WO2005094889A1

WO2005094889A1 - 関節炎症治療剤又は予防剤

Info

Publication number: WO2005094889A1
Application number: PCT/JP2005/006831
Authority: WO
Inventors: Kazuwa Nakao; Hidetomo Kitamura
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2004-03-31
Filing date: 2005-03-31
Publication date: 2005-10-13
Also published as: AU2005228817A1; EP1759710A4; KR20070017366A; EP1759710A1; US20100209958A1; CN1960758A; CN1960758B; CA2561530A1; AU2005228817B2; ES2465141T3; US8658373B2; CA2561530C; KR101207155B1; JPWO2005094889A1; US7642243B2; US20070197434A1; EP1759710B1; JP4825667B2

Abstract

　本発明は、変形性関節症などの関節炎症に対する新しい治療剤または予防剤を提供する。具体的には、本発明は、グアニルシクラーゼB（GC-B）活性化物質を有効成分として含むことを特徴とする、変形性関節炎症などの関節炎症の治療剤、予防剤または関節軟骨細胞増殖促進剤、あるいは、GC-Bを活性化することによる関節炎症の抑制方法又は関節軟骨細胞の増殖促進方法、あるいは、GC-Bの活性を指標とした関節軟骨細胞増殖促進剤又は関節炎症治療剤のスクリーニング方法を提供する。

Description

関節炎症治療剤又は予防剤

技術分野

本発明は、グァニルシクラーゼ B (以下「GC-B」とも称する）活性化物質による関節炎症、特に変形性関節症及びその類似関節炎症、の治療剤、予防剤又は関節軟骨増殖促進剤、あるいは該関節炎症の抑制方法、関節軟骨細胞の増殖促進方法に関する。本発明はさらに、 GC-B明の活性を指標とする、関節炎症治療剤又は関節軟骨細胞増殖促進剤のスクリ一二ング方法に関する。

書

発明の背景

関節炎症は、関節の炎症性疾患であり、症例数の最も多い疾患が慢性関節リウマチ及び変形性関節症（骨関節症）である。

慢性関節リゥマチは、自己免疫疾患と考えられており、関節の疼痛、こわばり、腫脹の症状を伴うが、病状が進行すると、しばしば変形性関節症様の関節軟骨表面の変性に導き、ついには関節の骨や軟骨の重度の破壊が起こる。

変形性関節症は高齢者において多発する関節軟骨の変性疾患である。変形性関節症（OA)とは、関節の構成要素の退行変性により、軟骨の破壊と骨、軟骨の増殖性変化を来たす疾患であり、さらに上記変化により二次的（続発性）に関節炎（滑膜炎）を来たすものである。変形性関節症は荷重関節である膝関節、肘関節および股関節にて多く認められるが（V irchows Arch 1996 ; 260 : 521-663)、肩関節 '肘関節 ·手関節のような非荷重関節においても発生が認められる。さらに顎関節においても同様の病態を示す顎関節症が知られている（ J Orofac Pa i n 1999； 13 (4) : 295-306)。

変形性関節症においては、軟骨はその機能本体である軟骨基質蛋白が減じるとともに、軟骨細胞数が減少していることが知られている（Arth Rheum 2002 ; 46 (8)：

1986-1996)。しかし、軟骨には血管が分布していないこと、軟骨細胞の数が少なく高度に分化していること、軟骨前駆細胞が乏しいこと、軟骨基質の代謝回転が遅いことなどの理由から、軟骨の自己再生能力は低く変形性関節症における関節軟骨基質と軟骨細胞数の減少が自然治癒する可能性は非常に低い（Novart i s Found. Symp. 2003； 249： 2-16) ₀ また、変形性関節症においては、軟骨変性とともに関節炎症も同時に生じ、関節疼痛の原因となっている（ J Rheumatol 2001；28 (6) : 1330-1337)。

慢性関節リウマチ、変形性関節症などの関節炎の治療剤 ·予防剤としては、例えばプロティンチロシンキナーゼインヒビター（特表平 11-512708号公報）、 N -ァシル化- 2 -ダルコスアミン誘導体（特表 2004-507490公報）、キノリン 'キナゾリン系誘導体（特開平 9-169646号公報）、などが報告されている。また、現在広く用いられている標準的な変形性関節症の治療剤は、経口で投薬される消炎鎮痛剤や、関節内に注射されるヒアルロン酸や副腎皮質ステロイドなどで、いずれも関節疼痛の抑制剤であり、関節軟骨変性に対する抑制作用を有する薬剤が求められている (Dec is ion Base 7, 2002) ₀

グァニノレシクラーゼ（GC) は、 GTP からセカンドメッセンジャーである c GMP の合成を触媒する酵素フアミリーに属する膜蛋白質であり、 GC-A, GC-B,■■· , GC-F が知られている。 GC-Bは主に血管内皮細胞に見出され、平滑筋の弛緩に関与すると考えられている。 GCを活性化する物質としてナトリウム利尿ペプチド（NP) が知られている。 NP 類は、 ANP (心房性ナトリゥムぺプチド）、 BNP (脳性ナトリゥム利尿ペプチド）および CNP (C型ナトリウム利尿ペプチド）の 3種類からなり、 2種類のグァニルシクラーゼ共役受容体（ANPおよび BNPに対する NPR-A、 CNPに対する NPR-B) を介して、細胞内 cGMP濃度を上昇させることにより、生物学的活性を示すと考えられている（Ann Rev Biochem 1991；60： 229-255)。

グァニルシクラーゼ共役受容体でない NPR-Cは、シグナル伝達に関与しない NP 類のクリアランス受容体として理解されている（Sc ience, 1987； 238： 675 - 678)。しかし、マウス骨髄マク口ファージをリポポリサッカライド（LPS)刺激したときのシクロォキシゲナーゼ 2 (C0X-2) 誘導によるプロスタグランジン E₂ (PGE₂)産生を亢進させる系において、 ANPおよび CNPが NPR - Cを介した細胞内 cAMP量低下作用にもとづいて ANPおよび CNPが PGE₂産生抑制作用を示すことが報告されており、

NPR-Cの NP類のシグナル伝達への関与が示唆されている（ Endocrinology 2002 ; 143 (3) : 846-852)。この文献では、マウス骨髄マクロファージ（BMM)の LPS刺激による PGE₂産生亢進に対して、 ANPが最大約 70%の抑制効果を示すのに対して、 CNP は最大約 20%の抑制効果であり、CNPの同作用が弱いことが記載されている。 cAMP や cGMPなどの cycl ic nucleot ideを介した C0X- 2の産生の制御は、細胞の種類や刺激の種類により促進/抑制と正反対の反応を取ることが知られているため、 CNP による B匪細胞での LPS誘導の PGE₂産生抑制がその他の細胞や刺激に対して適用できるかは不明である。また、 Endocrinology 2002 ; 143 (3)： 846-852 には、 ANP はマウスに LPSを投与して血中ト口ンボキサン B₂ (TXB₂)濃度が上昇する系において抑制効果を示すことが報告されており、同じ機序の cANFでは逆に亢進させるという相反する結果が得られている。またこの文献では ANPを関節炎や敗血症などの免疫関連疾患に適応することが記載されているものの、 CNP の関節疾患への適応について何ら言及していなレ、。従って CNPの関節炎症に対する作用については、現在まで全く知られていない。

NP類は、体液の恒常性の制御や血圧の調節に重要な役割を果たすと報告されているが（J Cl in Invest 1987； 93： 1911-1921 , J Cl in Invest 1994； 87 : 1402—1412)、心臓血管系以外の様々な組織での発現とその生理活性も知られている

(Endocrinol 1991； 129： 1104- 1106、 Ann Rev Biochem 1991；60： 553-575)。軟骨に関しては、 BNP (Pro Natl . Acad. Sc i. U. S. A. 1998； 95： 2337-2342) または CNP の過剰発現トランスジエニックマウスにおける成長軟骨の伸長と軟骨無形成症の治療への CNP の使用が報告されている（Nat Med 2004 ; 10 (1) : 80- 86、特開 2003-113116公報）。しかし、成長軟骨は石灰化を経て骨に置換されて最終的に消失する一時性軟骨であり、関節軟骨や気管軟骨のように、生涯にわたり存在する永久軟骨とは異なる生物学的性質を有することが知られている（Dev Biol 1989 ; 136 (2) : 500-507、 J Cel l Biol 2001； 153 (1)： 87-100)。さらに、永久軟骨である関節軟骨細胞に対する CNPの肥大化促進作用が in v itroで報告されているが

(J Biol Chem 2003；278 (21) : 18824-18832) ,正常動物の関節軟骨に対する in vivo での作用や変形性関節症における関節軟骨の変性破壊に対する作用や同疾患における関節炎症に対する作用については現在まで知られていない。

変形性関節症においては、関節軟骨は病態のごく初期にいったん肥大化して軟骨組織容量が増加するものの（J Rheum 1991 ; 18 (3) : 1905 - 1915)、病態の進展とともに軟骨基質の変性 ·破壊が進行して容量は減少する（Arthrit is Rheum 2004； 50 (2) : 476-487)。このとき、関節軟骨細胞の数はアポト一シスにより減少している（Arthritis Rheum 2004； 50 (2)： 507- 515)。一方、残存している個々の関節軟骨細胞は X型コラーゲンを発現して肥大軟骨細胞に分化し、一時性軟骨の性質をもつことが知られている（Arthrit is Rheum 1992 : 35 (7) : 806- 811)。また、関節軟骨の破壊に伴い関節炎症も生じており、臨床的に罹患関節における疼痛の要因であると考えられている（J Rheumatol. 2001； 28 (6)： 1330- 1337)。変形性関節症におけるこれらの変化の抑制、すなわち関節軟骨基質および関節軟骨細胞数の減少抑制又は復元、および関節炎抑制は、治療薬開発において有用であると考えられる。

本発明の目的は、変形性関節症を含む関節炎症に対する新しい治療剤又は予防剤、あるいは該関節炎症の治療方法、を提供することである。

本発明の別の目的は、関節軟骨細胞の増殖を促進する薬剤又は方法を提供することである。

本発明の別の目的は、変形性関節症を含む関節炎症を抑制する方法を提供することである。

本発明の別の目的は、関節炎症治療剤のスクリーニング方法を提供することである。

本発明の別の目的は、関節軟骨細胞増殖促進剤のスクリ一二ング方法を提供することである。発明の概要

本発明者らは、グァニルシクラーゼ B (GC-B) 活性化物質の一種である C型ナトリゥム利尿べプチド（CNP) を過剰発現する CNP トランスジヱニックマウスを作製し、関節軟骨への影響を検証した結果、 CNP トランスジヱニックマウスでは、関節軟骨の厚さおよび関節軟骨細胞数が有意に増加していること、さらに CNP トランスジ-ニックマウスを用いて作製した変形性関節症モデルでは関節腫脹に抵抗性であることおよび関節軟骨変性が抑制されること、滑膜細胞増勢、肉芽組織形成、炎症性細胞浸潤の変化が著しく弱いこと、関節軟骨中のプロテオダリカン含量は低下しなかったこと、これに対し、正常マウスを用いた変形性関節症モデルでは、滑膜細胞増勢、肉芽組織形成、炎症性細胞浸潤の変化が顕著であったことを見出した。これらの知見から、本発明者らは、 GC-B活性化物質が関節炎抑制作用と関節軟骨に対する同化的作用の両者を併せもつことを見出した。

