JP4825667B2 - 関節炎症治療剤又は予防剤 - Google Patents
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Description
本発明は、グアニルシクラーゼＢ（以下「ＧＣ−Ｂ」とも称する）活性化物質による関節炎症、特に変形性関節症及びその類似関節炎症、の治療剤、予防剤又は関節軟骨増殖促進剤、あるいは該関節炎症の抑制方法、関節軟骨細胞の増殖促進方法に関する。本発明はさらに、ＧＣ−Ｂの活性を指標とする、関節炎症治療剤又は関節軟骨細胞増殖促進剤のスクリーニング方法に関する。
関節炎症は、関節の炎症性疾患であり、症例数の最も多い疾患が慢性関節リウマチ及び変形性関節症（骨関節症）である。
慢性関節リウマチは、自己免疫疾患と考えられており、関節の疼痛、こわばり、腫脹の症状を伴うが、病状が進行すると、しばしば変形性関節症様の関節軟骨表面の変性に導き、ついには関節の骨や軟骨の重度の破壊が起こる。
変形性関節症は高齢者において多発する関節軟骨の変性疾患である。変形性関節症（ＯＡ）とは、関節の構成要素の退行変性により、軟骨の破壊と骨、軟骨の増殖性変化を来たす疾患であり、さらに上記変化により二次的（続発性）に関節炎（滑膜炎）を来たすものである。変形性関節症は荷重関節である膝関節、肘関節および股関節にて多く認められるが（Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ １９９６；２６０：５２１−６６３）、肩関節・肘関節・手関節のような非荷重関節においても発生が認められる。さらに顎関節においても同様の病態を示す顎関節症が知られている（Ｊ Ｏｒｏｆａｃ Ｐａｉｎ １９９９；１３（４）：２９５−３０６）。
変形性関節症においては、軟骨はその機能本体である軟骨基質蛋白が減じるとともに、軟骨細胞数が減少していることが知られている（Ａｒｔｈ Ｒｈｅｕｍ ２００２；４６（８）：１９８６−１９９６）。しかし、軟骨には血管が分布していないこと、軟骨細胞の数が少なく高度に分化していること、軟骨前駆細胞が乏しいこと、軟骨基質の代謝回転が遅いことなどの理由から、軟骨の自己再生能力は低く変形性関節症における関節軟骨基質と軟骨細胞数の減少が自然治癒する可能性は非常に低い（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．２００３；２４９：２−１６）。また、変形性関節症においては、軟骨変性とともに関節炎症も同時に生じ、関節疼痛の原因となっている（Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２００１；２８（６）：１３３０−１３３７）。
慢性関節リウマチ、変形性関節症などの関節炎の治療剤・予防剤としては、例えばプロテインチロシンキナーゼインヒビター（特表平１１−５１２７０８号公報）、Ｎ−アシル化−２−グルコスアミン誘導体（特表２００４−５０７４９０公報）、キノリン・キナゾリン系誘導体（特開平９−１６９６４６号公報）、などが報告されている。また、現在広く用いられている標準的な変形性関節症の治療剤は、経口で投薬される消炎鎮痛剤や、関節内に注射されるヒアルロン酸や副腎皮質ステロイドなどで、いずれも関節疼痛の抑制剤であり、関節軟骨変性に対する抑制作用を有する薬剤が求められている（Ｄｅｃｉｓｉｏｎ Ｂａｓｅ ７，２００２）。
グアニルシクラーゼ（ＧＣ）は、ＧＴＰからセカンドメッセンジャーであるｃＧＭＰの合成を触媒する酵素ファミリーに属する膜蛋白質であり、ＧＣ−Ａ，ＧＣ−Ｂ，…，ＧＣ−Ｆが知られている。ＧＣ−Ｂは主に血管内皮細胞に見出され、平滑筋の弛緩に関与すると考えられている。ＧＣを活性化する物質としてナトリウム利尿ペプチド（ＮＰ）が知られている。ＮＰ類は、ＡＮＰ（心房性ナトリウムペプチド）、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）およびＣＮＰ（Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド）の３種類からなり、２種類のグアニルシクラーゼ共役受容体（ＡＮＰおよびＢＮＰに対するＮＰＲ−Ａ、ＣＮＰに対するＮＰＲ−Ｂ）を介して、細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させることにより、生物学的活性を示すと考えられている（Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９１；６０：２２９−２５５）。
グアニルシクラーゼ共役受容体でないＮＰＲ−Ｃは、シグナル伝達に関与しないＮＰ類のクリアランス受容体として理解されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７；２３８：６７５−６７８）。しかし、マウス骨髄マクロファージをリポポリサッカライド（ＬＰＳ）刺激したときのシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）誘導によるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）産生を亢進させる系において、ＡＮＰおよびＣＮＰがＮＰＲ−Ｃを介した細胞内ｃＡＭＰ量低下作用にもとづいてＡＮＰおよびＣＮＰがＰＧＥ２産生抑制作用を示すことが報告されており、ＮＰＲ−ＣのＮＰ類のシグナル伝達への関与が示唆されている（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ２００２；１４３（３）：８４６−８５２）。この文献では、マウス骨髄マクロファージ（ＢＭＭ）のＬＰＳ刺激によるＰＧＥ２産生亢進に対して、ＡＮＰが最大約７０％の抑制効果を示すのに対して、ＣＮＰは最大約２０％の抑制効果であり、ＣＮＰの同作用が弱いことが記載されている。ｃＡＭＰやｃＧＭＰなどのｃｙｃｌｉｃ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅを介したＣＯＸ−２の産生の制御は、細胞の種類や刺激の種類により促進／抑制と正反対の反応を取ることが知られているため、ＣＮＰによるＢＭＭ細胞でのＬＰＳ誘導のＰＧＥ２産生抑制がその他の細胞や刺激に対して適用できるかは不明である。また、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ２００２；１４３（３）：８４６−８５２には、ＡＮＰはマウスにＬＰＳを投与して血中トロンボキサンＢ２（ＴＸＢ２）濃度が上昇する系において抑制効果を示すことが報告されており、同じ機序のｃＡＮＦでは逆に亢進させるという相反する結果が得られている。またこの文献ではＡＮＰを関節炎や敗血症などの免疫関連疾患に適応することが記載されているものの、ＣＮＰの関節疾患への適応について何ら言及していない。従ってＣＮＰの関節炎症に対する作用については、現在まで全く知られていない。
ＮＰ類は、体液の恒常性の制御や血圧の調節に重要な役割を果たすと報告されているが（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９８７；９３：１９１１−１９２１、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９４；８７：１４０２−１４１２）、心臓血管系以外の様々な組織での発現とその生理活性も知られている（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １９９１；１２９：１１０４−１１０６、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９１；６０：５５３−５７５）。軟骨に関しては、ＢＮＰ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９８；９５：２３３７−２３４２）またはＣＮＰの過剰発現トランスジェニックマウスにおける成長軟骨の伸長と軟骨無形成症の治療へのＣＮＰの使用が報告されている（Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００４；１０（１）：８０−８６、特開２００３−１１３１１６公報）。しかし、成長軟骨は石灰化を経て骨に置換されて最終的に消失する一時性軟骨であり、関節軟骨や気管軟骨のように、生涯にわたり存在する永久軟骨とは異なる生物学的性質を有することが知られている（Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １９８９；１３６（２）：５００−５０７、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００１；１５３（１）：８７−１００）。さらに、永久軟骨である関節軟骨細胞に対するＣＮＰの肥大化促進作用がｉｎ ｖｉｔｒｏで報告されているが（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００３；２７８（２１）：１８８２４−１８８３２）、正常動物の関節軟骨に対するｉｎ ｖｉｖｏでの作用や変形性関節症における関節軟骨の変性破壊に対する作用や同疾患における関節炎症に対する作用については現在まで知られていない。
変形性関節症においては、関節軟骨は病態のごく初期にいったん肥大化して軟骨組織容量が増加するものの（Ｊ Ｒｈｅｕｍ １９９１；１８（３）：１９０５−１９１５）、病態の進展とともに軟骨基質の変性・破壊が進行して容量は減少する（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ２００４；５０（２）：４７６−４８７）。このとき、関節軟骨細胞の数はアポトーシスにより減少している（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ２００４；５０（２）：５０７−５１５）。一方、残存している個々の関節軟骨細胞はＸ型コラーゲンを発現して肥大軟骨細胞に分化し、一時性軟骨の性質をもつことが知られている（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ １９９２；３５（７）：８０６−８１１）。また、関節軟骨の破壊に伴い関節炎症も生じており、臨床的に罹患関節における疼痛の要因であると考えられている（Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２００１；２８（６）：１３３０−１３３７）。変形性関節症におけるこれらの変化の抑制、すなわち関節軟骨基質および関節軟骨細胞数の減少抑制又は復元、および関節炎抑制は、治療薬開発において有用であると考えられる。
