PT2171053E

PT2171053E - Polipeptídeos natriuréticos

Info

Publication number: PT2171053E
Application number: PT87962874T
Authority: PT
Inventors: John C Burnett; Candace Y W Lee
Original assignee: Mayo Foundation
Priority date: 2007-07-20
Filing date: 2008-07-18
Publication date: 2014-06-25
Also published as: JP2010534062A; ES2472791T3; AU2008279379A1; PT2765139T; US20090054337A1; DK2171053T3; KR101581476B1; CN101541957B; EP2765139B1; HK1135136A1; EP2765139A2; EP2171053A1; CA2693303C; ES2632953T3; DK2765139T3; JP5718051B2; KR20100063019A; EP2765139A3; EP2171053B1; EP2171053A4

Description

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DESCRIÇÃO "POLIPEPTÍDEOS NATRIURÉTICOS"

DECLARAÇÃO SOBRE A INVESTIGAÇÃO APOIADA FINANCEIRAMENTE PELO GOVERNO FEDERAL

Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob a subvenção HL036634 concedida pelos Institutos Nacionais do Coração, Pulmão e Sangue. 0 governo tem determinados direitos na invenção.

ANTECEDENTES 1. Campo técnico

Este documento refere-se a polipeptídeos natriuréticos. Por exemplo, este documento proporciona métodos e materiais relacionados com os polipeptídeos natriuréticos, e o uso de polipeptídeos natriuréticos para o tratamento de patologias cardiovasculares e renais. 2. Informação sobre os antecedentes

Os polipeptídeos natriuréticos são polipeptídeos que podem causar natriurese (aumento da excreção de sódio na urina). Estes polipeptídeos podem ser produzidos pelo cérebro, coração, rim e/ou tecido vascular. 0 documento EP 0497 368 AI descreve peptídeos natriuréticos, incluindo peptídeos natriuréticos

quiméricos. Também descrito no documento EP 0497 368 AI estão agentes para suprimir o crescimento de células do músculo liso vascular, que contêm esses peptídeos como ingredientes eficazes.

Lee e Burnett (Hear Failure Reviews 2007, 12(2) : 131- 142) também descrevem peptídeos natriuréticos quiméricos. Os autores proporcionam um artigo de revisão sobre as aplicações terapêuticas de certos peptídeos natriuréticos em síndromes de insuficiência aguda do coração.

RESUMO A invenção pode ser definida pelas reivindicações 2 anexas .

De acordo com uma realização da invenção, é proporcionado um polipeptídeo com menos do que 44 resíduos de aminoácidos de comprimento, em que o polipeptídeo referido compreende, numa ordem a partir do terminal amino para o terminal carboxilo: (a) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 com não mais do que uma adição, subtração, ou substituição, (b) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 com não mais do que duas adições, subtrações, ou substituições, e (c) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 com não mais do que uma adição, subtração, ou substituição, em que o polipeptídeo referido compreende atividade natriurética. 0 polipeptídeo de acordo com a invenção pode compreender, numa ordem a partir do terminal amino para o terminal carboxilo: (a) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, (b) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 com não mais do que duas adições, subtrações, ou substituições, e (c) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 com não mais do que uma adição, subtração, ou substituição; ou (a) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 com não mais do que uma adição, subtração, ou substituição, (b) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2, e (c) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 com não mais do que uma adição, subtração, ou substituição; ou (a) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, ou a 3 sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 com não mais do que uma adição, subtração, ou substituição, (b) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 com não mais do que duas adições, subtrações, ou substituições, e (c) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3. 0 polipeptideo de acordo com a invenção pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 4. 0 polipeptideo de acordo com a invenção pode compreender, numa ordem a partir do terminal amino para o terminal carboxilo: (a) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 com não mais do que uma substituição de aminoácidos conservativa, (b) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 com não mais do que duas adições, subtrações, ou substituições, e (c) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 com não mais do que uma adição, subtração, ou substituição; ou (a) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 com não mais do que uma adição, subtração, ou substituição, (b) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 com não mais do que duas substituições de aminoácidos conservativas, e (c) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 com não mais do que uma adição, subtração, ou substituição; ou (a) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 com não mais do que uma adição, subtração, ou substituição, (b) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 com não mais do que duas adições, subtrações, ou substituições, e 4 (c) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 com não mais do que uma substituição de aminoácidos conservativa. 0 polipeptideo de acordo com a invenção pode não ter a capacidade para induzir a hipotensão arterial sistémica. 0 polipeptideo de acordo com a invenção pode ser um polipeptideo substancialmente puro.

De acordo com uma realização da invenção, é fornecido um ácido nucleico isolado que codifica o polipeptideo da invenção.

Para além disso, de acordo com uma realização da invenção, é fornecido um vetor, o vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica o polipeptideo da invenção.

Para além disso, de acordo com uma realização da invenção, é fornecida uma célula hospedeira, a célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico que codifica o polipeptideo da invenção. A célula hospedeira pode ser uma célula hospedeira eucariótica.

De acordo com uma realização da invenção, é proporcionada uma composição farmacêutica que compreende um veiculo farmaceuticamente aceitável e o polipeptideo da invenção.

Para além disso, de acordo com uma realização da invenção, é fornecido um polipeptideo da invenção para uso no aumento da atividade natriurética num mamifero, sem diminuir a pressão sanguínea.

De acordo com uma realização da invenção, é fornecido um polipeptideo da invenção para utilização no tratamento de um mamífero com uma patologia cardiovascular ou uma patologia renal, em que o polipeptideo referido é para ser administrado sob condições em que a gravidade de uma manifestação da patologia cardiovascular ou patologia renal referidas é reduzida. De acordo com uma realização preferida, a administração do polipeptideo referido ao 5 mamífero referido não diminui a pressão sanguínea do mamífero referido.

Este documento refere-se a polipeptídeos natriuréticos. Por exemplo, este documento proporciona métodos e materiais relacionados com polipeptídeos natriuréticos, e o uso de polipeptídeos natriuréticos para tratar patologias cardiovasculares, patologias renais, ou tanto patologias cardiovasculares como patologias renais. Em alguns casos, um polipeptídeo aqui proporcionado pode ter atividade diurética, atividade natriurética, a capacidade de ativar o cGMP, a capacidade de aumentar a taxa de filtração glomerular, a capacidade de reduzir a produção de renina, a capacidade de reduzir a produção de angiotensina, a capacidade de reduzir a produção de aldosterona, a capacidade de reduzir as pressões anormalmente elevadas de enchimento cardíaco, a capacidade de otimizar o fluxo sanguíneo renal, ou uma combinação das mesmas. Em alguns casos, um polipeptídeo aqui proporcionado pode aumentar os níveis endógenos de ANP, BNP e CNP. Em alguns casos, um polipeptídeo aqui proporcionado pode não ter a capacidade para reduzir a pressão sanguínea e pode não ter a capacidade de causar hipotensão arterial sistémica. Em alguns casos, um polipeptídeo aqui fornecido pode ser um agonista do recetor-A do peptídeo natriurético, do recetor-B do peptídeo natriurético, ou de ambos o recetor-A do peptídeo natriurético e do recetor-B do peptídeo natriurético.

Em geral, um aspeto do presente documento apresenta um polipeptídeo de menos de 44 resíduos de aminoácidos de comprimento, em que o polipeptídeo compreende, numa ordem a partir do terminal amino para o terminal carboxilo: (a) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 com não mais do que uma adição, subtração, ou substituição, (b) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2, ou a sequência estabelecida 6 na SEQ ID NO: 2 com não mais do que duas adições, subtrações, ou substituições, e (c) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO : 3 com não mais do que uma adição, subtração, ou substituição. 0 polipeptídeo compreende atividade natriurética. 0 polipeptídeo pode não possuir a capacidade para induzir a hipotensão arterial sistémica. 0 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1. 0 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2. 0 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3. 0 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2, e a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3. 0 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 com não mais do que uma substituição de aminoácidos conservativa. 0 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 com não mais do que duas substituições de aminoácidos conservativas. 0 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 com não mais do que uma substituição de aminoácidos conservativa. 0 polipeptídeo pode ser um polipeptídeo substancialmente puro.

Num outro aspeto, este documento apresenta um ácido nucleico isolado que codifica um polipeptídeo de menos de 44 resíduos de aminoácidos de comprimento, em que o polipeptídeo compreende, numa ordem a partir do terminal amino para o terminal carboxilo: (a) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 com não mais do que uma adição, subtração, ou uma substituição, (b) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 com não mais do que duas adições, subtrações, ou substituições, e (c) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 com não mais do que 7 uma adição, subtração, ou uma substituição. 0 polipeptídeo compreende atividade natriurética. 0 polipeptídeo pode não possuir a capacidade para induzir a hipotensão arterial sistémica. 0 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1. 0 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2. 0 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3. 0 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2, e a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3. 0 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 com não mais do que uma substituição de aminoácidos conservativa. 0 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 com não mais do que duas substituições de aminoácidos conservativas. 0 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 com não mais do que uma substituição de aminoácidos conservativa. 0 polipeptídeo pode ser um polipeptídeo substancialmente puro.

Num outro aspeto, este documento apresenta um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de menos de 44 resíduos de aminoácidos de comprimento, em que o polipeptídeo compreende, numa ordem a partir do terminal amino para o terminal carboxilo: (a) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 com não mais do que uma adição, subtração, ou uma substituição, (b) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 com não mais do que duas adições, subtrações, ou substituições, e (c) a sequência para estabelecida na SEQ ID NO: 3, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 com não mais do que uma adição, subtração, ou uma substituição. 0 polipeptídeo compreende atividade natriurética. 0 polipeptídeo pode não possuir a capacidade induzir a hipotensão arterial sistémica. 0 8 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1. 0 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2. 0 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3. 0 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2, e a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3. O polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 com não mais do que uma substituição de aminoácidos conservativa. 0 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 com não mais do que duas substituições de aminoácidos conservativas. 0 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 com não mais do que uma substituição de aminoácidos conservativa. 0 polipeptídeo pode ser um polipeptídeo substancialmente puro.

