JPH04121190A - ラットＣＮＰｃＤＮＡ及び前駆体蛋白 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、ラットＣＮ　Ｐ　（ｒｓｔ　Ｃ１ｙｐｅ　ｎ
ｔｔｒｉｏｒｅｐｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ；ｒｃＮＰ）を
コードするｃＤＮＡ及びこのｃＤＮＡにコードされてい
るｒＣＮＰ前駆体タンパク（ｐｒｅｐｒｏ　ｒＣＮＰ）
に関する。

発明の背景 近年、各種動物の心房及び脳から、ナトリウム利尿ペプ
チド（＋＋１ｔｒｉ＋＋ｒｅｔｉｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ；
　ＨＰ）とよばれる種々のペプチドが発見されてきた。

現在これらＮＰは、アミノ酸−次配列の類似性及びその
前駆体構造から、３つのタイプ、すなわちＡ型ＮＰ　（
Ａ−ｔｒｐｅ　ｎ１ｔｒｉ＋＋ｒｅｔｉｅ　ｐｅｐｔｉ
ｄｅ；ムＮＰ）　、　ＢｆｆｉＮ　Ｐ　（Ｂ−ｔｙｐｃ
ｍｉｔｒｉｕｒｅＬｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ；　ＩＮＦ）
及びＣ型Ｎ　Ｐ　（Ｃ−１ｙｐｅ　ａａｔｒｉｗｒｅｔ
ｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ；　ＣＮＰ）のいずれかに分類す
ることができる。このうち、ＡＮＰ−ＢＮＰは最初それ
ぞれ心房、脳から単離同定されたことから、ＡＮＰは心
房性ナトリウム利尿ペプチド（Ｎｒｉｘｌ　ａａｔｒｉ
ｗｒｅｔｉｃ　ｐｅｐＬｉｄ＠）、ＢＮＰは脳ナトリウ
ム利尿ペプチド（ｂｒａｉｎ　ａａｔｒｉｗｒｅｔｉｃ
　ｐｅｐｔｉｄｅ）とも呼ばれている（Ｍａｌｓｕｏ、
Ｈ。

ａｎｄ　　Ｎｏｋａｘａｔｏ、Ｈ，Ｅ＋＋ｄｏｃｒｉ＋
＋ｏ１．Ｍｅｌｂ、Ｃｌ１ｎ、ＮｏｒｔｂＡｍ、、＋６
．４３．１９ｇ７；　５ａｄｏｈ、Ｔ、ｅｊ　ａｌ、Ｎ
ｏｔｗｒｅ、！！！、７８゜１９８８）。しかし、現在
ＡＮＰは心房のみならず脳にも存在していること、同様
にＢＮＰは脳のみならず心房にも存在していることが判
ってきた。また、ＡＮＰ−ＢＮＰはいずれも顕著なナト
リウム利尿作用及び血圧降下作用を示すことから、ＡＮ
Ｐ−ＢＮＰはいずれも心房から血中へ分泌されるホルモ
ンとしてのみならず、脳内においては神経伝達物質とし
ても作用し、哺乳類の体液量及び血圧の恒常性を調節し
ていることが明らかになってきた。

一方、ＧＮＰはごく最近Ｓ＋＋＋ｌ＋にらにより、ＡＮ
Ｐ−ＢＮＰのいずれにも帰属されない第３のタイプに分
類されるＮＰとしてブタ脳から単離・同定されｆ＝　　
（Ｓｕｄｏｈ、Ｔ、ｅｔ　　１１．Ｂｉｏｃｈｕｉ、Ｂ
ｉｏｐｂｙｓ、Ｒｅｓ。

Ｃｏｔａ＋＋＋＋、、ｌ’６Ｂ、＄０．１９９０）　。

すなわち、まず最初に発見されたＧＮＰは２２アミノ酸
残基より成り、（なお、本明細書においてこのペプチド
を以下ｐＣＮＰ−２２と略す）、ＡＮＰ−ＢＮＰと同様
２個のシスティン残基を含んでおり、これが分子内でジ
スルフィド結合を形成し、１７アミノ酸残基より構成さ
れた環状構造を持っている。しかもこの環状構造を形成
しているアミノ酸−次配列にはＡＮＰ−ＢＮＰのそれら
と高い相同性が見いだされた。