本発明の目的は、変形性関節症を含む関節炎症に対する新しい治療剤又は予防剤、あるいは該関節炎症の治療方法、を提供することである。
本発明の別の目的は、関節軟骨細胞の増殖を促進する薬剤又は方法を提供することである。
本発明の別の目的は、変形性関節症を含む関節炎症を抑制する方法を提供することである。
本発明の別の目的は、関節炎症治療剤のスクリーニング方法を提供することである。
本発明の別の目的は、関節軟骨細胞増殖促進剤のスクリーニング方法を提供することである。
発明の概要
本発明者らは、グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質の一種であるＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）を過剰発現するＣＮＰ トランスジェニックマウスを作製し、関節軟骨への影響を検証した結果、ＣＮＰ トランスジェニックマウスでは、関節軟骨の厚さおよび関節軟骨細胞数が有意に増加していること、さらにＣＮＰ トランスジェニックマウスを用いて作製した変形性関節症モデルでは関節腫脹に抵抗性であることおよび関節軟骨変性が抑制されること、滑膜細胞増勢、肉芽組織形成、炎症性細胞浸潤の変化が著しく弱いこと、関節軟骨中のプロテオグリカン含量は低下しなかったこと、これに対し、正常マウスを用いた変形性関節症モデルでは、滑膜細胞増勢、肉芽組織形成、炎症性細胞浸潤の変化が顕著であったことを見出した。これらの知見から、本発明者らは、ＧＣ−Ｂ活性化物質が関節炎抑制作用と関節軟骨に対する同化的作用の両者を併せもつことを見出した。
したがって、本発明は、以下の発明からなる。
本発明は、第１の態様において、グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質を有効成分として含むことを特徴とする、関節炎症の治療剤又は予防剤を提供する。
本発明の一の実施態様において、上記関節炎症が変形性関節症である。
本発明の別の実施態様において、上記変形性関節症が荷重関節の変形性関節症又は非荷重関節の変形性関節症である。
本発明の別の実施態様において、上記変形性関節症が変形性膝関節症である。
本発明の別の実施態様において、上記変形性関節症が変形性股関節症である。
本発明の別の実施態様において、上記変形性関節症が顎関節症である。
本発明の別の実施態様において、上記関節炎症が関節リウマチに起因するものである。
本発明の別の実施態様において、上記関節炎症が変形性関節症に起因するものである。
本発明の別の実施態様において、上記ＧＣ−Ｂ活性化物質が、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）又はその誘導体である。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３から選択されるものである。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである。
本発明の別の実施形態において、上記関節炎症の治療剤又は予防剤が、少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含むものである。
本発明はさらに、第２の態様において、ＧＣ−Ｂ活性化物質を有効成分として含むことを特徴とする、関節軟骨細胞増殖促進剤を提供する。
本発明の一の実施態様において、上記ＧＣ−Ｂ活性化物質が、ＣＮＰ又はその誘導体である。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである。
本発明の別の実施形態において、上記関節軟骨細胞増殖促進剤が、少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含むものである。
本発明はさらに、第３の態様において、ＧＣ−Ｂを活性化することによって関節炎症を抑制することを特徴とする、関節炎症の抑制方法を提供する。
本発明の一の実施態様において、上記ＧＣ−Ｂは、ＣＮＰ又はその誘導体によって活性化される。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである。
本発明の別の実施態様において、上記ＧＣ−Ｂが、ＣＮＰ又はその誘導体と少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬との組み合わせによって活性化される。
本発明はさらに、第４の態様において、ＧＣ−Ｂを活性化することによって関節軟骨細胞の増殖を促進することを特徴とする、関節軟骨細胞の増殖促進方法を提供する。
本発明の一の実施態様において、上記ＧＣ−Ｂは、ＣＮＰ又はその誘導体によって活性化される。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである。
本発明の別の実施態様において、上記ＧＣ−Ｂが、ＣＮＰ又はその誘導体と少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬との組み合わせによって活性化される。
本発明はさらに、第５の態様において、ＧＣ−Ｂの活性を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む、関節軟骨細胞増殖促進剤のスクリーニング方法を提供する。
本発明の一の実施態様において、ＧＣ−Ｂを発現する培養細胞又は関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞のＧＣ−Ｂ活性を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む。
本発明の別の実施態様において、上記ＧＣ−Ｂの活性が、細胞内ｃＧＭＰ産生量として測定される。
本発明の別の実施態様において、上記方法は、ＧＣ−Ｂを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内ｃＧＭＰの産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内ｃＧＭＰ産生量の差を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む。
本発明はさらに、第６の態様において、ＧＣ−Ｂの活性を指標として、変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤のスクリーニング方法を提供する。
本発明の一の実施態様において、ＧＣ−Ｂを発現する培養細胞又は関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞のＧＣ−Ｂ活性を指標として変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む。
本発明の別の実施態様において、前記ＧＣ−Ｂの活性が、細胞内ｃＧＭＰ産生量として測定される。
本発明の別の実施態様において、上記方法は、ＧＣ−Ｂを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内ｃＧＭＰの産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内ｃＧＭＰ産生量の差を指標として変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む。
本発明はさらに、第７の態様において、ＧＣ−Ｂ活性化物質を有効成分として含む、変形性関節症の治療剤又は予防剤を提供する。
本発明の実施態様において、上記変形性関節症の治療剤又は予防剤が、少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含むものである。
本発明はさらに、第８の態様において、ＧＣ−Ｂ活性化物質を有効成分として含む、関節リウマチの治療剤又は予防剤を提供する。
本発明の実施態様において、上記関節リウマチの治療剤又は予防剤が、少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含むものである。
本発明はさらに、第９の態様において、非ステロイド性活性化剤を含む、グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質に対する活性化促進剤を提供する。
本発明の実施態様において、上記ＧＣ−Ｂ活性化物質が、ＣＮＰ又はその誘導体である。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３から選択される。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである。
本発明の別の実施態様において、上記非ステロイド性活性化剤がシクロオキシゲナーゼ酵素抑制剤である。
本発明の別の実施態様において、上記シクロオキシゲナーゼ酵素抑制剤がインドメタシン、イブプロフェン、ピロキシカム、サリチル酸、ジクロフェナク、ケトプロフェン、ナプロキセン及びピロキシカムからなる群より選択される。
本発明はさらに、第１０の態様において、上記の活性化促進剤を使用することを特徴とする、ＧＣ−Ｂ活性化物質の活性化方法を提供する。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００４−１０７９２４号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