したがって、本発明は、以下の発明からなる。

本発明は、第 1の態様において、グァニルシクラーゼ B (GC-B)活性化物質を有効成分として含むことを特徴とする、関節炎症の治療剤又は予防剤を提供する。本発明の一の実施態様において、上記関節炎症が変形性関節症である。

本発明の別の実施態様において、上記変形性関節症が荷重関節の変形性関節症又は非荷重関節の変形性関節症である。

本発明の別の実施態様において、上記変形性関節症が変形性膝関節症である。本発明の別の実施態様において、上記変形性関節症が変形性股関節症である。本発明の別の実施態様において、上記変形性関節症が顎関節症である。

本発明の別の実施態様において、上記関節炎症が関節リゥマチに起因するものである。

本発明の別の実施態様において、上記関節炎症が変形性関節症に起因するものである。

本発明の別の実施態様において、上記 GC- B活性化物質が、 C型ナトリゥム利尿ペプチド（CNP) 又はその誘導体である。

本発明の別の実施態様において、上記 CNPが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来の CNP- 22及び CNP-53から選択されるものである。

本発明の別の実施態様において、上記 CNP 、配列番号 1の CNP- 22又は配列番号 2の CNP-53である。

本発明の別の実施態様において、上記誘導体が、配列番号 1又は配列番号 2のアミノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつ CNP活性を有するものである。

本発明の別の実施形態において、上記関節炎症の治療剤又は予防剤が、少なくとも 1つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含むものである。本発明はさらに、第 2の態様において、 GC - B活性化物質を有効成分として含むことを特徴とする、関節軟骨細胞増殖促進剤を提供する。

本発明の一の実施態様において、上記 GC- B活性化物質が、 CNP又はその誘導体である。

本発明の別の実施態様において、上記 CNPが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来の CNP- 22又は CNP-53である。

本発明の別の実施態様において、上記 CNPが、配列番号 1の CNP-22又は配列番号 2の CNP-53である。

本発明の別の実施形態において、上記関節軟骨細胞増殖促進剤が、少なくとも 1つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含むものである。

本発明はさらに、第 3の態様において、 GOBを活性化することによって関節炎症を抑制することを特徴とする、関節炎症の抑制方法を提供する。

本発明の一の実施態様において、上記 GC-Bは、 CNP又はその誘導体によって活性化される。

本発明の別の実施態様において、上記 CNP力配列番号 1の CNP-22又は配列番号 2の CNP-53である。

本発明の別の実施態様において、上記 GC-Bが、 CNP又はその誘導体と少なくとも 1つの非ステロイド性抗炎症薬との組み合わせによって活性化される。

本発明はさらに、第 4の態様において、 GC-Bを活性化することによって関節軟骨細胞の増殖を促進することを特徴とする、関節軟骨細胞の増殖促進方法を提供する。本発明の一の実施態様において、上記 GC- Bは、 CNP又はその誘導体によって活性化される。

本発明の別の実施態様において、上記 CNP力配列番号 1の CNP- 22又は配列番号 2の CNP- 53である。

本発明の別の実施態様において、上記 GC- Bが、 CNP又はその誘導体と少なくとも 1つの非ステロイド性抗炎症薬との組み合わせによって活性化される。

本発明はさらに、第 5の態様において、 GC-Bの活性を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリ一ユングすることを含む、関節軟骨細胞増殖促進剤のスクリーニング方法を提供する。

本発明の一の実施態様において、 GC-Bを発現する培養細胞又は関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞の GC- B活性を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む。

本発明の別の実施態様において、上記 GC- Bの活性が、細胞内 c GMP産生量として測定される。

本発明の別の実施態様において、上記方法は、 GC-Bを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内 c GMPの産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内 c GMP産生量の差を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む。

本発明はさらに、第 6の態様において、 GC-Bの活性を指標として、変形性関節症、関節リゥマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤のスクリーニング方法を提供する。本発明の一の実施態様において、 GC-Bを発現する培養細胞又は関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞の GC- B活性を指標として変形性関節症、関節リゥマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む。

本発明の別の実施態様において、前記 GC- Bの活性が、細胞内 c GMP産生量として測定される。

本発明の別の実施態様において、上記方法は、 GC-Bを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内 c GMPの産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内 c GMP産生量の差を指標として変形性関節症、関節リゥマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む。

本発明はさらに、第 7の態様において、 GC-B活性化物質を有効成分として含む、変形性関節症の治療剤又は予防剤を提供する。

本発明の実施態様において、上記変形性関節症の治療剤又は予防剤が、少なくとも 1つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含むものである。

本発明はさらに、第 8の態様において、 GC-B活性化物質を有効成分として含む、関節リゥマチの治療剤又は予防剤を提供する。

本発明の実施態様において、上記関節リウマチの治療剤又は予防剤が、少なくとも 1つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含むものである。

本発明はさらに、第 9の態様において、非ステロイド性活性化剤を含む、グァニルシクラ一ゼ B (GC-B)活性化物質に対する活性化促進剤を提供する。

本発明の実施態様において、上記 GC-B活性化物質が、 CNP又はその誘導体である。

本発明の別の実施態様において、上記 CNPが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来の CNP-22及び CNP-53から選択される。

本発明の別の実施態様において、上記 CNPが、配列番号 1の CNP- 22又は配列番号 2の CNP- 53である。

本発明の別の実施態様において、上記誘導体が、配列番号].又は配列番号 2のアミノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつ CNP活性を有するものである。

本発明の別の実施態様において、上記非ステロイド性活性化剤がシクロォキシゲナーゼ酵素抑制剤である。

本発明の別の実施態様において、上記シクロォキシゲナーゼ酵素抑制剤がィンドメタシン、イブプロフェン、ピロキシカム、サリチル酸、ジクロフエナク、ケトプロフェン、ナプロキセン及びピロキシカムからなる群より選択される。

本発明はさらに、第 10 の態様において、上記の活性化促進剤を使用することを特徴とする、 GC-B活性化物質の活性化方法を提供する。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2004-107924号の明細書および Zまたは図面に記載される內容を包含する。図面の簡単な説明

図 1は、 CNP トランスジエニックマウス作製用ベクターの構築を示す。図 1 A： pGEM-T Easyベクターに組み込まれたマウス CNPの cDNAを Pst Iで切り出し両末端を平滑化した。図 l B : pSGl を Eco RIで処理して断端を平滑化した。図 1 C : 図 1 Aで得られたマウス CNPの cDNAを図 1 Bで得られた pSGlに組み込んだ。図 2は、ィンジェクション用 DNAフラグメントを示す。図 1 Cの pSGl-CNPから、 Hindll lおよび Xholで処理した後、 CNP遺伝子を含む断片（約 2. 3kb)を切り出し、ィンジェクション用のフラグメントとした。

図 3は、サザンプロット法による導入遺伝子の存在に関する CNP トランスジェニックマウスの遺伝子型解析結果を示す。野生型マウス（WT) では 3本のシグナル（野生型 CNP 遺伝子）が検出され、トランスジヱニックマウス（Tgm) で野生型 CNP遺伝子に加えて、導入遺伝子由来のシグナル（トランスジーン）が 2本検出された。

図 4は、 CNP トランスジエニックマウスにおける関節軟骨の肥厚を示す。大腿骨膝蓋面の関節軟骨の厚さについて、正常同腹仔（Wi ld) と CNP トランスジヱニックマウス（CNP tgm) の間で比較した。 CNP トランスジヱニックマウスは統計学的に有意に関節軟骨が厚いことを示している。 ** : ρ〈0· 01 、対応のない Student の t検定。図 5は、 CNP トランスジェニックマウスにおける関節軟骨細胞数の増加を示す。大腿骨膝蓋面の関節軟骨における光学顕微鏡下（対物 1 0倍） 1視野あたりの軟骨細胞数について、正常同腹仔（W i 1 d)と CNP トランスジエニックマウス（CNP t gm) の間で比較した。 CNP トランスジエニックマウスは統計学的に有意に 1視野あたりの軟骨細胞数が多いことを示す。 * : pく 0. 05 、対応のない Studentの t検定。図 6は、 CNP トランスジエニックマウスのコラゲナーゼ OAモデルにおける関節腫脹抵抗性を示す。 CNP トランスジエニックマウス（Tgm)および野生型マゥス（WT) の右膝関節に 3% コラゲナーゼ生理食塩液を投与後、左右の膝関節幅を計測し、その左右差を膝関節腫脹の指標として推移（図 6 A)とその曲線下面積（AUC) (図 6 B)を評価した。 CNP トランスジエニックマウスは右膝関節の腫脹が弱い傾向にあり、 AUC は野生型に対して有意に小さかった。 ** : p<0. 01, N. S.：有意差なし。対応のない Student の t検定。

図 7は、コラゲナーゼ OAモデルにおける右膝関節滑膜の組織学的変化を示す。 CNP トランスジエニックマウスおよび野生型マウスの右膝関節に 3% コラゲナーゼ生理食塩液を投与後、 2 8 日での右膝関節滑膜の組織像である。野生型マウスに 3%コラゲナーゼを投与すると、滑膜上皮細胞の増生、肉芽組織形成および炎症性細胞浸潤が認められた（図 7B)。一方、 CNP トランスジエニックマウスではこれら所見はきわめて軽微であった（図 7C)。図 7 Aは正常滑膜組織を示す。

図 8は、コラゲナーゼ OAモデルにおける右大腿骨内顆関節軟骨の組織学的変化を示す。 CNP トランスジエニックマウスおよび野生型マウスの右膝関節に 3% コラゲナーゼ生理食塩液を投与後、 2 8 日での右大腿骨内顆関節軟骨の組織像である。野生型マゥスでは軟骨基質のサフラニン 0染色性が低下し、プロテオダリカン含量低下が認められた（図 8B) のに対し、 CNP トランスジエニックマウスではサフラニン 0染色性は保たれていた（図 8C)。図 8Aは正常関節軟骨を示す。

図 9は、 Infusion投与した CNPのマウスコラゲナーゼ 0Aモデルにおける関節腫脹抑制効果を示す。 C57BL/6 J Jcl系マウスに CNP-22を皮下に持続投与し、右膝関節に 1. 5% コラゲナーゼ生理食塩液を投与して 6日後に測定した右膝関節腫脹を示す。 CNP- 22は 60， 600 ng/日群ともに溶媒対照群（ビヒクル）に対して有意に右膝関節の腫脹を抑制した。対応のない Studentの t検定。図 1 0は、 Infus ion投与した CNPのマウス外科的 OAモデルにおける関節腫脹抑制効果を示す。 C57BL/6 J Jcl系マウスに CNP-22を皮下に持続投与し、右膝関節に前十字靭帯切除、内側則副靭帯切除および内側半月板全切除の外科処置を加えて変形性関節症を惹起した。術後 4、 8、 11 日後に左右膝関節幅を測定、その差の AUCを示した。 CNP- 22は 60， 600 ng/日群ともに溶媒対照群（ビヒクル）に対して有意に右膝関節の腫脹を抑制した。対応のない Studentの t検定。

