KR20070017366A

KR20070017366A - 관절염증 치료제 또는 예방제

Info

Publication number: KR20070017366A
Application number: KR1020067022207A
Authority: KR
Inventors: 카즈와 나카오; 히데토모 기타무라
Original assignee: 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤; 카즈와 나카오
Priority date: 2004-03-31
Filing date: 2005-03-31
Publication date: 2007-02-09
Also published as: JP4825667B2; CN1960758A; US8658373B2; AU2005228817A1; CA2561530C; EP1759710A1; EP1759710A4; US7642243B2; CN1960758B; ES2465141T3; CA2561530A1; AU2005228817B2; WO2005094889A1; US20070197434A1; KR101207155B1; JPWO2005094889A1; EP1759710B1; US20100209958A1

Abstract

본 발명은 변형성 관절증 등의 관절염증에 대한 새로운 치료제 또는 예방제를 제공한다. 구체적으로는 구아닐 시클라제 B(GC-B) 활성화 물질을 유효성분으로 함유한 것을 특징으로 하는, 변형성 관절염증 등의 관절염증의 치료제, 예방제 또는 관절연골 세포의 증식촉진제, 또는 GC-B를 활성화함에 의한 관절염증의 억제방법 또는 관절연골 세포의 증식 촉진방법, 또는 GC-B의 활성을 지표로 한 관절연골 세포의 증식촉진제 또는 관절염증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

관절증, 구아닐 시클라제 B

Description

관절염증 치료제 또는 예방제 {REMEDY OR PREVENTIVE FOR ARTHRITIS}

본 발명은 구아닐 시클라제 B (이하 「GC-B」라고도 칭함) 활성화물질에 의한 관절염증, 특히 변형성 관절증 및 그 유사 관절염증의 치료제, 예방제 또는 관절연골 증식촉진제, 또는 관절염증의 억제방법, 관절 연골세포의 증식촉진방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, GC-B의 활성을 지표(指標)로 하는 관절염증 치료제 또는 관절 연골세포 증식촉진제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

관절염증은 관절의 염증성 질환으로서, 증례(證例)의 수가 가장 많은 질환이 만성관절 류머티즘 (rheumatoid arthritis) 및 변형성 관절증(골관절증)이다.

만성관절 류머티즘은 자기면역질환이라고 생각되는 것으로, 관절의 동통(疼痛), 경직(硬直), 종창(腫脹)의 증상을 수반하지만, 병상이 진행하면 자주 변형성 관절증과 같은 관절연골 표면의 변성으로 이어져, 마침내 관절의 뼈나 연골의 중증 파괴가 일어난다.

변형성 관절증은 고령자에게 다발하는 관절연골의 변성질환이다. 변형성 관절증(OA)이라 함은 관절의 구성요소의 퇴행변성에 따라, 연골의 파괴와 골이나 연골의 증식성 변화를 초래하는 질환으로서, 또한 상기 변화에 의해 2차적(속발성) 관절염(예를들어, 활막염; synovitis)을 초래하는 것이다. 변형성 관절증은 하중관 절인 슬관절(膝關節), 팔꿈치 관절 및 고관절(股關節)에서 많이 발생하고 있는바(Virchows Arch 1996; 260: 521-663), 어깨 관절, 팔꿈치 관절, 수관절과 같은 비하중 관절에서도 발생이 확인된다. 그리고 악관절에 있어서도 마찬가지 병태를 나타낸 악관절증이 알려져 있다(J Orofac Pain 1999; 13(4):295-306).

변형성 관절증에서 연골은 그 기능 본체인 연골기질 단백이 감소함과 더불어, 연골세포 수가 감소되어 있는 것이 알려져 있다 (Arth Rheum 2002; 46(8):1986-1996). 그러나 연골에는 혈관이 분포되어 있지 않은 점, 연골세포의 수가 적고 고도로 분화되어 있는 점, 연골 전구세포가 결핍되어 있는 점, 연골기질의 대사 회전이 느리다는 점의 이유로, 연골의 자기재생능력은 낮고 변형성 관절증에서의 관절 연골기질과 연골세포수의 감소가 자연치유될 가능성은 매우 낮다(Novartis Found. Symp. 2003;249:2-16). 또, 변형성 관절증에서는 연골변성과 함께 관절염증도 동시에 생기고, 관절동통의 원인으로 되고 있다 (J Rheumatol 2001; 28(6):1330-1337).

만성관절 류머티즘, 변형성 관절증 등의 관절염의 치료제·예방제로는, 예컨대 단백질 티로신 키나제 저해제(일본특허공개 평11-512708호), N-아실-2-글루코사민 유도체(일본특허공개 2004-507490호), 퀴놀린·키나졸린계 유도체(일본특허공개 9-169646호) 등이 보고되어 있다. 또, 현재 넓게 이용되고 있는 표준적인 변형성 관절증의 치료제는, 경구(經口)로 투약되는 소염진통제나, 관절 내에 주사되는 히알론산이나 부신피질 스테로이드 등으로서, 모두 관절동통의 억제제인바, 이들 관절 연골변성에 대한 억제작용을 가진 약제가 요구되고 있다(Decision Base 7, 2002).

구아닐 시클라제(GC)는 GTP으로부터 2차 메신저인 cGMP의 합성을 촉매하는 효소 패밀리에 속하는 막단백질로서, GC-A, GC-B, .., GC-F가 알려져 있다. GC-B는 주로 혈관내피 세포에서 발견되는 것으로, 평활근의 이완에 관여하는 것으로 생각되고 있다. GC를 활성화하는 물질로서 나트륨 이뇨 펩티드(NP)가 알려져 있다. NP류는 ANP(심방성 나트륨 펩티드), BNP(뇌성 나트륨 이뇨 펩티드) 및 CNP(C형 나트륨 이뇨 펩티드)의 3종류로 이루어져, 2종류의 구아닐 시클라제 공역수용체(ANP 및 BNP에 대한 NPR-A, CNP에 대한 NPR-B)를 매개로, 세포 내 cGMP 농도를 상승시킴으로써, 생물학적 활성을 나타낸다고 생각되고 있다 (Ann Rev Biochem 1991; 60:229-255).

구아닐 시클라제 공역수용체(公役受容體)가 아닌 NPR-C는, 시그널 전달에 관여하지 않는 NP 류의 클리어런스(clearance) 수용체로서 이해되고 있다(Science, 1987; 238: 675-678). 그러나, 마우스 골수 마크로파지를 리포폴리사카라이드(LPS)로 자극했을 때의 시클로옥시게나제 2(COX-2) 유도에 의한 프로스타그란딘 E₂(PGE₂) 생산을 항진(亢進)시키는 계(系)에서, ANP 및 CNP가 NPR-C를 개입시킨 세포 내 cAMP량 저하작용에 의거해서 ANP 및 CNP가 PGE_z 생산 억제 작용을 나타내는 것이 보고되어 있는바, NPR-C의 NP 류의 시그널 전달에의 관여가 시사되어 있다 ( Endocrinology 2002; 143(3):846-852). 이 문헌에서는 마우스 골수 마크로파지(BMM)의 LPS 자극에 의한 PGE₂ 생산 항진에 대해, ANP가 최대 약 70%의 억제효과를 나타내는 것에 대해, CNP는 최대 약 20%의 억제효과로서, CNP의 동(同) 작용이 약하다는 것이 기재되어 있다. cAMP이나 cGMP 등의 시클릭 뉴클레오티드를 개입시킨 COX-2의 생산 제어는, 세포의 종류나 자극의 종류에 따라 촉진/억제와 정반대의 반응을 취하는 것이 알려져 있기 때문에, CNP에 의한 BMM 세포에서의 LPS 유도의 PGE₂ 생산 억제가 그 이외의 세포나 자극에 대해 적용될 수 있는가는 불명확하다. 또, Endocrinology 2002; 143(3):846-852에는, ANP는 마우스에 LPS를 투여해서 혈중 트론복산 B_z(TXB_z) 농도가 상승하는 계에서 억제효과를 나타내는 것이 보고되어 있는바, 같은 메카니즘의 cANP에서는 역으로 항진시킨다고 하는 상반되는 결과가 얻어지고 있다. 또, 이 문헌에서는 ANP를 관절염이나 패혈증 등의 면역관련 질환에 적응하는 것이 기재되어 있지만, CNP의 관절질환에의 적응에 대해 어떤 언급도 되어 있지 않다. 따라서 CNP의 관절염증에 대한 작용에 대해서는 현재까지 전혀 알려져 있지 않다.

NP 류는 체액의 항상성의 제어나 혈압의 조절에 중요한 역할을 한다고 보고되어 있으나(J Clin Invest 1987;93:1911-1921, J Clin Invest 1994;87:1402-1412), 심장혈관계 이외의 여러 가지 조직에서의 발현과 그 생리활성도 알려져 있다 (Endocrinol 1991;129:1104-1106, Ann Rev Biochem 1991;60:553-575). 연골에 관해서는, BNP(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998;95:2337-2342) 또는 CNP의 과잉발현 트랜스제닉 마우스에서의 성장연골의 신장과 연골 무형성증의 치료에 CNP가 사용된 것이 보고되어 있다(Nat Med 2004;10(1):80-86, 일본특개 2003-113116호). 그러나 성장연골은 석회화를 거쳐 골로 치환되어 최종적으로 소실되는 일시성 연골로서, 관절연골이나 기관(氣管)연골과 같이 생애에 걸쳐 존재하는 영구연골과는 다른 생물학적 성질을 가진 것으로 알려져 있다(Dev BioI 1989;136(2):500-507, J Cell BioI 2001;153(1):87-100). 그리고 영구연골인 관절 연골세포에 대한 CNP의 비대화 촉진작용이 생체외에서 보고되어 있으나(J BioI Chern 2003;278(21):18824-18832), 정상동물의 관절 연골에 대한 생체내에서의 작용이나 변형성 관절증에서의 관절연골의 변성파괴에 대한 작용이나 동 질환에서의 관절염증에 대한 작용에 대해서는 현재까지 알려져 있지 않다.

변형성 관절증에서는 관절연골은 병태(病態)의 극히 초기에 일단 비대화해서 연골조직 용량이 증가하지만(J Rheum 1991;18(3):1905-1915), 병태의 진전과 함께 연골기질의 변성·파괴가 진행해서 용량은 감소한다 (Arthritis Rheum 2004;50(2):476-487). 이때 관절 연골세포의 수는 세포자멸사 (apoptosis)에 의해 감소한다 (Arthritis Rheum 2004; 50(2):507-515). 한편, 잔존하는 개개의 관절 연골세포는 X형 콜라겐을 발현해서 비대 연골세포로 분화하여, 일시성 연골의 성질을 갖는다는 것이 알려져 있다 (Arthritis Rheum 1992;35(7):806-811). 또, 관절연골의 파괴에 수반해서 관절염증도 생기고 있는바, 임상적으로 이환관절(affected jiont)서의 동통의 요인인 것으로 생각되고 있다 (J Rheumatol.2001;28(6):1330-1337). 변형성 관절증에서의 이들 변화의 억제, 즉 관절연골 기질 및 관절 연골세포수 감소의 억제 또는 복원 및 관절염 억제는 치료약 개발에서 유용하다고 생각될 수 있다.

본 발명의 목적은 변형성 관절증을 포함한 관절염증에 대한 새로운 치료제 또는 예방제, 또는 당해 관절염증의 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 관절 연골세포의 증식을 촉진하는 약제 또는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 변형성 관절증을 포함한 관절염증을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 관절염증 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 관절 연골세포 증식촉진제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

발명의 개요

본 발명자들은 구아닐 시클라제 B(GC-B) 활성화 물질의 일종인 C형 나트륨 이뇨 펩티드(CNP)를 과잉발현하는 CNP 트랜스제닉 마우스를 만들어, 관절연골에의 영향을 검정한 결과, CNP 트랜스제닉 마우스에서는 관절연골의 두께 및 관절연골 세포수가 유의하게 증가되는 것, 그리고 CNP 트랜스제닉 마우스를 이용해서 만든 변형성 관절증 모델에서는 관절종창에 저항성인 것 및 관절연골 변성이 억제되는 것, 활막세포 증가추세, 육아(肉芽)조직 형성, 염증성 세포침윤의 변화가 현저히 약한 것, 관절연골 중의 프로테오글리칸 함량은 저하되지 않은 다는 것, 이에 대해 정상 마우스를 이용한 변형성 관절증 모델에서는 활막세포 증가추세, 육아조직 형성, 염증성 세포침윤의 변화가 현저함을 알아내었다. 이들 지견으로부터, 본 발명자들은 GC-B 활성화 물질이 관절염 억제작용과 관절연골에 대한 동화적(assimilating) 작용 둘 다를 겸비한다는 것을 알아내었다.

따라서, 본 발명은 이하의 발명으로 이루어진다.

본 발명은 제1 실시태양으로, 구아닐 시클라제 B(GC-B) 활성화 물질을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 관절염증의 치료제 또는 예방제를 제공한다.

본 발명의 하나의 실시태양으로, 상기 관절염증이 변형성 관절증이다.

본 발명의 또 다른 실시태양으로, 상기 변형성 관절증이 하중관절의 변형성 관절증 또는 비하중 관절의 변형성 관절증이다.

본 발명의 또 다른 실시태양으로, 상기 변형성 관절증이 변형성 슬관절증이다.

본 발명의 또 다른 실시태양으로, 상기 변형성 관절증이 변형성 고관절증이다.

본 발명의 또 다른 실시태양으로, 상기 변형성 관절증이 악관절증이다.

본 발명의 또 다른 실시태양으로, 상기 관절염증이 관절 류머티즘에 기인하는 것이다.

본 발명의 또 다른 실시태양으로, 상기 관절염증이 변형성 관절증에 기인하는 것이다.

본 발명의 또 다른 실시태양으로, 상기 GC-B 활성화 물질이 C형 나트륨 이뇨

펩티드(CNP) 또는 그 유도체이다.