慢性関節リウマチは、自己免疫疾患と考えられており、関節の疼痛、こわばり、腫脹の症状を伴うが、病状が進行すると、しばしば変形性関節症様の関節軟骨表面の変性に導き、ついには関節の骨や軟骨の重度の破壊が起こる。
変形性関節症は高齢者において多発する関節軟骨の変性疾患である。変形性関節症（ＯＡ）とは、関節の構成要素の退行変性により、軟骨の破壊と骨、軟骨の増殖性変化を来たす疾患であり、さらに上記変化により二次的（続発性）に関節炎（滑膜炎）を来たすものである。変形性関節症は荷重関節である膝関節、肘関節および股関節にて多く認められるが（Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ １９９６；２６０：５２１−６６３）、肩関節・肘関節・手関節のような非荷重関節においても発生が認められる。さらに顎関節においても同様の病態を示す顎関節症が知られている（Ｊ Ｏｒｏｆａｃ Ｐａｉｎ １９９９；１３（４）：２９５−３０６）。
変形性関節症においては、軟骨はその機能本体である軟骨基質蛋白が減じるとともに、軟骨細胞数が減少していることが知られている（Ａｒｔｈ Ｒｈｅｕｍ ２００２；４６（８）：１９８６−１９９６）。しかし、軟骨には血管が分布していないこと、軟骨細胞の数が少なく高度に分化していること、軟骨前駆細胞が乏しいこと、軟骨基質の代謝回転が遅いことなどの理由から、軟骨の自己再生能力は低く変形性関節症における関節軟骨基質と軟骨細胞数の減少が自然治癒する可能性は非常に低い（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．２００３；２４９：２−１６）。また、変形性関節症においては、軟骨変性とともに関節炎症も同時に生じ、関節疼痛の原因となっている（Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２００１；２８（６）：１３３０−１３３７）。
慢性関節リウマチ、変形性関節症などの関節炎の治療剤・予防剤としては、例えばプロテインチロシンキナーゼインヒビター（特表平１１−５１２７０８号公報）、Ｎ−アシル化−２−グルコスアミン誘導体（特表２００４−５０７４９０公報）、キノリン・キナゾリン系誘導体（特開平９−１６９６４６号公報）、などが報告されている。また、現在広く用いられている標準的な変形性関節症の治療剤は、経口で投薬される消炎鎮痛剤や、関節内に注射されるヒアルロン酸や副腎皮質ステロイドなどで、いずれも関節疼痛の抑制剤であり、関節軟骨変性に対する抑制作用を有する薬剤が求められている（Ｄｅｃｉｓｉｏｎ Ｂａｓｅ ７，２００２）。
グアニルシクラーゼ（ＧＣ）は、ＧＴＰからセカンドメッセンジャーであるｃＧＭＰの合成を触媒する酵素ファミリーに属する膜蛋白質であり、ＧＣ−Ａ，ＧＣ−Ｂ，…，ＧＣ−Ｆが知られている。ＧＣ−Ｂは主に血管内皮細胞に見出され、平滑筋の弛緩に関与すると考えられている。ＧＣを活性化する物質としてナトリウム利尿ペプチド（ＮＰ）が知られている。ＮＰ類は、ＡＮＰ（心房性ナトリウムペプチド）、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）およびＣＮＰ（Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド）の３種類からなり、２種類のグアニルシクラーゼ共役受容体（ＡＮＰおよびＢＮＰに対するＮＰＲ−Ａ、ＣＮＰに対するＮＰＲ−Ｂ）を介して、細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させることにより、生物学的活性を示すと考えられている（Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９１；６０：２２９−２５５）。
グアニルシクラーゼ共役受容体でないＮＰＲ−Ｃは、シグナル伝達に関与しないＮＰ類のクリアランス受容体として理解されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７；２３８：６７５−６７８）。しかし、マウス骨髄マクロファージをリポポリサッカライド（ＬＰＳ）刺激したときのシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）誘導によるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）産生を亢進させる系において、ＡＮＰおよびＣＮＰがＮＰＲ−Ｃを介した細胞内ｃＡＭＰ量低下作用にもとづいてＡＮＰおよびＣＮＰがＰＧＥ２産生抑制作用を示すことが報告されており、ＮＰＲ−ＣのＮＰ類のシグナル伝達への関与が示唆されている（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ２００２；１４３（３）：８４６−８５２）。この文献では、マウス骨髄マクロファージ（ＢＭＭ）のＬＰＳ刺激によるＰＧＥ２産生亢進に対して、ＡＮＰが最大約７０％の抑制効果を示すのに対して、ＣＮＰは最大約２０％の抑制効果であり、ＣＮＰの同作用が弱いことが記載されている。ｃＡＭＰやｃＧＭＰなどのｃｙｃｌｉｃ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅを介したＣＯＸ−２の産生の制御は、細胞の種類や刺激の種類により促進／抑制と正反対の反応を取ることが知られているため、ＣＮＰによるＢＭＭ細胞でのＬＰＳ誘導のＰＧＥ２産生抑制がその他の細胞や刺激に対して適用できるかは不明である。また、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ２００２；１４３（３）：８４６−８５２には、ＡＮＰはマウスにＬＰＳを投与して血中トロンボキサンＢ２（ＴＸＢ２）濃度が上昇する系において抑制効果を示すことが報告されており、同じ機序のｃＡＮＦでは逆に亢進させるという相反する結果が得られている。またこの文献ではＡＮＰを関節炎や敗血症などの免疫関連疾患に適応することが記載されているものの、ＣＮＰの関節疾患への適応について何ら言及していない。従ってＣＮＰの関節炎症に対する作用については、現在まで全く知られていない。
ＮＰ類は、体液の恒常性の制御や血圧の調節に重要な役割を果たすと報告されているが（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９８７；９３：１９１１−１９２１、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９４；８７：１４０２−１４１２）、心臓血管系以外の様々な組織での発現とその生理活性も知られている（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １９９１；１２９：１１０４−１１０６、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９１；６０：５５３−５７５）。軟骨に関しては、ＢＮＰ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９８；９５：２３３７−２３４２）またはＣＮＰの過剰発現トランスジェニックマウスにおける成長軟骨の伸長と軟骨無形成症の治療へのＣＮＰの使用が報告されている（Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００４；１０（１）：８０−８６、特開２００３−１１３１１６公報）。しかし、成長軟骨は石灰化を経て骨に置換されて最終的に消失する一時性軟骨であり、関節軟骨や気管軟骨のように、生涯にわたり存在する永久軟骨とは異なる生物学的性質を有することが知られている（Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １９８９；１３６（２）：５００−５０７、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００１；１５３（１）：８７−１００）。さらに、永久軟骨である関節軟骨細胞に対するＣＮＰの肥大化促進作用がｉｎ ｖｉｔｒｏで報告されているが（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００３；２７８（２１）：１８８２４−１８８３２）、正常動物の関節軟骨に対するｉｎ ｖｉｖｏでの作用や変形性関節症における関節軟骨の変性破壊に対する作用や同疾患における関節炎症に対する作用については現在まで知られていない。
変形性関節症においては、関節軟骨は病態のごく初期にいったん肥大化して軟骨組織容量が増加するものの（Ｊ Ｒｈｅｕｍ １９９１；１８（３）：１９０５−１９１５）、病態の進展とともに軟骨基質の変性・破壊が進行して容量は減少する（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ２００４；５０（２）：４７６−４８７）。このとき、関節軟骨細胞の数はアポトーシスにより減少している（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ２００４；５０（２）：５０７−５１５）。一方、残存している個々の関節軟骨細胞はＸ型コラーゲンを発現して肥大軟骨細胞に分化し、一時性軟骨の性質をもつことが知られている（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ １９９２；３５（７）：８０６−８１１）。また、関節軟骨の破壊に伴い関節炎症も生じており、臨床的に罹患関節における疼痛の要因であると考えられている（Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２００１；２８（６）：１３３０−１３３７）。変形性関節症におけるこれらの変化の抑制、すなわち関節軟骨基質および関節軟骨細胞数の減少抑制又は復元、および関節炎抑制は、治療薬開発において有用であると考えられる。
本発明の目的は、変形性関節症を含む関節炎症に対する新しい治療剤又は予防剤、あるいは該関節炎症の治療方法、を提供することである。
本発明の別の目的は、関節軟骨細胞の増殖を促進する薬剤又は方法を提供することである。
