JP2002356437A - Ｇｌｉ１遺伝子の用途 - Google Patents

Ｇｌｉ１遺伝子の用途

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JP2002356437A
JP2002356437A JP2001235851A JP2001235851A JP2002356437A JP 2002356437 A JP2002356437 A JP 2002356437A JP 2001235851 A JP2001235851 A JP 2001235851A JP 2001235851 A JP2001235851 A JP 2001235851A JP 2002356437 A JP2002356437 A JP 2002356437A
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Yuichi Hikichi
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Takeda Chemical Industries Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 Ｇｌｉ１遺伝子の用途の提供。 【効果】 本発明のＧｌｉ１遺伝子を発現する能力を有
する細胞を用いたスクリーニング方法は、Ｇｌｉ１遺伝
子の発現を制御する活性を有する化合物またはその塩の
探索に用いることができる。Ｇｌｉ１遺伝子の発現を促
進する活性を有する化合物は骨、あるいは軟骨誘導活性
を有するため、整形外科領域の疾患、または歯科領域の
疾患、さらには骨粗鬆症などの予防・治療剤として用い
ることができる。また、美容外科領域における骨移植の
治療剤としても用いることができるし、再生医療におけ
る自家移植の際の分化誘導剤としても利用できる。一
方、Ｇｌｉ１遺伝子の発現を阻害する活性を有する化合
物は、例えば骨・軟骨形成過剰症の予防・治療剤として
用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はＧｌｉ１遺伝子を発
現する能力を有する細胞を用いたＧｌｉ１遺伝子の発現
を制御（促進または阻害）する活性を有する化合物また
はその塩のスクリーニング方法、該スクリーニング方法
を用いて得られうる化合物またはその塩、および該化合
物の用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】グリア芽腫遺伝子（Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２
およびＧｌｉ３）のうち、Ｇｌｉ１遺伝子の産物である
Ｇｌｉ１タンパク質はzinc fingerを有する転写因子に
属し、ショウジョウバエの転写因子Ｃｉ（Cubitus inte
rruptus）の脊椎動物におけるホモログとされている（A
za-Blanc, P. et al., Trends Genet. (1999) 15, 458-
462）。ショウジョウバエＣｉの機能については研究が
進んでおり、Ｃｉが誘導する分子などが報告されている
（McMahon, A.P. et al., Cell (2000) 100, 185-18
8）。Ｇｌｉタンパク質については、３種のＧｌｉタン
パク質すべてがzinc finger領域を介して共通な配列に
結合すること、Ｇｌｉ３タンパク質が直接Ｇｌｉ１遺伝
子に含まれるプロモーター領域に結合し、その転写を誘
導していることなどが報告されてはいるが、Ｇｌｉ１タ
ンパク質の機能はショウジョウバエのＣｉタンパク質の
機能からの類推が主となっており、誘導分子などについ
ても未知の点が多い。一方、Ｇｌｉ１遺伝子発現はヘッ
ジホッグ（hedgehog）と呼ばれる可溶性分泌タンパク質
によるシグナル伝達によって誘導されるとされている
（Dai,P. et al., J. Biol. Chem. (1999) 274, 8143-8
152）。ヘッジホッグファミリーは昆虫から脊椎動物ま
でを含む多くの動物種における形態形成の鍵として注目
されている一群のタンパク因子であり、例えばSonic he
dgehogの活性部位であるＮ末端ドメインを強制発現させ
た繊維芽細胞をヌードマウスに移植すると異所性骨形成
が誘導されることが報告されている（Kinto, N. et a
l., FEBS lett. (1997) 404,319-323）。これらの点で
ヘッジホッグタンパク質は様々な骨・軟骨障害、骨・軟
骨疾患の治療、予防に有効と考えられるが、天然には微
量にしか存在せず、治療に使用するべく大量に入手する
ためには組み換え型タンパク質を生産する必要がある。
一般的に組み換え型タンパク質の生産は低分子化合物の
生産よりはるかに多くの費用を要し、またタンパク質と
いう特性から、医薬品としての物性、投与法にも制約が
ある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】骨・軟骨組織は未分化
間葉系細胞等の多分化能を有する細胞の骨・軟骨前駆細
胞への分化決定の後、骨・軟骨細胞への分化、増殖、骨
・軟骨基質の合成といった一連の過程を経て形成され
る。胎生期や骨折治癒などの骨形成過程においては一般
に軟骨分化が骨形成に先立って起こることから、軟骨分
化促進は骨分化促進にもつながる。障害を受けた骨・軟
骨組織の修復や誘導を要する疾患、あるいは過形成が問
題となっている疾患はこれらのいずれかの過程が破綻し
ていると考えられるが、これらを治癒に向わせる安価
で、効果的な優れた医薬品の創製が切望されていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意検討した結果、Ｇｌｉ１の機能
解析研究においてＧｌｉ１を強制発現させると、軟骨マ
ーカーの発現が亢進することを見出し、さらには例えば
Ｓｃｌｅｒａｘｉｓなどのヘッジホッグシグナルに関与
するとの報告がない転写因子の遺伝子を強制発現させる
ことによってもＧｌｉ１誘導は可能であることなどから
ヘッジホッグタンパク質を用いなくともＧｌｉ１発現の
制御が可能であることを見出した。さらにヘッジホッグ
レセプターに直接作用するものではない一部の既存低分
子化合物がＧｌｉ１の発現を誘導し、ひいては軟骨マー
カー遺伝子の発現をも誘導することを見出した。本発明
者らは、これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねた
結果、本発明を完成するに至った。
【０００５】すなわち、本発明は （１）Ｇｌｉ１タンパク質、その部分ペプチドまたはそ
の塩を含有する骨・軟骨分化誘導剤、（２）Ｇｌｉ１タ
ンパク質が配列番号：１０、配列番号：１１、配列番
号：１３、配列番号：１５または配列番号：１７で表さ
れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ
酸配列を含有するタンパク質である前記（１）記載の
剤、（３）Ｇｌｉ１タンパク質が配列番号：１０、配列
番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５または配
列番号：１７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパ
ク質である前記（１）記載の剤、（４）Ｇｌｉ１タンパ
ク質、その部分ペプチドまたはその塩を含有する骨折、
変形性関節症、骨関節炎、軟骨損傷、外傷、骨形成不全
症、軟骨無形成症または骨粗鬆症の予防・治療剤、骨・
軟骨欠損部の再生治療剤、骨再建剤または骨移植治療
剤、（５）Ｇｌｉ１タンパク質またはその部分ペプチド
をコードするＤＮＡを含有する骨・軟骨分化誘導剤、
（６）ＤＮＡが配列番号：９、配列番号：１２、配列番
号：１４、配列番号：１６または配列番号：１８で表さ
れる塩基配列を含有する前記（５）記載の剤、（７）Ｇ
ｌｉ１タンパク質またはその部分ペプチドをコードする
ＤＮＡを含有する組換えベクターを含有する前記（５）
記載の剤、（８）Ｇｌｉ１タンパク質またはその部分ペ
プチドをコードするＤＮＡを含有する骨折、変形性関節
症、骨関節炎、軟骨損傷、外傷、骨形成不全症、軟骨無
形成症または骨粗鬆症の予防・治療剤、骨・軟骨欠損部
の再生治療剤、骨再建剤または骨移植治療剤、（９）Ｇ
ｌｉ１タンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の有
効量を哺乳動物に投与することを特徴とする骨・軟骨分
化誘導方法、（１０）Ｇｌｉ１タンパク質、その部分ペ
プチドまたはその塩の有効量を哺乳動物に投与すること
を特徴とする骨折、変形性関節症、骨関節炎、軟骨損
傷、外傷、骨形成不全症、軟骨無形成症または骨粗鬆症
の予防・治療方法、（１１）骨・軟骨分化誘導剤を製造
するためのＧｌｉ１タンパク質、その部分ペプチドまた
はそれらの塩の使用、（１２）骨折、変形性関節症、骨
関節炎、軟骨損傷、外傷、骨形成不全症、軟骨無形成症
または骨粗鬆症の予防・治療剤、骨・軟骨欠損部の再生
治療剤、骨再建剤または骨移植治療剤を製造するための
Ｇｌｉ１タンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの
塩の使用、（１３）Ｇｌｉ１タンパク質またはその部分
ペプチドをコードするＤＮＡの有効量を哺乳動物に投与
することを特徴とする骨・軟骨分化誘導方法、（１４）
Ｇｌｉ１タンパク質またはその部分ペプチドをコードす
るＤＮＡの有効量を哺乳動物に投与することを特徴とす
る骨折、変形性関節症、骨関節炎、軟骨損傷、外傷、骨
形成不全症、軟骨無形成症または骨粗鬆症の予防・治療
方法、（１５）骨・軟骨分化誘導剤を製造するためのＧ
ｌｉ１タンパク質またはその部分ペプチドをコードする
ＤＮＡの使用、（１６）骨折、変形性関節症、骨関節
炎、軟骨損傷、外傷、骨形成不全症、軟骨無形成症また
は骨粗鬆症の予防・治療剤、骨・軟骨欠損部の再生治療
剤、骨再建剤または骨移植治療剤を製造するためのＧｌ
ｉ１タンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤ
ＮＡの使用、（１７）配列番号：１０、配列番号：１
１、配列番号：１３、配列番号：１５または配列番号：
１７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同
一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分
ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列に相補的もしく
は実質的に相補的な塩基配列を含有するアンチセンスＤ
ＮＡを含有する骨・軟骨分化阻害剤、（１８）配列番
号：１０、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番
号：１５または配列番号：１７で表されるアミノ酸配列
と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
タンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮ
Ａ、または該ＤＮＡの塩基配列に相補的もしくは実質的
に相補的な塩基配列を含有するアンチセンスＤＮＡを含
有する骨・軟骨形成過剰症の予防・治療剤、（１９）配
列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１３、配列
番号：１５または配列番号：１７で表されるアミノ酸配
列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
るタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮ
Ａの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配
列を含有するアンチセンスＤＮＡを含有する骨・軟骨疾
患の診断剤、（２０）配列番号：１０、配列番号：１
１、配列番号：１３、配列番号：１５または配列番号：
１７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同
一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分
ペプチドをコードするＤＮＡ、または該ＤＮＡの塩基配
列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列を含有す
るアンチセンスＤＮＡを用いることを特徴とする骨・軟
骨疾患の診断方法、（２１）Ｇｌｉ１タンパク質、その
部分ペプチドまたはそれらの塩の抗体を含有する骨・軟
骨疾患の診断剤、（２２）Ｇｌｉ１タンパク質、その部
分ペプチドまたはそれらの塩の抗体を用いることを特徴
とする骨・軟骨疾患の診断方法、（２３）Ｇｌｉ１タン
パク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩を用いるこ
とを特徴とする骨・軟骨分化調節作用を有する化合物ま
たはその塩のスクリーニング方法、（２４）Ｇｌｉ１タ
ンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有す
る細胞を用いることを特徴とする前記（２３）記載のス
クリーニング方法、（２５）Ｇｌｉ１タンパク質または
その部分ペプチドを発現する能力を有する細胞を試験化
合物の存在下および非存在下に培養し、軟骨分化のマー
カー遺伝子の発現量を測定することを特徴とする前記
（２３）記載のスクリーニング方法、（２６）軟骨分化
のマーカー遺伝子がＩＩ型Ｂコラーゲン遺伝子である前
記（２５）記載のスクリーニング方法、（２７）Ｇｌｉ
１タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を
有する細胞を試験化合物の存在下および非存在下に培養
し、細胞の軟骨分化状態を観察することを特徴とする前
記（２３）記載のスクリーニング方法、（２８）Ｇｌｉ
１タンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩を含
有することを特徴とする骨・軟骨分化調節作用を有する
化合物またはその塩のスクリーニング用キット、（２
９）前記（２３）〜（２７）記載のスクリーニング方
法、または前記（２８）記載のスクリーニング用キット
を用いて得られうる、骨・軟骨分化調節作用を有する化
合物またはその塩、（３０）前記（２９）記載の化合物
またはその塩を含有する骨・軟骨分化調節剤、（３１）
前記（２９）記載の化合物またはその塩を含有する骨
折、変形性関節症、骨関節炎、軟骨損傷、外傷、骨形成
不全症、軟骨無形成症、骨粗鬆症または骨・軟骨形成過
剰症の予防・治療剤、骨・軟骨欠損部の再生治療剤、骨
再建剤または骨移植治療剤、（３２）前記（２９）記載
の化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与するこ
とを特徴とする骨・軟骨疾患の予防・治療方法、（３３）
前記（２９）記載の化合物またはその塩の有効量を哺乳
動物に投与することを特徴とする骨折、変形性関節症、
骨関節炎、軟骨損傷、外傷、骨形成不全症、軟骨無形成
症、骨粗鬆症または骨・軟骨形成過剰症の予防・治療方
法、（３４）骨・軟骨疾患の予防・治療剤を製造するため
の前記（２９）記載の化合物またはその塩の使用、（３
５）骨折、変形性関節症、骨関節炎、軟骨損傷、外傷、
骨形成不全症、軟骨無形成症、骨粗鬆症または骨・軟骨
形成過剰症の予防・治療剤、骨・軟骨欠損部の再生治療
剤、骨再建剤または骨移植治療剤を製造するための前記
（２９）記載の化合物またはその塩の使用、（３６）Ｇ
ｌｉ１タンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の作
用を増強または活性化することを特徴とする骨・軟骨分
化誘導方法、（３７）Ｇｌｉ１タンパク質、その部分ペ
プチドまたはその塩の作用を増強または活性化すること
を特徴とする骨折、変形性関節症、骨関節炎、軟骨損
傷、外傷、骨形成不全症、軟骨無形成症または骨粗鬆症
の予防・治療方法、（３８）Ｇｌｉ１遺伝子を発現する
能力を有する細胞を用いることを特徴とするＧｌｉ１遺
伝子の発現を制御する活性を有する化合物またはその塩
のスクリーニング方法、（３９）Ｇｌｉ１遺伝子を発現
する能力を有する細胞を試験化合物の存在下および非存
在下に培養し、Ｇｌｉ１遺伝子ＤＮＡもしくはその相補
ＤＮＡまたはその部分ＤＮＡを用いてそれぞれのＧｌｉ
１タンパク質をコードするｍＲＮＡの量を測定すること
を特徴とする前記（３８）記載のスクリーニング方法、
（４０）Ｇｌｉ１遺伝子のプロモーターもしくはエンハ
ンサーをレポーター遺伝子に連結させたＤＮＡで形質転
換した細胞を試験化合物の存在下および非存在下に培養
し、それぞれの該レポーター遺伝子の発現を検出するこ
とを特徴とするＧｌｉ１遺伝子のプロモーターもしくは
エンハンサーの活性を制御する作用を有する化合物また
はその塩のスクリーニング方法、（４１）Ｇｌｉ１遺伝
子を発現する能力を有する細胞が骨または軟骨への分化
能を有する細胞あるいは既に分化形態を示している細胞
である前記（３８）記載のスクリーニング方法、（４
２）Ｇｌｉ１遺伝子を発現する能力を有する細胞を含有
することを特徴とするＧｌｉ１遺伝子の発現を制御する
活性を有する化合物またはその塩のスクリーニング用キ
ット、（４３）Ｇｌｉ１遺伝子のプロモーターもしくは
エンハンサーをレポーター遺伝子に連結させたＤＮＡで
形質転換した細胞を含有することを特徴とするＧｌｉ１
遺伝子のプロモーターもしくはエンハンサーの活性を制
御する作用を有する化合物またはその塩のスクリーニン
グ用キット、（４４）前記（３８）記載のスクリーニン
グ方法、または前記（４２）記載のスクリーニング用キ
ットを用いて得られうる、Ｇｌｉ１遺伝子の発現を制御
する活性を有する化合物またはその塩（但し、配列番
号：２０または配列番号：２２で表されるＧｌｉ３遺伝
子またはその産物（配列番号：１９または配列番号：２
１）を除く）、（４５）前記（４０）記載のスクリーニ
ング方法、または前記（４３）記載のスクリーニング用
キットを用いて得られうる、Ｇｌｉ１遺伝子のプロモー
ターもしくはエンハンサーの活性を制御する作用を有す
る化合物またはその塩、（４６）前記（４４）または
（４５）記載の化合物またはその塩を含有する医薬、
（４７）前記（４４）または（４５）記載の化合物また
はその塩を含有する骨・軟骨疾患の予防・治療剤、（４
８）前記（４４）または（４５）記載の化合物またはそ
の塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする骨
・軟骨疾患の予防・治療方法、（４９）骨・軟骨疾患の
予防・治療剤を製造するための前記（４４）または（４
５）記載の化合物またはその塩の使用、（５０）Ｇｌｉ
１遺伝子の発現を増強または活性化することを特徴とす
る骨・軟骨分化誘導方法、（５１）Ｇｌｉ１遺伝子の発
現を増強または活性化することを特徴とする骨折、変形
性関節症、骨関節炎、軟骨損傷、外傷、骨形成不全症、
軟骨無形成症または骨粗鬆症の予防・治療方法などを提
供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明においてＧｌｉ１遺伝子と
はSasaki et al. Development (1999) 129,3915-3924、
Kinzler, KW. et al., Science (1987) 236, 70-73など
に記載されている公知の遺伝子であり、マウスの遺伝子
はＡＦ０２６３０５、ＡＢ０２５９２２、ヒトの遺伝子
はＸ０７３８４としてＧｅｎＢａｎｋに各々対応するア
ミノ酸配列とともに登録されている。また、Ｇｌｉ１遺
伝子の多型についての研究がなされ、配列番号：１４、
１６および１８（対応するアミノ酸配列はそれぞれ配列
番号：１３、１５および１７）で表される、ヒトＧｌｉ
１遺伝子上に３箇所の塩基置換が存在していることが報
告されている（J. Invest. Dermatol. (2000) 115, 328
-329）。本発明において「Ｇｌｉ１タンパク質」として
は、配列番号：１０、１１、１３、１５または１７で表
されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含有するタンパク質を挙げることができる。
Ｇｌｉ１タンパク質は、例えば、温血動物（例えば、ヒ
ト、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、
ブタ、ヒツジ、ウシ、サル等）のあらゆる細胞（例え
ば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄
細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細
胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細
胞、筋芽細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファー
ジ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細
胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜
細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細
胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆
細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）や血球系の細胞、
またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、
脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海
馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小
脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒
質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、
甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管
（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下
腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎
盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質
であってもよく、また合成タンパク質であってもよい。
なかでも温血動物（例えば、ヒト、モルモット、ラッ
ト、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、
サル等）の細胞（例えば、グリア細胞、骨髄細胞、表皮
細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、軟骨細胞、骨細胞もしく
は骨芽細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もし
くはガン細胞等）などに由来するタンパク質が好ましく
用いられる。
【０００７】配列番号：１０、１１、１３、１５または
１７で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ
酸配列としては、例えば、配列番号：１０、１１、１
３、１５または１７で表わされるアミノ酸配列と約５０
％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７
０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、なかでも好
ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の
相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。本発明
の配列番号：１０、１１、１３、１５または１７で表わ
されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含
有するタンパク質としては、例えば、配列番号：１０、
１１、１３、１５または１７で表わされるアミノ酸配列
と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１
０、１１、１３、１５または１７で表わされるアミノ酸
配列を有するタンパク質と実質的に同質の活性を有する
タンパク質などが好ましい。実質的に同質の活性として
は、例えば、転写活性や骨・軟骨分化誘導作用などが挙
げられる。実質的に同質とは、転写活性や骨・軟骨分化
誘導作用が性質的に同質であることを示す。したがっ
て、転写活性や骨・軟骨分化誘導作用が同等（例、約
０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、よ
り好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましい
が、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量
的要素は異なっていてもよい。骨・軟骨分化誘導作用な
どの活性の測定は、公知の方法に準じて行うことができ
るが、例えば、後に記載するスクリーニング方法に従っ
て測定することができる。転写活性の測定は公知の方
法、例えばレポーターアッセイや、ＲＴ−ＰＣＲなどの
方法を用いて行うことができる。
【０００８】また、本発明で用いられるのＧｌｉ１タン
パク質としては、配列番号：１０、１１、１３、１５
または１７で表わされるアミノ酸配列中の１または２個
以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１
〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））の
アミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１０、
１１、１３、１５または１７で表わされるアミノ酸配列
に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、よ
り好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個
（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
配列番号：１０、１１、１３、１５または１７で表わさ
れるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、
１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さら
に好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミ
ノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれらを組み
合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質なども用い
られる。
【０００９】本明細書におけるＧｌｉ１タンパク質は、
ペプチド表記の慣例に従って、左端がＮ末端（アミノ末
端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列
番号：１０、１１、１３、１５または１７で表わされる
アミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、本
発明のＧｌｉ１タンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基
（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ-)、アミ
ド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何
れであってもよい。ここでエステルにおけるＲとして
は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロ
ピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基、例え
ば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シク
ロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどの
Ｃ6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなど
のフェニル−Ｃ1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメ
チルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ
7-14アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用さ
れるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。本発
明におけるＧｌｉ１タンパク質がＣ末端以外にカルボキ
シル基（またはカルボキシレート）を有している場合、
カルボキシル基がアミド化またはエステル化されている
ものも本発明におけるＧｌｉ１タンパク質に含まれる。
この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端の
エステルなどが用いられる。さらに、本発明におけるＧ
ｌｉ１タンパク質には、上記したタンパク質において、
Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、
ホルミル基、アセチルなどのＣ2-6アルカノイル基など
のＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側
が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタ
ミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基
（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール
基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基
（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ2-6アルカノ
イル基などのＣ1-6アシル基など）で保護されているも
の、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質など
の複合タンパク質なども含まれる。本発明におけるＧｌ
ｉ１タンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：
１０、１１、１３、１５または１７で表わされるアミノ
酸配列を含有するタンパク質などが用いられる。
【００１０】本発明におけるＧｌｉ１タンパク質の部分
ペプチド（以下、部分ペプチドと略記する場合がある）
としては、上記したＧｌｉ１タンパク質の部分ペプチド
であれば何れのものであってもよい。本発明における部
分ペプチドのアミノ酸の数は、上記したＧｌｉ１タンパ
ク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、
好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上の
アミノ酸配列を含有するペプチドなどが好ましい。実質
的に同一のアミノ酸配列とは、これらアミノ酸配列と約
５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは
約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、なかで
も好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以
上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。ここで、「実
質的に同質の活性」とは、上記と同意義を示す。「実質
的に同質の活性」の測定は上記と同様に行うことができ
る。
【００１１】また、本発明の部分ペプチドは、上記アミ
ノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０
個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ
酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個
以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１
〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））の
アミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１ま
たは２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ま
しくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ
酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。また、本発
明の部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯ
Ｈ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ-）、アミド（−Ｃ
ＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであっ
てもよい。さらに、本発明の部分ペプチドには、上記し
た本発明のＧｌｉ１タンパク質と同様に、Ｎ末端のメチ
オニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、
Ｎ端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタ
ミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基
が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が
結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども
含まれる。本発明のＧｌｉ１タンパク質またはその部分
ペプチドの塩としては、酸または塩基との生理学的に許
容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される
酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無
機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との
塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン
酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン
酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベ
ンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００１２】本発明におけるＧｌｉ１タンパク質または
その塩は、上記した哺乳動物の細胞または組織から公知
のタンパク質の精製方法によって製造することもできる
し、後に記載する本発明のＧｌｉ１タンパク質をコード
するＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっ
ても製造することができる。また、後に記載するタンパ
ク質合成法またはこれに準じて製造することもできる。
哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、哺乳動物
の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出
を行い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交
換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み
合わせることにより精製単離することができる。
【００１３】本発明におけるＧｌｉ１タンパク質もしく
はその部分ペプチドまたはその塩またはそのアミド体の
合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いるこ
とができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロ
メチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルア
ミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベン
ジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン
樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニ
ルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、
４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメ
チル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシ
フェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂など
を挙げることができる。このような樹脂を用い、α−ア
ミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的
とするタンパク質の配列通りに、公知の各種縮合方法に
従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタン
パク質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに
高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施
し、目的のタンパク質またはそのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合
成に使用できる各種活性化試薬を用いることができる
が、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類
としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジ
イミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロ
リル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる
活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、Ｈ
ＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加する
か、または、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルある
いはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸
の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００１４】保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用
いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しう
ることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例え
ば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチル
アセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド
類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化
水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、
ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジ
ン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル
類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル
類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいは
これらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタ
ンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られてい
る範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範
囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は
通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応
を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基
