KR101581476B1 - 나트륨이뇨성 폴리펩티드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 나트륨이뇨성 폴리펩티드를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 나트륨이뇨 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공한다. 일부 경우에서, 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드는 나트륨이뇨 활성을 갖는 한편, 혈압 강하능은 결여될 수 있다. 본 발명은 또한 포유동물 내에서 나트륨이뇨 활성을 유도하기 위한 방법 및 물질을 제공한다.
Description
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2007년 7월 20일 출원된 미국 가출원 제60/951,117호를 우선권으로 주장한다.
주정부
지원 연구에 관한 진술
본 발명은 미국 정부 산하 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소에서 수여하는 HL036634 보조금을 지원받아 수행되었다. 미정부는 본 발명에 대한 일정 권리를 갖는다.
기술분야
본 발명은 나트륨이뇨성 폴리펩티드에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명은 나트륨이뇨성 폴리펩티드와 관련된 방법 및 물질, 및 심혈관성 병태 및 신장 병태를 치료하기 위한 나트륨이뇨성 폴리펩티드의 용도를 제공한다.
나트륨이뇨성 펩티드는 나트륨뇨 배설 항진(나트륨의 요배출 증가)을 일으킬 수 있는 폴리펩티드이다. 이러한 폴리펩티드는 뇌, 심장, 신장 및/또는 혈관 조직에서 생성될 수 있다.
본 발명은 나트륨이뇨성 폴리펩티드에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명은 나트륨이뇨성 폴리펩티드와 관련된 물질 및 방법, 및 심혈관성 병태, 신장 병태 또는 심혈관성 병태와 신장 병태 둘 모두를 치료하기 위한 나트륨이뇨성 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다. 일부 경우에서, 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드는 이뇨 활성, 나트륨이뇨 활성, cGMP 활성화능, 사구체 여과율 증가능, 레닌 생성 감소능, 안지오텐신 생성 감소능, 알도스테론 생성 감소능, 비정상으로 상승된 심장 충만압 감소능, 신장 혈류 최적화능 또는 이의 조합을 가질 수 있다. 일부 경우에서, 본 발명에서 제공하는 내생성 ANP, BNP 및 CNP 수준을 증가시킬 수 있다. 일부 경우에서, 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드는 혈압 강하능이 결여될 수 있고 전신성 저혈합증을 야기하는 능력이 없을 수 있다. 일부 경우에서, 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드는 나트륨이뇨성 펩티드 수용체-A, 나트륨이뇨성 펩티드 수용체-B, 또는 나트륨이뇨성 펩티드 수용체-A와 나트륨이뇨성 펩티드 수용체-B 둘 모두에 대한 작동제일 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 일 측면은 길이가 44 아미노산 잔기 이하인 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 이 폴리펩티드는 아미노 말단에서부터 카르복시 말단의 순으로, (a) 서열 번호 1에 기재된 서열, 또는 부가, 결실 또는 치환이 3개를 넘지 않는 서열 번호 1에 기재된 서열, (b) 서열 번호 2에 기재된 서열, 또는 부가, 결실 또는 치환이 5개를 넘지 않는 서열 번호 2에 기재된 서열, 및 (c) 서열 번호 3에 기재된 서열, 또는 부가, 결실 또는 치환이 3개를 넘지 않는 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 나트륨이뇨 활성을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 전신성 저혈압증을 유도하는 능력이 없다. 상기 폴리펩티드는 서열 번호 1에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 서열 번호 2에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 서열 번호 1에 기재된 서열, 서열 번호 2에 기재된 서열 및 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 보존성 아미노산 치환이 3개를 넘지 않는 서열 번호 1에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 보존성 아미노산 치환이 5개를 넘지 않는 서열 번호 2에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드 보존성 아미노산 치환이 3개를 넘지 않는 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 실질적으로 순수한 폴리펩티드일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 길이가 44 아미노산 잔기 이하인 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산을 특징으로 하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 아미노 말단에서부터 카르복시 말단 순으로 (a) 서열 번호 1에 기재된 서열, 또는 부가, 결실 또는 치환이 3개를 넘지 않는 서열 번호 1에 기재된 서열, (b) 서열 번호 2에 기재된 서열, 또는 부가, 결실 또는 치환이 5개를 넘지 않는 서열 번호 2에 기재된 서열, 및 (c) 서열 번호 3에 기재된 서열, 또는 부가, 결실 또는 치환이 3개를 넘지 않는 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 나트륨이뇨성 활성을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 전신성 저혈압증을 유도하는 능력이 없다. 상기 폴리펩티드는 서열 번호 1에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 서열 번호 2에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 서열 번호 1에 기재된 서열, 서열 번호 2에 기재된 서열 및 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 보존성 아미노산 치환이 3개를 넘지 않는 서열 번호 1에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 보존성 아미노산 치환이 5개를 넘지 않는 서열 번호 2에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 보존성 아미노산 치환이 3개를 넘지 않는 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 실질적으로 순수한 폴리펩티드일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 길이가 44 아미노산 잔기 이하인 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 특징으로 하며, 여기서 상기 폴리펩티드는, 아미노 말단에서부터 카르복시 말단의 순으로, (a) 서열 번호 1에 기재된 서열, 또는 부가, 결실 또는 치환이 3개를 넘지 않는 서열 번호 1에 기재된 서열, (b) 서열 번호 2에 기재된 서열, 또는 부가, 결실 또는 치환이 5개를 넘지 않는 서열 번호 2에 기재된 서열, 및 (c) 서열 번호 3에 기재된 서열, 또는 부가, 결실 또는 치환이 3개를 넘지 않는 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 나트륨이뇨 활성을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 전신성 저혈압증을 유도하는 능력이 없다. 상기 폴리펩티드는 서열 번호 1에 기재된 서열을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 서열 번호 2에 기재된 서열을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 서열 번호 1에 기재된 서열, 서열 번호 2에 기재된 서열, 및 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 보존성 아미노산 치환이 3개를 넘지 않는 서열 번호 1에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 보존성 아미노산 치환이 5개를 넘지 않는 서열 번호 2에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 보존성 아미노산 치환이 3개를 넘지 않는 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 실질적으로 순수한 폴리펩티드일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 길이가 44 아미노산 잔기 이하인 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 특징으로 하며, 여기서 상기 폴리펩티드는, 아미노 말단에서부터 카르복시 말단의 순으로, (a) 서열 번호 1에 기재된 서열, 또는 부가, 결실 또는 치환이 3개를 넘지 않는 서열 번호 1에 기재된 서열, (b) 서열 번호 2에 기재된 서열, 또는 부가, 결실 또는 치환이 5개를 넘지 않는 서열 번호 2에 기재된 서열, 및 (c) 서열 번호 3에 기재된 서열, 또는 부가, 결실 또는 치환이 3개를 넘지 않는 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 나트륨이뇨 활성을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 전신성 저혈압을 유도하는 능력이 없다. 상기 폴리펩티드는 서열 번호 1에 기재된 서열을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 서열 번호 2에 기재된 서열을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 서열 번호 1에 기재된 서열, 서열 번호 2에 기재된 서열, 및 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 보존성 아미노산 치환이 3개를 넘지 않는 서열 번호 1에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 보존성 아미노산 치환이 5개를 넘지 않는 서열 번호 2에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 보존성 아미노산 치환이 3개를 넘지 않는 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 실질적으로 순수한 폴리펩티드일 수 있다. 상기 숙주 세포는 진핵생물 숙주 세포일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 길이가 44 아미노산 잔기 이하인 폴리펩티드, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 특징으로 하고, 여기서 상기 폴리펩티드는, 아미노 말단에서부터 카르복시 말단의 순으로, (a) 서열 번호 1에 기재된 서열, 또는 부가, 결실 또는 치환이 3개를 넘지 않는 서열 번호 1에 기재된 서열, (b) 서열 번호 2에 기재된 서열, 또는 부가, 결실 또는 치환이 5개를 넘지 않는 서열 번호 2에 기재된 서열, 및 (c) 서열 번호 3에 기재된 서열, 또는 부가, 결실 또는 치환이 3개를 넘지 않는 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 나트륨이뇨 활성을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 전신성 저혈압을 유도하는 능력이 없다. 상기 폴리펩티드는 서열 번호 1에 기재된 서열을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 서열 번호 2에 기재된 서열을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 서열 번호 1에 기재된 서열, 서열 번호 2에 기재된 서열, 및 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 보존성 아미노산 치환이 3개를 넘지 않는 서열 번호 1에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 보존성 아미노산 치환이 5개를 넘지 않는 서열 번호 2에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 보존성 아미노산 치환이 3개를 넘지 않는 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 실질적으로 순수한 폴리펩티드일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 혈압을 강하시키지 않으면서 포유동물에서 나트륨이뇨 활성을 증가시키기 위한 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 상기 포유동물에게, 길이가 44 아미노산 잔기 이하인 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 폴리펩티드는, 아미노 말단에서부터 카르복시 말단의 순으로, (a) 서열 번호 1에 기재된 서열, 또는 부가, 결실 또는 치환이 3개를 넘지 않는 서열 번호 1에 기재된 서열, (b) 서열 번호 2에 기재된 서열, 또는 부가, 결실 또는 치환이 5개를 넘지 않는 서열 번호 2에 기재된 서열, 및 (c) 서열 번호 3에 기재된 서열, 또는 부가, 결실 또는 치환이 3개를 넘지 않는 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 나트륨이뇨 활성을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 전신성 저혈압을 유도하는 능력이 없다. 상기 폴리펩티드는 서열 번호 1에 기재된 서열을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 서열 번호 2에 기재된 서열을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 서열 번호 1에 기재된 서열, 서열 번호 2에 기재된 서열, 및 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 보존성 아미노산 치환이 3개를 넘지 않는 서열 번호 1에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 보존성 아미노산 치환이 5개를 넘지 않는 서열 번호 2에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 보존성 아미노산 치환이 3개를 넘지 않는 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 실질적으로 순수한 폴리펩티드일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 심혈관성 병태 또는 신장 병태를 갖는 포유동물을 치료하기 위한 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 심혈관성 병태 또는 신장 병태징후의 중증도가 감소되는 상황 하에서 길이가 44 아미노산 잔기 이하인 폴리펩티드를, 상기 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 폴리펩티드는, 아미노 말단에서부터 카르복시 말단의 순으로, (a) 서열 번호 1에 기재된 서열, 또는 부가, 결실 또는 치환이 3개를 넘지 않는 서열 번호 1에 기재된 서열, (b) 서열 번호 2에 기재된 서열, 또는 부가, 결실 또는 치환이 5개를 넘지 않는 서열 번호 2에 기재된 서열, 및 (c) 서열 번호 3에 기재된 서열, 또는 부가, 결실 또는 치환이 3개를 넘지 않는 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 나트륨이뇨 활성을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 전신성 저혈압을 유도하는 능력이 없다. 상기 폴리펩티드는 서열 번호 1에 기재된 서열을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 서열 번호 2에 기재된 서열을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 서열 번호 1에 기재된 서열, 서열 번호 2에 기재된 서열, 및 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 보존성 아미노산 치환이 3개를 넘지 않는 서열 번호 1에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 보존성 아미노산 치환이 5개를 넘지 않는 서열 번호 2에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 보존성 아미노산 치환이 3개를 넘지 않는 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 실질적으로 순수한 폴리펩티드일 수 있다. 포유동물에게 상기 폴리펩티드를 투여하는 단계는 상기 포유동물의 혈압을 강하시키지 않도록 수행될 수 있다.