本発明の別の目的は、変形性関節症を含む関節炎症を抑制する方法を提供することである。
本発明の別の目的は、関節炎症治療剤のスクリーニング方法を提供することである。
本発明の別の目的は、関節軟骨細胞増殖促進剤のスクリーニング方法を提供することである。
発明の概要
本発明者らは、グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質の一種であるＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）を過剰発現するＣＮＰ トランスジェニックマウスを作製し、関節軟骨への影響を検証した結果、ＣＮＰ トランスジェニックマウスでは、関節軟骨の厚さおよび関節軟骨細胞数が有意に増加していること、さらにＣＮＰ トランスジェニックマウスを用いて作製した変形性関節症モデルでは関節腫脹に抵抗性であることおよび関節軟骨変性が抑制されること、滑膜細胞増勢、肉芽組織形成、炎症性細胞浸潤の変化が著しく弱いこと、関節軟骨中のプロテオグリカン含量は低下しなかったこと、これに対し、正常マウスを用いた変形性関節症モデルでは、滑膜細胞増勢、肉芽組織形成、炎症性細胞浸潤の変化が顕著であったことを見出した。これらの知見から、本発明者らは、ＧＣ−Ｂ活性化物質が関節炎抑制作用と関節軟骨に対する同化的作用の両者を併せもつことを見出した。
したがって、本発明は、以下の発明からなる。
本発明は、第１の態様において、グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質を有効成分として含むことを特徴とする、関節炎症の治療剤又は予防剤を提供する。
本発明の一の実施態様において、上記関節炎症が変形性関節症である。
本発明の別の実施態様において、上記変形性関節症が荷重関節の変形性関節症又は非荷重関節の変形性関節症である。
本発明の別の実施態様において、上記変形性関節症が変形性膝関節症である。
本発明の別の実施態様において、上記変形性関節症が変形性股関節症である。
本発明の別の実施態様において、上記変形性関節症が顎関節症である。
本発明の別の実施態様において、上記関節炎症が関節リウマチに起因するものである。
本発明の別の実施態様において、上記関節炎症が変形性関節症に起因するものである。
本発明の別の実施態様において、上記ＧＣ−Ｂ活性化物質が、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）又はその誘導体である。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３から選択されるものである。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである。
本発明の別の実施形態において、上記関節炎症の治療剤又は予防剤が、少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含むものである。
本発明はさらに、第２の態様において、ＧＣ−Ｂ活性化物質を有効成分として含むことを特徴とする、関節軟骨細胞増殖促進剤を提供する。
本発明の一の実施態様において、上記ＧＣ−Ｂ活性化物質が、ＣＮＰ又はその誘導体である。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである。
本発明の別の実施形態において、上記関節軟骨細胞増殖促進剤が、少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含むものである。
本発明はさらに、第３の態様において、ＧＣ−Ｂを活性化することによって関節炎症を抑制することを特徴とする、関節炎症の抑制方法を提供する。
本発明の一の実施態様において、上記ＧＣ−Ｂは、ＣＮＰ又はその誘導体によって活性化される。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである。
本発明の別の実施態様において、上記ＧＣ−Ｂが、ＣＮＰ又はその誘導体と少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬との組み合わせによって活性化される。
本発明はさらに、第４の態様において、ＧＣ−Ｂを活性化することによって関節軟骨細胞の増殖を促進することを特徴とする、関節軟骨細胞の増殖促進方法を提供する。
本発明の一の実施態様において、上記ＧＣ−Ｂは、ＣＮＰ又はその誘導体によって活性化される。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである。
本発明の別の実施態様において、上記ＧＣ−Ｂが、ＣＮＰ又はその誘導体と少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬との組み合わせによって活性化される。
本発明はさらに、第５の態様において、ＧＣ−Ｂの活性を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む、関節軟骨細胞増殖促進剤のスクリーニング方法を提供する。
本発明の一の実施態様において、ＧＣ−Ｂを発現する培養細胞又は関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞のＧＣ−Ｂ活性を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む。
本発明の別の実施態様において、上記ＧＣ−Ｂの活性が、細胞内ｃＧＭＰ産生量として測定される。
本発明の別の実施態様において、上記方法は、ＧＣ−Ｂを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内ｃＧＭＰの産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内ｃＧＭＰ産生量の差を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む。
本発明はさらに、第６の態様において、ＧＣ−Ｂの活性を指標として、変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤のスクリーニング方法を提供する。
本発明の一の実施態様において、ＧＣ−Ｂを発現する培養細胞又は関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞のＧＣ−Ｂ活性を指標として変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む。
本発明の別の実施態様において、前記ＧＣ−Ｂの活性が、細胞内ｃＧＭＰ産生量として測定される。
本発明の別の実施態様において、上記方法は、ＧＣ−Ｂを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内ｃＧＭＰの産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内ｃＧＭＰ産生量の差を指標として変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む。
本発明はさらに、第７の態様において、ＧＣ−Ｂ活性化物質を有効成分として含む、変形性関節症の治療剤又は予防剤を提供する。
本発明の実施態様において、上記変形性関節症の治療剤又は予防剤が、少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含むものである。
本発明はさらに、第８の態様において、ＧＣ−Ｂ活性化物質を有効成分として含む、関節リウマチの治療剤又は予防剤を提供する。
本発明の実施態様において、上記関節リウマチの治療剤又は予防剤が、少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含むものである。
本発明はさらに、第９の態様において、非ステロイド性活性化剤を含む、グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質に対する活性化促進剤を提供する。
本発明の実施態様において、上記ＧＣ−Ｂ活性化物質が、ＣＮＰ又はその誘導体である。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３から選択される。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである。
本発明の別の実施態様において、上記非ステロイド性活性化剤がシクロオキシゲナーゼ酵素抑制剤である。
本発明の別の実施態様において、上記シクロオキシゲナーゼ酵素抑制剤がインドメタシン、イブプロフェン、ピロキシカム、サリチル酸、ジクロフェナク、ケトプロフェン、ナプロキセン及びピロキシカムからなる群より選択される。
本発明はさらに、第１０の態様において、上記の活性化促進剤を使用することを特徴とする、ＧＣ−Ｂ活性化物質の活性化方法を提供する。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００４−１０７９２４号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
図１は、ＣＮＰ トランスジェニックマウス作製用ベクターの構築を示す。図１Ａ：ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ベクターに組み込まれたマウスＣＮＰのｃＤＮＡをＰｓｔＩで切り出し両末端を平滑化した。図１Ｂ：ｐＳＧ１をＥｃｏ ＲＩで処理して断端を平滑化した。図１Ｃ：図１Ａで得られたマウスＣＮＰのｃＤＮＡを図１Ｂで得られたｐＳＧ１に組み込んだ。
図２は、インジェクション用ＤＮＡフラグメントを示す。図１ＣのｐＳＧ１−ＣＮＰから、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで処理した後、ＣＮＰ遺伝子を含む断片（約２．３ｋｂ）を切り出し、インジェクション用のフラグメントとした。