の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十
分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分
な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチル
イミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化する
ことができる。
【００１５】原料のアミノ基の保護基としては、例え
ば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニ
ル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベン
ジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマン
チルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロ
イル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジ
フェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられ
る。カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化
（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシ
ャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シク
ロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの
直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、ア
ラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−
ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステ
ル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエス
テル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカル
ボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニル
ヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護
することができる。セリンの水酸基は、例えば、エステ
ル化またはエーテル化によって保護することができる。
このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル
基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロ
イル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボ
ニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。
また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジ
ル基、テトラヒドロピラニル基、t-ブチル基などであ
る。チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、
例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ2−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジ
ル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、
Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼ
ンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕ
ｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００１６】原料のカルボキシル基の活性化されたもの
としては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エ
ステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノー
ル、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニ
トロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロ
フェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ
−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢt）とのエステル〕
などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたもの
としては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられ
る。保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ
−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気
流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンス
ルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオ
ロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジ
イソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリ
ジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモ
ニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸
処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温
度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソ
ール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、
パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタン
ジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカ
チオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンの
イミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロ
フェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリ
プトファンのインドール保護基として用いられるホルミ
ル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタ
ンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外
に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによる
アルカリ処理によっても除去される。
【００１７】原料の反応に関与すべきでない官能基の保
護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関
与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段
から適宜選択しうる。タンパク質のアミド体を得る別の
方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸
のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミ
ノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延
ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護
基のみを除いたタンパク質とＣ末端のカルボキシル基の
保護基のみを除去したタンパク質とを製造し、この両タ
ンパク質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮
合反応の詳細については上記と同様である。縮合により
得られた保護タンパク質を精製した後、上記方法により
すべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質を得るこ
とができる。この粗タンパク質は既知の各種精製手段を
駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の
タンパク質のアミド体を得ることができる。タンパク質
のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミ
ノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合
しアミノ酸エステルとした後、タンパク質のアミド体と
同様にして、所望のタンパク質のエステル体を得ること
ができる。
【００１８】本発明におけるＧｌｉ１タンパク質の部分
ペプチドまたはその塩は、公知のペプチドの合成法に従
って、あるいは本発明におけるＧｌｉ１タンパク質を適
当なペプチダーゼで切断することによって製造すること
ができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合
成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、
本発明のタンパク質を構成し得る部分ペプチドもしくは
アミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有
する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチド
を製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱
離としては、例えば、以下の〜に記載された方法が
挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide),
Academic Press, NewYork (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成
広川書店 また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留
・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー
・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精
製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプ
チドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な
塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合
は、公知の方法によって遊離体に変換することができ
る。
【００１９】本発明におけるＧｌｉ１タンパク質をコー
ドするポリヌクレオチドとしては、上記した本発明にお
けるＧｌｉ１タンパク質をコードする塩基配列（ＤＮＡ
またはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであ
ればいかなるものであってもよい。該ポリヌクレオチド
としては、本発明におけるＧｌｉ１タンパク質をコード
するＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっ
ても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖
ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリ
ッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、
コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非
コード鎖）であってもよい。本発明におけるＧｌｉ１タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、例え
ば、実験医学増刊「新ＰＣＲとその応用」15(7)、1997
記載の公知の方法またはそれに準じた方法により、Ｇｌ
ｉ１タンパク質のｍＲＮＡを定量することができる。Ｇ
ｌｉ１タンパク質をコードするＤＮＡとしては、ゲノム
ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組
織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ
ライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラ
リーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラ
スミド、コスミド、ファージミドなどいずれであっても
よい。また、上記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまた
はｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Tr
anscriptase Polymerase ChainReaction（以下、ＲＴ−
ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、Ｇｌｉ１タンパク質をコードするＤＮＡと
しては、例えば、配列番号：９、１２、１４、１６また
は１８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または
配列番号：９、１２、１４、１６または１８で表わされ
る塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズする塩基配列を有し、本発明のＧｌｉ１タンパク
質と実質的に同質の活性（例、転写活性や骨・軟骨分化
誘導作用など）を有するＧｌｉ１タンパク質をコードす
るＤＮＡであれば何れのものでもよい。配列番号：９、
１２、１４、１６または１８で表わされる塩基配列とハ
イブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番
号：９、１２、１４、１６または１８で表わされる塩基
配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好
ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の
相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いら
れる。
【００２０】ハイブリダイゼーションは、公知の方法あ
るいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クロ
ーニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et
al.,Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の
方法などに従って行うことができる。また、市販のライ
ブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方
法に従って行うことができる。より好ましくは、ハイス
トリンジェントな条件に従って行うことができる。該ハ
イストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃
度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭ
で、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃
の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温
度が約６５℃の場合が最も好ましい。より具体的には、
配列番号：１０で表わされるアミノ酸配列を含有するＧ
ｌｉ１タンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番
号：９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用
いられる。配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列を
含有するＧｌｉ１タンパク質をコードするＤＮＡとして
は、配列番号：１２で表わされる塩基配列を含有するＤ
ＮＡなどが用いられる。配列番号：１３で表わされるア
ミノ酸配列を含有するＧｌｉ１タンパク質をコードする
ＤＮＡとしては、配列番号：１４で表わされる塩基配列
を含有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：１５で
表わされるアミノ酸配列を含有するＧｌｉ１タンパク質
をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１６で表わさ
れる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。配列
番号：１７で表わされるアミノ酸配列を含有するＧｌｉ
１タンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：
１８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用い
られる。本発明におけるＧｌｉ１タンパク質をコードす
るＤＮＡの塩基配列の一部、または該ＤＮＡと相補的な
塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、
下記の本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡを包含
するだけではなく、ＲＮＡをも包含する意味で用いられ
る。本発明に従えば、Ｇｌｉ１タンパク質遺伝子の複製
または発現を阻害することのできるアンチセンス・ポリ
ヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいは決
定されたＧｌｉ１タンパク質をコードするＤＮＡの塩基
配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうしたポリヌ
クレオチド（核酸）は、Ｇｌｉ１タンパク質遺伝子のＲ
ＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成
または機能を阻害することができるか、あるいはＧｌｉ
１タンパク質関連ＲＮＡとの相互作用を介してＧｌｉ１
タンパク質遺伝子の発現を調節・制御することができ
る。Ｇｌｉ１タンパク質関連ＲＮＡの選択された配列に
相補的なポリヌクレオチド、およびＧｌｉ１タンパク質
関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができる
ポリヌクレオチドは、生体内および生体外でＧｌｉ１タ
ンパク質遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であ
り、また病気などの治療または診断に有用である。用語
「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基
配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは
相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列
または核酸とペプチド（タンパク質）との間で「対応す
る」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補
体から誘導される指令にあるペプチド（タンパク質）の
アミノ酸を通常指している。Ｇｌｉ１タンパク質遺伝子
の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピ
ート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コド
ン、タンパク質コード領域、翻訳終止コドン、３’端非
翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘ
アピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、
Ｇｌｉ１タンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象とし
て選択しうる。
【００２１】目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に
相補的なポリヌクレオチドとの関係、即ち対象物とハイ
ブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係
は、「アンチセンス」であるということができる。アン
チセンス・ポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リ
ボースを含有しているポリデオキシヌクレオチド、Ｄ−
リボースを含有しているポリデオキシヌクレオチド、プ
リンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその
他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチ
ド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタン
パク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）また
は特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポ
リマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペ
アリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチ
ドを含有する）などが挙げられる。それらは、二本鎖Ｄ
ＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、さ
らにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さ
らに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌク
レオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例
えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付
いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌク
レオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド
修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチル
ホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデー
ト、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合
または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホ
スホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク
質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキ
シン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンな
ど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖
基を有しているもの、インターカレント化合物（例え
ば、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート
化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、
酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含
有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αア
ノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレ
オシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリ
ンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾さ
れたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでい
て良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよ
びピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジ
ン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。
修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチド
はまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上
の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されてい
たり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換さ
れていてよい。
【００２２】本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド
（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸
（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例と
しては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そ
してポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミ
ドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定さ
れるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のよ
うな方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内で
のアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセ
ンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス
鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし
毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなも
のにする。こうして修飾は当該分野で数多く知られてお
り、例えば J. Kawakami et al.,Pharm Tech Japan, Vo
l. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Cr
ooke et al. ed., Antisense Research and Applicatio
ns, CRC Press, 1993などに開示がある。本発明のアン
チセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、
塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロス
フェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療
により適用されたり、付加された形態で与えられること
ができうる。こうして付加形態で用いられるものとして
は、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジ
ンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高め
たり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例え
ば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水
性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質として
は、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリ
ルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こ
うしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させ
ることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介
して付着させることができうる。その他の基としては、
核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャ
ップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどの
ヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げら
れる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレン
グリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコー
ルをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が
挙げられるが、それに限定されるものではない。アンチ
センス核酸の阻害活性は、Ｇｌｉ１遺伝子またはＧｌｉ
１遺伝子を含有する組換えベクターを含有する形質転換
体、生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいはＧｌｉ１
タンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べるこ
とができる。該核酸は公知の各種の方法で細胞に適用で
きる。
【００２３】本発明における部分ペプチドをコードする
ＤＮＡとしては、上記した本発明の部分ペプチドをコー
ドする塩基配列を含有するものであればいかなるもので
あってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライ
ブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記し
た細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡ
のいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクター
は、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファ
ージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細
胞・組織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接
Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅する
こともできる。具体的には、本発明の部分ペプチドをコ
ードするＤＮＡとしては、例えば、（１）配列番号：
９、１２、１４、１６または１８で表わされる塩基配列
を含有するＤＮＡの部分塩基配列を含有するＤＮＡ、ま
たは（２）配列番号：９、１２、１４、１６または１８
で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有
し、本発明のＧｌｉ１タンパク質と実質的に同質の活性
（例、転写活性や骨・軟骨分化誘導作用など）を有する
Ｇｌｉ１タンパク質をコードするＤＮＡの部分塩基配列
を含有するＤＮＡなどが用いられる。より具体的には、
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例
えば、（１）配列番号：９、１２、１４、１６または１
８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡの部分塩基配
列を含有するＤＮＡ、または（２）配列番号：９、１
２、１４、１６または１８で表わされる塩基配列を含有
するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズする塩基配列を含有し、本発明におけるＧｌｉ１
タンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質を
コードするＤＮＡの部分塩基配列を含有するＤＮＡなど
が用いられる。配列番号：９、１２、１４、１６または
１８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡとハイブリ
ダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：９、
１２、１４、１６または１８で表わされる塩基配列と約
７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは
約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を
有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。ま
た、配列番号：９、１２、１４、１６または１８で表わ
される塩基配列を含有するＤＮＡとハイブリダイズでき
るＤＮＡとしては、例えば、配列番号：９、１２、１
４、１６または１８で表わされる塩基配列と約７０％以
上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％
以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩
基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２４】本発明におけるＧｌｉ１タンパク質または
その部分ペプチド（以下、本発明のタンパク質と略記す
る場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニン
グの手段としては、本発明のタンパク質の部分塩基配列
を含有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によ
って増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤ
ＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコー
ドするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識した
ものとのハイブリダイゼーションによって選別すること
ができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、
モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２n
d（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Pre
ss, 1989）に記載の方法などに従って行うことができ
る。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の
使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
【００２５】ＤＮＡの塩基配列の置換は、ＰＣＲや公知
のキット、例えば、MutanTM−superExpress Km（宝酒
造）、MutanTM−K（宝酒造）等を用いて、ODA−LA PCR
法、gapped duplex法、Kunkel法等の公知の方法あるい
はそれらに準じる方法に従って行うことができる。クロ
ーン化された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは
目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化
したり、リンカーを付加したりして使用することができ
る。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとして
のＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンと
してのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよ
い。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当
な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもでき
る。本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、
（イ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含む、
例えばｃＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、
（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモー
ターの下流に連結することにより製造することができ
る。
【００２６】ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミ
ド（例、ｐＣＲ４、ｐＣＲ２．１、ｐＢＲ３２２、ｐＢ
Ｒ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプ
ラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９
４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１
５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウ
イルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの
動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲ
ｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏな
どが用いられる。本発明で用いられるプロモーターとし
ては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロ
モーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物
細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、
ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプ
ロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられ
る。これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモ
ーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア
属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモ
ーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、
ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である
場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモータ
ー、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合
は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡ
Ｐプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモータ
ー、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００２７】発現ベクターには、以上の他に、所望によ
りエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加
シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以
下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有
しているものを用いることができる。選択マーカーとし
ては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒ
と略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（Ｍ
ＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ
rと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子
（以下、Ｎｅｏrと略称する場合がある、Ｇ４１８耐
性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞
を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する
場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても
選択できる。また、必要に応じて、宿主に合ったシグナ
ル配列を、本発明のタンパク質のＮ端末側に付加する。
宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグ
ナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチ
ルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配
列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母で
ある場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナ
ル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュ
リン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル
配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用でき
る。このようにして構築された本発明のタンパク質をコ
ードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換
体を製造することができる。
【００２８】宿主としては、例えば、エシェリヒア属
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞な
どが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ
１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０
(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・
リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９
(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biolog
y），１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１
巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス
（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕，ＤＨ５α
〔Inoue,H.,Nojima,H.and Okayama,H.,Gene,96,23-28
(1990)〕，ＤＨ１０Ｂ〔プロシージングズ・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ
・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳ
Ａ），８７巻，４６４５−４６４９(１９９０)〕などが
用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス
・サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジー
ン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャ
ーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Bioch
emistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられ
る。酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビ
シエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２
Ｒ-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１
２、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomy
ces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピ
キア・パストリス（Pichia pastoris）などが用いられ
る。
【００２９】昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡ
ｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodop
tera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia ni
の中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のH
igh FiveTM 細胞、Mamestrabrassicae由来の細胞または
Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイル
スがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mor
i N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞とし
ては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１
細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Viv
o）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。昆虫とし
ては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田
ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８
５)〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−
７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以
下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニ
ーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆ
ｒ-）細胞と略記）、マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２
０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細
胞などが用いられる。
【００３０】エシェリヒア属菌を形質転換するには、例
えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１
１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１
９８２)などに記載の方法に従って行うことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecula
r ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７
９)などに記載の方法に従って行うことができる。酵母
を形質転換するには、例えば、メッソズ・イン・エンザ
イモロジー（Methods in Enzymology），１９４巻，１
８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・
オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. US
A），７５巻，１９２９(１９７８）などに記載の方法に
従って行うことができる。昆虫細胞または昆虫を形質転
換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Tech
nology）,6, 47-55(1988)）などに記載の方法に従って
行うことができる。動物細胞を形質転換するには、例え
ば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６
３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー
（Virology），５２巻，４５６（１９７３）に記載の方
法に従って行うことができる。このようにして、Ｇｌｉ
１タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクタ
ーで形質転換された形質転換体が得られる。宿主がエシ
ェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養す
る際、培養に使用される培地としては液体培地が適当で
あり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、
窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源とし
ては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱
粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウ
ム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプト
ン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液な
どの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩
化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシ
ウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン
類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは
約５〜８が望ましい。
【００３１】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics），４３１−
４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York１
９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルア
クリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエ
シェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約
３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えるこ
ともできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約
３０〜４０℃で約６〜２４時間行い、必要により通気や
撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転換
体を培養する際、培地としては、例えば、バークホール
ダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、プ
ロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA），７７巻，４５０５(１９８
０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitte
r, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユ
ーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），８１巻，
５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約
５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜
３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹
拌を加える。
【００３２】宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換
体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Mediu
m（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(196
2)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加え
たものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．
４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３
〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主
が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地として
は、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培
地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９５
２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８
巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジ
ャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシ
エーション（The Journal of the American Medical As
sociation）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培
地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー
・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding ofthe
Society for the Biological Medicine），７３巻，１
(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８である
のが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜
６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。以上
のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞
外に本発明のタンパク質を生成せしめることができる。
【００３３】上記培養物から本発明のタンパク質を分離
精製するには、例えば、下記の方法により行うことがで
きる。本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から
抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるい
は細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、
リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あ
るいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタン
パク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩
衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性
剤や、トリトンＸ−１００TMなどの界面活性剤が含まれ
ていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合
には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上
清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた
培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の精
製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うこ
とができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩
析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、
限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用
する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の
差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー
などの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロ
マトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電
点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用
いられる。
【００３４】このようにして得られるタンパク質が遊離
体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じ
る方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得ら
れた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法によ
り、遊離体または他の塩に変換することができる。な
お、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精
製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることによ
り、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除
去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例
えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンド
ペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼな
どが用いられる。このようにして生成する本発明のＧｌ
ｉ１タンパク質またはその塩の活性は、例えばＧｌｉ１
結合配列を持つ二本鎖ＤＮＡへの結合能等を指標に測定
することができる。
【００３５】本発明におけるＧｌｉ１タンパク質もしく
はその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発
明におけるＧｌｉ１タンパク質もしくはその部分ペプチ
ドまたはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクロー
ナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明におけるＧｌｉ１タンパク質もしくはその部分ペ
プチドまたはその塩（以下、本発明のタンパク質等と略
記する場合がある）に対する抗体は、本発明のタンパク
質等を抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造
法に従って製造することができる。
【００３６】〔モノクローナル抗体の作製〕 （ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製 本発明のタンパク質等は、哺乳動物に対して投与により
抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤
とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高める
ため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイント
アジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎
に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる
哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モル
モット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられる
が、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モノク
ローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫さ
れた温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた
個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ
節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細
胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体
価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質等と抗血
清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を
測定することにより行うことができる。融合操作は既知
の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイ
チャー（Nature)、２５６巻、４９５頁（１９７５
年）〕に従い実施することができる。融合促進剤として
は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセン
ダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが
用いられる。骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、
Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が
好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細
胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２
０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１００
０〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加
され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約
１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細
胞融合を実施できる。
【００３７】モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの
スクリーニングには種々の方法が使用できるが、例え
ば、タンパク質等の抗原を直接あるいは担体とともに吸
着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドー
マ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識
した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞
がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いら
れる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノ
クローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体
またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ
培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタ
ンパク質等を加え、固相に結合したモノクローナル抗体
を検出する方法などが挙げられる。モノクローナル抗体
の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行う
ことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミ
ノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地など
で行うことができる。選別および育種用培地としては、
ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地
を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０
〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、
１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工
業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（Ｓ
ＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることがで
きる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３
７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましく
は１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下
で行うことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価
は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定で
きる。
【００３８】（ｂ）モノクロナール抗体の精製 モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナ
ル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法
〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気
泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着
法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテ
インＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗
体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精
製法〕に従って行うことができる。
【００３９】〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポ
リクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に
したがって製造することができる。例えば、免疫抗原
（タンパク質等の抗原）とキャリアータンパク質との複
合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同
様に哺乳動物に免疫を行い、該免疫動物から本発明のタ
ンパク質等に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離
精製を行うことにより製造できる。哺乳動物を免疫する
ために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との
複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャ
リアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させ
て免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、
どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例
えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キ
ーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプ
テン１に対し、約０.１〜２０、好ましくは約１〜５の
割合でカプルさせる方法が用いられる。また、ハプテン
とキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いる
ことができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミ
ド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリ
ジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。縮
合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位
にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。
投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイント
アジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与し
てもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約
３〜１０回程度行うことができる。ポリクローナル抗体
は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水な
ど、好ましくは血液から採取することができる。抗血清
中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗
体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗
体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製
と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行うこと
ができる。
【００４０】（１）Ｇｌｉ１タンパク質、その部分ペプ
チドまたはそれらの塩、または該タンパク質またはその
部分ペプチドをコードするＤＮＡは骨・軟骨分化誘導剤
として有用である。 （２）Ｇｌｉ１タンパク質、その部分ペプチドまたはそ
れらの塩、Ｇｌｉ１遺伝子ＤＮＡもしくはその相補ＤＮ
Ａまたはその部分ＤＮＡおよびＧｌｉ１タンパク質また
はその部分ペプチドを発現する能力を有する細胞は、Ｇ
ｌｉ１遺伝子の発現を制御する活性を有する化合物、Ｇ
ｌｉ１遺伝子のプロモーターもしくはエンハンサーの活
性を制御する作用を有する化合物、ひいては骨・軟骨分
化調節作用を有する化合物等のスクリーニングに用いる
ことができる。 （３）Ｇｌｉ１遺伝子のアンチセンスＤＮＡ等は、所謂
遺伝子治療剤（骨・軟骨分化阻害剤または骨・軟骨形成
過剰症の予防・治療剤）として、または遺伝子診断剤
（骨・軟骨疾患の診断剤）などとして有用である。 （４）Ｇｌｉ１タンパク質、その部分ペプチドまたはそ
れらの塩の抗体は骨・軟骨疾患の診断剤として有用であ
る。 Ｇｌｉ１タンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩
（以下、本発明のタンパク質等と略記する場合があ
る）、Ｇｌｉ１タンパク質またはその部分ペプチドをコ
ードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合
がある）、Ｇｌｉ１タンパク質等に対する抗体（以下、
本発明の抗体と略記する場合がある）、Ｇｌｉ１遺伝子
のアンチセンスＤＮＡの用途等について、以下に具体的
に説明する。
【００４１】（１）骨・軟骨分化誘導剤 Ｇｌｉ１タンパク質、その部分ペプチドまたはそれら
の塩、または該タンパク質またはその部分ペプチドをコ
ードするＤＮＡは骨・軟骨分化誘導剤などの医薬として
使用することができる。例えば、生体内においてＧｌｉ
１タンパク質またはヘッジホッグが減少しているため
に、またはヘッジホッグによるシグナルが有効に伝達さ
れないためにＧｌｉ１遺伝子またはその産物よる生理作
用（転写活性、骨・軟骨分化誘導作用など）が期待でき
ない（該Ｇｌｉ１タンパク質の欠乏症）患者がいる場合
に、Ｇｌｉ１タンパク質等を該患者に投与し該タンパ
ク質の量を補充したり、（イ）本発明のタンパク質を
コードするＤＮＡあるいは該ＤＮＡを含有する組換えベ
クターを該患者に投与し発現させることによって、ある
いは（ロ）対象となる細胞（例えば、グリア細胞、骨髄
細胞、表皮細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、軟骨細胞、骨
細胞もしくは骨芽細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、
幹細胞等）に本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを
挿入し発現させた後に、該細胞を該患者に移植すること
などによって、患者の体内におけるＧｌｉ１タンパク質
の量を増加させ、転写活性、骨・軟骨分化誘導作用を充
分に発揮させることができる。すなわち、本発明のタン
パク質または該タンパク質をコードするＤＮＡは、安全
で低毒性な骨・軟骨分化誘導剤として有用である。本発
明のタンパク質または該タンパク質をコードするＤＮＡ
は骨・軟骨疾患、例えば整形外科領域の疾患（例、骨
折、変形性関節症、骨関節炎、半月板損傷等の軟骨損
傷、外傷、腫瘍摘出などによる骨、軟骨欠損部の再生、
脊椎固定術、脊柱管拡大術などの骨再建、骨形成不全
症、軟骨無形成症などの先天性骨・軟骨疾患）、歯科領
域の疾患（例、口蓋裂、下顎骨再建術、歯槽堤形成術な
どの骨再建）、骨粗鬆症などの予防・治療剤などの医薬
として用いることができる。また、美容外科領域におけ
る骨移植の治療剤などの医薬としても用いることができ
るし、再生医療における自家移植の際の分化誘導剤とし
ても利用できる。本発明のタンパク質を上記予防・治療
剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化する
ことができる。一方、本発明のタンパク質をコードする
ＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）
を上記予防・治療剤として使用する場合は、本発明のＤ
ＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウ
イルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイ
ルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套
手段に従って実施することができる。本発明のＤＮＡ
は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とと
もに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテ
ーテルによって投与できる。例えば、本発明のタンパ
ク質または該タンパク質をコードするＤＮＡは、必要
に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル
剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは
水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性
溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使
用できる。例えば、本発明のタンパク質または該タ
ンパク質をコードするＤＮＡを生理学的に認められる公
知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定
剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要
求される単位用量形態で混和することによって製造する
ことができる。これら製剤における有効成分量は指示さ
れた範囲の適当な用量が得られるようにするものであ
る。
【００４２】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩
化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアル
コール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート
８０TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液
としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶
解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。
【００４３】また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝
剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝
液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当な
アンプルに充填される。このようにして得られる製剤は
安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、
ヒト、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、
ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができ
る。本発明のタンパク質の投与量は、投与対象、対象臓
器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与
の場合、一般的に例えば、軟骨損傷患者（６０ｋｇとし
て）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍ
ｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約
１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、
その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法
などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常
例えば、軟骨損傷患者（６０ｋｇとして）においては、
一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約
０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０
ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。
他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与
することができる。本発明のＤＮＡの投与量は、投与対
象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はある
が、経口投与の場合、一般的に例えば、軟骨損傷患者
（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１ｍ
ｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より
好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与
する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症
状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤
の形では通常例えば、軟骨損傷患者（６０ｋｇとして）
においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好
ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約
０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好
都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算
した量を投与することができる。
【００４４】（２）Ｇｌｉ１遺伝子の発現を制御する
活性を有する化合物、Ｇｌｉ１遺伝子のプロモーター
もしくはエンハンサーの活性を制御する作用を有する化
合物または骨・軟骨分化調節作用を有する化合物のス
クリーニング方法 上記したごとく、Ｇｌｉ１タンパク質、その部分ペプチ
ドまたはそれらの塩、Ｇｌｉ１遺伝子ＤＮＡもしくはそ
の相補ＤＮＡまたはその部分ＤＮＡおよびＧｌｉ１タン
パク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有する
細胞は、Ｇｌｉ１遺伝子の発現を制御する活性を有する
化合物やＧｌｉ１遺伝子のプロモーターもしくはエンハ
ンサーの活性を制御する作用を有する化合物等のスクリ
ーニングに用いることができ、ひいては骨・軟骨分化調
節作用を有する化合物のスクリーニングに用いることが
できる。Ｇｌｉ１遺伝子を発現する能力を有する細胞と
しては、温血動物（例えば、ヒト、モルモット、ラッ
ト、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、
サル等）の細胞（例えば、グリア細胞、骨髄細胞、表皮
細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、軟骨細胞、骨細胞もしく
は骨芽細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もし
くはガン細胞等）が用いられる。特に、骨または軟骨へ
の分化能を有する細胞あるいは既に分化形態を示してい
る細胞が好ましく、軟骨細胞、繊維芽細胞（例、マウス
繊維芽細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２）、筋芽細胞（例、マ
ウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２）などがより好ましい。
【００４５】以下に、本発明のＧｌｉ１遺伝子の発現を
制御（促進または阻害）する活性を有する化合物または
その塩のスクリーニング方法について詳述する。Ｇｌｉ
１遺伝子発現はヘッジホッグと呼ばれる可溶性タンパク
質によるシグナル伝達によって誘導され、骨形成を誘導
し、骨・軟骨分化促進活性を有するため、Ｇｌｉ１遺伝
子の発現を促進する活性を有する化合物またはその塩
は、骨・軟骨分化調節（特に促進）作用を有し、骨・軟
骨疾患、例えば整形外科領域の疾患（例、骨折、変形性
関節症、骨関節炎、半月板損傷等の軟骨損傷、外傷、腫
瘍摘出などによる骨、軟骨欠損部の再生、脊椎固定術、
脊柱管拡大術などの骨再建、骨形成不全症、軟骨無形成
症などの先天性骨・軟骨疾患）、歯科領域の疾患（例、
口蓋裂、下顎骨再建術、歯槽堤形成術などの骨再建）、
骨粗鬆症などの予防・治療剤などの医薬として用いるこ
とができる。また、美容外科領域における骨移植の治療
剤などの医薬としても用いることができるし、再生医療
における自家移植の際の分化誘導剤としても利用でき
る。一方、Ｇｌｉ１遺伝子の発現を阻害する活性を有す
る化合物またはその塩は、骨・軟骨分化調節（特に阻
害）作用を有し、例えば骨・軟骨形成過剰症などの治療
・予防剤などの医薬として使用できる。したがって、Ｇ
ｌｉ１タンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの
塩、Ｇｌｉ１遺伝子ＤＮＡもしくはその相補ＤＮＡまた
はその部分ＤＮＡまたはＧｌｉ１遺伝子を発現する能力
を有する細胞は、Ｇｌｉ１遺伝子の発現を制御（促進ま
たは阻害）する活性を有する化合物またはその塩のスク
リーニング、ひいては骨・軟骨分化調節作用を有する化
合物のスクリーニングのための材料として用いることが
できる。
【００４６】すなわち、本発明は、Ｇｌｉ１遺伝子を
発現する能力を有する細胞を試験化合物の存在下に培養
し、Ｇｌｉ１遺伝子ＤＮＡもしくはその相補ＤＮＡまた
はその部分ＤＮＡを用いてＧｌｉ１タンパク質をコード
するｍＲＮＡ（以下、Ｇｌｉ１ｍＲＮＡと略称する場合
がある。）の量を測定することを特徴とするＧｌｉ１遺
伝子の発現を制御する活性を有する化合物またはその塩
のスクリーニング方法、より具体的には、（ｉ）Ｇｌ
ｉ１遺伝子を発現する能力を有する細胞を培養した場合
のＧｌｉ１ｍＲＮＡの発現量と、（ｉｉ）Ｇｌｉ１遺伝
子を発現する能力を有する細胞を試験化合物の存在下に
培養した場合のＧｌｉ１ ｍＲＮＡの量との比較を行う
ことを特徴とする、Ｇｌｉ１遺伝子の発現を制御する活
性を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を
提供する。Ｇｌｉ１遺伝子を発現する能力を有する細胞
としては、例えば、前記したＧｌｉ１遺伝子を発現する
能力を有する公知の温血動物細胞などがあげられる。Ｇ
ｌｉ１遺伝子を発現する能力を有する公知の温血動物細
胞としては、例えば、骨または軟骨への分化能を有する
細胞あるいは既に分化形態を示している細胞が好まし
く、具体的には軟骨細胞、繊維芽細胞（例、マウス繊維
芽細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２）、筋芽細胞（例、マウス
筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２）などが用いられる。Ｇｌｉ１遺
伝子を発現する能力を有する細胞の培養は、公知の動物
細胞培養法と同様にして行われる。例えば、培地として
は、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイ
エンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，
ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９
６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ１６４０培地〔ジャーナル・
オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション
（The Journal of the American Medical Associatio
n）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロ
シージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バ
イオロジカル・メディスン（Proceeding of the Societ
y for the Biological Medicine），７３巻，１(１９５
０)〕等が用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ま
しい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行
い、必要に応じて通気や撹拌を加えてもよい。発現誘導
剤を接触させることによってＧｌｉ１遺伝子が発現する
動物細胞を用いる場合には、該動物細胞を発現誘導剤の
存在下または非存在下で培養することができる。
【００４７】ｍＲＮＡの発現量の比較をハイブリダイゼ
ーション法によって行うには、公知の方法あるいはそれ
に準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング
（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Col
d Spring Harbor Lab. Press,1989）に記載の方法等に
従って行うことができる。具体的には、Ｇｌｉ１タンパ
ク質をコードするｍＲＮＡの量の測定は、公知の方法に
従って細胞から抽出したＲＮＡとＧｌｉ１遺伝子をコー
ドするＤＮＡ（Ｇｌｉ１遺伝子ＤＮＡ）もしくはその相
補ＤＮＡまたはその部分ＤＮＡとを接触させ、Ｇｌｉ１
遺伝子ＤＮＡまたはその相補ＤＮＡに結合したｍＲＮＡ
の量を測定することによって行われる。Ｇｌｉ１遺伝子
ＤＮＡの相補ＤＮＡまたはその部分ＤＮＡを、例えば放
射性同位元素、色素などで標識することによって、Ｇｌ
ｉ１遺伝子ＤＮＡの相補ＤＮＡに結合したＧｌｉ１ｍＲ
ＮＡの量が容易に測定できる。放射性同位元素として
は、例えば32Ｐ、3Ｈなどが用いられ、色素としては、
例えばfluorescein、ＦＡＭ（PE Biosystems社製）、Ｊ
ＯＥ（PE Biosystems社製）、ＴＡＭＲＡ（PE Biosyste
ms社製）、ＲＯＸ（PE Biosystems社製）、Ｃｙ５（Ame
rsham社製）、Ｃｙ３（Amersham社製）などの蛍光色素
が用いられる。また、Ｇｌｉ１ｍＲＮＡの量は、細胞か
ら抽出したＲＮＡを逆転写酵素によってｃＤＮＡに変換
した後、Ｇｌｉ１遺伝子をコードするＤＮＡもしくはそ
の相補ＤＮＡまたはその部分ＤＮＡをプライマーとして
用いるＰＣＲによって、増幅されるｃＤＮＡの量を測定
することによって行うことができる。Ｇｌｉ１ｍＲＮＡ
の量の測定に用いられるＧｌｉ１遺伝子ＤＮＡの相補Ｄ
ＮＡとしては、Ｇｌｉ１遺伝子ＤＮＡ（上鎖）に相補的
な配列を有するＤＮＡ（下鎖）があげられる。Ｇｌｉ１
遺伝子ＤＮＡの部分ＤＮＡとしては、例えばＧｌｉ１遺
伝子ＤＮＡの塩基配列中、連続した１０〜２２００個程
度、好ましくは１０〜３００個程度、さらに好ましくは
１０〜３０個程度の塩基から構成される塩基配列があげ
られる。Ｇｌｉ１遺伝子ＤＮＡの相補ＤＮＡの部分ＤＮ
Ａとしては、例えば前記したＧｌｉ１ＤＮＡの部分ＤＮ
Ａに相補的な配列を有するＤＮＡがあげられる。即ち、
例えばＧｌｉ１遺伝子ＤＮＡの塩基配列中、連続した１
０〜２２００個程度、好ましくは１０〜３００個程度、
さらに好ましくは１０〜３０個程度の塩基から構成され
る塩基配列に相補的な配列を有するＤＮＡがあげられ
る。ＰＣＲに用いられるプライマーとしては、例えば配
列番号：１で表される塩基配列を含有するＤＮＡおよび
配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡなど
があげられる。Ｇｌｉ１ ｍＲＮＡの量を増加させる試
験化合物を、Ｇｌｉ１遺伝子の発現を促進する活性を有
する化合物あるいは骨・軟骨分化調節（特に促進）作用
を有する化合物として選択することができ、またＧｌｉ
１ ｍＲＮＡの量を減少させる試験化合物を、Ｇｌｉ１
遺伝子の発現を阻害する活性を有する化合物あるいは骨
・軟骨分化調節（特に阻害）作用を有する化合物として
選択することができる。
【００４８】上記〜に示したスクリーニング方法に
おいて試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパ
ク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、
細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げら
れ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公
知の化合物であってもよい。
【００４９】また、本発明は、Ｇｌｉ１の公知プロモ
ーターやエンハンサー領域をゲノムＤＮＡよりクローニ
ングし、適当なレポーター遺伝子の上流に連結させたＤ
ＮＡで形質転換した細胞（例えば、軟骨細胞、繊維芽細
胞（例、マウス繊維芽細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２）、筋
芽細胞（例、マウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２）など）を試
験化合物の存在下で培養し、Ｇｌｉ１の発現に代えてレ
ポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする、Ｇ
ｌｉ１遺伝子のプロモーターもしくはエンハンサーの活
性を制御する作用を有する化合物またはその塩のスクリ
ーニング方法、ひいてはＧｌｉ１遺伝子の発現を制御す
る活性を有する化合物またはその塩のスクリーニング方
法を提供する。レポーター遺伝子としては、例えば、ｌ
ａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）などの染色マー
カー遺伝子等などが用いられる。レポーター遺伝子産物
（例、ｍＲＮＡ、タンパク質）の量を公知の方法を用い
て測定することによって、レポーター遺伝子産物の量を
増加させる試験化合物をＧｌｉ１遺伝子のプロモーター
もしくはエンハンサーの活性を制御（特に促進）する作
用を有する化合物、すなわちＧｌｉ１遺伝子の発現を促
進する活性を有する化合物として選択でき、逆に、レポ
ーター遺伝子産物の量を減少させる試験化合物をＧｌｉ
１遺伝子のプロモーターもしくはエンハンサーの活性を
制御（特に阻害）する作用を有する化合物、すなわちＧ
ｌｉ１遺伝子の発現を阻害する活性を有する化合物とし
て選択することができる。試験化合物としては、前記と
同様のものが使用される。細胞の培養は、公知の動物細
胞培養と同様に行うことができる。
【００５０】また、本発明は、Ｇｌｉ１タンパク質ま
たはその部分ペプチドを発現する能力を有する細胞を試
験化合物の存在下および非存在下に培養し、軟骨分化の
マーカー遺伝子の発現量を測定することを特徴とする骨
・軟骨分化調節（促進または阻害）作用を有する化合物
またはその塩のスクリーニング方法を提供する。軟骨分
化のマーカー遺伝子としてはＩＩ型Ｂコラーゲン遺伝子
が好ましい。軟骨分化のマーカー遺伝子の発現量の測定
は例えば配列番号：５、６、７または８で表される塩基
配列を有するプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法を実施
することにより測定することができる。軟骨分化のマー
カー遺伝子の発現量を増加させる試験化合物を、骨・軟
骨分化調節（特に促進）作用を有する化合物として選択
することができ、また軟骨分化のマーカー遺伝子の発現
量を減少させる試験化合物を、骨・軟骨分化調節（特に
阻害）作用を有する化合物として選択することができ
る。試験化合物としては、前記と同様のものが使用され
る。細胞の培養は、公知の動物細胞培養と同様に行うこ
とができる。
【００５１】また、本発明は、Ｇｌｉ１タンパク質ま
たはその部分ペプチドを発現する能力を有する細胞を試
験化合物の存在下および非存在下に培養し、細胞の軟骨
分化状態、例えば軟骨分化マーカーの発現を測定するこ
とを特徴とする骨・軟骨分化調節（促進または阻害）作
用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を
提供する。試験化合物としては、前記と同様のものが使
用される。細胞の培養は、公知の動物細胞培養と同様に
行うことができる。
【００５２】さらに、Ｇｌｉ１タンパク質はＧｌｉ１遺
伝子自身の転写あるいは、脳もしくは肺の分化に関与す
るＨＮＦ−３β遺伝子の転写を誘導していると報告され
ている。したがって、例えば上記したまたはのスク
リーニング方法を実施することにより直接的にＧｌｉ１
タンパク質の転写活性を測定できるか、またはＨＮＦ−
３βを発現し得る細胞株を用いれば例えば上記したま
たはに記載の方法に準じてＨＮＦ−３βのｍＲＮＡの
発現量を試験化合物の存在下および非存在下で測定し、
比較することによりＧｌｉ１タンパク質の転写活性を測
定することも可能である。
【００５３】本発明のスクリーニング用キットには上記
スクリーニング方法を実施するため、上記のＧｌｉタン
パク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩、またはＧ
ｌｉ１遺伝子またはその産生物を産生する能力を有する
細胞、またはＧｌｉ１遺伝子発現レポーターベクターを
導入した細胞（Ｇｌｉ１遺伝子のプロモーターもしくは
エンハンサーをレポーター遺伝子に連結させたＤＮＡで
形質転換した細胞）、およびＧｌｉ１遺伝子ＤＮＡもし
くはその相補ＤＮＡまたはその部分ＤＮＡを含有するも
のである。
【００５４】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク
質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細
胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから
選ばれた化合物であり、Ｇｌｉ１遺伝子の発現を制御
（促進または阻害）する活性を有する化合物あるいはＧ
ｌｉ１遺伝子のプロモーターもしくはエンハンサーの活
性を制御（促進または阻害）する作用を有する化合物、
ひいては骨・軟骨分化調節作用を有する化合物である。
該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、
無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）等との
塩が挙げられる。Ｇｌｉ１遺伝子の発現を促進する活性
を有する化合物（またはＧｌｉ１遺伝子のプロモーター
もしくはエンハンサーの活性を促進する作用を有する化
合物、骨・軟骨分化誘導作用を有する化合物）またはそ
の塩は、骨・軟骨疾患、例えば整形外科領域の疾患
（例、骨折、変形性関節症、骨関節炎、半月板損傷等の
軟骨損傷、外傷、腫瘍摘出などによる骨、軟骨欠損部の
再生、脊椎固定術、脊柱管拡大術などの骨再建、骨形成
不全症、軟骨無形成症などの先天性骨・軟骨疾患）、歯
科領域の疾患（例、口蓋裂、下顎骨再建術、歯槽堤形成
術などの骨再建）、骨粗鬆症などの予防・治療剤などの
医薬として用いることができる。また、美容外科領域に
おける骨移植の治療剤などの医薬としても用いることが
できるし、再生医療における自家移植の際の分化誘導剤
としても利用できる。一方、Ｇｌｉ１遺伝子の発現を阻
害する活性を有する化合物（またはＧｌｉ１遺伝子のプ
ロモーターもしくはエンハンサーの活性を阻害する作用
を有する化合物、骨・軟骨分化阻害作用を有する化合
物）またはその塩は、例えば骨・軟骨形成過剰症などの
治療・予防剤などの医薬として使用できる。
【００５５】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物を上述の治療
・予防剤として使用する場合、常套手段に従って実施す
ることができ、例えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル
剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などと
して、経口的または非経口的に投与することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるの
で、例えば、温血動物（例えば、ヒト、マウス、ラッ
ト、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、
イヌ、サル、チンパンジーなど；好ましくは哺乳動物）
に対して投与することができる。該化合物またはその塩
の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルー
トなどにより差異はあるが、例えば、軟骨損傷の治療目
的でＧｌｉ１遺伝子の発現を促進する活性を有する化合
物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇと
して）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１
００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好まし
くは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する
場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患な
どによっても異なるが、例えば、軟骨損傷の治療目的で
Ｇｌｉ１遺伝子の発現を促進する活性を有する化合物を
注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場
合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、
好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約
０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好
都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算
した量を投与することができる。一方、骨・軟骨形成過
剰症の治療目的でＧｌｉ１遺伝子の発現を阻害する活性
を有する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体
重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を
約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍ
ｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経
口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対
象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、骨・軟
骨形成過剰症の治療目的でＧｌｉ１遺伝子の発現を阻害
する活性を有する化合物を注射剤の形で通常成人（６０
ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約
０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍ
ｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈
注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合
も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができ
る。
【００５６】（３）アンチセンスヌクレオチドを含有す
る医薬（骨・軟骨分化阻害剤）または診断剤（骨・軟骨
疾患の診断剤） 本発明で用いられるＤＮＡに相補的に結合し、前記ＤＮ
Ａの発現を抑制することができる本発明で用いられるア
ンチセンスヌクレオチド（例、アンチセンスＤＮＡ）は
低毒性であり、生体内における本発明で用いられるタン
パク質または本発明で用いられるＤＮＡの機能抑制する
ことができるので、例えば、骨・軟骨形成過剰症などの
治療・予防剤などとして使用することができる。上記ア
ンチセンスヌクレオチドを上記の予防・治療剤として使
用する場合、公知の方法に従って製剤化し、投与するこ
とができる。例えば、前記アンチセンスヌクレオチドを
用いる場合、前記アンチセンスヌクレオチドを単独ある
いはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクタ
ー、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター
などの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従っ
て、温血動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサ
ギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サ
ル、チンパンジーなど、好ましくは哺乳動物）に対して
経口的または非経口的に投与することができる。前記ア
ンチセンスヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取
促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体と
ともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルの
ようなカテーテルによって投与できる。前記アンチセン
スヌクレオチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与
ルートなどにより差異はあるが、例えば、骨・軟骨形成
過剰症の治療の目的で本発明で用いられるアンチセンス
ヌクレオチドを経口投与する場合、成人（体重６０ｋ
ｇ）に対し、一日につき前記アンチセンスヌクレオチド
を約０．１〜１００ｍｇ投与する。さらに、前記アンチ
センスヌクレオチドは、組織や細胞における本発明で用
いられるＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診
断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することも
できる。上記アンチセンスヌクレオチドと同様に、二本
鎖ＲＮＡ、リボザイム、デコイオリゴヌクレオチドなど
も、前記ＤＮＡの発現を抑制することができ、生体内に
おける本発明で用いられるタンパク質または本発明で用
いられるＤＮＡの機能抑制することができるので、例え
ば、骨・軟骨形成過剰症の予防・治療剤などとして使用
することができる。二本鎖ＲＮＡは、公知の方法（例、
Nature, 411巻, 494頁, 2001年）に準じて、本発明で用
いられるＤＮＡの配列を基に設計して得られる。リボザ
イムは、公知の方法（例、TRENDS in Molecular Medici
ne, 7巻, 221頁, 2001年）に準じて、本発明で用いられ
るＤＮＡの配列を基に設計して得られる。デコイオリゴ
ヌクレオチドは、公知の方法（例、The Journal of Cli
nical Investigation, 106巻, 1071頁, 2000年）に準じ
て、本発明で用いられるＤＮＡの配列を基に設計して得
られる。Ｇｌｉ１は転写因子であるのでＧｌｉ１の結合
配列を含むデコイＧｌｉ１バインディングオリゴヌクレ
オチド〔例えば5'-GACCACCCA-3'(Kinzler KW, Vogelste
in B., Mol Cell Biol 1990 Feb;10(2): 634-42)を含有
するオリゴヌクレオリドなど〕などを有効に使用でき
る。上記の予防・治療剤として使用する場合、公知の方
法に従って製剤化し、投与することができる。
【００５７】（４）遺伝子診断剤 本発明のＤＮＡまたはアンチセンスＤＮＡは、プローブ
として使用することにより、哺乳動物（例えば、ヒト、
ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、
イヌ、サルなど）における本発明のタンパク質またはそ
の部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異
常（遺伝子異常）を検出することができるので、例え
ば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは
発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発
現過多などの遺伝子診断剤として有用である。本発明の
ＤＮＡまたはアンチセンスＤＮＡを用いる上記の遺伝子
診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーショ
ンやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomics），
第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージ
ングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceedings of t
he National Academy of Sciences of the USA），第８
６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などによ
り実施することができる。例えば、ノーザンハイブリダ
イゼーションにより本発明のタンパク質またはその部分
ペプチドをコードするｍＲＮＡの発現低下が検出された
場合は、例えば、骨・軟骨疾患、例えば整形外科領域の
疾患（例、骨折、変形性関節症、骨関節炎、半月板損傷
等の軟骨損傷、外傷、骨形成不全症、軟骨無形成症など
の先天性骨・軟骨疾患）、歯科領域の疾患（例、口蓋
裂）、骨粗鬆症などの疾患である可能性が高いまたは将
来罹患する可能性が高いと診断することができる。一
方、ノーザンハイブリダイゼーションにより本発明のタ
ンパク質またはその部分ペプチドをコードするｍＲＮＡ
の発現過多が検出された場合は、例えば、骨・軟骨形成
過剰症などの疾患である可能性が高いまたは将来罹患す
る可能性が高いと診断することができる。
【００５８】（５）Ｇｌｉ１タンパク質、その部分ペプ
チドまたはそれらの塩の抗体を用いた診断剤 Ｇｌｉ１タンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの
塩の抗体（以下、本発明の抗体と略称する場合がある）
は、本発明のタンパク質等を特異的に認識することがで
きるので、被検液中の本発明のタンパク質等の定量、特
にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用するこ
とができる。すなわち、本発明は、例えば、（ｉ）本発
明の抗体と、被検液および標識化タンパク質等とを競合
的に反応させ、該抗体に結合した標識化タンパク質等の
割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタ
ンパク質等の定量法、（ii）被検液と担体上に不溶化し
た本発明の抗体および標識化された本発明の抗体とを同
時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標
識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発
明のタンパク質等の定量法を提供する。上記（ii）にお
いては、一方の抗体が本発明のタンパク質等のＮ端部を
認識する抗体で、他方の抗体が本発明のタンパク質等の
Ｃ端部に反応する抗体であることが好ましい。
【００５９】本発明のタンパク質等に対するモノクロー
ナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称する
場合がある）を用いて本発明のタンパク質等の測定を行
なえるほか、組織染色等による検出を行うこともでき
る。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよ
く、また、抗体分子のＦ(ａｂ')2、Ｆａｂ'、あるいは
Ｆａｂ画分を用いてもよい。本発明のタンパク質等に対
する抗体を用いる測定法は、特に制限されるべきもので
はなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質量）
に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を
化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の
抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出す
る測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例
えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法お
よびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異
性の点で、後に記載するサンドイッチ法を用いるのが特
に好ましい。標識物質を用いる測定法に用いられる標識
剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物
質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素として
は、例えば、〔125Ｉ〕、〔131Ｉ〕、〔3Ｈ〕、
〔14Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で
比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクト
シダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファタ
ーゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用
いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミ
ン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられ
る。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノー
ル誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられ
る。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオ
チン−アビジン系を用いることもできる。
【００６０】抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物
理吸着を用いてもよく、また通常、タンパク質あるいは
酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を
用いる方法でもよい。担体としては、例えば、アガロー
ス、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポ
リスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹
脂、あるいはガラス等が用いられる。サンドイッチ法に
おいては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検
液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した本発明の
モノクローナル抗体を反応させ（２次反応）た後、不溶
化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中
の本発明のタンパク質量を定量することができる。１次
反応と２次反応は逆の順序に行なっても、また、同時に
行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識
化剤および不溶化の方法は上記のそれらに準じることが
できる。また、サンドイッチ法による免疫測定法におい
て、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は
必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させ
る等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよ
い。本発明のサンドイッチ法によるタンパク質等の測定
法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明
のモノクローナル抗体はタンパク質等の結合する部位が
相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反
応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反
応で用いられる抗体が、タンパク質のＣ端部を認識する
場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部
以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
【００６１】本発明のモノクローナル抗体をサンドイッ
チ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメト
リック法あるいはネフロメトリーなどに用いることがで
きる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体
に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原と
(Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ
／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液
中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶
性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、
上記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、およ
び、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、
第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗
体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリック
法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識
化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離する
か、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体と
を反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体
を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次
に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を
定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは
溶液中で抗原抗体反応の結果、生じた不溶性の沈降物の
量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の
沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用す
るレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００６２】これら個々の免疫学的測定法を本発明の測
定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発
明のタンパク質等の測定系を構築すればよい。これらの
一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを
参照することができる〔例えば、入江 寛編「ラジオイ
ムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛
編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発
行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭
和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第
２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編
「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年
発行）、「メソッズ・イン・エンザイモノジー（Method
s in ENZYMOLOGY）」 Vol. 70(Immunochemical Techniqu
es(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniqu
es(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniqu
es(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniqu
es(Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(I
mmunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibod
ies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol.
