CN107405390A - 用重组碱性磷酸酶治疗癫痫 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供一种在具有异常的碱性磷酸酶活性的受试者中治疗癫痫的方法，其包括给予受试者治疗有效量的至少一种重组碱性磷酸酶。

Description

用重组碱性磷酸酶治疗癫痫
序列表
本申请包含已经按ASCII格式电子文件提交并通过引用以其整体结合到本文中的序列表。所述ASCII拷贝，于2015年12月1日创建，被命名为0239PCT_SL.txt，且文件大小为19,449字节。
技术领域
本公开内容涉及在HPP或非-HPP患者中治疗癫痫的方法。更特别地，本公开内容涉及鉴定具有异常水平和/或功能的至少一种碱性磷酸酶底物，但具有正常或未受影响的矿化表型的HPP患者或非-HPP患者的亚群和用至少一种重组碱性磷酸酶治疗这样的患者亚群。
背景
磷酸酶过少症(HPP)是一种罕见的遗传形式的佝偻病或软骨病，对于较严重形式的疾病，具有在加拿大的门诺派教徒中高达每2,500个新生儿1例和在普通人群中每100,000个新生儿1例的发病率。较温和的形式是更为普遍的。这种“新陈代谢的先天错误”是由在编码碱性磷酸酶的组织非特异性同工酶的基因(ALPL)中的功能丧失突变引起的(TNALP；亦称为，肝/骨/肾型ALP)。在血清中生化标志低于正常的ALP活性(低磷酸酶血症)，其导致以下3种含磷化合物底物的血和/或尿水平升高：无机焦磷酸(PPi)、磷酸乙醇胺(PEA)和吡多醛5'-磷酸(PLP)。
HPP特征是围产期、婴儿、儿童、成年和齿型磷酸酶过少症形式，诊断时根据年龄历史分类。表型范围从在具有死产的子宫内骨矿化的几乎完全缺失，至成年生活中首次发生的自发性骨折和牙科疾病。围产期致命的HPP (围产期HPP，或PL-HPP)在子宫内表现并可以导致死胎。一些新生儿虽存活数天，但由于胸部发育不全和佝偻病的疾病而遭受不断增加的呼吸损害。在6个月龄前诊断的婴儿HPP中，产后发育似乎正常，直到发生不良喂养、体重增加不足和出现佝偻病。放射学特点是特征性的并显示骨骼矿化受损，有时伴有进行性骨骼去矿化作用，导致肋骨骨折和胸部畸形。儿童HPP具有高度可变化的临床表现。乳牙的过早丧失起因于连接齿根与牙周韧带的牙骨质的发育不全、发育不良，或发育异常。佝偻病导致身材矮小和骨骼畸形，包括，例如，弓形腿，干骺端张开所致的手腕、膝盖和脚踝增大。成年HPP通常存在于中年期间，虽然频繁地有佝偻病史和/或早期的牙齿缺失，接着在青春期和年青的成人生活期间的良好健康。复发性跖骨应力性骨折是常见的，而焦磷酸钙二水合物沉积引起关节炎和焦磷酸关节病的攻击。当只有临床异常是牙科疾病，和放射学研究，甚至骨活检显示没有佝偻病或软骨病的迹象时，齿型磷酸酶过少症才被诊断。
HPP的严重的临床形式通常作为显示低于正常水平的血清AP活性的此类患者的父母的常染色体隐性特征被遗传。对于较温和形式的HPP，例如成年和齿型磷酸酶过少症，一种常染色体显性模式的遗传也有文献证实。
由于HPP的出现是罕见的，HPP的诊断在疾病的早期阶段通常被错过。此外，大多数HPP症状，例如异常的头骨形状、背部疼痛、骨折、骨刺(关节周围的隆起物)、弓形腿、胸腔隆起、身体高度随时间的损失/身材矮小，和关节疼痛，类似于由其它更常见疾病，例如成骨不全症、营养性佝偻病、骨关节炎和骨质疏松症引起的症状。有时用来诊断HPP的其它因素包括，例如，血中低水平的碱性磷酸酶(ALP)、血和尿中高于正常水平的钙、骨改变(包括手臂和腿骨的弓形(弯曲))、生长不良、厚的手腕和脚踝、韧带松弛、骨疼痛、骨折、牙齿过早脱落、HPP的家族史，和ALPL基因突变。
由于HPP患者可出现不同严重性的症状(例如，矿化缺陷)，存在未鉴定的具有轻微至没有典型HPP症状的HPP患者亚群，他们在传统上被误诊和/或忽略了治疗(例如用重组TNALP进行酶替换)。而且，许多HPP患者除了他们的特征性矿化缺陷外，还具有另外的症状(例如癫痫)。因此，存在鉴定这样的患者群体的需要，这不仅为了监测(并因而为了早期治疗)具有HPP症状的潜在的健康恶化，而且还为了用重组TNALP治疗并非矿化缺陷的症状。
概述
本公开内容提供一种鉴定具有碱性磷酸酶(例如，在人中的ALPL和在小鼠中的Akp2)基因突变的受试者的群体的方法。这样的受试者的群体可以先前已被诊断患有HPP或可能还未被诊断患有HPP。这样的基因突变可导致减少的碱性磷酸酶蛋白水平和/或蛋白功能(例如，针对PPi、PLP和/或PEA，或其它底物例如对-硝基苯基磷酸酯(pNPP)的酶功能)。这样的基因突变可通过本领域熟知的方法鉴定。鉴定这样的群体后，密切监测将跟踪他们的癫痫和/或其它HPP症状的疾病进展。重组碱性磷酸酶将被供给这样的群体以治疗或预防癫痫和/或其它症状。
本公开内容在一个方面提供一种鉴定具有碱性磷酸酶基因突变和至少一种症状的受试者的群体的方法。在一些实施方案中，在这样的群体中的受试者先前已被诊断患有HPP，但有轻微的、不受影响的，或不可检测的骨和/或牙齿矿化缺陷。在其它实施方案中，在这样的群体中的受试者尚未被诊断患有HPP。在一个实施方案中，在这样的群体中的受试者尚未被诊断患有HPP且无特征性的HPP症状(例如骨和/或牙齿矿化缺陷)。在一些实施方案中，至少一种非-HPP症状是癫痫。这样的癫痫对维生素B6和/或其它传统的抗癫痫药治疗可以是有响应的或无响应的。术语“不可检测的”在本公开内容中指患者上的表型(例如，骨和/或牙齿矿化表型之一)太轻微，以致本领域普通技术人员采用本领域已知的普通技术不能检测到的场合，或这样的本领域普通技术人员不能区分患者上的表型与普通健康人或没有其中表型是通常可接受的诊断标准(例如，HPP)的疾病或病症的普通患者的表型的场合。术语“未受影响的”在本公开内容中指这样的场合，即患者上的表型(例如，骨和/或牙齿矿化表型)是不可检测的，或是可检测的，但太轻微而不能满足通常可接受的诊断阈值，以致这样的具有表型的患者被本领域普通技术人员认为是罹患其中表型是通常可接受的诊断标准(例如，HPP)的疾病或病症的患者。
本公开内容提供一种鉴定患有HPP的受试者亚群的方法，其包括测量那些受试者的骨和/或牙齿矿化的程度并将这样的程度与正常的健康受试者的那些比较，其中与正常的健康受试者比较，亚群中的这样的受试者具有轻微的、未受影响的，或不可检测的矿化缺陷。在一些实施方案中，亚群中的这样的受试者具有癫痫症状。这样的癫痫症状对维生素B6和/或其它传统的抗癫痫药治疗可以是有响应的或无响应的。
本公开内容提供一种鉴定尚未被诊断患有HPP的受试者亚群的方法，其包括测量这样的亚群的碱性磷酸酶水平和/或酶功能，其中与正常的健康受试者比较，亚群中的这样的受试者具有缺陷的碱性磷酸酶水平和/或酶功能。在一些实施方案中，亚群中的这样的受试者具有癫痫症状。这样的癫痫症状可以是对维生素B6和/或其它传统的抗癫痫药治疗有响应的或无响应的。本领域的传统技术可被应用来测量那些受试者的碱性磷酸酶水平。例如，碱性磷酸酶的DNA/RNA水平可通过用于基因筛查的PCR或杂交(例如，DNA/RNA印迹)方法测试。碱性磷酸酶的蛋白水平可通过PAGE/SDS-PAGE、蛋白质印迹、ELISA或采用抗-碱性磷酸酶抗体的其它免疫测定法测试。碱性磷酸酶的酶功能可采用碱性磷酸酶底物PPi、PLP和/或PEA，或其它底物例如对-硝基苯基磷酸酯(pNPP)经体外或体内测试。在一个实施方案中，亚群中的这样的受试者具有轻微的、未受影响的，或不可检测的矿化缺陷。
作为一个方面，本公开内容提供一种鉴定如上公开的受试者群体或亚群的方法。作为另一个方面，本公开内容提供一种用重组ALP补充治疗那些经鉴定的群体或亚群中的受试者的至少一种症状的方法。在一些实施方案中，这样的至少一种症状是癫痫，对维生素B6和/或其它抗癫痫药治疗有响应或者无响应。
在一些实施方案中，本公开内容提供一种在具有异常的碱性磷酸酶活性的受试者中治疗癫痫的方法，其包括给予受试者治疗有效量的至少一种重组碱性磷酸酶。这样的异常的碱性磷酸酶活性可能是由于受试者中至少一种碱性磷酸酶的异常蛋白水平和/或功能所致。本文公开的碱性磷酸酶活性可通过至少一种重组碱性磷酸酶在生理条件下对磷酸乙醇胺(PEA)、无机焦磷酸(PPi)和/或吡多醛5’-磷酸(PLP)，或其它底物例如对-硝基苯基磷酸酯(pNPP)的酶活性测定。在一个优选的实施方案中，至少一种碱性磷酸酶底物选自PLP、PPi和PEA。
在一些实施方案中，本公开内容提供一种在具有高于正常水平的至少一种碱性磷酸酶底物的受试者中治疗癫痫的方法，其包括给予受试者治疗有效量的至少一种重组碱性磷酸酶。在一个实施方案中，至少一种碱性磷酸酶底物选自PLP、PPi、PEA和其它底物例如对-硝基苯基磷酸酯(pNPP)。在一个优选的实施方案中，至少一种碱性磷酸酶底物选自PLP、PPi和PEA。
在本公开内容中，各种术语例如“超过正常”、“低于正常”、“高于正常”或类似的其它术语指在特定受试者(例如，人)中的至少一种分子的水平和/或活性，其超过、低于或高于在正常受试者(例如，正常人)中的所述至少一种分子(或它/它们的内源性对应物)的水平和/或活性。对于正常人的最明显的例子是没有HPP或HPP症状和没有可导致HPP-相关症状的ALPL基因和ALP蛋白的突变或修饰的人。在专注于ALP功能的另一种场合下，在本公开内容中，“正常”人的范围可以扩大到包括没有异常内源性碱性磷酸酶活性(其可通过例如，底物(PPi、PEA、PLP或pNPP)水平测试并与其它健康或正常人的对应的活性比较)的任何人。
在其它实施方案中，本公开内容提供一种治疗受试者的癫痫的方法，其包括：
(i) 鉴定罹患，或有可能罹患癫痫的具有异常碱性磷酸酶活性(例如，由于异常的蛋白水平和/或功能导致)的受试者亚群；和
(ii) 给予亚群中的受试者治疗有效量的至少一种重组碱性磷酸酶。本文公开的碱性磷酸酶活性可通过至少一种重组碱性磷酸酶在生理条件下对磷酸乙醇胺(PEA)、无机焦磷酸(PPi)和/或吡多醛5’-磷酸(PLP)，或其它底物例如对-硝基苯基磷酸酯(pNPP)的酶活性测量。在一个优选的实施方案中，至少一种碱性磷酸酶底物选自PLP、PPi和PEA。
在一些实施方案中，本公开内容提供一种治疗受试者的癫痫的方法，其包括：
(i)鉴定具有高于正常水平的至少一种碱性磷酸酶底物的、罹患或处于罹患癫痫风险中的受试者群体；和
(ii) 给予群体中的受试者治疗有效量的至少一种重组碱性磷酸酶。在一个实施方案中，至少一种碱性磷酸酶底物选自PLP、PPi、PEA，和其它底物例如对-硝基苯基磷酸酯(pNPP)。在一个优选的实施方案中，至少一种碱性磷酸酶底物选自PLP、PPi和PEA。
本文公开的群体或亚群的受试者可以是具有轻微或不可检测的骨和/或牙齿矿化缺陷的磷酸酶过少症(HPP)患者、非-HPP患者，或尚未被诊断患有HPP的受试者。
本文公开的群体或亚群的受试者可具有增加的血清吡多醛5’-磷酸(PLP)和/或减少的细胞内吡多醛5’-磷酸(PLP)。
本文公开的群体或亚群的受试者可具有减少的在脑和/或其它组织/器官中的至少一种γ-氨基丁酸(GABA)和丝氨酸水平。本文公开的群体或亚群的受试者可具有增加的在脑和其它组织/器官中胱硫醚水平的至少一种(如在尿中可检测的)。在一个实施方案中，受试者具有减少的脑GABA和减少的脑丝氨酸的至少一种。在另一个实施方案中，受试者具有增加的脑和尿胱硫醚的至少一种。
在一些实施方案中，本文公开的至少一种重组碱性磷酸酶给予亚群的受试者连续至少一周、一个月、三个月、六个月，或一年。例如，至少一种重组碱性磷酸酶可每日给予，持续3天、一周、两周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、一年、十五个月、十八个月、两年、三十个月、三年，或持续更长的时期。
在一个实施方案中，至少一种重组碱性磷酸酶的给予提高脑GABA和/或丝氨酸水平。在另一个实施方案中，给予至少一种重组碱性磷酸酶降低脑和/或尿胱硫醚水平。
