ES2632953T3 - Polipéptidos natriuréticos - Google Patents

Abstract

Un polipéptido con una longitud menor de 44 restos de aminoácidos, en donde dicho polipéptido comprende, en un orden desde el extremo amino al extremo carboxi: (a) la secuencia mostrada en SEQ ID NO:1 o la secuencia mostrada en SEQ ID NO:1 con no más de tres adiciones o sustituciones de aminoácidos, (b) la secuencia mostrada en SEQ ID NO:2 o la secuencia mostrada en SEQ ID NO:2 con no más de cinco adiciones, sustracciones o sustituciones de aminoácidos, y (c) la secuencia mostrada en SEQ ID NO:3 o la secuencia mostrada en SEQ ID NO:3 con no más de tres adiciones, sustracciones o sustituciones de aminoácidos.

Description

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excreción urinaria de ANP, BNP y CNP.

Estos resultados demuestran que un polipéptido CU-NP puede tener actividades de activación de GMPc, diuréticas, natriuréticas, de aumento de TFG, supresoras del sistema de renina-angiotensina-aldosterona (RAAS), de descarga

5 cardiaca y hemodinámicas renales favorables mientras que carece de la capacidad de bajar la presión sanguínea y causar hipotensión sistémica. Además, estos resultados demuestran que un polipéptido CU-NP puede incrementar niveles de ANP y BNP endógenos. Los efectos tubulares del polipéptido CU-NP sintetizado son consistentes con las acciones al nivel del túbulo proximal y células de conducto colector medular interno.

10 Tabla 2A

Datos renales y cardiovasculares para CU-NP

Pre-infusión

30 minutos 60 minutos Post-infusión

TFG (ml/min)

38,4 ± 3,6 50,7 ± 2,6* 53,8 ± 2,8†‡ 50,1 ± 3,5*

Flujo de orina (ml/min)

0,13 ± 0,02 1,28 ± 0,25†¶ 1,34 ± 0,22†¶ 0,33 ± 0,04

Excreción de Na+ (µEq/min)

8,0 ± 3,3 216,4 ± 42,3†¶ 237,7 ± 35,8†¶ 51,2 ± 9,4

Excreción de K+ (Teq/min)

14,9 ± 4,5 68,3 ± 12,5† 74,6 ± 15,3† 32,9 ± 3,0

RFPNa+ (%)

84,9 ± 2,5 62,4 ± 4,0† 61,3 ± 1,9† 70,4 ± 2,8†

RFDNa+ (%)

99,2 ± 0,2 92,4 ± 1,2†¶ 92,2 ± 1,1 †¶ 97,7 ± 0,4

Generación renal de GMPc (pmol/min)

469,0 ± 55,4 2168 ± 531†§ 2987 ± 622†¶ 1394 ± 185

GMPc en plasma (pmol/ml)

8,2 ± 0,7 26,2 ± 1,3†¶ 29,8 ± 1,5†¶ 13,0 ± 0,9†

Excreción urinaria de GMPc

770 ± 48 3508 ± 574†¶ 4591 ± 664†¶ 2052 ± 208

PECP (mmHg)

5,6 ± 0,9 3,9 ± 0,7* 2,9 ± 0,9† 4,3 ± 0,8

PAD (mmHg)

1,1 ± 0,6 0,3 ± 0,5 -0,1 ± 0,5* 0,7 ± 0,4

Hipotensión sistémica (mmHg)

135,9 ± 3,9 135,9 ± 2,7 133,9 ± 3,6 142,3 ± 2,7†

PAP (mmHg)

11,8 ± 0,9 10,7 ± 0,8* 10,5 ± 0,7† 12,3 ± 0,7

gasto cardiaco (l/min)

3,1 ± 0,3 3,4 ± 0,5 3,0 ± 0,5 2,8 ± 0,5

Actividad de renina en plasma (ng/ml/hora)

8,8 ± 2 2,5 ± 0,8† 1,5 ± 0,4† 14,0 ± 1,3†

Angiotesina II (pg/ml)

13,9 ± 2,0 6,9 ± 0,7† 4,5 ± 0,3† 22,6 ± 1,6†

Aldosterona (ng/dl)

15,8 ± 2,7 14,2 ± 2,2 12,1 ± 2,1 30,4 ± 3,5†

FSR ajustado (ml/kg/min)