121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Tec
hnology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミ
ックプレス社発行)など参照」。以上のように、本発明
の抗体を用いることによって、本発明のタンパク質等を
感度良く定量することができる。さらに、本発明の抗体
を用いて、生体内での本発明のタンパク質等を定量する
ことによって、上記したような各種骨・軟骨疾患の診断
をすることができる。例えば、上記の定量法を用いるこ
とにより本発明のタンパク質またはその部分ペプチドの
濃度減少が検出された場合は、例えば、骨・軟骨疾患、
例えば整形外科領域の疾患（例、骨折、変形性関節症、
骨関節炎、半月板損傷等の軟骨損傷、外傷、骨形成不全
症、軟骨無形成症などの先天性骨・軟骨疾患）、歯科領
域の疾患（例、口蓋裂）、骨粗鬆症などの疾患である可
能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断する
ことができる。一方、上記の定量法を用いることにより
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドの濃度上昇
が検出された場合は、例えば、骨・軟骨形成過剰症など
の疾患である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が
高いと診断することができる。また、本発明の抗体は、
体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタンパク
質等を特異的に検出するために使用することができる。
また、本発明のタンパク質等を精製するために使用する
抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のタンパ
ク質等の検出、被検細胞内における本発明のタンパク質
の挙動の分析などのために使用することができる。
【００６３】（６）ＤＮＡ転移動物 本発明は、外来性の本発明のタンパク質等をコードする
ＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）また
はその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記す
る場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。す
なわち、本発明は、（１）本発明の外来性ＤＮＡまたは
その変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、（２）非ヒト
哺乳動物がゲッ歯動物である第（１)記載の動物、（３）
ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第（２）記載の
動物、および（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変
異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換え
ベクターを提供するものである。本発明の外来性ＤＮＡ
またはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、
本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受
精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対
して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発
生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞
の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウ
ム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マ
イクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転
移することによって作出することができる。また、該Ｄ
ＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞な
どに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培
養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これ
ら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法により融合
させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出するこ
ともできる。
【００６４】非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、
ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモッ
ト、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。な
かでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生およ
び生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ
歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７
ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６
Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡ
ＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例え
ば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。哺乳動
物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動
物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどが
挙げられる。本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動
物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん
哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩
基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、
具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換など
が生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含
まれる。該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のタンパ
ク質を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発
明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させ
るＤＮＡなどが用いられる。本発明の外来性ＤＮＡは、
対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物
由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物
に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現
させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンスト
ラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本
発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高
い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサ
ギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マ
ウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモータ
ーの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコン
ストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精
卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクション
することによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転
移哺乳動物を作出することができる。
【００６５】本発明のタンパク質の発現ベクターとして
は、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミ
ド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリ
オファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィ
ルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなど
の動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由
来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由
来のプラスミドなどが好ましく用いられる。上記のＤＮ
Ａ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、
ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイル
ス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイ
ルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモ
ーター、各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、
モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の
プロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、
ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、
エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア繊維性酸
性タンパク質ク、グルタチオンＳ−トランスフェラー
ゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およ
びＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリック
ＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジス
トロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、
心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキ
ナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリ
ウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓ
ｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩ
およびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビタ
ー、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レ
ニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダ
ーゼ（ＴＰＯ）、ポリペプチド鎖延長因子1α（ＥＦ−
１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシ
ン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロ
ブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（Ｖ
ＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビ
ン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケ
ファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用
いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサ
イトメガロウイルスプロモーター、ヒトポリペプチド鎖
延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよ
びニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
【００６６】上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物にお
いて目的とするｍＲＮＡの転写を終結する配列（一般に
ターミネターと呼ばれる）を有していることが好まし
く、例えば、ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各
ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミア
ンウィルスのＳＶ４０ターミネーターなどが用いられ
る。その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現さ
せる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハ
ンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロ
モーター領域の５´上流、プロモーター領域と翻訳領域
間あるいは翻訳領域の３´下流 に連結することも目的
により可能である。正常な本発明のタンパク質の翻訳領
域は、各種哺乳動物（例えば、ヒト、ウサギ、イヌ、ネ
コ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由
来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、繊維芽細胞由来ＤＮＡお
よび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤ
ＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲
状腺細胞、繊維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により
調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来
る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組
織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変
異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができ
る。該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコ
ンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および
所望により転写終結部位の上流に連結させる通常の遺伝
子工学的手法により作製することができる。受精卵細胞
段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳
動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように
確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞におい
て、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物
の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに
本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発
明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はそ
の胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮ
Ａを有する。
【００６７】本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非
ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持
することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼
育環境で継代飼育することが出来る。受精卵細胞段階に
おける本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の
胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確
保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において
本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動
物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発
明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発
明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はそ
の胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡ
を過剰に有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つ
ホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配す
ることによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するよ
うに繁殖継代することができる。本発明の正常ＤＮＡを
有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現
させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進する
ことにより最終的に本発明のタンパク質の機能亢進症
(例、転写、骨・軟骨分化誘導などの亢進症)を発症する
ことがあり、その病態モデル動物として利用することが
できる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用い
て、本発明のタンパク質の機能亢進症や、本発明のタン
パク質が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの
疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。ま
た、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物
は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有するこ
とから、本発明のタンパク質に関連する疾患に対する治
療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
【００６８】一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する
非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保
持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼
育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とす
る外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原科とし
て用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンス
トラク卜は、通常の遺伝子工学的手法によって作製する
ことができる。受精卵細胞段階における本発明の異常Ｄ
ＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の
全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出
動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在する
ことは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細
胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味す
る。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の
子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異
常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持
つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配
することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように
繁殖継代することができる。本発明の異常ＤＮＡを有す
る非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させ
られており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害すること
により最終的に本発明のタンパク質の機能不活性型不応
症となることがあり、その病態モデル動物として利用す
ることができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物
を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の
病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行な
うことが可能である。また、具体的な利用可能性として
は、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のタンパ
ク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパ
ク質による正常タンパク質の機能阻害（dominant negat
ive作用）を解明するモデルとなる。また、本発明の外
来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明
のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタ
ンパク質の機能不活性型不応症に対する治療薬スクリー
ニング試験にも利用可能である。
【００６９】また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動
物のその他の利用可能性として、例えば、組織培養の
ための細胞源としての使用、本発明のＤＮＡ転移動物
の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、ま
たはＤＮＡにより発現されたタンパク質組織を分析する
ことによる、本発明のタンパク質により特異的に発現あ
るいは活性化するタンパク質との関連性についての解
析、ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術に
より培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織
からの細胞の機能の研究、上記記載の細胞を用いる
ことによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニ
ング、および本発明の変異タンパク質を単離精製およ
びその抗体作製などが考えられる。さらに、本発明のＤ
ＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活
性型不応症などを含む、本発明のタンパク質に関連する
疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のタ
ンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳
細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さ
らには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢
献することができる。また、本発明のＤＮＡ転移動物か
ら各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパ
ク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、
その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可
能である。さらに、本発明のタンパク質産生細胞の特定
化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、また
はそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異
常を調べることなどができ、本発明のタンパク質および
その作用解明のための有効な研究材料となる。さらに、
本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質
の機能不活性型不応症を含む、本発明のタンパク質に関
連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査
法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療
薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。ま
た、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮ
Ａ発現ベクターを用いて、本発明のタンパク質が関連す
る疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能であ
る。
【００７０】（７）ノックアウト動物 本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳
動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳
動物を提供する。すなわち、本発明は、（１）本発明の
ＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来の
β−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不
活性化された第（１）項記載の胚幹細胞、（３）ネオマ
イシン耐性である第（１）項記載の胚幹細胞、（４）非
ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）項記載の胚幹
細胞、（５）ゲッ歯動物がマウスである第（４）項記載
の胚幹細胞、（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該
ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、（７）該ＤＮＡがレポ
ーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポー
ター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制
御下で発現しうる第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（６）項記
載の非ヒト哺乳動物、（９）ゲッ歯動物がマウスである
第（８）項記載の非ヒト哺乳動物、および（１０）第
（７）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポータ
ー遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤ
ＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化
合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
【００７１】本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺
乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明
のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの
発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしてい
る本発明のタンパク質の活性を実質的に喪失させること
により、ＤＮＡが実質的に本発明のタンパク質の発現能
を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称す
ることがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ
細胞と略記する）をいう。非ヒト哺乳動物としては、前
記と同様のものが用いられる。本発明のＤＮＡに人為的
に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手
法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他のＤＮ
Ａを挿入または置換させることによって行なうことがで
きる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り
枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能
を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作
製すればよい。本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト
哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ
細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）
の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物
が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分に
ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子
を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−
ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とする
レポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機
能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分
に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ポリ
Ａ付加シグナルなど）を挿入し、完全なｍＲＮＡを合成
できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊する
ように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、タ
ーゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組
換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細
胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ
配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解
析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と
ターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮ
Ａ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣ
Ｒ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選
別することにより得ることができる。
【００７２】また、相同組換え法等により本発明のＤＮ
Ａを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述
のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知
EvansとKaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでも
よい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的
には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的
背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免
疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなど
の目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／
６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善し
たＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ
１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤ
Ｆ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であると
いう利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つ
ので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウ
スを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロ
スすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに
代えることが可能である点で有利に用い得る。また、Ｅ
Ｓ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の胚
盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤
胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚
を取得することができる。また、雌雄いずれのＥＳ細胞
を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キ
メラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手
間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行な
うことが望ましい。ＥＳ細胞の雌雄の判定方法として
は、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の
遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例として挙げる
ことができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析
をするのに約１０6個の細胞数を要していたのに対し
て、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むの
で、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを
雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の
選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削
減できる。
【００７３】また、第二次セレクションとしては、例え
ば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により
行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常
数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の
関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウト
した後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ
＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ま
しい。このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その
増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすい
ので、注意深く継代培養することが必要である。例え
ば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上
でＬＩＦ（１−１００００U/ml）存在下に炭酸ガス培養
器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５
％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養
するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプ
シン／ＥＤＴＡ溶液（通常０．００１−０．５％トリプ
シン／０．１−５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０．１
％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化
し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法な
どがとられる。このような継代は、通常１−３日毎に行
なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細
胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが
望まれる。ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至
るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで
浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの
種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M.