달리 정의하지 않으면, 본 명세서에서 사용하는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련가가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술한 것과 유사하거나 균등한 방법 및 재료를 본 발명을 실시하는데 사용할 수 있지만, 적절한 방법 및 재료는 이하에 기술한 것이다. 본 명세서에서 언급한 모든 공개물, 특허출원, 특허 및 다른 참조문헌을 전체로 참조하여 포함시킨다. 분쟁시, 정의를 포함하여, 본 명세서를 조정하게 된다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 설명을 위해 예시한 것이며, 이를 한정하려는 의도가 아니다.
본 발명의 1 이상의 구체예의 상세한 설명은 첨부된 도면 및 이하의 구체적인 내용에 기술하였다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 장점은 이하의 구체적인 내용 및 도면, 및 청구항을 통해 분명해질 것이다.
도 1은 길이가 32 아미노산 잔기인 CU-NP 폴리펩티드의 계략적인 도식이다(서열 번호 4). 서열 번호 4의 처음 10 아미노산 잔기는 인간 유로딜라틴의 아미노산 잔기 1 내지 10에 해당하고 이를 서열 번호 1로 나타내었다. 서열 번호 4의 아미노산 잔기 11 내지 27은 인간의 성숙한 CNP의 아미노산 잔기 6 내지 22에 상응하며 서열 번호 2로 나타내었다. 서열 번호 4의 아미노산 잔기 28 내지 32는 인간 유로딜라틴의 아미노산 잔기 28 내지 32에 상응하고 서열 번호 3으로 나타내었다.
도 2는 표시한 바와 같이 CU-NP 또는 URO로 처리한 정상 마취 개의 신장 관류압(RPP = MAP-RAP로 평가함)을 도시한 그래프이다(평균 ± SEM; * = P<0.05 vs. 베이스라인; ‡ = 그룹간 P<0.05).
도 3은 개에서 분리된 사구체에서 CU-NP, CNP 및 URO의 등몰 농도에 따른 cGMP 반응성을 도시한 그래프이다(n = 블랭크(blank)에 대해 3-7, 즉, 대조군; n = 사구체(glom)에 대해 5-8, † = P<0.0001 vs. 블랭크; * = P<0.01 vs. 블랭크).
도 4는 개에서 분리된 사구체에서 평가한, NPR-A 길항제(1 μM의 A71915), NPR-B 길항제(1 μM의 P19), 또는 이들 두 길항제(A71915 이후 P19, 둘 모두에 대해 최종 농도 1 μM)의 존재 또는 부재하에서, CU-NP의 등몰량 농도에 따른 cGMP 반응성을 도시한 그래프이다(n = 블랭크(blank)에 대해 2-4; n = 사구체(glom)에 대해 3-6; * = P<0.05 vs. 블랭크; † = P<0.01 vs. 블랭크; ‡ = P<0.0001 vs. 블랭크).
도 5는 인간 동맥 내피 세포에서 평가한, NPR-B 항체(1:100) 존재 또는 부재하에서 CNP 또는 CU-NP에 따른 cGMP 반응성을 도시한 그래프이다.
도 2는 표시한 바와 같이 CU-NP 또는 URO로 처리한 정상 마취 개의 신장 관류압(RPP = MAP-RAP로 평가함)을 도시한 그래프이다(평균 ± SEM; * = P<0.05 vs. 베이스라인; ‡ = 그룹간 P<0.05).
도 3은 개에서 분리된 사구체에서 CU-NP, CNP 및 URO의 등몰 농도에 따른 cGMP 반응성을 도시한 그래프이다(n = 블랭크(blank)에 대해 3-7, 즉, 대조군; n = 사구체(glom)에 대해 5-8, † = P<0.0001 vs. 블랭크; * = P<0.01 vs. 블랭크).
도 4는 개에서 분리된 사구체에서 평가한, NPR-A 길항제(1 μM의 A71915), NPR-B 길항제(1 μM의 P19), 또는 이들 두 길항제(A71915 이후 P19, 둘 모두에 대해 최종 농도 1 μM)의 존재 또는 부재하에서, CU-NP의 등몰량 농도에 따른 cGMP 반응성을 도시한 그래프이다(n = 블랭크(blank)에 대해 2-4; n = 사구체(glom)에 대해 3-6; * = P<0.05 vs. 블랭크; † = P<0.01 vs. 블랭크; ‡ = P<0.0001 vs. 블랭크).
도 5는 인간 동맥 내피 세포에서 평가한, NPR-B 항체(1:100) 존재 또는 부재하에서 CNP 또는 CU-NP에 따른 cGMP 반응성을 도시한 그래프이다.
본 발명은 나트륨이뇨성 폴리펩티드에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명은 나트륨이뇨성 폴리펩티드에 관한 방법 및 물질, 및 심혈관성 병태(예를 들어, 급성 비대상성 심부전, 급성 관상동맥 증후군 및 심근경색 후 심실 리모델링 등) 및 신장 병태(예를 들어, 수술전후 신장 기능이상, 심부전 속발된 신장 기능이상 및 당뇨병성 신병증)를 치료하기 위한 나트륨이뇨성 폴리펩티드의 용도를 제공한다.
일부 경우에서, 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드는 이뇨 활성, 나트륨이뇨 활성, cGMP 활성화능, 사구체 여과율 증가능, 레닌 생성 감소능, 안지오텐신 생성 감소능, 알도스테론 생성 감소능, 비정상적으로 상승된 심장 충만압 감소능, 신장 혈류 최적화능 또는 이의 조합을 가질 수 있다. 일부 경우에서, 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드는 내생성 ANP, BNP 및 CNP 수준을 증가시킬 수 있다. 일부 경우에서, 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드는 혈압 강하능력 및 전신성 저혈압증 유도능이 없을 수 있다. 일부 경우에서, 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드는 나트륨이뇨성 펩티드 수용체-A, 나트륨이뇨성 펩티드 수용체-B, 또는 나트륨이뇨성 펩티드 수용체-A와 나트륨이뇨성 펩티드 수용체-B 둘 모두에 대한 작동제일 수 있다.
본 발명에서 제공하는 폴리펩티드는 임의의 서열을 가질 수 있고, 임의의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드는 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드는 (a) 아미노산 부가, 결실, 치환 또는 이의 조합이 3 또는 그 이하(예를 들어, 2 또는 그 이하, 1 또는 0)인 서열 번호 1에 기재된 서열, (b) 아미노산 부가, 결실, 치환 또는 이의 조합이 5 또는 그 이하(예를 들어, 4 또는 그 이하, 3 또는 그 이하, 2 또는 그 이하, 1 또는 0)인 서열 번호 2에 기재된 서열, 및 (c) 아미노산 부가, 결실, 치환 또는 이의 조합이 3 또는 그 이하(예를 들어, 2 또는 그 이하, 1 또는 0)인 서열 번호 3에 기재된 서열로 정렬된 아미노산 서열을 함유할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드는 서열 번호 1의 제1 트레오닌 잔기 또는 마지막 세린 잔기가 결실되거나 또는 다른 아미노산 잔기로 치환된 것을 제외하고는 서열 번호 1에 기재된 서열을 함유할 수 있다.