Num outro aspeto, este documento apresenta uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo com menos de 44 resíduos de aminoácidos de comprimento, em que o polipeptídeo compreende, numa ordem a partir do terminal amino para o terminal carboxilo: (a) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 com não mais do que uma adição, subtração, ou uma substituição, (b) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 com não mais do que duas adições, subtrações, ou substituições, e (c) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 com não mais do que uma adição, subtração, ou uma substituição. 0 polipeptídeo compreende atividade natriurética. 0 polipeptídeo pode não possuir a capacidade para induzir a hipotensão arterial sistémica. 0 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1. 0 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2. 0 polipeptídeo pode 9 compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3. O polipeptideo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2, e a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3.0 polipeptideo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 com não mais do que uma substituição de aminoácidos conservativa. 0 polipeptideo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 com não mais do que duas substituições de aminoácidos conservativas. 0 polipeptideo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 com não mais do que uma substituição de aminoácidos conservativa. 0 polipeptideo pode ser um polipeptideo substancialmente puro. A célula hospedeira pode ser uma célula hospedeira eucariótica.

Num outro aspeto, este documento apresenta uma composição farmacêutica que compreende um veiculo farmaceuticamente aceitável e um polipeptideo de menos de 44 resíduos de aminoácidos de comprimento, em que o polipeptideo compreende, numa ordem a partir do terminal amino para o terminal carboxilo: (a) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 com não mais do que uma adição, subtração, ou uma substituição, (b) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 com não mais do que duas adições, subtrações, ou substituições, e (c) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 com não mais do que uma adição, subtração, ou uma substituição. 0 polipeptideo compreende atividade natriurética. 0 polipeptideo pode não possuir a capacidade para induzir a hipotensão arterial sistémica. 0 polipeptideo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1. 0 polipeptideo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2. 0 polipeptideo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3. 0 polipeptideo pode compreender a sequência 10 estabelecida na SEQ ID NO: 1, a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2, e a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3. O polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 com não mais do que uma substituição de aminoácidos conservativa. O polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 com não mais do que duas substituições de aminoácidos conservativas. O polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 com não mais do que uma substituição de aminoácidos conservativa. O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo substancialmente puro.

Também é divulgado um método para aumentar a atividade natriurética num mamífero, sem baixar a pressão sanguínea. O método compreende a administração ao mamífero de um polipeptídeo de menos de 44 resíduos de aminoácidos de comprimento, em que o polipeptídeo compreende, numa ordem a partir do terminal amino para o terminal carboxilo: (a) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 com não mais do que três adições, subtrações, ou substituições, (b) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 com não mais do que cinco adições, subtrações, ou substituições, e (c) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 com não mais do que três adições, subtrações, ou substituições. O polipeptídeo pode compreender atividade natriurética. O polipeptídeo pode não possuir a capacidade para induzir a hipotensão arterial sistémica. O polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1. O polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2. O polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3. O polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2, e a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3. O 11 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 com não mais do que três substituições de aminoácidos conservativas. 0 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 com não mais do que cinco substituições de aminoácidos conservativas. 0 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 com não mais do que três substituições de aminoácidos conservativas. 0 polipeptídeo pode ser um polipeptídeo substancialmente puro.

Também é divulgado um método para o tratamento de um mamífero com uma condição cardiovascular ou uma condição renal. 0 método compreende a administração ao mamífero de um polipeptídeo de menos de 44 resíduos de aminoácidos de comprimento, sob condições em que a gravidade de uma manifestação da condição cardiovascular ou da condição renal é reduzida, em que o polipeptídeo compreende, numa ordem a partir do terminal amino para o terminal carboxilo: (a) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 com não mais do que três adições, subtrações, ou substituições, (b) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 com não mais do que cinco adições, subtrações, ou substituições, e (c) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 com não mais do que três adições, subtrações, ou substituições. 0 polipeptídeo pode compreender atividade natriurética. 0 polipeptídeo pode não possuir a capacidade para induzir a hipotensão arterial sistémica. 0 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1. 0 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2. 0 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3. 0 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2, e a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3. 0 12 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 com não mais do que três substituições de aminoácidos conservativas. 0 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 com não mais do que cinco substituições de aminoácidos conservativas. 0 polipeptídeo pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 com não mais do que três substituições de aminoácidos conservativas. 0 polipeptídeo pode ser um polipeptídeo substancialmente puro. A administração do polipeptídeo ao mamífero pode ser tal que não diminui a pressão sanguínea do mamífero. A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado como vulgarmente entendido por um perito na tecnologia à qual pertence a invenção. Em caso de conflito, a presente especificação controlará, incluindo as definições.

Os detalhes de uma ou mais realizações da invenção são estabelecidos nos desenhos acompanhantes e na descrição que se segue. Outras caracteristicas, objetos e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição e dos desenhos, e a partir das reivindicações.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 é um diagrama esquemático de um polipeptídeo CU-NP, que é de 32 resíduos de aminoácidos de comprimento (SEQ ID NO: 4) . Os dez primeiros resíduos de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 correspondem aos resíduos de aminoácidos de 1 a 10 da urodilatina de humano e são designados como SEQ ID NO: 1. Os resíduos de aminoácidos de 11 a 27 da SEQ ID NO: 4 correspondem aos resíduos de aminoácidos de 6 a 22 do CNP maturo de humano e são designados como SEQ ID NO: 2. Os resíduos de aminoácidos de 28 a 32 da SEQ ID NO: 4 correspondem aos resíduos de aminoácidos de 28 a 32 da urodilatina de humano e são designados como SEQ ID NO: 3. 13 A figura 2 é um gráfico gue mostra a pressão de perfusão renal (estimada por PPR = PAM - PAD) de cães normais anestesiados tratados com o CU-NP ou o URO, tal como indicado (média ± SEM; * = P < 0,05 vs. a linha de base; Φ = P < 0,05 entre os grupos). A figura 3 é um gráfico gue mostra a resposta de cGMP para concentrações eguimolares do CU-NP, do CNP, e do URO em glomérulos isolados de caninos (n = 3 — 7 para brancos, isto é, controlo, n = 5 — 8 para glomérulos, t = P < 0, 0001 vs. branco; * = p < 0,01 vs. branco). A figura 4 é um gráfico gue mostra a resposta de cGMP para concentrações equimolares do CU-NP, na presença ou na ausência de um antagonista de NPR-A (1 μΜ de A71915), um antagonista de NPR-B (1 μΜ de P19) , ou de ambos os antagonistas (A71915 seguido de P19, concentração final de 1 μΜ para ambos), tal como avaliado em glomérulos isolados de caninos (n = 2 — 4 para brancos, n = 3 — 6 para glomérulos, * = P < 0,05 vs. branco; t = P < 0,01 vs. branco; Φ = P < 0,0001 vs. branco). A figura 5 é um gráfico que mostra a resposta de cGMP ao CNP ou ao CU-NP na ausência ou na presença de um anticorpo para NPR-B (1:100), tal como avaliado em células endoteliais aórticas humanas.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Este documento refere-se a polipeptideos natriuréticos. Por exemplo, este documento proporciona métodos e materiais relacionados com polipeptídeos natriuréticos e o uso de polipeptídeos natriuréticos para o tratamento de condições cardiovasculares (por exemplo, insuficiência cardíaca descompensada aguda, sindromes coronárias agudas, e remodelamento ventricular pós-infarto do miocárdio) , e de condições renais (por exemplo, disfunção renal no período perioperatório, disfunção renal secundária a insuficiência cardíaca e nefropatia de 14 diabetes) .

Um polipeptídeo aqui proporcionado tem atividade natriurética. Em alguns casos, tem a capacidade para ativar o cGMP, a capacidade de aumentar a taxa de filtração glomerular, a capacidade de reduzir a produção de renina, a capacidade de reduzir a produção de angiotensina, a capacidade de reduzir a produção de aldosterona, a capacidade de reduzir as pressões anormalmente elevadas de enchimento cardíaco, a capacidade de otimizar o fluxo sanguíneo renal, ou uma combinação das mesmas. Em alguns casos, um polipeptídeo aqui proporcionado pode aumentar os níveis endógenos do ANP, BNP e do CNP. Em alguns casos, um polipeptídeo aqui proporcionado pode não ter a capacidade para reduzir a pressão sanguínea e causar hipotensão arterial sistémica. Em alguns casos, um polipeptídeo aqui proporcionado pode ser um agonista do recetor-A do peptídeo natriurético, do recetor-B do peptídeo natriurético, ou de ambos, o recetor-A do peptídeo natriurético e do recetor-B do peptídeo natriurético.

Por exemplo, um polipeptídeo aqui proporcionado pode incluir a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, e SEQ ID NO: 3. Em alguns casos, um polipeptídeo aqui proporcionado pode conter uma sequência de aminoácidos que se alinha com (a) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 com uma ou zero adições, deleções ou substituições de aminoácidos, (b) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 com duas ou menos (uma ou zero) adições, deleções ou substituições de aminoácidos, e (c) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 com uma ou zero adições, deleções, ou substituições de aminoácidos. Por exemplo, um polipeptídeo aqui proporcionado pode conter a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, com a exceção de que o primeiro resíduo de treonina ou o último resíduo de serina da SEQ ID NO: 1 é suprimido ou substituído por um resíduo de aminoácido diferente. 15

As substituições de aminoácidos podem ser substituições de aminoácidos conservativas. As substituições conservativas de aminoácidos podem ser, por exemplo, aspártico — glutâmico como aminoácidos acidicos; lisina / arginina / histidina como aminoácidos básicos; leucina / isoleucina, metionina / valina, alanina / valina como aminoácidos hidrofóbicos; serina / glicina / alanina / treonina como aminoácidos hidrofílicos. As substituições conservativas de aminoácidos também incluem agrupamentos baseados em cadeias laterais. Por exemplo, um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais alifáticas é a glicina, a alanina, a valina, a leucina e a isoleucina; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais alifáticas — hidroxilo é a serina e a treonina; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais contendo amida é a asparagina e a glutamina; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais aromáticas é a fenilalanina, a tirosina e o triptofano; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais básicas é a lisina, a arginina e a histidina; e um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais contendo enxofre é a cisteina e a metionina. Depois de fazer uma substituição de aminoácidos, as atividades do polipeptídeo contendo a substituição de aminoácidos pode ser avaliada usando os ensaios aqui descritos.

Em alguns casos, um polipeptídeo aqui proporcionado pode conter (a) uma primeira sequência de aminoácidos que, ou é estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou alinha com a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 com uma, ou zero deleções, ou substituições de aminoácidos, (b) uma segunda sequência de aminoácidos que, ou é estabelecida na SEQ ID NO: 2 ou alinha com a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2, com duas ou menos (uma ou zero) adições, ou substituições de aminoácidos, e (c) uma terceira sequência de aminoácidos que, ou é estabelecida na SEQ ID NO: 3 ou alinha com a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 com uma ou zero 16 deleções, ou substituições de aminoácidos. Por exemplo, um polipeptideo aqui proporcionado pode compreender ou consistir da sequência apresentada na SEQ ID NO: 4.