본 발명의 또 다른 실시태양으로, 상기 CNP가 인간을 포함한 포유류 또는 조류 유래의 CNP-22 및 CNP-53으로부터 선택되는 것이다.

본 발명의 또 다른 실시태양으로, 상기 CNP가 서열번호 1의 CNP-22 또는 서열번호 2의 CNP-53이다.

본 발명의 또 다른 실시태양으로, 상기 유도체가 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 1 ~ 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되고, 또한 CNP 활성을 가진 것이다.

본 발명의 다른 실시태양으로, 상기 관절염증의 치료제 또는 예방제가 적어도 1가지 비스테로이드성 항염증약을 더 함유하는 것이다.

본 발명은 또한, 제2 실시태양으로, GC-B 활성화물질을 유효성분으로 함유한 것을 특징으로 하는 관절 연골세포 증식촉진제를 제공한다.

본 발명의 하나의 실시태양으로, 상기 GC-B 활성화 물질이, CNP 또는 그 유도체이다.

본 발명의 또 다른 실시태양으로, 상기 CNP가 인간을 포함한 포유류 또는 조류 유래의 CNP-22 또는 CNP-53이다.

본 발명의 또 다른 실시태양으로, 상기 유도체가 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 1 ~ 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가됨과 더불어 CNP 활성을 가진 것이다.

본 발명의 또 다른 실시태양으로, 상기 관절 연골세포 증식촉진제가 적어도 1 가지 비스테로이드성 항염증약을 더 함유하는 것이다.

본 발명은 또한, 제3 실시태양으로, GC-B를 활성화함으로써 관절염증을 억제하는 것을 특징으로 하는 관절염증의 억제방법을 제공한다.

본 발명의 하나의 실시태양으로, 상기 GC-B는 CNP 또는 그 유도체에 의해 활성화된다.

본 발명의 또 다른 실시태양으로, 상기 GC-B가 CNP 또는 그 유도체와 적어도 1가지 비스테로이드성 항염증약과의 조합에 의해 활성화된다.

본 발명은 또한, 제4 실시태양으로, GC-B를 활성화함으로써 관절 연골세포의 증식을 촉진하는 것을 특징으로 하는 관절 연골세포의 증식촉진 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시태양으로, 상기 GC-B가 CNP 또는 그 유도체와 적어도 1 가지의 비스테로이드성 항염증약과의 조합시키는 것에 의해 활성화된다.

본 발명은 또한, 제5 실시태양으로, GC-B의 활성을 지표로 해서 관절 연골세포의 증식촉진에 대해 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함하는 관절 연골세포 증식촉진제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 하나의 실시태양으로, GC-B를 발현하는 배양세포 또는 관절 연골세포 유래의 세포를 준비하고, 당해 세포를 후보약제의 존재 하에서 배양하고, 당해 세포의 GC-B 활성을 지표로 해서 관절 연골세포의 증식촉진에 대해 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시태양으로, 상기 GC-B의 활성이 세포 내 cGMP 생산량으로서 측정된다.

본 발명의 또 다른 실시태양으로, 상기 방법은 GC-B를 강제로 발현시킨 배양세포주를 준비하고, 당해 세포주를 후보약제의 존재 하에 또는 비존재 하에서 배양하고, 당해 세포주의 세포 내 cGMP의 생산량을 측정해서, 후보약제의 존재 하와 비존재 하에서의 세포 내 cGMP 생산량의 차이를 지표로 해서 관절 연골세포의 증식촉진에 대해 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한, 제6 실시태양으로 GC-B의 활성을 지표로 해서, 변형성 관절증, 관절 류머티즘 또는 관절염증 치료제의 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함하는, 변형성 관절증, 관절 류머티즘 또는 관절염증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 하나의 실시태양으로, GC-B를 발현하는 배양세포 또는 관절연골세포 유래의 세포를 준비하고, 당해 세포를 후보약제의 존재 하에서 배양하고, 당해 세포의 GC-B 활성을 지표로 해서 변형성 관절증, 관절 류머티즘 또는 관절염증 치료제의 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시태양으로, 상기 방법은 GC-B를 강제로 발현시킨 배양세포주를 준비하고, 당해 세포주를 후보약제의 존재 하에 또는 비존재 하에서 배양하고, 당해 세포주의 세포 내 cGMP의 생산량을 측정해서, 후보약제의 존재 하와 비존재 하에서의 세포 내 cGMP 생산량의 차이를 지표로 해서 변형성 관절증, 관절 류머티즘 또는 관절염증 치료제의 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 제7 실시태양으로, GC-B 활성화 물질을 유효성분으로 함유하는 변형성 관절증의 치료제 또는 예방제를 제공한다.

본 발명의 실시태양으로, 상기 변형성 관절증의 치료제 또는 예방제가 적어도 1가지의 비스테로이드성 항염증약을 더 포함하는 것이다.

본 발명은 또한 제8 실시태양으로, GC-B 활성화 물질을 유효성분으로 함유한 관절 류머티즘의 치료제 또는 예방제를 제공한다.

본 발명의 실시태양으로, 상기 관절 류머티즘의 치료제 또는 예방제가 적어도 1가지 비스테로이드성 항염증약을 더 함유하는 것이다.

본 발명은 또한 제9 실시예에서, 비스테로이드성 활성화제를 함유한 구아닐 시클라제 B(GC-B) 활성화 물질에 대한 활성화 촉진제를 제공한다.

본 발명의 실시태양으로, 상기 GC-B 활성화 물질이 CNP 또는 그 유도체이다.

본 발명의 또 다른 실시태양으로, 상기 CNP가 인간을 포함한 포유류 또는 조류 유래의 CNP-22 및 CNP-53으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 실시태양으로, 상기 비스테로이드성 활성화제가 시클로옥시게나제 효소 억제제이다.

본 발명의 또 다른 실시태양으로, 상기 시클로옥시게나제 효소 억제제가 인도메타신, 이부프로펜, 피록시캄, 살리실산, 디클로페낙, 케토프로펜, 나프록센 및 피록시캄으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명은 또한 제10 실시태양으로, 상기 활성화 촉진제를 사용하는 것을 특징으로 하는 GC-B 활성화 물질의 활성화 방법을 제공한다.

본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본국 특허출원 2004-107924 호의 명세서 및/또는 도면에 기재된 내용을 포함한다.

도 1은 CNP 트랜스제닉 마우스 제작용 벡터의 구축(構築)을 나타낸다. 도 lA : pGEM-T Easy 벡터에 병합된 마우스 CNP의 cDNA를 Pst I로 절단하여 양 말단을 평활화하였다. 도 1B: pSGl를 EcoRI로 처리해서 절단된 말단(斷端)을 평활화하였다. 도 1C: 도 1A에서 얻어진 마우스 CNP의 cDNA를 도 1B에서 얻어진 pSG1에 병합하였다.

도 2는 주입용 DNA 단편을 나타낸다. 도 1C의 pSG1-CNP로부터 HindⅢ 및 XhoⅠ로 처리한 후, CNP 유전자를 포함한 단편(약 2.3kb)을 잘라내어 주입용 단편으로 하였다.

도 3은 서던 블롯법에 의한 도입유전자의 존재에 관한 CNP 트랜스제닉 마우스의 유전자형 해석결과를 나타낸다. 야생형 마우스(WT)에서는 3개의 시그널(야생형 CNP 유전자)이 검출되고, 트랜스제닉 마우스(Tgm)에서 야생형 CNP 유전자에 더해 도입유전자 유래의 시그널(트란스진)이 2개 검출되었다.

도 4는 CNP 트랜스제닉 마우스에서의 관절연골의 비후(肥厚)를 나타낸다. 대퇴골 슬개면(膝蓋面)의 관절연골의 두께에 대해, 정상 동복자(Wild)와 CNP 트랜스 제닉 마우스(CNP tgm) 사이에서 비교하였다. CNP 트랜스제닉 마우스는 통계학적으로 유의하게 관절연골이 두꺼운 것을 나타내고 있다. **: p ＜ 0.01, 대응이 없는 Student의 t 검정.

도 5는 CNP 트랜스제닉 마우스에서의 관절연골 세포수의 증가를 나타낸다. 대퇴골 슬개면의 관절연골에서의 광학현미경 하(대물 10배) 1시야 당의 연골세포수에 대해, 정상 동복자(同腹仔)(Wi1d)와 CNP 트랜스제닉 마우스(CNP tgm) 사이에서 비교하였다. CNP 트랜스제닉 마우스는 통계학적으로 유의하게 1시야의 연골 세포수가 많은 것을 나타낸다. *: p ＜ 0.05, 대응이 없는 Student의 t 검정.

도 6은 CNP 트랜스제닉 마우스의 콜라게나제 OA 모델에서의 관절종창 저항성을 나타낸다. CNP 트랜스제닉 마우스(Tgm) 및 야생형 마우스(WT)의 오른쪽 슬관절에 3% 콜라게나제 생리식염액을 투여한 후, 좌우의 슬관절 폭을 계측하여, 그 좌우차이를 슬관절 종창의 지표로 해서 추이(도 6A)와 그 곡선 하면적(AUC; 도 6B)을 평가하였다. CNP 트랜스제닉 마우스는 오른쪽 슬관절의 종창이 약한 경향이 있고, AUC는 야생형에 비하여 유의하게 작았다. **: p < 0.01, N.S.: 유의차 없음. 대응이 없는 Student의 t 검정.

도 7은 콜라게나제 OA 모델에서의 오른쪽 슬관절 활막의 조직학적 변화를 나타낸다. CNP 트랜스제닉 마우스 및 야생형 마우스의 오른쪽 슬관절에 3% 콜라게나제 생리식염액을 투여한 후, 28일에서의 오른쪽 슬관절 활막의 조직모양이다. 야생형 마우스에 3% 콜라게나제를 투여하면, 활막 상피세포의 증생(hyperplasia), 육아조직 형성 및 염증성 세포침윤이 확인되었다(도 7B). 한편, CNP 트랜스제닉 마우스 에서는 이들 소견은 극히 경미하였다(도 7C). 도 7A는 정상 활막조직을 나타낸다.

도 8은 콜라게나제 OA 모델에서의 오른쪽 대퇴골내 과관절(顆關節) 연골의 조직학적 변화를 나타낸다. CNP 트랜스제닉 마우스 및 야생형 마우스의 오른쪽 슬관절에 3% 콜라게나제 생리식염액을 투여한 후, 28일에서의 오른쪽 대퇴골내 과관절 연골의 조직모양이다. 야생형 마우스에서는 연골기질의 사프라닌 O 염색성이 저하되고, 프로테오글리칸의 함량 저하가 인정된 데(도 8B)에 대해, CNP 트랜스제닉 마우스에서는 사프라닌 O 염색성은 유지되고 있었다(도 8C). 도 8A는 정상 관절연골을 나타낸다.

도 9는 Infusion 투여한 CNP의 마우스 콜라게나제 OA 모델에서의 관절종창 억제효과를 나타낸다. C57BL/6 J Jcl 계 마우스에 CNP-22를 피하로 지속적으로 투여하고, 오른쪽 슬관절에 1.5% 콜라게나제 생리식염액을 투여해서 6일 후에 측정한 오른쪽 슬관절 종창을 나타낸다. CNP-22는 60, 600ng/일 군과 함께 용매 대조군(비히클)에 비하여 유의하게 오른쪽 슬관절의 종창을 억제하였다. 대응이 없는 Student의 t 검정.

도 10은 Infusion 투여한 CNP의 마우스 외과적 OA 모델에서의 관절종창 억제효과를 나타낸다. C57BL/6 J Jcl 계 마우스에 CNP-22를 피하로 지속적으로 투여하고, 오른쪽 슬관절에 전(前)십자 인대 절제, 내측 칙부인대 절제 및 내측 반월판 전부 절제의 외과처리를 가해서 변형성 관절증을 야기시켰다. 시술 후 4, 8, 11일 후에 좌우 슬관절 폭을 측정하여, 그 차이의 AUC를 나타내었다. CNP-22는 60, 600ng/일 군과 함께 용매 대조군(비히클)에 비해 유의하게 오른쪽 슬관절의 종창을 억제하였다. 대응이 없는 Student의 t 검정.

도 11은 C57BL/6 J Jcl 계 마우스 콜라게나제 OA 모델에서의 슬관절 종창에 대한, CNP-22(6ng/일, 피하 지속투여), 인도메타신(Indo., 1mg/kg, 경구투여), 및 이들을 병용했을 경우의 억제효과를 나타낸다. 도 llA는 마우스 오른쪽 슬관절에 0.15%와 1.5% 콜라게나제 생리식염액을 투여한 후 7일간에 걸쳐 오른쪽 슬관절 종창의 추이를 나타낸다. 도 11B는 도 llA 그래프의 곡선 하면적(AUC)을 나타낸다. AUC의 비교에서, CNP-22는 용매 대조군(비히클)에 대해 유의하게 오른쪽 슬관절의 종창을 억제하였으나, 인도메타신은 억제되지 않았다. 한편, CNP-22와 인도메타신을 병용한 군은 현저한 억제를 나타내고, CNP-22 단독군에 비하여 유의한 억제를 나타내었다. 대응하지 않는 Student의 t 검정. *: p ＜ 0.05(vs. 비히클), **: p ＜ 0.01(vs. 비히클).

도 12는 랫 아쥬번트 관절염 모델에 대한 CNP-22의 사지말단의 관절염과 체중추이에 대한 효과를 나타낸다. 도 12A는 사지말단의 관절염 스코어의 추이를 나타내는바, CNP-22 군에서는 관절염 스코어가 낮은 경향이 인정된다. 도 12B는 체중의 추이를 나타내고 있고, 항원감작 후 7, 10일에서 CNP-22 군이 용매 대조군(피히클)에 비해 유의하게 체중이 무거운 것이 나타내어져 있다. 대응이 없는 Student t 검정. *: p ＜ 0.05(vs 비히클).