아미노산 치환은 보존성 아미노산 치환일 수 있다. 보존성 아미노산 치환은 예를 들어, 산성 아미노산으로서 아스파르트산-글루탐산; 염기성 아미노산으로 리신/아르기닌/히스티틴; 소수성 아미노산으로서 류신/이소류신, 메티오닌/발린, 알라닌/발린; 친수성 아미노산으로서 세린/글리신/알라닌/트레오닌일 수 있다. 보존성 아미노산 치환은 또한 측쇄를 기준으로 한 분류를 포함한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 군은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이고, 지방족-히드록실 측쇄를 갖는 아미노산군은 세린 및 트레오닌이며, 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산 군은 아스파라긴 및 글루타민이고, 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 군은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이며, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 군은 리신 및 아르기닌 및 히스티딘이고, 황 함유 측쇄를 갖는 아미노산 군은 시스테인 및 메티오닌이다. 아미노산 치환 이후, 이러한 아미노산 치환을 함유하는 폴리펩티드의 활성은 본 명세서에 기술한 분석법을 사용하여 측정할 수 있다.
일부 경우에서, 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드는 (a) 서열 번호 1에 기재되어 있거나 또는 아미노산 결실, 치환 또는 이의 조합이 3 또는 그 이하(예를 들어, 2 또는 그 이하, 1 또는 0)인 서열 번호 1에 기재된 서열로 정렬된 제1 아미노산 서열, (b) 서열 번호 2에 기재되거나, 또는 아미노산 부가, 치환 또는 이의 조합이 5 또는 그 이하(예를 들어, 4 또는 그 이하, 3 또는 그 이하, 2 또는 그 이하, 1 또는 0)인 서열 번호 2에 기재된 서열로 정렬된 제2 아미노산 서열, 및 (a) 서열 번호 3에 기재되거나 또는 아미노산 결실, 치환 또는 이의 조합이 3 또는 그 이하(예를 들어, 2 또는 그 이하, 1 또는 0)인 서열 번호 3에 기재된 서열로 정렬된 제3 아미노산 서열을 함유할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드는 서열 번호 4에 기재된 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
본 발명에서 제공하는 폴리펩티드는 임의의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드는 길이가 25 내지 45(예를 들어, 26 내지 44, 27 내지 43, 28 내지 42, 29 내지 41, 30 내지 40, 31 내지 39, 또는 30 내지 35) 아미노산 잔기일 수 있다. 길이가 25 또는 45 아미노산 잔기인 폴리펩티드는 25 내지 45 아미노산 잔기 길이인 폴리펩티드라는 것을 이해할 것이다.
일부 경우에서, 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드는 실질적으로 순수한 폴리펩티드이다. 본 명세서에서 사용되는, 폴리펩티드와 관련된 용어 "실질적으로 순수한"은 폴리펩티드가 이것이 천연적으로는 연합되어 있는 다른 폴리펩티드, 지질, 탄수화물 및 핵산이 실질적으로 없는 것을 의미한다. 따라서, 실질적으로 순수한 폴리펩티드는 이의 천연 환경에서 분리되고, 순도가 60% 이상이거나 또는 임의의 화학 합성된 폴리펩티드인 임의의 폴리펩티드이다. 실질적으로 순수한 폴리펩티드는 순도가 약 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 99% 이상일 수 있다. 대체로, 실질적으로 순수한 폴리펩티드는 비환원성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 단일한 주요 밴드를 나타내게 된다.
본 발명에서 제공하는 폴리펩티드는 이 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 핵산의 발현 또는 화학 합성(예를 들어, 고체상 폴리펩티드 합성법 또는 펩티드 합성기 예컨대 ABI 431A 펩티드 합성기(Applied Biosystems; Foster City, CA) 사용)을 통해 얻을 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터를 사용한 표준 재조합법을 사용할 수 있다. 이렇게 얻어진 폴리펩티드는 예를 들어 친화성 크로마토그래피 방법 및 HPLC를 사용하여 정제할 수 있다. 정제 정도는 이에 제한되는 것은 아니고, 컬럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액상 크로마토그래피를 포함하는 임의의 적절한 방법으로 측정할 수 있다. 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드는 폴리펩티드를 정제가능하게하는 태그 서열을 함유하도록 설계하거나 조작할 수 있다(예를 들어, 친화성 매트릭스 상에서 포획시킴). 예를 들어, c-myc, 해마글루티닌, 폴리히스티딘 또는 Flag™ 태그(Kodak) 등과 같은 태그를 사용하여 폴리펩티드 정제를 보조할 수 있다. 이러한 태그는 카르복실 또는 아미노 말단을 포함하는 폴리펩티드 내 임의 위치에 삽입시킬 수 있다. 사용할 수 있는 다른 융합물에는 예컨대 알칼리 포스파타제 등과 같은, 폴리펩티드의 검출에 도움이 되는 효소가 포함된다.
본 발명에서 제공하는 폴리펩티드는 3 영역, 즉 N 말단(예를 들어, 인간 유로딜라틴 폴리펩티드 유래 N 말단 서열)을 포함하는 제1 영역, 성숙한 나트륨이뇨성 폴리펩티드 예컨대 인간 CNP 폴리펩티드의 고리 구조를 포함하는 제2 영역, 및 C 말단(예를 들어, 인간 유로딜라틴 폴리펩티드 유래의 C 말단 서열)을 포함하는 제3 영역을 함유하도록 제조할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 폴리펩티드는 심혈관 질환, 울혈성 심부전증, 심근경색, 관상 동맥 질환, 신장 질환, 간질환, 암, 대사성 질환 또는 이의 조합을 치료하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CU-NP 폴리펩티드는 인간 관상 동맥 질환 징후의 중증도가 감소되는 상황 하에서 관상 동맥 질환을 갖는 인간에게 투여될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 폴리펩티드는 약학적으로 허용되는 비독성 부형제 또는 담체와 혼합되어 약학 조성물로서 제형화될 수 있다. 이러한 조성물은 예를 들어, 심장, 간, 신장 또는 다른 나트륨 유지 병태를 치료하기 위한 유효량으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 약학 조성물은 비경구 투여용, 특히 액상 용액 또는 생리적 완충 수용액 중 현탁액 형태; 경구 투여용, 특히 정제 또는 캡슐 형태; 또는 비강내 투여용, 특히 분말, 비 점적액 또는 에어로졸 형태로 제조될 수 있다. 다른 투여 경로용 조성물도 적절한 방법을 사용하여 목적에 따라 제조할 수 있다.
비경구 투여용 제형은 통상의 부형제, 멸균수, 염수, 폴리알킬렌 글리콜 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 식물 유래 오일, 수소화 나프탈렌 및 이의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 생체 내 폴리펩티드의 방출을 제어하기 위한 부형제로서 생체적합성, 생분해성 락티드 중합체, 락티드/글리콜리드 공중합체, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로핀렌 공중합체 또는 이의 조합을 사용할 수 있다. 사용할 수 있는 다른 적절한 비경구 전달 시스템은 제한없이, 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체 입자, 삼투성 펌프, 매몰식 주입 시스템, 리포솜 및 이의 조합을 포함한다. 흡입 투여용 제형은 락토스 등과 같은 부형제를 포함할 수 있다. 흡입 제형은 예를 들어, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 글리코콜레이트, 데옥시콜레이트 또는 이의 조합을 함유하는 수용액이거나, 또는 비 점적액 형태로 투여하기 위한 유성 용액일 수 있다. 필요하다면, 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 비강내 도포하기 위한 겔로서 제형화될 수 있다. 비경구 투여용 제형은 구강 투여용 글리코콜레이트를 포함할 수 있다.
경구 투여용, 정제 또는 캡슐은 약학적으로 허용되는 부형제 예컨대 결합제(예를 들어, 젤라틴 전처리된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스); 충전제(예를 들어, 락토스, 미정질 셀룰로스 또는 인산수소칼륨 등); 윤활제(예를 들어, 스테아르산마그네슘, 탈크 또는 실리카); 붕해제(예를 들어, 감자 전분 또는 글리콜산 전분 나트륨 등); 또는 습윤제(예를 들어, 황산라우릴나트륨 등)와 함께 적절한 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 정제는 적절한 방법을 사용하여 피복될 수 있다. 경구 투여용 조제물은 폴리펩티드의 방출이 제어되도록 제형화시킬 수 있다.
코 조제물은 액체 형태이거나 또는 건조 제품으로 존재할 수 있다. 분무식 수현탁액 또는 용액은 pH 및/또는 삼투성을 조정하기 위한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다.
폴리펩티드를 코딩하는 핵산
본 발명은 또한, 본 발명에서 제공하는 1 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 핵산과 관련하여 본 명세서에서 사용하는 용어 "단리된"은 이 핵산이 유래한 유기체의 천연 발생 게놈에서 바로 인접하는 양 서열(하나는 5' 상에, 다른 하나는 3' 상에)과 인접하지 않는 천연 발생 핵산을 의미한다. 예를 들어, 단리된 핵산은 제한없이, 임의 길이의 재조합 DNA 분자일 수 있는데, 단 천연 발생 게놈에서 이 재조합 DNA 분자에 바로 측접하는 정상적으로 발견되는 핵산 서열 중 하나가 제거되거나 없다. 따라서, 단리된 핵산은 제한없이, 다른 서열과 동립적으로 개별 분자로서 존재하는 재조합 DNA(예를 들어, PCR 또는 제한효소 처리로 생성된 게놈 DNA 단편 또는 cDNA)를 비롯하여, 벡터, 자가 복제 플라스미드, 바이러스(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스 등), 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA에 도입된 재조합 DNA를 포함한다. 또한, 단리된 핵산은 혼성체 또는 융합 핵산 서열의 일부인 재조합 DNA 분자를 포함할 수 있다.