図 1 1は、 C57BL/6 J Jcl系マウスコラゲナーゼ OAモデルにおける膝関節腫脹に対する、 CNP- 22 (6 ng/日、皮下持続投与）、インドメタシン（Indo.， 1 mg/kg、経口投与）、およびこれらを併用した場合の抑制効果を示す。図 11Aはマウス右膝関節に 0. 15%と 1. 5% コラゲナーゼ生理食塩液を投与したあとの 7日間の経日的な右膝関節腫脹推移を表す。図 11Bは、図 11Aのグラフの曲線下面積（AUC)を表す。 AUCの比較において、 CNP-22は溶媒対照群（ビヒクル）に対して有意に右膝関節の腫脹を抑制したが、インドメタシンは抑制しなかった。一方、 CNP-22 とインドメタシンを併用した群は顕著な抑制を示し、 CNP-22単独群に対しても有意な抑制を示した。対応のない Studentの t検定。 * : pく 0. 05 (vs. ビヒクル）， * *： pく 0. 01 (vs. ビヒクル）。

図 1 2は、ラットアジュバント関節炎モデルに対する、 CNP- 22の四肢末端の関節炎と体重推移に対する効果を示す。図 12Aは四肢末端の関節炎スコアの推移を表しており、 CNP- 22群では関節炎スコアが低い傾向が認められる。図 12Bは体重の推移を表しており、抗原感作後 7、 10 日において CNP- 22群が溶媒対照群（ビヒクル）に比して有意に体重が重いことが示されている。対応のない Student t 検定。 * ： pく 0. 05 (vs. ビヒクノレ）。

図 1 3は、ラットコラーゲン関節炎モデル体重に対する CNP- 22の作用を示す。正常群に対して、溶媒対照群（ビヒクル）は抗原感作後 21 , 24, 28 日で有意に体重が軽かったが、このとき CNP - 22群（CNP 6 z g/日）では溶媒対照群に対して有意に体重が重かったことが示されている。対応のない Student t検定。 pく 0. 01 (vs. 正常）， * ： pく 0. 05 (vs. ビヒクル）。発明の詳細な説明図面を参照しながら、本発明をさらに具体的に説明する。

本発明者らが後述の実施例 2に記載のように作製した CNP-トランスジヱニックマウス（CNPTgm) についてサザンブロット法を用いて遺伝子型解析を行ったところ、図 3に示されるように、野生型マウスでは 3本のシグナル（野生型 CNP 遺伝子）が検出され、 CNPTgmでは野生型 CNP遺伝子に加えて、導入遺伝子由来の 2 本のシグナル（トランスジーン）が検出された。 CNPTgmでの CNPの発現を検討するため、導入した遺伝子の高発現が予想される臓器である肝臓および血漿での CNP の濃度を調べたところ、 CNP Tgmは野生型に対し、肝臓で約 10倍、血漿で約 24 倍の CNP濃度を示しており、統計学的に有意に CNPぺプチドが過剰発現されていることが確認された（実施例 4の表 1 )。

さらに CNPTgmの関節軟骨の組織学的解析を行うために、関節軟骨の厚さおよび軟骨細胞数を組織学的に調べたところ、関節軟骨の厚さは、 CNPTgmにおいて統計学的に有意に厚いこと（図 4 )、また関節軟骨細胞数も CNPTgmにおいて統計学的に有意に多いこと（図 5 )が確認された。これらの結果から、 CNPなどの GC- B活性化物質は軟骨細胞数を増加させることによって関節軟骨の厚さを増加させることが示された。

後述の実施例 6では、マウスを用いて膝関節内へのコラゲナーゼ注射により膝関節の靭带および半月板を不安定化させて変形性関節症を惹起する変形性関節炎病態モデル動物を作製した（Am. J. Pathol . 1989； 135： ] 001- 14)。 CNPTgm の関節炎症および関節軟骨変性に対する抵抗性を評価する Θ的で、 CNPTgmおよび正常マウスを用いて作製した各変形性関節炎モデル動物を用いて検討を行ったところ、

CNPTgmを用いて作製したモデル動物では、正常マウスを用いて作製したモデル動物と比べて、膝関節腫脹が有意に小さかったこと、関節軟骨変性が有意に抑制されていたこと、滑膜における滑膜細胞增勢、肉芽組織形成、炎症性細胞浸潤の変化が著しく弱かったこと、および関節軟骨中のプロテオダリカン含量にはほとんど変化はなかったことが確認された（図 6〜図 8 )。これらの結果から、 GC - B活性化物質が、変形性関節症において関節炎症抑制作用と関節軟骨変性抑制作用を有することが判明した。

さらにまた、ォスモティックポンプを移植した正常マウスを用いて、変形性関節炎モデルを作製し、インフュージョン投与した CNPの変形性関節炎モデルに対する治療効果の検討を行った。 CNP 投与群では膝関節腫脹に抵抗性であること、関節軟骨変性が有意に抑制されていたこと、滑膜における滑膜細胞增勢、肉芽組織形成、炎症性細胞浸潤の変化が著しく弱かったことが確認された（図 9 )。これらの結果から、 GC-B活性化物質は変形性関節症に対する治療効果を有することが判明した。

さらに、ォスモティックポンプを移植した正常マウスの右膝関節に対して前十字靭帯切断、内側則副靭帯切断および内側半月板全切除の外科処置を施し、変形性関節症を惹起し、インフュージョン投与した CNPの変形性関節炎モデルに対する治療効果の検討を行った。その結果、 CNP投与群の AUC (曲線下面積）はいずれの用量とも溶媒対照群に対し有意に小さかったことが確認された（図 10)。この結果から、 GC-B活性化物質が外科処置により惹起される、膝関節への物理的過荷重にもとづく変形性関節症における関節炎症に対しても抑制作用を有することが明らかになつた。

さらにまた、コラゲナ一ゼ OAモデルマウスに、 CNPを単独でまたは非ステロイド性抗炎症薬（NSAID) と併用して投与したとき、使用した NSAID単独では膝関節腫張を抑制しなかったが、 CNP 甲-独投与では有意に膝関節腫張を抑制し、 CNP と NSAIDとの併用投与では、より大きい相乗的腫張抑制効果を示すことが判った（実施例 9、図 11)。

さらにまた、関節リウマチ（RA) モデルとしてラボで汎用されているアジュバント関節炎モデルおよびコラーゲン関節炎モデル（Arthritis & Rheumatism, 27 : 797-806, 1984； Bri tish journa l of Rheumatology, 33 : 798 - 807, 1994) を用いて、 CNPの効果をさらに調べた結果、 CNP投与群（ラット）では、関節炎が有意に抑制されるとともに、対照と比べて体重増加が観察され、一般状態の有意な改善が認められた（実施例 10、 11、及び図 12、 13)。これらの結果は、 CNPが関節リゥマチによる関節炎に対して効能があることを示している。

このような実証例に基づき、本発明者らは、特定の理論や特定の実験例に拘束されることなく、 CNPなどの GC - B活性化物質が関節炎症抑制作用と関節軟骨に対する同化的作用の両者を併せもつことを見出した。したがって、本発明は、 GC-B活性化物質を有効成分として含むことを特徴とする、関節炎症の治療剤又は予防剤を提供する。

本発明において治療又は予防可能な関節炎症は、特に関節軟骨に関わる疾患であり、例えば、変形性関節症に起因する関節炎症、滑膜炎、関節リウマチ（例えば慢性関節リゥマチ（成人）や若年性関節リゥマチ（子供)）、骨関節炎、全身性エリテマトーデス（SLE；)、痛風、強皮症、乾癬（乾癬性関節炎）、ブラストミセス症などの真菌感染、強直性脊推炎、ライター症候群、敗血症性関節炎、成人スティル病、第三次ライム病（後期）、結核（結核性関節炎）、ウィルス感染（ウィルス性関節炎）、淋疾（淋菌性関節炎）もしくはパクテリァによる感染（非りん菌性細菌性関節炎）などに起因する関節炎症が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の実施態様において、好ましい関節炎症は変形性関節症、あるいは、変形性関節症に起因する関節炎症である。

変形性関節症は、関節軟骨の変性と破壊に起因する疾患であり、適応可能な変形性関節症には例えば、（1 )荷重関節である膝関節、股関節、足関節、脊椎などにおける変形性膝関節症、変形性股関節症、変形性足関節症、及び変形性脊椎症などの荷重関節における変形性関節症、並びに（2)非荷重関節である肩関節、肘関節、手関節、顎関節などにおける変形性肩関節症、変形性肘関節症、変形性手関節症（例えばヘバーデン結節、ブシヤール結節、変形性母指 CM関節症など）、顎関節症などの非荷重関節における変形性関節症が含まれる。

本発明の実施態様において、変形性関節症は、荷重関節における変形性関節症であり、好ましくは変形性膝関節症及び変形性股関節症である。

本発明の別の実施態様において、変形性関節症は、非荷重関節における変形性関節症であり、好ましくは顎関節症である。

本発明の治療剤又は予防剤はまた、関節リゥマチの治療又は予防にも適応可能である。関節リウマチは、自己免疫疾患であると考えられており、変形性関節症とは病因を異にするが、その病状の進行に伴って変形性関節症と同様に関節軟骨表面の変性と軟骨の破壊が起こる。このため、本発明の治療剤を投与することによって、関節炎症を抑制又は軽減することができる。

本明細書中で使用する「治療」、「治療方法」、「治療剤」なる用語は、本発明に係る関節炎症をもつ患者の症状を除去、抑制又は軽減すること、あるいはそのための方法又は医薬を意味する。また、「予防」、「予防剤」なる用語は、関節炎症を予防すること、あるいはそのための医薬を意味する。

本発明においてグァニルシクラーゼ B (GC - B)とは、ナトリウム利尿ペプチド受容体 B (NPR-B)と同義の用語として使用する。

本発明において GC-B活性とは、グァニルシクラーゼ活性と同義の用語として使用する。本発明において、グァニルシクラーゼ B (GC-B) 活性化物質又は GC-B活性化物質は、 CNPの受容体として知られる GC- Bと結合してこれを活性化するぺプチド又は非べプチド性低分子化合物であり、好ましくは CNPぺプチド又はその誘導体である。ここでペプチドは、複数の（L -、 D-及び/又は修飾）アミノ酸のアミド結合連鎖からなる物質を指し、この中にはポリべプチド及び蛋白質も包含される。 GC-B活性化物質は、例えば、 COS - 7等の培養細胞株に GC-B受容体を発現させ、培地に候補薬剤を添加し、一定の温度及び一定の時間（例えば 37°C、 5分後）細胞株を培養したのち、細胞内の c GMP 産生量を測定する方法（Sc ience 1991； 252 : 120-123)によって同定されうる。すなわち、このようなアツセィ系を使用して細胞内 c GMPの産生量を指標として GC-B活性化物質を同定し、それを本発明に使用することができる。

本発明の実施態様において、 GC-B活性化物質は、ペプチドであり CNP又はその誘導体である。好ましい CNP は、ヒ卜を含む哺乳類又は鳥類由来の CNP-22及び CNP-53から選択されるものであり、さらに好ましくは、配列番号 1の CNP-22又は配列番号 2の CNP- 53である。

本発明の別の実施態様において、上記誘導体が、配列番号 1又は配列番号 2のアミノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつ CNP活性を有するものである。あるいは、上記 CNP誘導体は、配列番号].又は配列番号 2 のァミノ酸配列と約 70%以上、約 80%以上、約 85%以上、約 90%以上、約 95% 以上、約 97%以上、約 98%以上、約 99%以上の％同一性を有する配列を含みかつ CNP活性を有するものである。