在一些实施方案中，治疗有效量的至少一种另外的治疗剂与至少一种本文描述的重组碱性磷酸酶联合给予本文公开的群体或亚群的受试者。在一个实施方案中，这样的至少一种另外的治疗剂包含至少一种抗癫痫药。这样的至少一种抗癫痫药可以是一种或多种药物，并包括，但不限于，例如，维生素B6及其变体、阻断钠通道或提高γ-氨基丁酸(GABA)功能的任何抗癫痫药、GABAA受体、GAT-1 GABA转运蛋白、GABA转氨酶、阻断电压门控钙通道的任何抗癫痫药、突触囊泡糖蛋白2A (SV2A)、α2δ-醛(例如，仲醛)、芳族烯丙基醇(例如，Stiripentol)、巴比妥类(例如，苯巴比妥、甲苯巴比妥，和巴比沙隆(Barbexaclone))、苯并二氮杂䓬(例如，氯巴占、氯硝西泮、氯氮䓬、安定、咪达唑仑、劳拉西泮、硝基安定、替马西泮(Temazepam)，和尼美西泮)、溴化物(例如，溴化钾)、氨基甲酸酯(例如，非尔氨酯)、甲酰胺(例如，卡马西平、奥卡西平，和醋酸艾司利卡西平)、脂肪酸(例如，丙戊酸盐、氨己烯酸、普罗加胺，和噻加宾)、果糖衍生物(例如，托吡酯)、GABA类似物(例如，加巴喷丁和普加巴林)、乙内酰脲(例如，乙苯妥英、苯妥英、美苯妥英，和磷苯妥英)、噁唑烷二酮(例如，甲乙双酮、三甲双酮、二甲双酮，和依沙双酮)、丙酸盐(例如，贝克拉胺)、嘧啶二酮(例如，扑米酮)、吡咯啉(例如，布立西坦、左乙拉西坦，和塞曲西坦)、琥珀酰亚胺(例如，乙琥胺、苯琥胺，和甲琥胺)、磺酰胺(例如，乙酰唑胺、舒噻美、醋甲唑胺，和唑尼沙胺)、三嗪类(例如，拉莫三嗪)、脲(例如，苯丁酰脲和苯乙酰脲)、丙戊酰胺类(valproylamides) (丙戊酸盐的酰胺衍生物)(例如，丙戊酰胺和戊诺酰胺)，或其它(例如，吡仑帕奈(Perampanel))。本公开内容的术语“与…组合”或“与…联合”意指至少两次行动(例如，本文公开的任何重组碱性磷酸酶和/或任何另外的抗癫痫药的至少两次给予)发生在同一个时间点或空间上，包括，但不限于：以相同的制剂给予；以不同的制剂，但在相同的时间给予；以不同的制剂且以一定的间隔时间一个接着另一个给予，所述间隔时间短到足以使技术人员认为是在相同的时间给予；以及以不同的制剂且以一定的间隔时间一个接着另一个给予，所述间隔时间为至少例如30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、1周、2周，或更长的时间，只要这样的间隔时间被技术人员认为是在相同的时间点或空间上给予，而不是在不同的给予时间点用于治疗。
作为另一个方面，本公开内容提供一种治疗如本文公开的癫痫的方法，其还包括：
维持至少一种另外的抗癫痫药和至少一种重组碱性磷酸酶的共同给予一段预定的时间；和
退出给予至少一种另外的抗癫痫药，但维持给予至少一种重组碱性磷酸酶至受试者。
在一些实施方案中，至少一种另外的抗癫痫药和至少一种本文公开的重组碱性磷酸酶被共同给予受试者至少一个月、至少六个月，或至少一年。例如，共同给药的预定的时间可以是至少3天、一周、两周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、一年、十五个月、十八个月、两年、三十个月、三年，或更长的时期。在一个实施方案中，至少一种另外的抗癫痫药是维生素B6 (吡哆醇)或其变体的至少一种。
在一些实施方案中，用于治疗的至少一种本文描述的重组碱性磷酸酶是对磷酸乙醇胺(PEA)、无机焦磷酸(PPi)和/或吡多醛5’-磷酸(PLP)，或其它底物例如对-硝基苯基磷酸酯(pNPP)有生理活性的。在一些实施方案中，这样的至少一种重组碱性磷酸酶包含组织非特异性碱性磷酸酶(TNALP)、胎盘碱性磷酸酶(PALP)、胚细胞碱性磷酸酶(GCALP)、肠碱性磷酸酶(IALP)，或其功能片段、融合物或嵌合构建体。在一个实施方案中，这样的至少一种重组碱性磷酸酶是TNALP、PALP、GCALP或IALP的可溶性片段，或其功能片段、融合物或嵌合构建体。在一个实施方案中，这样的至少一种重组碱性磷酸酶是包含来自至少1种、2种、3种或4种不同的类型的碱性磷酸酶的片段或部分的融合物或嵌合蛋白，例如TNALP-IALP嵌合构建体、IALP-PALP嵌合构建体，和其它TNALP嵌合或融合蛋白。在一个实施方案中，本公开内容的至少一种重组碱性磷酸酶包含如列于SEQ ID NO: 2中的氨基酸序列。在一些其它实施方案中，本公开内容的至少一种重组碱性磷酸酶包含与SEQ ID NO: 2具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，本公开内容的至少一种重组碱性磷酸酶包含与SEQ ID NO: 2具有至少75%序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本公开内容的至少一种重组碱性磷酸酶包含与SEQID NO: 2具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本公开内容的至少一种重组碱性磷酸酶包含与SEQ ID NO: 2具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本公开内容的至少一种重组碱性磷酸酶包含与SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本公开内容的至少一种重组碱性磷酸酶包含与SEQ ID NO: 2具有至少95%序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，本公开内容的至少一种重组碱性磷酸酶由编码包含如在SEQ ID NO: 2中所列序列的多肽的多核苷酸分子编码。在一些其它实施方案中，本公开内容的至少一种重组碱性磷酸酶由编码多肽的多核苷酸分子编码，所述多肽包含与SEQ ID NO: 2具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，本公开内容的至少一种重组碱性磷酸酶由编码多肽的多核苷酸分子编码，所述多肽包含与SEQ ID NO: 2具有至少75%序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本公开内容的至少一种重组碱性磷酸酶由编码多肽的多核苷酸分子编码，所述多肽包含与SEQ ID NO: 2具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本公开内容的至少一种重组碱性磷酸酶由编码多肽的多核苷酸分子编码，所述多肽包含与SEQ ID NO: 2具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本公开内容的至少一种重组碱性磷酸酶由编码多肽的多核苷酸分子编码，所述多肽包含与SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本公开内容的至少一种重组碱性磷酸酶由编码多肽的多核苷酸分子编码，所述多肽包含与SEQ ID NO: 2具有至少95%序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，本公开内容的至少一种重组碱性磷酸酶由在高严格条件下与至少一种编码多肽的多核苷酸分子能杂交的多核苷酸分子编码，所述多肽包含与SEQ ID NO: 2具有至少90%、95%或更高的序列同一性的氨基酸序列，其中高严格条件包含：于68℃在6 X SSC、5 XDenhardt's试剂、0.5% SDS和100mg/ml变性的片段化鲑鱼精子DNA中预-杂交和杂交；和于室温下在2 X SSC和0.5% SDS中洗涤10 min；于室温下在2 X SSC和0.1% SDS中洗涤10min；和于65℃在0.1 X SSC和0.5% SDS中洗涤3次，每次5分钟。
在一些实施方案中，用于治疗的至少一种本文描述的重组碱性磷酸酶是融合蛋白。本领域已知的至少一个接头可插入这样的融合蛋白中。在一些实施方案中，至少一种重组碱性磷酸酶与免疫球蛋白分子融合。在一个实施方案中，免疫球蛋白分子是片段可结晶区(Fc)。在另一个实施方案中，Fc包含如在SEQ ID NO: 3中所列的氨基酸序列。在一些其它实施方案中，Fc包含与SEQ ID NO: 3具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的氨基酸序列。在一些其它实施方案中，Fc由编码多肽的多核苷酸分子编码，所述多肽包含与SEQ ID NO: 3具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，Fc由在高严格条件下与至少一种编码多肽的多核苷酸分子能杂交的多核苷酸分子编码，所述多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少90%、95%或更高的序列同一性的氨基酸序列，其中高严格条件包含：于68℃在6 XSSC、5 X Denhardt's试剂、0.5% SDS和100mg/ml变性的片段化鲑鱼精子DNA中预-杂交和杂交；并于室温下，在2 X SSC和0.5% SDS中洗涤10 min；于室温下在2 X SSC和0.1% SDS中洗涤10 min；和于65℃在0.1 X SSC和0.5% SDS中洗涤3次，每次5分钟。
在其它实施方案中，用于治疗的至少一种本文描述的重组碱性磷酸酶与带负电荷的肽融合。这样的带负电荷的肽可包括任何长度，例如，从6至20个氨基酸残基的多-天冬氨酸或多-谷氨酸。在一些实施方案中，带负电荷的肽是D10、D8、D16、E10、E8或E16。在一些实施方案中，带负电荷的肽是D10、D16、E10或E16。在一个优选的实施方案中，带负电荷的肽是D10。
在一些实施方案中，至少一种本文描述的重组碱性磷酸酶包含含有sALP-Fc-D10的结构，或sALP-Fc、Fc-sALP、Fc-sALP-D10、D10-sALP-Fc或D10-Fc-sALP的结构的可溶性ALP (sALP)融合蛋白。在一个实施方案中，至少一种本文描述的重组碱性磷酸酶包含sALP-Fc-D10的结构。在另一个实施方案中，至少一种重组碱性磷酸酶包含如在SEQ ID NO: 1或4中所列的氨基酸序列。在一些其它实施方案中，至少一种重组碱性磷酸酶包含与SEQ IDNO: 1或4具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的氨基酸序列。在一些其它实施方案中，至少一种重组碱性磷酸酶由编码多肽的多核苷酸分子编码，所述多肽包含与SEQ ID NO: 1或4具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，至少一种重组碱性磷酸酶由在高严格条件下与至少一种编码多肽的多核苷酸分子能杂交的多核苷酸分子编码，所述多肽包含与SEQ ID NO: 1或4具有至少90%、95%或更高的序列同一性的氨基酸序列，其中高严格条件包含：于68℃在6 X SSC、5 X Denhardt's试剂、0.5% SDS和100mg/ml变性的片段化鲑鱼精子DNA中预-杂交和杂交；和于室温下在2 X SSC和0.5% SDS中洗涤10 min；于室温下在2 X SSC和0.1% SDS中洗涤10 min；以及于65℃，在0.1 X SSC和0.5% SDS中洗涤3次，每次5分钟。
在一些实施方案中，至少一种本文描述的重组碱性磷酸酶可以从约0.1 mg/kg/天至约20 mg/kg/天，从约0.1 mg/kg/天至约10 mg/kg/天，从约0.1 mg/kg/天至约8 mg/kg/天，从约0.1 mg/kg/天至约5 mg/kg/天，从约0.1 mg/kg/天至约1 mg/kg/天，从约0.1 mg/kg/天至约0.5 mg/kg/天，从约0.5 mg/kg/天至约20 mg/kg/天，从约0.5 mg/kg/天至约10mg/kg/天，从约0.5 mg/kg/天至约8 mg/kg/天，从约0.5 mg/kg/天至约5 mg/kg/天，从约0.5 mg/kg/天至约1 mg/kg/天，从约1 mg/kg/天至约20 mg/kg/天，从约1 mg/kg/天至约10mg/kg/天，从约1 mg/kg/天至约8 mg/kg/天，从约1 mg/kg/天至约5 mg/kg/天的剂量，或相当的每周剂量(例如，6 mg/kg/周与1 mg/kg/天相当)给予。用于至少一种本文描述的重组碱性磷酸酶的给药途径可包括本领域任何已知的方法，至少包括，静脉内、肌内、皮下、舌下、鞘内和/或皮内给予。在一个实施方案中，至少一种重组碱性磷酸酶经静脉内给予。在一些实施方案中，至少一种重组碱性磷酸酶以多个剂量通过相同的或不同的途径给予。在其它实施方案中，至少一种重组碱性磷酸酶通过不同的途径，以多个剂量同时地或顺序地给予。例如，至少一种重组碱性磷酸酶可首先经静脉内给予，然后皮下给予以后的剂量。或者，为了快速治疗的反应，静脉内给予也可在以后的剂量中使用。多个剂量的给药途径的选择可由技术人员确定，以获得最大的效果、稳定性(例如，至少一种重组碱性磷酸酶和/或至少一种另外的抗癫痫药的半衰期)、效率，和/或成本效益的目标。本公开内容不意欲对给药途径的选择和/或以不同的剂量应用不同的给药途径进行特定限制。
作为另一个方面，本公开内容提供一种在具有异常的碱性磷酸酶活性的受试者中治疗癫痫的方法，其包括给予所述受试者治疗有效量的至少一种重组碱性磷酸酶，其中至少一种重组碱性磷酸酶包含sALP-Fc-D10的结构。在一个实施方案中，这样的至少一种重组碱性磷酸酶包含与SEQ ID NO: 2具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，这样的至少一种本公开内容的重组碱性磷酸酶由编码多肽的多核苷酸分子编码，所述多肽包含与SEQ ID NO: 2具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，至少一种重组碱性磷酸酶由在高严格条件下与至少一种编码多肽的多核苷酸分子能杂交的多核苷酸分子编码，所述多肽包含与SEQ ID NO: 2具有至少90%、95%或更高的序列同一性的氨基酸序列，其中高严格条件包含：于68℃，在6 X SSC、5 X Denhardt's试剂、0.5% SDS和100mg/ml变性的片段化鲑鱼精子DNA中预-杂交和杂交；和于室温下在2 XSSC和0.5% SDS中洗涤10 min；于室温下在2 X SSC和0.1% SDS中洗涤10 min；和于65℃，在0.1 X SSC和0.5% SDS中洗涤3次，每次5分钟。
