JP3026352B2 - ラットＣＮＰｃＤＮＡ及び前駆体蛋白 - Google Patents
ラットＣＮＰｃＤＮＡ及び前駆体蛋白Info
- Publication number
- JP3026352B2 JP3026352B2 JP02241074A JP24107490A JP3026352B2 JP 3026352 B2 JP3026352 B2 JP 3026352B2 JP 02241074 A JP02241074 A JP 02241074A JP 24107490 A JP24107490 A JP 24107490A JP 3026352 B2 JP3026352 B2 JP 3026352B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- rcnp
- dna
- cnp
- pcnp
- Prior art date
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- Expired - Lifetime
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/58—Atrial natriuretic factor complex; Atriopeptin; Atrial natriuretic peptide [ANP]; Cardionatrin; Cardiodilatin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/10—Antioedematous agents; Diuretics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/12—Antidiuretics, e.g. drugs for diabetes insipidus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、ラットCNP（rat C−type natriuretic pep
tide;rCNP）をコードするcDNA及びこのcDNAにコードさ
れているrCNP前駆体タンパク（prepro rCNP）に関す
る。
tide;rCNP）をコードするcDNA及びこのcDNAにコードさ
れているrCNP前駆体タンパク（prepro rCNP）に関す
る。
発明の背景 近年、各種動物の心房及び脳から、ナトリウム利尿ペ
プチド（natriuretic peptide;NP）とよばれる種々のペ
プチドが発見されてきた。現在これらNPは、アミノ酸一
次配列の類似性及びその前駆体構造から、３つのタイ
プ、すなわちＡ型NP（Ａ−type natriuretic peptide;A
NP）、Ｂ型NP（Ｂ−type natriuretic peptide;BNP）及
びＣ型NP（Ｃ−type natriuretic peptide;CNP）のいず
れかに分類することができる。このうち、ANP・BNPは最
初それぞれ心房、脳から単離同定されたことから、ANP
は心房性ナトリウム利尿ペプチド（atrial natriuretic
peptide）、BNPは脳ナトリウム利尿ペプチド（brain n
atriuretic peptide）とも呼ばれている（Matsuo,H.and
Nakazato,H.Endocrinol.Metab.Clin.North Am.,16,43,
1987;Sudoh,T.et al.Nature,332,78,1998）。しかし、
現在ANPは心房のみならず脳にも存在していること、同
様にBNPは脳のみならず心房にも存在していることが判
ってきた。また、ANP・BNPはいずれも顕著なナトリウム
利尿作用及び血圧降下作用を示すことから、ANP・BNPは
いずれも心房から血中へ分泌されるホルモンとしてのみ
ならず、脳内においては神経伝達物質としても作用し、
哺乳類の体液量及び血圧の恒常性を調節していることが
明らかになってきた。
プチド（natriuretic peptide;NP）とよばれる種々のペ
プチドが発見されてきた。現在これらNPは、アミノ酸一
次配列の類似性及びその前駆体構造から、３つのタイ
プ、すなわちＡ型NP（Ａ−type natriuretic peptide;A
NP）、Ｂ型NP（Ｂ−type natriuretic peptide;BNP）及
びＣ型NP（Ｃ−type natriuretic peptide;CNP）のいず
れかに分類することができる。このうち、ANP・BNPは最
初それぞれ心房、脳から単離同定されたことから、ANP
は心房性ナトリウム利尿ペプチド（atrial natriuretic
peptide）、BNPは脳ナトリウム利尿ペプチド（brain n
atriuretic peptide）とも呼ばれている（Matsuo,H.and
Nakazato,H.Endocrinol.Metab.Clin.North Am.,16,43,
1987;Sudoh,T.et al.Nature,332,78,1998）。しかし、
現在ANPは心房のみならず脳にも存在していること、同
様にBNPは脳のみならず心房にも存在していることが判
ってきた。また、ANP・BNPはいずれも顕著なナトリウム
利尿作用及び血圧降下作用を示すことから、ANP・BNPは
いずれも心房から血中へ分泌されるホルモンとしてのみ
ならず、脳内においては神経伝達物質としても作用し、
哺乳類の体液量及び血圧の恒常性を調節していることが
明らかになってきた。
一方、CNPはごく最近Sudohらにより、ANP・BNPのいず
れにも帰属されない第３のタイプに分類されるNPとして
ブタ脳から単離・同定された（Sudoh,T.et al,Biochem.
Biophys.Res.Commun.,168,863,1990）。すなわち、まず
最初に発見されたCNPは22アミノ酸残基より成り、（な
お、本明細書においてこのペプチドを以下pCNP−22と略
す）、ANP・BNPと同様２個のシステイン残基を含んでお
り、これが分子内でジスルフィド結合を形成し、17アミ
ノ酸残基より構成された環状構造を持っている。しかも
この環状構造を形成しているアミノ酸一次配列にはANP
・BNPのそれらと高い相同性が見いだされた。
れにも帰属されない第３のタイプに分類されるNPとして
ブタ脳から単離・同定された（Sudoh,T.et al,Biochem.