しかしｐＣＮＰ−２２は、ＡＮＰ−ＢＮＰがいずれも上
記環状構造のＣ−末端部分にさらに数個のアミノ酸が付
加したいわゆるテイル構造（ｔａｉｌ構造）を持ってい
るのに対し、このｔａｉｌ構造を持っていない。すなわ
ち、ｐＧＮＰ−２２のＣ−末端はシスティン残基で終わ
っている。このことから、ｐＣＮＰ−２２の構造はＡＮ
Ｐ−ＢＮＰと似ているが、これらとは全く異なっている
ことが判った。

さらに、ｐＣＮＰ−２２はナトリウム利尿作用及び血圧
降下作用を示し、かつヒヨコ直腸標本を用いた弛緩活性
でＡＮＰ−ＢＮＰに比べ高い比活性を示すことが判った
ことから、ｐＣＮＰ−２２は新しいタイプに帰属される
ＮＰであることが判り、このタイプに属するペプチドは
ＧＮＰと命名されｔ；。

また、ｐＧＮＰ−２２に続き、本発明者らにより、ＧＮ
Ｐに帰属される第２のペプチドがブタ脳から単離・同定
された。このペプチドはｐｃＮｐ−２２をＣ−末端に含
む５３アミノ酸残基から成るペプチドであることが判っ
た（以下、本明細書においてこのペプチドをｐＧＮＰ−
５３と略す）。

言い換えれば、ｐＧＮＰ−５３はｐｃＮＰ−２２のＮ−
末端にさらに３１個のアミノ酸残基が付加したペプチド
であることが判った。なお、興味あることにブタ脳では
ｐＣＮＰ−５３がｐＧＮＰ−２２より多く存在している
ことが明らかにされている（特願平２−１８６５８２）
。

さらに、ごく最近の研究で、ｐＣＮＰ−２２，１）ＧＮ
Ｐ−５３の前駆体タンパクの構造が遺伝子の解析から明
らかにされ、これらペプチドの生合成構造についても明
らかにされてきた（特願平２−１８６５８３）。すなわ
ち、本発明者らｊこより、ｐＣＮＰ−２２、ｐＣＮＰ−
５３をコードするブタ染色体遺伝子及びｃＤＮＡが単離
・同定され、この解析から、ブタＧＮＰ前駆体タンパク
（ｐｒｓｐｒａｐｃＮＰ）の構造が明らかにされると共
に、ｐＣＮＰ−２２、ｐＣＮＰ−５３は最初１２６アミ
ノ酸残基からなる一ｐｒｏｐｃＮＰとしてｍＲＮＡから
翻訳され、次ｊ；このＮ−末端領域に存在するシグナル
ペプチドが公認過程で切断されｐｒｏｐｃＮＰに転換さ
れ、さらにｐｒｅｐｒｏｐｃＮＰはプロセシング酵素に
より特異的に切断されることによりｐＣＮＰ−５３とｐ
ＣＮＰ−２２に転換されることが判った。

以上のことから、ｐＧＮＰ−２２及びｐｃＮｐ−５３に
ついてもＡＮＰ　−ＢＮＰ同様共通の前駆体タンパク（
ｐｒｅｐｒｏｐｃＮＰ）から生合成される分泌ペプチド
であることが判った。

しかしながら、現在までの研究でＡＮＰ　−ＢＮＰに帰
属されるペプチド類がいずれも心房から血中に分泌され
るホルモンとしてのみならず、脳内においては神経伝達
物質として作用し、体液量及び血圧の恒常性をｌｌｓし
ていることが判っているのに対し、ＧＮＰの詳細な生体
内分布及び生理作用に関しては不明な点が多い。

また、ＡＮＰ　−ＢＮＰに関しては、現在までにラット
の構造が明らかにされ、ラットＡＮＰ、ラットＢＮＰを
用いたラットでの生理作用が明らかにされており、種差
による影響を排除した薬効評価がなされているが、ＧＮ
Ｐに関しては、現在までのところ、ラットにおける構造
が明らかにされていない。

本発明が解決すべき課題 従って本発明は、ラットにおけるＣＮＰ　（ｒＣＮＰ）
構造、特にｐｃＮＰ−２２、ｐｃＮＰ−５３に対応する
ラットＧＮＰ構造を明らかにすると共に、この前駆体タ
ンパク（ブタにおけるｐｒｅｐｌ’０ｐｃＭＰに対応す
る）の構造をも明らかにすることを目的とする。