作为另一个方面，本公开内容提供一种在具有高于正常水平的至少一种碱性磷酸酶底物的受试者中治疗癫痫的方法，其包括给予所述受试者治疗有效量的至少一种重组碱性磷酸酶，其中至少一种重组碱性磷酸酶包含sALP-Fc-D10的结构。在一个实施方案中，这样的至少一种重组碱性磷酸酶包含与SEQ ID NO: 2具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本公开内容的这样的至少一种重组碱性磷酸酶由编码多肽的多核苷酸分子编码，所述多肽包含与SEQ IDNO: 2具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，至少一种重组碱性磷酸酶由在高严格条件下与至少一种编码多肽的多核苷酸分子能杂交的多核苷酸分子编码，所述多肽包含与SEQ ID NO: 2具有至少90%、95%或更高的序列同一性的氨基酸序列，其中高严格条件包含：于68℃在6 X SSC、5X Denhardt's试剂、0.5% SDS和100mg/ml变性的片段化鲑鱼精子DNA中预-杂交和杂交；和于室温下在2 X SSC和0.5% SDS中洗涤10 min；于室温下在2 X SSC和0.1% SDS中洗涤10min；和于65℃，在0.1 X SSC和0.5% SDS中洗涤3次，每次5分钟。
作为另一个方面，本公开内容提供一种治疗受试者的癫痫的方法，其包括：
(i) 鉴定具有异常的碱性磷酸酶活性的受试者群体，所述受试者罹患癫痫，或处于罹患癫痫的风险中；和
(ii) 给予群体中的受试者治疗有效量的至少一种重组碱性磷酸酶，
其中至少一种重组碱性磷酸酶包含sALP-Fc-D10的结构。在一个实施方案中，这样的至少一种重组碱性磷酸酶包含与SEQ ID NO: 2具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，这样的本公开内容的至少一种重组碱性磷酸酶由编码多肽的多核苷酸分子编码，所述多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，至少一种重组碱性磷酸酶由在高严格条件下与至少一种编码多肽的多核苷酸分子能杂交的多核苷酸分子编码，所述多肽包含与SEQ ID NO: 2具有至少90%、95%或更高的序列同一性的氨基酸序列，其中高严格条件包含：于68℃在6 X SSC、5 XDenhardt's试剂、0.5% SDS和100mg/ml变性的片段化鲑鱼精子DNA中预-杂交和杂交；和于室温下在2 X SSC和0.5% SDS中洗涤10 min；于室温下在2 X SSC和0.1% SDS中洗涤10min；和于65℃，在0.1 X SSC和0.5% SDS中洗涤3次，每次5分钟。
作为另一个方面，本公开内容提供一种治疗受试者的癫痫的方法，其包括：
(i) 鉴定具有高于正常水平的至少一种碱性磷酸酶底物的受试者群体，所述受试者罹患癫痫，或面临罹患癫痫的风险；和
(ii) 给予群体中的受试者治疗有效量的至少一种重组碱性磷酸酶，
其中至少一种重组碱性磷酸酶包含sALP-Fc-D10的结构。在一个实施方案中，这样的至少一种重组碱性磷酸酶包含与SEQ ID NO: 2具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，这样的本公开内容的至少一种重组碱性磷酸酶由编码多肽的多核苷酸分子编码，所述多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，至少一种重组碱性磷酸酶由在高严格条件下与至少一种编码多肽的多核苷酸分子能杂交的多核苷酸分子编码，所述多肽包含与SEQ ID NO: 2具有至少90%、95%或更高的序列同一性的氨基酸序列，其中高严格条件包含：于68℃在6 X SSC、5 XDenhardt's试剂、0.5% SDS和100mg/ml变性的片段化鲑鱼精子DNA中预-杂交和杂交；和于室温下在2 X SSC和0.5% SDS中洗涤10 min；于室温下在2 X SSC和0.1% SDS中洗涤10min；和于65℃，在0.1 X SSC和0.5% SDS中洗涤3次，每次5分钟。
在一些实施方案中，本文描述的受试者是人或非-人哺乳动物。在一个实施方案中，受试者是人。
附图简述
图1表示由人可溶性TNALP融合蛋白hsTNALP-FcD10举例说明的本公开内容的重组ALP的设计和示意结构。小图A表示包括N-末端信号肽和用于GPI-添加的瞬时膜-锚定信号的人组织非-特异性碱性磷酸酶基因(TNALP)的完整初级翻译产物的示意图。小图B表示融合蛋白的初级翻译产物。小图C表示缺乏可裂解的TNALP信号肽的初级翻译产物。
图2表示具有N-末端肽信号的hsTNALP-FcD10的蛋白序列(SEQ ID NO: 1)。在这个序列中，17-aa N-末端肽信号用斜体和下划线显示。hsTNALP部分(SEQ ID NO: 2)为斜体，但没有下划线。Fc部分(SEQ ID NO: 3)是加下划线的，但不是斜体。对应于假定的N-糖基化位点的天冬酰胺(N)残基以粗体和小写字母标记。大写粗体字母(即，LK和DI)分别对应于hsTNALP部分和Fc部分之间以及Fc部分和C-末端D10之间的接头。这些接头源自在cDNA工程改造期间引入的核酸内切酶限制性位点。
图3表示没有N-末端肽信号的hsTNALP-FcD10的蛋白序列(SEQ ID NO: 4)。hsTNALP部分(SEQ ID NO: 2)为斜体，但没有下划线。Fc部分(SEQ ID NO: 3)是加下划线的，但不是斜体。对应于假定的N-糖基化位点的天冬酰胺(N)残基以粗体和小写字母标记。大写粗体字母(即，LK和DI)分别对应于hsTNALP部分和Fc部分之间以及Fc部分和C-末端D10之间的接头。
图4表示显示得自野生型小鼠(WT)、Akp2 +/-杂合子小鼠(HET)和Akp2 -/-纯合子小鼠(HOM)的腿骨矿化的X-射线图像。不同的程度的矿化缺陷(从具有严重的到未受影响的表型)见于Akp2 -/-纯合子小鼠中。
图5表示Akp2 -/-纯合子小鼠的不同的群落中表型分布的概要(使用放射图像评分)。
图6描述Akp2 -/-纯合子小鼠(传代代码：F4)的体重与它们的疾病严重性相关(即，具有重度或轻度矿化缺陷或未受影响的/正常矿化)。野生型小鼠(Akp2 +/+ )被用作对照。
图7描述Akp2 -/- 纯合子小鼠的体重与它们的疾病严重性矿化表型相关。最左边的2组数据(Akp2 -/- )表示具有不同的(例如，严重的或未受影响的)疾病严重性的所有Akp2 -/- 纯合子小鼠的数据。野生型和Akp2 +/-杂合子小鼠被用作对照。
图8描述Akp2 -/- 纯合子小鼠(传代代码：F10)的骨(股骨和胫骨)长度与它们的疾病严重性相关。最左边的组的数据(Akp2 -/- )表示具有不同的(例如，严重的或未受影响的)疾病严重性的所有Akp2 -/- 纯合子小鼠的数据。野生型和Akp2 +/-杂合子小鼠被用作对照。
图9表示在具有不同矿化表型的Akp2 -/-纯合子小鼠中寿命的比较。所有Akp2 -/-纯合子小鼠具有明显减少的寿命，而不管矿化表型。
图10描述Akp2 -/-纯合子小鼠具有减少的脑γ-氨基丁酸(GABA)浓度，其可通过每日ALP (sTNALP-FcD10，或阿司弗泰斯阿尔法(asfotase alfa))治疗来纠正。采用或未采用治疗的野生型小鼠被用作对照。左小图：于第10天对(从左到右)用空白媒介对照每日处理至第9天的敲除小鼠(“GRP 1”)，用sTNALP-FcD10 (8.2 mg/kg)每日处理至第9天的敲除小鼠(“GRP 2”)，和无任何处理的野生型小鼠(“GRP 3”)测量GABA浓度。右小图：于第48天对(从左到右)用sTNALP-FcD10 (8.2 mg/kg)每日处理至第35天，然后用空白媒介对照(即，中止治疗)每日处理至第47天的敲除小鼠(“GRP 1”)，用sTNALP-FcD10每日处理至第47天的敲除小鼠(“GRP 2”)，和无任何处理的野生型小鼠(“GRP 3”)，和用sTNALP-FcD10每日处理至第35天，然后用空白媒介对照每日处理至第47天的野生型小鼠(“GRP 4”)测量GABA浓度。
图11描述Akp2 -/-纯合子小鼠具有明显升高的脑胱硫醚浓度，其可通过每日ALP(sTNALP-FcD10，或阿司弗泰斯阿尔法)治疗来纠正。采用或未采用治疗的野生型小鼠被用作对照。左小图：于第10天对(从左到右)用空白媒介对照每日处理至第9天的敲除小鼠(“GRP 1”)，用sTNALP-FcD10 (8.2 mg/kg)每日处理至第9天的敲除小鼠(“GRP 2”)，和无任何处理的野生型小鼠(“GRP 3”)测量胱硫醚浓度。右小图：于第48天对(从左到右)用sTNALP-FcD10 (8.2 mg/kg)每日处理至第35天，然后用空白媒介对照每日处理至第47天(“中止”)的敲除小鼠(“GRP 1”)，用sTNALP-FcD10每日处理至第47天的敲除小鼠(“GRP2”)，无任何治疗的野生型小鼠(“GRP 3”)，和用sTNALP-FcD10每日处理至第35天，然后用空白媒介对照每日处理至第47天的野生型小鼠(“GRP 4”)测量胱硫醚浓度。
图12描述Akp2 -/-纯合子小鼠具有明显减少的脑丝氨酸浓度，其可通过每日ALP(sTNALP-FcD10，或阿司弗泰斯阿尔法)治疗来纠正。采用或未采用治疗的野生型小鼠被用作对照。左小图：于第10天对(从左到右)用空白媒介对照每日处理至第9天的敲除小鼠(“GRP 1”)，用sTNALP-FcD10每日处理至第9天的敲除小鼠(“GRP 2”)，和无任何处理的野生型小鼠(“GRP 3”)测量丝氨酸浓度。右小图：于第48天对(从左到右)用sTNALP-FcD10 (8.2mg/kg)每日处理至第35天，然后用空白媒介对照每日处理至第47天(“中止”)的敲除小鼠(“GRP 1”)，用sTNALP-FcD10每日处理至第47天的敲除小鼠(“GRP 2”)，无任何治疗的野生型小鼠(“GRP 3”)，和用sTNALP-FcD10每日处理至第35天和用空白媒介对照每日处理至第47天的野生型小鼠(“GRP 4”)测量丝氨酸浓度。
图13比较接受325 ppm膳食吡哆醇补剂的Akp2 -/-纯合子小鼠(具有严重的矿化缺陷或正常矿化)的寿命。
图14比较具有严重的矿化缺陷(KO-严重的)或正常矿化(KO-正常)的野生型(WT)或Akp2 -/-纯合子小鼠的脑GABA和胱硫醚浓度，全部接受325 ppm膳食吡哆醇补剂。阴影区域指其中小鼠具有比较低的脑GABA浓度，但比较高的脑胱硫醚浓度的概况。
详细描述
许多HPP患者患有癫痫作为他们的特征性矿化缺陷的另外的症状。Akp2 -/- 小鼠也发生随后为致命的癫痫。见Waymire et al. 1995 Nature Genetics 11:45-51。因为维生素B6(吡哆醇)是用于癫痫的传统的治疗，患有癫痫的许多HPP患者用维生素B6治疗作为一种预防性治疗。然而，一些HPP患者对吡哆醇治疗没有响应。即使对于那些吡哆醇-有响应的HPP患者，随着时间的推移，高剂量的维生素B6可能是有毒性的，并且可导致神经损伤或四肢麻木和刺痛，其最终可能是不可逆转的。最常见的维生素B6毒性症状包括，例如，头痛、严重疲劳、情绪变化、神经变化等。依照Mayo Clinic Health System在其网站(http://www.mayoclinic.org/drugs-supplements/vitamin -b6/safety/hrb-20058788)关于维生素B6 (吡哆醇)的安全性出版物，过量的维生素B6可造成异常心律、痤疮、过敏反应、胸部增大或酸痛、叶酸水平的变化、肌张力降低、嗜睡或镇静、喉咙感觉有异物块、对皮肤感觉有刺痛、头痛、胃灼热、食欲不振、恶心、皮疹、溃疡性结肠炎复发(炎性肠道疾病)、胃部不适或疼痛、阳光过敏、呕吐、恶化的哮喘、低血压、血糖水平变化，和增加的出血风险。维生素B6也可干扰其它医药治疗。例如，它可以减少左旋多巴治疗的有效性，该药被用来治疗帕金森氏病。服用青霉胺(用来治疗威尔逊氏病(Wilson's disease)、铅中毒、肾结石和关节炎)的人，应该只能在临床医师的直接监督下服用维生素B6。雌激素的草药和补品，包括避孕丸，可与维生素B6相互作用。