Um polipeptideo aqui proporcionado é menor do que 44 aminoácidos de comprimento. Por exemplo, um polipeptideo aqui proporcionado pode ser entre, 28 e 42, entre 29 e 41, entre 30 e 40, entre 31 e 39, ou entre 30 e 35 residuos de aminoácidos de comprimento. Será apreciado que um polipeptideo com um comprimento de 25 residuos de aminoácidos é um polipeptideo com um comprimento de 25 residuos de aminoácidos.

Em alguns casos, um polipeptideo aqui fornecido pode ser um polipeptideo substancialmente puro. Tal como aqui utilizado, o termo "substancialmente puro" em referência a um polipeptideo significa que o polipeptideo é substancialmente livre de outros polipeptideos, lipidos, hidratos de carbono e ácidos nucleicos, com os quais está naturalmente associado. Assim, um polipeptideo substancialmente puro é qualquer polipeptideo que é removido do seu ambiente natural e é pelo menos 60 por cento puro, ou é qualquer polipeptideo sintetizado quimicamente. Um polipeptideo substancialmente puro pode ser de pelo menos cerca de 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ou 99 por cento puro. Tipicamente, um polipeptideo substancialmente puro dará uma única banda principal num gel de poliacrilamida não redutor.

Um polipeptideo proporcionado aqui pode ser obtido por expressão de um ácido nucleico recombinante que codifica o polipeptideo, ou por síntese química (por exemplo, usando métodos de fase sólida de síntese polipeptídica ou um sintetizador de peptídeos, tal como um sintetizador de peptídeos ABI 431A; Applied Biosystems, Foster City, CA) . Por exemplo, pode ser utilizada a tecnologia recombinante convencional utilizando os vetores de expressão que codificam um polipeptideo aqui proporcionado. Os 17 polipeptídeos resultantes podem, em seguida, ser purificados utilizando, por exemplo, técnicas de cromatografia de afinidade e de HPLC. 0 grau de purificação pode ser medido por qualquer método adequado, incluindo, mas não se limitando a: cromatografia de coluna, eletroforese em gel de poliacrilamida, ou cromatografia liquida de elevado desempenho. Um polipeptídeo aqui proporcionado pode ser concebido ou modificado para conter uma sequência de marcador que permita que o polipeptídeo seja purificado (por exemplo, capturado numa matriz de afinidade). Pode por exemplo ser usado um marcador tal como c-myc, hemaglutinina, poli-histidina, ou marcador Flag™ (Kodak) para auxiliar a purificação do polipeptídeo. Estes marcadores podem ser inseridos em qualquer lugar dentro do polipeptídeo, incluindo tanto no terminal carboxilo como amino. Outras fusões que podem ser utilizadas incluem enzimas que ajudam na deteção do polipeptídeo, tal como a fosfatase alcalina.

Um polipeptídeo aqui proporcionado pode ser produzido para conter três regiões, uma primeira região que inclui um terminal-N (por exemplo, uma sequência terminal-N de um polipeptídeo urodilatina humano), uma segunda região que inclui uma estrutura de anel de um polipeptídeo maduro natriurético, tal como um polipeptídeo CNP humano, e terceira região que inclui um terminal-C (por exemplo, uma sequência terminal-C de um polipeptídeo urodilatina humano).

Um polipeptídeo aqui fornecido pode ser usado para o tratamento de doenças cardiovasculares, insuficiência cardíaca congestiva, enfarte do miocárdio, doenças das artérias coronárias, doenças renais. Por exemplo, um polipeptídeo CU-NP possuindo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4 pode ser administrado a um humano com uma doença da artéria coronária, sob condições em que é reduzida a gravidade dos sintomas da doença da 18 artéria coronária do humano.

Um polipeptideo aqui proporcionado pode ser formulado como uma composição farmacêutica por mistura com excipientes ou veiculos farmaceuticamente aceitáveis, não-tóxicos. Estas composições podem ser administradas a um sujeito em necessidade das mesmas, numa quantidade eficaz para tratar, por exemplo, condições do coração, figado, rim, ou outras condições de retenção de sódio. As composições farmacêuticas podem ser preparadas para a administração parentérica, particularmente na forma de soluções liquidas ou suspensões em soluções aquosas de tampão fisiológico; para a administração oral, particularmente na forma de comprimidos ou cápsulas; ou para a administração intranasal, particularmente na forma de pós, gotas nasais ou aerossóis. As composições para outras vias de administração podem ser preparadas como desejado, utilizando os métodos adequados.

As formulações para a administração parentérica podem incluir como excipientes comuns, água estéril, solução salina, polialquilenoglicóis tais como o polietilenoglicol, óleos de origem vegetal, naftalenos hidrogenados, e combinações dos mesmos. Em alguns casos, podem ser utilizados como excipientes polímero de lactido biocompatível, biodegradável, copolímero de lactido / glicolido, copolímeros de polioxietileno — polioxipropileno, ou combinações dos mesmos, para controlar a libertação do polipeptideo in vivo. Outros sistemas de administração parentérica adequados que podem ser utilizados incluem, sem limitação, copolímero de partículas de acetato de etilenovinil, bombas osmóticas, sistemas de infusão implantáveis, lipossomas e combinações dos mesmos. As formulações para a administração por inalação podem incluir excipientes tais como a lactose. As formulações para inalação podem ser soluções aquosas contendo, por exemplo, éter de polioxietileno-9-laurilo, glicocolato, 19 desoxicolato, ou combinações dos mesmos, ou podem ser soluções oleosas para a administração na forma de gotas nasais. Se desejado, uma composição contendo um polipeptídeo aqui fornecido pode ser formulada na forma de gel para ser aplicada por via intranasal. As formulações para a administração parentérica podem incluir glicocolato para a administração bucal.

Para a administração oral, podem ser preparados comprimidos ou cápsulas, utilizando métodos adequados com excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes de ligação (por exemplo, amido de milho pré-gelatinizado, polivinilpirrolidona, ou hidroxipropilmetilcelulose); agentes de enchimento (por exemplo, lactose, celulose microcristalina ou hidrogenofosfato de cálcio); agentes lubrificantes (por exemplo estearato de magnésio, talco ou sílica); agentes desintegrantes (por exemplo, amido de batata ou amido glicolato de sódio); ou agentes humidificantes (por exemplo, lauril sulfato de sódio).Os comprimidos podem ser revestidos através de métodos apropriados. As preparações para a administração oral podem ser formuladas para originar uma libertação controlada do polipeptídeo.

As preparações nasais podem ser apresentadas numa forma liquida ou como um produto seco. As suspensões aquosas nebulizadas ou soluções podem incluir veículos ou excipientes para ajustar o pH e/ou a tonicidade. Ácidos nucleicos que codificam para polipeptídeos

Este documento também proporciona ácidos nucleicos isolados que codificam para um ou mais dos polipeptídeos aqui fornecidos. 0 termo "isolado", tal como aqui utilizado com referência a ácido nucleico, refere-se a um ácido nucleico de ocorrência natural que não está imediatamente contíguo com ambas as sequências com as quais está imediatamente contíguo (uma na extremidade 5' e uma na extremidade 3') no genoma que ocorre naturalmente do 20 organismo a partir do qual é derivado. Por exemplo, um ácido nucleico isolado pode ser, sem limitação, uma molécula de ADN recombinante de qualquer comprimento, desde que uma das sequências de ácidos nucleicos normalmente encontrada imediatamente flanqueando essa molécula de ADN recombinante num genoma de ocorrência natural seja removida ou ausente. Assim, um ácido nucleico isolado inclui, sem limitação, um ADN recombinante que existe como uma molécula separada (por exemplo, um ADNc ou um fragmento de ADN genómico produzido por PCR ou tratamento com uma endonuclease de restrição), independente de outras sequências, bem como ADN recombinante que é incorporado num vetor, num plasmideo de replicação autónoma, um virus (por exemplo, um retrovirus, adenovirus ou virus do herpes), ou no ADN genómico de um procariota ou eucariota. Para além disso, um ácido nucleico isolado pode incluir uma molécula de ADN recombinante que é parte de uma sequência hibrida ou de fusão do ácido nucleico. O termo "isolado", tal como aqui utilizado com referência a ácido nucleico, também inclui qualquer ácido nucleico que não ocorre naturalmente, uma vez que sequências de ácidos nucleicos que não ocorrem naturalmente não são encontradas na natureza e não têm as sequências imediatamente adjacentes num genoma que ocorre naturalmente. Por exemplo, um ácido nucleico que não ocorre naturalmente, tal como um ácido nucleico desenhado, é considerado ser um ácido nucleico isolado. Pode ser feito um ácido nucleico desenhado (por exemplo, um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende ou que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4), usando a clonagem molecular comum ou técnicas químicas de síntese de ácido nucleico. O ácido nucleico de não ocorrência natural isolado pode ser independente de outras sequências, ou incorporado num vetor, num plasmideo de replicação autónoma, num vírus (por exemplo, um retrovirus, 21 adenovírus ou vírus do herpes) , ou o ADN genómico de um procariota ou eucariota. Para além disso, um ácido nucleico que não ocorre naturalmente pode incluir uma molécula de ácido nucleico que é parte de uma sequência híbrida ou de fusão do ácido nucleico. Um ácido nucleico existente entre as centenas de milhões de outros ácidos nucleicos no interior, por exemplo, de bibliotecas de ADNc ou bibliotecas de ADN genómico, ou fatias de gel contendo um ADN genómico digerido por restrição, não é para ser considerado um ácido nucleico isolado.