J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第
292巻、154頁、1981年；G. R. Martin プロシーディン
グス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）第78
巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschmanら、ジャーナル
・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタ
ル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明
のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不
全細胞は、インビトロにおける本発明のタンパク質の細
胞生物学的検討において有用である。本発明のＤＮＡ発
現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方
法を用いて測定して間接的にその発現量を比較すること
により、正常動物と区別することが可能である。該非ヒ
ト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
【００７４】本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物
は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティン
グベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入
し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤ
ＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えに
より、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の
本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることに
より、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができ
る。本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発
明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブと
したサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッ
ティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティング
ベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の
近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法に
よる解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹
細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明
のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、そ
の細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動
物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠
させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された
動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変
異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成さ
れるキメラ動物である。該キメラ動物の生殖細胞の一部
が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキ
メラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体
群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤ
ＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コート
カラーの判定等により選別することにより得られる。こ
のようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク
質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質の
ヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本
発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができ
る。卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマ
イクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入すること
によりターゲッティングベクターを染色体内に導入した
トランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、
これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、
遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のある
ものを選択することにより得られる。
【００７５】このようにして本発明のＤＮＡがノックア
ウトされている個体は、交配により得られた動物個体も
該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常
の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。さらに、
生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよ
い。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を
交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両
方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホ
モザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，
ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することに
より効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物
の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有する
ホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代
する。本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物
胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を
作出する上で、非常に有用である。また、本発明のＤＮ
Ａ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のタンパク質によ
り誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明
のタンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病の
モデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治
療法の検討に有用である。
【００７６】（７ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷など
に起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物
のスクリーニング方法 本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤ
ＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病、例えば、骨・軟
骨疾患、例えば整形外科領域の疾患（例、骨折、変形性
関節症、骨関節炎、半月板損傷等の軟骨損傷、外傷、骨
形成不全症、軟骨無形成症などの先天性骨・軟骨疾
患）、歯科領域の疾患（例、口蓋裂）、骨粗鬆症などの
疾患に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリー
ニングに用いることができる。すなわち、本発明は、本
発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投
与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とす
る、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に
対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のス
クリーニング方法を提供する。該スクリーニング方法に
おいて用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動
物としては、前記と同様のものが挙げられる。試験化合
物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド
性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物
抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら
化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物
であってもよい。具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全
非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照
動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状など
の変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験
することができる。試験動物を試験化合物で処理する方
法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いら
れ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて
適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量
は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選
択することができる。例えば、ＧＬＩ１遺伝子発現不全
に起因して起こるような軟骨損傷治癒不全に対して治療
・予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に骨・軟骨損傷
処置（例えば、骨折など）を行ない、骨・軟骨損傷処置
前または処置後に試験化合物を投与し、該動物の軟骨分
化マーカーの発現量、体重変化などを経時的に測定す
る。該スクリーニング方法において、試験動物に試験化
合物を投与した場合、該試験動物の軟骨分化マーカーが
約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましく
は約５０％以上上昇した場合、該試験化合物を軟骨損傷
に対して治療・予防効果を有する化合物として選択する
ことができる。
【００７７】本発明のスクリーニング方法を用いて得ら
れる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物
であり、本発明のタンパク質等の欠損や損傷などによっ
て引き起こされる疾患、例えば、骨・軟骨疾患、例えば
整形外科領域の疾患（例、骨折、変形性関節症、骨関節
炎、半月板損傷等の軟骨損傷、外傷、骨形成不全症、軟
骨無形成症などの先天性骨・軟骨疾患）、歯科領域の疾
患（例、口蓋裂）、骨粗鬆症などの疾患に対して治療・
予防効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な
治療・予防剤などの医薬として使用することができる。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導
される化合物も同様に用いることができる。該スクリー
ニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよ
く、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸
（例、無機酸、有機酸）や塩基（例アルカリ金属）など
との塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付
加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸
（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、
あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、
フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、
リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼ
ンスルホン酸）との塩などが用いられる。該スクリーニ
ング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬
は、前記した本発明のタンパク質の活性を調節する化合
物を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるの
で、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウ
ス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、
ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができ
る。該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与
対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、軟
骨損傷の治療目的で該化合物を経口投与する場合、一般
的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につ
き該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．
０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与
する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与
量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例え
ば、軟骨損傷の治療目的で該化合物を注射剤の形で通常
成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該
化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．
１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ
程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の
動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与する
ことができる。
【００７８】（７ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモー
ターの活性を促進する化合物をスクリーニング方法 本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、
試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出す
ることを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモータ
ーの活性を促進する化合物またはその塩のスクリーニン
グ方法を提供する。上記スクリーニング方法において、
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記
した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、
本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することによ
り不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡ
に対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用い
られる。試験化合物としては、前記と同様のものが挙げ
られる。レポーター遺伝子としては、前記と同様のもの
が用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃ
Ｚ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはル
シフェラーゼ遺伝子などが好適である。本発明のＤＮＡ
をレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不
全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤ
ＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レ
ポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースする
ことにより、プロモーターの活性を検出することができ
る。
【００７９】例えば、本発明のタンパク質をコードする
ＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明
のタンパク質の発現する組織で、本発明のタンパク質の
代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例
えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラク
トシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することによ
り、簡便に本発明のタンパク質の動物生体内における発
現状態を観察することができる。具体的には、本発明の
タンパク質欠損マウスまたはその組織切片をグルタルア
ルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢ
Ｓ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または
３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組
織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄すること
によって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色
を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコー
ドするｍＲＮＡを検出してもよい。
【００８０】上記スクリーニング方法を用いて得られる
化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれ
た化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター
活性を促進または阻害する化合物である。該スクリーニ
ング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、
該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、
無機酸）や塩基（例、有機酸）などとの塩が用いられ、
とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。こ
の様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リ
ン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例
えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン
酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安
息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との
塩などが用いられる。本発明のＤＮＡに対するプロモー
ター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のタ
ンパク質の発現を促進し、該タンパク質の機能を促進す
ることができるので、例えば、骨・軟骨疾患、例えば整
形外科領域の疾患（例、骨折、変形性関節症、骨関節
炎、半月板損傷等の軟骨損傷、外傷、骨形成不全症、軟
骨無形成症などの先天性骨・軟骨疾患）、歯科領域の疾
患（例、口蓋裂）、骨粗鬆症などの疾患などに対する安
全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として有用であ
る。
【００８１】該スクリーニング方法で得られた化合物ま
たはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパ
ク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造する
ことができる。このようにして得られる製剤は、安全で
低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、
ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、
ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与する
ことができる。該化合物またはその塩の投与量は、対象
疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、
例えば、軟骨損傷の治療目的で本発明のＤＮＡに対する
プロモーター活性を促進する化合物を経口投与する場
合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、
一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましく
は約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０
ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の
１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なる
が、例えば、軟骨損傷の治療目的で本発明のＤＮＡに対
するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で
通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につ
き該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約
０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０
ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。
他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与
することができる。このように、本発明のＤＮＡ発現不
全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモー
ターの活性を促進する化合物またはその塩をスクリーニ
ングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不
全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の
開発に大きく貢献することができる。また、本発明のタ
ンパク質のプロモーター領域を含有するＤＮＡを使っ
て、その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連
結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランス
ジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異
的にそのタンパクを合成させ、その生体での作用を検討
することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に
適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するよ
うな細胞株を樹立すれば、 本発明のタンパク質そのも
のの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する
作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。ま
た該プロモーター部分を解析することにより新たなシス
エレメントやそれに結合する転写因子を見つけることも
可能である。
【００８２】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸等を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Co
mmission on Biochemical Nomenclature による略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があ
り得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとす
る。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
【００８３】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 ［配列番号：１］Ｇｌｉ１ ｍＲＮＡの量を測定する際
に使用できるＰＣＲ用プライマーを示す。（実施例４お
よび５） ［配列番号：２］Ｇｌｉ１ ｍＲＮＡの量を測定する際
に使用できるＰＣＲ用プライマーを示す。（実施例４お
よび５） ［配列番号：３］マウスＧｌｉ１ ｃＤＮＡの取得のた
めに使用したプライマーを示す。 ［配列番号：４］マウスＧｌｉ１ ｃＤＮＡの取得のた
めに使用したプライマーを示す。 ［配列番号：５］実施例１、２および４のＲＴ−ＰＣＲ
で使用したプライマーを示す。 ［配列番号：６］実施例１、２および４のＲＴ−ＰＣＲ
で使用したプライマーを示す。 ［配列番号：７］実施例３のＲＴ−ＰＣＲで使用したプ
ライマーを示す。 ［配列番号：８］実施例３のＲＴ−ＰＣＲで使用したプ
ライマーを示す。 ［配列番号：９］マウスＧｌｉ１遺伝子（ｃＤＮＡ）の
塩基配列を示す。 ［配列番号：１０］マウスＧｌｉ１タンパク質のアミノ
酸配列を示す。 ［配列番号：１１］ヒトＧｌｉ１タンパク質のアミノ酸
配列を示す。 ［配列番号：１２］ヒトＧｌｉ１遺伝子（ｃＤＮＡ）の
塩基配列を示す。 ［配列番号：１３］ヒトＧｌｉ１変異タンパク質１のア
ミノ酸配列を示す。 ［配列番号：１４］ヒトＧｌｉ１変異遺伝子１（ｃＤＮ
Ａ）の塩基配列を示す。 ［配列番号：１５］ヒトＧｌｉ１変異タンパク質２のア
ミノ酸配列を示す。 ［配列番号：１６］ヒトＧｌｉ１変異遺伝子２（ｃＤＮ
Ａ）の塩基配列を示す。 ［配列番号：１７］ヒトＧｌｉ１変異タンパク質３のア
ミノ酸配列を示す。 ［配列番号：１８］ヒトＧｌｉ１変異遺伝子３（ｃＤＮ
Ａ）の塩基配列を示す。 ［配列番号：１９］マウスＧｌｉ３タンパク質のアミノ
酸配列を示す。 ［配列番号：２０］マウスＧｌｉ３遺伝子（ｃＤＮＡ）