図３は、サザンブロット法による導入遺伝子の存在に関するＣＮＰ トランスジェニックマウスの遺伝子型解析結果を示す。野生型マウス（ＷＴ）では３本のシグナル（野生型ＣＮＰ遺伝子）が検出され、トランスジェニックマウス（Ｔｇｍ）で野生型ＣＮＰ遺伝子に加えて、導入遺伝子由来のシグナル（トランスジーン）が２本検出された。
図４は、ＣＮＰ トランスジェニックマウスにおける関節軟骨の肥厚を示す。大腿骨膝蓋面の関節軟骨の厚さについて、正常同腹仔（Ｗｉｌｄ）とＣＮＰ トランスジェニックマウス（ＣＮＰ ｔｇｍ）の間で比較した。ＣＮＰ トランスジェニックマウスは統計学的に有意に関節軟骨が厚いことを示している。＊＊：ｐ＜０．０１、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定。
図５は、ＣＮＰ トランスジェニックマウスにおける関節軟骨細胞数の増加を示す。大腿骨膝蓋面の関節軟骨における光学顕微鏡下（対物１０倍）１視野あたりの軟骨細胞数について、正常同腹仔（Ｗｉｌｄ）とＣＮＰ トランスジェニックマウス（ＣＮＰ ｔｇｍ）の間で比較した。ＣＮＰ トランスジェニックマウスは統計学的に有意に１視野あたりの軟骨細胞数が多いことを示す。＊：ｐ＜０．０５、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定。
図６は、ＣＮＰ トランスジェニックマウスのコラゲナーゼＯＡモデルにおける関節腫脹抵抗性を示す。ＣＮＰ トランスジェニックマウス（Ｔｇｍ）および野生型マウス（ＷＴ）の右膝関節に３％コラゲナーゼ生理食塩液を投与後、左右の膝関節幅を計測し、その左右差を膝関節腫脹の指標として推移（図６Ａ）とその曲線下面積（ＡＵＣ）（図６Ｂ）を評価した。ＣＮＰ トランスジェニックマウスは右膝関節の腫脹が弱い傾向にあり、ＡＵＣは野生型に対して有意に小さかった。＊＊：ｐ＜０．０１，Ｎ．Ｓ．：有意差なし。対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定。
図７は、コラゲナーゼＯＡモデルにおける右膝関節滑膜の組織学的変化を示す。ＣＮＰ トランスジェニックマウスおよび野生型マウスの右膝関節に３％コラゲナーゼ生理食塩液を投与後、２８日での右膝関節滑膜の組織像である。野生型マウスに３％コラゲナーゼを投与すると、滑膜上皮細胞の増生、肉芽組織形成および炎症性細胞浸潤が認められた（図７Ｂ）。一方、ＣＮＰ トランスジェニックマウスではこれら所見はきわめて軽微であった（図７Ｃ）。図７Ａは正常滑膜組織を示す。
図８は、コラゲナーゼＯＡモデルにおける右大腿骨内顆関節軟骨の組織学的変化を示す。ＣＮＰ トランスジェニックマウスおよび野生型マウスの右膝関節に３％コラゲナーゼ生理食塩液を投与後、２８日での右大腿骨内顆関節軟骨の組織像である。野生型マウスでは軟骨基質のサフラニン０染色性が低下し、プロテオグリカン含量低下が認められた（図８Ｂ）のに対し、ＣＮＰ トランスジェニックマウスではサフラニン０染色性は保たれていた（図８Ｃ）。図８Ａは正常関節軟骨を示す。
図９は、Ｉｎｆｕｓｉｏｎ投与したＣＮＰのマウスコラゲナーゼＯＡモデルにおける関節腫脹抑制効果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６ Ｊ Ｊｃｌ系マウスにＣＮＰ−２２を皮下に持続投与し、右膝関節に１．５％コラゲナーゼ生理食塩液を投与して６日後に測定した右膝関節腫脹を示す。ＣＮＰ−２２は６０，６００ｎｇ／日群ともに溶媒対照群（ビヒクル）に対して有意に右膝関節の腫脹を抑制した。対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定。
図１０は、Ｉｎｆｕｓｉｏｎ投与したＣＮＰのマウス外科的ＯＡモデルにおける関節腫脹抑制効果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６ Ｊ Ｊｃｌ系マウスにＣＮＰ−２２を皮下に持続投与し、右膝関節に前十字靭帯切除、内側則副靭帯切除および内側半月板全切除の外科処置を加えて変形性関節症を惹起した。術後４、８、１１日後に左右膝関節幅を測定、その差のＡＵＣを示した。ＣＮＰ−２２は６０，６００ｎｇ／日群ともに溶媒対照群（ビヒクル）に対して有意に右膝関節の腫脹を抑制した。対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定。
図１１は、Ｃ５７ＢＬ／６ Ｊ Ｊｃｌ系マウスコラゲナーゼＯＡモデルにおける膝関節腫脹に対する、ＣＮＰ−２２（６ｎｇ／日、皮下持続投与）、インドメタシン（Ｉｎｄｏ．，１ｍｇ／ｋｇ、経口投与）、およびこれらを併用した場合の抑制効果を示す。図１１Ａはマウス右膝関節に０．１５％と１．５％コラゲナーゼ生理食塩液を投与したあとの７日間の経日的な右膝関節腫脹推移を表す。図１１Ｂは、図１１Ａのグラフの曲線下面積（ＡＵＣ）を表す。ＡＵＣの比較において、ＣＮＰ−２２は溶媒対照群（ビヒクル）に対して有意に右膝関節の腫脹を抑制したが、インドメタシンは抑制しなかった。一方、ＣＮＰ−２２とインドメタシンを併用した群は顕著な抑制を示し、ＣＮＰ−２２単独群に対しても有意な抑制を示した。対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定。＊：ｐ＜０．０５（ｖｓ．ビヒクル），＊＊：ｐ＜０．０１（ｖｓ．ビヒクル）。
図１２は、ラットアジュバント関節炎モデルに対する、ＣＮＰ−２２の四肢末端の関節炎と体重推移に対する効果を示す。図１２Ａは四肢末端の関節炎スコアの推移を表しており、ＣＮＰ−２２群では関節炎スコアが低い傾向が認められる。図１２Ｂは体重の推移を表しており、抗原感作後７、１０日においてＣＮＰ−２２群が溶媒対照群（ビヒクル）に比して有意に体重が重いことが示されている。対応のないＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定。＊：ｐ＜０．０５（ｖｓ．ビヒクル）。
図１３は、ラットコラーゲン関節炎モデル体重に対するＣＮＰ−２２の作用を示す。正常群に対して、溶媒対照群（ビヒクル）は抗原感作後２１，２４，２８日で有意に体重が軽かったが、このときＣＮＰ−２２群（ＣＮＰ ６μｇ／日）では溶媒対照群に対して有意に体重が重かったことが示されている。対応のないＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定。＃＃：ｐ＜０．０１（ｖｓ．正常），＊：ｐ＜０．０５（ｖｓ．ビヒクル）。
発明の詳細な説明
図面を参照しながら、本発明をさらに具体的に説明する。
本発明者らが後述の実施例２に記載のように作製したＣＮＰ−トランスジェニックマウス（ＣＮＰＴｇｍ）についてサザンブロット法を用いて遺伝子型解析を行ったところ、図３に示されるように、野生型マウスでは３本のシグナル（野生型ＣＮＰ遺伝子）が検出され、ＣＮＰＴｇｍでは野生型ＣＮＰ遺伝子に加えて、導入遺伝子由来の２本のシグナル（トランスジーン）が検出された。ＣＮＰＴｇｍでのＣＮＰの発現を検討するため、導入した遺伝子の高発現が予想される臓器である肝臓および血漿でのＣＮＰの濃度を調べたところ、ＣＮＰ Ｔｇｍは野生型に対し、肝臓で約１０倍、血漿で約２４倍のＣＮＰ濃度を示しており、統計学的に有意にＣＮＰペプチドが過剰発現されていることが確認された（実施例４の表１）。
さらにＣＮＰＴｇｍの関節軟骨の組織学的解析を行うために、関節軟骨の厚さおよび軟骨細胞数を組織学的に調べたところ、関節軟骨の厚さは、ＣＮＰＴｇｍにおいて統計学的に有意に厚いこと（図４）、また関節軟骨細胞数もＣＮＰＴｇｍにおいて統計学的に有意に多いこと（図５）が確認された。これらの結果から、ＣＮＰなどのＧＣ−Ｂ活性化物質は軟骨細胞数を増加させることによって関節軟骨の厚さを増加させることが示された。
後述の実施例６では、マウスを用いて膝関節内へのコラゲナーゼ注射により膝関節の靭帯および半月板を不安定化させて変形性関節症を惹起する変形性関節炎病態モデル動物を作製した（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９８９；１３５：１００１−１４）。ＣＮＰＴｇｍの関節炎症および関節軟骨変性に対する抵抗性を評価する目的で、ＣＮＰＴｇｍおよび正常マウスを用いて作製した各変形性関節炎モデル動物を用いて検討を行ったところ、ＣＮＰＴｇｍを用いて作製したモデル動物では、正常マウスを用いて作製したモデル動物と比べて、膝関節腫脹が有意に小さかったこと、関節軟骨変性が有意に抑制されていたこと、滑膜における滑膜細胞増勢、肉芽組織形成、炎症性細胞浸潤の変化が著しく弱かったこと、および関節軟骨中のプロテオグリカン含量にはほとんど変化はなかったことが確認された（図６〜図８）。これらの結果から、ＧＣ−Ｂ活性化物質が、変形性関節症において関節炎症抑制作用と関節軟骨変性抑制作用を有することが判明した。
さらにまた、オスモティックポンプを移植した正常マウスを用いて、変形性関節炎モデルを作製し、インフュージョン投与したＣＮＰの変形性関節炎モデルに対する治療効果の検討を行った。ＣＮＰ投与群では膝関節腫脹に抵抗性であること、関節軟骨変性が有意に抑制されていたこと、滑膜における滑膜細胞増勢、肉芽組織形成、炎症性細胞浸潤の変化が著しく弱かったことが確認された（図９）。これらの結果から、ＧＣ−Ｂ活性化物質は変形性関節症に対する治療効果を有することが判明した。
さらに、オスモティックポンプを移植した正常マウスの右膝関節に対して前十字靭帯切断、内側則副靭帯切断および内側半月板全切除の外科処置を施し、変形性関節症を惹起し、インフュージョン投与したＣＮＰの変形性関節炎モデルに対する治療効果の検討を行った。その結果、ＣＮＰ投与群のＡＵＣ（曲線下面積）はいずれの用量とも溶媒対照群に対し有意に小さかったことが確認された（図１０）。この結果から、ＧＣ−Ｂ活性化物質が外科処置により惹起される、膝関節への物理的過荷重にもとづく変形性関節症における関節炎症に対しても抑制作用を有することが明らかになった。
さらにまた、コラゲナーゼＯＡモデルマウスに、ＣＮＰを単独でまたは非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）と併用して投与したとき、使用したＮＳＡＩＤ単独では膝関節腫張を抑制しなかったが、ＣＮＰ単独投与では有意に膝関節腫張を抑制し、ＣＮＰとＮＳＡＩＤとの併用投与では、より大きい相乗的腫張抑制効果を示すことが判った（実施例９、図１１）。