Tal como aqui utilizado, o termo "ácido nucleico" refere-se tanto ao ARN como ao ADN, incluindo o ARNm, o ADNc, o ADN genómico, o ADN sintético (por exemplo, sintetizado quimicamente), e análogos de ácidos nucleicos. 0 ácido nucleico pode ser de cadeia dupla ou de cadeia simples, e quando de cadeia simples, pode ser a cadeia sentido ou a cadeia antissentido. Para além disso, o ácido nucleico pode ser circular ou linear. Os análogos de ácidos nucleicos podem ser modificados na porção de base, na porção de açúcar, ou no esqueleto de fosfato, para melhorar, por exemplo, a estabilidade, a hibridação, ou a solubilidade de um ácido nucleico. As modificações na porção de base incluem desoxiuridina para desoxitimidina, e 5-metil-2'-desoxicitidina e 5-bromo-2'-desoxicitidina para desoxicitidina. As modificações na porção de açúcar podem incluir a modificação do grupo hidroxilo na posição 2' da ribose para formar açúcares 2'-0-metilo ou 2'-0-alilo. A estrutura de fosfato de desoxirribose pode ser modificada para produzir ácidos nucleicos morfolino, em que cada porção de base está ligada a um anel morfolino de seis membros, ou ácidos nucleicos de peptídeos, em que o esqueleto desoxifosfato é substituído por um esqueleto pseudopeptídeo e as quatro bases são retidas. Veja-se, por exemplo, Summerton e Weller Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 7: 187-195 (1997); e Hyrup et al., Bioorgan. Med. 22

Chem., 4: 5-23 (1996). Para além disso, o esqueleto desoxifosfato pode ser substituído com, por exemplo, um esqueleto de fosforotioato ou fosforoditioato, uma fosforamidite, ou um esqueleto de fosfotriéster de alquilo.

Um ácido nucleico aqui proporcionado pode compreender ou consistir de uma sequência que codifica a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4. Por exemplo, este ácido nucleico pode conter a sequência de ácido nucleico humana para o CNP e urodilatina concebida para codificar para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4 .

Normalmente, um ácido nucleico isolado aqui proporcionado é de, pelo menos, 10 nucleótidos de comprimento (por exemplo, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, ou mais nucleótidos de comprimento). As moléculas de ácido nucleico que são menos do que o comprimento total podem ser úteis, por exemplo, como oligonucleótidos iniciadores ou sondas para fins de diagnóstico. As moléculas de ácidos nucleicos isolados podem ser produzidas por técnicas convencionais, incluindo, sem limitação, a clonagem molecular comum e técnicas químicas de síntese de ácido nucleico. Por exemplo, pode ser usada a reação em cadeia da polimerase (PCR) . A PCR refere-se a um procedimento ou técnica em que os ácidos nucleicos alvo são amplificados enzimaticamente. A informação da sequência das extremidades da região de interesse ou para além desta, é utilizada tipicamente para desenhar oligonucleótidos iniciadores que são idênticos em sequência a cadeias opostas do molde a ser amplificado. A PCR pode ser utilizada para amplificar sequências específicas de ADN, bem como de ARN, incluindo as sequências de ADN genómico total ou ARN celular total. Os oligonucleótidos iniciadores são tipicamente de 15 a 50 nucleótidos de comprimento, mas podem variar de 10 nucleótidos até centenas de nucleótidos de comprimento. Por 23 exemplo, um oligonucleótido iniciador pode ser de 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40 ou 45 nucleótidos de comprimento. Um oligonucleótido iniciador pode ser purificado a partir de uma digestão de restrição, por métodos convencionais, ou pode ser sintetizado quimicamente. Os oligonucleótidos iniciadores são tipicamente de cadeia única para a máxima eficiência na amplificação, mas um oligonucleótido iniciador pode ser de cadeia dupla. Os oligonucleótidos iniciadores de cadeia dupla são desnaturados primeiro (por exemplo, tratados com calor), para separar as cadeias antes de serem utilizados na amplificação. As técnicas gerais de PCR estão descritas, por exemplo em PCR Primer: A Laboratory Manual, ed. por Dieffenbach e Dveksler, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. Quando se utiliza o ARN como fonte de molde, pode ser utilizado a transcriptase reversa para sintetizar a cadeia de ADN complementar (ADNc). Também pode ser usada a reação em cadeia com ligase, a amplificação por deslocamento de cadeia, a replicação de sequência autossustentada ou a amplificação baseada na sequência de ácido nucleico para se obter os ácidos nucleicos isolados, tal como descrito noutro local (Lewis, Genetic Engineering News, 12(9): 1 (1992); Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87: 1874-1878 (1990); e Weiss, Science 254: 1292 (1991)).

Os ácidos nucleicos isolados podem também ser sintetizados quimicamente, quer como uma única molécula de ácido nucleico (por exemplo, utilizando a síntese automatizada de ADN na direção de 3' para 5' utilizando a tecnologia de fosforamidite) ou como uma série de oligonucleótidos. Por exemplo, um ou mais pares de oligonucleótidos longos (por exemplo, > 100 nucleótidos) pode ser sintetizado contendo a sequência desejada, com cada par contendo um segmento curto de complementaridade (por exemplo, cerca de 15 nucleótidos), de tal forma que é 24 formada uma dupla-hélice quando o par de oligonucleótidos é emparelhado. É utilizada a polimerase de ADN para ampliar os oligonucleótidos, resultando numa molécula de ácido nucleico única, de cadeia dupla, por cada par de oligonucleótido, que, em seguida, pode ser ligada a um vetor.

Os ácidos nucleicos isolados também podem ser obtidos por mutagénese. Por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, 2, 3, ou 4 pode ser mutada através de técnicas padrão, tais como, por exemplo, mutagénese dirigida ao oligonucleótido e/ou mutagénese dirigida ao local por PCR. Veja-se, Short Protocols in Molecular Biology, capitulo 8, Green Publishing Associates e John Wiley & Sons, editado por Ausubel et al., 1992 . Estas mutações incluem adições, deleções, substituições, e combinações das mesmas.

Vetores e células hospedeiras

Este documento também proporciona vetores que contêm um ácido nucleico aqui proporcionado. Tal como aqui utilizado, um "vetor" é um replicão, tal como um plasmídeo, fago, ou cosmideo, ao qual pode ser inserido outro segmento de ADN, de modo a provocar a replicação do segmento inserido. Um vetor pode ser um vetor de expressão. Um "vetor de expressão" é um vetor que inclui uma ou mais sequências de controlo de expressão, e uma "sequência de controlo de expressão" é uma sequência de ADN que controla e regula a transcrição e/ou a tradução de outra sequência de ADN.

Num vetor de expressão aqui proporcionado, o ácido nucleico pode ser ligado operativamente a uma ou mais sequências de controlo de expressão. Tal como aqui utilizado, "ligado operativamente" significa incorporado numa construção genética de modo a que as sequências de controlo de expressão controlam eficazmente a expressão de 25 uma sequência de codificação de interesse. Os exemplos de sequências de controlo de expressão incluem promotores, potenciadores e regiões de terminação da transcrição. Um promotor é uma sequência de controlo de expressão constituída por uma região de uma molécula de ADN, normalmente a cerca de 100 nucleótidos a montante do ponto em que a transcrição começa (geralmente perto do local de iniciação da polimerase II de ARN). Para colocar uma sequência de codificação sob 0 controlo de um promotor, pode ser necessário posicionar o local de iniciação da tradução do quadro de leitura de tradução do polipeptídeo entre um e cerca de cinquenta nucleótidos a jusante do promotor. Os potenciadores fornecem especificidade de expressão em termos de tempo, localização e nível. Ao contrário dos promotores, os potenciadores podem funcionar quando localizados a distâncias diferentes do local de transcrição. Um potenciador pode também estar localizado a jusante do local de iniciação da transcrição. Uma sequência de codificação está "ligada operativamente" e "sob o controlo" das sequências de controlo de expressão numa célula, quando a polimerase de ARN é capaz de transcrever a sequência codificadora em ARNm, que depois pode ser traduzida no polipeptídeo codificado pela sequência de codificação.

Os vetores de expressão adequados incluem, sem limitação, plasmídeos e vetores virais derivados de, por exemplo, bacteriófago, baculovírus, vírus do mosaico do tabaco, vírus de herpes, citomegalovirus, retrovírus, poxvírus, adenovírus, e vírus adenoassociados. Estão comercialmente disponíveis numerosos vetores e sistemas de expressão, a partir de empresas tais como Novagen (Madison, WI), Clontech Laboratories (Mountain View, CA), Stratagene (La Jolla, CA) , e Invitrogen / Life Technologies (Carlsbad, CA) .

Um vetor de expressão pode incluir uma sequência de 26 marcação concebida para facilitar a manipulação subsequente da sequência de ácido nucleico expressa (por exemplo, purificação ou localização). As sequências de marcação, tais como a proteína fluorescente verde (GFP), a glutationa S-transferase (GST), a poli-histidina, c-myc, hemaglutinina, ou o marcador Flag™ (Kodak, New Haven, CT) são tipicamente expressas como uma fusão com o polipeptídeo codificado. Estes marcadores podem ser inseridos em qualquer lugar dentro do polipeptídeo, incluindo tanto no terminal carboxilo como amino.

Este documento também proporciona células hospedeiras que contêm uma molécula de ácido nucleico e/ou um vetor de ácido nucleico aqui proporcionado. 0 termo "célula hospedeira" refere-se a células procarióticas e células eucarióticas, nas quais pode ser introduzida uma molécula de ácido nucleico ou vetor. Pode ser utilizado qualquer método para introduzir o ácido nucleico numa célula. Por exemplo, a precipitação com fosfato de cálcio, a electroporação, o choque térmico, a lipofecção, a micro-injeção, e a transferência de ácido nucleico mediada por vírus, podem ser utilizados para introduzir o ácido nucleico nas células. Para além disso, o ADN nu pode ser entregue diretamente a células in vivo, tal como descrito noutro local (patente US N.° 5 580 859 e 5 589 466) .

Deteção de polipeptideos

Este documento proporciona métodos e materiais para a deteção de um polipeptídeo aqui proporcionado. Tais métodos e materiais podem ser utilizados para monitorizar os níveis de polipeptideos num mamífero que recebe o polipeptídeo como terapêutica. Um polipeptídeo aqui proporcionado (por exemplo, um polipeptídeo CU-NP que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4) pode ser detetado, por exemplo, imunologicamente utilizando um ou mais anticorpos. Tal como aqui utilizado, o termo "anticorpo" inclui moléculas intactas bem como fragmentos das mesmas, 27 que são capazes de se ligarem a um determinante epitópico de um polipeptídeo aqui proporcionado. 0 termo "epítopo" refere-se a um determinante antigénico de um antigénio ao qual o paratopo de um anticorpo se liga. Os determinantes epitópicos consistem normalmente em agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcares, e geralmente possuem características estruturais tridimensionais especificas, assim como caracteristicas de carga específicas. Os epítopos geralmente possuem pelo menos cinco aminoácidos contíguos (um epítopo contínuo) ou, alternativamente, podem ser um conjunto de aminoácidos não contíguos, que definem uma estrutura particular (por exemplo, um epítopo conformacional). 0 termo "anticorpo" inclui anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, anticorpos humanizados ou quiméricos, fragmentos de anticorpos Fv de cadeia simples, fragmentos Fab e fragmentos F(ab)2. Os anticorpos policlonais são populações heterogéneas de moléculas de anticorpos que estão contidas no soro dos animais imunizados. Os anticorpos monoclonais são populações homogéneas de anticorpos para um epítopo particular de um antigénio.