課題を解決するための手段 本発明者らは、ＡＮＰのアミノ酸配列およびそれをコー
ドする遺伝子の塩基配列が各種動物間で強く保存されて
いることから、ＧＮＰの場合も同様の可能性が高いと考
えた。そこで、本発明者らは、先にブタＧＮＰの染色体
遺伝子あるいはｃＤＮＡを単離するのに用いたＤＮＡプ
ローブ（ｐＤＣ−５３）を用いｒＣＮＰのｃＤＮＡを単
離し、これを解析することによりｒＣＮＰ前駆体タンパ
クの構造を明らかにすることを計画した本発明では、ま
ずｐＤＣ−５３をＤＮＡプローブとして用い、ラット染
色体遺伝子ライブラリー（λ７アージにラット染色体遺
伝子断片を組み込んだもの）をスクリーニングしたとこ
ろ、ｐＤＣ−５３に弱い条件下でハイブリダイズ（ｋｙ
ｂｒｉｄｉ＊ｅ）するクローンが５つ得られた。このう
ちの１つのクローン（λｒｃＮＰＧ３）を解析したとこ
ろ、λｒ　ＣＮ　Ｐ　Ｇ　３は約１４ｔｃｂｐのラット
染色体遺伝子を含んでおり、またこの１４ｋｂｐのうち
約２．１ｋｂｐからなるＢｉｓ＋Ｉ［Ｉ　ＤＮＡ断片が
ｐＤＣ−５３ＤＮＡプローブとｋｙｂｒｉシｉｘｅする
ことが判った。そこでこの約２．１ｋｂｐからなるＢ＊
ａ＋ＩＩＩ　ＤＮＡ断片の一部の塩基配列を決定したと
ころ、このＤＮＡが、ｒ　ＣＮＰ遺伝子をコードするこ
とが明らかとなった。

なお、このＢ！ＩＩＩ　＋断片の制限酵素地図及び塩基
配列を決定した領域を第１ａ図に、また決定しｔ；塩基
配列及びそこにコードされるアミノ酸配列を第１ｂ図に
示した。

次にこのＤＮＡ断片からＳ＋ｉａ　ＩおよびＭＶ＆　！
制限酵素で切り出されるｒＣＮＰ−２２をコードする１
５０ｂｐのＤＮＡ断片（以下このＤＮＡ断片をｒＤＣ−
２２と略す。）をプローブとして用い、ラット脳ｃＤＮ
Ａライブラリーをスクリーニングした。

この結果ｒＤＣ−２２にｈｙｂｒｉｄｉｒｅする２２債
のクローンが得られ、このうち最も長いｃ　ＤＮＡ（約
Ｉ　　Ｋｂｐ）を持つクローンはλｒＣにＰａｌである
ことが判った。そこで次にこのλｒＣＮＰ！ｌがもつ約
１ｋｂｌ）のｃＤＮＡ断片の全塩基配列を決定した。

この結果、第２図に示すようにこのｃＤＮＡ断片はｒ　
ＣＮＰ前駆体タンパクの全アミノ酸配列をコ−ドしてる
ことが判っｔ二。

すなわち、まずこのＤＮＡ断片には塩基配列番号ｌから
３に存在するＡＴＧから始まる長いオープンリーディン
グフレームが存在しており、このＡＴＧは、ｃＤＮＡの
中で最初に現れるメチオニンコドンであり、しかもこの
コドンの回りの塩基配列は真核生物で知られている翻訳
開始コドンのフンセンサスシーフェンスＡ／Ｇ　ＮＮＡ
ＴＧ　（Ｎはム、Ｔ、Ｇ、Ｃ。

いずれかの塩基を示す）と一致していることから、本発
明者らはこのＡＴＧがｒＣＮＰ前駆体の翻訳開始コドン
であると推定した。このオープンリーディングフレーム
には１２６アミノ酸残基からなるポリペプチドがコード
されていることが判った。また、このアミノ酸−次配列
を、ｐｃＮＰ前駆体のそれと比較すると非常によく一致
していることが判った。このことから本発明者らは、得
られたＣＤＮＡが間違いなくｒＣＮＰをコードするｃＤ
ＮＡであることを確信した。