10,8 ± 0,8 11,64 ± 0,5 12,21 ± 0,4† 11,60 ± 0,5

RVR (x10 -3 mmHg·min·l -1)

0,55 ± 0,05 0,50 ± 0,04 0,47 ± 0,03† 0,53 ± 0,04

Hematocrito (%)

37,8 ± 1,3 40,3 ± 1,3† 41,1 ± 1,4† 40,3 ± 1,8†

ANP en plasma (pg/ml)

14,1 ± 0,8 16,7 ± 0,9* 16,6 ± 1,1* 15,2 ± 0,6

BNP en plasma (pg/ml)

8,2 ± 0,9 21,0 ± 1,8† 17,0 ± 2,2† 10,1 ± 1,4

CNP en plasma (pg/ml)

4,0 ± 0,3 154 ± 0,9† 15,1 ± 1,4† 3,2 ± 0,2

Excreción de ANP (pg/ml)

3,2 ± 1,5 21,9 ± 9,5 28,3 ± 13,6 10,4 ± 2,5

Excreción de BNP (pg/ml)

13,9 ± 1,5 18,2 ± 1,5 19,3 ± 1,2 28,3 ± 5,4*

Excreción de CNP (pg/ml)

2,0 ± 0,4 4,0 ± 1,2 9,1 ± 3,9 21,5 ± 17,4

*=P<0,05 frente a pre-I; †=P<0,01 frente a pre-I; ‡=P<0,05 frente a CNP; §=P<0,01 frente a CNP; ¶=P<0,001 frente a CNP; TFG=tasa de filtración glomerular; RFPNa+=reabsorción fraccional proximal de sodio; RFDNa+= reabsorción fraccional distal de sodio; PECP=presión de enclavamiento capilar pulmonar; PAD=presión de atrio derecho; PAP=presión arterial pulmonar; FSR=flujo sanguíneo renal; RVR=resistencia vascular renal.

Tabla 2B

Datos renales y cardiovasculares comparativos para CNP

Pre-infusión

30 minutos 60 minutos Post-infusión

TFG (ml/min)

38 ± 4 42 ± 4 39 ± 3 44 ± 3

Flujo de orina (ml/min)

0,1 ± 0,02 0,3 ± 0,06† 0,4 ± 0,02† 0,3 ± 0,04

Excreción de Na+ (µEq/min)

16 ± 6 56 ± 21 71 ± 8* 30 ± 8

RFPNa+ (%)

83 ± 3 67 ± 3 51 ± 7† 68 ± 3*

RFDNa+ (%)

99 ± 0,5 98 ± 0,8 98 ± 0,5 99 ± 0,2

Generación renal de GMPc (pmol/min)

491 ± 65 452 ± 202 603 ± 199 582 ± 91

GMPc en plasma (pmol/ml)

8 ± 1 11 ± 1† 12 ± 1† 12 ± 1†

Excreción urinaria de GMPc

830 ± 74 1119 ± 102 1338 ± 81 † 1090 ± 76*

*=P<0,05 frente a pre-I;

12

†=P<0,01 frente a pre-I; TFG=tasa de filtración glomerular; RFPNa+=reabsorción fraccional proximal de sodio; RFDNa+=reabsorción fraccional distal de sodio.

Ejemplo 3-Evaluación de CU-NP en células endoteliales de aorta humana in vivo

Se ensayó CU-NP en células endoteliales de aorta humana (HAEC), y se definió el trascurso del tiempo de 5 activación de GMPc in vivo. Se incubó CU-NP con HAEC (pasos 2 a 5, a 80 a 90 % de confluencia) a 10-10, 10-8 o 10-6

M durante 10 minutos en un incubador de CO2. CU-NP (n=6) o CNP (n=3) se administraron por infusión intravenosamente a perros anestesiados normales a 14 pmol/kg/min durante 75 minutos. Se recogió sangre preinfusión, a 25, 30, 45, 60, 75 minutos durante la infusión (I) y a 1, 2, 4, 6, 10, 20, 30, 45, 60 minutos post-infusión (post-I). Se cuantificó el GMP cíclico por radioinmunoensayo.