本明細書中で使用される「1〜数個」という用語は、通常 ].〜 10、好ましくは

；!〜 5、さらに好ましくは 1〜 3の任意の整数を表す。また、 2つのアミノ酸配列間の「％同一性」は、当業者に公知の BLASTタンパク質検索などの手法を用いて決定することができる（Altschul, S. F. , Gish, W. , Miller, W. , Myers, E. W. & Lipman, D. J. (1990) "Basic Local Alignment Search Tool" J. Mol. Biol. 215:403-410)。

本発明で使用可能な CNP には、ヒトを含む哺乳類由来 CNP(CNP_22:Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990； 168： 863-870, 国際公開 W091/16342、 CNP- 53： Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990； 170:973-979, 特開平 4- 74198号公報、特開平 4- 139199号公報、特開平 4-121190号公報）、鳥類由来 CNP (特開平 4- 120094 号公報）、両生類由来 CNP (特開平 4-120095号公報）、並びに、特開平 6-9688号公報、国際公開 W002/074234に開示される CNP類似体ぺプチドのような CNP誘導体が含まれる。

天然由来 CNP として、 22及び 53アミノ残基からなる CNP- 22及び CNP - 53が知られており、鳥類及びヒトを含む哺乳類由来の各 CNPを比較すると種を超えて配列相同が高いため、本発明においては、鳥類又はヒトを含む哺乳類由来の CNP、好ましくはヒトを含む哺乳類由来の CNP、さらに好ましくはヒト由来の CNPが使用されうる。ヒト CNP-22及び CNP- 53のアミノ酸配列は、下記の配列番号 1及び配列番号 2 ：

Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg lie uly Ser Met >er Gly Leu Gly Cys (ヒト CNP- 22：配列番号 1 ) ；

Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gin Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys uly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg lie Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys (ヒト CNP- 53: 配列番号 2)

として示される配列を有しており、いずれも分子内ジスルフィド結合を有し、すなわちヒト CNP - 22では 6位のシスティン残基と 22位のシスティン残基との間で、またヒト CNP- 53では 37位のシスティン残基と 53位のシスティン残基との間でそれぞれ分子内ジスルフィド結合を有し、環状ペプチド構造を形成している。

ブタ CNP-22及びラット CNP- 22は、ヒト CNP- 22 と同一のアミノ酸配列を有するが、一方、ブタ CNP-53及びラット CNP-53では 17位及び 28位のァミノ酸残基がそれぞれ His及び Glyであるのに対しヒト CNP-53ではそれぞれ Gin及び Alaであり、 2つのアミノ酸が相違する（特開平 4-139199号公報、特開平 4- 121190号公報、特開平 4-74198号公報）。さらにまた、ニヮトリ CNP-22は、 9位のアミノ酸残基 Val のみがヒト CNP - 22 と異なる以外は同じ一次構造を有している（特開平 4-120094号公報）。

本発明で使用しうる上記 CNPは、天然からの精製 CNP、既知の遺伝子工学的手法で製造された遺伝子組換え CNP、既知の化学合成法（例えばペプチド合成機を用いる固相合成法）で製造された CNPを含み、好ましくは遺伝子工学的手法で製造されたヒト CNP-22およびヒト CNP- 53である。遺伝子工学的手法によるヒト CNP の製造は、例えば、ヒト CNP-22又は CNP-53の DNA配歹 IJ (特開平 4 - 139199号公報）をプラスミド、ファージなどのベクターに組み込み、大腸菌や酵母などの原核もしくは真核生物宿主細胞に形質転換したのち、適する培地中で発現し、好ましくは細胞外に CNPぺプチドを分泌させ、産生した CNPぺプチドを回収し精製する各工程を含む。また、目的 DNAの増幅のために、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR) 技術を使用することができる。

遺伝子組換え技術、部位特異的突然変異誘発法、 PCR 技術などの基本的な手法は当業者には公知であり、例えば】. Sambrook ら， Mol ecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990) ; Ausubel ら， Current Protocols In Molecular Biology, John Wi ley & Sons (1998)などに記載されており、そこに開示される技術を本発明のために利用することができる。またベクターとしては、市販のベクタ一あるいは刊行物記載のベクタ一が使用できる。

本発明で使用しうる CNP誘導体は、 CNP活性を有するとともに、ヒト CNP-22又は CNP-53 と同一の 2つのシスティン残基間のジスルフィド結合による環状ぺプチド構造を有するものであって、上記 CNPのフラグメント、上記 CNP又はそのフラグメン卜の構成アミノ酸の少なくとも 1つをその他のアミノ酸に置換したぺプチド、上記 CNPそのもの又はその部分べプチドの構成アミノ酸の少なくとも 1つを欠失したぺプチド、及び上記 CNPそのもの又はその部分べプチドの構成ァミノ酸に 1つ以上のアミノ酸を付加したペプチドを含む。アミノ酸の置換、欠失、付加とは、 CNP 活性を損なわない限り、部位特異的突然変異誘発法などの周知の方法にてアミノ酸の置換、欠失又は付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失又は付加されることを意味する。このような CNP- 22又は CNP- 53の誘導体は例えば、配列番号 1又は配列番号 2のアミノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつ CNP活性を有するものである。

アミノ酸の置換については、一般的に保存的アミノ酸置換が好ましい。保存的アミノ酸は、例えば極性度（または疎水性度）や電荷の種類によって分類されることができる。例えば、非極性の非電荷型アミノ酸にはグリシン、ァラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリンなど、芳香族アミノ酸にはフエニルァラニン、チロシン、トリプトファン、極性の非電荷型アミノ酸にはセリン、トレォニン、システィン、メチォニン、ァスパラギン、グルタミンなど、負電荷アミノ酸にはァスパラギン酸、グルタミン酸、正電荷アミノ酸にはリジン、アルギニン、ヒスチジンが、それぞれ含まれる。

本発明において CNP活性とは、 GC-Bに作用してグァニルシクラーゼ活性を上昇させる活性や変形性関節症を含む関節炎症を除去、抑制又は軽減する活性あるいは関節軟骨の増殖を促進させる活性をいう。 CNP 活性は、細胞のグァニルシクラーゼ活性、たとえば細胞内 c GMPの産生量を測定することによること、及び/又は、マウス、ラットなどの関節炎症、変形性関節症もしくは関節リウマチモデル動物に一定期間 CNP又はその誘導体を投与したのち、後述の実施例 7から 10に記載されるように関節炎症抑制効果又は関節軟骨変性抑制効果の程度を測定すること、によって決定しうる。

CN-22類似べプチドには、例えば特開平 6-9688号公報や国際公開 W002/074234 に記載されるような下記の環状ペプチドが含まれる（なお、配列中の下線はヒト CNP-22からの変異を表す）。

Gly Leu ¾er Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg l ie Gly Ala Met Ser Gly Leu Gly Cys (配列番号 3)

Gly Leu Ser Lys uly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg lie Gly Ser Gin Ser Gly Leu Gly Cys (配列番号 4)

Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg lie Gly Ser Ala Ser G y Leu Gly Cys (配列番号 5)

Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg He Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys (酉己列番号 6)

Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg lie Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys (配列番号 7)

Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg lie Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr (酉己歹 ij番号 8)

Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg lie Gly Ser Gin Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr (配列番号 9)

Cys Phe Gly Xaa Xbb XccAsp Arg lie Gly Xdd Xee Ser Xff XRK Gly Cys

(ここで、 aa=Leu, lie, Val; Xbb=Lys, し eu， Met; Xcc=Leu, lie, Ala, Val; Xdd=Ser, Ala, Gly, Thr, Asn; Xee=Met, Ala, Trp, His, Lys, Ser, Gly; Xff=Gly, Lys, Ala, Leu; Xgg=Leu, Metである。）（配列番号 10)

また、 CNP-53類似ぺプチドには、上記の CNP-22類似べプチドに対応するアミノ酸の同様の変異を含む環状べプチドが含まれる。

本発明はさらに、 GC-B活性化物質を有効成分として含むことを特徴とする、関節軟骨細胞増殖促進剤を提供する。この発明は、 GC-B活性化物質が関節軟骨細胞を增加させる働きがあることに基づく。 GOB活性化物質の具体例は、上記定義の

CNP又はその誘導体である。 CNPは、好ましくは、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来の CNP- 22又は CNP - 53であり、さらに好ましくは、配列番号 1の CNP-22又は配列番号 2の CNP- 53である。また、 CNP誘導体は、配列番号 1又は配列番号 2のアミノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつ CNP活性を有するものを含む。他の GC-B活性化物質は、例えば、 COS- 7等の培養細胞株に GC-B 受容体を発現させ、培地に候補薬剤を添加し、一定の温度及び一定の時間（例えば

37°C、 5 分後）細胞株を培養したのち、細胞内の c GMP 産生量を測定する方法

(Science 1991； 252： 120- 123)によって同定されうる。すなわち、このようなァッセィ系を使用して細胞内 c GMPの産生量を指標として GC-B活性化物質を同定し、それを本発明に使用することができる。

本発明はまた、 GC-Bを活性化することによって関節炎症を抑制することを特徴とする、関節炎症の抑制方法を提供する。さらに本発明は、 GC-Bを活性化することによって関節軟骨細胞の増殖を促進することを特徴とする、関節軟骨細胞の增殖促進方法を提供する。これらの発明は、 GC-B活性化物質によって、言い換えれば GC- Bを活性化することによって、上記定義の関節炎症、好ましくは変形性関節症を抑制することができるという知見、また関節軟骨細胞の増殖を促進するという知見に基づく。本発明の実施態様により、 GC-Bは、上記定義の CNP又はその誘導体によって活性化されうる。

本発明はさらに、 GC - Bの活性を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む、関節軟骨細胞増殖促進剤のスクリー- ング方法を提供する。 GC- Bは、グァニルシクラーゼ活性により GTPからセカンドメッセンジャーである c GMPの合成を触媒することが知られているので、 GC- Bの活性は、細胞内 c GMP産生量として測定されうる。

本発明の実施態様において、上記スクリーニング方法は、 GC-Bを発現する細胞や関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞のグァニルシクラーゼ活性、たとえば細胞内 c GMP の産生量を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリ一二ングすることからなる工程を含むことができる。

本発明の実施態様においてより好ましくは、 GC- Bを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内 c GMPの産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内 c GMP産生量の差を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリ一二ングすることを含む。

本発明のスクリ一二ング方法は、例えば、 C0S-7等の培養細胞株に GC- Bを発現させ、培地に候補薬剤を添加し、一定の温度及び一定の時間（例えば 37°C、 5分間）細胞株を培養したのち、細胞内の c GMP 産生量を測定する方法（Sc i ence 1991； 252： 120 - 123)によって関節軟骨細胞増殖促進剤をスクリ一ニングすることができる。

本発明はさらに、 GC-Bの活性を指標として、変形性関節症、関節リゥマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリ一二ングすることを含む、変形性関節症、関節リゥマチあるいは関節炎症治療剤のスクリーニング方法を提供する。上記と同様に、 GC-Bの活性は、グァエルシクラーゼ活性、たとえば細胞内 c GMP産生量として測定されうる。

本発明の実施態様において、上記スクリーユング方法は、 GC- Bを発現する培養細胞や関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞のグァニルシクラーゼ活性、たとえば細胞内 c GMP の産生量を指標として変形性関節症、関節リゥマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることからなる方法を含むことができる。

本発明の実施態様においてより好ましくは、 GC-Bを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内 c GMPの産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内 c GMP産生量の差を指標として変形性関節症、関節リゥマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーユングすることを含む。