Podem ser gerados por meio de técnicas conhecidas fragmentos de anticorpos que têm afinidade de ligação específica para um polipeptídeo aqui fornecido (por exemplo, um polipeptídeo CU-NP que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4) . Por exemplo, podem ser produzidos fragmentos de F(ab')2 por digestão com pepsina da molécula de anticorpo. Os fragmentos de Fab podem ser gerados pela redução das pontes dissulfureto dos fragmentos de F(ab')2. Em alguns casos, podem ser construídas bibliotecas de expressão de Fab. Veja-se, por exemplo, Huse et al., Science, 246: 1275 (1989) . Uma vez produzidos, os anticorpos, ou fragmentos dos mesmos, podem ser testados para o reconhecimento de um polipeptídeo aqui 28 proporcionado por meio de métodos de imunoensaios convencionais, incluindo as técnicas de ELISA, radioimunoensaios e Western blotting. Veja-se, Short Protocols in Molecular Biology, capitulo 11, Green Publishing Associates e John Wiley & Sons, editado por Ausubel, F.M. et al., 1992.

Em ensaios imunológicos, um anticorpo com afinidade de ligação especifica para um polipeptídeo aqui fornecido ou um anticorpo secundário que se liga a um tal anticorpo pode ser marcado, direta ou indiretamente. Os marcadores adequados incluem, sem limitação, radionuclidos (por exemplo, 125I 131-1- r 35s 3h, 32P, 33P, ou, 14C) , porções fluorescentes (por exemplo, fluoresceína , FITC, PerCP, rodamina, ou PE) , porções luminescentes (por exemplo, nanopartícuias de Qdot™ fornecidas por Invitrogen (Carlsbad, CA)), compostos que absorvem a luz de um comprimento de onda definido, ou enzimas (por exemplo, fosfatase alcalina ou peroxidase de rábano). Os anticorpos podem ser marcados indiretamente por conjugação com biotina, em seguida detetada com avidina ou estreptavidina marcada com uma molécula descrita anteriormente. Os métodos de deteção ou quantificação de um marcador dependem da natureza do marcador e são conhecidos na tecnologia. Os exemplos de detetores incluem, sem limitação, filme de raios-x, contadores de radioatividade, contadores de cintilação, espectrofotómetros, colorimetros, fluorimetros, luminómetros e densitómetros. Podem ser utilizadas combinações destes métodos, (incluindo ensaios "multicamada") conhecidas pelos peritos na tecnologia, para aumentar a sensibilidade dos ensaios.

Os ensaios imunológicos para a deteção de um polipeptideo aqui fornecido podem ser realizados numa variedade de formatos conhecidos, incluindo ensaios em sanduíche, ensaios de competição (RIA competitivo), ou imunoensaios ponte. Veja-se, por exemplo, patente US N.° 5 29 296 347, 4 233 402, 4 098 876, e 4 034 074. Os métodos de deteção de um polipeptídeo aqui proporcionado incluem geralmente o contacto de uma amostra biológica com um anticorpo que se liga a um polipeptideo aqui descrito, e a deteção da ligação do polipeptideo ao anticorpo. Por exemplo, um anticorpo com afinidade de ligação especifica para um polipeptideo aqui proporcionado pode ser imobilizado sobre um substrato sólido, por qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos na tecnologia e, em seguida, exposto à amostra biológica. A ligação do polipeptideo ao anticorpo sobre o substrato sólido pode ser detetada através da exploração do fenómeno de ressonância de plasma de superfície, o que resulta numa alteração na intensidade da ressonância de plasma de superfície após a ligação, que pode ser detetada qualitativamente ou quantitativamente por um instrumento apropriado, por exemplo, um aparelho Biacore (Biacore International AB, Rapsgatan, Suécia). Em alguns casos, o anticorpo pode ser marcado e detetado tal como descrito anteriormente. Pode ser gerada uma curva padrão utilizando quantidades conhecidas de um polipeptideo aqui proporcionado, para auxiliar na quantificação dos niveis do polipeptideo.

Em algumas realizações, pode ser usado um ensaio "sanduíche", no qual um anticorpo de captura é imobilizado sobre um substrato sólido, para detetar a presença, ausência, ou nível de um polipeptídeo aqui proporcionado. O substrato sólido pode ser posto em contacto com a amostra biológica, de modo a que qualquer polipeptídeo de interesse na amostra pode ligar-se ao anticorpo imobilizado. A presença, ausência, ou nível do polipeptídeo ligado ao anticorpo pode ser determinado utilizando um anticorpo de "deteção" com afinidade de ligação específica para o polipeptídeo. Em algumas realizações pode ser utilizado um anticorpo de captura que tem afinidade de ligação para o CNP ou a urodilatina, bem como para um polipeptídeo aqui 30 proporcionado. Nesta realização, pode ser utilizado um anticorpo de deteção que tem uma afinidade de ligação especifica para um polipeptídeo particular aqui fornecido (por exemplo, um polipeptídeo CU-NP que possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4) . Entende-se que, em ensaios em sanduíche, o anticorpo de captura não deve ligar-se ao mesmo epítopo (ou gama de epítopos no caso de um anticorpo policlonal) que o anticorpo de deteção. Assim, se é utilizado um anticorpo monoclonal como um anticorpo de captura, o anticorpo de deteção pode ser um outro anticorpo monoclonal que se liga a um epítopo que está fisicamente separado ou só se sobrepõe parcialmente com o epítopo ao qual se liga o anticorpo monoclonal de captura, ou um anticorpo policlonal que se liga a outros epítopos para além de, ou em adição a, aquele ao qual o anticorpo monoclonal de captura se liga. Se é usado um anticorpo policlonal como um anticorpo de captura, o anticorpo de deteção pode ser ou um anticorpo monoclonal que se liga a um epítopo que ou está fisicamente separado ou se sobrepõe parcialmente com qualquer um dos epítopos aos quais se liga o anticorpo policlonal de captura, ou um anticorpo policlonal que se liga a outros epítopos para além de, ou em adição ao, que se liga o anticorpo policlonal de captura. Os ensaios sanduíche podem ser realizados como ensaios de ELISA sanduíche, ensaios de Western blotting sanduíche, ou ensaios de deteção imunomagnética sanduíche.

Os substratos sólidos adequados aos quais pode ser ligado um anticorpo (por exemplo, um anticorpo de captura) incluem, sem limitação, placas de microtitulação, tubos, membranas, tais como membranas de nylon ou de nitrocelulose, e grânulos ou partículas (por exemplo, agarose, celulose, vidro, poliestireno, poliacrilamida, grânulos ou partículas magnéticas, ou magnetizáveis). As partículas magnéticas ou magnetizáveis podem ser 31 particularmente úteis quando é utilizado um sistema de imunoensaio automatizado.

Os anticorpos com afinidade de ligação especifica para um polipeptideo aqui proporcionado podem ser produzidos através de métodos convencionais. Por exemplo, um polipeptideo pode ser produzido de forma recombinante tal como descrito anteriormente, pode ser purificado a partir de uma amostra biológica (por exemplo, um sistema de expressão heterólogo) , ou pode ser sintetizado quimicamente, e utilizado para imunizar os animais hospedeiros, incluindo coelhos, galinhas, ratinhos, cobaias ou ratos. Por exemplo, pode ser utilizado para imunizar um animal um polipeptideo tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4 ou fragmentos do mesmo, que são, de pelo menos, seis aminoácidos em comprimento. Os vários adjuvantes que podem ser utilizados para aumentar a resposta imunológica dependem da espécie do hospedeiro, e incluem o adjuvante de Freund (completo e incompleto), géis minerais tais como o hidróxido de alumínio, substâncias tensioativas tais como a lisolecitina, os polióis plurónicos, os polianiões, os peptídeos, as emulsões oleosas, a hemocianina de lapa e o dinitrofenol. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados utilizando um polipeptideo aqui fornecido e tecnologia de hibridoma convencional. Em particular, os anticorpos monoclonais podem ser obtidos por qualquer técnica que proporciona a produção de moléculas de anticorpo por linhas celulares continuas em cultura, tal como descrito por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), a técnica do hibridoma de células B humanas (Kosbor et al., Immunology Today, 4: 72 (1983);

Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80: 2026 (1983)), e a técnica do hibridoma de EBV (Cole et al., "Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy", Alan R. Liss, Inc., pp 77— 96 (1983)). Estes anticorpos podem ser de qualquer classe de imunoglobulina incluindo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD e 32 qualquer subclasse das mesmas. 0 hibridoma que produz os anticorpos monoclonais pode ser cultivado in vitro e in vi vo.

Outras técnicas para a deteção de um polipeptídeo aqui proporcionado incluem técnicas de espectrofotometria de massa tais como a ionização por electrospray (ESI), e a desabsorção de ionização laser assistida por matriz (MALDI). Veja-se, por exemplo, Gevaert et ai.,

Electrophoresis, 22(9): 1645-51 (2001); Chaurand et ai., J. Am. Soc. Mass Spectrom., 10(2): 91-103 (1999). Os espectrómetros de massa úteis para estas aplicações estão disponíveis em Applied Biosystems (Foster City, CA); Bruker Daltronics (Billerica, MA); e Amersham Pharmacia (Sunnyvale, CA). A invenção será ainda descrita nos exemplos que se seguem. Os exemplos não pertencentes à invenção, têm apenas fins ilustrativos.

EXEMPLOS

Exemplo 1 - Síntese de CU-NP

Foi concebido e sintetizado um polipeptídeo com a sequência apresentada na figura 1, utilizando um sintetizador de péptidos ABI 431A. Este polipeptídeo é referido como um polipeptídeo CU-NP (figura 1) . O polipeptídeo CU-NP sintetizado foi confirmado por cromatografia líquida de elevado desempenho / espectrometria de massa. O seu peso molecular é de 3535,09, e a sua sequência de aminoácidos é Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Met-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr (SEQ ID NO: 4), com uma ponte de dissulfureto a unir os resíduos de Cys (figura 1).