핵산과 관련되어 본 명세서에서 사용하는 용어 "단리된"은 또한 비천연 발생 핵산 서열이 자연계에서 발견되지 않고 천연 발생 게놈에서 바로 인접한 서열을 갖지 않기 때문에 임의의 비천연 발생 핵산을 포함한다. 예를 들어, 비천연 발생 핵산 예컨대 유전자조작된 핵산을 단리된 핵산이라고 한다. 유전자조작된 핵산(예를 들어, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산)을 통상의 분자 클로닝법 또는 화학 핵산 합성법을 사용하여 제조할 수 있다. 단리된 비천연 발생 핵산은 다른 서열과는 독립적으로 존재하거나 또는 벡터, 자가 복제 플라스미드, 바이러스(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스 등) 또는 원핵생물이나 진핵생물의 게놈 DNA 에 도입될 수 있다. 또한, 비천연 발생 핵산은 혼성체 또는 융합 핵산 서열의 일부인 핵산 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, cDNA 라이브러리 또는 게놈 라이브러리, 또는 게놈 DNA 제한효소 분해물을 함유하는 겔 조각 내 수백 내지 수백만의 다른 핵산 중에 존재하는 핵산은 단리된 핵산으로 간주하지 않는다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "핵산"은 mRNA, cDNA, 게놈 DNA, 합성(예를 들어, 화학 합성) DNA 및 핵산 유사체를 포함하는 RNA와 DNA를 의미한다. 핵산은 이중 가닥이거나 단일 가닥일 수 있고, 단일 가닥인 경우에는, 센스 가닥이거나 또는 안티센스 가닥일 수 있다. 또한, 핵산은 원형이거나 또는 선형일 수 있다. 핵산 유사체는 예를 들어, 핵산의 안정성, 혼성화도 또는 가용성을 증가시키기 위해 염기 부분, 당 부분 또는 포스페이트 골격에서 변형될 수 있다. 염기 부분의 변형은 데옥시티미딘에 대해 데옥시우리딘, 데옥시시티딘에 대해 5-메틸-2'-데옥시시티딘 및 5-브로모-2'-데옥시시티딘을 포함한다. 당 부분의 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-O-알릴 당을 형성시키는 리보스 당의 2' 히드록실 변형을 포함할 수 있다. 데옥시리보스 포스페이트 골격을 변형하여 모르폴리노 핵산을 생성시킬 수 있는데, 여기서 각 염기 부분은 6원, 모르폴리노 고리 또는 펩티드 핵산에 연결되고, 이때 데옥시포스페이트 골격은 슈도펩티드 골격으로 치환되고, 4 염기는 유지된다. 예를 들어, 문헌 [Summerton and Weller Antisense Nucleic Acid Drug Dev ., 7:187-195 (1997); 및 Hyrup et al. Bioorgan . Med . Chem., 4:5-23 (1996)]을 참조한다. 또한, 데옥시포스페이트 골격은 예를 들어, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 골격, 포스포로아미다이트 또는 알킬 포스포트리에스테르 골격으로 치환될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 핵산은 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수있다. 예를 들어, 이러한 핵산은 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 코딩하도록 조작된 CNP 및 유로딜라틴에 대한 인간 핵산 서열을 함유할 수 있다.
대체로, 본 발명에서 제공하는 단리된 핵산은 길이가 10 뉴클레오티드 이상이다(예를 들어, 길이가 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 또는 그 이상의 뉴클레오티드). 전체 길이보다 짧은 핵산 분자는 예를 들어, 진단 목적의 프로브 또는 프라이머로 유용할 수 있다. 단리된 핵산 분자는 제한없이 통상의 분자 클로닝 및 화학적 핵산 합성법을 포함하는 표준 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 방법을 사용할 수 있다. PCR은 표적 핵산을 효소적으로 증폭시키는 과정 또는 방법을 의미한다. 일반적으로, 증폭하려는 주형의 대향 가닥과 서열이 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하기 위해 목적 영역의 말단 또는 그 이상에 대한 서열 정보가 사용된다. PCR을 사용하여 전체 게놈 DNA 또는 전체 세포 DNA 유래의 서열을 포함하여, DNA와 RNA로부터 특정 서열을 증폭할 수 있다. 프라이머는 대체로 그 길이가 15 내지 50 뉴클레오티드이지만, 길이가 10 뉴클레오티드부터 수백 뉴클레오티드 범위일 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 길이가 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 또는 45 뉴클레오티드일 수 있다. 프라이머는 통상의 방법을 사용하여 제한효소 분해물로부터 정제하거나 또는 화학적으로 합성할 수 있다. 대체로 프라이머는 증폭 최대 효율을 위해 단일 가닥이지만, 이중 가닥일 수도 있다. 이중 가닥 프라이머는 증폭에 사용하기전 우선 변성(예를 들어, 열처리)시켜 가닥을 분리시킨다. 일반적인 PCR 방법은 예를 들어, 문헌 [PCR Primer : A Laboratory Manual, ed. by Dieffenbach and Dveksler, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995]에 기술되어 있다. 주형으로서 RNA를 사용하는 경우, 역전사효소를 사용하여 상보성 DNA(cDNA) 가닥을 합성할 수 있다. 그밖에 기술된 바와 같이 리가제 연쇄 반응, 가닥 치환 증폭, 자가 지속 서열 복제 또는 핵산 서열 기반 증폭법을 사용하여 단리된 핵산을 얻을 수 있다(Lewis, Genetic Engineering News, 12(9):1 (1992); Guatelli et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 87:1874-1878 (1990); and Weiss, Science, 254:1292 (1991)).
단리된 핵산도 단일 핵산 분자로서 또는 일련의 올리고뉴클레오티드로서 화학 합성할 수 있다(예를 들어, 포스포르아미다이트 방법을 사용한 3' 내지 5' 방향으로의 자동화 DNA 합성법 사용). 예를 들어, 목적 서열을 함유하는, 1 이상의 긴 올리고뉴클레오티드(예를 들어, >100 뉴클레오티드) 쌍을 합성할 수 있는데, 각 쌍은 상보성이 있는 단분절(예를 들어, 약 15 뉴클레오티드)을 함유하며, 올리고뉴클레오티드 쌍이 어닐링하는 경우에 듀플렉스가 형성된다. DNA 중합효소를 사용하여 올리고뉴클레오티드를 연장시키면, 올리고뉴클레오티드 쌍 당 단일한, 이중 가닥 핵산 분자가 생성되며, 이후 이를 벡터에 결찰시킬 수 있다.
단리된 핵산은 또한 돌연변이 유발법을 통해 얻을 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 1, 2, 3 또는 4에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 표준 방법 예를 들어, PCR을 통한 부위 지정 돌연변이 유발법 및/또는 올리고뉴클레오티드 지정 돌연변이 유발법을 사용해 돌연변이시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Short Protocols in Molecular Biology, Chapter 8, Green Publishing Associates and John Wiley & Sons, Edited by Ausubel et al ., 1992]을 참조할 수 있다. 이러한 돌연변이에는 부가, 결실, 치환 및 이의 조합이 포함된다.
벡터 및 숙주 세포
본 발명은 또한 본 발명에서 제공하는 핵산을 함유하는 벡터를 제공한다. 본 명세서에서 사용하는 "벡터"는 다른 DNA 분절이 삽입되어 삽입된 분절의 복제가 일어날 수 있는 레플리콘, 예컨대 플라스미드, 파지 또는 코스미드이다. 벡터는 발현 벡터일 수 있다. "발현 벡터"는 1 이상의 발현 제어 서열을 포함하는 벡터이고, "발현 제어 서열"은 다른 DNA 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하고 제어하는 DNA 서열이다.
본 발명에서 제공하는 발현 벡터에서, 핵산은 1 이상의 발현 제어 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 본 명세서에서 사용하는 "작동적으로 연결된"은 발현 제어 서열이 목적하는 코딩 서열의 발현을 효과적 제어하도록 유전자 구성체에 도입된 것을 의미한다. 발현 제어 서열의 예는 프로모터, 인핸서 및 전사 종결 영역을 포함한다. 프로모터는 대체로, 전사가 개시되는 지점의 상류 100 뉴클레오티드 내(일반적으로 RNA 중합효소 II에 대한 개시 부위 근처), DNA 분자 영역으로 구성된 발현 제어 서열이다. 프로모터 제어하에 코딩 서열을 위치시키기 위해서, 폴리펩티드의 번역 리딩 프레임의 번역 개시 부위를 프로모터 하류 1 내지 약 50 뉴크레오티드에 위치시키는 것이 필수적일 수 있다. 인핸서는 시점, 위치 및 수준 등의 관점에서 발현 특이성을 제공한다. 프로모터와 달리, 인핸서는 전사 부위로부터 다양한 간격으로 존재할 때 기능할 수 있다. 인핸서는 또한 전사 개시 부위의 하류에 위치할 수 있다. 코딩 서열은 RNA 중합효소가 코딩 서열을 mRNA로 전사시키고, 이어서 코딩 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드로 번역될 수 있는 경우에 세포 내 발현 제어 서열에 "작동적으로 연결"되고 이의 "제어 하"에 있는 것이다.
적절한 발현 벡터는 제한없이, 예를 들어, 박테리오파지, 배큘로바이러스, 담배 모자이크 바이러스, 헤르페스 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, 폭스바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 연합 바이러스에서 유래한 바이러스 벡터 및 플라스미드를 포함한다. 다양한 벡터 및 발현 시스템이 예컨대 Novagen(미국, 위스콘신주, 매디슨 소재), Clontech Laboratories(미국, 캘리포니아주, 마운틴 뷰 소재), Stratagene(미국, 캘리포니아주, 라졸라 소재) 및 Invitrogen/Life Technologies(미국, 캘리포니아주 칼스바드 소재) 등의 회사에서 판매된다.