の塩基配列を示す。 ［配列番号：２１］ヒトＧｌｉ３タンパク質のアミノ酸
配列を示す。 ［配列番号：２２］ヒトＧｌｉ３遺伝子（ｃＤＮＡ）の
塩基配列を示す。
【００８４】
【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説
明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
なお、大腸菌を用いての遺伝子操作は、モレキュラー・
クローニング（Molecular Cloning）に記載されている
方法に従い、各種キット類の使用法は添付されているマ
ニュアルに従った。
【００８５】まず実施例に用いたＧｌｉ１およびＳｃｌ
ｅｒａｘｉｓ発現ベクターの作製方法、細胞培養条件、
遺伝子導入法を以下に示す。 〔Ｇｌｉ１発現ベクターの調製〕マウス１９日胎児ライ
ブラリーより配列番号：３および４に示すプライマーを
使用し、PfuTurbo(Stratagene)DNA polymerase を用い
てＰＣＲ法にてマウスＧｌｉ１ ｃＤＮＡを得た。得ら
れた断片はｐＣＲｂｌｕｎｔ（Invitrogen）ベクターに
クローニング後、塩基配列を決定した。その結果、得ら
れた遺伝子は公知のマウス遺伝子であるＡＦ０２６３０
５とはアミノ酸レベルで２４個、またＡＢ０２５９２２
とは同じく２個の異なる配列を有していた〔ＤＮＡ配
列:配列番号：９（マウスＧｌｉ１遺伝子の塩基配列は
具体的には配列番号：９の第２１３番目のＡから第３５
４５番目のＣまでの塩基配列）、タンパク質のアミノ酸
配列：配列番号：１０および図１〕。次にこのベクター
をＮｏｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐｃＤＮＡ３．
１（Invitrogen）にＧｌｉ１断片をサブクローニングす
ることによって動物細胞発現ベクターを調製した。 〔Ｓｃｌｅｒａｘｉｓ発現ベクターの調製〕Ｓｃｌｅｒ
ａｘｉｓは骨・軟骨分化に関与することが報告されてい
るが(Liu,Y. et al. J. Biol. Chem. (1997) 272, 2988
0-29885)、その機能の詳細は不明なところが多い転写因
子である。マウスライブラリーよりＰＣＲ法にてマウス
Ｓｃｌｅｒａｘｉｓ ｃＤＮＡを得た。得られた断片は
ｐＣＲｂｌｕｎｔ（Invitrogen）ベクターにクローニン
グ後、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩで消化し、ｐｃＤＮＡ３．
１(Invitrogen)にＳｃｌｅｒａｘｉｓ断片をサブクロー
ニングすることによって動物細胞発現ベクターを調製し
た。 〔細胞培養法〕マウス繊維芽細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２
株、およびマウス筋芽細胞種Ｃ２Ｃ１２はＡＴＣＣより
購入し、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）
にて培養した。ヒト正常軟骨細胞は東洋紡より購入しヒ
ト正常軟骨細胞培養キットに含まれるChondrocytes gro
wth mediumを用い、細胞培養ディッシュ（Ｆａｌｃｏ
ｎ）で培養した。なお、この細胞はディッシュで培養し
ているため脱分化しており、軟骨細胞マーカーであるＩ
Ｉ型Ｂコラーゲン遺伝子は発現しなくなっている。 〔遺伝子導入法〕ウェルあたり約１５万個の細胞を２４
ウェルプレートに播き、翌日上記発現ベクターとFugene
6（ベーリンガー）を混和し、各種細胞に添加すること
によってトランスフェクションした。 〔化合物添加法〕ウェルあたり約２０万個の細胞を２４
ウェルプレートに播き、２時間後、ジメチルスルフォキ
シド（ＤＭＳＯ）に溶解した9-(2-Tetrahydrofuryl)ade
nine（ＴＨＦＡ）を添加した。最終ＤＭＳＯ濃度は０．
１％（ｖ／ｖ）以下とした。 〔発現量比較〕トランスフェクション、あるいは化合物
添加後２日目にRNeasy mini kit（Qiagen）を用いてＲ
ＮＡを抽出し、message clean kit（genhunter）でＤＮ
ａｓｅ処理した後、RNA PCR kit（Takara）に従いＲＴ
−ＰＣＲを行った。反応後、アガロースゲルにて電気泳
動し、Gel image（Genomic solutions）を用いて目的の
バンドの比較を行った。
【００８６】実施例１ Ｇｌｉ１発現ベクター導入によ
るマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の軟骨分化に及ぼす影
響 Ｇｌｉ１発現ベクターまたはｐｃＤＮＡ３．１をＣ３Ｈ
１０Ｔ１／２細胞株にトランスフェクション後,２日目
に配列番号：５および６に示すプライマーを用いてＲＴ
−ＰＣＲを行ったところ軟骨分化のマーカーであるＩＩ
型Ｂコラーゲン遺伝子（Ｃｏｌ２ａ１）の発現が、ベク
ターｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen）を導入した場合を
１とするとＧｌｉ１を導入すると３．０を示した。ま
た、この時同時にSonic hedgehog、Indian hedgehogお
よびＳｃｌｅｒａｘｉｓの発現を見たが、全く発現を認
めなかった。
【００８７】実施例２ Ｇｌｉ１発現ベクター導入によ
るマウスＣ２Ｃ１２細胞の軟骨分化に及ぼす影響 Ｇｌｉ１発現ベクターまたはｐｃＤＮＡ３．１をＣ２Ｃ
１２細胞株にトランスフェクション後２日目に配列番
号：５および６に示すプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ
を行ったところ、この細胞はベクターｐｃＤＮＡ３．１
を導入した場合Ｃｏｌ２ａ１を全く発現していなかった
のに対し、Ｇｌｉ１遺伝子を導入することによってＣｏ
ｌ２ａ１の発現を認めた。
【００８８】実施例３ Ｇｌｉ１発現ベクター導入によ
る脱分化型ヒト正常軟骨細胞の再分化に及ぼす影響 Ｇｌｉ１発現ベクターまたはｐｃＤＮＡ３．１を脱分化
型ヒト正常軟骨細胞にトランスフェクション後２日目に
配列番号：７および８に示すプライマーを用いてＲＴ−
ＰＣＲを行ったところ、この細胞はベクターｐｃＤＮＡ
３．１を導入した場合ＣＯＬ２Ａ１を全く発現していな
かったのに対し、Ｇｌｉ１遺伝子を導入することによっ
てＣＯＬ２Ａ１の発現を認めた。
【００８９】実施例４ マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞
の軟骨分化に及ぼすＳｃｌｅｒａｘｉｓ遺伝子の発現に
よる軟骨分化に及ぼす効果 マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の軟骨分化に及ぼすＧｌ
ｉ１以外の転写因子の発現による軟骨分化に及ぼす効果
を見るために、Ｓｃｌｅｒａｘｉｓ遺伝子をトランスフ
ェクションした。トランスフェクション２日目に配列番
号：５および６に示すプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ
を行ったところ軟骨分化のマーカーであるＩＩ型Ｂコラ
ーゲン遺伝子（Ｃｏｌ２ａ１）の発現が、ベクターｐｃ
ＤＮＡ３．１を導入した場合の約２倍向上していた。こ
の時同様にＳｃｌｅｒａｘｉｓ遺伝子発現によるＧｌｉ
１遺伝子の発現を配列番号：１および２に示すプライマ
ーを用いて見たところｐｃＤＮＡ３．１を導入した場合
の約２.５倍向上していることがわかった。このことは
Ｓｃｌｅｒａｘｉｓの軟骨分化に対する効果はＧｌｉ１
の発現上昇に起因することを示唆しているが、Sonic he
dgehogおよびIndian hedgehogはこの条件ではいずれも
発現しておらず、Ｓｃｌｅｒａｘｉｓはヘッジホッグを
介さずにＧｌｉ１を誘導しうることがわかった。即ちヘ
ッジホッグタンパク質を用いなくともＧｌｉ１を介した
軟骨分化を誘導しうることが明らかとなった。
【００９０】実施例５ Ｇｌｉ１発現を誘導する低分子
化合物の探索 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を用いてＧｌｉ１発現を誘導す
る低分子化合物を探索した。その結果、9-(2-Tetrahydr
ofuryl)adenine（ＴＨＦＡ）を500μＭで添加すると２
日後にはＧｌｉ１遺伝子の発現はＤＭＳＯ添加時に比べ
約２．３倍向上していることが配列番号：１および２に
示すプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲにてわかった。
この時Ｃｏｌ２ａ１の発現も約２．３倍向上していた。
この場合もＳｃｌｅｒａｘｉｓやSonic hedgehog、Indi
an hedgehogの発現は認められず、ＴＨＦＡの軟骨分化
誘導効果はヘッジホッグタンパクを介さずにＧｌｉ１を
誘導することに起因していることがわかった。以上の結
果より、Ｇｌｉ１の発現の増減を指標として選択される
化合物は骨・軟骨疾患予防、治療薬として有望であるこ
とが判明した。また上記の実験はマウスの遺伝子を用い
て実施されたが、ヒトの遺伝子とマウスの遺伝子には非
常に高い相同性があることは既知であり、ヒトの遺伝子
を用いてもこれらの結果と同様の結果が得られることは
容易に予測できる。
【００９１】
【発明の効果】Ｇｌｉ１遺伝子またはその産物は骨ある
いは軟骨分化誘導活性をするため、整形外科領域の疾患
（例、骨折、変形性関節症、骨関節炎、半月板損傷等の
軟骨損傷、外傷、腫瘍摘出などによる骨、軟骨欠損部の
再生、脊椎固定術、脊柱管拡大術などの骨再建、骨形成
不全症、軟骨無形成症などの先天性骨・軟骨疾患）また
は、歯科領域の疾患（例、口蓋裂、下顎骨再建術、歯槽
堤形成術などの骨再建）、さらには骨粗鬆症などの予防
・治療剤として用いることができる。また、美容外科領
域における骨移植の治療剤としても用いることができる
し、再生医療における自家移植の際の分化誘導剤として
も利用できる。また、Ｇｌｉ１タンパク質等を用いたス
クリーニング方法、Ｇｌｉ１遺伝子を発現する能力を有
する細胞を用いたスクリーニング方法またはレポーター
遺伝子発現形質転換体を用いたスクリーニング方法は、
Ｇｌｉ１遺伝子の発現を制御（促進または阻害）する活
性を有する化合物、Ｇｌｉ１遺伝子のプロモーターもし
くはエンハンサーの活性を制御（促進または阻害）する
作用を有する化合物、骨・軟骨分化調節（促進または阻
害）作用を有する化合物、またはそれらの塩の探索に用
いることができる。このような化合物を用いてＧｌｉ１
遺伝子またはその産物の作用（例、転写活性）を増強ま
たは活性化することによって骨・軟骨分化を誘導するこ
とができる。上記スクリーニングにより得られうるＧｌ
ｉ１遺伝子の発現を促進する活性を有する化合物などは
骨、あるいは軟骨誘導活性を有するため、整形外科領域
の疾患（例、骨折、変形性関節症、骨関節炎、半月板損
傷等の軟骨損傷、外傷、腫瘍摘出などによる骨、軟骨欠
損部の再生、脊椎固定術、脊柱管拡大術などの骨再建、
骨形成不全症、軟骨無形成症などの先天性骨・軟骨疾
患）または、歯科領域の疾患（例、口蓋裂、下顎骨再建
術、歯槽堤形成術などの骨再建）、さらには骨粗鬆症な
どの予防・治療剤として用いることができる。また、美
容外科領域における骨移植の治療剤としても用いること
ができるし、再生医療における自家移植の際の分化誘導
剤としても利用できる。一方、上記スクリーニングによ
り得られうるＧｌｉ１遺伝子の発現を阻害する活性を有
する化合物やＧｌｉ１遺伝子のアンチセンスＤＮＡなど
は、例えば骨・軟骨形成過剰症の予防・治療剤として用
いることができる。
【００９２】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Use of Gli1 gene <130> P2001-179 <140> <141> <150> JP 2000-242767 <151> 2000-8-4 <160> 22 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA encoding Gli1 <400> 1 AGACTGCCGC TGGGATGGTT GC 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA encoding Gli1 <400> 2 TCCCCTCGAT GCCGCTTGGT CA 22 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA encoding Gli1 <400> 3 TTGAGGTTGG GATGAAGAAG CAGT 24 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA encoding Gli1 <400> 4 AATACAGCCC CCAGCCCAAA CCT 23 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA encoding mouse Col2 a1 <400> 5 GCTCATCGCC GCGGTCCTAC G 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA encoding mouse Col2 a1 <400> 6 CTCGCCAGGT TCGCCAGGAT TG 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA encoding human Col2 a1 <400> 7 CCCCGGCACT CCTGGCACTG AT 22 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA encoding human Col2 a1 <400> 8 CTTGGGCACC TCGGGCTCCT TTAG 24 <210> 9 <211> 3635 <212> DNA <213> Mouse <400> 9 TTGAGGTTGG GATGAAGAAG CAGTTGGGAC GGCCAGCTGG AGGTCTGCGT GGTAGAGGGA 60 ACTCCAGAGA CTGTGGATCC CCAAGACTGA ACGGCTGCTT CTGCCCACTC TTTGGGATGT 120 TTCTTCTTAA GGAAGCTGAA AAACGTTATT GATTTCCATG ACCAGTTTCT GAGATGAGGG 180 TTAGAGGTCC CCTCATCCTT CCCTGAGACG CCATGTTCAA TCCAATGACT CCGCCACAAG 240 TCAATAGCTA TGGTGAGCCA TGCTGTCTCC GACCCCTCCA CAGCCAAGGA GTCCCCAGCA 300 TGGGAACAGA AGGACTTTCT GGTCTGCCCT TTTGCCACCA AGCCAACTTT ATGTCAGGGT 360 CCCAGGGTTA TGGAGCAGCC AGAGAGACCA GCAGCTGCAC TGAAGGATCT CTCTTTCCTC 420 CTCCTCCTCC TCCTCGGAGT TCAGTCAAAT TAACAAAGAA GCGGGCTCTC TCCATCTCGC 480 CCCTTTCTGA TGCCAGCCTC GACCTGCAAA CCGTAATCCG GACCTCACCC AGCTCCCTGG 540 TGGCTTTCAT CAACTCTCGC TGTACATCTC CGGGCGGTTC CTACGGCCAT CTCTCCATTG 600 GTACCATGAG CCCTTCTTTA GGATTCCCAC CTCAGATGAG TCATCAAAAA GGAACTTCAC 660 CTCCCTATGG AGTCCAGCCC TGTGTTCCAC ATGACTCTAC TCGGGGTTCA ATGATGCTTC 720 ACCCCCAGGC CCGGGGACCA CGTGCAACCT GCCAGCTGAA GTCAGAGCTG GATATGATGG 780 TTGGCAAGTG CCCGGAGGAC CCTTTGGAAG GGGACATGTC TAGCCCCAAC TCCACAGGCA 840 CACAGGATCA CCTGTTGGGG ATGCTGGATG GGCGGGAGGA CCTGGAGAGA GAGGAGAAGC 900 CTGAGCCTGA GTCTGTGTAT GAGACAGACT GCCGCTGGGA TGGTTGCAGC CAGGAGTTCG 960 ATTCCCAGGA GCAGCTGGTG CACCACATCA ACAGTGAGCA TATCCACGGG GAGCGGAAGG 1020 AATTCGTGTG CCATTGGGGA GGTTGCTCCA GGGAGCTGAG GCCCTTCAAG GCCCAATACA 1080 TGCTGGTGGT GCACATGCGC AGACACACGG GCGAGAAGCC ACACAAGTGC ACGTTTGAAG 1140 GCTGTCGGAA GTCCTATTCA CGCCTTGAAA ACCTCAAGAC GCACCTTCGG TCGCACACGG 1200 GTGAGAAGCC TTACATGTGT GAGCAAGAAG GTTGCAGCAA GGCCTTTAGC AATGCCAGTG 1260 ACCGCGCCAA GCACCAGAAT CGGACCCACT CCAATGAGAA GCCATACGTG TGCAAGCTCC 1320 CCGGCTGCAC CAAGCGCTAC ACAGATCCCA GCTCGCTCCG CAAACACGTG AAGACAGTGC 1380 ATGGTCCGGA TGCCCACGTG ACCAAGCGGC ATCGAGGGGA TGGCCCCTTG CCACGGGCTC 1440 AGCCCCTCTC CACAGTGGAG CCCAAGCGGG AAAGGGAAGG AGGATCCGGC AGGGAAGAGA 1500 GCAGACTGAC TGTGCCCGAG AGTGCCATGC CGCAGCAGAG CCCCGGAGCG CAGTCCTCTT 1560 GCAGCAGCGA CCACTCCCCA GCAGGCAGTG CGGCCAACAC GGACAGCGGC GTGGAGATGG 1620 CCGGCAACGC CGGGGGCAGC ACTGAGGACT TGTCCAGCTT GGATGAAGGA CCTTGTGTCT 1680 CGGCCACCGG ACTCTCCACG CTTCGCCGCC TGGAGAACCT TAGGCTGGAT CAGCTGCATC 1740 AGCTCCGGCC CATAGGGTCT CGGGGTCTCA AACTGCCCAG CTTAACCCAC GCTGGCGCAC 1800 CTGTGTCTCG CCGTCTGGGC CCCCCAGTCT CMCTGGACCG CCGCAGCAGC AGCTCCAGCA 1860 GCATGAGCTC TGCTTACACA GTCAGCCGCA GGTCCTCCCT GGCATCCCCT TTCCCGCCGG 1920 GAACCCCACC AGAGAATGGG GCATCGTCAC TACCTGGCCT CACACCTGCT CAGCACTACA 1980 TGCTCCGTGC CAGATATGCT TCAGCCAGGG GGAGTGGCAC CCCGCCCACT GCAGCTCACA 2040 GCCTGGATCG GATGGGAGGT CTTTCTGTTC CTCCTTGGAG AAGCCGAACC GAGTACCCGG 2100 GATACAACCC AAATGCAGGG GTCACTCGGA GGGCCAGTGA CCCAGCCCGG GCTGCTGACC 2160 ACCCAGCTCC AGCCAGAGTC CAGCGGTTCA AGAGCCTGGG ATGTGTCCAC ACGCCCCCTA 2220 GTGTGGCAAC AGGACGGAAC TTCGATCCCC ACCACCCTAC CTCTGTCTAT TCGCCACAGC 2280 CCCCCAGCAT CACCGAAAAT GTTGCCATGG ATACTAGGGG GCTACAGGAG GAGCCAGAGG 2340 TTGGAACTTC CGTGATGGGC AATGGTCTGA ACCCATACAT GGATTTTTCC TCCACTGATA 2400 CTCTGGGATA TGGGGGACCC GAGGGGACGG CAGCTGAGCC TTATGAAGCT AGGGGTCCAG 2460 GTTCCCTGCC TCTTGGGCCT GGTCCACCAA CCAACTATGG CCCTGGCCAC TGTGCCCAGC 2520 AGGTCTCCTA TCCTGATCCC ACCCCAGAAA ACTGGGGTGA GTTCCCTTCT CATGCTGGGG 2580 TGTACCCTAG CAATAAGGCT CCGGGTGCTG CCTATAGCCA GTGTCCTCGA CTTGAGCATT 2640 ATGGACAAGT GCAGGTAAAA CCAGAACAAG GGTGCCCAGT GGGGTCTGAC TCCACCGGAT 2700 TGGCACCCTG CCTCAATGCC CACCCCAGTG AAGGGTCCCC AGGCCCGCAG CCTCTGTTTT 2760 CACATCATCC CCAGCTCCCT CAGCCCCAGT ATCCCCAGTC GGGTCCCTAT CCTCAGCCTC 2820 CCCATGGTTA TCTCTCAACA GAACCCAGGC TTGGCCTCAA TTTCAACCCC TCCTCCTCTC 2880 ATTCCACAGG ACAGCTCAAA GCTCAGCTGG TGTGTAATTA CGTTCAGTCG CAGCAGGAAT 2940 TGTTGTGGGA GGGAAGAAAC CGGGGAGGGC TCCCCAACCA GGAACTCCCA TACCAGAGCC 3000 CCAAGTTTCT GGGGGGTTCC CAAGTTAGTC AGAGCCCTGC CAAGACCCCA GCAGCAGCGG 3060 CGGCAGCATA TGGATCTGGC TTTGCACCTG CTTCGGCCAA TCACAAATCA GGCTCCTATC 3120 CTGCCCCTTC ACCCTGCCAT GAAACTTTCA CCGTGGGAGT AAACAGGCCT TCCCACAGGC 3180 CAGCAGCACC ACCCCGACTT CTGCCCCCGC TGTCCCCTTG CTATGGGCCC CTCAAGGTGG 3240 GGGATACCAA CCCCAGCTGT GGCCATCCTG AGGTGGGCAG GTTAGGAGCA GGCCCTGCCT 3300 TGTACCCTCC TCCTGAAGGG CAGGTGTGTA ACGCTCTGGA CTCTCTTGAC CTGGACAACA 3360 CTCAGCTGGA CTTTGTGGCT ATCCTAGATG AGGCCCAGGG CCTGAGCCCT CCTCTTTCCC 3420 ATGAGCAAGG GGACAGCTCT AAAAACACCC CATCTCCCTC TGGGCCCCCC AACATGGCAG 3480 TGGGTAACAT GAGTGTCTTG CTGGGGTCTC TGCCTGGAGA GACACAATTC CTCAACTCTA 3540 GTGCCTAAAA GGGTAAGGAA CCCCAAGCAG ATGGTATTTC CTAAATGGCT ACATGAGGTG 3600 CCCAGGGATG GGAGGTTTGG GCTGGGGGCT GTATT 3635 <210> 10 <211> 1111 <212> PRT <213> Mouse <400> 10 Met Phe Asn Pro Met Thr Pro Pro Gln Val Asn Ser Tyr Gly Glu Pro 1 5 10 15 Cys Cys Leu Arg Pro Leu His Ser Gln Gly Val Pro Ser Met Gly Thr 20 25 30 Glu Gly Leu Ser Gly Leu Pro Phe Cys His Gln Ala Asn Phe Met Ser 35 40 45 Gly Ser Gln Gly Tyr Gly Ala Ala Arg Glu Thr Ser Ser Cys Thr Glu 50 55 60 Gly Ser Leu Phe Pro Pro Pro Pro Pro Pro Arg Ser Ser Val Lys Leu 65 70 75 80 Thr Lys Lys Arg Ala Leu Ser Ile Ser Pro Leu Ser Asp Ala Ser Leu 85 90 95 Asp Leu Gln Thr Val Ile Arg Thr Ser Pro Ser Ser Leu Val Ala Phe 100 105 110 Ile Asn Ser Arg Cys Thr Ser Pro Gly Gly Ser Tyr Gly His Leu Ser 115 120 125 Ile Gly Thr Met Ser Pro Ser Leu Gly Phe Pro Pro Gln Met Ser His 130 135 140 Gln Lys Gly Thr Ser Pro Pro Tyr Gly Val Gln Pro Cys Val Pro His 145 150 155 160 Asp Ser Thr Arg Gly Ser Met Met Leu His Pro Gln Ala Arg Gly Pro 165 170 175 Arg Ala Thr Cys Gln Leu Lys Ser Glu Leu Asp Met Met Val Gly Lys 180 185 190 Cys Pro Glu Asp Pro Leu Glu Gly Asp Met Ser Ser Pro Asn Ser Thr 195 200 205 Gly Thr Gln Asp His Leu Leu Gly Met Leu Asp Gly Arg Glu Asp Leu 210 215 220 Glu Arg Glu Glu Lys Pro Glu Pro Glu Ser Val Tyr Glu Thr Asp Cys 225 230 235 240 Arg Trp Asp Gly Cys Ser Gln Glu Phe Asp Ser Gln Glu Gln Leu Val 245 250 255 His His Ile Asn Ser Glu His Ile His Gly Glu Arg Lys Glu Phe Val 260 265 270 Cys His Trp Gly Gly Cys Ser Arg Glu Leu Arg Pro Phe Lys Ala Gln 275 280 285 Tyr Met Leu Val Val His Met Arg Arg His Thr Gly Glu Lys Pro His 290 295 300 Lys Cys Thr Phe Glu Gly Cys Arg Lys Ser Tyr Ser Arg Leu Glu Asn 305 310 315 320 Leu Lys Thr His Leu Arg Ser His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Met Cys 325 330 335 Glu Gln Glu Gly Cys Ser Lys Ala Phe Ser Asn Ala Ser Asp Arg Ala 340 345 350 Lys His Gln Asn Arg Thr His Ser Asn Glu Lys Pro Tyr Val Cys Lys 355 360 365 Leu Pro Gly Cys Thr Lys Arg Tyr Thr Asp Pro Ser Ser Leu Arg Lys 370 375 380 His Val Lys Thr Val His Gly Pro Asp Ala His Val Thr Lys Arg His 385 390 395 400 Arg Gly Asp Gly Pro Leu Pro Arg Ala Gln Pro Leu Ser Thr Val Glu 405 410 415 Pro Lys Arg Glu Arg Glu Gly Gly Ser Gly Arg Glu Glu Ser Arg Leu 420 425 430 Thr Val Pro Glu Ser Ala Met Pro Gln Gln Ser Pro Gly Ala Gln Ser 435 440 445 Ser Cys Ser Ser Asp His Ser Pro Ala Gly Ser Ala Ala Asn Thr Asp 450 455 460 Ser Gly Val Glu Met Ala Gly Asn Ala Gly Gly Ser Thr Glu Asp Leu 465 470 475 480 Ser Ser Leu Asp Glu Gly Pro Cys Val Ser Ala Thr Gly Leu Ser Thr 485 490 495 Leu Arg Arg Leu Glu Asn Leu Arg Leu Asp Gln Leu His Gln Leu Arg 500 505 510 Pro Ile Gly Ser Arg Gly Leu Lys Leu Pro Ser Leu Thr His Ala Gly 515 520 525 Ala Pro Val Ser Arg Arg Leu Gly Pro Pro Val Ser Leu Asp Arg Arg 530 535 540 Ser Ser Ser Ser Ser Ser Met Ser Ser Ala Tyr Thr Val Ser Arg Arg 545 550 555 560 Ser Ser Leu Ala Ser Pro Phe Pro Pro Gly Thr Pro Pro Glu Asn Gly 565 570 575 Ala Ser Ser Leu Pro Gly Leu Thr Pro Ala Gln His Tyr Met Leu Arg 580 585 590 Ala