도 13은 랫 콜라겐 관절염 모델 체중에 대한 CNP-22의 작용을 나타낸다. 정상군에 비해, 용매 대조군(비히클)은 항원감작 후 21, 24, 28일에서 유의하게 체중이 가벼웠지만, 이때 CNP-22 군(CNP 6㎍/일)에서는 용매 대조군에 비해 유의하게 체중이 무거운 것이 나타나 있다. 대응이 없는 Student t 검정. ##: p ＜ 0.01(vs. 정상), *: p ＜ 0.05(vs. 비히클).

이하, 도면을 참조하면서, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명자들 후술되는 실시예 2에 기재된 것과 같이 해서 만든 CNP-트랜스제닉 마우스(CNPTgm)에 대해 서던 블롯법을 이용해서 유전자형 해석을 실행하였더니, 도 3에 나타나 있듯이, 야생형 마우스에서는 3개의 시그널(야생형 CNP 유전자)이 검출되고, CNPTgm에서는 야생형 CNP 유전자에 더해 도입유전자 유래의 2개의 시그널(트란스진)이 검출되었다. CNPTgm에서의 CNP의 발현을 검토하기 위해, 도입한 유전자의 고발현이 예상되는 장기인 간장(肝臟) 및 혈장(血漿)에서의 CNP의 농도를 조사하였더니, CNPTgm은 야생형에 비해, 간장에서 약 10배, 혈장에서 약 24배의 CNP 농도를 나타내고 있는바, 통계학적으로 유의하게 CNP 펩티드가 과잉발현되어 있는 것이 확인되었다 (실시예 4의 표 1).

그리고 CNPTgm의 관절연골의 조직학적 해석을 실행하기 위해, 관절연골의 두께 및 연골 세포수를 조직학적으로 조사하였더니, 관절연골의 두께는 CNPTgm에서 통계학적으로 유의하게 두꺼웠고(도 4), 또 관절연골 세포수도 CNPTgm에서 통계학적으로 유의하게 많은 것(도 5)이 확인되었다. 이들 결과로부터, CNP 등의 GC-B 활성화 물질은 연골 세포수를 증가시킴으로써 관절연골의 두께를 증가시킬 수 있음이 나타났다.

후술되는 실시예 6에서는 마우스를 이용해서 슬관절 내로 콜라게나제 주사를 해서 슬관절의 인대 및 반달판을 불안정화시켜 변형성 관절증을 야기하는 변형성 관절염 병태 모델 동물을 만들었다(Am. J. Pathol.1989; 135:1001-14). CNPTgm의 관절염증 및 관절연골 변성에 대한 저항성을 평가할 목적으로, CNPTgm 및 정상 마우스를 이용해서 만든 각 변형성 관절염 모델동물을 이용해서 검토를 실행하였더니, CNPTgm을 이용해서 만든 모델 동물에서는 정상 마우스를 이용해서 만든 모델동물과 비교해서 슬관절 종창이 유의하게 작아진 것, 관절연골 변성이 유의하게 억제되어 있는 것, 활막에서의 활막세포 증가추세, 육아조직의 형성, 염증성 세포침윤의 변화가 현저히 약해진 것, 및 관절연골 중의 프로테오글리칸 함량에는 거의 변화가 없다는 것이 확인되었다(도 6 ~ 도 8). 이들 결과로부터 GC-B 활성화 물질이 변형성 관절증에서 관절염증 억제작용과 관절연골 변성 억제작용을 갖는다는 것이 판명되었다.

그리고 또, 삼투압 펌프를 이식한 정상 마우스를 이용해서 변형성 관절염 모델을 만들어 변형성 관절염 모델에 대한 CNP 주입의 치료효과의 검토를 실행하였다. CNP 투여군에서는 슬관절 종창에 저항성인 것, 관절연골 변성이 유의하게 억제되어 있는 것, 활막에서의 활막세포 증가추세, 육아조직의 형성, 염증성 세포침윤의 변화가 현저히 약해진 것이 확인되었다(도 9). 이들 결과로부터 GC-B 활성화 물질은 변형성 관절증에 대한 치료효과를 갖는다는 것이 판명되었다.

그리고 삼투압 펌프를 이식한 정상 마우스의 오른쪽 슬관절에 대해 전십자인대 절단, 내측 측부인대 절단 및 내측 반월판 전부절제의 외과처리를 실시하고 변형성 관절증을 야기시켜, CNP 주입의 변형성 관절염 모델에 대한 치료효과의 검토 를 실행하였다. 그 결과 CNP 투여군의 AUC(곡선 하면적)는 어떤 용량으로도 용매 대조군에 비해 유의하게 작아진 것이 확인되었다(도 10). 이 결과로부터 GC-B 활성화 물질이 외과처리에 의해 야기되는 슬관절에의 물리적 과하중에 기한 변형성 관절증에서의 관절염증에 대해서도 억제작용을 갖는다는 것이 밝혀졌다.

그리고 또, 콜라게나제 OA 모델 마우스에 CNP를 단독으로 또는 비스테로이드성 항염증약(NSAID)과 병용해서 투여했을 때, 사용한 NSAID 단독으로는 슬관절 종c창을 억제하지 않았으나, CNP 단독 투여에서는 유의하게 슬관절 종창을 억제하였고, CNP와 NSAID과의 병용투여에서는 보다 큰 상승적 종창 억제효과를 나타내는 것이 판명되었다(실시예 9, 도 11).

그리고 또, 관절 류머티즘(RA) 모델로서 실험실에서 범용되고 있는 아쥬번트 관절염 모델 및 콜라겐 관절염 모델 (Arthritis & Rheumatism, 27:797-806, 1984; British Journal of Rheumatology, 33:798-807, 1994)을 이용해서 CNP의 효과를 더 조사한 결과, CNP 투여군(랫)에서는 관절염이 유의하게 억제됨과 더불어, 대조군에 비해 체중증가가 관찰되어 일반상태의 유의한 개선이 확인되었다(실시예 10, 11, 및 도 12, 13). 이들 결과는 CNP가 관절 류머티즘에 의한 관절염에 대해 효능이 있음을 나타내고 있다.

이와 같은 실증예에 기해, 본 발명자들은 특정한 이론이나 특정한 실험예에 구속되지 않고, CNP 등의 GC-B 활성화 물질이 관절염증 억제작용과 관절연골에 대한 동화적 작용의 양자를 겸비하는 것을 알아내었다.

따라서 본 발명은 GC-B 활성화 물질을 유효성분으로 함유한 것을 특징으로 하는 관절염증의 치료제 또는 예방제를 제공한다.

본 발명에서 치료 또는 예방할 수 있는 관절염증은 특히 관절연골에 관련되는 질환으로서, 예컨대 변형성 관절증에 기인하는 관절염증, 활막염, 관절 류머티즘(예컨대 만성관절 류머티즘(성인)이나 청년성 관절 류머티즘(어린이), 골관절염, 전신 홍반성 낭창(SLE), 통풍, 강피증(强皮症), 건선(건선성 관절염), 블라스토마이코시스 등의 진균감염, 강직성 척추염, 레이터(Reiter) 증후군, 패혈증성 관절염, 성인 스틸(Still)병, 제3차 라임(Lyme)병(후기), 결핵(결핵성 관절염), 바이러스 감염(바이러스성 관절염), 임질(임균성 관절염) 또는 박테리아에 의한 감염(비임균성 세균성 관절염) 등에 기인하는 관절염증이 포함되는바, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 실시태양에서 바람직한 관절염증은 변형성 관절증, 또는 변형성 관절증에 기인하는 관절염증이다.

변형성 관절증은 관절연골의 변성과 파괴에 기인하는 질환으로서, 적응 가능한 변형성 관절증에는 예컨대 (1) 하중 관절인 슬관절, 고관절, 족관절, 척추 등에서의 변형성 슬관절증, 변형성 고관절증, 변형성 족관절증, 및 변형성 척추증 등의 하중관절에서의 변형성 관절증 및, (2) 비하중 관절인 견관절, 주관절, 수관절, 악관절 등에서의 변형성 견관절증, 변형성 주관절증, 변형성 수관절증(예컨대 헤버덴(Heberden) 결절, 보샤드(Bouchard) 결절, 변형성 엄지손가락 CM 관절증 등), 악관절증 등의 비하중 관절에서의 변형성 관절증이 포함된다.

본 발명의 실시태양에서 변형성 관절증은 하중 관절에서의 변형성 관절증으 로서, 바람직하기는 변형성 슬관절증 및 변형성 고관절증이다.

본 발명의 또 다른 실시태양에서 변형성 관절증은 비하중 관절에서의 변형성

관절증로서, 바람직하기는 악관절증이다.

본 발명의 치료제 또는 예방제는 또한 관절 류머티즘의 치료 또는 예방에도 적응가능하다. 관절 류마티즘은 자기면역질환이라고 생각되고 있는바, 변형성 관절증과는 병인을 달리하지만, 그 병상의 진행에 수반해서 변형성 관절증과 마찬가지로 관절연골 표면의 변성과 연골의 파괴가 일어난다. 이 때문에 본 발명의 치료제를 투여함으로써, 관절염증을 억제 또는 경감할 수가 있다.

본 명세서 중에서 사용하는 「치료」, 「치료방법」, 「치료제」라는 용어는 본 발명에 관계되는 관절염증을 가진 환자의 증상을 제거, 억제 또는 경감하는 것, 또는 그를 위한 방법 또는 의약을 의미한다. 또 「예방」, 「예방제」라는 용어는 관절염증을 예방하는 것, 또는 그를 위한 의약을 의미한다.

본 발명에서 구아닐 시클라제 B(GC-B)라 함은 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 B(NPR-B)와 동의(同義)의 용어로 사용한다.

본 발명에서 GC-B 활성이라 함은 구아닐 시클라제 활성과 동의의 용어로 사용한다. 본 발명에서 구아닐 시클라제 B(GC-B) 활성화 물질 또는 GC-B 활성화 물질은 CNP의 수용체으로서 알려진 GC-B와 결합해서 이를 활성화하는 펩티드 또는 비펩티드성 저분자 화합물로서, 바람직하기는 CNP 펩티드 또는 그 유도체이다. 여기서 펩티드는 복수의(L-, D- 및/또는 수식) 아미노산의 아미드 결합 연쇄로 된 물질을 지칭하는바, 이 중에는 폴리펩티드 및 단백질도 포함된다. GC-B 활성화 물질은 예 컨대 COS-7 등의 배양 세포주에 GC-B 수용체를 발현시켜, 배지에 후보약제를 첨가하고, 일정한 온도 및 일정한 시간(예컨대 37℃, 5분 후) 세포주를 배양한 후, 세포 내의 cGMP 생산량을 측정하는 방법(Science 1991; 252: 120-123)으로 동정될 수 있다. 즉, 이와 같은 분석(assay)계를 사용해서 세포 내 cGMP의 생산량을 지표로 해서 GC-B 활성화물질을 동정하고, 그것을 본 발명에 사용할 수가 있다.

본 발명의 실시태양으로 GC-B 활성화 물질은 펩티드로서 CNP 또는 그 유도체이다. 바람직한 CNP는 인간을 포함한 포유류 또는 조류 유래의 CNP-22 및 CNP-53으로부터 선택되는 것으로, 더 바람직하기는 서열번호 1의 CNP-22 또는 서열번호 2의 CNP-53이다.

본 발명의 또 다른 실시태양으로, 상기 유도체는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 1 ~ 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가됨과 더불어 CNP 활성을 가진 것이다. 또는 상기 CNP 유도체는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열과 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상의 % 동일성을 가진 서열을 포함함과 더불어 CNP 활성을 가진 것이다.

본 명세서 중에서 사용되는 「1 ~ 수개」라는 용어는 통상 1 ~ 10, 바람직하기는 1 ~ 5, 더 바람직하기는 1 ~ 3의 임의의 정수를 나타낸다. 또, 2개의 아미노산서열 사이의 「% 동일성」은 당업자에게 공지의 BLAST 단백질 검색 등의 수법을 이용해서 결정할 수가 있다 (Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J.(1990) " Basic Local Alignment Search Tool" J. Mol. Biol. 215 : 403-410).

본 발명에서 사용할 수 있는 CNP에는 인간을 포함한 포유류 유래의 CNP(CNP-22 : Biochem. Biophys. Res. Commun.1990; 168:863-870, 국제공개 W091/16342, CNP-53 : Biochem. Biophys. Res. Commun.1990; 170:973-979, 일본특개 평4-74198호, 일본특개 평4-139199호, 일본특개 평4-121190호), 조류 유래의 CNP(일본특개 평4-120094호), 양생류 유래의 CNP(일본특개 평4-120095호) 및, 일본특개 평6-9688호 공보, 국제공개 W002/074234에 개시된 CNP 유사체 펩티드와 같은 CNP 유도체가 포함된다.

천연 유래의 CNP로서, 22 및 53 아미노 잔기로 된 CNP-22 및 CNP-53 이 알려져 있는바, 조류 및 인간을 포함한 포유류 유래의 각 CNP를 비교하면 종(種)을 넘어 서열상동이 높기 때문에, 본 발명에서는 조류 또는 인간을 포함한 포유류 유래의 CNP, 바람직하기는 인간을 포함한 포유류 유래의 CNP, 더 바람직하기는 인간 유래의 CNP가 사용될 수 있다. 인간 CNP-22 및 CNP-53의 아미노산 서열은 아래의 서열번호 1 및 서열번호 2:

Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys (인간 CNP-22 : 서열번호 1);

Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys (인간 CNP-53 : 서열번호 2)

로 도시되는 서열을 갖고 있는바, 모두 분자 내 디설파이드 결합을 갖고, 즉 인간 CNP-22에서는 6번 위치의 시스테인 잔기와 22번 위치의 시스테인 잔기와의 사이에서, 또 인간 CNP-53에서는 37번 위치의 시스테인 잔기와 53번 위치의 시스테인 잔기와의 사이에서 각각 분자 내 디슬파이드 결합을 갖고서 환상펩티드 구조를 형성하고 있다.