本発明のスクリ一ユング方法は、例えば、 C0S-7等の培養細胞株に GC- Bを発現させ、培地に候補薬剤を添加し、一定の温度及び一定の時間（例えば 37°C、 5分間）細胞株を培養したのち、細胞内の c GMP 産生量を測定する方法（Sc i ence 1991； 252： 120- 123)によって変形性関節症、関節リゥマチあるいは関節炎症治療剤をスクリ一二ングすることができる。本発明の変形性関節症等の関節炎症の治療剤又は予防剤は、有効成分としての上記定義の GC- B活性化物質を、製薬上許容可能な担体、賦形剤、添加剤などと組み合わせて、経口投与用又は非経口投与用に製剤化される。

製剤用の担体ゃ賦形剤としては、例えば、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、タルク、ゼラチン、寒天、ぺクチン、アラビアゴム、ォリーブ油、ゴマ油、カカオバター、エチレングリコールなどやその他常用されるものをあげることができる。

経口投与のための固体組成物としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤などが用いられる。このような固体組成物においては、少なくともひとつの有効成分が少なくともひとつの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶性セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合される。組成物は、常法にしたがって不活性な希釈剤以外の添加物、例えば、ステアリン酸マグネシゥムのような潤滑剤、繊維素グリコール酸カルシウムのような崩壊剤、グルタミン酸又はァスパラギン酸のような溶解補助剤を含んでいてもよい。錠剤又は丸剤は、必要によりショ糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートなどの糖衣や胃溶性又は腸溶性物質のフィルムで被覆してもよいし、

2つ以上の層で被覆してもよい。さらに、ゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも含まれる。

経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤などを含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水、エタノールなどを含んでいてもよい。この組成物は、不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤などを含んでいてもよい。

非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤が含まれる。水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば、注射用水及び注射用生理食塩液が含まれる。非水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコーノレ、ォリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート 80 (登録商標）などが含まれる。このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えば、乳糖）、溶解補助剤（例えば、グルタミン酸、ァスパラギン酸）のような補助剤を含んでいてもよい。これらは、例えば、精密ろ過膜によるろ過滅菌、高圧蒸気滅菌のような加熱滅菌、あるいは、殺菌剤の配合などの通常の滅菌方法によって無菌化することが可能である。注射剤は溶液製剤であっても、使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥のための賦形剤としては例えばマンニトール、ブドウ糖などの糖アルコールや糖類を使用することができる。

本発明の治療剤又は予防剤は、医薬に一般に使用されている経口投与方法又は非経口投与方法のいずれかによつて投与される。好ましくは非経口投与方法、例えば注射による投与（皮下注射、静脈注射、筋肉注射、腹腔内への注射などによる投与）、経皮投与、経粘膜投与（経鼻投与、経直腸投与など）、経肺投与などであるが、経口投与方法による投与も可能である。

本発明の製剤中に含まれる有効成分である GC-B活性化物質、好ましくは上記定義の CNP又はその誘導体、の量は、治療すべき疾患の種類、疾患の重症度、患者の年齢などに応じて決定できるが、一般に 0. OOS ^u g/kg l OOmg/kgの範囲で投与することができるが、 0. 02 ;u g/kg〜5nig/k_g で投与することが好ましい。さらに 0. 02 // g/kg〜0. 25 mg/kgでの投与が好ましい。しかしながら本発明の CNPを含有する薬剤はこれらの投与量に制限されるものではない。

本発明の治療剤又は予防剤は、抗炎症薬、ヒアルロン酸や副腎皮質ステロイドなどの従来又は新規の治療剤と組み合わせたり、また関節鏡視下手術、人工関節置換や骨切り術などの整形外科手術と組み合わせて使用することができる。

特に、抗炎症薬、例えば少なくとも 1つの非ステロイド性抗炎症薬を GC- B活性化物質（例えば、上記定義の CNP又はその誘導体）と併用するときには、関節炎に対する相乗的抑制効果がある（実施例 10)。

本明細書で使用する「非ステロイド性抗炎症薬」は、ステロイド骨格をもたなぃ抗炎症薬を指し、プロスタグランジンの産生に関わるシクロォキシゲナーゼ酵素を抑制する作用をもつものが好ましい。本発明で使用可能な非ステロイド性抗炎症薬には、以下のものに限定されないが、例えばィンドメタシン（ィンダシン（商標）など）、イブプロフェン（ブルフェン（商標）など）、ピロキシカム、サリチル酸、ジクロフェナク（ボルタレン（商標）など）、ケトプロフェン、ナプロキセン、ピロキシカムなどを含む。

さらにまた、上記の GC - B 活性化物質を非ステロイド性抗炎症薬と併用するときの相乗効果は、 GC- B活性化物質を単独に使用したときと比べて GC-Bの活性化が促進されること、言い換えれば、上記の非ステロイド性抗炎症薬の有効成分が GC-B活性化物質による GC- Bの活性化の際の活性化促進剤となること、を示している。

したがって、本発明はさらに、非ステロイド性活性化剤を含む、 GC - B活性化物質に対する活性化促進剤を提供する。

GC-B 活性化物質には、上述したような、 CNP 又はその誘導体が含まれる。 CNP の例は、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来の CNP- 22及び CNP - 53であり、さらに具体的には、配列番号 1の CNP-22又は配列番号 2の CNP-53である。また、 CNPの誘導体の例は、配列番号 1又は配列番号 2のアミノ酸配列において 1〜数個のァミノ酸が欠失、置換又は付加しかつ CNP活性を有するものである。

本発明において、上記非ステロイド性活性化剤は、好ましくはシクロォキシゲナーゼ酵素抑制剤である。シクロォキシゲナーゼ酵素抑制剤には、例えばインドメタシン、イブプロフェン、ピロキシカム、サリチル酸、ジクロフエナク、ケトプロフェン、ナプロキセン、ピロキシカムなどが含まれるが、これらに限定されない。

本発明の活性化促進剤の剤型、用量、投与方法は、本発明の治療剤及び予防剤について上で説明した事項をそのまま適用できる。

本発明はまた、上記の活性化促進剤を使用することを特徴とする GC- B 活性化物質の活性化方法も提供する。

上記の本発明の活性化促進剤および方法は、患者において、例えば GC-B 活性化を介して関節炎症などの疾患を治療する場合などに有効に使用することができる。

本発明として以下の事項を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。

(1)グァニルシクラーゼ B (GC-B)活性化物質を有効成分として含むことを特徴とする、関節炎症の治療剤又は予防剤。

(2)上記関節炎症が変形性関節症である、上記（1)に記載の治療剤又は予防剤。

(3)上記変形性関節症が荷重関節の変形性関節症又は非荷重関節の変形性関節症である、上記（2)に記載の治療剤又は予防剤。

(4)上記変形性関節症が変形性膝関節症である、上記（3)に記載の治療剤又は予防剤。

(5)上記変形性関節症が変形性股関節症である、上記（3)に記載の治療剤又は予防剤。

(6)上記変形性関節症が顎関節症である、上記（3)に記載の治療剤又は予防剤。

(7)上記関節炎症が関節リゥマチに起因する、上記（1)に記載の治療剤又は予防剤。 (8)上記関節炎症が変形性関節症に起因する、上記（1)に記載の治療剤又は予防剤。

(9)上記 GC-B活性化物質が、 C型ナトリゥム利尿べプチド（CNP) 又はその誘導体である、上記（ 1 )〜（8)のいずれかに記載の治療剤又は予防剤。

(10)上記 CNP力ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来の CNP - 22及び CNP-53から選択される、上記（9)に記載の治療剤又は予防剤。

(11)上記 CNPが、配列番号 1の CNP- 22又は配列番号 2の CNP-53である、上記（9) に記載の治療剤又は予防剤。

(12)上記誘導体が、配列番号 1又は配列番号 2のアミノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつ CNP 活性を有するものである、上記（9) に記載の治療剤又は予防剤。

( 13) 少なくとも 1つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含む、上記（1 ) 〜（12) のいずれかに記載の治療剤又は予防剤。

( 14) GC-B活性化物質を有効成分として含むことを特徴とする、関節軟骨細胞増殖促進剤。

( 15) 前記 GC-B活性化物質が、 CNP又はその誘導体である、上記（14) に記載の増殖促進剤。

( 16)前記 CNP 、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来の CNP - 22又は CNP-53である、上記（15) に記載の増殖促進剤。

( 17) 前記 CNP力配列番号 1の CNP-22又は配列番号 2の CNP-53である、上記 ( 15) に記載の増殖促進剤。

( 18) 前記誘導体が、配列番号 1又は配列番号 2のアミノ酸配列において 1〜数個のァミノ酸が欠失、置換又は付加しかつ CNP活性を有するものである、上記（15) に記載の増殖促進剤。

( 19) 少なくとも 1つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含む、上記（14)〜（18) のいずれかに記載の増殖促進剤。

(20) GC-Bを活性化することによって関節炎症を抑制することを特徴とする、関節炎症の抑制方法。

(21) 前記 GC- Bが、 CNP又はその誘導体によって活性化される、上記（20)に記載の抑制方法。 (22) 前記 CNP力 S、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来の CNP - 22又は CNP- 53である、上記（21)に記載の抑制方法。

(23) 前記 CNPが、配列番号 1の CNP- 22又は配列番号 2の CNP- 53である、上記 (21)に記載の抑制方法。

(24)前記誘導体が、配列番号 1又は配列番号 2のアミノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつ CNP活性を有するものである、請求項 21 に記載の抑制方法。

(25)前記 GC-Bが、 CNP又はその誘導体と少なくとも 1つの非ステロイド性抗炎症薬との組み合わせによって活性化される、上記（20)〜（24)のいずれかに記載の抑制方法。

(26) GC-B を活性化することによって関節軟骨細胞の増殖を促進することを特徴とする、関節軟骨細胞の増殖促進方法。

(27)前記 GC - B力 CNP又はその誘導体によって活性化される、上記（26)に記載の増殖促進方法。

(28)前記 CNPが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来の CNP-22又は CNP- 53である、上記（27)に記載の増殖促進方法。

(29)前記 CNPが、配列番号 1の CNP-22又は配列番号 2の CNP- 53である、上記 (27) に記載の増殖促進方法。

(30)前記誘導体が、配列番号 1又は配列番号 2のアミノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつ CNP活性を有するものである、上記（27) に記載の増殖促進方法。

(31)前記 GC- Bが、 CNP又はその誘導体と少なくとも 1つの非ステロイド性抗炎症薬との組み合わせによって活性化される、上記（26)〜（30)のいずれかに記載の増殖促進方法。

(32) GC-B の活性を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む、関節軟骨細胞増殖促進剤のスクリーニング方法。

(33) GC-B を発現する培養細胞又は関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞の GC- B活性を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーユングすることを含む、上記（32)に記載のスクリ一二ング方法。

(34)前記 GC- B活性が、細胞内 c GMP産生量として測定される、上記（32)又は（33) に記載のスクリーニング方法。

(35) GC-B を強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内 c GMP の産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内 c GMP 産生量の差を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む、上記（32)〜（34)のいずれかに記載のスクリーユング方法。

(36) GC-B の活性を指標として、変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤のスクリ一二ング方法。

(37) GC-B を発現する培養細胞又は関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞の GC- B活性を指標として変形性関節症、関節リゥマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、上記（36)に記載のスクリ一ユング方法。