本公开内容提供一种鉴定具有异常的(例如，缺乏的)碱性磷酸酶(ALP)活性(例如，具有在人类中的ALPL基因或在小鼠中的Akp2 (ALPL的直向同源物)基因的缺陷的等位基因)或ALP底物(例如，PPi、PEA和PLP)的异常基因和/或蛋白水平的受试者群体的方法。如本文所用的，术语“异常”意指蛋白(例如，ALP)，或其生物活性融合物或片段的表达水平和/或酶活性偏离正常的、适当的或预期的过程。例如，具有“异常” ALP活性的受试者(例如，人或非-人动物，包括，但不限于小鼠)意味着这样的受试者具有异常的ALP活性，其可能是由于，例如，相对于来自健康受试者或无HPP症状或以至少一种ALP底物(例如，PPi、PLP和PEA)的异常蛋白水平和/或活性为特征的疾病或病症状态的受试者的此类ALP蛋白的表达水平和/或活性，ALP基因或蛋白产物的缺乏或缺少，和/或ALP基因或蛋白产物的缺陷或功能丧失所致。特别是，当这样的表达水平或活性比来自健康受试者或无HPP症状或以至少一种ALP底物(例如，PPi、PLP和PEA)的异常蛋白水平和/或活性为特征的疾病或病症状态的受试者的此类ALP蛋白的表达水平或活性更低(例如，少于95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、1%，或更低)时，ALP的蛋白表达水平或活性是缺乏、缺少，或有缺陷的。受试者的群体可被鉴定，无论他们是否先前曾被诊断出患有磷酸酶过少症(HPP)。由于例如缺乏或减少水平的ALP蛋白和/或具有减少或消除的酶活性的有缺陷的ALP蛋白，群体可例如，基于减少的ALP活性来鉴定。减少的ALP活性的原因包括，例如，编码ALPs的基因突变，从而导致此类基因的有缺陷的等位基因；调节ALPs的表达的信号传导分子的缺陷；辅因子的异常表达或调节，和/或调节ALPs活性的上游或下游因子的异常表达。ALPL的特定等位基因可导致，例如，减少的碱性磷酸酶蛋白水平和/或蛋白功能。这样的等位基因可通过本领域已知的方法鉴定。鉴定的群体的成员应被监测以确定疾病进展(HPP)和其它症状，例如，癫痫。重组碱性磷酸酶，例如，可供给鉴定的群体以治疗或预防癫痫和/或其它症状，例如，与HPP或减少的ALP活性相关的症状。
术语“个体”、“受试者”和“患者”可互换使用并指需要诊断、治疗或疗法的任何受试者，特别是人。其它受试者可包括，例如，牛、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马等。如本文所用的，“面临风险”的受试者是被鉴定为具有发展与例如，异常的ALP活性有关的疾病、病症或症状的风险的受试者。
HPP患者传统上通过他们的特征性的骨和/或牙齿矿化缺陷来鉴定。然而，HPP患者就矿化缺陷的程度方面来说是变化的，范围从非常严重至不可检测。明显地，具有轻微或没有矿化缺陷的那些HPP患者容易误诊和耽搁(如果有的话)用例如，重组碱性磷酸酶的治疗。本文描述了鉴定具有轻微的、未受影响的或不可检测的骨和/或牙齿矿化缺陷的HPP患者亚群的材料和方法，用于碱性磷酸酶替代治疗。这样的患者可能先前已被诊断患有HPP，但由于他们的轻微的、未受影响的或不可检测的矿化缺陷，尚未用碱性磷酸酶治疗。本公开内容包括提供用例如，碱性磷酸酶或增加内源性碱性磷酸酶活性的药剂治疗亚群中这样的受试者的材料和方法。这样的治疗可例如治疗或预防并非矿化缺陷的症状和/或预防将来由于疾病进展所致的矿化缺陷。
本文描述了鉴定显示HPP和/或HPP相关症状，或者面临发生HPP和/或HPP相关症状的风险的ALP缺陷的受试者的群体的方法。鉴定的群体可包括先前已被鉴定为患有HPP或HPP-相关症状，或没有之前的诊断的无症状受试者。减少的血清ALP活性导致，例如，至少一种碱性磷酸酶底物(例如，焦磷酸(PPi)、吡多醛5’-磷酸(PLP)或磷酸乙醇胺(PEA))的蛋白水平和/或功能增加。鉴定受试者群体的方法包括，例如，有缺陷的碱性磷酸酶等位基因(产前或出生后)的检测，体内蛋白表达水平或功能活性的测量，样品中相关标记分析物的测量，或本领域已知的测定ALP活性的其它方法。
鉴定的具有异常ALP活性的群体可具有并非骨和牙齿矿化缺陷的症状。然而，由于他们的轻度矿化缺陷或没有矿化缺陷，这样的受试者不太可能被诊断为HPP受试者或用例如碱性磷酸酶治疗。因此，本文描述了鉴定和治疗处于发展与异常的ALP活性相关的疾病、病症或症状的风险中的受试者，特别是未显示一些常见HPP症状(例如，骨矿化缺陷)的那些受试者的材料和方法。
本公开内容提供具有轻度、未受影响的或不可检测的矿化缺陷，但仍有缩短的寿命的碱性磷酸酶敲除(Akp2 -/- )小鼠亚群。对这些小鼠的研究表明，碱性磷酸酶缺乏明显减少γ-氨基丁酸(GABA) (哺乳动物中枢神经系统中的一种主要抑制性神经递质)的蛋白水平。脑GABA的观察到的减少通过重组碱性磷酸酶治疗补救。由于受试者的群体具有缺陷的碱性磷酸酶，但没有或只有最少的矿化缺陷，存在面临ALP相关疾病、病症或症状，例如癫痫的风险的受试者群体，他们对例如碱性磷酸酶替代疗法或用于增加ALP活性的其它疗法有响应。
加上HPP患者常常显示癫痫这一事实，本文描述的资料显示，即使在不显示一些更明显的HPP症状(例如，骨矿化缺陷)的患者中，减少或消除的血清ALP活性也会导致癫痫。这个群体经历或面临经历癫痫和与减少的或消除的ALP活性相关的其它疾病、病症或症状的风险(例如，面临发生HPP或HPP症状的风险)。
本公开内容中的一种或多种癫痫可被广义地分类为癫痫性发作(涉及由于脑中的异常过度的或同步神经元活动所致体征和/或症状的短暂发作)和非癫痫性发作，后者是模仿癫痫性发作的突发性事件，但不涉及异常的、有节奏的皮质神经元的放电。癫痫的外向效应可从不受控制的抽搐运动(强直阵挛性癫痫发作(先前称为癫痫大发作)；有时称为“惊厥”)到与短暂的意识丧失(癫痫小发作)一样微弱而不同(Fisher et al., 2005Epilepsia 46: 470-2和Ricker 2003 Differential Diagnosis in AdultNeuropsychological assessment. Springer Publishing Company. p. 109. ISBN 0-8261-1665-5)。如本文所用的，“癫痫”指由于任何生理学或环境原因导致的任何癫痫或惊厥事件，包括，但不限于，癫痫性发作、非-癫痫性发作、对维生素B6-有响应的癫痫、对B6-无响应的癫痫等。术语“癫痫”与“惊厥”通常可互换使用。当受试者的身体快速和不受控制地摇晃时，惊厥发生。在惊厥发作期间，人的肌肉反复收缩和放松。有许多不同的类型的癫痫。一些具有温和症状而没有摇晃。
缺乏碱性磷酸酶功能(例如，Akp2 -/- )的小鼠发生随后为致命的癫痫(Waymire1995)。癫痫由吡多醛5'-磷酸(PLP)的代谢中碱性磷酸酶的缺乏引起，类似于在HPP患者中发现的缺乏。一般来说，吡哆醇(维生素B6)可作为3种不同的类维生素被吸收：PLP、吡哆胺-P，和吡哆醇-葡糖苷(Plecko 2009 Can J Neurol Sci 36: S73-S77)。然而，在肝中，后面两种将由吡哆醇(胺)-5-磷酸氧化酶(PNPO)转化为唯一的活性辅因子PLP。然后，在血液循环中的PLP被碱性磷酸酶去磷酸化为吡多醛(PL)，其自由地穿过细胞膜并被吡多醛激酶再磷酸化成为细胞内PLP。PLP，一旦在细胞内，则为在氨基酸和神经递质代谢中各种酶反应的辅因子，例如，谷氨酸转化为γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸裂解系统、多巴胺、组胺、D-丝氨酸、硫化氢和在血清素和高香草酸合成中的芳香酸脱羧酶。在Akp2 -/- 小鼠中，由于有缺陷的碱性磷酸酶，PL不能从PLP产生，导致血浆PLP水平升高，但细胞内PLP浓度减少。缺乏细胞内PLP会关闭下游新陈代谢，包括例如，在脑中GABA通过谷氨酸脱羧酶(GAD)的产生。
GABA在脊椎动物的脑中，通过结合于突触前和后神经元过程的血浆膜中的特异性跨膜受体，用作抑制性突触。这种结合造成离子通道的开放，以允许带负电的氯离子流入细胞或者带正电的钾离子离开细胞。这种作用导致跨膜电位的负面变化，通常导致超极化。两种通常类型的GABA受体是已知的：GABAA，其中受体是配体门控离子通道复合物的一部分，和GABAB亲代谢型受体，其是通过中间体打开或关闭离子通道的G蛋白偶联受体。与对照同窝出生仔鼠比较，GABA水平被发现在Akp2 -/- 小鼠中减少约50%，其对敲除小鼠的寿命缩短负有责任(Waymire 1995)。而且，通过补充维生素B6 (吡哆醛，或PL，但不是PN)，癫痫表型在约67%的具有混合遗传背景的Akp2 -/- 小鼠中得到补救，虽然获得补救的动物随后发生有缺陷的生齿。剩余的33%对PL注射反应差甚或没有响应。相反，具有先天性遗传背景的Akp2 -/- 小鼠全部对PL补充反应差或甚至没有响应。
碱性磷酸酶(ALP)
有4种已知的ALP同工酶，即组织非特异性碱性磷酸酶(TNALP，见下文的讨论)、胎盘碱性磷酸酶(PALP) (NCBI参考序列[NP_112603]和[NP_001623])、胚细胞碱性磷酸酶(GCALP)(NCBI参考序列[P10696])和肠碱性磷酸酶(IALP) (NCBI参考序列[NP_001622])。这些酶具有非常类似的三维结构。它们的催化位点的每一个包含对酶活性必需的金属离子(两个Zn2+和一个Mg2+)的4个金属结合结构域。这些酶催化磷酸一酯的水解并且还在高浓度的磷酸受体的存在下，催化转磷酸反应。例如，PALP对PEA、PPi和PLP是有生理活性的，PEA、PPi和PLP是TNALP的已知的天然底物(Whyte, 1995；Zhang, 2004)。
基于ALP中的结构类似性，人们也期望它们中的一些功能重叠。用高脂肪含量，例如，具有升高水平的源自IALP的循环ALP的食物喂给人和啮齿动物(Langman 1966和Gould1944 Biochem. 4:175-181)。因此，增加膳食摄入量可升高IALP，因而通过减少Akp2 -/- 小鼠中的循环PLP补偿TNALP功能。类似地，在怀孕期间，在HPP的女性携带者中表达的PALP显示对TNALP的补偿(Whyte 1995 J. Clin. Invest. 95:1440-1445)。
具有减少或消除的ALP活性的受试者群体的鉴定可随后，例如，用治疗有效量的重组TNALP或其它ALP同工酶治疗。不同的同工酶可以单独地进行互换或组合给予。鉴定的受试者可例如用重组TNALP、PALP、IALP和/或GCALP治疗。这些ALP可以是哺乳动物(例如人)蛋白、非-哺乳动物蛋白，或包含至少部分的哺乳动物部分的融合蛋白。
TNALP和变体
TNALP是一种通过糖脂锚定于其C末端的膜结合蛋白(Swiss-Prot, P05186)。这种糖磷脂酰肌醇(GPI)锚钩在除去疏水性C末端后经翻译后加入，其作为暂时性膜锚钩和作为添加GPI的信号起作用。本文描述的重组TNALP包括，例如，TNALP的可溶性部分。一个更具体的例子包括包含人TNALP的重组TNALP，其中疏水性C-末端序列的第一氨基酸，即丙氨酸，被终止密码子替代。如此形成的可溶性TNALP (在此称为sTNALP)包含催化位点的形成所必需的天然锚定形式的TNALP的所有氨基酸，但缺乏GPI膜锚钩。已知的TNALP包括，例如，人TNALP[NCBI参考序列NP_000469、AAI10910、AAH90861、AAH66116、AAH21289，和AAI26166]；恒河猴TNALP [XP_001109717]；大鼠TNALP [NP_037191]；狗TNALP [AAF64516]；猪TNALP[AAN64273]、小鼠[NP_031457]、牛[NP_789828、NP_776412、AAM 8209、AAC33858]，和猫[NP_001036028]。用于本公开内容的TNALP或其它基因或蛋白的术语“野生型”或“野生型序列”指在其天然出现于正常人、非-人哺乳动物或其它活的有机体时这样的基因或蛋白的典型形式。野生型序列可指在用于多肽或蛋白的基因或标准“正常”原始氨基酸序列(任选地具有标准“正常”翻译后修饰和/或链间键合和/或在各氨基酸残基中的相互作用)的基因座中的标准"正常"等位基因，与非-标准的、"突变体"等位基因或氨基酸序列/修饰/相互作用产生的等位基因形成对比。“突变体”等位基因可在很大的程度上变化，且如果在群体内发生基因移位，甚至成为野生型。现在意识到大多数或全部基因座(和不太频繁地，但对于大多数多肽序列仍然是可能的)以各种等位基因形式存在，其在一个物种的整个地理范围内的出现频率是变化的，并且一致的野生型可能不一定存在。然而，一般来说，最普遍的等位基因或氨基酸序列 – 即，在正常个人或其它生物体中具有最高频率的氨基酸序列 - 被认为是本公开内容中的野生型的氨基酸序列。在本说明书用于人或其它生物体的术语“正常”，除了另外指明外，指没有任何疾病(例如，HPP)、病症和/或症状或生理后果(例如，矿化缺陷、癫痫等)的人或其它生物体，所述疾病、病症和/或症状或生理后果由相关基因或多肽/蛋白的异常活性(其可由于例如基因或蛋白产物的缺乏或缺少，和/或基因或蛋白产物的缺陷或功能丧失导致)引起或与异常活性相关。对于正常人的最明显的例子是没有HPP或HPP症状且没有可导致HPP-相关症状的ALPL基因和ALP蛋白的突变或修饰的人。在专注于ALP功能的另一种场合下，在本公开内容中的“正常”人的范围可放宽到包括不具有异常的内源性碱性磷酸酶活性(且可通过例如，底物(PPi、PEA和PLP)水平测试并与其它健康或正常人的对应的活性比较)的任何人。