돼지 CNP-22 및 랫 CNP-22는 인간 CNP-22와 동일한 아미노산 서열을 갖고 있지만, 한편 돼지 CNP-53 및 랫 CNP-53에서는 17번 위치 및 28번 위치의 아미노산 잔기가 각각 His 및 Gly 임에 비해, 인간 CNP-53에서는 각각 GIn 및 Ala 이어서, 2개의 아미노산이 상위하였다(일본특개 평4-139199호, 일본특개 평4-121190호, 일본특개 평4-74198호). 그리고 또, 닭 CNP-22는 9번 위치의 아미노산 잔기 Val 만이 인간 CNP-22와 다른 이외는 같은 1차 구조를 갖고 있다 (일본특개 평4-120094호).

본 발명에서 사용될 수 있는 상기 CNP는 천연으로부터의 정제 CNP, 기존의 유전자공학적 수법으로 제조된 유전자 재조합 CNP, 기존의 화학합성법(예컨대 펩티드 합성기를 이용하는 고상합성법)으로 제조된 CNP를 포함하고, 바람직하기는 유전자공학적 수법으로 제조된 인간 CNP-22 및 인간 CNP-53이다. 유전자공학적 수법에 의한 인간 CNP의 제조는 예컨대, 인간 CNP-22 또는 CNP-53의 DNA 서열(일본특개 평4-139199호)을 플라스미드, 파지 등의 벡터에 도입하고, 대장균이나 효모 등의 원핵 또는 진핵생물 숙주세포에 형질전환한 후, 적합한 배지 중에서 발현하고, 바람직하기는 세포 외에 CNP 펩티드를 분비시켜, 생산한 CNP 펩티드를 회수해서 정제하는 각 공정을 포함한다. 또, 목적 DNA의 증폭을 위해 폴리머라제 연쇄반응(PCR) 기 술을 사용할 수가 있다.

유전자 재조합 기술, 부위 특이적 돌연변이 유발법, PCR 기술 등의 기본적인 수법은 당업자에는 공지로서, 예컨대 J. Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); Ausubel 등, Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998) 등에 기재되어 있고, 그곳에 개시되는 기술을 본 발명을 위해 이용할 수 있다. 또 벡터로는 시판의 벡터 또는 간행물 기재의 벡터가 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 CNP 유도체는 CNP 활성을 가짐과 더불어, 인간 CNP-22 또는 CNP-53과 동일한 2개의 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합에 의한 환상펩티드 구조를 가진 것으로서, 상기 CNP의 단편, 상기 CNP 또는 그 단편의 구성 아미노산의 적어도 하나를 다른 아미노산으로 치환한 펩티드, 상기 CNP 그것 또는 그 부분 펩티드의 구성 아미노산의 적어도 하나를 결실한 펩티드, 및 상기 CNP 그것 또는 그 부분 펩티드의 구성 아미노산에 1 이상의 아미노산을 부가시킨 펩티드를 포함한다. 아미노산의 치환, 결실, 부가는 CNP 활성을 해치지 않는 이상 부위 특이적 돌연변이 유발법 등의 주지의 방법으로 아미노산의 치환, 결실 또는 부가할 수 있을 정도의 수의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가되는 것을 의미한다. 이와 같은 CNP-22 또는 CNP-53의 유도체는 예컨대, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 1 ~ 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가됨과 더불어 CNP 활성을 가진 것이다.

아미노산의 치환에 대해서는 일반적으로 보존적 아미노산 치환이 바람직하 다. 보존적 아미노산은 예컨대, 극성도(또는 소수성도)나 전하의 종류에 따라 분류될 수가 있다. 예컨대, 비극성의 비전하형 아미노산으로는 글리신, 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 프롤린 등, 방향족 아미노산으로는 페닐알라닌, 티로신, 트리프토판, 극성의 비전하형 아미노산으로는 세린, 트레오닌, 시스테인, 메티오닌, 아스파라긴, 글루타민 등, 음전하 아미노산으로는 아스파라긴산, 글루타민산, 양전하 아미노산으로는 라이신, 알기닌 및 히스티딘이 각각 포함된다.

본 발명에서 CNP 활성이라 함은 GC-B에 작용해서 구아닐 시클라제 활성을 상승시키는 활성이나 변형성 관절증을 포함한 관절염증을 제거, 억제 또는 경감하는 활성 또는 관절연골의 증식을 촉진시키는 활성을 말한다. CNP 활성은 세포의 구아닐 시클라제 활성, 예컨대 세포 내 cGMP의 생산량을 측정함에 의한 것, 및/또는 마우스, 랫 등의 관절염증, 변형성 관절증 또는 관절 류머티즘 모델 동물에 일정기간 CNP 또는 그 유도체를 투여한 후, 후술되는 실시예 7 ~ 10에 기재되어 있듯이 관절염증 억제효과 또는 관절연골 변성 억제효과의 정도를 측정하는 것에 의해 결정될 수 있다.

CN-22 유사 펩티드에는 예컨대 일본특개 평6-9688호나 국제공개 W002/074234에 기재되어 있는 것과 같은 아래의 환상펩티드가 포함된다(한편, 서열 중의 밑줄은 인간 CNP-22로부터의 변이를 나타낸다).

Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ala Met Ser Gly Leu Gly Cys (서열번호 3)

Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Gln Ser Gly Leu Gly Cys (서열번호 4)

Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Ala Ser Gly Leu Gly Cys (서열번호 5)

Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys (서열번호 6)

Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys (서열번호 7)

Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr (서열번호 8)

Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr (서열번호 9)

Cys Phe Gly Xaa Xbb Xcc Asp Arg Ile Gly Xdd Xee Ser Xff Xgg Gly Cys

(여기서, Xaa=Leu, Ile, Val; Xbb=Lys, Leu, Met; Xcc=Leu, I1e, Ala, Val; Xdd=Ser, Ala, Gly, Thr, Asn; Xee=Met, Ala, Trp, His, Lys, Ser, Gly; Xff=Gly, Lys, Ala, Leu; Xgg=Leu, Met이다) (서열번호 10)

또 CNP-53 유사 펩티드에는 상기의 CNP-22 유사 펩티드에 대응하는 아미노산의 마찬가지의 변이를 포함한 환상펩티드가 포함된다.

본 발명은 또한, GC-B 활성화 물질을 유효성분으로 함유한 것을 특징으로 하는 관절연골 세포 증식촉진제를 제공한다. 본 발명은 GC-B 활성화 물질이 관절연골세포를 증가시키는 기능이 있는 것에 근거한다. GC-B 활성화 물질의 구체적인 예는 상기 정의의 CNP 또는 그 유도체이다. CNP는 바람직하기는 인간을 포함한 포유류 또는 조류 유래의 CNP-22 또는 CNP-53이고, 더 바람직하기는 서열번호 1의 CNP-22 또는 서열번호 2의 CNP-53이다. 또, CNP 유도체는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 1 ~ 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가됨과 더불어 CNP 활성을 가진 것을 포함하였다. 다른 GC-B 활성화 물질은 예컨대, C0S-7 등의 배양세포주에 GC-B 수용체를 발현시켜 배지에 후보약제를 첨가하고, 일정한 온도 및 일정한 시간(예컨대 37℃, 5분 후) 세포주를 배양한 후, 세포 내의 cGMP 생산량을 측정하는 방법(Science 1991; 252:120-123)으로 동정될 수 있다. 즉, 이와 같은 분석계를 사용해서 세포 내 cGMP의 생산량을 지표로 해서 GC-B 활성화 물질을 동정하고, 그것을 본 발명에 사용할 수가 있다.

본 발명은 또, GC-B를 활성화함으로써 관절염증을 억제하는 것을 특징으로 하는 관절염증의 억제방법을 제공한다. 그리고 본 발명은 GC-B를 활성화함으로써 관절연골 세포의 증식을 촉진하는 것을 특징으로 하는 관절연골 세포의 증식촉진 방법을 제공한다. 이들 발명은 GC-B 활성화 물질에 의해, 바꿔말해 GC-B를 활성화함으로써, 상기 정의의 관절염증, 바람직하기는 변형성 관절증을 억제할 수가 있다고 하는 지견, 또 관절연골 세포의 증식을 촉진한다고 하는 지견에 근거한다. 본 발명의 실시예에 의해, GC-B는 상기 정의의 CNP 또는 그 유도체에 의해 활성화될 수 있다.

본 발명은 또한, GC-B의 활성을 지표로 해서 관절연골 세포의 증식촉진에 대해 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함하고, 관절연골 세포 증식촉진제의 스크리닝 방법을 제공한다. GC-B는 구아닐 시클라제 활성에 의해 GTP로부터 2차 메신저인 cGMP의 합성을 촉매하는 것이 알려져 있기 때문에, GC-B의 활성은 세포 내 cGMP 생산량으로 측정될 수 있다.

본 발명의 실시태양으로, 상기 스크리닝 방법은 GC-B를 발현하는 세포나 관절연골 세포 유래의 세포를 준비하고, 당해 세포를 후보약제의 존재 하에서 배양하고, 당해 세포의 구아닐 시클라제 활성인, 예컨대 세포 내 cGMP의 생산량을 지표로 해서 관절연골 세포의 증식촉진에 대해 후보약제를 스크리닝함으로써 이루어지는 공정을 포함할 수가 있다.

본 발명의 실시태양으로 보다 바람직하기는, GC-B를 강제발현시킨 배양세포주를 준비하고, 당해 세포주를 후보약제의 존재하에 또는 비존재하에 배양하고, 당해 세포주의 세포 내 cGMP의 생산량을 측정해서, 후보약제의 존재하에 그리고 비존재하에서의 세포 내 cGMP 생산량의 차이를 지표로 해서 관절연골 세포의 증식촉진에 대해 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함한다.

본 발명의 스크리닝 방법은 예컨대, COS-7 등의 배양 세포주에 GC-B를 발현시켜, 배지에 후보약제를 첨가하고, 일정한 온도 및 일정한 시간(예컨대 37℃, 5분간) 세포주를 배양한 후, 세포 내의 cGMP 생산량을 측정하는 방법(Science 1991; 252:120-123)으로 관절연골 세포 증식촉진제를 스크리닝할 수가 있다.

본 발명은 또한, GC-B의 활성을 지표로 해서, 변형성 관절증, 관절 류머티즘 또는 관절염증 치료제의 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함하여, 변형성 관절증, 관절 류머티즘 또는 관절염증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 상기와 마찬가 지로, GC-B의 활성은 구아닐 시클라제 활성인, 예컨대 세포 내 cGMP 생산량으로 해서 측정할 수 있다.

본 발명의 실시태양으로, 상기 스크리닝 방법은 GC-B를 발현하는 배양세포나 관절연골 세포 유래의 세포를 준비하고, 당해 세포를 후보약제의 존재 하에서 배양하고, 당해 세포의 구아닐 시클라제 활성인, 예컨대 세포 내 cGMP의 생산량을 지표로 해서 변형성 관절증, 관절 류머티즘 또는 관절염증 치료제의 후보약제를 스크리닝함으로써 이루어지는 방법을 포함할 수가 있다.

본 발명의 실시태양으로 보다 바람직하기는, GC-B를 강제발현시킨 배양세포주를 준비하고, 당해 세포주를 후보약제의 존재하에 또는 비존재하에서 배양하고, 당해 세포주의 세포 내 cGMP의 생산량을 측정하고, 후보약제의 존재하에 그리고 비존재하에서 세포 내 cGMP 생산량의 차이를 지표로 해서 변형성 관절증, 관절 류머티즘 또는 관절염증 치료제의 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함한다.

본 발명의 스크리닝 방법은 예컨대, COS-7 등의 배양세포주에 GC-B를 발현시켜, 배지에 후보약제를 첨가하고, 일정한 온도 및 일정한 시간(예컨대 37℃, 5분간) 세포주를 배양한 후, 세포 내의 cGMP 생산량을 측정하는 방법(Science 1991; 252: 120-123)에 의해 변형성 관절증, 관절 류머티즘 또는 관절염증 치료제를 스크리닝할 수가 있다.

본 발명의 변형성 관절증 등의 관절염증의 치료제 또는 예방제는 유효성분으로서의 상기 정의의 GC-B 활성화 물질을 제약상 허용가능한 담체, 부형제, 첨가제 등과 조합해서 경구투여용 또는 비경구 투여용으로 제제화된다.

제제용 담체나 부형제로는 예컨대 유당, 스테아린산 마그네슘, 전분, 탈크, 젤라틴, 한천, 펙틴, 아라비아 고무, 올리브유, 참기름, 카카오버터, 에틸렌글리콜 등이나 기타 상용되는 것을 들 수가 있다.

경구투여를 위한 고체 조성물로는 정제, 환제, 캡슐제, 가루약, 과립제 등이 쓰인다. 이와 같은 고체 조성물에서는 적어도 하나의 유효성분이 적어도 하나의 불활성인 희석제 예컨대, 유당, 만니톨, 포도당, 히드록시프로필 셀룰로오스, 미결정성 셀룰로오스, 전분, 폴리비닐피롤리돈, 메타규산 알루민산마그네슘 등과 혼합된다. 조성물은 통상적인 방법에 따라 불활성인 희석제 이외의 첨가물, 예컨대 스테아린산 마그네슘과 같은 윤활제, 섬유성 글리콜산 칼슘과 같은 붕괴제, 글루타민산 또는 아스파라긴산과 같은 용해보조제를 포함하고 있어도 좋다. 정제 또는 환제는 필요에 따라 자당, 젤라틴, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 프탈레이트 등의 당의(糖衣)나 위용성(胃溶性) 또는 장용성(腸溶性) 물질의 필름으로 피복되어도 좋고, 2가지 이상의 층으로 피복되어도 좋다. 그리고 젤라틴과 같은 흡수될 수 있는 물질의 캡슐도 포함된다.

경구투여를 위한 액체 조성물은 약제적으로 허용되는 유탁제, 용액제, 현탁제, 시럽제, 에릭서제(elixirs) 등을 포함하고, 일반적으로 쓰이는 불활성 희석제, 예컨대 정제수, 에탄올 등을 포함하고 있어도 좋다. 이 조성물은 불활성 희석제 이외에 습윤제, 현탁제와 같은 보조제, 감미제, 풍미제, 방향제, 방부제 등을 포함하고 있어도 좋다.