Arg Tyr Ala Ser Ala Arg Gly Ser Gly Thr Pro Pro Thr Ala Ala 595 600 605 His Ser Leu Asp Arg Met Gly Gly Leu Ser Val Pro Pro Trp Arg Ser 610 615 620 Arg Thr Glu Tyr Pro Gly Tyr Asn Pro Asn Ala Gly Val Thr Arg Arg 625 630 635 640 Ala Ser Asp Pro Ala 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tggtggtaca cccacataat 3780 ctgtggaagg ttggcactgg cccagctggg ggatatcaga ccctcgggga gaatagcagt 3840 acctacaatg gcccagagca ctttgcaatc cacagtgggg atggacttgg caccaatgga 3900 aatactttcc atgaacagcc ctttaagacc cagcagtatg ggagccagct caacaggcag 3960 ccactgactt ccagtgctct agatcatgcc tgtggtacag ggattcaagg gtccaagcta 4020 aaaggcaaca gcttgcaaga gaatgggggt ttgctagatt tcagcctgtc cgtggcacca 4080 aatgagttag ctggcaacac agtgaatggc atgcaaaccc aagatcaaat gggacaggga 4140 tacattgccc atcagctact cagtggcagc atgcaacacc aggggcccag ccgccctggt 4200 caacaggtac tagggcaggt tggtgctacc tcacatatca acatctatca agggacagag 4260 agctgcctac cagggactca ggacaacagc agccagccat caagcatggc agctatcagg 4320 ggctaccagc cctgtgccag ctatgggggt aacaggcgtc aggcaatgcc aaggggcaac 4380 ctcactctgc aacaaggaca gctcagtgac atgagtcaga gcagcagggt gaacagcatc 4440 aaaatggagg cacaaggtca gtcccagcag ctctgctcta ccgtgcagaa ttattccggt 4500 cagttctatg accaaaccat gggcttcagt cagcaagaca ggaaagctgg ctcgttctcc 4560 ctctcagatg ccaactgcct gctccaaggg acatgcactg 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1310 Gln Asn Gln Asp Pro Val Gly Gln Gly Tyr Leu Ala His Gln Leu Leu 1315 1320 1325 Gly Asp Ser Met Gln His Pro Gly Ala Gly Arg Pro Gly Gln Gln Met 1330 1335 1340 Leu Gly Gln Ile Ser Ala Thr Ser His Ile Asn Ile Tyr Gln Gly Pro 1345 1350 1355 1360 Glu Ser Cys Leu Pro Gly Ala His Gly Met Gly Ser Gln Pro Ser Ser 1365 1370 1375 Leu Ala Val Val Arg Gly Tyr Gln Pro Cys Ala Ser Phe Gly Gly Ser 1380 1385 1390 Arg Arg Gln Ala Met Pro Arg Asp Ser Leu Ala Leu Gln Ser Gly Gln 1395 1400 1405 Leu Ser Asp Thr Ser Gln Thr Cys Arg Val Asn Gly Ile Lys Met Glu 1410 1415 1420 Met Lys Gly Gln Pro His Pro Leu Cys Ser Asn Leu Gln Asn Tyr Ser 1425 1430 1435 1440 Gly Gln Phe Tyr Asp Gln Thr Val Gly Phe Ser Gln Gln Asp Thr Lys 1445 1450 1455 Ala Gly Ser Phe Ser Ile Ser Asp Ala Ser Cys Leu Leu Gln Gly Thr 1460 1465 1470 Ser Ala Lys Asn Ser Glu Leu Leu Ser Pro Gly Ala Asn Gln Val Thr 1475 1480 1485 Ser Thr Val Asp Ser Leu Asp Ser His Asp Leu Glu Gly Val Gln Ile 1490 1495 1500 Asp Phe Asp Ala Ile Ile Asp Asp Gly Asp His Ser Ser Leu Met Ser 1505 1510 1515 1520 Gly Ala Leu Ser Pro Ser Ile Ile Gln Asn Leu Ser His Ser Ser Ser 1525 1530 1535 Arg Leu Thr Thr Pro Arg Ala Ser Leu Pro Phe Pro Val Ala Val His 1540 1545 1550 Glu His His Gln His Gly Tyr Arg Gly His Glu Phe Phe Ala Asp Leu 1555 1560 1565 Pro Ser Gly Arg Lys Gln Ile Pro Cys Ser Tyr Ala Ile Gly Phe Arg 1570 1575 1580 Lys Lys Arg Leu Gln Pro Thr Glu Ile Asn Arg Ser 1585 1590 1595 <210> 22 <211> 5055 <212> DNA <213> Human <400> 22 cgatactacg tgggcatttt tggtcgaaga gagctgaagt aatgagaaga catcatggag 60 gcccagtccc acagctccac gaccactgaa aagaaaaaag ttgagaattc catagtgaag 120 tgctccactc gaacagatgt gagcgagaaa gccgttgcct ccagcaccac ttctaatgag 180 gatgaaagtc ctggacagac ttatcacaga gagagaagaa acgcaatcac tatgcagcca 240 cagaatgtcc aggggctcag caaagtcagt gaggaacctt caacatcgag tgacgagagg 300 gcctcattga tcaagaaaga gatccatggg tccctgccac acgtggcgga gccctctgtg 360 ccgtaccgcg ggacggtgtt tgccatggac cccaggaatg gttacatgga gccccactac 420 caccctcctc atcttttccc tgccttccat 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cgaggaggtg cagcgacggg 3000 ggagcccacg gctacgggcg gcgccacctg cagccgcacg atgcgctggg ccacggcgtg 3060 aggagggcca gcgacccggt gcggacaggc tccgagggcc tggccctgcc tcgtgtgccg 3120 cgcttcagca gcctcagcag ctgcaacccc ccggcgatgg ccacgtccgc ggagaagcgc 3180 agtctcgtgc ttcagaatta cacgcggccc gagggcggcc agtcccgaaa cttccactcg 3240 tccccctgtc ctcccagcat caccgagaac gtcaccctgg agtccctgac catggacgct 3300 gatgccaacc tgaacgatga ggatttcctg ccggacgacg tggtgcagta tttaaattcc 3360 cagaaccaag cagggtacga gcagcacttc cccagcgccc tcccggacga cagcaaagtg 3420 ccccacgggc ccggtgactt tgacgcgccc gggctgccag acagccacgc tggccagcag 3480 ttccatgccc tcgagcagcc ctgccccgag ggcagcaaaa ccgacctgcc cattcagtgg 3540 aacgaagtca gctccggaag cgccgacctg tcctcctcca agctcaagtg tgggccgcgg 3600 cccgctgtgc cgcagactcg cgcctttggg ttctgcaacg gcatggtcgt ccacccgcag 3660 aaccccttga ggagcgggcc tgctgggggc tatcagaccc tcggggagaa cagcaacccc 3720 tacggtggcc cagagcactt gatgctccac aacagccccg gaagtggcac cagtggaaac 3780 gccttccatg aacagccctg taaggccccg cagtatggga actgtctcaa caggcagcca 3840 gtggcccctg gtgcactcga cggtgcctgt ggtgccggga ttcaagcctc aaagctgaag 3900 agcaccccca tgcaagggag cgggggccag ctgaatttcg gcctgccggt agcgccaaat 3960 gagtcagctg gcagcatggt gaatggcatg cagaaccagg acccagtggg acaggggtac 4020 ctggctcacc agctcctcgg cgacagcatg cagcacccgg gggcaggccg ccccggtcag 4080 cagatgcttg ggcagattag tgctacctca cacatcaaca tctaccaagg gccagagagc 4140 tgcctgccag gggctcacgg catgggcagc cagccgtcaa gcttggcagt tgtcaggggc 4200 taccagccat gtgccagctt tgggggcagc aggcgccagg ctatgccgag ggacagcctt 4260 gctctgcagt caggacagct cagtgacaca agtcagacct gcagggtgaa tggtatcaag 4320 atggagatga aagggcagcc ccatccgctg tgctctaatc tgcagaatta ctctggtcag 4380 ttctatgacc aaaccgtggg cttcagtcag caagacacga aagctggttc attctctatt 4440 tcagacgcca gctgcctgct acaggggacc agcgccaaaa actctgagtt actttcccca 4500 ggtgctaatc aggtgacaag cacagtggac agcctcgaca gccatgacct ggaaggggta 4560 cagattgact tcgatgccat catagacgat ggggaccact ccagcctgat gtcgggggcc 4620 ctgagcccaa gtatcattca gaacctttcc catagctcct cccgcctcac cacgcctcgg 4680 gcgtccctcc cattcccagt cgctgtccat gagcaccacc aacatggcta tcggggacat 4740 gagttctttg ctgacctccc tagcggaaga aagcaaattc cttgcagtta tgcaataggc 4800 tttaggaaaa aaagactgca accaacggaa atcaatagga gttgaagaga ttaaactgac 4860 tttgttttgg ctgttttttt agttctgtat gtattttagc aatctcatct cacctaactg 4920 agatgtgttt caattatatt ccttttatgg aaaaggactc tgaaaaaccc taaagtattc 4980 tagggagaaa ctgtcttcca tttcagtttt gaatcagtat tgttacactc aaaccaccct 5040 ctttttaaaa aaaaa 5055
【図面の簡単な説明】
【図１】一文字表記によるマウスＧｌｉ１のアミノ酸配
列を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 19/00 Ａ６１Ｐ 19/02 ４Ｃ０８６ 19/02 19/08 ４Ｈ０４５ 19/08 19/10 19/10 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/06 1/68 Ａ 15/09 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｍ 33/50 33/566 33/53 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｋ 37/02 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ０７Ｋ 14/47 5/00 Ｅ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA09 CA20 DA02 DA03 EA04 FA02 FA06 GA13 GA18 HA11 HA14 HA17 4B063 QA01 QA05 QA13 QA17 QA19 QQ08 QQ21 QQ41 QQ43 QQ53 QQ61 QQ89 QR08 QR32 QR35 QR40 QR42 QR56 QR62 QR77 QR80 QS16 QS25 QS34 QX02 4B065 AA91X AA91Y AA93X AA93Y AB01 AC14 AC20 BA02 CA24 CA43 CA44 CA46 4C084 AA02 AA13 AA17 BA01 BA02 BA22 CA17 NA14 ZA96 ZA97 ZB21 4C086 AA01 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA96 ZA97 ZB21 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 EA20 EA50 FA74

Claims (51)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ｇｌｉ１タンパク質、その部分ペプチド
    またはその塩を含有する骨・軟骨分化誘導剤。
  2. 【請求項２】 Ｇｌｉ１タンパク質が配列番号：１０、
    配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５また
    は配列番号：１７で表されるアミノ酸配列と同一もしく
    は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質で
    ある請求項１記載の剤。
  3. 【請求項３】 Ｇｌｉ１タンパク質が配列番号：１０、
    配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５また
    は配列番号：１７で表されるアミノ酸配列を含有するタ
    ンパク質である請求項１記載の剤。
  4. 【請求項４】 Ｇｌｉ１タンパク質、その部分ペプチド
    またはその塩を含有する骨折、変形性関節症、骨関節
    炎、軟骨損傷、外傷、骨形成不全症、軟骨無形成症また
    は骨粗鬆症の予防・治療剤、骨・軟骨欠損部の再生治療
    剤、骨再建剤または骨移植治療剤。
  5. 【請求項５】 Ｇｌｉ１タンパク質またはその部分ペプ
    チドをコードするＤＮＡを含有する骨・軟骨分化誘導
    剤。
  6. 【請求項６】 ＤＮＡが配列番号：９、配列番号：１
    ２、配列番号：１４、配列番号：１６または配列番号：
    １８で表される塩基配列を含有する請求項５記載の剤。
  7. 【請求項７】 Ｇｌｉ１タンパク質またはその部分ペプ
    チドをコードするＤＮＡを含有する組換えベクターを含
    有する請求項５記載の剤。
  8. 【請求項８】 Ｇｌｉ１タンパク質またはその部分ペプ
    チドをコードするＤＮＡを含有する骨折、変形性関節
    症、骨関節炎、軟骨損傷、外傷、骨形成不全症、軟骨無
    形成症または骨粗鬆症の予防・治療剤、骨・軟骨欠損部
    の再生治療剤、骨再建剤または骨移植治療剤。
  9. 【請求項９】 Ｇｌｉ１タンパク質、その部分ペプチド
    またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴
    とする骨・軟骨分化誘導方法。
  10. 【請求項１０】 Ｇｌｉ１タンパク質、その部分ペプチ
    ドまたはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特
    徴とする骨折、変形性関節症、骨関節炎、軟骨損傷、外
    傷、骨形成不全症、軟骨無形成症または骨粗鬆症の予防
    ・治療方法。
  11. 【請求項１１】 骨・軟骨分化誘導剤を製造するための
    Ｇｌｉ１タンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの
    塩の使用。
  12. 【請求項１２】 骨折、変形性関節症、骨関節炎、軟骨
    損傷、外傷、骨形成不全症、軟骨無形成症または骨粗鬆
    症の予防・治療剤、骨・軟骨欠損部の再生治療剤、骨再
    建剤または骨移植治療剤を製造するためのＧｌｉ１タン
    パク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩の使用。
  13. 【請求項１３】 Ｇｌｉ１タンパク質またはその部分ペ
    プチドをコードするＤＮＡの有効量を哺乳動物に投与す
    ることを特徴とする骨・軟骨分化誘導方法。
  14. 【請求項１４】 Ｇｌｉ１タンパク質またはその部分ペ
    プチドをコードするＤＮＡの有効量を哺乳動物に投与す
    ることを特徴とする骨折、変形性関節症、骨関節炎、軟
    骨損傷、外傷、骨形成不全症、軟骨無形成症または骨粗
    鬆症の予防・治療方法。
  15. 【請求項１５】 骨・軟骨分化誘導剤を製造するための
    Ｇｌｉ１タンパク質またはその部分ペプチドをコードす
    るＤＮＡの使用。
  16. 【請求項１６】 骨折、変形性関節症、骨関節炎、軟骨
    損傷、外傷、骨形成不全症、軟骨無形成症または骨粗鬆
    症の予防・治療剤、骨・軟骨欠損部の再生治療剤、骨再
    建剤または骨移植治療剤を製造するためのＧｌｉ１タン
    パク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡの使
    用。
  17. 【請求項１７】 配列番号：１０、配列番号：１１、配
    列番号：１３、配列番号：１５または配列番号：１７で
    表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のア
    ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチ
    ドをコードするＤＮＡの塩基配列に相補的もしくは実質
    的に相補的な塩基配列を含有するアンチセンスＤＮＡを
    含有する骨・軟骨分化阻害剤。
  18. 【請求項１８】 配列番号：１０、配列番号：１１、配
    列番号：１３、配列番号：１５または配列番号：１７で
    表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のア
    ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチ
    ドをコードするＤＮＡの塩基配列に相補的もしくは実質
    的に相補的な塩基配列を含有するアンチセンスＤＮＡを
    含有する骨・軟骨形成過剰症の予防・治療剤。
  19. 【請求項１９】 配列番号：１０、配列番号：１１、配
    列番号：１３、配列番号：１５または配列番号：１７で
    表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のア
    ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチ
    ドをコードするＤＮＡ、または該ＤＮＡの塩基配列に相
    補的もしくは実質的に相補的な塩基配列を含有するアン
    チセンスＤＮＡを含有する骨・軟骨疾患の診断剤。
  20. 【請求項２０】 配列番号：１０、配列番号：１１、配
    列番号：１３、配列番号：１５または配列番号：１７で
    表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のア
    ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチ
    ドをコードするＤＮＡ、または該ＤＮＡの塩基配列に相
    補的もしくは実質的に相補的な塩基配列を含有するアン
    チセンスＤＮＡを用いることを特徴とする骨・軟骨疾患
    の診断方法。
  21. 【請求項２１】 Ｇｌｉ１タンパク質、その部分ペプチ
    ドまたはそれらの塩の抗体を含有する骨・軟骨疾患の診
    断剤。
  22. 【請求項２２】 Ｇｌｉ１タンパク質、その部分ペプチ
    ドまたはそれらの塩の抗体を用いることを特徴とする骨
    ・軟骨疾患の診断方法。
  23. 【請求項２３】 Ｇｌｉ１タンパク質、その部分ペプチ
    ドまたはそれらの塩を用いることを特徴とする骨・軟骨
    分化調節作用を有する化合物またはその塩のスクリーニ
    ング方法。
  24. 【請求項２４】 Ｇｌｉ１タンパク質またはその部分ペ
    プチドを発現する能力を有する細胞を用いることを特徴
    とする請求項２３記載のスクリーニング方法。
  25. 【請求項２５】 Ｇｌｉ１タンパク質またはその部分ペ
    プチドを発現する能力を有する細胞を試験化合物の存在
    下および非存在下に培養し、軟骨分化のマーカー遺伝子
    の発現量を測定することを特徴とする請求項２３記載の
    スクリーニング方法。
  26. 【請求項２６】 軟骨分化のマーカー遺伝子がＩＩ型Ｂ
    コラーゲン遺伝子である請求項２５記載のスクリーニン
    グ方法。
  27. 【請求項２７】 Ｇｌｉ１タンパク質またはその部分ペ
    プチドを発現する能力を有する細胞を試験化合物の存在
    下および非存在下に培養し、細胞の軟骨分化状態を観察
    することを特徴とする請求項２３記載のスクリーニング
    方法。
  28. 【請求項２８】 Ｇｌｉ１タンパク質、その部分ペプチ
    ドまたはそれらの塩を含有することを特徴とする骨・軟
    骨分化調節作用を有する化合物またはその塩のスクリー
    ニング用キット。
  29. 【請求項２９】 請求項２３〜２７記載のスクリーニン
    グ方法、または請求項２８記載のスクリーニング用キッ
    トを用いて得られうる、骨・軟骨分化調節作用を有する
    化合物またはその塩。
  30. 【請求項３０】 請求項２９記載の化合物またはその塩
    を含有する骨・軟骨分化調節剤。
  31. 【請求項３１】 請求項２９記載の化合物またはその塩
    を含有する骨折、変形性関節症、骨関節炎、軟骨損傷、
    外傷、骨形成不全症、軟骨無形成症、骨粗鬆症または骨
    ・軟骨形成過剰症の予防・治療剤、骨・軟骨欠損部の再
    生治療剤、骨再建剤または骨移植治療剤。
  32. 【請求項３２】 請求項２９記載の化合物またはその塩
    の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする骨・軟
    骨疾患の予防・治療方法。
  33. 【請求項３３】 請求項２９記載の化合物またはその塩
    の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする骨折、
    変形性関節症、骨関節炎、軟骨損傷、外傷、骨形成不全
    症、軟骨無形成症、骨粗鬆症または骨・軟骨形成過剰症
    の予防・治療方法。
  34. 【請求項３４】 骨・軟骨疾患の予防・治療剤を製造する
    ための請求項２９記載の化合物またはその塩の使用。
  35. 【請求項３５】 骨折、変形性関節症、骨関節炎、軟骨
    損傷、外傷、骨形成不全症、軟骨無形成症、骨粗鬆症ま
    たは骨・軟骨形成過剰症の予防・治療剤、骨・軟骨欠損
    部の再生治療剤、骨再建剤または骨移植治療剤を製造す
    るための請求項２９記載の化合物またはその塩の使用。
  36. 【請求項３６】 Ｇｌｉ１タンパク質、その部分ペプチ
    ドまたはその塩の作用を増強または活性化することを特
    徴とする骨・軟骨分化誘導方法。
  37. 【請求項３７】 Ｇｌｉ１タンパク質、その部分ペプチ
    ドまたはその塩の作用を増強または活性化することを特
    徴とする骨折、変形性関節症、骨関節炎、軟骨損傷、外
    傷、骨形成不全症、軟骨無形成症または骨粗鬆症の予防
    ・治療方法。
  38. 【請求項３８】 Ｇｌｉ１遺伝子を発現する能力を有す
    る細胞を用いることを特徴とするＧｌｉ１遺伝子の発現
    を制御する活性を有する化合物またはその塩のスクリー
    ニング方法。
  39. 【請求項３９】 Ｇｌｉ１遺伝子を発現する能力を有す
    る細胞を試験化合物の存在下および非存在下に培養し、
    Ｇｌｉ１遺伝子ＤＮＡもしくはその相補ＤＮＡまたはそ
    の部分ＤＮＡを用いてそれぞれのＧｌｉ１タンパク質を
    コードするｍＲＮＡの量を測定することを特徴とする請
    求項３８記載のスクリーニング方法。
  40. 【請求項４０】 Ｇｌｉ１遺伝子のプロモーターもしく
    はエンハンサーをレポーター遺伝子に連結させたＤＮＡ
    で形質転換した細胞を試験化合物の存在下および非存在
    下に培養し、それぞれの該レポーター遺伝子の発現を検
    出することを特徴とするＧｌｉ１遺伝子のプロモーター
    もしくはエンハンサーの活性を制御する作用を有する化
    合物またはその塩のスクリーニング方法。
  41. 【請求項４１】 Ｇｌｉ１遺伝子を発現する能力を有す
    る細胞が骨または軟骨への分化能を有する細胞あるいは
    既に分化形態を示している細胞である請求項３８記載の
    スクリーニング方法。
  42. 【請求項４２】 Ｇｌｉ１遺伝子を発現する能力を有す
    る細胞を含有することを特徴とするＧｌｉ１遺伝子の発
    現を制御する活性を有する化合物またはその塩のスクリ
    ーニング用キット。
  43. 【請求項４３】 Ｇｌｉ１遺伝子のプロモーターもしく
    はエンハンサーをレポーター遺伝子に連結させたＤＮＡ
    で形質転換した細胞を含有することを特徴とするＧｌｉ
    １遺伝子のプロモーターもしくはエンハンサーの活性を
    制御する作用を有する化合物またはその塩のスクリーニ
    ング用キット。
  44. 【請求項４４】 請求項３８記載のスクリーニング方
    法、または請求項４２記載のスクリーニング用キットを
    用いて得られうる、Ｇｌｉ１遺伝子の発現を制御する活
    性を有する化合物またはその塩（但し、Ｇｌｉ３遺伝子
    またはその産物を除く）。
  45. 【請求項４５】 請求項４０記載のスクリーニング方
    法、または請求項４３記載のスクリーニング用キットを
    用いて得られうる、Ｇｌｉ１遺伝子のプロモーターもし
    くはエンハンサーの活性を制御する作用を有する化合物
    またはその塩。
  46. 【請求項４６】 請求項４４または４５記載の化合物ま
    たはその塩を含有する医薬。
  47. 【請求項４７】 請求項４４または４５記載の化合物ま
    たはその塩を含有する骨・軟骨疾患の予防・治療剤。
  48. 【請求項４８】 請求項４４または４５記載の化合物ま
    たはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴と
    する骨・軟骨疾患の予防・治療方法。
  49. 【請求項４９】 骨・軟骨疾患の予防・治療剤を製造す
    るための請求項４４または４５記載の化合物またはその
    塩の使用。
  50. 【請求項５０】 Ｇｌｉ１遺伝子の発現を増強または活
    性化することを特徴とする骨・軟骨分化誘導方法。
  51. 【請求項５１】 Ｇｌｉ１遺伝子の発現を増強または活
    性化することを特徴とする骨折、変形性関節症、骨関節
    炎、軟骨損傷、外傷、骨形成不全症、軟骨無形成症また
    は骨粗鬆症の予防・治療方法。
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