Exemplo 2 - Efeitos in vivo de CU-NP A função cardiorenal foi avaliada em três cães normais anestesiados. As liberações foram obtidas antes da infusão, durante a infusão intravenosa de 10, 50, e 100 ng de CU- 33 NP/kg/minuto durante 45 minutos a cada nível de dosagem (isto é, cada cão recebeu infusões consecutivas de 45 minutos de 10, 50, e 100 ng/kg/minuto), e após a infusão. A reabsorção tubular de Na+ e a TFG foram avaliadas pela liberação de Li+ e de inulina, respetivamente. As neuro-hormonas foram quantificadas por radioimunoensaios. Os dados foram analisados por medidas ANOVA repetidas seguidas pelo teste de Dunnett. Os resultados (média ± SEM) são apresentados no quadro 1.

Para além disso, a atividade da renina no plasma diminuiu de 9 ± 2 para 5 ± 1* para 3 ± 1+ para 3 ± 1 + ng/ml/hora, e os níveis de angiotensina II diminuíram de 18 ± 1 para 10 ± 0,4+para 5 ± 0,4+ para 7 ±l+pg/ml. Não foi observada nenhuma mudança significativa no intervalo QTc (ms) no final da infusão de 100 ng/kg/minuto (329 ± 15) versus antes da infusão (323 ± 6) .

Estes resultados demonstram que um polipeptídeo que contém sequências de aminoácidos de CNP e de urodilatina pode, de uma forma dependente da dose, (1) aumentar a natriurese, a diurese, e a TFG, (2) diminuir a pressão de enchimento cardíaco, e (3) inibir a renina e a angiotensina, sem induzir hipotensão arterial significativa.

Quadro 1

Dados renais e cardiovasculares para o CU-NP Pré-infusão 10 ng/kg/minuto 50 ng/kg/minuto 100 ng/kg/minuto Pós- infusão TFG (ml/min) 31 ± 5 39 ± 1 43 ± 4* 53 ± 3t 36 ± 2 Fluxo de urina (ml/min) 0,09 ± 0,01 0,3 ± 0,07 1,5 ± 0,5t 1, 9 ± 0,3t 0,3 ± 0,05 Excreção de Na+ (peq/min) 1,9 ± 0,9 33 ± 13 235 ± 72t 342 ± 60t 66 ± 12 RFPNa+ (%) 92 ± 0,9 73 ± 4,5t 54 ±1,8t 55 ± 2,6t 62 ± 3,5t RFDNa+ (%) 99 ± 0,3 98 ± 0,5 92 ±1,6t 90 + 0,8t 97 ± 0, 6* Formação de cGMP renal (pmol/min) 356 ± 36 534 ± 94 1301 ± 60* 4608 ± 370t 1086 ± 27 34

Dados renais e cardiovasculares para o CU-NP Pré-infusão 10 ng/kg/minuto 50 ng/kg/minuto 100 ng/kg/minuto Pós- infusão PCP (mm de Hg) 4,6 ± 0,7 3, 8 ± 1 2,5 ± lt 1, 7 ± 0, 91 3,2 ± 1* PAD (mm de Hg) 1, 5 ± 1 0,9 ± 0,9 0,6 ± 1* -0,2 ± 0,8t 0, 1± 0,9t PAM (mm de Hg) 129 ± 17 129 ± 13 128 ± 10 120 ± 11 124 ± 13 * = P < 0,05; t = P < 0,01; TFG = taxa de filtração glomerular; RFPNa+ = reabsorção fracionada proximal de sódio; RFDNa+ = reabsorção fracionada distai de sódio; PCP = pressão capilar pulmonar; PAD = pressão arterial no átrio direito; PAM = pressão arterial média.

Exemplo 3 - Efeitos biológicos adicionais do CU-NP 0 polipeptídeo CU-NP ou o CNP foi administrado, por via intravenosa a cães normais anestesiados, a 50 ng/kg/minuto durante 75 minutos. Foram recolhidas amostras de sangue e de urina antes da infusão (pre-I), aos 30 e 60 minutos de infusão, e após a infusão (pos-I) . A liberação de inulina foi utilizada para a avaliação da taxa de filtração glomerular (TFG). A técnica de liberação de litio foi utilizada para a medição da reabsorção fracionada proximal e distai de Na+ (RPFNa e RFDNa, respetivamente) . Foram feitas comparações nos três últimos pontos de tempo versus pre-I. 0 teste t de Student foi utilizado na comparação entre resultados para dois pontos de tempo, enquanto que as medidas ANOVA repetidas foram utilizadas para comparar quatro pontos de tempo. Os resultados (média ± SEM) são apresentados nos quadros 2A e 2B. O polipeptídeo CU-NP aumentou significativamente o cGMP no plasma e a excreção urinária de cGMP. O CU-NP também aumentou o fluxo de urina e a excreção urinária de Na+, e levou a um aumento da taxa de filtração glomerular. A pressão capilar pulmonar e a pressão arterial do átrio direito foram reduzidas sem reduzir a hipotensão arterial sistémica. A pressão arterial pulmonar foi também reduzida significativamente, e o resultado cardíaco foi preservado. 35 A atividade da renina no plasma, os niveis de angiotensina II, e os niveis de aldosterona foram reprimidos durante a infusão do CU-NP, mas foram seguidos por uma elevação ou "ressalto" após a interrupção da infusão do CU-NP. Estes dados sugerem que pode ser utilizada uma forma de ação prolongada do CU-NP para a supressão continua de neuro-hormonas. 0 CU-NP também aumentou significativamente a produção renal de cGMP e a excreção urinária de K+. Tanto a RFPNa+ como a RFDNa+ foram significativamente reduzidas. Estes resultados foram associados com um aumento do fluxo sanguíneo renal ajustado ao peso, e uma diminuição da resistência vascular renal. Foi também observado um aumento no hematócrito. 0 ANP no plasma, o BNP no plasma, e o CNP no plasma foram aumentados, tal como foi a excreção urinária de ANP, BNP, e de CNP.

Estes resultados demonstram que um polipeptídeo CU-NP pode ter atividades de ativador de cGMP, diuréticas, natriuréticas, promotoras da TFG, de supressão (RAAS) do sistema renina — angiotensina — aldosterona, de descarga cardíaca, e hemodinâmicas renais favoráveis, ao mesmo tempo que carece da capacidade para reduzir a pressão arterial e causar hipotensão arterial sistémica. Para além disso, estes resultados demonstram que um polipeptídeo CU-NP pode aumentar os níveis endógenos do ANP e do BNP. Os efeitos tubulares do polipeptídeo CU-NP sintetizado são consistentes com as ações a nível do túbulo proximal e das células do dueto coletor medular interno.

Quadro 2A

Dados renais e cardiovasculares para o CU-NP Pré-infusão 30 minutos 60 minutos Pós-infusão TFG (ml/min) 38,4 ± 3,6 50,7 ± 2,6* 53, 8 ± 2, 8 + φ 50, 1 ± 3,5* Fluxo de urina (ml/min) 0,13 ± 0,02 1, 28 ± 0, 25φ1 1, 34 ± 0,22φ1 0,33 ± 0,04 36

Dados renais e cardiovasculares para o CU-NP Pré-infusão 30 minutos 60 minutos Pós-infusão Excreção de Na+ (peq/min) 8,0 ± 3,3 216, 4 ± 42, 3+1 237,7 ± 35, 8+1 51,2 ± 9,4 Excreção de K+ (peq/min) 14,9 ± 4,5 68,3 ±12,5 + 74,6 ±15,3 + 32,9 ± 3,0 RFPNa+ (%) 84,9 ± 2,5 62, 4 ± 4, 0 + 61, 3 ± 1, 9 + 70,4 ± 2,8 + RFDNa+ (%) 99,2 ±0,2 92, 4 ± 1,2+1 92,2 ± 1, 1+1 97,7 ± 0,4 Formação renal de cGMP 469,0 ± 55,4 2168 ± 53ts 2987 ± 622n 1394 ± 185 (pmol/min) cGMP no plasma (pmol/ml) 8,2 ± 0,7 26, 2 ± 1,3+1 29, 8 ± 1, 5+1 13,0 ± 0,9 + Excreção urinária de cGMP 770 ± 48 3508 ± 574+1 4591 ± 664+1 2052 ± 208 (pmol/min) PCP (mm de Hg) 5,6 ± 0,9 3,9 ± 0,7* 2, 9 ± 0, 9 + 4,3 ± 0,8 PAD (mm de Hg) 1,1 ± 0,6 0,3 ± 0,5 -0,1 ± 0,5* 0,7 ± 0,4 Hipotensão sistémica (mm 135,9 ± 3,9 135,9 ± 2,7 133,9 ± 3,6 142,3 ± 2,7 + de Hg) PAP (mm de Hg) 11,8 ± 0,9 10,7 ± 0,8* 10,5 ± 0,7 + 12, 3 ± 0, 7 Resultado cardíaco (1/min) 3,1 ± 0,3 3,4 ± 0,5 3,0 ± 0,5 2,8 ± 0,5 Atividade da renina no 8, 8 ± 2 2, 5 ± 0, 8 + 1, 5 ± 0, 4f 14,0 ±1,33 plasma (ng/ml/hora) Angiotensina II (pg//ml) 13,9 ± 2,0 6, 9 ± 0, 7 + 4, 5 ± 0, 3f 22,6 ±1,63 Aldosterona (ng/dl) 15,8 ± 2,7 14,2 ± 2,2 12,1 ± 2,1 30,4 ± 3,5 + FSR ajustado (ml/kg/min) 10,8 ± 0,8 11,64 ± 0,5 12,21± 0,43 11,60 ± 0,5 RVR (x lCT3mm de Hg · 0,55 ± 0,05 0, 50 ± 0, 04 0,47 ± 0,033 0, 53 ± 0,04 min · 1_1) Hematócrito (%) 37,8 ± 1,3 40, 3 ± 1, 3+ 41, 1 ± 1, 43 40,3 ±1,8 + ANP no plasma (pg/ml) 14,1 ± 0,8 16, 7 + 0,9* 16,6 ± 1,1* 15,2 ± 0,6 BNP no plasma (pg/ml) 8,2 ± 0,9 21, 0 ± 1, 8 + 17,0 ± 2,23 10,1 ± 1,4 CNP no plasma (pg/ml) 4,0 ± 0,3 15, 4 ± 0, 9+ 15, 1 ± 1, 43 3,2 ± 0,2 Excreção de ANP (pg/min) 3,2 ± 1,5 21,9 ± 9,5 28,3 ± 13,6 10,4 ± 2,5 Excreção de BNP (pg/min) 13,9 ± 1,5 18,2 ± 1,5 19,3 ± 1,2 28,3 ± 5,4* Excreção de CNP (pg/min) 2,0 ± 0,4 4,0 ± 1,2 9,1 ± 3,9 21,5 ± 17,4 * = P < 0,05 vs. pre-I; t = P < 0,01 vs . pre-I; Φ = P < 0,05 vs. CNP; § = P < 0,01 vs. CNP; ΐ = P < 0,001 vs. CNP; TFG = taxa de filtração glomerular; RFPNa+ = reabsorção fracionada pro ximal de sódio; RFDNa+ = reabsorção fracionada distai de sódio; PCP = pressão capilar pulmonar; PAD = pressão arterial do átrio direito; PAP = pressão arterial pulmonar; FSR = fluxo sanguíneo renal; RVR = resistência vascular renal. 37