Biophys.Res.Commun.,168,863,1990）。すなわち、まず
最初に発見されたCNPは22アミノ酸残基より成り、（な
お、本明細書においてこのペプチドを以下pCNP−22と略
す）、ANP・BNPと同様２個のシステイン残基を含んでお
り、これが分子内でジスルフィド結合を形成し、17アミ
ノ酸残基より構成された環状構造を持っている。しかも
この環状構造を形成しているアミノ酸一次配列にはANP
・BNPのそれらと高い相同性が見いだされた。
しかしpCNP−22、ANP・BNPがいずれも上記環状構造の
Ｃ−末端部分にさらに数個のアミノ酸が付加したいわゆ
るテイル構造（tail構造）を持っているのに対し、この
tail構造を持っていない。すなわち、pCNP−22のＣ−末
端はシステイン残基で終わっている。このことから、pC
NP−22の構造はANP・BNPと似ているが、これらとは全く
異なっていることが判った。さらに、pCNP−22はナトリ
ウム利尿作用及び血圧降下作用を示し、かつヒヨコ直腸
標本を用いた弛緩活性でANP・BNPに比べ高い比活性を示
すことが判ったことから、pCNP−22は新しいタイプに帰
属されるNPであることが判り、このタイプに属するペプ
チドはCNPと命名された。
Ｃ−末端部分にさらに数個のアミノ酸が付加したいわゆ
るテイル構造（tail構造）を持っているのに対し、この
tail構造を持っていない。すなわち、pCNP−22のＣ−末
端はシステイン残基で終わっている。このことから、pC
NP−22の構造はANP・BNPと似ているが、これらとは全く
異なっていることが判った。さらに、pCNP−22はナトリ
ウム利尿作用及び血圧降下作用を示し、かつヒヨコ直腸
標本を用いた弛緩活性でANP・BNPに比べ高い比活性を示
すことが判ったことから、pCNP−22は新しいタイプに帰
属されるNPであることが判り、このタイプに属するペプ
チドはCNPと命名された。
また、pCNP−22に続き、本発明者らにより、CNPに帰
属される第２のペプチドがブタ脳から単離・同定され
た。このペプチドはpCNP−22をＣ−末端に含む53アミノ
酸残基から成るペプチドであることが判った（以下、本
明細書においてこのペプチドをpCNP−53と略す）。
属される第２のペプチドがブタ脳から単離・同定され
た。このペプチドはpCNP−22をＣ−末端に含む53アミノ
酸残基から成るペプチドであることが判った（以下、本
明細書においてこのペプチドをpCNP−53と略す）。
言い換えれば、pCNP−53はpCNP−22のＮ−末端にさら
に31個のアミノ酸残基が付加したペプチドであることが
判った。なお、興味あることにブタ脳ではpCNP−53がpC
NP−22より多く存在していることが明らかにされている
（特願平２−186582）。
に31個のアミノ酸残基が付加したペプチドであることが
判った。なお、興味あることにブタ脳ではpCNP−53がpC
NP−22より多く存在していることが明らかにされている
（特願平２−186582）。
さらに、ごく最近の研究で、pCNP−22、pCNP−53の前
駆体タンパクの構造が遺伝子の解析から明らかにされ、
これらペプチドの生合成構造についても明らかにされて
きた（特願平２−186583）。すなわち、本発明者らによ
り、pCNP−22、pCNP−53をコードするブタ染色体遺伝子
及びcDNAが単離・同定され、この解析から、ブタCNP前
駆体タンパク（prepropCNP）の構造が明らかにされると
共に、pCNP−22、pCNP−53は最初126アミノ酸残基から
なるpropCNPとしてmRNAから翻訳され、次にこのＮ−末
端領域に存在するシグナルペプチドが分泌過程で切断さ
れpropCNPに転換され、さらにprepropCNPはプロセシン
グ酵素により特異的に切断されることによりpCNP−53と
pCNP−22に転換されることが判った。
駆体タンパクの構造が遺伝子の解析から明らかにされ、
これらペプチドの生合成構造についても明らかにされて
きた（特願平２−186583）。すなわち、本発明者らによ
り、pCNP−22、pCNP−53をコードするブタ染色体遺伝子
及びcDNAが単離・同定され、この解析から、ブタCNP前
駆体タンパク（prepropCNP）の構造が明らかにされると
共に、pCNP−22、pCNP−53は最初126アミノ酸残基から
なるpropCNPとしてmRNAから翻訳され、次にこのＮ−末
端領域に存在するシグナルペプチドが分泌過程で切断さ
れpropCNPに転換され、さらにprepropCNPはプロセシン
グ酵素により特異的に切断されることによりpCNP−53と
pCNP−22に転換されることが判った。
以上のことから、pCNP−22及びpCNP−53についてもAN
P・BNP同様共通の前駆体タンパク（prepropCNP）から生
合成される分泌ペプチドであることが判った。
P・BNP同様共通の前駆体タンパク（prepropCNP）から生
合成される分泌ペプチドであることが判った。
しかしながら、現在までの研究でANP・BNPに帰属され
るペプチド類がいずれも心房から血中に分泌されるホル
モンとしてのみならず、脳内においては神経伝達物質と
して作用し、体液量及び血圧の恒常性を調節しているこ
とが判っているのに対し、CNPの詳細な生体内分布及び
生理作用に関しては不明な点が多い。
るペプチド類がいずれも心房から血中に分泌されるホル
モンとしてのみならず、脳内においては神経伝達物質と
して作用し、体液量及び血圧の恒常性を調節しているこ
とが判っているのに対し、CNPの詳細な生体内分布及び
生理作用に関しては不明な点が多い。
また、ANP・BNPに関しては、現在までにラットの構造
が明らかにされ、ラットANP、ラットBNPを用いたラット
での生理作用が明らかにされており、種差による影響を
排除した薬効評価がなされているが、CNPに関しては、
現在までのところ、ラットにおける構造が明らかにされ
ていない。