以上、本発明者らは、ｒｃＮＰｃＤＮＡを単離し、それ
を解析することにより、ｒ　ＣＮＰ前駆体タンパクが第
２図に示すアミノ酸−次配列を持っ１２６アミノ酸残基
からなるポリペプチドであること明らかにすることに成
功した。このようにして明らかにされたｒＣＮＰ前駆体
タンパク（以降、本発明では、ｐｒｅｐｒｏｒＣＮＰと
略す。）のアミノ厳−次配列のＣ−末端領域には、ブタ
脳から最初に構造決定されたｐＣＮＰ−２２およびｐＣ
ＮＰ−５３に対応する配列であるラットＧＮＰ−２２（
ｒＣＮＰ−２２；第２図アミノ酸配列番号１０５から１
２６番目）及びラー／トＣＮＰ−５３（ｒｃＮＰ−５３
；第２図アミノ酸配列番号７４から１２６番目）が存在
し、しかもｐＧＮＰ−２２とｒＣＮＰ−２２およびｐＣ
ＮＰ−５３とｒＣＮＰ−５３のアミノ酸配列はそれぞれ
完全に一致していた。なお、これらのペプチドが合成さ
れるためには、前駆体からのプロセシング酵素による切
断が不可欠と考えられるが、このプロセシングが起こる
と考えられるｐｒｅｐｒｏｒＣＮＰのＣ−末端から２２
番目付近、及び５３番目付近のアミノ酸配列がラットと
ブタで完全に一致していることからラット脳においても
ｒＣＮＰ−２２あるいはｒＣＮＰ−５３が合成されてい
る可能性は極めて高いといえる。また％　ｐｒｅｐｒｏ
ｒｃＮＰのＮ−末端領域には、これもブタ同様、疎水性
アミン憩残基に富む領域（第２図アミノ酸−次配列番号
１０から１６番目）が存在していることがら、ｐｒｅｐ
ｒｏｒｃＮＰのＮ−末端領域には分泌に必要なシグナル
ペプチドが存在している可能性が高い。

以上のことを総合的に考えると、ｒＣＮＰ−２２、ｒＣ
Ｎｊ−５３は以下に述べる経路で生合成されることが推
定される。すなわち、まず１２６アミノ酸残基からなる
ｐｒｅｐｒｏｒｃＮＰがｍＲＮＡから翻訳される。次に
このＮ−末端領域に存在するシグナルペプチドが分泌過
程で切断されｐｒｏｒｃＮＰに転換される。さらに、ｐ
ｒｏｒＣＮＰはプロセシング酵素により特異的に切断さ
れ（第２図アミノ酸配列番号で７３と７４の間、１０４
と１０５の間）、ｒＣＮＰ−５３とｒＣＮＰ−２２に転
換される。

以上まとめると、本発明者らはｒＣＮＰ　（ｒＣＮＰ−
２２、ｒＣＮＰ−５３）前駆体タンパクをコードするｃ
ＤＮＡを単離し、これを解析するこトニヨってｒＣＮＰ
前駆体タンパクのアミノ酸−次配列を明らかにすると共
に、ブタｃＮＰ　（ｐＣＮＰ−５３、ｐＣＮＰ−２２）
に対応するラットＧＮＰ　（ｒＣＮＰ−５３、ｒＣＮＰ
−２２）の構造をも明らかにすることに成功し、本発明
を完成させた。

以下、実施例により本発明の詳細な説明する。

４℃に保存されたラット染色体遺伝子ファージＤＮＡラ
イブラリー（Ｃｌｏａｅｔｅｅｋ社製）を大腸菌に１２
株由米ＬＥ３９２に感染させ、ＬＢ培地（１０（Ｂｉｅ
…ｒ７ｐｔｏｍｅ、５１　Ｙｅａｓｔ　ｔｘＬｒｓｃＬ
、ｆ　Ｎ５ＣＩ。

１．５％ｌ１ａｃｔｏＢｉｒ全量１１）に拡げ、３７℃
で一夜培養した。プレートを４℃で３０分間冷却した後
、７アジプラーク上にニトロセルロースフィルターＣ５
ｋ１ｇｉｅｋｅｒ　＆　５ｃｂｕ１１社製〕を５分間放
置した。

次にこのフィルターをプレートからはがし、風乾後アル
カリ変性液（０，５１ＮｉＯＨ，１，５Ｍ　Ｎ＊Ｃ１）
に１分間浸し、次に中和液（０，ＳＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ　ｐＨ７，０゜１．５ＭＮ＆ＣＩ）に１分間浸した。