(38)前記 GC-B活性が、細胞内 c GMP産生量として測定される、上記（36)又は（37) に記載のスクリーニング方法。

(39) GC-B を強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内 c GMP の産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内 c GMP 産生量の差を指標として変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、上記（36)〜（38)のいずれかに記載のスクリ一ユング方法。

(40)グァニルシクラーゼ B (GC-B)活性化物質を有効成分として含む、変形性関節症の治療剤又は予防剤。

(41)少なくとも 1つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含む、上記（40)に記載の変形性関節症の治療剤又は予防剤。

(42)グァニルシクラーゼ B (GC-B)活性化物質を有効成分として含む、関節リゥマチの治療剤又は予防剤。

(43)少なくとも 1つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含む、請求項 42に記載の、関節リウマチの治療剤又は予防剤。

(44) 関節炎症の治療を必要とする患者に GC-B 活性化物質を投与することを含む、該関節炎症の治療方法。

(45)上記 GC-B活性化物質が CNP又はその誘導体である、上記（44)に記載の治療方法。

(46)上記関節炎症が変形性関節症である、上記（44)又は（45)に記載の治療方法。

(47)上記変形性関節症が荷重関節の変形性関節症又は非荷重関節の変形性関節症である、上記（46)に記載の治療方法。

(48)上記変形性関節症が変形性膝関節症、変形性股関節症又は顎関節症である、上記（47)に記載の治療方法。

(49)上記関節炎症が関節リゥマチに起因する、上記（44)に記載の治療方法。

(50)上記関節炎症が変形性関節症に起因する、上記（44)に記載の治療方法。

(51)上記 CNP 、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来の CNP-22及び。 -53から選択される、上記（45)〜（50)のいずれかに記載の治療方法。

(52)上記 CNPが、配列番号 1の CNP-22又は配列番号 2の CNP- 53である、上記 (45) 〜（50)のいずれかに記載の治療方法。

(53)上記誘導体が、配列番号 1又は配列番号 2のアミノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつ CNP活性を有するものである、上記（45) 〜（50)のいずれかに記載の治療方法。

(54) 上記 GC-B活性化物質を、少なくとも 1つの非ステロイド性抗炎症薬と組み合わせて含む、上記（44)〜（53)のいずれかに記載の治療方法。

(55)非ステロイド性活性化剤を含む、 GC-B活性化物質に対する活性化促進剤。

(56)上記 GC- B活性化物質が、 CNP又はその誘導体である、上記（55)に記載の活性化促進剤。

(57)上記 CNP ヽヒトを含む哺乳類又は鳥類由来の CNP - 22及び CNP- 53から選択される、上記（56)に記載の活性化促進剤。

(58)上記 CNPが、配列番号 1の CNP- 22又は配列番号 2の CNP-53である、上記 (56) に記載の活性化促進剤。

(59)上記誘導体が、配列番号 1又は配列番号 2のアミノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつ CNP活性を有するものである、上記（56) に記載の活性化促進剤。

(60)上記非ステロイド性活性化剤がシクロォキシゲナーゼ酵素抑制剤である、上記（55)に記載の活性化促進剤。

(61)上記シクロォキシゲナーゼ酵素抑制剤がィンドメタシン、ィブプロフェン、ピロキシカム、サリチル酸、ジクロフエナク、ケトプロフェン、ナプロキセン及びピロキシカムからなる群より選択される、上記（60)に記載の活性化促進剤。

(62)上記（55)〜（61)のいずれかに記載の活性化促進剤を使用することを特徴とする、 GC- B活性化物質の活性化方法。

以下の実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は単に例示を目的としたものであって、本発明を制限するものではない。それゆえ、本発明は、これらの実施例によって制限されないものとする。実施例 1

CNP トランスジエニックマウス作製用ベクターの構築

121 1 A tこ示すよう（こ、 pGEM_T easy vector ( Promega社製）【こマウス CNP cDNA (526 bp ; FEBS Lett. 276 : 209-213， 1990)をサブクローニングさせたものを Pst Iで切断し、断端を平滑化してマウス CNP cDNA を調製した。 PSG1 ベクター（Promega 社製；図 1 B)を Eco RIで切断し断端を平滑化して、図 1 Cのようにマウス CNP cDNA を l igat ion し、 SAP_mCNP ベクタ一（pSGl-CNP) を作製した。実施例 2

CNP トランスジエニックマウスの作製

インジェクション用 DNAフラグメントは、次のようにして調製した。まず CNP 遺伝子を挿入した SAP-mCNPベクター（pSGl-CNP；図 1C)を、 Hindlllおよび Xhol で処理した後、 CNP遺伝子を含む断片（約 2. 3kb)を切り出した。この断片を、 Gel

Extraction Kit (QIAGEN)により回収し、 3 ng/ μ 1 になるように PBS—で希釈してィンジェクション用 DNAフラグメント（図 2)とした。

DNA フラグメントを注入するマウス前核期卵は、次のようにして回収した。すなわち、まず C57BL/6雌マウス（日本クレア）に 5 i . uの妊馬血清性性腺刺激ホルモン（PMSG)を腹腔内投与、さらに 48時間後 5 i . uのヒト絨毛ゴナドトロピン（hCG) を腹腔内投与することによって、過排卵処理した。この雌マウスを同系統の雄マウスと交配させた。交配の翌朝、プラグを確認したマウスの卵管を灌流してマウス前核期卵を回収した。

ィンジェクション用 DNAフラグメントは、マイクロマニピュレーターを用いて前核期卵へ注入した（ジーンターゲティングの最新技術（羊土社）、 190- 207、 2000)。 DNAフラグメントを 660個の C57BL/6J胚へ注入し、翌日、 2細胞期に発生していた胚 561個を、偽妊娠 1 日目の受容雌の卵管に片側当たり 10個前後（1匹あたり 20個前後）を移植した。

分娩予定日に至っても産仔を娩出しなかった受容雌については、帝王切開を施し里親に哺育させた。 136例の産仔が得られ、そのうちの 5例が CNP遺伝子が導入されたトランスジエニックマウスであった。以下、最初に得られたマウスを Founderと記載する。

Founderは全て雄マウスで、これら 5 ラインのうち 4ラインから、次世代（F1 マウス）の産仔が得られた。実施例 3

CNP トランスジ-ニックマウスの遺伝子型解析

遺伝子型解析は下記に示す手順に従ってサザンブロット法によって行った。

3週齢になったマウスの尾（約 15mm)を採取して prote inase K処理（55°C、 100 rpm で 1 昼夜振盪）して溶解液を得た。この溶解液を核酸自動分離装置（KURAB0

NA-1000) にかけてゲノム DNAを調製した。ゲノム DNA15 i gを Pvu Π (200 U) で処理してからフエノール · ク口口ホルム処理によって制限酵素を除いた後にェタノール沈殿で DNAを回収した。回収された DNAを 25 μ ίの TEに溶解して 0. 7% ァガロースゲル電気泳動（50V定電圧）にかけ、泳動終了後、ゲルを 0. 25 M HC1 溶液で 15分間処理して DNAを切断し、水洗してから 0. 4 NaOH溶液でナイロンメンブレンに一晚ブロッティングした。その後、メンブレン上の DNAを UVクロスリンク法で固定した。メンブレンをハイブリダイゼ一ション溶液（50% Formami de , 0. 5 x Denhardt ' s、 0. 5% SDS、 5x SSPE) で処理（42°C、 2時間）してから、 CNP の cDNA (約 0. 5kb) を铸型として BcaBEST Label ing Ki t (TaKaRa) で調製した³² P 標識プローブを加えて 42°Cでー晚ハイブリダィゼーシヨンした。その後、洗浄溶液（2 x SSC、 0. 1% SDS) で 55°C、 20分間処理してから Imaging Plate (Fuj i Fi lm) にー晚露光し、導入遺伝子のシグナルを BAS2000 (Fuj i Fi lm)で検出した（図 3 )。野生型マウス（WT) では 3本のシグナル（野生型 CNP遺伝子）が検出され、トランスジエニックマウスでは野生型 CNP遺伝子に加えて、導入遺伝子由来のシグナル（トランスジーン）が 2本検出された。実施例 4

CNP トランスジエニックマウスにおける CNPの発現

CNP濃度の測定には、 CNP- 22 EIA測定キット（PHOENIX PHARMACEUTICALS INC. 社製）を用いた。

7週齢の雌雄 CNP トランスジヱニックマウスおよび雌雄の正常同腹マウス各 3例をエーテル麻酔下で後大静脈から全採血して安楽死させた。

導入した遺伝子の高発現が予想される臓器である肝臓を採取し、肝重量 0. 1 g に対して、上記測定キットの EIA assay バッファー 1 mLを加え氷冷した。ヮーリングブレンダー（ヒスコトロン社製）でホモジナイズし、遠心分離（2, 000 rpm、 5分間）した上清を CNP- 22濃度測定サンプルとした。

採取した血液に、 1 m_gのエチレンジァミン 4酢酸 ' 4ナトリウム塩（純正化学社製）と 2 トリプシン阻害寧-位のァプロチュン（Sigma社製）を添加して攪拌して血漿を分離し、 CNP- 22濃度測定サンプルとした。

測定結果を表 1に示した。

CNP トランスジエニックマウスにおける CNPの発現肝臓血漿

(ng/g組織）平均土 SD (ng/mU 平均土 SD

牛 gy No.1 38.8 0.3

No.2 5.9 29.3± 20.5 0.4 0.3±0.06

No.3 43.3 0.3

CNP tgm No.1 293.3 10.3

No.2 370.0 290±81.7** 1 1.1 8.0±4.7^#

No.3 206.7 2.6

**： pく 0. 01 (対応のない Student t-test)

# : pく 0. 05 (Wi lcoxon 順位和検定）

CNP トランスジヱニックマウス（CNP tgm) は野生型（Wi ld type)に対する平均値土標準偏差（mean 土 SD)の比較では肝臓（Liver)で約 1 0倍、血漿（Plasma)で約 2 4倍の CNP- 22濃度を示しており、いずれも統計学的に有意な差であった。これらの結果より、 CNP トランスジエニックマウスにおいて、 CNPぺプチドが過剰発現されていることが確認された。実施例 5

CNP トランスジエニックマウス関節軟骨の組織学的解析

関節軟骨の厚さおよび軟骨細胞数を組織学的に解析する目的で、 9週齢の CNP トランスジヱニックマウスおよび同腹の正常マウスの雌各 5例、計 1 0例をエーテル麻酔下で後大静脈から全採血して安楽死させ、大腿骨を 2 0 %ホルマリンにより 1週間固定した。その後 2 0 %EDTA- 4Na (純正化学社製）水溶液（pH7. 4) に浸漬して脱灰した後、大腿骨膝蓋面を正中矢状断して常法に従いパラフィン包埋し、パラフィンブロックを作製した。厚さ 4 mmの切片をミク口トームを用いて薄切してパラフィン切片を作製し、へマトキシリン 'ェォジン染色した。関節軟骨の厚さは、対物レンズ 1 0倍での 1視野を画像解析ソフト（IPAP, 住化テクノサービス社製）に取り込み、同ソフトを用いて視野中の 5点について長さを計測して平均値を算出し、その個体の関節軟骨の厚さとした。この計測に用いた同一の視野について、軟骨細胞数を計測した。これら項 Sについて、同性の正常マウスと CNP トランスジエニックマウスの間で平均値および標準偏差を算出し