さらにまた、関節リウマチ（ＲＡ）モデルとしてラボで汎用されているアジュバント関節炎モデルおよびコラーゲン関節炎モデル（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，２７：７９７−８０６，１９８４；Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，３３：７９８−８０７，１９９４）を用いて、ＣＮＰの効果をさらに調べた結果、ＣＮＰ投与群（ラット）では、関節炎が有意に抑制されるとともに、対照と比べて体重増加が観察され、一般状態の有意な改善が認められた（実施例１０、１１、及び図１２、１３）。これらの結果は、ＣＮＰが関節リウマチによる関節炎に対して効能があることを示している。
このような実証例に基づき、本発明者らは、特定の理論や特定の実験例に拘束されることなく、ＣＮＰなどのＧＣ−Ｂ活性化物質が関節炎症抑制作用と関節軟骨に対する同化的作用の両者を併せもつことを見出した。
したがって、本発明は、ＧＣ−Ｂ活性化物質を有効成分として含むことを特徴とする、関節炎症の治療剤又は予防剤を提供する。
本発明において治療又は予防可能な関節炎症は、特に関節軟骨に関わる疾患であり、例えば、変形性関節症に起因する関節炎症、滑膜炎、関節リウマチ（例えば慢性関節リウマチ（成人）や若年性関節リウマチ（子供））、骨関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、痛風、強皮症、乾癬（乾癬性関節炎）、ブラストミセス症などの真菌感染、強直性脊推炎、ライター症候群、敗血症性関節炎、成人スティル病、第三次ライム病（後期）、結核（結核性関節炎）、ウイルス感染（ウイルス性関節炎）、淋疾（淋菌性関節炎）もしくはバクテリアによる感染（非りん菌性細菌性関節炎）などに起因する関節炎症が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の実施態様において、好ましい関節炎症は変形性関節症、あるいは、変形性関節症に起因する関節炎症である。
変形性関節症は、関節軟骨の変性と破壊に起因する疾患であり、適応可能な変形性関節症には例えば、（１）荷重関節である膝関節、股関節、足関節、脊椎などにおける変形性膝関節症、変形性股関節症、変形性足関節症、及び変形性脊椎症などの荷重関節における変形性関節症、並びに（２）非荷重関節である肩関節、肘関節、手関節、顎関節などにおける変形性肩関節症、変形性肘関節症、変形性手関節症（例えばヘバーデン結節、ブシャール結節、変形性母指ＣＭ関節症など）、顎関節症などの非荷重関節における変形性関節症が含まれる。
本発明の実施態様において、変形性関節症は、荷重関節における変形性関節症であり、好ましくは変形性膝関節症及び変形性股関節症である。
本発明の別の実施態様において、変形性関節症は、非荷重関節における変形性関節症であり、好ましくは顎関節症である。
本発明の治療剤又は予防剤はまた、関節リウマチの治療又は予防にも適応可能である。関節リウマチは、自己免疫疾患であると考えられており、変形性関節症とは病因を異にするが、その病状の進行に伴って変形性関節症と同様に関節軟骨表面の変性と軟骨の破壊が起こる。このため、本発明の治療剤を投与することによって、関節炎症を抑制又は軽減することができる。
本明細書中で使用する「治療」、「治療方法」、「治療剤」なる用語は、本発明に係る関節炎症をもつ患者の症状を除去、抑制又は軽減すること、あるいはそのための方法又は医薬を意味する。また、「予防」、「予防剤」なる用語は、関節炎症を予防すること、あるいはそのための医薬を意味する。
本発明においてグアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）とは、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｂ（ＮＰＲ−Ｂ）と同義の用語として使用する。
本発明においてＧＣ−Ｂ活性とは、グアニルシクラーゼ活性と同義の用語として使用する。本発明において、グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質又はＧＣ−Ｂ活性化物質は、ＣＮＰの受容体として知られるＧＣ−Ｂと結合してこれを活性化するペプチド又は非ペプチド性低分子化合物であり、好ましくはＣＮＰペプチド又はその誘導体である。ここでペプチドは、複数の（Ｌ−、Ｄ−及び／又は修飾）アミノ酸のアミド結合連鎖からなる物質を指し、この中にはポリペプチド及び蛋白質も包含される。ＧＣ−Ｂ活性化物質は、例えば、ＣＯＳ−７等の培養細胞株にＧＣ−Ｂ受容体を発現させ、培地に候補薬剤を添加し、一定の温度及び一定の時間（例えば３７℃、５分後）細胞株を培養したのち、細胞内のｃＧＭＰ産生量を測定する方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１；２５２：１２０−１２３）によって同定されうる。すなわち、このようなアッセイ系を使用して細胞内ｃＧＭＰの産生量を指標としてＧＣ−Ｂ活性化物質を同定し、それを本発明に使用することができる。
本発明の実施態様において、ＧＣ−Ｂ活性化物質は、ペプチドでありＣＮＰ又はその誘導体である。好ましいＣＮＰは、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３から選択されるものであり、さらに好ましくは、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである。あるいは、上記ＣＮＰ誘導体は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列と約７０％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の％同一性を有する配列を含みかつＣＮＰ活性を有するものである。
本明細書中で使用される「１〜数個」という用語は、通常１〜１０、好ましくは１〜５、さらに好ましくは１〜３の任意の整数を表す。また、２つのアミノ酸配列間の「％同一性」は、当業者に公知のＢＬＡＳＴタンパク質検索などの手法を用いて決定することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｇｉｓｈ，Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９０）“Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）。
本発明で使用可能なＣＮＰには、ヒトを含む哺乳類由来ＣＮＰ（ＣＮＰ−２２：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９０；１６８：８６３−８７０，国際公開ＷＯ９１／１６３４２、ＣＮＰ−５３：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９０；１７０：９７３−９７９，特開平４−７４１９８号公報、特開平４−１３９１９９号公報、特開平４−１２１１９０号公報）、鳥類由来ＣＮＰ（特開平４−１２００９４号公報）、両生類由来ＣＮＰ（特開平４−１２００９５号公報）、並びに、特開平６−９６８８号公報、国際公開ＷＯ０２／０７４２３４に開示されるＣＮＰ類似体ペプチドのようなＣＮＰ誘導体が含まれる。
天然由来ＣＮＰとして、２２及び５３アミノ残基からなるＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３が知られており、鳥類及びヒトを含む哺乳類由来の各ＣＮＰを比較すると種を超えて配列相同が高いため、本発明においては、鳥類又はヒトを含む哺乳類由来のＣＮＰ、好ましくはヒトを含む哺乳類由来のＣＮＰ、さらに好ましくはヒト由来のＣＮＰが使用されうる。ヒトＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３のアミノ酸配列は、下記の配列番号１及び配列番号２：
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ（ヒトＣＮＰ−２２：配列番号１）；
Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ（ヒトＣＮＰ−５３：配列番号２）
として示される配列を有しており、いずれも分子内ジスルフィド結合を有し、すなわちヒトＣＮＰ−２２では６位のシステイン残基と２２位のシステイン残基との間で、またヒトＣＮＰ−５３では３７位のシステイン残基と５３位のシステイン残基との間でそれぞれ分子内ジスルフィド結合を有し、環状ペプチド構造を形成している。
ブタＣＮＰ−２２及びラットＣＮＰ−２２は、ヒトＣＮＰ−２２と同一のアミノ酸配列を有するが、一方、ブタＣＮＰ−５３及びラットＣＮＰ−５３では１７位及び２８位のアミノ酸残基がそれぞれＨｉｓ及びＧｌｙであるのに対しヒトＣＮＰ−５３ではそれぞれＧｌｎ及びＡｌａであり、２つのアミノ酸が相違する（特開平４−１３９１９９号公報、特開平４−１２１１９０号公報、特開平４−７４１９８号公報）。さらにまた、ニワトリＣＮＰ−２２は、９位のアミノ酸残基ＶａｌのみがヒトＣＮＰ−２２と異なる以外は同じ一次構造を有している（特開平４−１２００９４号公報）。
本発明で使用しうる上記ＣＮＰは、天然からの精製ＣＮＰ、既知の遺伝子工学的手法で製造された遺伝子組換えＣＮＰ、既知の化学合成法（例えばペプチド合成機を用いる固相合成法）で製造されたＣＮＰを含み、好ましくは遺伝子工学的手法で製造されたヒトＣＮＰ−２２およびヒトＣＮＰ−５３である。遺伝子工学的手法によるヒトＣＮＰの製造は、例えば、ヒトＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３のＤＮＡ配列（特開平４−１３９１９９号公報）をプラスミド、ファージなどのベクターに組み込み、大腸菌や酵母などの原核もしくは真核生物宿主細胞に形質転換したのち、適する培地中で発現し、好ましくは細胞外にＣＮＰペプチドを分泌させ、産生したＣＮＰペプチドを回収し精製する各工程を含む。また、目的ＤＮＡの増幅のために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用することができる。