が明らかにされ、ラットANP、ラットBNPを用いたラット
での生理作用が明らかにされており、種差による影響を
排除した薬効評価がなされているが、CNPに関しては、
現在までのところ、ラットにおける構造が明らかにされ
ていない。
本発明が解決すべき課題 従って本発明は、ラットにおけるCNP（rCNP）構造、
特にpCNP−22、pCNP−53に対応するラットCNP構造を明
らかにすると共に、この前駆体タンパク（ブタにおける
prepropCNPに対応する）の構造をも明らかにすることを
目的とする。
特にpCNP−22、pCNP−53に対応するラットCNP構造を明
らかにすると共に、この前駆体タンパク（ブタにおける
prepropCNPに対応する）の構造をも明らかにすることを
目的とする。
課題を解決するための手段 本発明者らは、ANPのアミノ酸配列およびそれをコー
ドする遺伝子の塩基配列が各種動物間で強く保存されて
いることから、CNPの場合も同様の可能性が高いと考え
た。そこで、本発明者らは、先にブタCNPの染色体遺伝
子あるいはcDNAを単離するのに用いたDNAプローブ（pDC
−53）を用いrCNPのcDNAを単離し、これを解析すること
によりrCNP前駆体タンパクの構造を明らかにすることを
計画した 本発明では、先ずpDC−53をDNAプローブとして用い、
ラット染色体遺伝子ライブラリー（λファージにラット
染色体遺伝子断片を組み込んだもの）をスクリーニング
したところ、pDC−53に弱い条件下でハイブリダイズ（h
ybridize）するクローンが５つ得られた。このうちの１
つのクローン（λrCNPG3）を解析したところ、λrCNPG3
は約14kbpのラット染色体遺伝子を含んでおり、またこ
の14kbpのうち約2.1kbpからなるBamH I DNA断片がpDC−
53DNAプローブとhybridizeすることが判った。そこでこ
の約2.1kbpからなるBamH I DNA断片の一部の塩基配列を
決定したところ、このDNAが、rCNP遺伝子をコードする
ことが明らかとなった。
ドする遺伝子の塩基配列が各種動物間で強く保存されて
いることから、CNPの場合も同様の可能性が高いと考え
た。そこで、本発明者らは、先にブタCNPの染色体遺伝
子あるいはcDNAを単離するのに用いたDNAプローブ（pDC
−53）を用いrCNPのcDNAを単離し、これを解析すること
によりrCNP前駆体タンパクの構造を明らかにすることを
計画した 本発明では、先ずpDC−53をDNAプローブとして用い、
ラット染色体遺伝子ライブラリー（λファージにラット
染色体遺伝子断片を組み込んだもの）をスクリーニング
したところ、pDC−53に弱い条件下でハイブリダイズ（h
ybridize）するクローンが５つ得られた。このうちの１
つのクローン（λrCNPG3）を解析したところ、λrCNPG3
は約14kbpのラット染色体遺伝子を含んでおり、またこ
の14kbpのうち約2.1kbpからなるBamH I DNA断片がpDC−
53DNAプローブとhybridizeすることが判った。そこでこ
の約2.1kbpからなるBamH I DNA断片の一部の塩基配列を
決定したところ、このDNAが、rCNP遺伝子をコードする
ことが明らかとなった。
なお、このBamH I断片の制限酵素地図及び塩基配列を
決定した領域を第1a図に、また決定した塩基配列及びそ
こにコードされるアミノ酸配列を第1b図に示した。
決定した領域を第1a図に、また決定した塩基配列及びそ
こにコードされるアミノ酸配列を第1b図に示した。
次にこのDNA断片からSma IおよびMva I制限酵素で切
り出されるrCNP−22をコードする150bpのDNA断片（以下
このDNA断片をrDC−22と略す。）をプローブとして用
い、ラット脳cDNAライブラリーをスクリーニングした。
り出されるrCNP−22をコードする150bpのDNA断片（以下
このDNA断片をrDC−22と略す。）をプローブとして用
い、ラット脳cDNAライブラリーをスクリーニングした。
この結果rDC−22にhybridizeする22個のクローンが得
られ、このうち最も長いcDNA（約1Kbp）を持つクローン
はλrCNP21であることが判った。そこで次にこのλrCNP
21がもつ約1kbpのcDNA断片の全塩基配列を決定した。こ
の結果、第２図に示すようにこのcDNA断片はrCNP前駆体
タンパクの全アミノ酸配列をコードしてることが判っ
た。
られ、このうち最も長いcDNA（約1Kbp）を持つクローン
はλrCNP21であることが判った。そこで次にこのλrCNP
21がもつ約1kbpのcDNA断片の全塩基配列を決定した。こ
の結果、第２図に示すようにこのcDNA断片はrCNP前駆体
タンパクの全アミノ酸配列をコードしてることが判っ
た。
すなわち、まずこのDNA断片には塩基配列番号１から
３に存在するATGから始まる長いオープンリーディング
フレームが存在しており、このATGは、cDNAの中で最初
に現れるメチオニンコドンであり、しかもこのコドンの
回りの塩基配列は真核生物で知られている翻訳開始コド
ンのコンセンサスシークエンスA/G NNATG（ＮはA.T.G.
C.いずれかの塩基を示す）と一致していることから、本
発明者らはこのATGがrCNP前駆体の翻訳開始コドンであ
ると推定した。このオープンリーディングフレームには
126アミノ酸残基からなるポリペプチドがコードされて
いることが判った。また、このアミノ酸一次配列を、pC
NP前駆体のそれと比較すると非常によく一致しているこ
とが判った。このことから本発明者らは、得られたcDNA
が間違いなくrCNPをコードするcDNAであることを確信し
た。
３に存在するATGから始まる長いオープンリーディング
フレームが存在しており、このATGは、cDNAの中で最初
に現れるメチオニンコドンであり、しかもこのコドンの
回りの塩基配列は真核生物で知られている翻訳開始コド
ンのコンセンサスシークエンスA/G NNATG（ＮはA.T.G.