발현 벡터는 발현된 핵산 서열의 후속 조작(예를 들어, 정제 또는 국재화 등)이 용이하도록 설계된 태그 서열을 포함할 수 있다. 태그 서열, 예컨대 녹색 형광 단백질(GFP), 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 폴리히스티딘, c-myc, 해마글루티닌 또는 Flag™ 태그(Kodak, 미국, 코네티컷주, 뉴헤이븐 소재)는 대체로 코딩된 폴리펩티드와 융합되어 발현된다. 이러한 태그는 카르복실 또는 아미노 말단을 포함하여 폴리펩티드 내 임의 위치에 삽입될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에서 제공하는 핵산 분자 및/또는 핵산 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 용어 "숙주 세포"는 핵산 분자 또는 벡터가 도입될 수 있는 원핵생물 세포 및 진핵생물 세포를 의미한다. 임의의 방법을 사용하여 세포로 핵산을 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 인산칼슘 침전법, 전기천공, 열충격, 리포펙틴, 미세주입법 및 바이러스 매개 핵산 전달법을 사용하여 세포에 핵산을 도입할 수 있다. 또한, 나형 DNA를 문헌에 기술된 바와 같이 생체 내에서 세포에 직접 전달할 수 있다(U.S. 특허 제5,580,859호 및 제5,589,466호 참조).
폴리펩티드 검출
본 발명은 또한 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드를 검출하기 위한 방법 및 물질을 제공한다. 이러한 방법 및 물질을 사용하여 치료제로서 폴리펩티드를 수여받은 포유동물 내 폴리펩티드 수준을 모니터링할 수 있다. 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드(예를 들어, 서열 번호 4에 기술한 아미노산 서열을 갖는 CU-NP 폴리펩티드)는 예를 들어, 1 이상의 항체를 사용하여 면역학적으로 검출할 수있다. 본 명세서에서 기술하는 용어 "항체"는 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드의 에피토프 결정부에 결합할 수 있는 완전한 분자 및 이의 단편을 포함한다. 용어 "에피토프"는 항체의 파라토프가 결합하는 항원 상의 항원성 결정부를 의미한다. 에피토프 결정부는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄 등과 같은 분자들의 화학적 활성 표면 집단으로 이루어지고, 대체로 특이적인 3차 구조 특징과 특이적인 전하 특징을 갖는다. 에피토프는 일반적으로 5 이상의 연속된 아미노산(연속 에피토프)을 갖거나, 또는 특정 구조로 특징되는 비연속 아미노산 세트(예를 들어, 구조적 에피토프)일 수 있다. 용어 "항체"는 다클론 항체, 단일클론 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체, 단쇄 Fv 항체 단편, Fab 단편 및 F(ab)2 단편을 포함한다. 다클론 항체는 면역화된 동물의 혈청에 함유된 항체 분자의 이종성 개체군이다. 단일클론 항체는 항원의 특정 에피토프에 대한 항체의 동종성 개체군이다.
본 발명에서 제공하는 폴리펩티드(예를 들어, 서열 번호 4에 기재한 아미노산 서열을 갖는 CU-NP 폴리펩티드)에 특이적 결합 친화성을 갖는 항체 단편은 공지 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 단편은 항체 분자의 펩신 분해를 통해 생성시킬 수 있고, Fab 단편은 F(ab')2 단편의 이황화 브릿지를 환원시켜 생성시킬 수 있다. 일부 경우에서, Fab 발현 라이브러리를 제작할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Huse et al., Science, 246:1275 (1989)]을 참조한다. 생성이 되면, 항체 또는 이의 단편은 ELISA 방법, 방사면역분석법 및 웨스턴 블랏법을 포함하는 표준 면역분석 방법을 통해 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드 인식 여부를 시험할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Short Protocols in Molecular Biology, Chapter 11, Green Publishing Associates and John Wiley & Sons, Edited by Ausubel, F.M et al., 1992]을 참조한다.
면역학적 분석법에서, 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드에 대해 특이적 결합 친화성을 갖는 항체 또는 이러한 항체에 결합하는 2차 항체를 직접적으로 또는 간접적으로 표지화할 수 있다. 적절한 표지는 제한없이, 방사성 핵종(예를 들어, 125I, 131I, 35S, 3H, 32P, 33P 또는 14C), 형광성 부분(예를 들어, 플루오레세인, FITC, PerCP, 로다민 또는 PE), 발광성 부분(예를 들어, Qdot™ 나노입자(Invitrogen; 미국, 캘리포니아주, 칼스바드 소재), 특정 파장광을 흡광하는 화합물 또는 효소(예를 들어, 알칼리 포스파타제 또는 홀스래디쉬 퍼옥시다제 등)를 포함한다. 항체는 비오틴과의 접합을 통해 간접적으로 표지화한 후 상기 기술한 분자로 표지화된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 사용하여 검출할 수 있다. 표지를 검출하거나 정량하는 방법은 표지 성질에 따라 좌우되며 이는 당분야에 공지이다. 검출기의 예는 제한없이, X선 필름, 방사능 측정기, 섬광 측정기, 분광광도계, 색채계, 형광측정기, 발광측정기 및 밀도측정기 등을 포함한다. 당분야의 숙련가에게 친숙한 이들 접근법의 조합법("다층" 분석법 포함)을 사용하여 분석 감도를 증가시킬 수 있다.
본 발명에서 제공하는 폴리펩티드를 검출하기 위한 면역학적 분석법은 샌드위치 분석법, 경쟁 분석법(경쟁적 RIA) 또는 브릿지 면역분석법을 포함하는 다양한 공지의 방식으로 수행할 수 있다. 예를 들어, U.S. 특허 제5,296,347호; 제4,233,402호; 제4,098,876호; 및 제4,034,074호를 참조한다. 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드를 검출하는 방법은 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드에 결합하는 항체와 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계 및 항체에 폴리펩티드의 결합을 검출하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드에 대해 특이적 결합 친화성을 갖는 항체를 당분야에 공지된 임의의 다양한 방법을 통해 고체 기재 상에 고정시킨 후 생물학적 샘플에 노출시킬 수 있다. 고체 기재 상의 항체에 대한 폴리펩티드의 결합은 표면 플라즈몬 공명 현상을 수행하여 검출할 수 있는데, 결합시에 표면 플라즈몬 공명 강도에 변화가 일어나고, 이러한 변화를 예를 들어 비아코어 장치(Biacore International AB; 스웨덴, 라프스가탄 소재) 등의 적절한 장치를 사용하여 정성 또는 정량 검출할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 기술한 바와 같이, 항체를 표지하여 검출할 수 있다. 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드의 기지량을 사용하여 표준 그래프를 생성시켜 폴리펩티드 수준을 정량하는데 도움을 줄 수 있다.
일부 구체예에서, 포획 항체를 고체 기재에 고정시킨 "샌드위치" 분석법을 사용하여 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드의 유무 또는 수준을 검출할 수 있다. 샘플 중 목적하는 임의의 폴리펩티드가 고정된 항체에 결합하도록 고체 기재를 생물학적 샘플과 접촉시킬 수 있다. 항체에 결합한 폴리펩티드의 유무 또는 수준은 상기 폴리펩티드에 대해 특이적 결합 친화성을 갖는 "검출" 항체를 사용하여 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드를 비롯하여 CNP 또는 유로딜라틴에 대한 결합 친화성을 갖는 포획 항체를 사용할 수 있다. 이러한 구체예에서, 본 발명에서 제공하는 특정 폴리펩티드(예를 들어, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CU-NP 폴리펩티드)에 대한 특이적 결합 친화성을 갖는 검출 항체를 사용할 수 있다. 샌드위치 분석법에서, 포획 항체는 검출 항체와 동일한 에피토프(또는 다클론 항체의 경우에는 에피토프 범위)에 결합하는 것이 아니여야 한다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 단일클론 항체를 포획 항체로 사용하는 경우, 검출 항체는 포획 단일클론 항체가 결합하는 에피토프와 단지 부분적으로만 중첩되거나, 또는 물리적으로 분리된 에피토프에 결합하는 다른 단일클론 항체이거나, 또는 포획 단일클론 항체가 결합하는 에피토프 이외에 또다른 에피토프 또는 그외 에피토프에 결합하는 다클론 항체일 수 있다. 다클론 항체가 포획 항체로 사용되는 경우, 검출 항체는 포획 다클론 항체가 결합하는 임의의 에피토프와 부분적으로 중첩되거나, 또는 물리적으로 분리된 에피토프에 결합하는 단일클론 항체이거나, 또는 포획 다클론 항체가 결합하는 것 이외에 또 다른 또는 그외 에피토프에 결합하는 다클론 항체일 수 있다. 샌드위치 분석법은 샌드위치 ELISA 분석법, 샌드위치 웨스턴 블랏 분석법 또는 샌드위치 면역자기 검출 분석법으로 수행할 수 있다.