遺伝子組換え技術、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ技術などの基本的な手法は当業者には公知であり、例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９９８）などに記載されており、そこに開示される技術を本発明のために利用することができる。またベクターとしては、市販のベクターあるいは刊行物記載のベクターが使用できる。
本発明で使用しうるＣＮＰ誘導体は、ＣＮＰ活性を有するとともに、ヒトＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３と同一の２つのシステイン残基間のジスルフィド結合による環状ペプチド構造を有するものであって、上記ＣＮＰのフラグメント、上記ＣＮＰ又はそのフラグメントの構成アミノ酸の少なくとも１つをその他のアミノ酸に置換したペプチド、上記ＣＮＰそのもの又はその部分ペプチドの構成アミノ酸の少なくとも１つを欠失したペプチド、及び上記ＣＮＰそのもの又はその部分ペプチドの構成アミノ酸に１つ以上のアミノ酸を付加したペプチドを含む。アミノ酸の置換、欠失、付加とは、ＣＮＰ活性を損なわない限り、部位特異的突然変異誘発法などの周知の方法にてアミノ酸の置換、欠失又は付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失又は付加されることを意味する。このようなＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３の誘導体は例えば、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである。
アミノ酸の置換については、一般的に保存的アミノ酸置換が好ましい。保存的アミノ酸は、例えば極性度（または疎水性度）や電荷の種類によって分類されることができる。例えば、非極性の非電荷型アミノ酸にはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリンなど、芳香族アミノ酸にはフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、極性の非電荷型アミノ酸にはセリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンなど、負電荷アミノ酸にはアスパラギン酸、グルタミン酸、正電荷アミノ酸にはリジン、アルギニン、ヒスチジンが、それぞれ含まれる。
本発明においてＣＮＰ活性とは、ＧＣ−Ｂに作用してグアニルシクラーゼ活性を上昇させる活性や変形性関節症を含む関節炎症を除去、抑制又は軽減する活性あるいは関節軟骨の増殖を促進させる活性をいう。ＣＮＰ活性は、細胞のグアニルシクラーゼ活性、たとえば細胞内ｃＧＭＰの産生量を測定することによること、及び／又は、マウス、ラットなどの関節炎症、変形性関節症もしくは関節リウマチモデル動物に一定期間ＣＮＰ又はその誘導体を投与したのち、後述の実施例７から１０に記載されるように関節炎症抑制効果又は関節軟骨変性抑制効果の程度を測定すること、によって決定しうる。
ＣＮ−２２類似ペプチドには、例えば特開平６−９６８８号公報や国際公開ＷＯ０２／０７４２３４に記載されるような下記の環状ペプチドが含まれる（なお、配列中の下線はヒトＣＮＰ−２２からの変異を表す）。
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ（配列番号３）
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ（配列番号４）
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ（配列番号５）
Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ（配列番号６）
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ（配列番号７）
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｙｒ（配列番号８）
Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｙｒ（配列番号９）
Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｘａａ Ｘｂｂ ＸｃｃＡｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｘｄｄ Ｘｅｅ Ｓｅｒ Ｘｆｆ Ｘｇｇ Ｇｌｙ Ｃｙｓ（ここで、Ｘａａ＝Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ；Ｘｂｂ＝Ｌｙｓ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ；Ｘｃｃ＝Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ａｌａ，Ｖａｌ；Ｘｄｄ＝Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｔｈｒ，Ａｓｎ；Ｘｅｅ＝Ｍｅｔ，Ａｌａ，Ｔｒｐ，Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ｓｅｒ，Ｇｌｙ；Ｘｆｆ：Ｇｌｙ，Ｌｙｓ，Ａｌａ，Ｌｅｕ；Ｘｇｇ＝Ｌｅｕ，Ｍｅｔである。）（配列番号１０）
また、ＣＮＰ−５３類似ペプチドには、上記のＣＮＰ−２２類似ペプチドに対応するアミノ酸の同様の変異を含む環状ペプチドが含まれる。
本発明はさらに、ＧＣ−Ｂ活性化物質を有効成分として含むことを特徴とする、関節軟骨細胞増殖促進剤を提供する。この発明は、ＧＣ−Ｂ活性化物質が関節軟骨細胞を増加させる働きがあることに基づく。ＧＣ−Ｂ活性化物質の具体例は、上記定義のＣＮＰ又はその誘導体である。ＣＮＰは、好ましくは、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３であり、さらに好ましくは、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である。また、ＣＮＰ誘導体は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものを含む。他のＧＣ−Ｂ活性化物質は、例えば、ＣＯＳ−７等の培養細胞株にＧＣ−Ｂ受容体を発現させ、培地に候補薬剤を添加し、一定の温度及び一定の時間（例えば３７℃、５分後）細胞株を培養したのち、細胞内のｃＧＭＰ産生量を測定する方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１；２５２：１２０−１２３）によって同定されうる。すなわち、このようなアッセイ系を使用して細胞内ｃＧＭＰの産生量を指標としてＧＣ−Ｂ活性化物質を同定し、それを本発明に使用することができる。
本発明はまた、ＧＣ−Ｂを活性化することによって関節炎症を抑制することを特徴とする、関節炎症の抑制方法を提供する。さらに本発明は、ＧＣ−Ｂを活性化することによって関節軟骨細胞の増殖を促進することを特徴とする、関節軟骨細胞の増殖促進方法を提供する。これらの発明は、ＧＣ−Ｂ活性化物質によって、言い換えればＧＣ−Ｂを活性化することによって、上記定義の関節炎症、好ましくは変形性関節症を抑制することができるという知見、また関節軟骨細胞の増殖を促進するという知見に基づく。本発明の実施態様により、ＧＣ−Ｂは、上記定義のＣＮＰ又はその誘導体によって活性化されうる。
本発明はさらに、ＧＣ−Ｂの活性を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む、関節軟骨細胞増殖促進剤のスクリーニング方法を提供する。ＧＣ−Ｂは、グアニルシクラーゼ活性によりＧＴＰからセカンドメッセンジャーであるｃＧＭＰの合成を触媒することが知られているので、ＧＣ−Ｂの活性は、細胞内ｃＧＭＰ産生量として測定されうる。
本発明の実施態様において、上記スクリーニング方法は、ＧＣ−Ｂを発現する細胞や関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞のグアニルシクラーゼ活性、たとえば細胞内ｃＧＭＰの産生量を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることからなる工程を含むことができる。
本発明の実施態様においてより好ましくは、ＧＣ−Ｂを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内ｃＧＭＰの産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内ｃＧＭＰ産生量の差を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む。
本発明のスクリーニング方法は、例えば、ＣＯＳ−７等の培養細胞株にＧＣ−Ｂを発現させ、培地に候補薬剤を添加し、一定の温度及び一定の時間（例えば３７℃、５分間）細胞株を培養したのち、細胞内のｃＧＭＰ産生量を測定する方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１；２５２：１２０−１２３）によって関節軟骨細胞増殖促進剤をスクリーニングすることができる。
本発明はさらに、ＧＣ−Ｂの活性を指標として、変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤のスクリーニング方法を提供する。上記と同様に、ＧＣ−Ｂの活性は、グアニルシクラーゼ活性、たとえば細胞内ｃＧＭＰ産生量として測定されうる。