C.いずれかの塩基を示す）と一致していることから、本
発明者らはこのATGがrCNP前駆体の翻訳開始コドンであ
ると推定した。このオープンリーディングフレームには
126アミノ酸残基からなるポリペプチドがコードされて
いることが判った。また、このアミノ酸一次配列を、pC
NP前駆体のそれと比較すると非常によく一致しているこ
とが判った。このことから本発明者らは、得られたcDNA
が間違いなくrCNPをコードするcDNAであることを確信し
た。
以上、本発明者らは、rCNPcDNAを単離し、それを解析
することにより、rCNP前駆体タンパクが第２図に示すア
ミノ酸一次配列を持つ126アミノ酸残基からなるポリペ
プチドであること明らかにすることに成功した。このよ
うにして明らかにされたrCNP前駆体タンパク（以降、本
発明では、preprorCNPと略す。）のアミノ酸一次配列の
Ｃ−末端領域には、ブタ脳から最初に構造決定されたpC
NP−22およびpCNP−53に対応する配列であるラットCNP
ー22（rCNP−22;第２図アミノ酸配列番号105から126番
目）及びラットCNPー53（rCNP−53;第２図アミノ酸配列
番号74から126番目）が存在し、しかもpCNP−22とrCNP
−22およびpCNP−53とrCNP−53のアミノ酸配列はそれぞ
れ完全に一致していた。なお、これらのペプチドが合成
されるためには、前駆体からのプロセシング酵素による
切断が不可欠と考えられるが、このプロセシングが起こ
ると考えられるpreprorCNPのＣ−末端から22番目付近、
及び53番目付近のアミノ酸配列がラットとブタで完全に
一致していることからラット脳においてもrCNP−22ある
いはrCNP−53が合成されている可能性は極めて高いとい
える。また、preprorCNPのＮ−末端領域には、これもブ
タ同様、疎水性アミノ酸残基に富む領域（第２図アミノ
酸一次配列番号10から16番目）が存在していることか
ら、preprorCNPのＮ−末端領域には分泌に必要なシグナ
ルペプチドが存在している可能性が高い。
することにより、rCNP前駆体タンパクが第２図に示すア
ミノ酸一次配列を持つ126アミノ酸残基からなるポリペ
プチドであること明らかにすることに成功した。このよ
うにして明らかにされたrCNP前駆体タンパク（以降、本
発明では、preprorCNPと略す。）のアミノ酸一次配列の
Ｃ−末端領域には、ブタ脳から最初に構造決定されたpC
NP−22およびpCNP−53に対応する配列であるラットCNP
ー22（rCNP−22;第２図アミノ酸配列番号105から126番
目）及びラットCNPー53（rCNP−53;第２図アミノ酸配列
番号74から126番目）が存在し、しかもpCNP−22とrCNP
−22およびpCNP−53とrCNP−53のアミノ酸配列はそれぞ
れ完全に一致していた。なお、これらのペプチドが合成
されるためには、前駆体からのプロセシング酵素による
切断が不可欠と考えられるが、このプロセシングが起こ
ると考えられるpreprorCNPのＣ−末端から22番目付近、
及び53番目付近のアミノ酸配列がラットとブタで完全に
一致していることからラット脳においてもrCNP−22ある
いはrCNP−53が合成されている可能性は極めて高いとい
える。また、preprorCNPのＮ−末端領域には、これもブ
タ同様、疎水性アミノ酸残基に富む領域（第２図アミノ
酸一次配列番号10から16番目）が存在していることか
ら、preprorCNPのＮ−末端領域には分泌に必要なシグナ
ルペプチドが存在している可能性が高い。
以上のことを総合的に考えると、rCNP−22、rCNP−53
は以下に述べる経路で生合成されることが推定される。
すなわち、まず126アミノ酸残基からなるpreprorCNPがm
RNAから翻訳される。次にこのＮ−末端領域に存在する
シグナルペプチドが分泌過程で切断されprorCNPに転換
される。さらに、prorCNPはプロセシング酵素により特
異的に切断され（第２図アミノ酸配列番号73と74の間、
104と105の間）、rCNP−53とrCNP−22に転換される。
は以下に述べる経路で生合成されることが推定される。
すなわち、まず126アミノ酸残基からなるpreprorCNPがm
RNAから翻訳される。次にこのＮ−末端領域に存在する
シグナルペプチドが分泌過程で切断されprorCNPに転換
される。さらに、prorCNPはプロセシング酵素により特
異的に切断され（第２図アミノ酸配列番号73と74の間、
104と105の間）、rCNP−53とrCNP−22に転換される。
以上まとめると、本発明者らはrCNP（rCNP−22、rCNP
−53）前駆体タンパクをコードするcDNAを単離し、これ
を解析することによってrCNP前駆体タンパクのアミノ酸
一次配列を明らかにすると共に、ブタCNP（pCNP−53、p
CNP−22）に対応するラットCNP（rCNP−53、rCNP−22）
の構造をも明らかにすることに成功し、本発明を完成さ
せた。
−53）前駆体タンパクをコードするcDNAを単離し、これ
を解析することによってrCNP前駆体タンパクのアミノ酸
一次配列を明らかにすると共に、ブタCNP（pCNP−53、p
CNP−22）に対応するラットCNP（rCNP−53、rCNP−22）
の構造をも明らかにすることに成功し、本発明を完成さ
せた。
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。
実施例1.ラットCNP前駆体タンパクをコードする染色体
遺伝子の単離 ４℃に保存されたラット染色体遺伝子ファージDNAラ
イブラリー（Clonetech社製）を大腸菌K12株由来LE392
に感染させ、LB培地（10g Bactotryptone,5g Yeast ext
ract,5g NaCl,1.5％ Bactoagar全量1l）に拡げ、37℃で
一夜培養した。プレートを４℃で30分間冷却した後、フ
ァジプラーク上にニトロセルロースフィルター（Shleic
her ＆ Schnell社製）を５分間放置した。次にこのフィ
ルターをプレートからはがし、風乾後アルカリ変性液
（0.5M NaOH,1.5M NaCl）に１分間浸し、次に中和液
（0.5M Tris−HCl pH7.0,1.5MNaCl）に１分間浸した。
その後、３×SSC溶液（20×SSC NaCl 175.3g,クエン酸
三ナトリウム 88.2g全量1l）でニトロセルロースフィ
ルターをすすぎ、風乾後、減圧下80℃120分間熱処理を
行った。
遺伝子の単離 ４℃に保存されたラット染色体遺伝子ファージDNAラ
イブラリー（Clonetech社製）を大腸菌K12株由来LE392
に感染させ、LB培地（10g Bactotryptone,5g Yeast ext
ract,5g NaCl,1.5％ Bactoagar全量1l）に拡げ、37℃で
一夜培養した。プレートを４℃で30分間冷却した後、フ
ァジプラーク上にニトロセルロースフィルター（Shleic
her ＆ Schnell社製）を５分間放置した。次にこのフィ
ルターをプレートからはがし、風乾後アルカリ変性液
（0.5M NaOH,1.5M NaCl）に１分間浸し、次に中和液
（0.5M Tris−HCl pH7.0,1.5MNaCl）に１分間浸した。
その後、３×SSC溶液（20×SSC NaCl 175.3g,クエン酸
三ナトリウム 88.2g全量1l）でニトロセルロースフィ
ルターをすすぎ、風乾後、減圧下80℃120分間熱処理を
行った。
このようにして調製したニトロセルロースフィルター
を用い、以下に示す条件でプラークハイブリダイゼーシ
ョンを行った。すなわち、ニトロセルロースフィルター