その後、３ＸＳＳＣ溶液（２０ｘＳＳＣＮｉＯＨ１７５
，３ｇ、クエン酸三ナトリウム　１Ｌ２Ｈ全量１１　）
でニトロセルロースフィルターをすすぎ、風乾後、減圧
下８０℃１２０分間熱処理を行った。

このようにして調製したニトロセルロースフィルターを
用い、以下に示す条件でプラークハイプリダイゼーシ膳
ンを行った。すなわち、ニトロセルロースフィルターを
プレハイブリダイゼーシ曹ン液［３ＸＳＳＣ，５Ｘデン
ハート液（アルブミン、ポリビニルピロリドン、フィコ
ール、各々１１ｇ／鳳１）。

サケ精子ＤＤＮＡ１００Ｊ／層１１３０％ホルムアミド
、０．１％ＳＤＳ］に加え３７℃にて２時間プレハイブ
リダイゼーシ１ンを行った。次に２枚のニトロセルロー
スフィルターあたり、前記ｐＤＣ−５３ＤＮＡプローブ
（このＤＮＡプローブの作製は本発明者等により、特願
平２−１８６５８３に記載されている）を１００万Ｃｐ
Ｉ１１．及び前記プレハイブリダイゼーンヨン溶液１　
鱈を用い、３７℃にて一部ハイブリダイゼーションを行
った。

次にこのフィルターをＯ６１％ＳＤＳを含む３×ＳＳＣ
溶液で４０℃４０分間２回、５５℃３０分間１回洗浄後
、風乾し、オートラジオグラフィーを一８０℃で一昼夜
行った。このようにして約５０万クローンをスクリーニ
ングすることによりｐＤＣ−５３ＤＮＡプローブと／ｈ
イブリダイズするクローンが８個得られた。これらのク
ローンのうちの一つをλｒ　ＣＮ　Ｐ　Ｇ　３と命名し
、以後の解析を行った。

まず常法に従いλｒＣＮＰＧ３ファージからＤＮＡを調
製した。次に、この７７−ジＤＮＡを制限酵素Ｂａ５ａ
ｌ　Ｉ、ＥｅｏＲＩ及びＰｓｔ　Ｉを用い切断し、切断
されたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離・解
析した。この結果、λｒｃＮＰＧ３は約１４ｋｂｐのラ
ット染色体遺伝子を含む７アージであることが判った。

また、ｐＤＣ−５３ＤＮＡプローブを用い、サザンプロ
ット解析を行った結果、約１１ｋｂｐのＢ１鳳ＩＩ　Ｉ
　ＤＮＡ断片、約１９ｋｂｐのＥｅｏＲＩＤＮＡ断片、
約１．１ｓｈｂｐのＰｓｔ　ＩＤ　Ｎ　Ａ断片がｐＤＣ
−５３ＤＮＡプローブとハイブリダイズすることが判っ
た。そこで、ｐＤＣ−５３ＤＮＡプローブとハイブリダ
イズするＢ直■ＨＩ　（！、１ｋｂＰ）ＤＮＡ断片の一
部の塩基配列を、以下に示す方法で決定した。

Ｂ、　Ｂ１ｍ１［Ｉ　ＤＮＡ断片の塩　配列決定まず、
ＩｌｔｍＨＩ　ＤＮＡ断片の塩基配列を決定するために
、−旦、ｌ１１ｍ１ｌ　Ｉ　ＤＮＡ断片をプラスミドベ
クターｐＵＣ１８（宝酒造）の１１鳳Ｈｌサイトにサブ
クローニングした。得られたプラスミド（ＰＵＣｒＣＮ
ＰＧ３）から、ｐＤＣ−５３ＤＮＡプローブとに７ｄｒ
ｉｄｔｓｅするＤＮＡ断片Ｓｍｓ　Ｉ　ＸｂｉＩフラグ
メント（４５０ｂ　ｐ）を単離し、７ア一ジベクターＭ
　１３　ｍ　ｐ　１　ｇ及び１９にサブクロニングした
。得られた一本鎖ＤＮＡ断片を１ｅａｐｌａｔｅにして
Ｕｉｉマｅｒｓ＊ｌプライマーを用い、ジテオキン法［
５ＥＱＵＥＮＡＳＥ（Ｕ＋＋１ｔｅｄ　５（Ｎｔｓ　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃ＊ＩＣｏｒｐｏｒｓ目ｏｎ）、シーク
エンスキット（宝酒造）コでＤＮＡ塩基配列を決定した
。以上の方法で決定した塩基配列及びこの塩基配列から
予想されるアミノ酸配列を第１ｂ図に示した。