비경구투여를 위한 주사제로는 무균의 수성 또는 비수성의 용액제, 현탁제, 유탁제가 포함된다. 수성의 용액제, 현탁제로는 예컨대 주사용 물 및 주사용 생리식염액이 포함된다. 비수성의 용액제, 현탁제로는 예컨대 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브유와 같은 식물유, 에타놀와 같은 알코올류, 폴리솔베이트 80^® 등이 포함된다. 이와 같은 조성물은 다시 방부제, 습윤제, 유화제, 분산제, 안정화제(예컨대 유당), 용해보조제(예컨대 글루타민산, 아스파라긴산)와 같은 보조제를 포함하고 있어도 좋다. 이들은 예컨대 정밀여과막에 의한 여과멸균, 고압증기멸균와 같은 가열멸균, 또는 살균제의 배합 등의 통상적인 멸균방법에 의해 무균화하는 것이 가능하다. 주사제는 용액제제이어도 사용 전에 용해시켜 재구성하기 위해 동결건조한 것이어도 좋다. 동결건조를 위한 부형제로는 예컨대 만니톨, 포도당 등의 당알코올이나 당류를 사용할 수가 있다.

본 발명의 치료제 또는 예방제는 의약에 일반적으로 사용되고 있는 경구 투여방법 또는 비경구 투여방법 중 어느 하나에 의해 투여된다. 바람직하기는 비경구투여방법인, 예컨대 주사에 의한 투여 (피하주사, 정맥주사, 근육주사, 복강 내에의 주사 등에 의한 투여), 경피투여, 경점막투여(경비투여, 경직장투여 등), 경폐투여 등이지만, 경구 투여방법에 의한 투여도 가능하다.

본 발명의 제제 중에 포함되는 유효성분인 GC-B 활성화 물질, 바람직하기는 상기 정의의 CNP 또는 그 유도체의 량은, 치료해야 할 질환의 종류, 질환의 중증도, 환자의 연령 등에 대응해서 결정할 수 있지만, 일반적으로 0.005㎍/kg ~ 10Omg/kg의 범위로 투여할 수 있으나, 0.02㎍/kg ~ 5mg/kg으로 투여하는 것이 바람 직하다. 그리고 0.02㎍/kg ~ 0.25mg/kg에서의 투여가 바람직하였다. 그러나 본 발명의 CNP를 함유하는 약제는 이들의 투여량에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 치료제 또는 예방제는 항염증약, 히알루론산이나 부신피질 스테로이드와 같은 종래 또는 신규의 치료제와 조합한다거나, 또 관절경시하 수술, 인공관절 치환이나 골 절제술 등의 정형외과 수술과 조합해서 사용할 수가 있다.

특히 항염증약, 예컨대 적어도 1가지의 비스테로이드성 항염증약을 GC-B 활성화 물질(예컨대, 상기 정의의 CNP 또는 그 유도체)와 병용할 때에는 관절염에 대한 상승적 억제효과가 있다(실시예 10).

본 명세서에서 사용하는 「비스테로이드성 항염증약」은 스테로이드 골격을 갖지 않은 항염증약을 지칭하는바, 프로스타그란딘의 생산에 관련되는 시클로옥시게나제 효소를 억제하는 작용을 갖는 것이 바람직하였다. 본 발명에서 사용할 수 있는 비스테로이드성 항염증약에는 이하의 것에 한정되지 않으나, 예컨대 인도메타신(Indacin™ 등), 이부프로펜(Brufen™ 등), 피록시캄, 살리실산, 디클로페낙(Voltaren™ 등), 케토프로펜, 나프록센, 피록시캄 등을 포함한다.

그리고 또, 상기의 GC-B 활성화 물질을 비스테로이드성 항염증약과 병용할 때의 상승효과는 GC-B 활성화 물질을 단독으로 사용했을 때에 비해 GC-B의 활성화가 촉진되는 점, 바꿔말해 상기의 비스테로이드성 항염증약의 유효성분이 GC-B 활성화물질에 의한 GC-B의 활성화 때의 활성화 촉진제로 되는 것을 나타내고 있다.

따라서 본 발명은 또한, 비스테로이드성 활성화제를 포함한 GC-B 활성화 물질에 대한 활성화 촉진제를 제공한다.

GC-B 활성화물질에는 앞에서 설명한 바와 같은 CNP 또는 그 유도체가 포함된다. CNP의 예는 인간을 포함한 포유류 또는 조류 유래의 CNP-22 및 CNP-53으로서, 보다 구체적으로는 서열번호 1의 CNP-22 또는 서열번호 2의 CNP-53이다. 또, CNP의 유도체의 예는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 1 ~ 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가됨과 더불어 CNP 활성을 가진 것이다.

본 발명에서 상기 비스테로이드성 활성화제는 바람직하기는 시클로옥시게나제 효소 억제제이다. 시클로옥시게나제 효소 억제제에는 예컨대 인도메타신, 이부프로펜, 피록시캄, 살리실산, 디클로페낙, 케트프로펜, 나프록센, 피록시캄 등이 포함되지만 이들에 한정되지는 않는다.

본 발명의 활성화 촉진제의 제형, 용량, 투여방법은 본 발명의 치료제 및 예방제에 대해 위에서 설명한 사항을 그대로 적용할 수 있다.

본 발명은 또, 상기의 활성화 촉진제를 사용하는 것을 특징으로 하는 GC-B 활성화 물질의 활성화 방법도 제공한다.

상기의 본 발명의 활성화 촉진제 및 방법은 환자에게 예컨대 GC-B 활성화를 매개로 관절염증 등의 질환을 치료하는 경우 등에 유효하게 사용할 수가 있다.

본 발명으로서 이하의 사항을 들 수가 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다.

(1) 구아닐 시클라제 B(GC-B) 활성화 물질을 유효성분으로 함유한 것을 특징으로 하는 관절염증의 치료제 또는 예방제.

(2) 상기 관절염증이 변형성 관절증인, 상기 (1)에 기재된 치료제 또는 예방제.

(3) 상기 변형성 관절증이 하중 관절의 변형성 관절증 또는 비하중 관절의 변형성 관절증인, 상기 (2)에 기재된 치료제 또는 예방제.

(4) 상기 변형성 관절증이 변형성 슬관절증인, 상기 (3)에 기재된 치료제 또는 예방제.

(5) 상기 변형성 관절증이 변형성 고관절증인, 상기 (3)에 기재된 치료제 또는 예방제.

(6) 상기 변형성 관절증이 악관절증인, 상기 (3)에 기재된 치료제 또는 예방제.

(7) 상기 관절염증이 관절 류머티즘에 기인하는, 상기 (1)에 기재된 치료제 또는 예방제.

(8) 상기 관절염증이 변형성 관절증에 기인하는, 상기 (1)에 기재된 치료제 또는 예방제.

(9) 상기 GC-B 활성화물질이 C형 나트륨 이뇨 펩티드(CNP) 또는 그 유도체인, 상기 (1) ~ (8) 중 어느 하나에 기재된 치료제 또는 예방제.

(10) 상기 CNP가 인간을 포함한 포유류 또는 조류 유래의 CNP-22 및 CNP-53으로부터 선택되는, 상기 (9)에 기재된 치료제 또는 예방제.

(11) 상기 CNP가 서열번호 1의 CNP-22 또는 서열번호 2의 CNP-53인, 상기 (9)에 기재된 치료제 또는 예방제.

(12) 상기 유도체가 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 1 ~ 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가됨과 더불어 CNP 활성을 가진 것인, 상기 (9)에 기재된 치료제 또는 예방제.

(13) 적어도 1가지 비스테로이드성 항염증약을 더 포함하는, 상기 (1) ~ (12) 중 어느 하나에 기재된 치료제 또는 예방제.

(14) GC-B 활성화물질을 유효성분으로 함유한 것을 특징으로 하는, 관절연골세포 증식촉진제.

(15) 상기 GC-B 활성화물질이, CNP 또는 그 유도체인, 상기 (14)에 기재된 증식촉진제.

(16) 상기 CNP가 인간을 포함한 포유류 또는 조류 유래의 CNP-22 또는 CNP-53인, 상기 (15)에 기재된 증식촉진제.

(17) 상기 CNP가 서열번호 1의 CNP-22 또는 서열번호 2의 CNP-53인, 상기 (15)에 기재된 증식촉진제.

(18) 상기 유도체가 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 1 ~ 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가됨과 더불어 CNP 활성을 가진 것인, 상기 (15)에 기재된 증식촉진제.

(19) 적어도 1가지 비스테로이드성 항염증약을 더 포함하는, 상기 (14) ~ (18) 중 어느 하나에 기재된 증식촉진제.

(20) GC-B를 활성화함으로써 관절염증을 억제하는 것을 특징으로 하는, 관절염증의 억제방법.

(21) 상기 GC-B가 CNP 또는 그 유도체에 의해 활성화되는, 상기 (20)에 기재의 억제방법.

(22) 상기 CNP가 인간을 포함한 포유류 또는 조류 유래의 CNP_22 또는 CNP-53인, 상기 (21)에 기재된 억제방법.

(23) 상기 CNP가 서열번호 1의 CNP-22 또는 서열번호 2의 CNP-53인, 상기 (21)에 기재된 억제방법.

(24) 상기 유도체가 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 1 ~ 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가됨과 더불어 CNP 활성을 가진 것인, 상기 (21)에 기재된 억제방법.

(25) 상기 GC-B가 CNP 또는 그 유도체와 적어도 1가지의 비스테로이드성 항염증약과의 조합에 의해 활성화되는, 상기 (20) ~ (24) 중 어느 하나에 기재된 억제방법.

(26) GC-B를 활성화함으로써 관절연골 세포의 증식을 촉진하는 것을 특징으로 하는 관절연골 세포의 증식촉진 방법.

(27) 상기 GC-B가 CNP 또는 그 유도체에 의해 활성화되는, 상기 (26)에 기재된 증식촉진 방법.

(28) 상기 CNP가 인간을 포함한 포유류 또는 조류 유래의 CNP-22 또는 CNP-53인, 상기 (27)에 기재된 증식촉진 방법.

(29) 상기 CNP가 서열번호 1의 CNP-22 또는 서열번호 2의 CNP-53인, 상기 (27)에 기재된 증식촉진 방법.

(30) 상기 유도체가 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 1 ~ 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가됨과 더불어 CNP 활성을 가진 것인, 상기 (27)에 기재된 증식촉진 방법.

(31) 상기 GC-B가 CNP 또는 그 유도체와 적어도 1가지의 비스테로이드성 항염증약과의 조합에 의해 활성화되는, 상기 (26) ~ (30) 중 어느 하나에 기재된 증식촉진 방법.

(32) GC-B의 활성을 지표로 해서 관절연골 세포의 증식촉진에 대해 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함하는, 관절연골 세포 증식촉진제의 스크리닝 방법.

(33) GC-B를 발현하는 배양세포 또는 관절연골 세포 유래의 세포를 준비하고, 당해 세포를 후보약제의 존재 하에서 배양하고, 당해 세포의 GC-B 활성을 지표로 해서 관절연골 세포의 증식촉진에 대해 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함하는, 상기 (32)에 기재된 스크리닝 방법.

(34) 상기 GC-B 활성이 세포 내 cGMP 생산량으로서 측정되는, 상기 (32) 또는 (33)에 기재된 스크리닝 방법.

(35) GC-B를 강제발현시킨 배양 세포주를 준비하고, 당해 세포주를 후보약제의 존재 하에 또는 비존재 하에서 배양하고, 당해 세포주의 세포 내 cGMP의 생산량을 측정해서, 후보약제의 존재 하와 비존재 하에서의 세포 내 cGMP 생산량의 차이를 지표로 해서 관절연골 세포의 증식촉진에 대해서 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함하는, 상기 (32) ~ (34) 중 어느 하나에 기재된 스크리닝 방법.

(36) GC-B의 활성을 지표로 해서 변형성 관절증, 관절 류머티즘 또는 관절염증 치료제의 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함한, 변형성 관절증, 관절 류머티즘 또는 관절염증 치료제의 스크리닝 방법.

(37) GC-B를 발현하는 배양세포 또는 관절연골 세포 유래의 세포를 준비하고, 당해 세포를 후보약제의 존재 하에서 배양하고, 당해 세포의 GC-B 활성을 지표로 해서 변형성 관절증, 관절 류머티즘 또는 관절염증 치료제의 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함하는, 상기 (36)에 기재된 스크리닝 방법.

(38) 상기 GC-B 활성이 세포 내 cGMP 생산량으로서 측정되는, 상기 (36) 또는 (37)에 기재된 스크리닝 방법.

(39) GC-B를 강제발현시킨 배양 세포주를 준비하고, 당해 세포주를 후보약제의 존재 하에 또는 비존재 하에서 배양하고, 당해 세포주의 세포 내 cGMP의 생산량을 측정해서, 후보약제의 존재 하와 비존재 하에서의 세포 내 cGMP 생산량의 차이를 지표로 해서 변형성 관절증, 관절 류머티즘 또는 관절염증 치료제의 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함하는, 상기 (36) ~ (38)중 어느 하나에 기재된 스크리닝 방법.

(40) 구아닐 시클라제 B(GC-B) 활성화 물질을 유효성분으로 함유한, 변형성 관절증의 치료제 또는 예방제.

(41) 적어도 1가지의 비스테로이드성 항염증약을 더 함유하는, 상기 (40)에 기재된 변형성 관절증의 치료제 또는 예방제.

(42) 구아닐 시클라제 B(GC-B) 활성화 물질을 유효성분으로 함유한, 관절 류마티즘의 치료제 또는 예방제.

(43) 적어도 1가지의 비스테로이드성 항염증약을 더 함유하는, 상기 (42)에 기재된 관절 류머티즘의 치료제 또는 예방제.