항체(예를 들어, 포획 항체)가 결합할 수 있는 적절한 고체 기재는 제한없이, 미량역가 평판, 튜브, 막 예컨대 나일론 또는 니트로셀룰로스 막, 및 비드 또는 입자(예를 들어, 아가로스, 셀룰로스, 유리, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 자성 또는 자기화가능한 비드 또는 입자 등)을 포함한다. 자성 또는 자기화가능한 입자는 자동 면역분석 시스템을 사용하는 경우에 특이 유용할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 폴리펩티드에 대한 특이적 결합 친화성을 갖는 항체는 표준 방법을 통해 제조할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 상기 기술한 바와 같이 재조합적으로 생성시킬 수 있거나, 생물학적 샘플(예를 들어, 이종성 발현 시스템)에서 정제하거나, 또는 화학적으로 합성할 수 있고, 토끼, 닭, 마우스, 귀니아 피그 또는 래트를 포함한 숙주 동물을 면역화하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 길이가 6 아미노산 이상인 이의 단편을 사용하여 동물을 면역화시킬 수 있다. 면역반응을 증가시키는데 사용될 수 있는 다양한 보조제는 숙주 종에 따라 좌우되고 프로인트 보조제(완전 및 불완전), 미네랄 겔 예컨대 수산화알루미늄, 표면 활성제 예컨대 리소렉시틴, Pluronic 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 유성 에멀션, 키홀 림펫 헤모시아닌 및 디니트로페놀이 포함된다. 단일클론 항체는 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드 및 표준 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 구체적으로, 단일클론 항체는 예를 들어, 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 기술된 바와 같은 연속 배양 세포주, 인간 B 세포 하이브리도마 방법(Kosbor et al., Immunology Today, 4:72 (1983); Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2026 (1983)) 및 EBV-하이브리도마 방법(Cole et al., "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy," Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1983)) 등을 통한, 항체 분자를 생성하는 임의의 방법에 의해 얻을 수 있다. 이러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, 및 이들의 임의의 하위부류를 포함하는 임의의 면역글로불린 부류일 수 있다. 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마는 생체 내 및 시험관 내에서 배양할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 폴리펩티드를 검출하기 위한 다른 방법은 질량-분광광도법 예컨대 전기분무 이온화법(ESI), 및 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화법(MALDI)을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Gevaert et al., Electrophoresis, 22(9):1645-51 (2001); Chaurand et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom., 10(2):91-103 (1999)]을 참조한다. 이러한 분야에 유용한 질량 분광계는 Applied Biosystems(미국, 캘리포니아주, 포스터 시티 소재); Bruker Daltronics(미국, 매사추세츠주, 빌레리카 소재); 및 Amersham Pharmacia(미국, 캘리포니아주, 서니베일 소재)에서 구매가능하다.
본 발명을 이하 실시예를 통해 더욱 설명하지만, 청구항에 기술한 본 발명의 범주를 한정하는 것은 아니다.
실시예
실시예
1:
CU
-
NP
의 합성
도 1에 도시한 서열을 갖는 폴리펩티드를 설계하고 ABI 431A 펩티드 합성기를 사용하여 합성하였다. 이 폴리펩티드를 CU-NP 폴리펩티드(도 1)라 명명하였다. 합성된 CU-NP 폴리펩티드는 고성능 액상 크로마토그래피/질량 분석법을 통해 확인하였다. 이의 분자량은 3535.09이고, 아미노산 서열은 Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Met-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr(서열 번호 4)이며, 이황화 결합으로 Cys 잔기가 연결되어 있다(도 1).
실시예
2:
CU
-
NP
의 생체 내 효과
3마리의 정상 마취된 개에서 심신 기능을 평가하였다. 주입 전, 각 용량 수준으로 45분간 10, 50 및 100 ng CU-NP/kg/분의 정맥내 주입시(즉, 각각의 개는 10, 50 및 100 ng/kg/분의 주입물을 연속 45분간 주입받음), 및 주입 후 시기에서의 제어율을 획득하였다. 관상 Na+ 재흡수 및 GFR은 각각 Li+ 및 이뉼린의 제거율을 통해 측정하였다. 신경호르몬은 방사면역분석법을 정량하였다. Dunnett 시험을 수반하는 반복 측정 ANOVA를 통해 자료를 분석하였다. 결과(평균 ± SEM)를 표 1에 나타내었다.
또한, 혈장 레닌 활성은 9 ± 2에서 5 ± 1*, 3 ± 1†, 3 ± 1† ng/mL/시로 감소하였고, 안지오텐신 II 수준은 18 ± 1에서 10 ± 0.4†, 5 ± 0.4†, 7 ± 1†pg/mL로 감소하였다. 주입 전(323 ± 6) 대비 100 ng/kg/분(329 ± 15)의 주입 종료시에 QTc 간격(ms)에 유의한 변화가 관찰되지 않았다.
이러한 결과는 CNP 및 유로딜라틴 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 용량 의존적 방식으로, 유의한 저혈압 유도없이, (1) 나트륨배설항진, 이뇨 및 GFR을 증가시키고, (2) 심장 충만압을 감소시키며, (3) 레닌과 안지오텐신을 억제한다는 것을 보여주는 것이다.
| CU-NP에 대한 신장 및 심혈관 데이타 | |||||
| 주입전 | 10 ng/kg/분 | 50 ng/kg/분 | 100 ng/kg/분 | 주입후 | |
| GFR (mL/분) | 31 ± 5 | 39 ± 1 | 43 ± 4* | 53 ± 3† | 36 ± 2 |
| 소변량 (mL/분) | 0.09 ± 0.01 | 0.3 ± 0.07 | 1.5 ± 0.5† | 1.9 ± 0.3† | 0.3 ± 0.05 |
| Na+ 배출량 (μEq/분) |
1.9 ± 0.9 | 33 ± 13 | 235 ± 72† | 342 ± 60† | 66 ± 12 |
| PFRNa + (%) | 92 ± 0.9 | 73 ± 4.5† | 54 ± 1.8† | 55 ± 2.6† | 62 ± 3.5† |
| DFRNa + (%) | 99 ± 0.3 | 98 ± 0.5 | 92 ± 1.6† | 90 ± 0.8† | 97 ± 0.6* |
| cGMP 신장 생성률 (pmol/분) |
356 ± 36 | 534 ± 94 | 1301 ± 60* | 4608 ± 370† | 1086 ± 27 |
| PCWP (mmHg) | 4.6 ± 0.7 | 3.8 ± 1 | 2.5 ± 1† | 1.7 ± 0.9† | 3.2 ± 1* |
| RAP (mmHg) | 1.5 ± 1 | 0.9 ± 0.9 | 0.6 ± 1* | -0.2 ± 0.8† | 0.1 ± 0.9† |
| MAP (mmHg) | 129 ± 17 | 129 ± 13 | 128 ± 10 | 120 ± 11 | 124 ± 13 |
| * = P<0.05; † = P<0.01 GFR = 사구체 여과율; PFRNa + = 나트륨의 근위성 분할 재흡수율; DFRNa+ = 나트륨의 원위성 분할 재흡수율; PCWP = 폐모세혈관 쐐기압; RAP = 우심방압; MAP = 평균 동맥압. | |||||
실시예
3:
CU
-
NP
의 추가적인 생물학적 효과
CU-NP 또는 CNP 폴리펩티드를 75분간 50 ng/kg/분으로 정상 마취된 개에게 정맥 내 주입하였다. 혈액 및 뇨 샘플을 주입전(pre-I), 주입 30분 및 60분 경, 그리고 주입후(post-I)에 채취하였다. 이뉼린 제거율을 사용하여 사구체 여과율(GFR)을 평가하였다. 리튬 제거 방법을 사용하여 Na+의 근위성 및 원위성 분할 재흡수율(각각 PFRNa 및 DFRNa)을 측정하였다. pre-I 대비 후기 3 시점을 비교하였다. 2시점에 대한 비교 결과는 스튜던트 t-검정법을 사용하였고, 반면 4시점을 비교하기 위해서는 반복 측정법 ANOVA를 사용하였다. 결과(평균 ± SEM)는 표 2A 및 2B에 나타내었다.
The CU-NP 폴리펩티드는 혈장 cGMP 및 cGMP 뇨 배출을 유의하게 증가시켰다. 또한, CU-NP는 소변량 및 Na+ 뇨 배출을 증가시켜서, 사구체 여과율을 증강시켰다. 폐모세혈관 쐐기압 및 우심방압은 전신성 저혈압증 감소없이 감소되었다. 폐 동맥압도 유의하게 감소되었고, 심박출량은 보존되었다. 혈장 레닌 활성, 안지오텐신 II 수준 및 알도스테론 수준은 CU-NP 주입동안 억제되었지만, CU-NP 주입이 중지된 후에는 상승하거나 또는 "반등"하였다. 이러한 결과는 CU-NP의 장기 작용형태가 신경호르몬의 연속적인 억제에 사용될 수 있다는 것을 시사한다.
CU-NP는 또한 cGMP의 신장 생성 및 K+ 뇨배출을 유의하게 증가시켰다. PFRNa + 및 DFRNa + 둘 모두도 유의하게 감소되었다. 이러한 결과는 중량 조정된 신장 혈류 의 증가 및 신장 혈관 내성 감소와 연관된 것이다. 적혈구용적율 증가도 관찰되었다. ANP, BNP 및 CNP의 뇨분비에 따라서, 혈장 ANP, 혈장 BNP 및 혈장 CNP가 증가되었다.
이러한 결과는 CU-NP 폴리펩티드가 cGMP-활성화, 이뇨, 나트륨이뇨성, GFR-증가, 레닌-안지오텐신-알도스테론 시스템(RAAS)-억제, 심장-무부하 및 호의적인 신장 혈역학적 활성을 갖는 한편, 혈압을 강하시키는 능력 및 전신성 저혈압증을 야기하는 능력은 결여될 수 있다는 것을 의미한다. 또한, 이러한 결과는 CU-NP 폴리펩티드가 내생성 ANP 및 BNP 수준을 증가시킬 수 있다는 것을 의미한다. 합성된 CU-NP 폴리펩티드의 관상 효과는 근위성 관 및 내부 수질 집합관 세포 수준에서의 작용과 일관되는 것이다.