(Microsoft Excel2000, マイクロソフト社製）、対応のない Student の t検定によって統計学的解析を行った（SAS ver. 6. 12, SASインスティチュートジャパン社製）。

関節軟骨の厚さは、雌雄ともに CNP トランスジヱニックマウスにおいて統計学的に有意に厚いことが判明した（図 4 )。また、 1視野あたりの関節軟骨細胞数も雌雄ともに CNP トランスジエニックマウスにおいて統計学的に有意に多いことが判明した（図 5 )。

これらの結果から、 CNP などの GC- B (NPR- B)を活性化する物質が、公知である個々の軟骨細胞の肥大化 [J Biol Chem 2003； 278 (21)： 18824- 32]による細胞容積の増加でなく、軟骨細胞数の増加を伴って関節軟骨の厚さを増加させることが明らかになつた。実施例 6

CNP トランスジエニックマウスの変形性関節炎モデルに対する抵抗性

膝関節内へのコラゲナーゼ注射により膝関節の靭帯および半月板を不安定化させ変形性関節症を惹起する変形性関節炎動物モデル [Am J Pathol

1989 ; 135 : 1001-14] を作成した。 CNP の変形性関節炎に対する予防及び治療効果を確認する目的で、 CNP トランスジエニックマウスを用いた変形性関節炎動物モデルの関節炎症および関節軟骨変性に対する抵抗性を評価した。 CNP トランスジエニックマウスおよび同腹の野生型 C57BL/6系マウスの右膝関節内に 6 マイクロリットルの 3 % タイプ I I コラゲナーゼ（Sigma社製）生理食塩溶液を 2回投与

(投与開始当日と投与開始後 7日）した。左右の膝関節幅をノギス（ミツトヨ社製）を用いて投与後 28 日まで経時的に測定し、左右の差を算出して膝関節腫脹を表す値とした。その経時的推移曲線下面積（AUC) を台形法により算出し、 CNP トランスジエニックマウスと野生型マウスの間で Student t検定で比較した。その結果、 CNP トランスジエニックマウスにおける AUCは野生型よりも有意に小さく、

CNP トランスジエニックマウスがコラゲナーゼによる膝関節腫脹に抵抗性であることが判明した（図 6 )。関節炎症および関節軟骨変性を病理組織学的に評価するため、コラゲナ一ゼ投与後 28 日にエーテル麻酔下に全採血による安楽死後に膝関節を採取し、実施例 5に記載した方法でへマトキシリン 'ェォジン染色標本およびサフラニン o染色標本を作成し、組織学的に解析した。その結果、野生型マウスではコラゲナーゼにより滑膜における滑膜細胞増勢、肉芽組織形成、炎症性細胞浸潤が顕著であつたのに対し、 CNP トランスジエニックマウスではこれら変化が著しく弱かった（図 7 )。関節軟骨変性については、野生型マウスではサフラ二ン 0染色性が低下し、関節軟骨中のプロテオダリカン含量が低下したのに対し、 CNP トランスジエニックマウスではその変化は軽微であり、 CNP トランスジェニックマウスはコラゲナーゼ投与による関節軟骨変性に抵抗性であることが病理組織学的に示された（図 8 )。このとき、血漿中 CNP 濃度を EIA キット（Phoenix Pharmaceut ica l 社製）を用いて測定したところ、野生型マウスの平均値は 0. 21 ng/mLであったのに対し、 CNP トランスジエニックマウスでは 0. 50 ng/mLであつた。

これらの結果から、 CNP の変形性関節症における関節炎症抑制作用と関節軟骨変性抑制作用を有することが判明した。実施例 7

ィンフュージョン投与した CNPの変形性関節炎モデルに対する治療効果（1)

9週齢の C57BL/6 J系の雄マウスの背部皮下に、以下の溶液を含むォスモティックポンプ（2004型、 Durect社製）を移植した。

'溶媒： 5 % デキストロース（純正化学社製）、 10% マンノース（ナカライテスク社製）および 5 mmol/L 塩酸（和光純薬社製）を含有する蒸留水。

- CNP-22 (Calbiochem Novabiochem社製） 10 mg/mL 溶液（60 ng/日）。

• CNP— 22 (Calbiochem Novabiochem社製） 100 mg/mL 溶液（600 ng/日）。

移植後 6 日に 1. 5% タイプ I Iコラゲナーゼ（Sigma社製）溶液 6 mLを右膝関節内に投与し、 6 日後まで膝左右の膝関節幅をノギス（ミツトヨ社製）を用いて投与後 28 曰まで経時的に測定し、左右の差を算出した。この差を膝関節腫脹を表す値とし、その AUCを溶媒対照群と CNP投与群の間で Student t検定で比較した（SAS ver. 6. 12)。その結果、 CNP-22投与群の AUCはいずれの用量とも溶媒対照群に対し有意に小さかった。また、実施例 5に記載した方法でへマトキシリン ·ェォジン染色標本およびサフラニン 0染色標本を作成し、病理組織学的に解析した。その結果、溶媒対照群ではコラゲナーゼにより滑膜における滑膜細胞増勢、肉芽組織形成、炎症性細胞浸潤が顕著であつたのに対し、 CNP 投与群ではこれら変化が著しく弱いことが判明した（図 9 )。滑膜組織膝関節のこの結果から、 CNPが変形性関節症に対して治療効果を有することが判明した。実施例 8

インフュージョン投与した CNPの変形性関節炎モデルに対する治療効果（2)

9週齢の C57BL/6 J系の雄マウス（日本クレア社製）の背部皮下に、以下の溶液を含むォスモティックポンプ（2004型、 Durect社製）を移植した。

• 溶媒： 5 % デキストロース（純正化学社製）、 10% マンノース（ナカライテスク社製）および 5 mmol/L 塩酸（和光純薬社製）を含有する蒸留水。

- CNP-22 (Calbiochem Novabiochem社製） 10 mg/mL 溶液（60 ng/日）。

• CNP- 22 (Calbiochem Novabiochem社製） 100 mg/mL 溶液（600 ng/曰）。

移植翌日にマウスをエーテル麻酔し、右膝関節に対して前十字靭帯切断、内側則副靭帯切断および内側半月板全切除の外科処置を施し、変形性関節症を惹起した。左右膝関節幅をノギス（ミツトヨ社製）を用いて投与後 1 1 日まで経時的に測定し、左右の差を算出した。この差を膝関節腫脹を表す値とし、その AUCを溶媒対照群と CNP投与群の間で Student t検定で比較した（SAS前臨床パッケージ、 SASィンスティチュートジャパン社製）。その結果、 CNP- 22投与群の AUCはいずれの用量とも溶媒対照群に対し有意に小さかった（図 10)。

この結果から、 CNP が外科処置により惹起される、膝関節への物理的過荷重にもとづく変形性関節症における関節炎症に対しても抑制作用を有することが明らかになつた。実施例 9

コラゲナーゼ 0Aモデルにおける非ステロイド性抗炎症薬（NSAID)と CNPの併用効果

9週齢の C57BL/6 J系の雄マウスの背部皮下に、以下の溶液を含むォスモティックポンプ（2004型、 Durect社製）を移植した。 '溶媒： 5 % デキストロース（純正化学社製）、 10% マンノース（ナカライテスク社製）および 5 mmol/L 塩酸（和光純薬社製）を含有する蒸留水。

- CNP-22 (Ca lb iochem Novab i ochem社製) 1 μ g/ml 溶液 (6 ng/日）。

また、 NSAIDであるインドメタシン（S i gma社製）の効果と、 CNPと併用したときの効果を検討するために、上記のポンプ移植日から 1 日 1回、連日 4日間 lmg/kg の用量でィンドメタシンの 0. 2%カルボキシメチルセルロース（ナカライテスク社製）溶液への懸濁液を強制経口投与した。

実験群は以下の如く設定した。

溶媒対照（インフユ一ジョン溶媒、経口投与溶媒）

CNP 6 ng/曰

インドメタシン 1 mg/kg

CNP 6 ng/日 + インドメタシン 1 mg/kg

ポンプの移植当日に 0. 15% タイプ I I コラゲナーゼ（S i gma社製）溶液 6 L、翌日に 1. 5% タイプ I Iコラゲナーゼ溶液 6 I Lを右膝関節内に投与し、膝左右の膝関節幅をノギス（ミツトヨ社製）を用いて投与後 7日まで経日的に測定し、左右の差を算出した。この差を膝関節腫脹を表す値とし、その AUCを溶媒対照群と CNP投与群の間で Studen t t検定で比較した（SAS ver. 6. 12)。

その結果、インドメタシン単独では膝関節腫脹を抑制しなかった。このとき、 CNP 6 ng/日群は有意に膝関節腫脹を抑制した。しかし、 CNP とインドメタシンを併用した群では CNP単独群に対しても有意に膝関節腫脹を抑制していた（図 11)。この結果から、 CNP による膝関節腫脹抑制は、寧-独投与では関節炎治療の標準薬である NSAIDに比して有意な効果を有することに加え、 NSAID との併用投与では相乗的な効果を有することが判明した。実施例 1 0

ラットアジュバント関節炎モデルに対する CNPの作用

6週齢の LEW/Crj系ォスラット（日本チャールズ' リバ一社製）の背部皮下に、以下の溶液を含むォスモティックポンプ（2004型、 Durect社製）を移植した。

CNP-22 (Calbiochem Novabiochem社製） 10 μ g/mL 溶液（60 ng/日）。

移植翌日に、結核死菌粉末（M. TUBERCULOSIS DES. H37 RA、 DIFCO LABORATORIES 社製を 3 mg/mLの濃度で流動パラフィン（純正化学社製）に懸濁し、 50 // Lをラット尾根部に皮内接種した。接種後、四肢末端の状態を以下の基準に従って経日的にスコア評価し、四肢末端スコアを合計したスコアをその個体の関節炎スコアとした。

スコア 0 ：病変なし

スコア 1 : 1 つ以上の指関節に発赤 ·腫脹が認められる。または甲の部分が赤変しているが腫脹は認められない。

スコア 2 ：前肢または後肢の甲に軽度の腫脹が認められる。

スコア 3 ：前肢または後肢の甲に高度な腫脹が認められるが、全ての指にはそれが認、められない。

スコア 4 ：前肢または後肢の甲および指に高度の腫脹が認められる。

その結果、 CNP 投与群では関節炎スコアが溶媒対照群に対して低下する傾向が認められた（図 12A)。

体重の推移も経日的に測定した。その結果、溶媒対照群に対して、 CNP 投与群は有意に体重の増加高かった（図 12B)。

これらの結果から、 CNP はラットアジュバントモデルにおいても関節炎を抑制し、一般状態を改善することが判明した。実施例 1 1

ラットコラーゲン関節炎モデルに対する CNPの作用

10週齢の DA/Slc系メスラット（日本エスエルシー社製）の背部皮下に、以下の溶液を含むォスモティックポンプ（2004型、 Durect社製）を移植した。

•溶媒： 5 % デキストロース（純正化学社製）、 10% マンノース（ナカライテスク社製）および 5 mmol/L 塩酸（和光純薬社製）を含有する蒸留水。

- CNP-22 (Calbiochem Novabiochem社製） 1 mg/mL 溶液（6 // g/日）。

移植直後に、ゥシ II型コラーゲン（コラーゲン技術研修会社製）を 1. 5 _mg/mL になるよう 0. 1 mol/L 酢酸水に溶角し、等用量の Adjuvant Incomplete Adjuvant (DIFCO LABORATORIES社製）と懸濁した液 400 しをラット背部に皮内接種した。接種後、体重の推移も経日的に測定した。また、ポンプ移植も接種も行わない正常群も設定し、同様に体重の推移を測定した。