(44) 관절염증의 치료를 필요로 하는 환자에 GC-B 활성화 물질을 투여하는 것을 포함하는 관절염증의 치료방법.

(45) 상기 GC-B 활성화 물질이 CNP 또는 그 유도체인, 상기 (44)에 기재된 치료방법.

(46) 상기 관절염증이 변형성 관절증인, 상기 (44) 또는 (45)에 기재된 치료방법.

(47) 상기 변형성 관절증이 하중 관절의 변형성 관절증 또는 비하중 관절의 변형성 관절증인, 상기 (46)에 기재된 치료방법.

(48) 상기 변형성 관절증이 변형성 슬관절증, 변형성 고관절증 또는 악관절증인, 상기 (47)에 기재된 치료방법.

(49) 상기 관절염증이 관절 류머티즘에 기인하는, 상기 (44)에 기재된 치료방법.

(50) 상기 관절염증이 변형성 관절증에 기인하는, 상기 (44)에 기재된 치료방법.

(51) 상기 CNP가 인간을 포함한 포유류 또는 조류 유래의 CNP-22 및 CNP-53으로부터 선택되는, 상기 (45) ~ (50)중 어느 하나에 기재된 치료방법.

(52) 상기 CNP가 서열번호 1의 CNP-22 또는 서열번호 2의 CNP-53인, 상기 (45) ~ (50)중 어느 하나에 기재된 치료방법.

(53) 상기 유도체가 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 1 ~ 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가됨과 더불어 CNP 활성을 가진 것인, 상기 (45) ~ (50) 중 어느 하나에 기재된 치료방법.

(54) 상기 GC-B 활성화 물질을 적어도 1가지의 비스테로이드성 항염증약과 조합시켜 함유한, 상기 (44) ~ (53)중 어느 하나에 기재된 치료방법.

(55) 비스테로이드성 활성화제를 함유한, GC-B 활성화 물질에 대한 활성화 촉진제.

(56) 상기 GC-B 활성화 물질이 CNP 또는 그 유도체인, 상기 (55)에 기재된 활성화 촉진제.

(57) 상기 CNP가 인간을 포함한 포유류 또는 조류 유래의 CNP-22 및 CNP-53으로부터 선택되는, 상기 (56)에 기재된 활성화 촉진제.

(58) 상기 CNP가 서열번호 1의 CNP-22 또는 서열번호 2의 CNP-53인, 상기 (56)에 기재된 활성화 촉진제.

(59) 상기 유도체가 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 1 ~ 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가됨과 더불어 CNP 활성을 가진 것인, 상기 (56)에 기재된 활성화 촉진제.

(60) 상기 비스테로이드 활성화제가 시클로옥시게나제 효소 억제제인, 상기 (55)에 기재된 활성화 촉진제.

(61) 상기 시클로옥시게나제 효소 억제제가 인도메타신, 이부프로펜, 피록시캄, 살리실산, 디클로페낙, 케토프로펜, 나프록센 및 피록시캄으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상기 (60)에 기재된 활성화 촉진제.

(62) 상기 (55) ~ (61)중 어느 하나에 기재된 활성화 촉진제를 사용하는 것 을 특징으로 하는, GC-B 활성화 물질의 활성화 방법.

이하의 실시예에 의해 본 발명을 다시 상세히 설명하지만, 이들의 실시예는 단지 예시를 목적으로 한 것으로서 본 발명을 제한하는 것은 아니다. 그 때문에 본 발명은 이들의 실시예에 의해 제한되지 않는 것으로 한다.

실시예 1

CNP 트랜스제닉 마우스 제작용 벡터의 구축

도 lA에 도시된 것과 같이, pGEM-T easy vector(Promega)에 마우스 CNP cDNA (526bp; FEBS Lett. 276:209-213, 1990)을 서브클로닝 시킨 것을 Pst I로 절단하고, 말단을 평활화해서 마우스 CNP cDNA를 조제했다. PSGI 벡터(Promega; 도 1B)를 EcoRI으로 절단해서 말단을 평활화해서, 도 1C와 같이 마우스 CNP cDNA를 결찰하고, SAP-mCNP 벡터(pSGl-CNP)를 만들었다.

실시예 2

CNP 트랜스제닉 마우스의 제조

인젝션용 DNA 단편은 다음과 같이 해서 제조하였다. 먼저 CNP 유전자를 삽입한 SAP-mCNP 벡터(pSGl-CNP; 도 1C)를 HindIII 및 XhoI로 처리한 후, CNP 유전자를 포함한 단편(약 2.3kb)를 잘라냈다. 이 단편을 Gel 추출 키트(QIAGEN)로 회수해서, 3ng/㎕가 되도록 PBS^-로 희석해서 주입용 DNA 단편(도 2)로 한다.

DNA 단편을 주입하는 마우스 전핵기란(前核期卵)은 다음과 같이 해서 회수하 였다. 즉, 먼저 C57BL/6 암컷 마우스(Clea Japan, Inc.)에 5 i.u의 임신마 혈청성 성선자극호르몬(PMSG)을 복강내 투여하고, 다시 48시간 후 5 i.u의 인간 융모 고나도트로핀(hCG)을 복강내 투여함으로써 과배란(過排卵) 처리를 하였다. 이 암컷 마우스를 같은 계통의 수컷 마우스와 교배시켰다. 교배 이튿날 아침, 플러그를 확인한 마우스의 난관을 관류(灌流)해서 마우스 전핵기란을 회수하였다.

주입용 DNA 단편은 마이크로매니퓨레이터 (Latest Technology in Gene Targeting(Yodosha, Japan), 190-207, 2000)를 이용해서 전핵기란에 주입하였다. DNA 단편을 660개의 C57BL/6J 배아에 주입하고, 다음날 2 세포기에 발생해 있던 배아 561개를 가짜 임신 1일째의 수용 암컷의 난관에 편당(片當) 10개 전후(1마리당 20개 전후)를 이식하였다.

분만 예정일에 이르러도 새끼를 분만하지 않은 수용 암컷에 대해서는 제왕절개를 실시해서 수양부모에게 포육시켰다. 136 예의 새끼가 얻어지고, 그 중의 5예가 CNP 유전자가 도입되어 트랜스제닉 마우스로 되었다. 이하, 최초로 얻어진 마우스를 Founder라 기재한다.

Founder는 모두 수컷 마우스로서, 이들 5라인 중 4라인으로부터 차세대(Fl 마우스)의 새끼가 얻어졌다.

실시예 3

CNP 트랜스제닉 마우스의 유전자형 해석

유전자형 해석은 아래에 나타낸 순서에 따라 서던 블롯법으로 실행하였다. 3주령이 된 마우스의 꼬리(약 15mm)를 잘라 proteinase K 처리(55℃, 100 rpm에서 하루 밤낮 진탕)하여 용해액을 얻었다. 이 용해액을 핵산자동 분리장치(KURABO NA-I000)에 걸어 게놈 DNA를 조제하였다. 게놈 DNA 15㎍을 PvuII(200 U)로 처리하고 나서 페놀-클로로포름 처리에 의해 제한효소를 제외한 후에 에탄올 침전으로 DNA를 회수하였다. 회수된 DNA를 25㎕의 TE에 용해해서 0.7% 아가로스겔 전기영동(50V 정전압)에 걸고, 영동종료 후 겔을 0.25M HCl 용액으로 15분간 처리해서 DNA를 절단하고, 수세하고 나서 0.4M NaOH 용액으로 나일론 멤브레인에 하룻밤 블롯팅하였다. 그 후 멤브레인 상의 DNA를 UV 클로스링크 법으로 고정시켰다. 멤브레인을 혼성화 용액(50% formamide, 0.5 x Denhardt's, 0.5% SDS, 5 x SSPE)에서 처리(42℃, 2시간)하고 나서, CNP의 cDNA(약 0.5kb)를 주형으로 해서 BcaBEST 라벨링 키트(TaKaRa)에서 조제한 ³²P 표지 프로브를 가해 42℃에서 하룻밤 혼성화 하였다. 그 후, 세정용액(2 x SSC, 0.1% SDS)로 55℃, 20분간 처리하고 나서 영상화 플레이트(Fuji Fi1m)에서 하룻밤 노광하고, 도입유전자의 시그널을 BAS2000(Fuji Fi1m)에서 검출하였다(도 3). 야생형 마우스(WT)에서는 3개의 시그널(야생형 CNP 유전자)이 검출되고, 트랜스제닉 마우스에서는 야생형 CNP 유전자에 더해, 도입유전자 유래의 시그널(트랜스진)이 2개 검출되었다.

실시예 4

CNP 트랜스제닉 마우스에서의 CNP의 발현

CNP 농도의 측정에는 CNP-22 EIA 측정 키트(PHOENIX PHARMACEUTICALS INC.)을 이용하였다.

7주령의 암수 CNP 트랜스제닉 마우스 및 암수의 정상 동복(同腹) 마우스 각 3 예를 에테르 마취 하에서 후대정맥으로부터 전혈을 채혈해서 안락사시켰다.

도입한 유전자의 고발현이 예상되는 장기인 간장을 채취하고, 간중량 0.1 g에 대해 상기 측정 키트의 EIA assay 버퍼 1ml를 가해서 빙냉시켰다. 워링 (Waring) 블렌더 (Physcotron)으로 동질화하고, 원심분리(2,000rpm, 5분간)한 후, 상청(上淸)액을 CNP-22 농도측정 샘플로 하였다.

채취한 혈액에 1mg의 에틸렌디아민 4초산·4나트륨염(Junsei Chemical Co. Ltd, Japan)와 2 트립신 저해 단위의 아프로티닌(Sigma)을 첨가해서 교반해서 혈장을 분리하여, CNP-22 농도측정 샘플로 하였다.

측정결과를 표 1에 나타내었다.

표 1: CNP 트랜스제닉 마우스에서의 CNP 의 발현

		간장 (ng/g 조직)	평균±SD	혈장 (ng/mL)	평균±SD
야생형	No. 1	38.8	29.3 ± 20.5	0.3	0.3 ± 0.06
	No. 2	5.9		0.4
	No. 3	43.3		0.3
CPN tgm	No. 1	293.3	290 ± 81.7^**	10.3	8.0 ± 4.7^#
	No. 2	370.0		11.1
	No. 3	206.7		2.6

**: p ＜ 0.01(대응이 없는 Student t-test)

# : p ＜ 0.05(Wi1coxon 순위화 검정)

CNP 트랜스제닉 마우스(CNP tgm)는 야생형에 대한 평균치 ± 표준편차(mean ± SD)의 비교에서는 간장(Liver)에서 약 10배, 혈장(Plasma)에서 약 24배의 CNP-22 농도를 나타내고 있는바, 모두 통계학적으로 유의한 차이였다. 이들의 결과로부터, CNP 트랜스제닉 마우스에서 CNP 펩티드가 과잉발현되어 있는 것이 확인되었다.

실시예 5

CNP 트랜스제닉 마우스 관절연골의 조직학적 해석

관절연골의 두께 및 연골 세포수를 조직학적으로 해석할 목적으로, 9주령의 CNP 트랜스제닉 마우스 및 동복의 정상 마우스의 암컷 각 5예, 합계 10예를 에테르 마취 하에서 후대정맥으로부터 전혈을 채혈해서 안락사시켜, 대퇴골을 20% 포르말린으로 1주간 고정사켰다. 그 후 20% EDTA-4Na (Junsei Chemical Co., Ltd., Japan) 수용액(pH 7.4)에 침지해서 탈회(decalcification)한 후, 대퇴골 슬개면(膝蓋面)을 정중시(正中矢) 형상으로 잘라 통상적인 방법으로 파라핀으로 포매(包埋)하여 파라핀 블록을 만들었다. 두께 4mm의 절편을 마이크로톰을 이용해서 얇게 박절(薄折)해서 파라핀 절편을 만들어, 헤마토크실린·에오신 염색을 하였다. 관절연골의 두께는 대물렌즈 10배에서의 1 시야를 화상해석 소프트웨어(IPAP, Sumika Technoservice)에 취입하여, 동 소프트웨어를 이용해서 시야 중의 5점에 대해 길이를 계측해서 평균치를 산출하여, 그 개체의 관절연골 두께로 하였다. 이 계측에 이용한 동일한 시야에 대해, 연골 세포수를 계측하였다. 이들 항목에 대해, 동성(同性)의 마우스와 CNP 트랜스제닉 마우스의 사이에서 평균치 및 표준편차를 산출하고 (Microsoft Exce1 2000, Microsoft), 대응이 없는 Student의 t 검정에 의해 통계학적 해석을 실행하였다 (SAS ver. 6. 12, SAS Institute Japan, Japan).

관절연골의 두께는 암수 모두 CNP 트랜스제닉 마우스에서 통계학적으로 유의하게 두꺼운 것이 판명되었다(도 4). 또, 1 시야 당의 관절연골 세포수도 암수 모두 CNP 트랜스제닉 마우스에서 통계학적으로 유의하게 많다는 것이 판명되었다(도 5).

이들 결과로부터 CNP 등의 GC-B(NPR-B)를 활성화하는 물질이, 공지인 개개의 연골세포의 비대화 [J Biol Chem 2003; 278(21):18824-32]에 의한 세포용적의 증가가 아니고, 연골세포 수의 증가를 수반해서 관절연골의 두께를 증가시킨다는 것이 밝혀졌다.