[표 2a]
[표 2b]
실시예
3: 인간 동맥 내피 세포 및 생체 내에서
CU
-
NP
의 평가
CU-NP를 인간 동맥 내피 세포(HAEC)에서 시험하였고, 시간 경과에 따른 생체 내 cGMP 활성화를 밝혔다. CO2 항온배양기에서 10분간 10-10, 10-8 또는 10-6 M의 농도로 CU-NP를 HAEC(2-5 계대, 80-90% 성장 포화율)와 항온반응시켰다. CU-NP(n = 6) 또는 CNP(n = 3)를 75분 동안 14 pmol/kg/분으로 정상 마취된 개에게 정맥 내 주입하였다. 주입전, 주입 동안(I) 25, 30, 45, 60, 75분경, 및 주입 후(post-I) 1, 2, 4, 6, 10, 20, 30, 45, 60분경에 혈액을 채취하였다. cGMP를 방사면역분석법으로 정량하였다.
표 3에 도시한 바와 같이, CU-NP는 HAEC에서 cGMP 생성을 자극하였다(10-6 M vs. 미처리 경우, p<0.01). 또한, CU-NP는 pre-I 대비 생체 내에서 혈장 cGMP를 증가시켰다(I 동안의 모든 시점 및 post-I의 모든 시점에서 P<0.01, 단 post-I의 45분의 경우는, P<0.05). CU-NP는 CNP에 비하여 cGMP를 보다 높은 정도로 활성화시켰다(25분 I 내지 30분 post-I 경우, P<0.001). 따라서, CU-NP는 HAEC에서 유의하게 cGMP를 활성화시켰고, 또한 생체 내에서 CNP에 비하여 보다 높은 정도로 cGMP를 유의하게 자극하였다.
| HAEC에 대한 CU-NP 효과 | |
| CU-NP 농도 | cGMP (평균 ±SEM, pmol/mL) |
| 10-10 M | 0.0007 ± 0.0007 |
| 10-8 M | 0.03 ± 0.02 |
| 10-6 M | 0.571 ± 0.05† |
| 미처리 | 0.003 ± 0.002 |
| † = P<0.01 vs. 미처리. | |
실시예
4: 개에서 분리된 사구체에서
CU
-
NP
의
cGMP
자극 작용
분리된 사구체에서 CU-NP가 직접적으로 cGMP를 자극하는지 확인하고, C 말단 위치에 융합된 N 말단 중복부를 갖는 전체 길이 22 AA의 CNP로 이루어진, CPN-C, URO 및 CNP와, CU-NP의 cGMP 활성화 작용을 비교하기 위한 실험을 수행하였다. 사구체는 정상 개 신장 채취시에 분리하였다. 대조군 대비, 사구체와 CU-NP, CNP, URO, 및 CNP-C(10-5 M)를 항온반응시켰다. cGMP는 RIA로 측정하고, 단백질 수준에 대해 보정하였다. CU-NP 및 URO는 각각의 대조군에 비하여 상당한 cGMP 반응을 유도시켰지만, 그룹간에 차이가 없었다. CU-NP 및 URO는 CNP 대비 및 CNP-C 대비 cGMP 반응을 상당히 자극시켰다(P<0.001). 따라서, CU-NP는 사구체에서 CNP 보다 높은 정도로 cGMP를 자극하였으나, URO와는 유사한 정도로 자극하였다. CNP-C는 cGMP를 활성화시키지 않았다. 이러한 데이타는 강력하게 활성화된 cGMP의 증가에는 NP 수용체-A를 위한 리간드의 N 말단 및/또는 C 말단이 필요할 수 있다는 것을 시사하는 것이다.
| 분리된 사구체에서 cGMP 생성에 대한 CU-NP의 효과 | |
| 처리 | cGMP (평균 ± SEM; fmol/㎍) |
| CU-NP | 0.73 ± 0.09†‡ |
| CNP | 0.0019 ± 0.0005 |
| URO | 0.69 ± 0.07†‡ |
| CNP-C | 0.00597 ± 0.0053 |
| † = P<0.01 vs. 상응하는 대조군; ‡ = P<0.001 vs. CNP 및 CNP-C | |
실시예
5:
CU
-
NP
의 혈액농축 효과
적혈구용적률 증가를 통해 나타나는 혈관 투과성에 대한 3종의 인간 NP(BNP, CNP, URO) 및 CU-NP의 영향을 평가하기 위해 실험하였다. 정상 마취된 개에게 14 pmol/kg/분의 BNP(n = 7), CNP(n = 6), URO(n = 5) 또는 CU-NP(n = 6)를 정맥 내 주입하였다. 얼음 상의 EDTA 튜브에 혈액을 채취하고 원심분리하였다. 베이스라인 및 주입 60분경의 데이타를 기록하였다. 적혈구용적률 증가이외에도(표 5), CU-NP는 생체 내에서 PCW 압력을 감소시켰다(베이스라인 6 ± 0.9 mmHg, 60분 3 ± 0.9 mmHg; P<0.05). 따라서, CU-NP의 혈액농축 효과가 생체 내에서 심장 무부하 작용에 기여하는 듯하다.
| 적혈구용적률에 대한 CU-NP의 효과 | ||
| 처리 | 적혈구 용적률 (평균 ± SEM; %) | |
| 베이스라인 | 60분 | |
| BNP | 36 ± 1 | 40 ± 2* |
| CNP | 36 ± 1 | 37 ± 1 |
| URO | 37 ± 1 | 40 ± 1* |
| CU-NP | 38 ± 1 | 41 ± 1† |
| (* = P<0.05; † = P<0.01) | ||
실시예
6: 개의 실험적 심부전증에서
CU
-
NP
의 심신 및
신경액성
작용
CU-NPrk 2차 메신저 cGMP를 활성화시키고 과도한 저혈압증없이 바람직한 작용을 하는지 확인하기 위해서, 개 심부전증(HF)에서 CU-NP를 평가하였다. 경증 HF를 페이싱(pacing)을 통해 유도하였다(10일간 180 bpm). 75분간 75 ng/kg/분의 CU-NP를 6마리의 마취된 개에게 정맥 내 주입하였다. 이뉼린 제거율을 통해 GFR을 측정하였다. Na+(FRNa)의 분할 재흡수율은 Li+ 제거율을 통해 측정하였다. 주입전(pre-I), 주입 30 및 60분경(I) 및 주입후(post-I)의 데이타를 수집하였다. 혈장 레닌 활성, 안지오텐신 II, 알도스테론 및 cGMP도 측정하였다. 결과(평균 ± SEM)를 표 6에 도시하였다.
CU-NP는 혈장 cGMP, cGMP 뇨배출량, cGMP의 순 신장 생성률, 소변량 및 Na+ 뇨배출량을 증가시켰다. 근위성 및 원위성 FRNa는 감소하였다. 신장 혈류 및 GFR이 증가되었고 MAP가 조금 감소하였다. CO 및 SVR 둘 모두는 변화가 없었다. PCWP 및 PAP는 감소하였다. 혈장 레닌 활성, 안지오텐신 II 및 알도스테론도 억제되었다. 따라서, CU-NP는 과도한 저혈압증없이, 개의 HF에서 cGMP를 활성화시키고, 신장-증강, 심장-무부하 및 레닌-안지오스타틴-알도스테론 시스템 억제 작용을 나타내었다.
| 실험적 HF에서 CU-NP에 대한 신장 및 심혈관 데이타 | ||||
| 주입전 | 30 분 | 60 분 | 주입후 | |
| GFR (mL/분) | 40 ± 5 | 51 ± 9 | 51 ± 3 | 53 ± 7* |
| 소변량 (mL/분) | 0.09 ± 0.01 | 0.50 ± 0.15† | 0.56 ± 0.11† | 0.19 ± 0.03 |
| Na+ 배출량 (μEq/분) | 2.9 ± 0.9 | 80.5 ± 29.4† | 102.0 ± 22.2† | 22.1 ± 7.9 |
| PFRNa + (%) | 89 ± 2 | 68 ± 5† | 67 ± 3† | 79 ± 3* |
| DFRNa + (%) | 99.6 ± 0.1 | 96 ± 1† | 96 ± 1† | 99 ± 0.3 |
| cGMP의 신장 생성률 (pmol/분) | 610 ± 66 | 2977 ± 549† | 3255 ± 662† | 1342 ± 200 |
| 혈장 cGMP (pmol/mL) | 17 ± 3 | 41 ± 3† | 43 ± 2† | 21 ± 2 |
| cGMP 뇨배출량 (pmol/분) |
1186 ± 152 | 5066 ± 826† | 5476 ± 876† | 2394 ± 197 |
| PCWP (mmHg) | 11 ± 1 | 9 ± 1† | 8 ± 1† | 10 ± 1 |
| PAP (mmHg) | 16 ± 0.8 | 15 ± 0.6* | 14 ± 0.7† | 16 ± 0.7 |
| 혈장 레닌 활성 (ng/mL/시) | 9 ± 2 | 3 ± 1† | 2 ± 1† | 9 ± 2 |
| 안지오텐신 II (pg/mL) | 32 ± 7 | 9 ± 2† | 9 ± 3† | 19 ± 4 |
| 알도스테론 (ng/dL) | 14 ± 5 | 9 ± 2 | 6 ± 2* | 11 ± 3 |
| RBF (mL/분) | 238 ± 39 | 281 ± 42* | 294 ± 42† | 275 ± 42* |
| MAP (mmHg) | 108 ± 9 | 100 ± 8† | 96 ± 8† | 107 ± 8 |
| CO (L/분) | 2.4 ± 0.1 | 2.5 ± 0.1 | 2.4 ± 0.1 | 2.3 ± 0.04 |
| SVR (mmHgL-1Min) | 42 ± 3 | 39 ± 3 | 39 ± 3 | 45 ± 3 |
| * = P<0.05 vs. pre-I † = P<0.01 vs. pre-I; GFR = 사구체 여과율; PFRNa + = 나트륨의 근위성 분할 재흡수율; DFRNa + = 나트륨의 원위성 분할 재흡수율; PCWP = 폐모세혈관 쐐기압; PAP = 폐동맥압; RBF = 신장혈류; MAP = 평균 동맥압; CO = 심박출량; SVR = 전신 혈관 내성. | ||||
실시예
7: 신장
관류압에
대한
CU
-
NP
의 생체 내 효과
RPP가 신장 기능의 핵심 결정인자이기 때문에, 신장 관류압(RPP, MAP-RAP로 측정)에 대한, CNP, CU-NP 및 URO의 생체 내 작용을 확인하는 실험을 수행하였다. CU-NP의 GFR 증강 작용을 제공하여, 또한 CU-NP(CNP와 달리)가 강력한 신장 작용성 NP 수용체인 NBR-A를 활성화시킨다는 가설을 시험하는 실험도 수행하였다.