10 Tal como se muestra en la Tabla 3, CU-NP estimuló la producción de GMPc en HAEC (P<0,01 para 10-6 M frente a no tratamiento). Además, CU-NP incrementó GMPc en plasma in vivo frente a pre-I (todos los momentos durante I y post-I, P<0,01, excepto a 45 minutos post-I, P<0,05). CU-NP activó GMPc a un mayor grado en comparación con CNP (P<0,001, 25 minutos I a 30 minutos post-I). Por tanto, CU-NP activó significativamente GMPc en HAEC, y

15 también estimuló significativamente GMPc a mayor grado que CNP in vivo.

Tabla 3

Efectos de CU-NP sobre HAEC

Concentración de CU-NP

GMPc (media ± EEM, pmol/ml)

10 -10 M

0,0007 ± 0,0007

10 -8 M

0,03 ± 0,02

10 -6 M

0,571 ± 0,05†

No tratamiento

0,003 ± 0,002

†=P<0,01 frente a no tratamiento

20 Ejemplo 4 –acciones estimulantes de GMPc de CU-NP en glomérulos caninos aislados

Se condujeron experimentos para determinar si CU-NP estimula directamente GMPc en glomérulos aislados, y para comparar las acciones activadoras de GMPc de CU-NP con CNP, URO y CNP-C, que consistían en la longitud completa de 22 aminoácidos de CNP con un duplicado del extremo N fusionado en la posición C terminal. Los 25 glomérulos se aislaron tras la extracción de riñones caninos normales. CU-NP, CNP, URO, y CNP-C (10-5 M) se incubaron con glomérulos frente a control. Se midió GMP cíclico por RIA, con corrección para niveles de proteína. CU-NP y URO suscitaron mayores respuestas de GMPc que los respectivos controles (P<0,01), pero sin diferencia entre grupos. CU-NP y URO estimularon mayores respuestas de GMPc frente a CNP y frente a CNP-C (P<0,001). Por tanto, CU-NP estimuló GMPc en glomérulos en mayor grado que CNP, pero en similar grado que URO. CNP-C

30 no activó GMPc. Estos datos sugieren que el GMPc aumentado potencialmente activado puede requerir extremos N y/o C de ligandos para el receptor A de NP. Tabla 4

Efectos de CU-NP sobre la producción de GMPc en glomérulos aislados

Tratamiento

GMPc (media ± EEM; fmol/Tg)

CU-NP

0,73 ± 0,09†‡

CNP

0,0019 ± 0,0005

URO

0,69 ± 0,07†‡

CNP-C

0,00597 ± 0,0053

†=P<0,01 frente a correspondiente control; ‡=P<0,001 frente a CNP y CNP-C

35 Ejemplo 5 – Efectos de hemoconcentración de CU-NP

Se estudiaron tres NP humanos (BNP, CNP, URO) y CU-NP para evaluar sus efectos sobre la permeabilidad vascular manifestada por un incremento en hematocrito. Perros anestesiados normales recibieron intravenosamente infusiones de BNP (n=7), CNP (n=6), URO (n=5), o CU-NP (n=6) a 14 pmol/kg/minuto. Se recogió sangre en tubos

40 EDTA sobre hielo y se centrifugaron. Los datos se informan para la línea base y a 60 minutos de infusión. Además de incrementar el hematocrito (Tabla 5), CU-NP redujo la presión de ECP in vivo (línea base 6 ± 0.9 mmHg, 60 minutes 3 ± 0.9 mmHg; P<0,05). Por tanto, los efectos de la hemoconcentración de CU-NP pueden contribuir a sus acciones de descarga cardiaca in vivo.

13

Tabla 5

Efectos de CU-NP sobre hematocrito

Tratamiento

Hematocrito (media ± EEM; %)

línea base

60 min

BNP

36 ± 1 40 ± 2

CNP

36 ± 1 37 ± 1

URO

37 ± 1 40 ± 1

CU-NP

38 ± 1 41 ± 1†

(*=P<0,05; †=P<0,01)

Ejemplo 6 – Acciones cardiorrenales y neurohumurales de CU-NP en insuficiencia cardiaca experimental canina

5 Se evaluó CU-NP en insuficiencia cardiaca (IC) canina para determinar si CU-NP activaría el segundo mensajero GMPc y ejercería acciones favorables sin excesiva hipotensión. Se indujo IC suave marcando el ritmo (180 lpm durante 10 días). CU-NP se administró por infusión intravenosamente en 6 perros anestesiados a 75 ng/kg/minuto durante 75 minutos. TFG se midió por la depuración de inulina. Se valoró la reabsorción fraccional de Na+ (RFNa)

10 por depuración de Li+. Los datos se recogieron a pre-infusión (pre-I), 30 y 60 minutos I, y post-I. La actividad de la renina en plasma, la angiotensina II, la aldosterona y el GMPc también se midieron. Los resultados (media ± EEM) se presenta en la Tabla 6.