をプレハイブリダイゼーション液［３×SSC,5×デンハ
ート液（アルブミン、ポリビニルピロリドン、フィコー
ル、各々1mg/ml），サケ精子DNA100μg/ml、30％ホルム
アミド、0.1％SDS］に加え37℃にて２時間プレハイブリ
ダイゼーションを行った。次に２枚のニトロセルロース
フィルターあたり、前記pDC−53DNAプローブ（このDNA
プローブの作製は本発明者等により、特願平２ー186583
に記載されている）を100万cpm、及び前記プレハイブリ
ダイゼーション溶液1mlを用い、37℃にて一夜ハイブリ
ダイゼーションを行った。次にこのフィルターを0.1％S
DSを含む３×SSC溶液で40℃40分間２回、55℃30分間１
回洗浄後、風乾し、オートラジオグラフィーを−80℃で
一昼夜行った。このようにして約50万クローンをスクリ
ーニングすることによりpDC−53DNAプローブとハイブリ
ダイズするクローンが８個得られた。これらのクローン
のうちの一つをλrCNPG3と命名し、以後の解析を行っ
た。
を用い、以下に示す条件でプラークハイブリダイゼーシ
ョンを行った。すなわち、ニトロセルロースフィルター
をプレハイブリダイゼーション液［３×SSC,5×デンハ
ート液（アルブミン、ポリビニルピロリドン、フィコー
ル、各々1mg/ml），サケ精子DNA100μg/ml、30％ホルム
アミド、0.1％SDS］に加え37℃にて２時間プレハイブリ
ダイゼーションを行った。次に２枚のニトロセルロース
フィルターあたり、前記pDC−53DNAプローブ（このDNA
プローブの作製は本発明者等により、特願平２ー186583
に記載されている）を100万cpm、及び前記プレハイブリ
ダイゼーション溶液1mlを用い、37℃にて一夜ハイブリ
ダイゼーションを行った。次にこのフィルターを0.1％S
DSを含む３×SSC溶液で40℃40分間２回、55℃30分間１
回洗浄後、風乾し、オートラジオグラフィーを−80℃で
一昼夜行った。このようにして約50万クローンをスクリ
ーニングすることによりpDC−53DNAプローブとハイブリ
ダイズするクローンが８個得られた。これらのクローン
のうちの一つをλrCNPG3と命名し、以後の解析を行っ
た。
実施例2.λrCNPG3ファージの解析 A.λrCNPG3ファージDNAの解析 まず常法に従いλrCNPG3ファージからDNAを調製し
た。次に、このファージDNAを制限酵素BamH I,EcoR I及
びPst Iを用い切断し、切断されたDNA断片をアガロース
ゲル電気泳動で分離・解析した。この結果、λrCNPG3は
約14kbpのラット染色体遺伝子を含むファージであるこ
とが判った。また、pDC−53DNAプローブを用い、サザン
ブロット解析を行った結果、約2.1kbpのBamH I DNA断
片、約19kbpのEcoR I DNA断片、約1.65kbpのpst I DNA
断片がpDC−53DNAプローブとハイブリダイズすることが
判った。そこで、pDC−53DNAプローブとハイブリダイズ
するBamH I（2.1kbp）DNA断片の一部の塩基配列を、以
下に示す方法で決定した。
た。次に、このファージDNAを制限酵素BamH I,EcoR I及
びPst Iを用い切断し、切断されたDNA断片をアガロース
ゲル電気泳動で分離・解析した。この結果、λrCNPG3は
約14kbpのラット染色体遺伝子を含むファージであるこ
とが判った。また、pDC−53DNAプローブを用い、サザン
ブロット解析を行った結果、約2.1kbpのBamH I DNA断
片、約19kbpのEcoR I DNA断片、約1.65kbpのpst I DNA
断片がpDC−53DNAプローブとハイブリダイズすることが
判った。そこで、pDC−53DNAプローブとハイブリダイズ
するBamH I（2.1kbp）DNA断片の一部の塩基配列を、以
下に示す方法で決定した。
B.BamH I DNA断片の塩基配列決定 まず、BamH I DNA断片の塩基配列を決定するために、
一旦、BamH I DNA断片をプラスミドベクターpUC18（宝
酒造）のBamH Iサイトにサブクローニングした。得られ
たプラスミド（pUCrCNPG3）から、pDC−53DNAプローブ
とhydridizeするDNA断片Sma I Xba Iフラグメント（450
bp）を単離し、ファージベクターM13mp18及び19にサブ
クローニングした。得られた一本鎖DNA断片をtemplate
にしてUniversalプライマーを用い、ジデオキシ法［SEQ
UENASE（United States Biochemical Corporation）、
シークエンスキット（宝酒造）］でDNA塩基配列を決定
した。以上の方法で決定した塩基配列及びこの塩基配列
から予想されるアミノ酸配列を第1b図に示した。
一旦、BamH I DNA断片をプラスミドベクターpUC18（宝
酒造）のBamH Iサイトにサブクローニングした。得られ
たプラスミド（pUCrCNPG3）から、pDC−53DNAプローブ
とhydridizeするDNA断片Sma I Xba Iフラグメント（450
bp）を単離し、ファージベクターM13mp18及び19にサブ
クローニングした。得られた一本鎖DNA断片をtemplate
にしてUniversalプライマーを用い、ジデオキシ法［SEQ
UENASE（United States Biochemical Corporation）、
シークエンスキット（宝酒造）］でDNA塩基配列を決定
した。以上の方法で決定した塩基配列及びこの塩基配列
から予想されるアミノ酸配列を第1b図に示した。
実施例3.DNAプローブ（rDC−22）の作製 rCNP前駆体タンパクをコードするcDNAをクローニング
するために用いるDNAプローブ（rDC−22）の作製は、前
記プラスミドpUCrCNPG3を制限酵素Sma I及びMva Iで切
断し、14bpDNA断片を単離、このDNAを［α−32p］dCTP
を用い、マルチプライムラベリングキット（宝酒造）で
放射標識することにより作製した。
するために用いるDNAプローブ（rDC−22）の作製は、前
記プラスミドpUCrCNPG3を制限酵素Sma I及びMva Iで切
断し、14bpDNA断片を単離、このDNAを［α−32p］dCTP
を用い、マルチプライムラベリングキット（宝酒造）で
放射標識することにより作製した。
実施例4.ラットCNPcDNAの単離 A.λgt10cDNAライブラリーの作製 ラット脳2.7gからグアニジン−チオシアネート法を用
い、全RNA（total RNA）1295μｇを抽出単離した。次
に、このtotal RNA 1295μｇからオリゴ（dT）セルロー
スカラムを用い、poly（Ａ）＋RNAを約84μｇ調製し
た。続いて、４μｇのpoly（Ａ）＋RNAを用いて、Guble
rとHoffmanの方法（Gubler,U.et al.Gene,25,263,198
3）により２本鎖cDNAを作製した。得られたcDNAに13塩
基からなるEcoR Iアダプターをライゲートし、これらを
１％アガロースゲル電気泳動を用いてサイズ分画した。
このようにして得られた300−1500塩基対からなるcDNA
をファージλgt10アームにライゲートし、in vitro pac
kagingにより１μgpoly（Ａ）＋RNA当たり、4.7−11.1
×106個のindependent cloneからなるcDNAライブラリー
を作製した。
い、全RNA（total RNA）1295μｇを抽出単離した。次
に、このtotal RNA 1295μｇからオリゴ（dT）セルロー
スカラムを用い、poly（Ａ）＋RNAを約84μｇ調製し
た。続いて、４μｇのpoly（Ａ）＋RNAを用いて、Guble