本文描述的重组TNALP可包括在核苷酸或者在氨基酸水平，被在TNALP序列的一个或多个位置，在TNALP序列的两个或更多个位置，在TNALP序列的3个或更多个位置，在TNALP序列的5个或更多个位置，在TNALP序列的10或更多个位置，或在TNALP序列的15-20个或更多个位置的序列取代的序列。取代可包括，例如，保守取代、用直系同源序列替代，和/或破坏性取代。TNALP序列也可具有缺失或重排。
本领域技术人员将认识到，保守取代可在核苷酸水平进行以编码导致功能表达产物的序列。因此，TNALP序列和片段(任选地包括外显子和调节序列)可以是TNALP的野生型序列，或它们可以是与野生型序列共享高同源性的变异序列。本公开内容提供与所需野生型序列具有至少约70%、约71%、约72%、约73%、约74%、约75%、约76%、约77%、约78%、约79%、约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%或以上同一性的序列的应用。如本文所用的，术语“约”意指与其使用的数字的数值的加或减10%。
术语“同源性”或“同一性”或“相似性”指两个序列之间的序列关系并在为了比较的目的比对时，可通过比较每个序列中的核苷酸位置或氨基酸位置来确定。术语“同源性”指两个核酸或氨基酸序列的关联性。术语“同一性”指经比较的序列的相同程度。术语“相似性”指两个序列相同的程度，但包括可在密码子内被取代而不改变密码子的氨基酸同一性的中性简并核苷酸。
本领域普通技术人员将认识到，对在编码序列中改变、添加或缺失单一氨基酸或小百分率的氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白序列的独立的取代、缺失或添加是“保守地修饰变体”。这样的变体可用来，例如，改变肽的物理性质，例如，增加肽的稳定性或效果。提供功能类似的氨基酸的保守取代表是本领域普通技术人员已知的。这样的保守地修饰变体是除了和不排除多态性变体外，还包括种间同系物和可供选择的等位基因。以下的组别提供可彼此保守地取代的氨基酸的非限制性例子：1) 丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2) 天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3) 天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4) 精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5) 异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6) 苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7) 丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和 8) 半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)。
不受理论的限制，本文描述的重组ALP涵盖包含源自人ALP同工酶和已知功能ALP(例如，源自人、非-人哺乳动物、小鼠、大鼠、牛、猫、狗、猪等的ALP)的ALP胞外域的共有序列的序列。如本文所用的术语“胞外域”指天然蛋白的任何功能性细胞外部分(例如，没有肽信号)。保留原始氨基酸1-501 (18-501，当考虑分泌信号肽时) (Oda et al., J. Biochem126: 694-699, 1999)、氨基酸1-504 (18-504，当分泌时) (Bernd et al., 美国专利6,905,689)和氨基酸1-505 (18-505，当分泌时) (Tomatsu et al., US 2007/0081984)的重组sTNALP，是酶促活性的。而且，保留原始TNALP的氨基酸1-502 (18-502，当分泌时)的重组sTNALP (图3)是酶促活性的(见PCT公布号WO 2008/138131)。这表明氨基酸残基可从天然碱性磷酸酶的C末端去除，而不影响其酶活性。此外，本公开内容还包括任何ALP变体，其包含对野生型ALP的氨基酸残基的至少一个取代、缺失、添加和/或修饰(例如，糖基化、聚乙二醇化、谷胱甘肽化、遍在蛋白化、唾液酸化、乙酰化、酰胺化、封闭、甲酰化、γ羧基谷氨酸羟基化、甲基化、磷酸化、吡咯烷酮羧酸和/或硫酸酯化(sulfatation))。可用于本公开内容的这样的变体，仅需要保留一定程度(例如，超过或约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约100%、约150%、约200%、约300%，或更多)的体外和/或体内活性(与野生型ALP比较)。
包含ALP的融合蛋白
本文描述的方法可利用重组ALP (例如，TNALP)融合蛋白以治疗鉴定的受试者群体。融合蛋白可包含本文公开的ALP或变体的全长或片段并维持生物学活性。不受理论的限制，融合蛋白可包含其它部分，例如任何多肽、脂质、核苷酸或其它部分，以维持或改进，例如，碱性磷酸酶功能。例如，融合蛋白可包含免疫球蛋白的片段可结晶区(Fc)或其它全长或片段，以增加ALP在体内的稳定性或保留时间(例如，具有更长的半衰期)。类似地，白蛋白融合技术可用来改进循环ALP的半衰期(Schulte 2011 Thromb Res. 128:S9-12)。此外，融合蛋白可包含将ALP导向特定组织、器官或细胞的靶向部分。
本公开内容还涵盖包含翻译后修饰的ALP蛋白或其片段的融合蛋白，其通过例如，糖基化、聚乙二醇化、谷胱甘肽化、遍在蛋白化、唾液酸化、乙酰化、酰胺化、封闭、甲酰化、γ羧基谷氨酸羟基化、甲基化、磷酸化、吡咯烷酮羧酸和/或硫酸酯化修饰。
术语“重组蛋白”或“重组多肽”指由遗传操控的核酸编码的蛋白。核酸通常放置在对宿主细胞合适的载体内，例如质粒或病毒。虽然中国仓鼠卵巢(CHO)细胞已被用作表达本文描述的一些重组蛋白的宿主，但本领域普通技术人员将理解，许多其它宿主和表达系统，例如，修饰的CHO细胞包括，但不限于CHO-DG44和CHO/dhfr- (也称为CHO duk-)、HEK293细胞、PerCβ、幼仓鼠肾(BHK)细胞、细菌细胞、体外系统、L细胞、C127细胞、3T3细胞、COS-7细胞等，可被用来生产重组蛋白。“重组可裂解的”蛋白或多肽指可通过宿主细胞酶裂解以生产一种修饰的活性的重组蛋白，例如，使重组蛋白或多肽成为分泌的或可溶性蛋白。
片段可结晶区(Fc)片段
本公开内容的有用的Fc片段包括含有铰链、CH2和CH3结构域的IgG的Fc片段。例如，可使用IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG-3和IgG-4。在本公开内容中，用于具有ALP的融合蛋白的Fc片段的示例性氨基酸序列列于SEQ ID NO: 3中。类似地，用于Fc片段的其它氨基酸序列，例如与SEQ ID NO: 3具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的氨基酸序列，也包括在本公开内容中。
带负电荷的肽
本公开内容的ALP融合蛋白可包含骨靶向多肽，例如，带负电荷的肽。带负电荷的肽可以是选自D10、D8、D11、D12、D13、D14、D15、D16、E10、E8、E11、E12、E13、E14、E15和E16，或本领域已知的任何其它形式的聚天冬氨酸或聚谷氨酸，例如，如在PCT公布号WO 2008/138131中所述。
融合蛋白的构成
本公开内容提供一种治疗鉴定的例如HPP患者的受试者群体和亚群的重组ALP构建体或ALP融合蛋白。这样的重组ALP构建体或融合蛋白可包含可溶性ALP (sALP，例如，sTNALP)同工酶的全长或片段和Fc片段，还伴有或没有带负电荷的肽。这些组分可以从5’末端至3’末端的任何顺序融合在一起，只要生成的融合蛋白维持或改进碱性磷酸酶活性。融合蛋白的示例性形式包括，但不限于，sALP-Fc-D10、sALP-Fc、D10-Fc-sALP、Fc-sALP、D10-sALP-Fc、Fc-sALP-D10、Fc-D10-sALP等。在这些形式中，D10可任选地由任何其它带负电荷的肽或靶向部分取代，而Fc片段可由任何功能IgG或免疫球蛋白取代。
本公开内容提供一种用重组ALP构建体(包括具有或没有Fc融合和/或带负电荷的肽标记的sALP)治疗癫痫的方法。虽然本领域熟知的是带负电荷的肽标记(例如D10)可使ALP靶向骨组织(见，例如，PCT公布号WO 2008/138131)，令人吃惊的是，靶向骨的sALP-Fc-D10构建体(即，阿司弗泰斯阿尔法)很好地发挥提高Akp2 -/- 小鼠存活率并改善癫痫-相关的生理学参数，例如恢复脑中的GABA和丝氨酸水平并降低胱硫醚水平的功能。
间隔区
ALP融合蛋白的不同的组分(例如，片段或部分)可通过独立的接头或间隔区融合在一起。在一些实施方案中，间隔区可以是短的多肽，包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸。在一个实施方案中，在sALP(例如，sTNALP)融合蛋白中的Fc片段用作允许蛋白更有效地折叠的间隔区。这由sTNALP-Fc-D10的表达高于sTNALP-D10的表达的发现(PCT公布号WO2008/138131的实施例2)所证实。虽然不受理论的限制，Fc片段可用来缓解由D10序列在sALP序列的C末端加入的高负电荷的存在引起的斥力。其它有用的间隔区包括，但不限于，能够缓解由加入到sALP序列中的高负电荷序列(例如，聚-天冬氨酸例如D10)的存在引起的斥力的多肽。
间隔区可被设计以例如缓解可能阻碍来自两个sALP单体的两个sALP结构域的相互作用的空间位阻。此外，如果需要，间隔区可被引入sALP部分和Fc部分之间，例如，如在图2和3中所示的sTNALP-Fc-D10构建体具有在sTNALP之间的间隔区。Fc和D10包含两个氨基酸(分别为LK和DI)。
靶向骨的sALP (例如，sTNALP-Fc-D10)还可任选地包含1)聚天冬氨酸或聚谷氨酸下游；和/或2)聚天冬氨酸和Fc片段之间；和/或3)间隔区例如Fc片段和sALP片段之间的一个或多个另外的氨基酸。例如，当用来生产靶向骨的缀合物的克隆策略在这些位置引入外源性氨基酸时，即是这种情况。然而，应该选择外源性氨基酸，以便不提供另外的GPI锚定信号。设计的由宿主细胞的转酰氨基酶裂解的序列的可能性可如Ikezawa (Ikezawa 2002Biol Pharm. Bull. 25(4):409-417)所述进行预测。
适合于sALP表达或其融合蛋白的条件可如由本领域技术人员应该认识的那样进行优化。这样的条件包括，例如，能够生产sALP或其融合蛋白的培养基的使用。这样的培养基可用以下制备：缓冲剂，其包含，例如，碳酸氢盐和/或HEPES；离子，包括，例如，氯离子、磷酸根、钙、钠、钾和/或镁；铁；碳源，包括，例如，单糖和/或氨基酸；脂质、核苷酸、维生素和/或生长因子，包括，例如，胰岛素。可以使用可市售获得的培养基像αMEM、DMEM、Ham's-F12和IMDM (补充有2-4 mM L-谷氨酰胺和5%胎牛血清)。可以使用可市售获得的无动物蛋白的培养基像，例如，Hyclone™ SFM4CHO、Sigma CHO DHFR-、Cambrex POWER™ CHO CD(补充有2-4 mM L谷氨酰胺)。理想地制备没有胸苷、次黄嘌呤和L-甘氨酸的这些培养基，以维持允许稳定的蛋白产物表达的选择性压力。
术语“骨组织”在本文被用来指由成骨细胞合成的组织，其由主要包含胶原蛋白的有机基质构成，并经羟磷灰石晶体沉积矿化。
本公开内容的骨递送缀合物包含的融合蛋白可用于通过提供有效量的融合蛋白至骨，来治疗性治疗骨缺陷的病症。融合蛋白以在任何标准的药学上可接受的载体中的药用组合物的形式提供，并以任何标准程序，例如通过静脉内注射给予。
如本文所用的术语“HPP表型”一般意思是(如果没有另外指明)指具有HPP的受试者的任何特征性表型，例如，但不限于，任何与骨或牙齿矿化缺陷相关的表型。除了骨矿化缺陷，HPP表型还可包括“HPP症状”，包括，但不限于，例如，佝偻病(在生长板软骨中的缺陷)、软骨病、升高的血和/或尿水平的无机PPi、PEA或PLP；癫痫、骨痛、在关节中导致软骨钙质沉着病和过早死亡的焦磷酸钙二水合物结晶沉积(CPPD)。不受这样的限制，HPP表型可通过伴有长骨长度(例如，股骨、胫骨、肱骨、桡骨、尺骨)的降低、总骨平均密度的降低和在骨例如，股骨、胫骨、肋骨和跖骨和指骨中的骨矿化的降低、牙齿矿化的降低、乳牙的过早缺失(例如，牙骨质的发育不全、发育不良或发育异常)的生长迟缓来证实。不受这样的限制，骨矿化缺陷的纠正或预防可通过一个或多个以下现象观察到：长骨长度的增加、骨和/或牙齿矿化的增加、弓形腿的纠正、骨痛的减轻和关节中CPPD结晶沉积的减少。