実施例３．ＤＮＡプローブ（ｒＤＣ−２２）の作製 ｒ　ＣＮＰ前駆体タンパクをコードするｃＤＮＡをクロ
ーニングするために用いるＤＮＡプローブ（ｒＤＣ−２
２）の作製は、前記のプラスミドｐＵＣｒＣＮＰＧ３を
制限酵素Ｓｍｍ　＋及びＭｖａ　Ｉで切断し、目ｂｐＤ
　Ｎ　Ａ断片を単離、このＤＮＡを［ａ　−”ｐ　］　
ｄｃＴＰを用い、マルチプライムラベリングキット（宝
酒造）で放射標識することにより作製した。

ラット脳２．７ｇからグアニジン−チオシアネート法を
用い、全ＲＮＡ　（ｔ＋ｔ＊ｌ　ＲＮＡ）　１２９ＳＪ
ｇを抽出単離した。次に、このｔｏｔｉｌ　ＲＮＡ　Ｎ
９５Ｊ１ｇからオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用い
、ｐｏｌｙ（＾）＋ＲＮＡを約８４　μｇ調製した。続
いて、４　月のｐｏｌｙ（＾）＋　ＲＮ　Ａを用いて、
ＧｕｂｌｅｒとＨｏｆｆｍｘｎの方法（Ｇｕｂｌｅｒ、
Ｕ、ｃｌ　ｘｌ、Ｇｅｎｅ、２５，２６３．１９８３）
により２重鎖ｃＤＮＡを作製した。得られたｃ　ＤＮＡ
に１３塩基からなるＥｃｏＲＩアダプターをライゲート
し、これらを１％アガロースゲル電気泳動を用いてサイ
ズ分画した。このようにして得られた３００−１５００
塩基対からなるｃＤＮＡをファージλｇｔ１０アームに
ライゲートし、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｐｉｃｋｉｔｉｕに
より１　ｐ　ｇ　ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮ　Ａ当たり、４
．７−１１．１Ｘ１０’個の１ｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　
ｅｌｏ＋＋ｅからなるｃＤＮＡライブラリーを作製した
。

Ｂ、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング得られたｃ
ＤＮＡライブラリーの中の約６ＸＩＯ’クローンを実施
例４で作製したｒＤＣ−２２ＤＮＡプローブを用いスク
リーニングした。方法は、実施例２で示したものと同様
であるが、菌体はｃ６００ｈｆｌを使用、ハイブリダイ
ゼーション溶液中のホルムアミドの濃度は５０％また塩
は５ＸＳＳＰＥ（２０Ｘ　５ＳＰＥ、３Ｍ　ＮａＣ１，
０，２Ｍリン酸−ナトリウム、０．０２＋ＩＩＥＤＴＡ
）　トした。また洗いの条件は２ＸＳＳＣ，０，１％Ｓ
ＤＳ。

温度を６５℃、４０ｍ＋ａＸ２とした。

このスクリーニングの結果、ｒＤＣ−２２ＤＮＡグロー
ブとハイブリダイズするクローンを得、このクローンを
λｒｃＮＰ２１と命名した。

Ｃ１λｒｃＮＰ２１フアージの解析及び塩基配列へ１友 まず常法に従いλｒｃＮＰ２１７アージからＤＮＡを調
製した。このＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ＋で切断した結
果、λｒｃＮＰ２１は約１　ｋｂｐのｃＤＮＡを含んで
いることが判った。最終的なｅＤＮＡの解析は、この１
　ｋｂｐのＤＮＡ断片を−ＨＭ１３ファージにサブクロ
ーニングし、ジデオキシ法でこのＤＮＡ塩基配列を決定
することにより行った。第２図にこのようにして決定し
たｃＤＮＡの塩基配列と、このＤＮＡ塩基配列から予想
されるアミノ酸−次起動を示した。

［発明の効果］ 以上のように、本発明者らは、ｐＤＣ−５３をプローブ
として、ラット染色体遺伝子ライブラリーからｒＣＮＰ
遺伝子の一部を単離し、さらにこれをプローブとして、
ｒＣＮＰ前駆体の全領域をコードするｃＤＮＡをラット
脳由来のｍＲＮＡから合成し、単離することに成功した
。この結果、まず、ラットにおいてもブタ同様ＧＮＰを
コードする遺伝子が存在することが明らかとなり、ざら
にｒＣＮＰ前駆体タンパクの全構造が決定された。