rとHoffmanの方法（Gubler,U.et al.Gene,25,263,198
3）により２本鎖cDNAを作製した。得られたcDNAに13塩
基からなるEcoR Iアダプターをライゲートし、これらを
１％アガロースゲル電気泳動を用いてサイズ分画した。
このようにして得られた300−1500塩基対からなるcDNA
をファージλgt10アームにライゲートし、in vitro pac
kagingにより１μgpoly（Ａ）＋RNA当たり、4.7−11.1
×106個のindependent cloneからなるcDNAライブラリー
を作製した。
B.cDNAライブラリーのスクリーニング 得られたcDNAライブラリーの中の約６×105クローン
を実施例４で作製したrDC−22DNAプローブを用いスクリ
ーニングした。方法は、実施例２で示したものと同様で
あるが、菌体はc600hflを使用、ハイブリダイゼーショ
ン溶液中のホルムアミドの濃度は50％また塩は５×SSPE
（20×SSPE,3M NaCl,0.2Mリン酸一ナトリウム、0.02MED
TA）とした。また洗いの条件は２×SSC,0.1％SDS、温度
を65度,40min×２とした。
を実施例４で作製したrDC−22DNAプローブを用いスクリ
ーニングした。方法は、実施例２で示したものと同様で
あるが、菌体はc600hflを使用、ハイブリダイゼーショ
ン溶液中のホルムアミドの濃度は50％また塩は５×SSPE
（20×SSPE,3M NaCl,0.2Mリン酸一ナトリウム、0.02MED
TA）とした。また洗いの条件は２×SSC,0.1％SDS、温度
を65度,40min×２とした。
このスクリーニングの結果、rDC−22DNAプローブとハ
イブリダイズするクローンを得、このクローンをλrCNP
21と命名した。
イブリダイズするクローンを得、このクローンをλrCNP
21と命名した。
C.λrCNP21ファージの解析及び塩基配列の決定 まず常法に従いλrCNP21ファージからDNAを調製し
た。このDNAを制限酵素EcoR Iで切断した結果、λrCNP2
1は約1kbpのcDNAを含んでいることが判った。最終的なc
DNAの解析は、この1kbpのDNA断片を一旦M13ファージに
サブクローニングし、ジデオキシ法でこのDNA塩基配列
を決定することにより行った。第２図にこのようにして
決定したcDNAの塩基配列と、このDNA塩基配列から予想
されるアミノ酸一次配列を示した。
た。このDNAを制限酵素EcoR Iで切断した結果、λrCNP2
1は約1kbpのcDNAを含んでいることが判った。最終的なc
DNAの解析は、この1kbpのDNA断片を一旦M13ファージに
サブクローニングし、ジデオキシ法でこのDNA塩基配列
を決定することにより行った。第２図にこのようにして
決定したcDNAの塩基配列と、このDNA塩基配列から予想
されるアミノ酸一次配列を示した。
［発明の効果］ 以上のように、本発明者らは、pDC−53をプローブと
して、ラット染色体遺伝子ライブラリーからrCNP遺伝子
の一部を単離し、さらにこれをプローブとして、rCNP前
駆体の全領域をコードするcDNAをラット脳由来のmRNAか
ら合成し、単離することに成功した。この結果、まず、
ラットにおいてもブタ同様CNPをコードする遺伝子が存
在することが明らかとなり、さらにrCNP前駆体タンパク
の全構造が決定された。rCNP前駆体タンパクは、ブタ同
様126個のアミノ酸残基からなり、そのＣ−末端には、
ブタ脳から単離されたpCNP−53およびpCNP−22に対応す
るアミノ酸配列が存在した。これらのペプチドのプロセ
シング部位のアミノ酸配列はブタとラットで完全に一致
することから、ラットにおいても本発明者らがすでに明
らかにしているブタ同様の生合成経路を経て、これらの
ペプチドが作られ、生体内の体液および血圧の恒常性を
調製するホルモンまたは神経伝達物質として作用するこ
とが予想される。
して、ラット染色体遺伝子ライブラリーからrCNP遺伝子
の一部を単離し、さらにこれをプローブとして、rCNP前
駆体の全領域をコードするcDNAをラット脳由来のmRNAか
ら合成し、単離することに成功した。この結果、まず、
ラットにおいてもブタ同様CNPをコードする遺伝子が存
在することが明らかとなり、さらにrCNP前駆体タンパク
の全構造が決定された。rCNP前駆体タンパクは、ブタ同
様126個のアミノ酸残基からなり、そのＣ−末端には、
ブタ脳から単離されたpCNP−53およびpCNP−22に対応す
るアミノ酸配列が存在した。これらのペプチドのプロセ
シング部位のアミノ酸配列はブタとラットで完全に一致
することから、ラットにおいても本発明者らがすでに明
らかにしているブタ同様の生合成経路を経て、これらの
ペプチドが作られ、生体内の体液および血圧の恒常性を
調製するホルモンまたは神経伝達物質として作用するこ
とが予想される。
また、rCNP前駆体をコードするcDNAを動物細胞で発現
させ、細胞外へ分泌されるタンパクあるいはペプチドを
単離、同定すれば、rCNP前駆体から生合成されるペプチ
ドのうちpCNP前駆体からは合成されえない３種の新規ペ
プチド（preprorCNPのアミノ酸一次配列番号24、30番目
のリジン、33番目のアルギニン残基のＣ−末端側がそれ
ぞれ特異的に切断されてできるもの。）の生理活性を調
べることができる。
させ、細胞外へ分泌されるタンパクあるいはペプチドを
単離、同定すれば、rCNP前駆体から生合成されるペプチ
ドのうちpCNP前駆体からは合成されえない３種の新規ペ
プチド（preprorCNPのアミノ酸一次配列番号24、30番目
のリジン、33番目のアルギニン残基のＣ−末端側がそれ
ぞれ特異的に切断されてできるもの。）の生理活性を調
べることができる。
また、本発明で特に注目すべきことは、rCNP−53およ
びrCNP−22の構造が同定され、それがブタのものとまっ
たく同一であることが明らかになった点にある。このこ
とは、いままでラットを用いて評価してきたpCNPの生理
活性が種差の影響を受けず正しく測定されたことを示す
ものである。さらに、ここで得たラットCNPをコードす
るcDNAを用いれば、ラットにおけるCNPの発現部位を正
確に調べることができる。
びrCNP−22の構造が同定され、それがブタのものとまっ
たく同一であることが明らかになった点にある。このこ
とは、いままでラットを用いて評価してきたpCNPの生理
活性が種差の影響を受けず正しく測定されたことを示す
ものである。さらに、ここで得たラットCNPをコードす
るcDNAを用いれば、ラットにおけるCNPの発現部位を正
確に調べることができる。
以上、本発明により明らかにされたrCNP前駆体タンパ
クのcDNAおよびアミノ酸一次配列の情報は、今後、哺乳
動物におけるCNPの生合成、生理作用のメカニズムを解
明する上で、さらに、CNPファミリーに属するペプチド
を医薬品へと応用する上で、多いに貢献するものであ
る。
クのcDNAおよびアミノ酸一次配列の情報は、今後、哺乳
動物におけるCNPの生合成、生理作用のメカニズムを解
明する上で、さらに、CNPファミリーに属するペプチド
を医薬品へと応用する上で、多いに貢献するものであ
る。
第1a図は、rCNP前駆体タンパクの染色体遺伝子（BamH I
DNA断片）の制限酵素地図及び塩基配列を決定した領域
（図中矢印で示した部分）を示す図である。 第1b図は、決定した塩基配列及びそこにコードされてい
るrCNP前駆体タンパクのアミノ酸一次配列を示す図であ
る。 第２図は、CNPcDNAの全塩基配列とこれにコードされるr
CNP前駆体タンパクのアミノ酸一次配列を示す図であ
る。
DNA断片）の制限酵素地図及び塩基配列を決定した領域