“非-HPP受试者”意欲指任何以下受试者：1) 尚未被诊断患有HPP且没有HPP表型；2) 已确诊没有HPP；或3) 没有异常的碱性磷酸酶活性。
“治疗”指对于患者或受试者的治疗剂的给予或医学程序的执行，用于预防(防止)或者在其中患者患病的情况下治愈或减轻疾患或疾病的症状。与异常的ALP活性相关的疾病、病症或症状的预防包括在治疗的范围内。本文描述的或通过本文描述的方法鉴定的方法和组合物可用作治疗有效量的治疗方案的一部分。“治疗有效量”是足以减轻、预防或缓解与医学病症相关的症状的量。
其它抗癫痫药
常规抗癫痫药可阻断钠通道或提高GABA功能。除了电压-门控钠通道和GABA系统的组分外，其它靶标包括GABAA受体、GAT-1 GABA转运蛋白和GABA转氨酶。另外的靶标包括电压-门控钙通道、SV2A和α2δ。示例性的抗癫痫药包括，例如，醛(例如，仲醛)、芳族烯丙基醇(例如，Stiripentol)、巴比妥类(例如，苯巴比妥、甲苯巴比妥和巴比沙隆)、苯并二氮杂䓬(例如，氯巴占、氯硝西泮、氯氮䓬、安定、咪达唑仑、劳拉西泮、硝基安定、替马西泮和尼美西泮)、溴化物(例如，溴化钾)、氨基甲酸酯(例如，非尔氨酯)、甲酰胺(例如，卡马西平、奥卡西平和醋酸艾司利卡西平)、脂肪酸(例如，丙戊酸盐、氨己烯酸、普罗加胺和噻加宾)、果糖衍生物(例如，托吡酯)、GABA类似物(例如，加巴喷丁和普加巴林)、乙内酰脲(例如，乙苯妥英、苯妥英、美苯妥英和磷苯妥英)、噁唑烷二酮(例如，甲乙双酮、三甲双酮和依沙双酮)、丙酸盐(例如，贝克拉胺)、嘧啶二酮(例如，扑米酮)、吡咯啉(例如，布立西坦、左乙拉西坦，和塞曲西坦)、琥珀酰亚胺(例如，乙琥胺、苯琥胺和甲琥胺)、磺酰胺(例如，乙酰唑胺、舒噻美、醋甲唑胺和唑尼沙胺)、三嗪类(例如，拉莫三嗪)、脲(例如，苯丁酰脲和苯乙酰脲)、丙戊酰胺类(丙戊酸盐的酰胺衍生物) (例如，丙戊酰胺和戊诺酰胺)，和其它(例如，吡仑帕奈)。
至少一种常规抗癫痫药可与一种或多种本文描述的重组ALP一起共同给予受试者，以治疗或减轻癫痫症状。特别是，这样的组合疗法可被用来治疗罹患维生素B6抗性癫痫的受试者，且它们可被用来治疗如本文描述的鉴定的群体，这些受试者显示减少的ALP活性而不管他们是否具有其它HPP类症状。这样的常规抗癫痫药可与重组ALP在相同的时间(持续一个预定的时间段)，或在ALP给予之前或之后给予。
给药途径
本文描述的治疗剂，例如，重组ALP，可例如经口服、经鼻、静脉内、肌内、皮下、舌下、鞘内或皮内给予。给药途径可取决于多个因素，例如环境和治疗目标。
举例来说，本公开内容的药用组合物可呈现为液体、溶液、悬浮液、丸剂、胶囊、片剂、囊形片、散剂、凝胶剂、软膏剂、霜剂、喷雾剂(nebulae)、尘雾剂(mist)、雾化蒸汽、气溶胶或phytosome的形式。在合适时，如本文公开的膳食补充剂可包含药学上可接受的添加剂例如助悬剂、乳化剂、非水性媒介、防腐剂、缓冲盐水、调味剂、着色剂和甜味剂。口服给予的制剂也可适当地配制以给出控制释放的活性成分。
剂量
特定的剂量将取决于许多因素，包括给药模式和受试者的年龄和体重。通常地，包含在单一剂量内靶向骨的或未标记的ALP的量是有效地预防、延缓或纠正癫痫，而不诱导显著毒性的量。通常地，依据本公开内容的sALPs或其融合蛋白可以范围从0.001-500 mg/kg/天，并且在一个更特定的实施方案中，以约0.1至约100 mg/kg/天，并且在一个更特定的实施方案中，以约0.2至约20 mg/kg/天的剂量给予受试者。异速生长缩放方法(Mahmood et al.2003 Clin. Pharmacol., 43(7):692-7和Mahmood 2009 J. Pharma. Sci., 98(10):3850-3861)可用来将剂量从小鼠外推到人。剂量可由临床医生根据常规因素例如疾病的严重程度和得自患者的不同的参数改变。
sALP或其融合蛋白的治疗有效量也可直接测量。有效量可每日或每周或其部分给予。通常地，本文公开的药用组合物可以从约0.001 mg至最高约500 mg每kg体重每天(例如，0.05、0.01、0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、0.8、1 mg、2 mg、3 mg、4mg、5 mg、8 mg、10 mg、15mg、16 mg、20 mg、30 mg、50 mg、100 mg或250 mg)的量给予。剂量可以单剂量或者多个剂量方案提供。例如，在一些实施方案中，sALP或其融合蛋白的有效量是范围从约0.1至约100mg/kg/天，从约0.2 mg至约20 mg每天，从约1 mg至约5 mg每天，从约1 mg至约6 mg每天，从约1 mg至约7 mg每天，从约1 mg至约8 mg每天，从约1 mg至约10 mg每天，从约0.7 mg至约210 mg每周，从约1.4 mg至约140 mg每周，从约0.3 mg至约300 mg每3天，从约0.4 mg至约40 mg每隔一天，和从约2 mg至约20 mg每隔一天的剂量。
这些仅仅是指导原则，因为实际剂量必须小心地选择并由主治医师基于对每个患者的独特的临床因素或通过营养师用滴定法测量。最适每日剂量将通过本领域已知的方法测定并将受到因素诸如如上指明的患者的年龄和其它临床相关因素的影响。此外，患者可服用用于其它疾病或病症的药物。其它药物可在sALP或其融合蛋白被给予患者的时间期内继续，但在这样的情况下用低剂量开始以确定是否经历不利副作用是特别可取的。
载体/媒介
包含sALP或其融合蛋白的制剂可与药学上可接受的无菌含水或非-含水溶剂、悬浮液或乳液组合提供给患者。非含水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油、鱼油，和可注射有机酯。含水载体包括水、水醇溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲的医学肠胃外媒介包括氯化钠溶液、林格氏(Ringer's)葡萄糖溶液、葡萄糖加氯化钠溶液、包含乳糖的林格氏溶液，或固定油。静脉内媒介可包括流体和营养素补充剂、电解质补充剂，例如基于林格氏(Ringer's)葡萄糖的那些，等等。
本文描述的药用组合物可以控释系统递送。在一个实施方案中，可使用包括聚乳酸、聚原酸酯、交联两亲嵌段共聚物和水凝胶、聚羟基丁酸和聚二氢吡喃的聚合物材料(也见Smolen和Ball, Controlled Drug Bioavailability, Drug product design and performance, 1984, John Wiley & Sons；Ranade和Hollinger, Drug Delivery Systems，pharmacology and toxicology series, 2003, 第2版, CRRC Press)，在另一个实施方案中，可使用泵(Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574)。
本公开内容的治疗剂可以呈现为采用适当的赋形剂溶液(例如，蔗糖)作为稀释剂的冻干粉末的形式。
而且，依照本公开内容的核苷酸片段或蛋白可以许多方式引入个体。例如，成骨细胞可从受累个体分离，用本文公开的核苷酸构建体转化并以许多方式重新引入受累个体，包括静脉内注射。或者，核苷酸构建体可例如通过注射直接给予受累个体。核苷酸构建体可也通过媒介例如脂质体递送，其可被设计以靶向特定细胞类型，并经工程改造以通过不同的途径给予。
本公开内容的融合蛋白也可有利地通过基因疗法递送。有用的基因治疗方法包括在PCT公布号WO 2006/060641、美国专利号US 7,179,903和PCT公布号WO 2001/036620中描述的那些，采用例如用于治疗性蛋白并靶向作为蛋白产生细胞的肝细胞的腺病毒载体。
“基因递送载体”被定义为可携带插入到宿主细胞中的多核苷酸的任何分子。基因递送载体的例子有脂质体、生物相容性聚合物，包括天然聚合物和合成聚合物；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人工病毒包膜；金属颗粒；以及本领域通常使用的细菌，或病毒，例如杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒、噬菌体、粘粒、质粒、真菌载体和其它重组载体，它们已被描述用于在各种真核和原核宿主中的表达，并且可用于基因疗法以及用于简单的蛋白表达。如本文所用的"基因递送"、"基因转移"等是指将外源性多核苷酸(有时称为"转基因")引入宿主细胞，而不管所用的引入方法的术语。这样的方法包括各种技术，例如，载体介导的基因转移(例如，病毒感染/转染，或各种其它的基于蛋白或基于脂质的基因递送复合体)以及促进递送"裸"多核苷酸的技术(例如电传孔、"基因枪"递送和用来引入多核苷酸的其它各种技术)。
引入的多核苷酸可稳定地或短暂地维持在宿主细胞中。稳定的维持通常需要引入的多核苷酸包含与宿主细胞相容的复制起点或者整合到宿主细胞的复制子例如染色体外复制子(例如，质粒)或核或线粒体染色体。许多载体能够介导基因转移至哺乳动物细胞。
“病毒载体”被定义为重组产生的病毒或包含要递送至宿主细胞的多核苷酸的病毒颗粒。病毒载体的例子包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体(例如，见PCT公布号WO 2006/002203)、甲病毒载体等。
在其中基因转移由DNA病毒载体，例如腺病毒(Ad)或腺伴随病毒(MV)介导的方面，载体构建体指包含病毒基因组或其部分，和转基因的多核苷酸。Ad是一组相对清楚地表征的同源病毒，包括超过50个血清型(WO 95/27071)。Ad容易生长且不需要整合到宿主细胞基因组中。还已经构建了重组Ad衍生的载体，特别是减少野生型病毒的重组和传代的潜在性的那些(WO 95/00655和WO 95/11984)。包含启动子和多核苷酸可操作地连接于其中的克隆位点二者的载体是本领域已知的。这样的载体能够在体外或体内转录RNA。为优化表达和/或体外转录，可能有必要除去、添加或改变克隆的5'和/或3'未翻译部分，以消除额外的、潜在的不适当的可选翻译起始密码子或可在转录或者翻译水平上干扰或减少表达的其它序列。
本公开内容的sALP或其融合蛋白也可与至少一种其它活性成分组合使用，以纠正骨矿化缺陷或HPP的另一个有害的症状，例如癫痫。它也可以与至少一种其它活性成分组合使用以纠正牙骨质缺损。
药剂盒
本公开内容还涉及一种鉴定显示减少的ALP活性的受试者的群体和/或治疗鉴定的群体的药剂盒。所述药剂盒，例如，可鉴定未显示骨矿化缺陷的受试者，并可包括，例如，治疗癫痫(例如，通过重组ALP，例如重组TNALP治疗的B6抗性癫痫)的治疗剂和制剂。药剂盒还可包括给予组合物或载体至受试者以纠正或预防与减少的ALP活性相关的疾病、病症或症状，例如，HPP和HPP相关症状的使用说明书。
这样的药剂盒还可包含至少一种能够预防或纠正受试者的表型的其它活性剂(例如其它抗癫痫药)。
此外，根据本公开内容的隔室分开的药剂盒包括其中试剂包含在分开的容器中的任何药剂盒。这样的容器包括小玻璃容器、塑料容器或塑料或纸的条带。这样的容器允许试剂从一个隔室有效转移至另一个隔室中，以致样品和试剂不会交叉污染且每个容器的药剂或溶液可以定量方式从一个隔室加入另一个隔室中。
本文引用的所有参考文献通过引用以其整体及为了所有的目的结合到本文中，如同各个独立的出版物或专利或专利申请特别地和单独地指明为了所有的目的通过引用以其整体结合到本文中的程度一样。在通过引用结合的出版物和专利或专利申请与在本说明书中包含的公开内容有抵触时，意欲使本说明书代替和/或优先于任何此类矛盾的材料。
表示用于本说明书和权利要求书的成分、反应条件等的量的所有数字应被理解为在所有的情况下由术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，在本说明书和所附权利要求书中提出的数字参数是近似的，其取决于由本公开内容寻求获得的所需性质而可能会有所不同。至少，且不是试图限制等同原则应用到权利要求书的范围，每个数字参数应依据有效数字的数量和普通的舍入方法来解释。
实施例
实施例1 重组sTNALP-FcD10的表达和纯化