ｒＣＮＰ前駆体タンパクは、ブタ同様１２６個のアミノ
酸残基からなり、そのＣ−末端には、ブタ脳から単離さ
れたｐＧＮＰ−５３および９ＣＮＰ−２２に対応するア
ミノ酸配列が存在した。これらのペプチドのプロセシン
グ部位のアミノ酸配列はブタとラットで完全に一致する
ことから、ラットにおいても本発明者らがすでに明らか
にしているブタ同様の生合成経路を経て、これらのペプ
チドが作られ、生体内の体液および血圧の恒常性を調製
するホルモンまたは神経伝達物質として作用することが
予想される。

また、ｒ　ＣＮＰ前駆体をコードするｃＤＮＡを動物細
胞で発現させ、細胞外へ分泌されるタンパクあるいはペ
プチドを単離、同定すれば、ｒＣＮＰ前駆体から生合成
されるペプチドのうちｐＣＮＰ前駆体からは合成されえ
ない３種の新規ペプチド（＋）ｒｅｐｒｏｒｃＮＰのア
ミノ酸−次配列番号２４．３０番目のリジン、３３番目
のアルギニン残基のＣ−末端側がそれぞれ特異的に切断
されてできるもの。）の生理活性を調べることができる
。

また、本発明で特に注目すべきことは、ｒＣＮＰ−５３
およびｒＣＮＰ−２２の構造が同定され、それがブタの
ものとまったく同一であることが明らかになった点にあ
る。このことは、いままでラットを用いて評価してきた
ｐＧＮＰの生理活性が種差の影響を受けず正しく測定さ
れたことを示すものである。さらに、ここで得たラット
ＧＮＰをコードするｃＤＮＡを用いれば、ラットにおけ
るＣＮＰの発現部位を正確に調べることができる。

以上、本発明により明らかにされたｒＣＮＰ前駆体タン
パクのｃＤＮＡおよびアミノ酸−次配列の情報は、今後
、哺乳動物におけるＣＮＰの生合成、生理作用のメカニ
ズムを解明する上で、さらに、ＧＮＰ７７ミリーに属す
るペプチドを医薬品へと応用する上で、多いに貢献する
ものである。

【図面の簡単な説明】

第１ａ図は、ｒｃＮＰ前駆体タンパクの染色体遺伝子（
ＢＪＩＨＩ　ＤＮＡ断片）の制限酵素地図及び塩基配列
を決定した領域（図中矢印で示した部分）を示す図であ
る。 第１ｂ図は、決定した塩基配列及びそこにコードされて
いるｒＣＮＰ前駆体タンパクのアミノ酸−次配列を示す
図である。 第２図は、ＣＮＰｃＤＮＡの全塩基配列とこれにコード
されるｒ　ＣＮＰ前駆体タンパクのアミノ酸−次配列を
示す図である。 代　理　人　弁理士　　湯　浅　恭　三−〉τ−ヒー二
＝９ （外４名）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド。 【アミノ酸配列があります。】
2. （２）請求項第１項記載のアミノ酸配列においてＮ末端
   からシグナルペプチドが欠損しているポリペプチド。
3. （３）請求項第１項記載のアミノ酸配列においてＮ末端
   の１位及至７３位何れか２個の隣接するアミノ酸残基間
   が切断され、Ｎ末端のペプチドが欠損しているポリペプ
   チド。
4. （４）下記のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
   ドするＤＮＡ。 【アミノ酸配列があります。】
5. （５）前記のＤＮＡが下記の塩基配列を有する請求項第
   ４項記載のＤＮＡ。 【塩基配列があります。】
6. （６）下記のアミノ酸配列においてＮ末端からシグナル
   ペプチドが欠損しているポリペプチドをコードするＤＮ
   Ａ。 【アミノ酸配列があります。】 【アミノ酸配列があります。】
7. （７）下記のアミノ酸配列においてＮ末端側の１位乃至
   ７３位の何れか２個の隣接するアミノ酸残基間が切断さ
   れ、Ｎ末端のペプチドが欠損しているポリペプチドをコ
   ードするＤＮＡ。 【アミノ酸配列があります。】 【アミノ酸配列があります。】
8. （８）下記の塩基配列を有するＤＮＡ。 【塩基配列があります。】 【塩基配列があります。】 【塩基配列があります。】