（図中矢印で示した部分）を示す図である。 第1b図は、決定した塩基配列及びそこにコードされてい
るrCNP前駆体タンパクのアミノ酸一次配列を示す図であ
る。 第２図は、CNPcDNAの全塩基配列とこれにコードされるr
CNP前駆体タンパクのアミノ酸一次配列を示す図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 寒川 賢治 宮崎県宮崎郡清武町加納甲1520番地の24 (72)発明者 南野 直人 大阪府吹田市青山台３丁目50，Ｄ―10― 303 (56)参考文献 特開 平４−74199（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂ ｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃ ｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｖ ｏｌ．170，Ｎｏ．２，（Ｊｕｌｙ31, 1990）ｐ．973−979 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/00 - 14/825 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ
Claims (6)
- 【請求項１】下記のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド。 - 【請求項２】請求項１記載のアミノ酸配列において、Ｎ
末端側の１位乃至49位のいずれか２個の隣接するアミノ
酸残基間が切断され、Ｎ末端のペプチドが欠損している
ポリペプチド。 - 【請求項３】下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド
をコードするDNA。 - 【請求項４】前記のDNAが下記に示される塩基配列であ
る請求項３記載のDNA。 - 【請求項５】下記のアミノ酸配列において、Ｎ末端側の
１位乃至49位のいずれか２個の隣接するアミノ酸残基間
が切断され、Ｎ末端のペプチドが欠損しているポリペプ
チドをコードするDNA。 - 【請求項６】下記の塩基配列を有するDNA。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02241074A JP3026352B2 (ja) | 1990-09-11 | 1990-09-11 | ラットＣＮＰｃＤＮＡ及び前駆体蛋白 |
| US07/757,606 US5973134A (en) | 1990-09-11 | 1991-09-11 | Rat CNP complementary DNA and precursor protein |
| DK91115393.0T DK0475394T3 (da) | 1990-09-11 | 1991-09-11 | Rotte C-type natriuretisk peptid cDNA, og precursorprotein |
| ES91115393T ES2104639T3 (es) | 1990-09-11 | 1991-09-11 | Adnc para un peptido natriuretico de tipo c de rata, y proteina precursora. |
| DE69126487T DE69126487T2 (de) | 1990-09-11 | 1991-09-11 | cDNA für Ratten C-Typ natriuretisches Peptid und Vorläuferprotein |
| AT91115393T ATE154387T1 (de) | 1990-09-11 | 1991-09-11 | Cdna für ratten c-typ natriuretisches peptid und vorläuferprotein |
| EP91115393A EP0475394B1 (en) | 1990-09-11 | 1991-09-11 | Rat C-type natriuretic peptide cDNA and precursor protein |
| GR970402222T GR3024580T3 (en) | 1990-09-11 | 1997-08-29 | Rat C-type natriuretic peptide cDNA and precursor protein |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02241074A JP3026352B2 (ja) | 1990-09-11 | 1990-09-11 | ラットＣＮＰｃＤＮＡ及び前駆体蛋白 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04121190A JPH04121190A (ja) | 1992-04-22 |
| JP3026352B2 true JP3026352B2 (ja) | 2000-03-27 |
Family
ID=17068911
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02241074A Expired - Lifetime JP3026352B2 (ja) | 1990-09-11 | 1990-09-11 | ラットＣＮＰｃＤＮＡ及び前駆体蛋白 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5973134A (ja) |
| EP (1) | EP0475394B1 (ja) |
| JP (1) | JP3026352B2 (ja) |
| AT (1) | ATE154387T1 (ja) |
| DE (1) | DE69126487T2 (ja) |
| DK (1) | DK0475394T3 (ja) |
| ES (1) | ES2104639T3 (ja) |
| GR (1) | GR3024580T3 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| IL142118A0 (en) * | 2001-03-20 | 2002-03-10 | Prochon Biotech Ltd | Method and composition for treatment of skeletal dysplasias |
| EP3446711A1 (en) | 2004-03-31 | 2019-02-27 | Kazuwa Nakao | Composition for increasing body height |
| ES2465141T3 (es) | 2004-03-31 | 2014-06-05 | Kazuwa Nakao | Remedio o medicamento preventivo para la artritis |
| PL3404102T3 (pl) | 2004-04-21 | 2021-12-13 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Koniugaty do dostarczania do kości i sposób ich wykorzystania do nakierowywania białek na kość |
| CA2823066A1 (en) | 2010-12-27 | 2012-07-05 | Alexion Pharma International Sarl | Compositions comprising natriuretic peptides and methods of use thereof |