为了促进重组TNALP的表达和纯化，指定TNALP中的GPI-锚钩附着的疏水性C-末端序列被消除以使其为可溶性分泌的酶(Di Mauro et al. 2002 Journal of Bone and Mineral Research 17:1383-1391)。TNALP胞外域的编码序列还用人IgG1(γ1)的Fc区扩展(Swiss-Prot P01857)。这允许重组酶在蛋白A层析上的快速纯化并令人吃惊地增加其表达。此外，为使重组TNALP靶向骨组织，十-天冬氨酸(D10)序列附着于Fc区的C-末端。这种嵌合形式的TNALP，称为sTNALP-FcD10，当在pH 9.8采用人工底物对-硝基苯基磷酸酯测定时和当在pH7.4采用无机焦磷酸(PPi)作为生理学底物测定时均保留全酶活性。当呈现天然存在形式的TNALP时，N-末端信号肽在跨粗面内质网的蛋白的共同翻译易位期间被裂解。其设计和结构被图示地说明于图1中。融合蛋白(包括信号肽)的氨基酸序列显示于图2中。分泌的融合蛋白的氨基酸序列(即无信号肽)显示于图3中。对于示例性sTNALP-FcD10融合蛋白的表达过程和特征的全面描述，见例如PCT公布号WO 2008/138131。
实施例2 “未受影响的” HPP小鼠亚群
Akp2 -/-小鼠一般显示类似于人HPP患者的生理学表现。例如，这样的小鼠可以1) 具有很少(例如，少于1%)的ALP血浆活性；2) 在出生时似乎正常，但在6或11天龄发展为明显的骨骼疾病(取决于表型)；3) 具有PPi、PLP和PEA的至少一种的升高的血浆水平；4) 具有进行性佝偻病的变化、骨量减少，且容易骨折；5) 具有癫痫性发作和呼吸暂停；6) 具有差的进食和/或体重增加不足；和/或7) 到21天龄死亡。然而，Akp2 -/- 小鼠可具有不同程度的表型表达。例如，在Waymire 1995，没有一只Akp2 -/- 小鼠具有矿化缺陷。此外，B6补剂(呈吡哆醛或PL，但非PN的形式)也补救癫痫表型并促进约67%的具有C57BL/6、129/Sv (B6129)混合遗传背景的Akp2 -/- 小鼠的存活，虽然补救的动物随后发展为有缺陷的生齿。剩余的33%对PL注射响应不佳或是无响应的。然而，所有具有先天129/Sv遗传背景的Akp2 -/- 小鼠对PL注射响应不佳或是无响应的。
本公开内容提供具有不同程度的矿化表型，但具有类似的缩短寿命的一组Akp2 -/- 小鼠(具有与Waymire 1995相同的混合遗传背景，但来自不同的传代)。有趣的是，在无B6补剂的情况下，重组TNALP补救所有的KO小鼠并恢复GABA、丝氨酸和胱硫醚至WT水平。
与野生型同窝出生仔鼠比较，不同亚群的Akp2 -/- 小鼠具有重度、中度、轻度或甚至未受影响的表型。图4显示Akp2 -/- 小鼠的不同的矿化缺陷。图5显示，具有相同基因型的不同小鼠群落存在表型严重性的广泛分布。在每个群落中约30%的敲除小鼠显示“未受影响的”表型(例如，未有明显的骨矿化缺陷，如在图4中所示，未有明显的体重缺失，如在图6中所示，和未有明显的骨长度缺陷，如在图8中所示)。令人惊奇的是，具有“未受影响的” (矿化)表型的敲除小鼠仍具有与具有更严重的表型的其它敲除小鼠相当的明显减少的寿命(图9；显示几乎所有敲除小鼠(严重的和未受影响的小鼠)在出生后大约25天死亡)。
对用重组TNALP预防性治疗和退出重组TNALP对在Akp2 -/- 小鼠脑中的维生素B6跨膜转运的影响进行了分析。在预防性研究中，对来自HPP-M2h_F4喂饲群落的具有C57BL/6、129/Sv (B6129)混合背景的Akp2 -/- 小鼠用8.2 mg/kg (即，8.2 mpk)重组TNALP或者媒介皮下注射，在出生时开始，每日1次，持续9天。相同背景的野生型小鼠未进行治疗且用作参考对照。在撤出研究中，相同的混合背景和F4代Akp2 -/- 小鼠从出生时用类似剂量的重组TNALP每日治疗，持续35天，随后12天用媒介(撤出)或者继续用重组TNALP治疗。对照包括未治疗的野生型小鼠和用重组TNALP治疗前35天，然后转为用媒介处理另外12天的小鼠二者。所有小鼠具有随意获得的经认证的、但不补充吡哆醇的商业实验室啮齿动物饮食(CharlesRiver Rodent Diet 5075-US)。在尸检时，收集脑，在液氮中冷冻并于-80˚C贮存。
用sTNALP-FcD10连续每日治疗，Akp2 -/- 小鼠(包括具有“未受影响的”表型的那些)具有与未治疗小鼠比较的更长得多的寿命。如在图10-12中右小图所示，这样的“未受影响的”敲除小鼠至少存活至第48天(此时全部小鼠终止)。
“未受影响的” Akp2 -/-小鼠亚群的这一发现与先前报告的具有维生素B6-抗性癫痫但没有骨畸形的HPP患者亚群一致(例如，见de Roo et al., 2014 Molecular Genetics and Metabolism 111: 404-407和Baumgartner-Sigl et al., 2007 Bone 40: 1655-1661)。明显地，对这样的HPP患者亚群有错过及时和有效的诊断的风险，如果医护人员限制他们的HPP诊断方法至骨畸形或矿化缺陷的传统检测的话。具有正常骨矿化的患者不应该被忽视具有其它HPP-相关症状的可能性。如果患者具有癫痫和/或异常的ALP蛋白水平/功能(例如，具有增加水平的ALP底物，例如PPi、PLP和PEA)，则应该进行测定以验证这样的患者属于“未受影响的”亚群以及是否需要用ALP补剂治疗。一般来说，如果患者患有癫痫，特别是维生素B6-抗性癫痫，应额外实施以测试患者是否具有有缺陷的ALP功能或增加水平的ALP底物，这样来确定是否需要ALP补剂治疗。
实施例3 Akp2 -/-小鼠具有减少的脑γ-氨基丁酸(GABA)，其可通过每日重组sTNALP-FcD10治疗纠正
碱性磷酸酶，例如TNALP、PLALP、GALP和IALP，对它们的底物磷酸乙醇胺(PEA)、无机焦磷酸(PPi)和吡多醛5’-磷酸(PLP)是有生理活性的。减少的碱性磷酸酶活性，例如在TNALP敲除或突变的受试者中，导致细胞外PLP和PPi的积聚。系统PLP的积聚导致细胞内PLP的伴随的减少，因为PLP，在其磷酸化状态时，不能越过血浆膜进入细胞。PLP是维生素B6的催化活性形式并用作超过140个不同的、涉及胺和氨基酸代谢的酶反应的辅因子(Percudani,R. & Peracchi, A., EMBO Rep., 4:850 4, 2003)。例如，低的细胞内PLP可导致减少的CNS GABA，其可进一步导致癫痫。此外，高浓度的PPi可导致佝偻病(软骨病)、颅缝早闭、呼吸受损、肾钙质沉着症，或肌无力。在严重的情况下，这些并发症可导致死亡。异常的胺和氨基酸代谢，由于减低的碱性磷酸酶活性，促进了HPP的发病机理和表型特征。
为测量脑氨基酸浓度，将从-80˚C贮存的小鼠全脑在每毫克组织2.5 µL磷酸盐缓冲盐水中匀化(pH 7.4，加蛋白酶抑制剂合剂，Roche Diagnostics Cat # 05892970001)。将组织悬浮液超声处理15秒，并于4˚C以21,000 x g经3次连续的离心15 min以除去碎屑来澄清。于-80˚C冷冻上清液提取物直至分析。总蛋白采用Coomassie Plus Bradford微量测定板分析(Thermo Scientific Cat # PI23236)测定。
通过Biochrom 30+ (Biochrom Ltd., UK)氨基酸分析，依照锂高性能程序，采用L-正氨酸(NORL) (Sigma Cat# N8513)作为内部标准(ISTD)对氨基酸浓度进行定量。通过1:4稀释至含有最终浓度分别为250 µmol/L和2.5%的NORL-ISTD和5-磺基水杨酸二水合物(SSA) (Sigma Cat# S7422)的主混合物，使脑提取物脱蛋白质。于4˚C，通过以10,000 x g两次连续离心除去蛋白沉淀。通过加入酸性、中性和碱性氨基酸标准品(Sigma Cat# A6407和A6282)以及NORL-ISTD至最终体积250 µmol/L (含2.5% SSA)制备标准混合物。将40 µL标准混合物和脱蛋白质的样品注入分析仪，如在“Accelerated Analysis of Amino Acidsin Physiological Samples”, Biochrom Application Note: 90 (依照Biochrom Ltd.(Cambridge, UK)生产商的指示)中所述分离氨基酸。氨基酸浓度(µmol/L)采用EZChrom软件测定。最终浓度表示为µmol氨基酸/克脑湿重。
如在图10的左小图中所示，Akp2 -/-小鼠显示出相对于野生型小鼠的降低的GABA浓度，其通过sTNALP-FcD10的连续每日治疗得到纠正。图10的右小图显示通过至少持续至第48天的这样的连续治疗的GABA恢复，明显超过敲除小鼠的第25天寿命。然而，在第35天后中止sTNALP-FcD10治疗，Akp2 -/-小鼠的GABA浓度再次减少。
为进一步研究sTNALP-FcD10 (SEQ ID NO: 1)的功能，对脑胱硫醚和丝氨酸(二者均已知由PLP调节其生产)浓度进行测定并在Akp2 -/-小鼠和野生型小鼠之间进行比较。如分别在图11和12中所示，与野生型小鼠的那些比较，Akp2 -/-小鼠明显减少脑丝氨酸水平，但明显升高脑胱硫醚水平。然而，在那些敲除小鼠中，用sTNALP-FcD10连续治疗升高丝氨酸水平并减少胱硫醚水平至与野生型小鼠相当的水平。类似地，在第35天后中止sTNALP-FcD10治疗逆转由sTNALP-FcD10所致的纠正(见图11和12的右小图)。
每日sTNALP-FcD10治疗改进体内碱性磷酸酶功能和增加脑GABA浓度。这样的治疗再平衡Akp2 -/-小鼠中的异常胺和氨基酸代谢并表明对癫痫和癫痫-相关表型的这样的治疗的功效。
有趣的是，骨-靶标信号D10在测试的构建体中未阻止其改进敲除小鼠存活和改善癫痫-相关生理学参数，例如在脑中中恢复GABA和丝氨酸水平和降低胱硫醚水平的功能。
实施例4 临床试验改进
临床试验测试hsTNALP-FcD10 (阿司弗泰斯阿尔法, SEQ ID NO: 1)治疗是否改进HPP患者的癫痫。具有对维生素B6有响应的癫痫史的所有患者受到HPP非常严重的影响，且他们中的两个在用hsTNALP-FcD10开始治疗后死亡。患者之一在出生时即患有癫痫并在hsTNALP-FcD10治疗数年后死亡。维生素B6被供应给该患者，但不足以预防癫痫发作。然后给予氯硝西泮，但该患者在经历癫痫伴有脑水肿、发热、差别的离子失衡和潜在的心肌病后死亡。
在用hsTNALP-FcD10开始治疗之前接受B6预防方案的具有对B6有响应的癫痫史的6个患者在hsTNALP-FcD10治疗期间未经历癫痫。另外一个患者，其可能具有对B6有响应的癫痫史并在hsTNALP-FcD10治疗开始后立即中止用B6预防，经历了癫痫，但当B6辅助-预防疗法恢复时，癫痫问题得到解决。另一个具有对B6有响应的癫痫史的患者，其维持B6预防结合用hsTNALP-FcD10治疗，在共同-治疗1年后中止B6预防并仅维持hsTNALP-FcD10治疗。该患者在中止B6预防后未有癫痫经历。
初步临床数据显示hsTNALP-FcD10治疗HPP患者的癫痫。临床数据显示用hsTNALP-FcD10的单一疗法是有效的，而维生素B6补剂不是必要的，至少在共同给予两种分子一定长度的时间(例如，在一个患者中1年)后。hsTNALP-FcD10 B6-中止后的治疗作用得到公认，因为对B6-有响应的癫痫通常不能由B6补充完全预防(例如，仅一部分Akp2 -/-小鼠可被维生素B6补剂拯救)。然而，如果没有共同-给予(B6和hsTNALP-FcD10)步骤(例如，未共同-给予1个患者)或(很可能)如果共同-给予期未持续足够长的时间，hsTNALP-FcD10单独治疗不足以继续预防对B6-有响应的癫痫的复发。
在回顾性自然史研究和两个用阿司弗泰斯阿尔法治疗的II期临床试验中评价HPP患者。收集对于来自不同试验(对他们的鸡胸、呼吸受损和/或维生素B6-有响应的癫痫史配对)的类似患者(例如，患有围产期或婴儿HPP的严重受影响的婴儿和幼儿)，用或不用阿司弗泰斯阿尔法治疗的临床数据并进行比较。四十八(48)个患者从自然史研究鉴定和37个患者从阿司弗泰斯阿尔法治疗研究鉴定，人口统计资料如在下表1中所示。
表1 来自临床研究的患者的人口统计资料
NA：不适用。*：在一个试验中未收集。
对这些患者在研究开始时(即，在对来自II期研究的患者进行阿司弗泰斯阿尔法治疗之前)的严重HPP的体征/症状进行记录并总结(表2)。选择来自自然史研究和来自II期治疗研究(表2中“治疗的”，与表1一致)的具有类似严重HPP体征/症状的百分率的患者。在自然史研究的48个患者中的10个和II期治疗研究的37个患者中的13个患者患有对维生素B6-有响应的癫痫。
表2. 具有严重的HPP体征的研究群体的总结
比较从自然史研究和从II期阿司弗泰斯阿尔法治疗选择的患者的存活率并概述于表3中。在自然史研究中的大多数患者(约58%)不能存活一年，而他们的存活率继续下降并达到一年至三年半之间的约27%的底线。然而，大多数用阿司弗泰斯阿尔法治疗的患者(约89%)存活甚至超过5年。
表3. 从不同的研究选择的不同年龄患者的存活率