CU-NP incrementó GMPc en plasma, la excreción urinaria de GMPc, la generación de GMPc renal neta, el flujo de

15 orina, y la excreción urinaria de Na+. Se redujeron RFNa proximal y distal. Se aumentaron el flujo sanguíneo renal y la TFG, con un descenso suave en PAM. Tanto GC como RVS eran iguales. Se redujeron PECP y PAP. Se suprimieron también la actividad de renina en plasma, la angiotensina II y la aldosterona. Por tanto, CU-NP activó GMPc en IC canina y ejerció las acciones de aumento renal, descarga cardiaca y de supresión del sistema reninaangiotensina-aldosterona sin excesiva hipotensión.

20 Tabla 6

Datos renales y cardiovasculares para CU-NP en IC experimental

Pre-infusión

30 minutos 60 minutos Post-infusión

TFG (ml/min)

40 ± 5 51 ± 9 51 ± 3 53 ± 7†

Flujo de orina (ml/min)

0,09 ± 0,01 0,50 ± 0,15† 0,56 ± 0,11† 0,19 ± 0,03

Excreción de Na+ (µEq/min)

2,9 ± 0,9 80,5 ± 29,4† 102,0 ± 22,2† 22,1 ± 7,9

RFPNa+ (%)

89 ± 2 68 ± 5† 67 ± 3† 79 ± 3*

RFDNa+ (%)

99,6 ± 0,1 96 ± 1† 96 ± 1† 99 ± 0,3

Generación renal de GMPc (pmol/min)

610 ± 66 2977 ± 549† 3255 ± 662† 1342 ± 200

GMPc en plasma (pmol/ml)

17 ± 3 41 ± 3† 43 ± 2† 21 ± 2

Excreción urinaria de GMPc

1186 ± 152 5066 ± 826† 5476 ± 876† 2394 ± 197

PECP (mmHg)

11 ± 1 9 ± 1† 8 ± 1† 10 ± 1

PAP (mmHg))

16 ± 0,8 15 ± 0,6* 14 ± 0,7† 16 ± 0,7

Actividad de renina en plasma (ng/ml/hora)

9 ± 2 3 ± 1† 2 ± 1† 9 ± 2

Angiotesina II (pg/ml)

32 ± 7 9 ± 2† 9 ± 3† 19 ± 4

Aldosterona (ng/dl)

14 ± 5 9 ± 2 6 ± 2* 11 ± 3

FSR (ml/min)

238 ± 39 281 ± 42* 294 ± 42† 275 ± 42*

PAM (mmHg)

108 ± 9 100 ± 8† 96 ± 8† 107 ± 8

GC (l/min)

2,4 ± 0,1 2,5 ± 0,1 2,4 ± 0,1 2,3 ± 0,04

RVS (mmHg·l -1·min)

42 ± 3 39 ± 3 39 ± 3 45 ± 3

*=P<0,05 frente a pre-I; †=P<0,01 frente a pre-I; TFG=tasa de filtración glomerular; RFPNa+=reabsorción fraccional proximal de sodio; RFDNa+=reabsorción fraccional distal de sodio; PECP=presión de enclavamiento capilar pulmonar; PAP=presión arterial pulmonar; FSR=flujo sanguíneo renal; PAM=presión arterial media; GC=gasto cardiaco; RVS=resistencia vascular sistémica.

Ejemplo 7 – Efectos in vivo de CU-NP sobre la presión de perfusión renal

Se condujeron estudios para determinar las acciones in vivo de CNP, CU-NP y URO sobre la presión de perfusión renal (PPR, estimada por PAM-PAD), ya que PPR es una clave determinante de la función renal. Dada la acción de aumento de TFG de CU-NP, también se hicieron estudios in vitro para ensayar la hipótesis de que CU-NP (a

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Claims (1)

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