실시예 6

CNP 트랜스제닉 마우스의 변형성 관절염 모델에 대한 저항성

슬관절 내에 콜라게나제를 주사해서 슬관절의 인대 및 반달판을 불안정화시켜, 변형성 관절증을 야기하는 변형성 관절염 동물 모델 [Am J Pathol 1989;135:1001-14]을 작성하였다. CNP의 변형성 관절염에 대한 예방 및 치료효과를 확인할 목적으로, CNP 트랜스제닉 마우스를 이용한 변형성 관절염 동물 모델의 관절염증 및 관절연성 변성에 대한 저항성을 평가하였다. CNP 트랜스제닉 마우스 및 동복(同腹)의 야생형 C57BL/6 계 마우스의 오른쪽 슬관절 내에 6 마이크로리터의 3% 타입 II 콜라게나제(Sigma) 생리식염 용액을 2회 투여(투여 개시 당일과 투여개시 후 7일)하였다. 좌우의 슬관절 폭을 캘리퍼(Mitutoyo Corp., Japan)을 이용해서 투여 후 28일까지 경시적으로 측정해서 좌우의 차이를 산출하여, 슬관절 종창을 나타내는 값으로 하였다. 그 경시적 추이곡선 하면적(AUC)을 사다리꼴법으로 산출하 고, CNP 트랜스제닉 마우스와 야생형 마우스 사이에서 Student t 검정으로 비교하였다. 그 결과, CNP 트랜스제닉 마우스에서의 AUC는 야생형보다도 유의하게 작아, CNP 트랜스제닉 마우스가 콜라게나제에 의한 슬관절 종창에 저항성인 것이 판명되었다 (도 6). 관절염증 및 관절연골 변성을 조직병리학적으로 평가하기 위해, 콜라게나제 투여 후 28일에 에테르 마취 하에 전혈 채혈에 의한 안락사 후에 슬관절을 채취하고, 실시예 5에 기재한 방법으로 헤마토크실린·에오신 염색표본 및 사프라닌 0 염색표본을 제조하고 조직학적으로 해석하였다. 그 결과, 야생형 마우스에서는 콜라게나제에 의해 활막에서의 활막세포 증가추세, 육아조직 형성, 염증성 세포침윤이 현저하였던 바에 비해서, CNP 트랜스제닉 마우스에서는 이들 변화가 현저히 약하였다(도 7). 관절연골 변성에 대해서는 야생형 마우스에서는 사프라닌 0 염색성이 저하되고, 관절연골 중의 프로테오글리칸 함량이 저하된 것에 비해, CNP 트랜스제닉 마우스에서는 그 변화는 경미하였고, CNP 트랜스제닉 마우스는 콜라게나제 투여에 의한 관절연골 변성에 저항성인 것이 병리조직학적으로 나타났다(도 8). 이때, 혈장 중 CNP 농도를 EIA 키트(Phoenix Pharmaceutical)을 이용해서 측정하였더니, 야생형 마우스의 평균치는 0.21 ng/mL 이었음에 비해, CNP 트랜스제닉 마우스에서는 0.50 ng/mL 이었다.

이들 결과로부터, CNP의 변형성 관절증에서의 관절염증 억제작용과 관절연골변성 억제작용을 가진 것이 판명되었다.

실시예 7

CNP 주입의 변형성 관절염 모델에 대한 치료효과(1)

9주령의 C57BL/6 J계의 수컷 마우스의 배부 피하에 이하의 용액을 포함한 삼투압 펌프(2004형, Durect)를 이식하였다.

·용매 : 5% 덱스트로스(Junsei Chemical Co., Ltd.), 10% 만노스(Nacalai Tesque Inc., Japan) 및 5mmol/L 염산(Walko Pure Chemical Industries, Japan)을 함유하는 증류수.

·CNP-22(Calbiochem Novabiochem) 10mg/mL 용액(60ng/일).

·CNP-22(Calbiochem Novabiochem) 100mg/mL 용액(600ng/일).

이식 후 6일에 1.5% 타입 II 콜라게나제(Sigma) 용액 6mL를 오른쪽 슬관절 내에 투여하고, 6일 후까지 슬 좌우의 슬관절 폭을 캘리퍼(Mitutoyo Corp., Japan)를 이용해서 투여 후 28일까지 경시적으로 측정해서 좌우의 차이를 산출하였다. 이 차이를 슬관절 종창을 나타내는 값으로 해서, 그 AUC를 용매 대조군과 CNP 투여군 사이에서 Student t 검정으로 비교하였다(SAS ver. 6. 12). 그 결과, CNP-22 투여군의 AUC는 어느 용량으로도 용매 대조군에 대해 유의하게 작았다. 또, 실시예 5에 기재한 방법으로 헤마토크실린·에오신 염색표본 및 사프라닌 0 염색표본을 제조하고 조직병리학적으로 해석하였다.

그 결과, 용매 대조군에서는 콜라게나제에 의해 활막에서의 활막세포 증가추세, 육아조직 형성, 염증성 세포침윤이 현저하였던 것에 비해, CNP 투여군에서는 이들 변화가 현저히 약하다는 것이 판명되었다(도 9). 활막조직 슬관절의 이 결과로부터, CNP가 변형성 관절증에 대해 치료효과를 갖는다는 것이 판명되었다.

실시예 8

CNP 주입의 변형성 관절염 모델에 대한 치료효과(2)

9주령의 C57BL/6 J계의 수컷 마우스(Clea Japan, Japan)의 배부 피하에 이하의 용액을 포함한 삼투압 펌프(2004형, Durect)를 이식하였다.

·CNP-22(Calbiochem Novabiochem) 10mg/mL 용액(60ng/일).

·CNP-22(Calbiochem Novabiochem) 100mg/mL 용액(600ng/일).

이식 다음날에 마우스를 에테르 마취하고, 오른쪽 슬관절에 대해 전십자 인대 절단, 내측 측부인대 절단 및 내측 반월판 전절제의 외과처리를 실시하여, 변형성 관절증을 야기시켰다. 좌우 슬관절 폭을 캘리퍼(Mitutoyo Corp., Japan)를 이용해서 투여 후 11일까지 경시적으로 측정해서 좌우의 차이를 산출하였다. 이 차이를 슬관절 종창을 나타내는 값으로 하고, 그 AUC를 용매 대조군과 CNP 투여군 사이에서 Student t 검정으로 비교하였다(SAS 전임상 팩키지, SAS Institute Japan, Japan). 그 결과, CNP-22 투여군의 AUC는 어느 용량으로도 용매 대조군에 대해 유의하게 작았다(도 10).

이 결과로부터, CNP가 외과처리에 의해 야기되는 슬관절에의 물리적 과하중에 기초를 둔 변형성 관절증에서의 관절염증에 대해서도 억제작용을 갖는다는 것이 밝혀졌다.

실시예 9

콜라게나제 OA 모델에서의 비스테로이드성 항염증약(NSAID)과 CNP의 병용 효과

·용매: 5% 덱스트로스(Junsei Chemical Co., Ltd.), 10% 만노스(Nacalai Tesque Inc., Japan) 및 5mmol/L 염산(Walko Pure Chemical Industries, Japan)을 함유하는 증류수.

·CNP-22(Calbiochem Novabiochem) 1㎍/mL 용액(6 ng/일).

또, NSAID인 인도메타신(Sigma)의 효과와, CNP와 병용했을 때의 효과를 검토하기 위해, 상기의 펌프 이식일로부터 1일 1회, 계속해 4일간 1mg/kg의 용량으로 인도메타신의 0.2% 카르복시메틸 셀룰로오스(Nacalai Tesque Inc., Japan) 용액에의 현탁액을 강제로 경구투여하였다.

실험군는 이하와 같이 설정하였다.

용매대조군(주입 용매, 경구투여 용매)

CNP 6ng/일

인도메타신 1mg/kg

CNP 6 ng/일 + 인도메타신 1mg/kg

펌프의 이식 당일에 0.15% 타입 II 콜라게나제(Sigma) 용액 6㎕, 다음날에 1.5% 타입 II 콜라게나제 용액 6㎕를 오른쪽 슬관절 내에 투여하고, 슬 좌우의 슬관절 폭을 캘리퍼(Mitutoyo Corp., Japan)를 이용해서 투여 후 7일까지 경일적(經日的)으로 측정해서 좌우의 차이를 산출하였다. 이 차이를 슬관절 종창을 나타내는 값으로 하고, 그 AUC를 용매 대조군과 CNP 투여군 사이에서 Student t 검정으로 비교하였다(SAS ver. 6. 12).

그 결과 인도메타신 단독으로는 슬 관절 종창이 억제되지 않았다. 이때 CNP 6 ng/일의 군은 유의하게 슬관절 종창을 억제하였다. 그러나 CNP와 인도메타신을 병용한 군에서는 CNP 단독군에 대해서도 유의하게 슬관절 종창을 억제하고 있었다(도 11). 이 결과로부터 CNP에 의한 슬관절 종창의 억제는 단독투여에서는 관절염 치료의 표준약인 NSAID에 비해 유의한 효과를 갖는 데에 더해, NSAID과의 병용투여에서는 상승적인 효과를 갖는다는 것이 판명되었다.

실시예 10

래트 아쥬반트 관절염 모델에 대한 CNP의 작용

6주령의 LEW/Crj계 수컷 래트(Charles River Laboratories Japan, Inc., Japan)의 배부 피하에 이하의 용액을 포함한 삼투압 펌프(2004형, Durect)를 이식하였다.

·CNP-22(Calbiochem Novabiochem) 10㎍/mL 용액(60ng/일).

이식 다음날에, 결핵사균 분말(M. TUBERCULOSIS DES. H37 RA, DIFCO LABORATORIES)를 3mg/mL의 농도로 유동파라핀(Junsei Chemical Co., Ltd.)에 현탁 해서, 50㎕를 래트의 미근부(尾根部)에 피내(皮內) 접종하였다. 접종 후, 사지말단의 상태를 이하의 기준에 따라 경일적으로 스코어 평가하고, 사지말단 스코어를 합계한 스코어를 그 개체의 관절염 스코어로 하였다.

스코어 0 : 병변 없음.

스코어 1 : 1개 이상의 손가락 관절에 발적(發赤) 종창이 인정됨. 또는 껍질 부분이 붉게 변화되어 있으나 종창은 인정되지 않음.

스코어 2 : 앞다리 또는 뒷다리의 껍질에 경도의 종창이 인정됨.

스코어 3 : 앞다리 또는 뒷다리의 껍질에 고도한 종창이 인정되나, 모든 손가락에는 그것이 인정되지 않음.

스코어 4 : 앞다리 또는 뒷다리의 껍질 및 손가락에 고도의 종창이 인정됨.

그 결과, CNP 투여군에서는 관절염 스코어가 용매 대조군에 비해 저하되는 경향이 인정되었다(도 12A). 체중의 추이도 경일적으로 측정하였다. 그 결과, 용매 대조군에 비해, CNP 투여군은 유의하게 체중의 증가가 높았다(도 12B).

이들 결과로부터, CNP는 래트 아쥬반트 모델에서도 관절염을 억제하고, 일반상태를 개선한다는 것이 판명되었다.

실시예 11

래트 콜라겐 관절염 모델에 대한 CNP의 작용

10주령의 DA/S1c 계 메스 래트(Japan SLC, Inc., Japan)의 배부 피하에, 이하의 용액을 포함한 삼투압 펌프(2004형, Durect)를 이식하였다.

·CNP-22(Calbiochem Novabiochem) 1mg/mL 용액(6㎍/일).

이식 직후에, 소 타입 II 콜라겐(Collagen Technology Training Co., Japan) 1.5mg/mL로 되도록 0.1mol/L 초산수(酢酸水)에 용해하고, 같은 용량의 프로인드 ㅂ불완전 아쥬반트 (DIFCO LABORATORIES)와 현탁한 액 400㎕를 래트의 배부에 피부내 접종하였다. 접종 후, 체중의 추이도 경일적으로 측정하였다. 또, 펌프 이식도 접종도 실행하지 않은 정상군도 설정하여, 마찬가지로 체중의 추이를 측정하였다.

그 결과, 정상군에 비해 용매 대조군은 유의하게 체중이 감소하는 데에 대해, CNP 투여군은 용매 대조군에 비해 유의하게 체중의 감소가 적었다(도 13). 이 결과로부터, CNP는 래트 콜라겐 관절염 모델에서 일반상태를 개선하는 것이 판명되었다.

본 발명의, GC-B 활성화 물질을 유효성분으로 함유한 치료제 또는 예방제는, 관절연골의 두께 및 관절연골 세포 수가 유의하게 증가된 것, 관절종창에 저항성인 것, 관절연골 변성이 억제되는 것, 활막세포 증가추세, 육아조직의 형성, 염증성 세포침윤의 변화가 현저히 약한 것, 및 관절연골 중의 프로테오글리칸 함량이 저하되지 않는 것 등의 효능을 갖게 됨으로써, 변형성 슬관절증, 변형성 고관절증, 변형성 주관절증, 변형성 척추증, 악관절증 등의 변형성 관절증을 포함한 관절염증의 치료 또는 예방을 위해 유용하였다. 본 발명의 의약의 투여에 의해, 관절 환부에서 의 관절연골 기질 및 연골세포 수의 감소, 억제 또는 재생이 일어나, 관절연골 변성과 관절부의 종창이 억제되고, 이에 따라 관절염증이 억제 또는 경감되게 된다. 특히 본 발명의 변형성 관절증 치료제는, 종래의 관절경 시하수술, 인공관절 치환이나 골절술 등의 정형외과 수술에 비해 환자의 부담이나 고통이 적기 때문에, 환자의 QOL을 배려한 뛰어난 치료제로 될 수가 있다.

GC-B 활성화 물질이 상기와 같은 효능을 갖는다고 하는 신규의 지견으로부터, GC-B를 활성화함으로써 관절염증을 억제하는 것 및 관절연골 세포의 증식을 촉진시키는 것이 가능하다. 또, GC-B의 활성(예컨대 세포 내 cGMP 생산량)을 지표로 함으로써, 관절연골 세포 증식촉진제나 관절염증 치료제를 스크리닝할 수도 있다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고로 해서 본 명세서에 병합하는 것으로 한다.

서열목록 설명

서열번호 1의 설명 : 6-Cys와 22-Cys 사이에서 디설파이드 결합이 형성됨.

서열번호 2의 설명 : 37-Cys와 53-Cys 사이에서 디설파이드 결합이 형성됨.

서열번호 3의 인공서열의 설명 : CNP-22 유도체(여기서, 6-Cys와 22-Cys 사이에서 디설파이드 결합이 형성됨).