在达到1岁后，分析来自不同研究的存活患者的严重HPP的体征。如在表4中所示，来自自然史研究组48个患者中，具有鸡胸的患者的33% (13/40)存活，而罹患呼吸受损的患者的18% (7/40)存活。然而，没有一个患有对维生素B6-有响应的癫痫的患者(0/10)存活。相反，在II期治疗组中，90%的具有鸡胸的患者(27/30)存活和89%的具有呼吸受损的患者(24/27)存活。特别地，85%具有对维生素B6-有响应的癫痫的患者(11/13)存活。因此，阿司弗泰斯阿尔法治疗极大地提高了对维生素B6-有响应的癫痫患者的存活率，而维生素B6单独(对那些在自然史研究组中的患者)很难通过抑制癫痫提高存活。
表4. 在治疗后具有严重HPP的体征的研究群体的总结
当患者存活作为分析的主要参数时，无侵入性人工呼吸的存活被设置为次级分析参数。类似地，在表5中，在自然史研究中，只有31%的无侵入性人工呼吸患者在1岁时存活，而他们的无侵入性人工呼吸的存活率继续降低并达到一年至三年半之间的约25%的底线。然而，大多数用阿司弗泰斯阿尔法治疗的患者(约83%)存活甚至超过5年。
表5. 患者分年龄的无侵入性人工呼吸的存活率
阿司弗泰斯阿尔法治疗受HPP严重影响的婴儿显著地改善他们的骨骼矿化，这平均发生在早期3个月时，继续，并且一般持续超过3年。患者显示改善的粗大运动技能、精细运动技能和认知能力。
总之，与历史对照比较，阿司弗泰斯阿尔法治疗帮助具有围产期和婴儿HPP (其处于死亡的高风险中)的严重受影响的患者改进总存活率(89%对比27%，P<0.0001)和无侵入性人工呼吸的存活率。
实施例5 治疗小鼠和人的癫痫
具有轻微、未受影响的，或不可检测的矿化缺陷的Akp2 -/-小鼠和野生型同窝出生仔鼠用可溶性重组ALP构建体(例如，sTNALP、sTNALP-Fc、sTNALP-FcD10或其它重组同工酶构建体)治疗。通过摄像机或其它生理学方法记录治疗前后的癫痫。测试脑GABA、丝氨酸和胱硫醚(也可来自血清或尿源)的浓度并与已知的方法比较。重组ALP的治疗效果通过发现治疗Akp2 -/-小鼠后的癫痫减轻和/或GABA/丝氨酸浓度的恢复来显现。测试不同的剂量方案并进行比较。也测试维生素B6单独或组合疗法的任何潜在的协同作用。
类似地，具有轻微、未受影响的，或不可检测的矿化缺陷的HPP患者和健康志愿者用在本公开内容中公开的可溶性重组ALP构建体治疗。报告治疗前后的癫痫并进行比较。测量生理学参数，例如血浆和/或尿胱硫醚(或GABA、丝氨酸和/或胱硫醚的脑浓度)并记录。重组ALP的治疗效果通过治疗后发现的癫痫减轻和/或血浆/尿胱硫醚浓度恢复来显现。也测试维生素B6单独或组合疗法的任何潜在的协同作用。测试共同-疗法的不同的时间长度以优化共同-疗法过程及随后的ALP补剂单独疗法。
也通过基因筛查或其它已知的方法鉴定一个新的先前未诊断为受HPP影响的、具有缺陷的碱性磷酸酶蛋白水平和/或功能的患者亚群。这样的患者亚群具有的一个特征性症状是癫痫，对维生素B6-有响应或者无响应。在这样的亚群中的患者然后用本文公开的重组ALP构建体(伴有或没有B6补剂)治疗。如果B6补剂被共同给予，它将在一定时间(由临床医师或药物给予者依照每个患者的各别情况确定)后中止，接着用ALP单一疗法。
实施例6 通过监测患者的生物标记使癫痫治疗效果最大化
患有癫痫的患者的一个特定亚群通过他们的特征性的高于正常水平的碱性磷酸酶底物(例如，PPi、PEA和PLP)来鉴定。那些底物的此类丰富的DNA、RNA和/或蛋白水平通过本领域已知的常规方法，包括，例如，定量PCR、DNA印迹、RNA印迹、PAGE、SDS-PAGE、蛋白质印迹等检测。在鉴定这个特定的患者亚群后，将给予本文公开的重组ALP构建体以减轻癫痫症状。任选地，一种或多种其它抗癫痫药，例如维生素B6类维生素，可共同给予至少一段时间。对于这样的单一或与ALP替代的组合疗法，患者在治疗之前、期间和之后须对他们的内源性生物标记进行密切的监测。例如，当维生素B6被共同给予时，临床医师或其他给药师将监测接受者患者的生物标记水平，优选地基于每个患者的各别情况，确定共同给予维生素B6的时间点，用于B6和/或重组ALP的剂量方案，共同-给予的时长，和中止维生素B6的共同给予的时间点等。
适合于本文监测的生物标记至少包括，碱性磷酸酶底物(PPi、PEA，和/或PLP)，或其它受这些碱性磷酸酶底物影响的生物标记(例如，GABA、胱硫醚、丝氨酸、多巴胺、血清素、组胺、D-丝氨酸和硫化氢等)。这样的生物标记可采用患者血清或尿或通过本领域已知的其它标准测试方法测试。
实施例7 维生素B6未能治疗Akp2 -/- 小鼠的癫痫
维生素B6治疗是标准癫痫治疗。然而，许多HPP患者和Akp2 -/- 小鼠具有B6-抗性癫痫，其不能通过维生素B6给予得到纠正并可导致死亡。进行进一步的研究以证实维生素B6对Akp2 -/- 小鼠的作用的缺乏。在该研究中，Akp2 -/- 小鼠用325 ppm膳食维生素B6 (吡哆醇)补剂治疗。然而，在具有正常骨矿化或者具有严重的矿化缺陷的Akp2 -/- 小鼠中仍观察到癫痫。具有任一种矿化表型的敲除小鼠没有一只存活超过25天(图13)。
为证实在Akp2 -/- 小鼠中的生物标记分布不能被吡哆醇补剂纠正，脑氨基酸浓度采用如在实施例3中公开的相同的方法测量，除了S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC) (SigmaCat# A2636) (代替L-正亮氨酸(NORL))被用作内部标准(ISTD)，并且分析最终15 µL(而不是40 µL)的标准混合物和脱蛋白质样品。如在图14中所示，接受食物吡哆醇补剂的17-19天龄的野生型小鼠在脑中具有比较高的GABA浓度和低的胱硫醚浓度，而具有严重的矿化缺陷(即，典型维生素B6-抗性HPP组，具有在阴影区域中的生物标记分布)的Akp2 -/- 小鼠在脑中具有比较低的GABA浓度和高的胱硫醚浓度(在阴影区域中显示)，而不管325 ppm膳食吡哆醇补剂。对于具有正常骨矿化的Akp2 -/- 小鼠，一些具有被吡哆醇补剂纠正的GABA和胱硫醚浓度，而也存在具有那些未被吡哆醇补剂纠正的生物标记的亚组(在阴影区域中显示)。
总之，Akp2 -/- 小鼠亚组被证实具有正常骨矿化，但致命的维生素B6-抗性癫痫。因此，具有ALP缺陷和癫痫但骨矿化正常的类似亚群的患者也存在(无论是诊断为HPP患者或未被诊断)。一个新的诊断方案(基于ALP功能，例如PLP/PPi/PEA水平或如本文公开的生物标记)因而被提议以鉴定这样的患者亚群，以及时有效地治疗他们的症状。此外，应给予ALP(例如阿司弗泰斯阿尔法)补充(单独或与维生素B6组合)，而不是维生素B6单独，以更好治疗这个亚群的患者。
本文公开的许多修改和变动可在不偏离其精神或范围的情况下进行，如对于本领域技术人员将是显而易见的。本文描述的特定实施方案仅以实例的方式提出，并不意味着以任何方式进行限制。打算将说明书和实施例仅视为示例性的，本发明的真正范围或精神由以下权利要求书指明。

Claims (44)

1.一种在具有异常的碱性磷酸酶活性的受试者中治疗癫痫的方法，其包括给予受试者治疗有效量的至少一种重组碱性磷酸酶。
2.一种在具有高于正常水平的至少一种碱性磷酸酶底物的受试者中治疗癫痫的方法，其包括给予受试者治疗有效量的至少一种重组碱性磷酸酶。
3. 一种治疗受试者的癫痫的方法，其包括：
(i) 鉴定具有异常的碱性磷酸酶活性的受试者群体，所述受试者罹患癫痫，或面临罹患癫痫的风险；和
(ii) 给予所述群体中的受试者治疗有效量的至少一种重组碱性磷酸酶。
4. 一种治疗受试者的癫痫的方法，其包括：
(i) 鉴定具有高于正常水平的至少一种碱性磷酸酶底物的受试者群体，所述受试者罹患癫痫，或面临罹患癫痫的风险；和
(ii) 给予所述群体中的受试者治疗有效量的至少一种重组碱性磷酸酶。
5.权利要求1-4的任一项的方法，其中所述受试者已被诊断患有磷酸酶过少症(HPP)和其中所述受试者具有轻度或未-可检测的骨矿化缺陷。
6.权利要求1-4的任一项的方法，其中所述受试者尚未被诊断患有HPP。
7.权利要求1或3的方法，其中碱性磷酸酶活性通过碱性磷酸酶对吡多醛5’-磷酸(PLP)、无机焦磷酸(PPi)和磷酸乙醇胺(PEA)的至少一种的酶活性来测定。
8.权利要求2或4的方法，其中至少一种碱性磷酸酶底物选自PLP、PPi和PEA。
9.权利要求1-8的任一项的方法，其中所述受试者具有增加的血清吡多醛5’-磷酸(PLP)。
10.权利要求1-9的任一项的方法，其中所述受试者具有减少的细胞内吡多醛5’-磷酸(PLP)。
11.权利要求1-10的任一项的方法，其中所述受试者具有减少的脑γ-氨基丁酸(GABA)和减少的脑丝氨酸的至少一种。
12.权利要求1-11的任一项的方法，其中所述受试者具有增加的脑和尿胱硫醚的至少一种。
13.权利要求1-12的任一项的方法，其中至少一种重组碱性磷酸酶每日给予受试者，持续至少一周、一个月、三个月、六个月，或一年。
14.权利要求1-13的任一项的方法，其中至少一种重组碱性磷酸酶的给予提高脑GABA。
15.权利要求1-14的任一项的方法，其中治疗有效量的至少一种另外的治疗剂被联合给予受试者。
16.权利要求15的方法，其中至少一种另外的治疗剂是抗癫痫药。
17. 权利要求15的方法，其还包括：
维持至少一种另外的治疗剂与至少一种重组碱性磷酸酶的共同给予一段预定的时间；和
退出给予受试者至少一种另外的治疗剂，同时维持给予至少一种重组碱性磷酸酶。
18.权利要求15的方法，其中至少一种另外的抗癫痫药和至少一种重组碱性磷酸酶被共同给予受试者至少一个月、至少六个月，或至少一年。
19. 权利要求15-18的任一项的方法，其中至少一种另外的治疗剂是维生素B6 (吡哆醇)和维生素B6类维生素的至少一种。
20.权利要求1-19的任一项的方法，其中至少一种重组碱性磷酸酶包含组织非特异性碱性磷酸酶(TNALP)、胎盘碱性磷酸酶(PALP)、胚细胞碱性磷酸酶(GCALP)、肠碱性磷酸酶(IALP)或其生物学功能片段、融合物或嵌合构建体的至少一种。
21.权利要求20的方法，其中至少一种重组碱性磷酸酶是TNALP、PALP、GCALP或IALP的可溶性片段。
22. 权利要求1-21的任一项的方法，其中至少一种重组碱性磷酸酶包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。
23.权利要求1-22的任一项的方法，其中至少一种重组碱性磷酸酶是融合蛋白。
24.权利要求23的方法，其中至少一种重组碱性磷酸酶与免疫球蛋白分子融合。
25.权利要求24的方法，其中免疫球蛋白分子是片段可结晶区(Fc)。
26. 权利要求25的方法，其中Fc包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列。
27.权利要求1-26的任一项的方法，其中至少一种重组碱性磷酸酶与带负电荷的肽融合。
28.权利要求27的方法，其中带负电荷的肽是D10、D16、E10和E16的至少一种。
29.权利要求1-28的任一项的方法，其中至少一种重组碱性磷酸酶包含sALP-Fc-D10的结构。
30. 权利要求29的方法，其中至少一种重组碱性磷酸酶包含SEQ ID NO: 1或SEQ IDNO: 4的氨基酸序列。
31. 前述权利要求的任一项的方法，其中至少一种重组碱性磷酸酶以约0.1 mg/kg/天至约20 mg/kg/天的剂量，或相当的每周剂量给予。
32. 权利要求31的方法，其中至少一种重组碱性磷酸酶以约0.5 mg/kg/天至约20 mg/kg/天的剂量，或相当的每周剂量给予。
33. 权利要求31的方法，其中至少一种重组碱性磷酸酶以约0.5 mg/kg/天至约10 mg/kg/天的剂量，或相当的每周剂量给予。
34. 权利要求31的方法，其中至少一种重组碱性磷酸酶以约0.5 mg/kg/天至约8 mg/kg/天的剂量，或相当的每周剂量给予。
35. 权利要求31的方法，其中至少一种重组碱性磷酸酶以约0.5 mg/kg/天至约5 mg/kg/天的剂量，或相当的每周剂量给予。
36. 权利要求31的方法，其中至少一种重组碱性磷酸酶以约0.1 mg/kg/天至约0.5mg/kg/天的剂量，或相当的每周剂量给予。
37. 权利要求31的方法，其中至少一种重组碱性磷酸酶以约0.1 mg/kg/天至约1 mg/kg/天的剂量，或相当的每周剂量给予。
38. 权利要求31的方法，其中至少一种重组碱性磷酸酶以约1 mg/kg/天至约5 mg/kg/天的剂量，或相当的每周剂量给予。
39. 权利要求31的方法，其中至少一种重组碱性磷酸酶以约1 mg/kg/天至约8 mg/kg/天的剂量，或相当的每周剂量给予。
40. 权利要求31的方法，其中至少一种重组碱性磷酸酶以约1 mg/kg/天至约10 mg/kg/天的剂量，或相当的每周剂量给予。
41.前述权利要求的任一项的方法，其中至少一种重组碱性磷酸酶通过静脉内、肌内、皮下、舌下、鞘内和皮内途径的至少一种给予。
42.权利要求41的方法，其中至少一种重组碱性磷酸酶经静脉内给予。
43.权利要求42的方法，其中至少一种重组碱性磷酸酶经静脉内，然后皮下给予。
44.前述权利要求的任一项的方法，其中所述受试者是人。
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