Quadro 2B

Dados renais e cardiovasculares comparativos para o CNP Pré-infusão 30 minutos 60 minutos Pós-infusão TFG (ml/min) 38 ± 4 42 ± 4 39 ± 3 44 ± 3 Fluxo de urina (ml/min) 0, 1 ± 0, 02 0,3 ± 0,06t 0, 4 ± 0, 021 0, 3 ± 0,04 Excreção de Na+ (peq/min) 16 ± 6 56 ± 21 71 ± 8* 30 ± 8 RFPNa+ (%) 83 ± 3 67 ± 3 51 ± 71 68 ± 3* RFDNa+ (%) 99 ± 0,5 98+0,8 98 ± 0,5 99 ± 0,2 Formação renal de cGMP (pmol/min) 491 ± 65 452 ± 202 603 ± 199 582 ± 91 cGMP no plasma (pmol/ml) 8 ± 1 11 ± lt 12 ± lt 12 ± lt Excreção urinária de cGMP (pmol/min) 830 ± 74 1119 ± 102* 1338 ± 811 1090 ± 76* * = P < 0,05 vs. pre-I; t = P < 0,01 vs. pre-I; TFG = taxa de filtração glomerular; RFPNa+ = reabsorção fracionada proximal de sódio; RFDNa+ = reabsorção fracionada distai de sódio.

Exemplo 3 - Avaliação do CU-NP em células endoteliais aórticas humanas e in vivo 38 aos 25 minutos de infusão até aos 30 minutos após a infusão). Assim, o CU-NP ativou significativamente o cGMP em HAEC, e também estimulou significativamente o cGMP em maior extensão do que o CNP in vivo.

Quadro 3

Efeitos do CU-NP em HAEC Concentração CU-NP cGMP (média ± SEM, pmol/ml) 10~1(J M 0,0007 ± 0,0007 10'y M 0,03 ± 0,02 10'b M 0,571± 0,05t Sem tratamento 0,003 ± 0,002 t = P < 0,01 vs. sem tratamento.

Exemplo 4 - Ações de estimulação de cGMP do CU-NP em glomérulos isolados de canino

Foram realizadas experiências para determinar se o CU-NP estimula diretamente o cGMP em glomérulos isolados, e para comparar as ações de ativação de cGMP do CU-NP com o CNP, o URO e o CNP-C, que consistia dos 22 aminoácidos do comprimento total do CNP com um duplicado do terminal-N fusionado na posição do terminal-C. Foram isolados glomérulos após a colheita de rins de cães normais. O CU- NP, o CNP, o URO, e o CNP-C (IO-5 M) foram incubados com glomérulos vs. controlo. O GMP cíclico foi medido por RIA, com correção para os níveis de proteína. O CU-NP e o URO provocaram maiores respostas de cGMP do que os seus respetivos controlos (P < 0,01), mas sem diferença entre os grupos. O CU-NP e o URO estimularam maiores respostas de cGMP vs. o CNP e vs. o CNP-C (P < 0,001). Assim, o CU-NP estimulou o cGMP em glomérulos numa maior extensão do que o CNP, mas numa extensão similar como o URO. O CNP-C não ativou o cGMP. Estes dados sugerem que o aumento do cGMP potencialmente ativado pode necessitar do terminal-N e/ou do terminal-C de ligandos para o recetor-A de NP. 39

Quadro 4

Efeitos do CU-NP sobre a produção de cGMP em glomérulos isolados Tratamento cGMP (média ± SEM; fmol/ug) CU-NP 0,73 ± 0,09™ CNP 0,0019 ± 0,0005 URO 0, 69 ± 0,07™ CNP-C 0,00597 ± 0,0053 t = P < 0,01 vs. controlo correspondente. Φ = P < 0,001 vs. 0CNP e CNP-C

Exemplo 5 - Efeitos de hemo-concentração do CU-NP

Foram estudados três NP de humano (BNP, CNP, URO) e o CU-NP para avaliar os seus efeitos na permeabilidade vascular, que se manifesta por um aumento do hematócrito. Cães normais anestesiados receberam infusões por via intravenosa de BNP (n = 7) , CNP (n = 6) , URO (n = 5) , ou CU-NP (n = 6), a 14 pmol/kg/minuto. 0 sangue foi recolhido em tubos de EDTA em gelo, e centrifugado. Os dados são apresentados para a linha de base e aos 60 minutos de infusão. Para além de aumentar o hematócrito (quadro 5), o CU-NP reduziu a pressão capilar pulmonar in vivo (linha de base 6 ± 0,9 mm de Hg, 60 minutos 3 ± 0,9 mm de Hg, P < 0,05). Assim, os efeitos de hemo-concentração do CU-NP podem contribuir para as suas ações de descarga cardíaca in vi vo.

Quadro 5

Efeitos do CU-NP no hematócrito Tratamento Hematócrito (média ± SEM; %) Linha de base 60 minutos BNP 36 ± 1 40 ± 2* CNP 36 ± 1 37 ± 1 URO 37 ± 1 40 ± 1* CU-NP 38 ± 1 41 ± lt (* = P < 0,05; t = P < 0,01) 40

Exemplo 6 - Ações cardiorrenais e neuro-humorais do CU-NP na insuficiência cardíaca experimental em caninos O CU-NP foi avaliado na insuficiência cardíaca (IC) em caninos para determinar se o CU-NP ativaria o segundo mensageiro cGMP, e exercia ações favoráveis sem hipotensão arterial excessiva. Foi induzida uma IC ligeira por estimulação (180 bpm durante 10 dias) . O CU-NP foi administrado por via intravenosa a 6 cães anestesiados, a 75 ng/kg/minuto, durante 75 minutos. A TFG foi medida pela liberação de inulina. A reabsorção fracionada de Na+ (RFNa) foi avaliada pela liberação de Li+. Os dados foram recolhidos antes da infusão (pre-I), aos 30 e 60 minutos de infusão (I), e após a infusão (pos-I). Também foi medida a atividade da renina no plasma, a angiotensina II, a aldosterona e o cGMP. Os resultados (média ± SEM) são apresentados no quadro 6. 0 CU-NP aumentou o cGMP no plasma, a excreção urinária de cGMP, a formação total de cGMP renal, o fluxo de urina e a excreção urinária de Na+. A RFNa proximal e a distai foram reduzidas. 0 fluxo sanguíneo renal e a TFG foram melhorados, com uma ligeira diminuição na PAM. Tanto o resultado cardíaco como a RVS ficaram inalterados. A PCP e a PAP foram reduzidas. A atividade da renina no plasma, a angiotensina II, e a aldosterona também foram reprimidas. Assim, o CU-NP ativou o cGMP na IC em caninos, e exerceu ações de melhoria renal, de descarga cardíaca e de supressão do sistema renina — angiotensina — aldosterona, sem hipotensão arterial excessiva.

Quadro 6

Dados renais e cardiovasculares para o CU-NP em IC experimental Pré-infusão 30 minutos 60 minutos Pós-infusão TFG (ml/min) 40 ± 5 51 ± 9 51 ± 3 53 ± 7* Fluxo de urina (ml/min) 0,09 ± 0,01 0,50 ± 0,15t 0,56 ± 0,llt 0,19 ± 0,03 Excreção de Na+ (peq/min) 2,9 ± 0,9 80,5 ± 29,4t 102,0 ± 22,2t 22,1 ± 7,9 41

Dados renais e cardiovasculares para o CU-NP em IC experimental Pré-infusão 30 minutos 60 minutos Pós-infusão RFPNa+ (%) 89 ± 2 68 ± 5t 67 ± 3t 79 ± 3* RFDNa+ (%) 99,6 ± 0,1 96 ± lt 96 ± lt 99 ± 0,3 Formação renal de cGMP (pmol/min) 610 ± 66 2977 ± 549t 3255 ± 662t 1342 ± 200 cGMP no plasma (pmol/ml) 17 + 3 41 ± 3t 43 ± 21 21 + 2 Excreção urinária de cGMP (pmol/min) 1186 ± 152 5066 ± 8261 5476 ± 8761 2394 ± 197 PCP (mm de Hg) 11 ± 1 9 ± lt 8 ± lt 10 ± 1 PAP (mm de Hg) 16 ± 0,8 15 ± 0,6* 14 ± 0,71 16 ± 0,7 Atividade da renina no plasma (ng/ml/hora) 9 ± 2 3 ± lt 2 ± lt 9 + 2 Angiotensina II (pg/ml) 32 ± 7 9 ± 2 t 9 ± 3t 19 ± 4 Aldosterona (ng/dl) 14 ± 5 9 ± 2 6 ± 2* 11 ± 3 FSR (ml/min) 238 ± 39 281 ± 42* 294 ± 42t 275 ± 42* PAM (mm de Hg) 108 ± 9 100 ± 8t 96 ± 8t 107 ± 8 Resultado cardíaco (1/min) 2,4 ± 0,1 2,5 ± 0,1 2,4 ± 0,1 2,3+ 0,04 RVS (mm de Hg L"1 · min) 42 ± 3 39 ± 3 39 + 3 45 ± 3 (continuação) * = P < 0,05 vs. pre-I; t = P < 0,01 vs. pre-I; TFG = taxa de filtração glomerular; RFPNa+ = reabsorção fracionada proximal de sódio; RFDNa+ = reabsorção fracionada distai de sódio; PCP = pressão capilar pulmonar; PAP = pressão arterial pulmonar; FSR = fluxo sanguíneo renal; PAM = pressão arterial média; RVS = resistência vascular sistémica.

Exemplo 7 - Efeitos in vivo do CU-NP na pressão de perfusão renal

Foram realizados estudos para determinar as ações in vivo do CNP, CU-NP e do URO na pressão de perfusão renal 42 (PPR, estimado pela PAM—PAD) , uma vez que a PPR é um fator determinante da função renal. Dada a ação de reforço da TGF do CU-NP, também foram feitos estudos in vitropara testar a hipótese de que o CU-NP (ao contrário do CNP) também ativa NPR-A, um recetor NP de ação renal potente.