서열번호 4의 인공서열의 설명 : CNP-22 유도체(여기서, 6-Cys와 22-Cys 사이에서 디설파이드 결합이 형성됨).

서열번호 5의 인공서열의 설명 : CNP-22 유도체(여기서, 6-Cys와 22-Cys 사이에서 디설파이드 결합이 형성됨).

서열번호 6의 인공서열의 설명 : CNP-22 유도체(여기서, 1-Cys와 17-Cys 사이에서 디설파이드 결합이 형성됨).

서열번호 7의 인공서열의 설명 : CNP-22 유도체(여기서, 7-Cys와 23-Cys 사이에서 디설파이드 결합이 형성됨).

서열번호 8의 인공서열의 설명 : CNP-22 유도체(여기서, 6-Cys와 22-Cys 사이에서 디설파이드 결합이 형성됨).

서열번호 9의 인공서열의 설명 : CNP-22 유도체(여기서, 1-Cys와 17-Cys 사이에서 디슬파이드 결합이 형성됨).

서열번호 10의 인공서열의 설명 : CNP-22 유도체(여기서, 4-Xaa=Leu, I1e, Val; 5-Xaa=Lys, Leu, Met; 6-Xaa=Leu, Ile, Ala, Val; 11-Xaa=Ser, Ala, Gly, Thr, Asn; 12-Xaa=Met, Ala, Trp, His, Lys, Ser, Gly; 14-Xaa=Gly, Lys, Ala, Leu; 15-Xaa=Leu, Met. 또, l-Cys와 17 1cys 사이에서 디설파이드 결합이 형성됨).

SEQUENCE LISTING <110> Nakao, Kazuwa <120> Therapeutic or prophylactic agent for arthritis <130> PH-2442-PCT <150> JP 2004-107924 <151> 2004-03-31 <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DISULFID <222> (6)..(22) <223> A disulfide bond is formed <400> 1 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser 1 5 10 15 Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 2 <211> 53 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DISULFID <222> (37)..(53) <223> A disulfide bond is formed <400> 2 Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu 1 5 10 15 Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly 20 25 30 Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met 35 40 45 Ser Gly Leu Gly Cys 50 <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DISULFID <222> (6)..(22) <223> A disulfide bond is formed <400> 3 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ala 1 5 10 15 Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 4 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DISULFID <222> (6)..(22) <223> A disulfide bond is formed <400> 4 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser 1 5 10 15 Gln Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 5 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DISULFID <222> (6)..(22) <223> A disulfide bond is formed <400> 5 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser 1 5 10 15 Ala Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DISULFID <222> (1)..(17) <223> A disulfide bond is formed <400> 6 Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly 1 5 10 15 Cys <210> 7 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DISULFID <222> (7)..(23) <223> A disulfide bond is formed <400> 7 Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 8 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DISULFID <222> (6)..(22) <223> A disulfide bond is formed <400> 8 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser 1 5 10 15 Met Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 25 <210> 9 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DISULFID <222> (1)..(17) <223> A disulfide bond is formed <400> 9 Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Gln Ser Gly Leu Gly 1 5 10 15 Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (4)..(4) <223> Xaa is Leu, Ile, or Val <220> <221> MUTAGEN <222> (5)..(5) <223> Xaa is Lys, Leu, or Met <220> <221> MUTAGEN <222> (6)..(6) <223> Xaa is Leu, Ile, Ala, or Val <220> <221> MUTAGEN <222> (11)..(11) <223> Xaa is Ser, Ala, Gly, Thr, or Asn <220> <221> MUTAGEN <222> (12)..(12) <223> Xaa is Met, Ala, Trp, His, Lys, Ser, or Gly <220> <221> MUTAGEN <222> (12)..(12) <223> Xaa is Met, Ala, Trp, His, Lys, Ser, or Gly <220> <221> MUTAGEN <222> (14)..(14) <223> Xaa is Gly, Lys, Ala, or Leu <220> <221> MUTAGEN <222> (15)..(15) <223> Xaa is Leu or Met <220> <221> DISULFID <222> (1)..(17) <223> A disulfide bond is formed <400> 10 Cys Phe Gly Xaa Xaa Xaa Asp Arg Ile Gly Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 Cys 1/8

Claims

구아닐 시클라제 B(GC-B) 활성화 물질을 유효성분으로 함유한 것을 특징으로 하는 관절염증의 치료제 또는 예방제.
제1항에 있어서, 상기 관절염증이 변형성 관절증인 관절염증의 치료제 또는 예방제.
제2항에 있어서, 상기 변형성 관절증이 하중 관절의 변형성 관절증 또는 비하중 관절의 변형성 관절증인 관절염증의 치료제 또는 예방제.
제3항에 있어서, 상기 변형성 관절증이 변형성 슬관절증인 관절염증의 치료제 또는 예방제.
제3항에 있어서, 상기 변형성 관절증이 변형성 고관절증인 관절염증의 치료제 또는 예방제.
제3항에 있어서, 상기 변형성 관절증이 악관절증인 관절염증의 치료제 또는 예방제.
제1항에 있어서, 상기 관절염증이 관절 류머티즘에 기인하는 것임을 특징으로 하는 관절염증의 치료제 또는 예방제.
제1항에 있어서, 상기 관절염증이 변형성 관절증에 기인하는 것임을 특징으로 하는 관절염증의 치료제 또는 예방제.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GC-B 활성화 물질이 C형 나트륨 이뇨 펩티드(CNP) 또는 그의 유도체인 것을 특징으로 하는 관절염증의 치료제 또는 예방제.
제9항에 있어서, 상기 CNP가 인간을 포함한 포유류 또는 조류 유래의 CNP-22 및 CNP-53으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 관절염증의 치료제 또는 예방제.
제9항에 있어서, 상기 CNP가 서열번호 1의 CNP-22 또는 서열번호 2의 CNP-53인 것을 특징으로 하는 관절염증의 치료제 또는 예방제.
제9항에 있어서, 상기 유도체가 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 1 ~ 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가됨과 더불어 CNP 활성을 가진 것임을 특징으로 하는 관절염증의 치료제 또는 예방제.
제1항에 있어서, 1가지 이상의 비스테로이드성 항염증약을 더 포함하는 것임을 특징으로 하는 관절염증의 치료제 또는 예방제.
GC-B 활성화 물질을 유효성분으로 함유한 것을 특징으로 하는 관절연골 세포 증식촉진제.
제14항에 있어서, 상기 GC-B 활성화 물질이 CNP 또는 그 유도체인 것을 특징으로 하는 관절연골 세포 증식촉진제.
제15항에 있어서, 상기 CNP가 인간을 포함한 포유류 또는 조류 유래의 CNP-22 또는 CNP-53인 것을 특징으로 하는 관절연골 세포 증식촉진제.
제15항에 있어서, 상기 CNP가 서열번호 1의 CNP-22 또는 서열번호 2의 CNP-53인 것을 특징으로 하는 관절연골 세포 증식촉진제.
제15항에 있어서, 상기 유도체가 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 l ~ 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가됨과 더불어 CNP 활성을 가진 것임을 특징으로 하는 관절연골 세포 증식촉진제.
제14항에 있어서, 1가지 이상의 비스테로이드성 항염증약을 더 포함하는 것임을 특징으로 하는 관절연골 세포 증식촉진제.
GC-B를 활성화함에 의해 관절염증을 억제하는 것을 특징으로 하는 관절염증의 억제방법.
제20항에 있어서, 상기 GC-B가 CNP 또는 그의 유도체에 의해 활성화되는 것임을 특징으로 하는 관절염증의 억제방법.
제21항에 있어서, 상기 CNP가 인간을 포함한 포유류 또는 조류 유래의 CNP-22 또는 CNP-53인 것을 특징으로 하는 관절염증의 억제방법.
제21항에 있어서, 상기 CNP가 서열번호 1의 CNP-22 또는 서열번호 2의 CNP-53인 것을 특징으로 하는 관절염증의 억제방법.
제21항에 있어서, 상기 유도체가 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 1 ~ 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가됨과 더불어 CNP 활성을 가진 것임을 특징으로 하는 관절염증의 억제방법.
제20항에 있어서, 상기 GC-B가 CNP 또는 그 유도체와 1가지 이상의 비스테로 이드성 항염증약과의 조합에 의해 활성화되는 것임을 특징으로 하는 관절염증의 억제방법.
GC-B를 활성화함에 의해 관절연골 세포의 증식을 촉진하는 것을 특징으로 하는 관절연골 세포의 증식 촉진방법.
제26항에 있어서, 상기 GC-B가 CNP 또는 그 유도체에 의해 활성화되는 것을 특징으로 하는 관절연골 세포의 증식 촉진방법.
제27항에 있어서, 상기 CNP가,인간을 포함한 포유류 또는 조류 유래의 CNP-22 또는 CNP-53인 것을 특징으로 하는 관절연골 세포의 증식 촉진방법.
제27항에 있어서, 상기 CNP가 서열번호 1의 CNP-22 또는 서열번호 2의 CNP-53인 것을 특징으로 하는 관절연골 세포의 증식 촉진방법.
제27항에 있어서, 상기 유도체가 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 1 ~ 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가됨과 더불어 CNP 활성을 가진 것임을 특징으로 하는 관절연골 세포의 증식 촉진방법.
제26항에 있어서, 상기 GC-B가 CNP 또는 그 유도체와 1가지 이상의 비스테로 이드성 항염증약과의 조합에 의해 활성화되는 것을 특징으로 하는 관절연골 세포의 증식 촉진방법.
GC-B의 활성을 지표로 해서 관절연골 세포의 증식촉진에 대해 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함하는 관절연골 세포 증식 촉진제의 스크리닝 방법.
제32항에 있어서, GC-B를 발현하는 배양세포 또는 관절연골 세포 유래의 세포를 준비하고, 상기 세포를 후보약제의 존재 하에서 배양하고, 상기 세포의 GC-B 활성을 지표로 해서 관절연골 세포의 증식 촉진에 대해 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함하는 관절연골 세포의 증식 촉진제의 스크리닝 방법.
제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 GC-B 활성이 세포 내 cGMP 생산량에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는 관절연골 세포의 증식 촉진제의 스크리닝 방법.
제32항에 있어서, GC-B를 강제발현시킨 배양세포주를 준비하고, 상기 세포주를 후보약제의 존재 하에 또는 비존재 하에서 배양하고, 상기 세포주의 세포 내 cGMP의 생산량을 측정해서, 후보약제의 존재 하와 비존재 하에서의 세포 내 cGMP 생산량의 차이를 지표로 해서 관절연골 세포의 증식촉진에 대해 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함하는 관절연골 세포의 증식 촉진제의 스크리닝 방법.
GC-B의 활성을 지표로 해서, 변형성 관절증, 관절 류머티즘 또는 관절염증 치료제의 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함한, 변형성 관절증, 관절 류머티즘 또는 관절염증의 치료제의 스크리닝 방법.
제36항에 있어서, GC-B를 발현하는 배양세포 또는 관절연골 세포 유래의 세포를 준비하고, 상기 세포를 후보약제의 존재 하에서 배양하고, 상기 세포의 GC-B 활성을 지표로 해서 변형성 관절증, 관절 류머티즘 또는 관절염증 치료제의 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함하는 치료제의 스크리닝 방법.
제36항 도는 제37항에 있어서, 상기 GC-B 활성이 세포 내 cGMP 생산량에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는 치료제의 스크리닝 방법.
제36항에 있어서, GC-B를 강제발현시킨 배양 세포주를 준비하고, 상기 세포주를 후보약제의 존재 하에 또는 비존재 하에서 배양하고, 상기 세포주의 세포 내 cGMP의 생산량을 측정해서, 후보약제의 존재 하와 비존재 하에서의 세포 내 cGMP 생산량의 차이를 지표로 해서 변형성 관절증, 관절 류머티즘 또는 관절염증 치료제의 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함하는 치료제의 스크리닝 방법.
구아닐 시클라제 B(GC-B) 활성화 물질을 유효성분으로 함유한 변형성 관절증의 치료제 또는 예방제.
제40항에 있어서, 1가지 이상의 비스테로이드성 항염증약을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 변형성 관절증의 치료제 또는 예방제.
구아닐 시클라제 B(GC-B) 활성화물질을 유효성분으로 함유한 관절 류머티즘의 치료제 또는 예방제.
제42항에 있어서, 1가지 이상의 비스테로이드성 항염증약을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 관절 류머티즘의 치료제 또는 예방제.
비스테로이드성 활성화제를 함유한, GC-B 활성화 물질에 대한 활성화 촉진

제.
제44항에 있어서, 상기 GC-B 활성화 물질이 CNP 또는 그 유도체인 것을 특징으로 하는 GC-B 활성화 물질에 대한 활성화 촉진제.
제45항에 있어서, 상기 CNP가 인간을 포함한 포유류 또는 조류 유래의 CNP-22 및 CNP-53으로부터 선택되는 것임으로 특징으로 하는 GC-B 활성화 물질에 대한 활성화 촉진제.
제45항에 있어서, 상기 CNP가 서열번호 1의 CNP-22 또는 서열번호 2의 CNP-53인 것을 특징으로 하는 GC-B 활성화 물질에 대한 활성화 촉진제.
제45항에 있어서, 상기 유도체가 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 l ~ 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가됨과 더불어 CNP 활성을 가진 것임을 특징으로 하는 GC-B 활성화 물질에 대한 활성화 촉진제.
제44항에 있어서, 상기 비스테로이드 활성화제가 시클로옥시게나제 효소억제제인 것을 특징으로 하는 GC-B 활성화 물질에 대한 활성화 촉진제.
제49항에 있어서, 상기 시클로옥시게나제 효소억제제가 인도메타신, 이부프로펜, 피록시캄, 살리실산, 디클로페낙, 케토프로펜, 나프록센 및 피록시캄으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 GC-B 활성화 물질에 대한 활성화 촉진제.
제44항 내지 제50항 중 어느 하나에 기재된 활성화 촉진제를 사용하는 것을 특징으로 하는 GC-B 활성화 물질의 활성화 방법.