| US10052366B2 (en) | 2012-05-21 | 2018-08-21 | Alexion Pharmaceuticsl, Inc. | Compositions comprising alkaline phosphatase and/or natriuretic peptide and methods of use thereof |
| US10822596B2 (en) | 2014-07-11 | 2020-11-03 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for treating craniosynostosis |
| RU2708068C2 (ru) | 2014-12-05 | 2019-12-04 | Алексион Фармасьютикалз, Инк. | Лечение судорог с использованием рекомбинантной щелочной фосфатазы |
| JP6868561B2 (ja) | 2015-01-28 | 2021-05-12 | アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | アルカリホスファターゼ欠損を有する被験者を治療する方法 |
| CN108350440A (zh) | 2015-08-17 | 2018-07-31 | 阿雷克森制药公司 | 碱性磷酸酯的制造 |
| EP3355904A4 (en) | 2015-09-28 | 2019-06-12 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | IDENTIFICATION OF EFFECTIVE DOSE SHEETS FOR TISSUE-SPECIFIC ALKALINE PHOSPHATASE ENZYMERSAT THERAPY OF HYPOPHOSPHATASIA |
| WO2017074466A1 (en) | 2015-10-30 | 2017-05-04 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating craniosynostosis in a patient |
| US11065306B2 (en) | 2016-03-08 | 2021-07-20 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating hypophosphatasia in children |
| US10898549B2 (en) | 2016-04-01 | 2021-01-26 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating hypophosphatasia in adolescents and adults |
| EP3436052A4 (en) | 2016-04-01 | 2019-10-09 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | TREATMENT OF MUSCLE WEAKNESS USING ALKALINE PHOSPHATASES |
| WO2017214130A1 (en) | 2016-06-06 | 2017-12-14 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Metal impact on manufacturing of alkaline phosphatases |
| JP7018933B2 (ja) | 2016-08-18 | 2022-02-14 | アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | 気管気管支軟化症の治療方法 |
| US11224637B2 (en) | 2017-03-31 | 2022-01-18 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating hypophosphatasia (HPP) in adults and adolescents |
| WO2019190752A1 (en) | 2018-03-30 | 2019-10-03 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Manufacturing of glycoproteins |
Family Cites Families (1)
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|---|---|---|---|---|
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-
1990
- 1990-09-11 JP JP02241074A patent/JP3026352B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-09-11 DK DK91115393.0T patent/DK0475394T3/da active
- 1991-09-11 ES ES91115393T patent/ES2104639T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-11 AT AT91115393T patent/ATE154387T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-09-11 EP EP91115393A patent/EP0475394B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-11 US US07/757,606 patent/US5973134A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-11 DE DE69126487T patent/DE69126487T2/de not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-08-29 GR GR970402222T patent/GR3024580T3/el unknown
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌ．１７０，Ｎｏ．２，（Ｊｕｌｙ３１，１９９０）ｐ．９７３−９７９ |
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| EP0475394A3 (en) | 1992-09-16 |
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| JPH04121190A (ja) | 1992-04-22 |
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| ES2104639T3 (es) | 1997-10-16 |
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| DK0475394T3 (da) | 1997-07-07 |
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