-Asn-Ala-Pro-
    Ser-Thr-Ser-Ala-(R)（配列番号３）［式中、RはOH, NH₂, NHR³又はN(R³)(R⁴)で
    あり、ここでR³及びR⁴は独立して、フェニル又は（C₁-C₄）アルキルである］で
    表されるペプチド化合物、又は医薬的に許容できるその塩。
18. 【請求項１８】 式：(H)-Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-Cys-Phe-
    Gly-Arg-Lys-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Pro-Ser-Leu-
    Arg-Asp-Pro-Arg-Pro-Asn-Ala-Pro-Ser-Thr-Ser-Ala-(R)（配列番号１）［式中
    、RはOH, NH₂, NHR³又はN(R³)(R⁴)であり、ここでR³及びR⁴は独立して、フェニ
    ル又は（C₁-C₄）アルキルであり：そして前記２個のCys残基はジスルフィド結合
    により結合される］で表されるペプチド化合物、又は医薬的許容できるその塩。
19. 【請求項１９】 式：(H)-Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Asp-
    Arg-Ile-Gly-Ser-Met-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Pro-Ser-Leu-Arg-Asp-Pro-Arg-Pro-
    Asn-Ala-Pro-Ser-Thr-Ser-Ala-(R)［式中、RはOH, NH₂, NHR³又はN(R³)(R⁴)であ
    り、ここでR³及びR⁴は独立して、フェニル又は（C₁-C₄）アルキルであり：そし
    て前記２個のCys残基はジスルフィド結合により結合される］で表されるペプチ
    ド化合物、又は医薬的に許容できるその塩。
20. 【請求項２０】 医薬的に許容できるキャリヤーと共に、治療的に有効量の
    請求項17、18又は19記載の化合物、又はその組み合わせを含んで成る、ナトリウ
    ム利尿剤、利尿剤、レニン−抑制剤又は血管拡張剤として有用な組成物。
21. 【請求項２１】 哺乳類における心不全を処理するための方法であって、医
    薬的に許容できる供給ビークル中、有効量のデンドロアスピスナトリウム利尿性
    ペプチド、生物学的活性変異体又はその一部を、哺乳類に投与することを含んで
    成る方法。
22. 【請求項２２】 前記哺乳類が、ヒト、ラット、マウス、イヌ、ウシ、ウマ
    、羊、ヤギ又はネコである請求項21記載の方法。
23. 【請求項２３】 医学的治療への使用のためのデンドロアスピスナトリウム
    利尿性ペプチドの生物学的活性部分を含んで成るペプチド、又はその変異体。
24. 【請求項２４】 前記ペプチドが、血管拡張、ナトリウム排泄増加、利尿及
    びレニン−抑制活性から成る群から選択された少なくとも１つの活性を有する請
    求項23記載のペプチド。
25. 【請求項２５】 デンドロアスピスナトリウム利尿性ペプチドではないナト
    リウム利尿性ペプチドの少なくとも一部をさらに含んで成る請求項23記載のペプ
    チド。
26. 【請求項２６】 デンドロアスピスナトリウム利尿性ペプチドを含んで成る
    前記ペプチドの一部が、そのペプチドのカルボキシ−末端で存在する請求項23記
    載のペプチド。
27. 【請求項２７】 デンドロアスピスナトリウム利尿性ペプチドではない前記
    ナトリウム排泄増加ペプチドが、脳ナトリウム利尿性ペプチドである請求項25記
    載のペプチド。
28. 【請求項２８】 デンドロアスピスナトリウム利尿性ペプチドではない前記
    ナトリウム排泄増加ペプチドが、C−型ナトリウム排泄性ペプチドである請求項2
    5記載のペプチド。
29. 【請求項２９】 配列番号３を含んで成る請求項23記載のペプチド。
30. 【請求項３０】 配列番号１を含んで成る請求項25記載のペプチド。
31. 【請求項３１】 配列番号２を含んで成る請求項25記載のペプチド。