Foram administradas por via intravenosa doses equimolares de CU-NP, CNP de humano, ou URO de humano a 14,14 pmol/kg/minuto em 17 cães normais anestesiados, durante 75 minutos. A PPR foi avaliada na linha de base e aos 60 minutos de infusão. Os dados estão expressos como média ± SEM. As liberações foram medidas a partir do minuto 16 até ao minuto 45, e do minuto 46 ao minuto 75, após o inicio da infusão de peptideo. Dentro de cada grupo, foi usado um teste t de dois pares a dois lados, para comparar a PPR aos 60 minutos de infusão de peptideo vs. a linha de base. As comparações entre os grupos foram feitas por análise ANOVA de duas vias seguida do pós-teste de Bonferroni.

Foram também avaliadas as respostas de cGMP aos 3 peptideos nos glomérulos isolados a partir de rins de cães após a colheita, na presença ou na ausência de um antagonista de NPR-A, A719153 (1 μΜ) , ou de um antagonista de NPR-B, P194 (1 μΜ), ou de ambos os antagonistas adicionados sequencialmente (A71915 seguido por P194, concentração final de 1 μΜ para ambos). Para confirmar o envolvimento de NPR-B na resposta de cGMP do CU-NP, foram realizadas experiências adicionais usando células endoteliais aórticas humanas (HAEC). A resposta de GMP ciclico foi determinada por incubação do CU-NP (10 6 M) , durante 10 minutos, na ausência ou na presença de um anticorpo contra o domínio de ligação ao ligando de NPR-B. Os dados in vitro (média ± SEM) foram analisados por uma ANOVA de uma via seguida pelo pós-teste de Bonferroni. A significância estatística foi definida como P < 0,05. Foi usado o GraphPad Prism 4 (GraphPad Software, San Diego, CA) 43 para a análise estatística.

Nos estudos in vivo, a PPR (mm Hg) foi conservada com o CU-NP, em comparação com o URO. Quando os dois grupos foram comparados, a PPR foi significativamente mais baixa com o URO vs. o CU-NP aos 60 minutos de infusão do peptídeo (P < 0,05, figura 2). A PPR não foi alterada pelo CNP.

Quadro 7

Efeitos do CU-NP na PPR PPR (média ± SEM; mm de Hg) Tratamento Pre-I 60 minutos CNP 120 ± 4 123 ± 8 URO 127 ± 4 119 ± 4* CU-NP 135 ± 4 134 ± 4 * = P = 0,05 vs. linha de base

In vitro, 10-5M do CU-NP aumentaram 7 vezes o cGMP vs. o CNP (0,76 ± 0,05Φ fmol/pg vs. 0,11 ± 0,05 fmol/pg), com

uma tendência para ativar ainda mais o cGMP do que o URO (0,54 ± 0,10 fmol/pg, P = 0,086). Estes resultados estão ilustrados na figura 3. A ação estimulante de cGMP do CU-NP foi atenuada pelo bloqueio de NPR-A com A71915 (0,31 ± 0,05+fmol/pg), pelo bloqueio de NPR-B com P19 (0,28 ± 0,04+ fmol/pg), ou pelo bloqueio de ambos NPR-A e NPR-B com A71915 e P19 (0,23 ± 0,05+ fmol/pg) , tal como mostrado na figura 4.

Em HAEC, 10~6 M do CU-NP e do CNP aumentaram o cGMP para 0,30 ± 0,02 pmol/ml e 0,17 ± 0,04 pmol/ml, respetivamente (P < 0,01 para o CU-NP vs. o CNP, P < 0,001 para o CU-NP vs. o controlo, P < 0,001 para CNP vs. o controlo). Na presença do anticorpo para NPR-B (1:100), as respostas de cGMP foram atenuadas para 0,19 ± 0,02 pmol/ml para o CU-NP, e para 0,08 ± 0,01 pmol/ml para o CNP (P < 0,01 para o CU-NP vs. nenhum anticorpo, e P < 0,05 para o CNP vs. nenhum anticorpo). Os resultados estão

representados na figura 5. Estes dados sugerem que o NPR-B 44 está envolvido, pelo menos em parte, na resposta de cGMP ao CU-NP.

Assim, o CU-NP conserva a PPR em doses renais potenciadoras, em contraste com o URO, que reduz a PPR. Para além disso, nos glomérulos isolados as ações do CU-NP envolvem a coativação tanto do NPR-A como do NPR-B, o que representa um novo ativador do recetor duplo NP no rim. 0 NPR-B está envolvido na parte da resposta do cGMP ao CU-NP em células endoteliais aórticas humanas. Assim, o CU-NP representa uma nova tecnologia de peptídeos novos que são capazes de dupla ativação do NPR-A e do NPR-B. 45

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

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Documentos de patente referidos na descrição • EP 0497368 AI [0004] • US 5580859 A [0056] • US 5589466 A [0056] • US 5296347 A [0060] • US 4233402 A [0060] • US 4098876 A [0060] • US 4034074 A [0060]

Literatura não relacionada com patentes referida na descrição • LEE; BURNETT. Hear Failure Reviews, 2007, vol. 12 (2), 131-142 [0005] • SUMMERTON ; WELLER. Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 1997, vol. 7, 187-195 [0047] • HYRUP et al. Bioorgan. Med. Chem., 1996, vol. 4, 5-23 [0047] • PCR Primer: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995 [0049] • LEWIS. Genetic Engineering News, 1992, vol. 12 (9), 1 [0049] • GUATELLI et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1990, vol. 87, 1874-1878 [0049] • WEISS. Science, 1991, vol. 254, 1292 [0049] • Short Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, 1992 [0051] • HUSE et al. Science, 1989, vol. 246, 1275 [0058] 46 • Short Protocols in Molecular Biology. Green Publishing Associates and John Wiley & Sons, 1992 [0058] • KOHLER et al. Nature, 1975, vol. 256, 495 [0063] • KOSBOR et al. Immunology Today, 1983, vol. 4, 72 [0063] • COLE et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1983, vol. 80, 2026 [0063] • COLE et al. Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy. Alan R. Liss, Inc, 1983, 77-96 [0063] • GEVAERT et al. Electrophoresis, 2001, vol. 22 (9), 1645-51 [0064] • CHAURAND et al. J. Am. Soc. Mass Spectrom., 1999, vol. 10 (2), 91-103 [0064]

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um polipept ídeo com menos de 44 resíduos de aminoácidos de comprimento, em que o polipeptídeo referido compreende, numa ordem a partir do terminal amino para o terminal carboxilo: (a) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 com não mais do que uma adição de aminoácidos, subtração de aminoácidos, ou substituição de aminoácidos, (b) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 com não mais do que duas adições de aminoácidos, subtrações de aminoácidos, ou substituições de aminoácidos, e (c) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 com não mais do que uma adição de aminoácidos, subtração de aminoácidos, ou substituição de aminoácidos, em que o polipeptídeo referido compreende atividade natriurética.

2. O polipeptídeo da reivindicação 1, em que o polipeptídeo referido compreende, numa ordem a partir do terminal amino para o terminal carboxilo: (a) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, (b) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 com não mais do que duas adições de aminoácidos, subtrações de aminoácidos, ou substituições de aminoácidos, e (c) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 com não mais do que uma adição de aminoácidos, subtração de aminoácidos, ou substituição de aminoácidos; ou (a) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, ou a 2 sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 com não mais do que uma adição de aminoácidos, subtração de aminoácidos, ou substituição de aminoácidos, (b) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2, e (c) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 com não mais do que uma adição de aminoácidos, subtração de aminoácidos, ou substituição de aminoácidos; ou (a) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 com não mais do que uma adição de aminoácidos, subtração de aminoácidos, ou substituição de aminoácidos, (b) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 com não mais do que duas adições de aminoácidos, subtrações de aminoácidos, ou substituições de aminoácidos, e (c) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3. 3. 0 polipeptideo polipeptideo referido na SEQ ID NO: 4. da reivindicação 1, em que o compreende a sequência estabelecida 4. 0 polipeptideo da reivindicação 1, em que o polipeptideo referido compreende, numa ordem a partir do terminal amino para o terminal carboxilo: (a) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 com não mais do que substituição de aminoácidos conservativa, (b) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 com não mais do que duas adições de aminoácidos, subtrações de aminoácidos, ou substituições de aminoácidos, e (c) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 com não mais do que uma adição de aminoácidos, subtração de 3 aminoácidos, ou substituição de aminoácidos; ou (a) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 com não mais do que uma adição de aminoácidos, subtração de aminoácidos, ou substituição de aminoácidos, (b) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 com não mais do que duas substituições de aminoácidos conservativas, e (c) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 com não mais do que uma adição de aminoácidos, subtração de aminoácidos, ou substituição de aminoácidos; ou (a) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 com não mais do que uma adição de aminoácidos, subtração de aminoácidos, ou substituição de aminoácidos, (b) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2, ou a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 com não mais do que duas adições de aminoácidos, subtrações de aminoácidos, ou substituições de aminoácidos, e (c) a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 com não mais do que uma substituição de aminoácidos conservativa. 5. 0 polipeptideo de qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, em que o polipeptideo referido não tem a capacidade para induzir a hipotensão sistémica. 6. 0 polipeptideo de qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, em que o polipeptideo referido é um polipeptideo substancialmente puro.

7. Um ácido nucleico isolado que codifica o polipeptideo 4 de qualquer uma das reivindicações de 1 a 4.

8. Um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações de 1 a 4.

9. Uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações de 1 a 4.

10. A célula hospedeira da reivindicação 9, em que a célula hospedeira referida é uma célula hospedeira eucariótica.

11. Uma composição farmacêutica que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e o polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações de 1 a 6.

12. Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6 para utilização no tratamento de patologias cardiovasculares ou de patologias renais num mamífero, sem baixar a pressão sanguínea.

13. Um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6 para utilização no tratamento de um mamífero com uma patologia cardiovascular ou uma patologia renal, em que o polipeptídeo referido é para ser administrado sob condições em que é reduzida a gravidade de uma manifestação da patologia cardiovascular ou da patologia renal referidas. 14. 0 polipeptídeo para utilização no tratamento de um mamífero com uma patologia cardiovascular ou uma patologia renal de acordo com a reivindicação 13, em que a administração do polipeptídeo referido ao mamífero referido não diminui a pressão sanguínea deste mamífero.