75분 동안 17마리의 정상 마취된 개에게 14.14 pmol/kg/분으로, CU-NP, 인간 CNP 또는 인간 URO의 등몰량을 정맥 내 주입하였다. RPP는 베이스라인 및 주입 60분경에 평가하였다. 결과는 평균 ± SEM으로 나타내었다. 제거율은 펩티드 주입 개시 후 16분 내지 45분, 및 46분 내지 75분경에 측정하였다. 각 그룹 내에서, 양측 대응 t 검정법을 사용하여 베이스라인 대비 펩티드 주입 60분경에서 RPP를 비교하였다. 그룹간 비교는 2방식 ANOVA와 후속 Bonferroni 사후검정법으로 수행하였다.
NPR-A 길항제인 A719153(1 μM), 또는 NPR-B 길항제인 P194(1 μM) 또는 순차적으로 부가된 상기 2 길항제(A71915 후 P194, 둘 모두 최종 농도 1μM)의 존재 또는 부재하에서, 채취시 개 신장에서 분리한 사구체에서, 3 펩티드에 대한 cGMP 반응도 측정하였다. CU-NP에 대한 cGMP 반응에 NPR-B의 관여를 확인하기 위해서, 인간 동맥 내피 세포(HAEC)를 사용하여 추가 실험을 수행하였다. cGMP 반응은 NPR-B의 리간드 결합 도메인에 대한 항체의 존재 또는 부재하에서 10분 동안 CU-NP(10-6 M)를 항온반응시켜 측정하였다. 시험관 내 데이타(평균 ± SEM)는 1방식 ANOVA와 후속 Bonferroni 사후 검정법을 통해 분석하였다. 통계적 유의성은 P<0.05였다. GraphPad Prism 4(GraphPad Software; 미국, 캘리포니아주, 샌디에고 소재)를 통계 분석에 사용하였다.
생체 내 시험에서, URO와 비교시 CU-NP 사용으로 RPP(mmHg)는 보존되었다. 2 그룹을 비교한 경우, RPP는 펩티드 주입 60분경에 CU-NP에 비해서 URO를 사용한 경우 유의하게 낮아졌다(P<0.05, 도 2). RPP는 CNP에 의해 변화되지 않았다.
| RPP에 대한 CU-NP 효과 | ||
| RPP (평균 ± SEM; mmHg) | ||
| 처리 | Pre-I | 60 분 |
| CNP | 120 ± 4 | 123 ±8 |
| URO | 127 ± 4 | 119 ± 4* |
| CU-NP | 135 ± 4 | 134 ±4 |
| * = P=0.05 vs. 베이스라인 | ||
시험관 내에서, 10-5M CU-NP는 CNP에 비하여 cGMP를 7배 증가(0.76 ± 0.05‡ fmol/㎍ vs. 0.11 ± 0.05 fmol/㎍)시켰고, URO(0.54 ± 0.10 fmol/㎍; P = 0.086)보다 더욱 cGMP를 활성화시키는 경향이 있었다. 이러한 결과를 도 3에 도시하였다. CU-NP의 cGMP 자극 작용은 도 4에 도시한 바와 같이, A71915에 의한 NPR-A 차단(0.31 ± 0.05† fmol/㎍), P19에 의한 NPR-B 차단(0.28 ± 0.04† fmol/㎍) 또는 A71915와 P19에 의한 NPR-A 및 NPR-B 둘 모두의 차단(0.23 ± 0.05† fmol/㎍)에 의해 감쇠되었다.
HAEC에서, 10-6 M CU-NP 및 CNP는 각각 cGMP를 0.30 ± 0.02 pmol/mL 및 0.17 ± 0.04 pmol/mL로 증가시켰다(CU-NP vs. CNP의 경우 P<0.01 ; CU-NP vs. 대조군 경우 P<0.001; CNP vs. 대조군의 경우 P<0.001). NPR-B 항체(1:100)가 존재하는 경우에, cGMP 반응은 CU-NP 경우에는 0.19 ± 0.02 pmol/mL로, CNP 경우에는 0.08 ± 0.01 pmol/mL로 감쇠하였다(CU-NP vs. 무항체 경우는 P<0.01이고, CNP vs. 무항체의 경우는 P<0.05). 결과를 도 5에 그래프로 나타내었다. 이러한 결과는 적어도 부분적으로, NPR-B가 CU-NP에 대한 cGMP 반응성에 관여한다는 것을 의미한다.
따라서, CU-NP는, RPP를 감소시키는 URO와 대조적으로, 신장 증강 용량에서 RPP를 보존하였다. 또한, 분리된 사구체에서, CU-NP의 작용은 NPR-A과 NPR-B 둘 모두의 공동 활성화를 포함하며, 이것이 신장에서의 신규한 이중 NP 수용체 활성화제라는 것을 의미한다. NPR-B는 인간 동맥 내피 세포에서 부분적으로 CU-NP에 대한 cGMP 반응성에 관여한다. 그러므로, CU-NP가 NPR-A 및 NPR-B를 이중 활성화시킬 수 있는 새로운 신규 펩티드 기술이라는 것을 의미한다.
다른
구체예
본 발명을 이의 구체적인 설명과 함께 기술하였지만, 전술한 설명은 예시를 위한 것이고 첨부된 청구항의 범주에서 정하는 본 발명의 범주를 제한하려는 것이 아님을 이해할 것이다. 다른 측면, 장점 및 별법도 이하 청구항의 범주에 속한다.
SEQUENCE LISTING
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Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser Ser
1 5 10
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<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly
1 5 10 15
Cys
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Asn Ser Phe Arg Tyr
1 5
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<400> 4
Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Leu Lys Leu
1 5 10 15
Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr
20 25 30
Claims (19)
- 길이가 44 아미노산 잔기보다 짧고, 아미노 말단에서 카르복시 말단의 순으로,
(a) 서열 번호 1에 기재된 서열, 또는 보존성 아미노산 치환이 1개를 넘지 않는 서열 번호 1에 기재된 서열,
(b) 서열 번호 2에 기재된 서열, 또는 보존성 아미노산 치환이 2개를 넘지 않는 서열 번호 2에 기재된 서열, 및
(c) 서열 번호 3에 기재된 서열, 또는 보존성 아미노산 치환이 1개를 넘지 않는 서열 번호 3에 기재된 서열
을 포함하는 것인 폴리펩티드. - 제1항에 있어서, 나트륨이뇨 활성을 포함하는 것인 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, 전신성 저혈압증을 유도하는 능력은 결여된 것인 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, 서열 번호 1에 기재된 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, 서열 번호 2에 기재된 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, 서열 번호 1에 기재된 서열, 서열 번호 2에 기재된 서열 및 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, 보존성 아미노산 치환이 1개를 넘지 않는 서열 번호 1에 기재된 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, 보존성 아미노산 치환이 2개를 넘지 않는 서열 번호 2에 기재된 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, 보존성 아미노산 치환이 1개를 넘지 않는 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, 길이가 30 내지 35 아미노산 잔기인 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, 60% 이상의 순도를 갖는 것인 폴리펩티드.
- 제1항의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산.
- 제1항의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터.
- 제1항의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포.
- 제15항에 있어서, 진핵생물 숙주 세포인 숙주 세포.
- 제1항의 폴리펩티드를 포함하는, 포유동물 내에서 혈압 강하없이 나트륨이뇨 활성을 증가시키기 위한 약학적 조성물.
- 제1항의 폴리펩티드를 포함하는, 급성 비대상성 심부전, 급성 관상동맥 증후군, 심근경색 후 심실 리모델링, 수술전후 신장 기능이상, 심부전 속발된 신장 기능이상 및 당뇨병성 신병증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 심혈관성 병태 또는 신장 병태를 치료하기 위한 약학적 조성물.
- 제18항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 포유동물으로의 투여는 상기 포유동물의 혈압을 강하시키지 않는 것인 약학적 조성물.
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