その結果、正常群に対して溶媒対照群は有意に体重が減少するのに対して、 CNP 投与群は溶媒対照群に対して有意に体重減少が少なかった（図 13)。この結果から、 CNP はラットコラーゲン関節炎モデルにおいて、一般状態を改善することが判明した。産業上の利用可能性

本発明の、 GC-B活性化物質を有効成分として含む治療剤又は予防剤は、関節軟骨の厚さおよび関節軟骨細胞数が有意に増加させること、関節腫脹に抵抗性であること、関節軟骨変性が抑制されること、滑膜細胞增勢、肉芽組織形成、炎症性細胞浸潤の変化が著しく弱いこと、並びに、関節軟骨中のプロテオダリカン含量が低下しないことなどの効能をもつことから、変形性膝関節症、変形性股関節症、変形性肘関節症、変形性脊椎症、顎関節症などの変形性関節症を含む関節炎症の治療又は予防のために有用である。本発明の医薬の投与によって、関節患部における関節軟骨基質および軟骨細胞数の減少抑制又は再生が起こり、関節軟骨変性と関節部の腫脹が抑制され、これによつて関節炎症が抑制又は軽減される。特に本発明の変形性関節症治療剤は、従来の関節鏡視下手術、人工関節置換や骨切り術などの整形外科手術と比べて患者の負担や苦痛が少ないために、患者の Q0Lに配慮した、優れた治療剤となりうる。

GC-B活性化物質が上記のような効能をもっという新規の知見から、 GC-Bを活性化することによって、関節炎症を抑制すること及び関節軟骨細胞の増殖を促進させることが可能である。また、 GC-Bの活性（たとえば細胞内 c GMP産生量）を指標とすることによって、関節軟骨細胞増殖促進剤や関節炎症治療剤をスクリーニングすることも可能である。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。配列表フリーテキスト

配列番号 1の説明： 6- Cys と 22- Cysの間でジスルフィド結合が形成される。

配列番号 2の説明： 37-Cys と 53- Cysの間でジスルフィド結合が形成される。

配列番号 3の人工配列の説明： CNP-22誘導体（ここで、 6-Cys と 22-Cysの間でジスルフィド結合が形成される）。

配列番号 4の人工配列の説明： CNP- 22誘導体（ここで、 6-Cys と 22-Cysの間でジスルフィド結合が形成される）。

配列番号 5の人工配列の説明： CNP-22誘導体（ここで、 6- Cys と 22-Cysの間でジスルフィド結合が形成される）。

配列番号 6の人工配列の説明： CNP' -22誘導体（ここで、 1- Cys と 17- Cysの間でジスルフィド結合が形成される）。

配列番号 7の人工配列の説明： CNP -22誘導体（ここで、 7_Cys と 23_Cysの間でジスルフィド結合が形成される）。

配列番号 8の人工配列の説明： CNP- 22誘導体（ここで、 6-Cys と 22-Cysの間でジスルフィド結合が形成される）。

配列番号 9の人工配列の説明： CNP 22誘導体（ここで、 1-Cys と 17 - Cysの間でジスルフィド結合が形成される）。

配列番号 10の人工配列の説明： CNP-22誘導体（ここで、 4 - Xaa=Leu, li e, Val ; 5-Xaa=Lys, Leu, Met ; 6-Xaa=Leu, l ie, Ala, Val ; l l-Xaa=Ser, Ala, Gly, Thr, Asn ; 12-Xaa=Met, Ala, Trp, His, Lys, Ser, Gly； 14-Xaa=Gly, Lys, Ala, Leu ; 15 - Xaa=Leu, Met。また、 1- Cys と 17-Cysの間でジスルフィド結合が形成される。）。

Claims

請求の範囲

1 . グァニルシクラーゼ B (GC-B)活性化物質を有効成分として含むことを特徴とする、関節炎症の治療剤又は予防剤。

2 . 前記関節炎症が変形性関節症である、請求項 1に記載の治療剤又は予防剤。

3 . 前記変形性関節症が荷重関節の変形性関節症又は非荷重関節の変形性関節症である、請求項 2に記載の治療剤又は予防剤。

4 . 前記変形性関節症が変形性膝関節症である、請求項 3に記載の治療剤又は予防剤。

5 . 前記変形性関節症が変形性股関節症である、請求項 3に記載の治療剤又は予防剤。

6 . 前記変形性関節症が顎関節症である、請求項 3に記載の治療剤又は予防剤。

7 . 前記関節炎症が関節リウマチに起因する、請求項 1に記載の治療剤又は予防剤。

8 . 前記関節炎症が変形性関節症に起因する、請求項 1に記載の治療剤又は予防剤。

9 . 前記 GC- B活性化物質が、 C型ナトリゥム利尿ぺプチド（CNP) 又はその誘導体である、請求項 1〜 8のいずれか一項に記載の治療剤又は予防剤。

1 0 . 前記じが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来の CNP- 22及び CNP- 53から選択される、請求項 9に記載の治療剤又は予防剤。

1 1 . 前記 CNPが、配列番号 1の CNP- 22又は配列番号 2の CNP- 53である、請求項 9に記載の治療剤又は予防剤。

1 2 . 前記誘導体が、配列番号 1又は配列番号 2のァミノ酸配列において 1 〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつ CNP活性を有するものである、請求項 9に記載の治療剤又は予防剤。

1 3 . 少なくとも 1つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含む、請求項 1に記載の治療剤又は予防剤。

1 4 . GC-B活性化物質を有効成分として含むことを特徴とする、関節軟骨細胞増殖促進剤。

1 5 . 前記 GC-B活性化物質が、 CNP又はその誘導体である、請求項 14に記載の増殖促進剤。

1 6 . 前記 CNPが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来の CNP- 22又は CNP-53である、請求項 15に記載の増殖促進剤。

1 7 . 前記 CNPが、配列番号 1の CNP- 22又は配列番号 2の CNP-53である、請求項 15に記載の増殖促進剤。

1 8 . 前記誘導体が、配列番号 1又は配列番号 2のアミノ酸配列において 1 〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつ CNP活性を有するものである、請求項 15に記載の増殖促進剤。

1 9 . 少なくとも 1つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含む、請求項 14 に記載の増殖促進剤。

2 0 . GC-Bを活性化することによって関節炎症を抑制することを特徴とする、関節炎症の抑制方法。

2 1 . 前記 GC-B 、 CNP又はその誘導体によって活性化される、請求項 20 に記載の抑制方法。

2 2 . 前記 CNPが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来の CNP- 22又は CNP-53である、請求項 21に記載の抑制方法。

2 3 . 前記 CNPが、配列番号 1の CNP- 22又は配列番号 2の CNP-53である、請求項 21に記載の抑制方法。

2 4 . 前記誘導体が、配列番号 1又は配列番号 2のァミノ酸配列において 1 〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつ CNP活性を有するものである、請求項 21に記載の抑制方法。

2 5 . 前記 GC-Bが、 CNP又はその誘導体と少なくとも 1つの非ステロイド性抗炎症薬との組み合わせによつて活性化される、請求項 20に記載の抑制方法。

2 6 . GC-Bを活性化することによって関節軟骨細胞の増殖を促進することを特徴とする、関節軟骨細胞の増殖促進方法。

2 7 . 前記 GC-B 、 CNP又はその誘導体によって活性化される、請求項 26 に記載の増殖促進方法。

2 8 . 前記 CNPが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来の CNP-22又は CNP- 53である、請求項 27に記載の増殖促進方法。

2 9 . 前記 CNPが、配列番号 1の CNP- 22又は配列番号 2の CNP- 53である、請求項 27に記載の増殖促進方法。

3 0 . 前記誘導体が、配列番号 1又は配列番号 2のアミノ酸配列において 1 〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつ CNP活性を有するものである、請求項 27に記載の増殖促進方法。

3 1 . 前記 GC-Bが、 CNP又はその誘導体と少なくとも 1つの非ステロイド性抗炎症薬との組み合わせによつて活性化される、請求項 26に記載の増殖促進方法。

3 2 . GC- Bの活性を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーユングすることを含む、関節軟骨細胞増殖促進剤のスクリーユング方法。

3 3 . GC-Bを発現する培養細胞又は関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞の GC- B活性を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリ一二ングすることを含む、請求項 32に記載のスクリ一ユング方法。

3 4 . 前記 GC-B活性が、細胞内 c GMP産生量として測定される、請求項 32 又は請求項 33に記載のスクリ一二ング方法。

3 5 . GC-Bを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内 c GMP の産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内 c GMP 産生量の差を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む、請求項 32に記載のスクリ一ユング方法。

3 6 . GC-Bの活性を指標として、変形性関節症、関節リゥマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、変形性関節症、関節リゥマチあるいは関節炎症治療剤のスクリ一二ング方法。

3 7 . GC-Bを発現する培養細胞又は関節軟骨細胞由来の細胞を难備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞の GC-B活性を指標として変形性関節症、関節リゥマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリ一二ングすることを含む、請求項 36に記載のスクリーニング方法。

3 8 . 前記 GC-B活性が、細胞内 c GMP産生量として測定される、請求項 36 又は 37に記載のスクリ一二ング方法。

3 9 . GC-Bを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内 c GMP の産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内 c GMP 産生量の差を指標として変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、請求項 36に記載のスクリーニング方法。

4 0 . グァニルシクラーゼ B (GC-B)活性化物質を有効成分として含む、変形性関節症の治療剤又は予防剤。

4 1 . 少なくとも 1つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含む、請求項 40 に記載の変形性関節症の治療剤又は予防剤。

4 2 . グァニルシクラーゼ B (GC-B)活性化物質を有効成分として含む、関節リゥマチの治療剤又は予防剤。

4 3 . 少なくとも 1つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含む、請求項 42 に記載の、関節リウマチの治療剤又は予防剤。

4 4 . 非ステロイド性活性化剤を含む、 GC- B活性化物質に対する活性化促進剤。

4 5 . 前記 GC-B活性化物質が、 CNP又はその誘導体である、請求項 44に記載の活性化促進剤。

4 6 . 前記 CNPが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来の CNP-22及び CNP- 53から選択される、請求項 45に記載の活性化促進剤。

4 7 . 前記 CNPが、配列番号 1の CNP- 22又は配列番号 2の CNP- 53である、請求項 45に記載の活性化促進剤。

4 8 . 前記誘導体が、配列番号 1又は配列番号 2のアミノ酸配列において 1 〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつ CNP活性を有するものである、請求項 45に記載の活性化促進剤。

4 9 . 前記非ステロイド性活性化剤がシクロォキシゲナーゼ酵素抑制剤である、請求項 44に記載の活性化促進剤。

5 0 . 前記シクロォキシゲナーゼ酵素抑制剤がインドメタシン、イブプロフェン、ピロキシカム、サリチル酸、ジクロフエナク、ケトプロフェン、ナプロキセン及びピロキシカムからなる群より選択される、請求項 49に記載の活性化促進剤。

5 1 . 請求項 44〜50 のいずれかに記載の活性化促進剤を使用することを特徴とする、 GC-B活性化物質の活性化方法。