本発明の実施態様において、上記スクリーニング方法は、ＧＣ−Ｂを発現する培養細胞や関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞のグアニルシクラーゼ活性、たとえば細胞内ｃＧＭＰの産生量を指標として変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることからなる方法を含むことができる。
本発明の実施態様においてより好ましくは、ＧＣ−Ｂを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内ｃＧＭＰの産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内ｃＧＭＰ産生量の差を指標として変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む。
本発明のスクリーニング方法は、例えば、ＣＯＳ−７等の培養細胞株にＧＣ−Ｂを発現させ、培地に候補薬剤を添加し、一定の温度及び一定の時間（例えば３７℃、５分間）細胞株を培養したのち、細胞内のｃＧＭＰ産生量を測定する方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１；２５２：１２０−１２３）によって変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤をスクリーニングすることができる。
本発明の変形性関節症等の関節炎症の治療剤又は予防剤は、有効成分としての上記定義のＧＣ−Ｂ活性化物質を、製薬上許容可能な担体、賦形剤、添加剤などと組み合わせて、経口投与用又は非経口投与用に製剤化される。
製剤用の担体や賦形剤としては、例えば、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、オリーブ油、ゴマ油、カカオバター、エチレングリコールなどやその他常用されるものをあげることができる。
経口投与のための固体組成物としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤などが用いられる。このような固体組成物においては、少なくともひとつの有効成分が少なくともひとつの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶性セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合される。組成物は、常法にしたがって不活性な希釈剤以外の添加物、例えば、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、繊維素グリコール酸カルシウムのような崩壊剤、グルタミン酸又はアスパラギン酸のような溶解補助剤を含んでいてもよい。錠剤又は丸剤は、必要によりショ糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートなどの糖衣や胃溶性又は腸溶性物質のフィルムで被覆してもよいし、２つ以上の層で被覆してもよい。さらに、ゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも含まれる。
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤などを含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水、エタノールなどを含んでいてもよい。この組成物は、不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤などを含んでいてもよい。
非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤が含まれる。水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば、注射用水及び注射用生理食塩液が含まれる。非水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート８０（登録商標）などが含まれる。このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えば、乳糖）、溶解補助剤（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）のような補助剤を含んでいてもよい。これらは、例えば、精密ろ過膜によるろ過滅菌、高圧蒸気滅菌のような加熱滅菌、あるいは、殺菌剤の配合などの通常の滅菌方法によって無菌化することが可能である。注射剤は溶液製剤であっても、使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥のための賦形剤としては例えばマンニトール、ブドウ糖などの糖アルコールや糖類を使用することができる。
本発明の治療剤又は予防剤は、医薬に一般に使用されている経口投与方法又は非経口投与方法のいずれかによって投与される。好ましくは非経口投与方法、例えば注射による投与（皮下注射、静脈注射、筋肉注射、腹腔内への注射などによる投与）、経皮投与、経粘膜投与（経鼻投与、経直腸投与など）、経肺投与などであるが、経口投与方法による投与も可能である。
本発明の製剤中に含まれる有効成分であるＧＣ−Ｂ活性化物質、好ましくは上記定義のＣＮＰ又はその誘導体、の量は、治療すべき疾患の種類、疾患の重症度、患者の年齢などに応じて決定できるが、一般に０．００５μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲で投与することができるが、０．０２μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇで投与することが好ましい。さらに０．０２μｇ／ｋｇ〜０．２５ｍｇ／ｋｇでの投与が好ましい。しかしながら本発明のＣＮＰを含有する薬剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
本発明の治療剤又は予防剤は、抗炎症薬、ヒアルロン酸や副腎皮質ステロイドなどの従来又は新規の治療剤と組み合わせたり、また関節鏡視下手術、人工関節置換や骨切り術などの整形外科手術と組み合わせて使用することができる。
特に、抗炎症薬、例えば少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をＧＣ−Ｂ活性化物質（例えば、上記定義のＣＮＰ又はその誘導体）と併用するときには、関節炎に対する相乗的抑制効果がある（実施例１０）。
本明細書で使用する「非ステロイド性抗炎症薬」は、ステロイド骨格をもたない抗炎症薬を指し、プロスタグランジンの産生に関わるシクロオキシゲナーゼ酵素を抑制する作用をもつものが好ましい。本発明で使用可能な非ステロイド性抗炎症薬には、以下のものに限定されないが、例えばインドメタシン（インダシン（商標）など）、イブプロフェン（ブルフェン（商標）など）、ピロキシカム、サリチル酸、ジクロフェナク（ボルタレン（商標）など）、ケトプロフェン、ナプロキセン、ピロキシカムなどを含む。
さらにまた、上記のＧＣ−Ｂ活性化物質を非ステロイド性抗炎症薬と併用するときの相乗効果は、ＧＣ−Ｂ活性化物質を単独に使用したときと比べてＧＣ−Ｂの活性化が促進されること、言い換えれば、上記の非ステロイド性抗炎症薬の有効成分がＧＣ−Ｂ活性化物質によるＧＣ−Ｂの活性化の際の活性化促進剤となること、を示している。
したがって、本発明はさらに、非ステロイド性活性化剤を含む、ＧＣ−Ｂ活性化物質に対する活性化促進剤を提供する。
ＧＣ−Ｂ活性化物質には、上述したような、ＣＮＰ又はその誘導体が含まれる。ＣＮＰの例は、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３であり、さらに具体的には、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である。また、ＣＮＰの誘導体の例は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである。
本発明において、上記非ステロイド性活性化剤は、好ましくはシクロオキシゲナーゼ酵素抑制剤である。シクロオキシゲナーゼ酵素抑制剤には、例えばインドメタシン、イブプロフェン、ピロキシカム、サリチル酸、ジクロフェナク、ケトプロフェン、ナプロキセン、ピロキシカムなどが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の活性化促進剤の剤型、用量、投与方法は、本発明の治療剤及び予防剤について上で説明した事項をそのまま適用できる。
本発明はまた、上記の活性化促進剤を使用することを特徴とするＧＣ−Ｂ活性化物質の活性化方法も提供する。
上記の本発明の活性化促進剤および方法は、患者において、例えばＧＣ−Ｂ活性化を介して関節炎症などの疾患を治療する場合などに有効に使用することができる。
本発明として以下の事項を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
（１）グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質を有効成分として含むことを特徴とする、関節炎症の治療剤又は予防剤。
（２）上記関節炎症が変形性関節症である、上記（１）に記載の治療剤又は予防剤。
（３）上記変形性関節症が荷重関節の変形性関節症又は非荷重関節の変形性関節症である、上記（２）に記載の治療剤又は予防剤。
（４）上記変形性関節症が変形性膝関節症である、上記（３）に記載の治療剤又は予防剤。
（５）上記変形性関節症が変形性股関節症である、上記（３）に記載の治療剤又は予防剤。
（６）上記変形性関節症が顎関節症である、上記（３）に記載の治療剤又は予防剤。
（７）上記関節炎症が関節リウマチに起因する、上記（１）に記載の治療剤又は予防剤。
（８）上記関節炎症が変形性関節症に起因する、上記（１）に記載の治療剤又は予防剤。
（９）上記ＧＣ−Ｂ活性化物質が、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）又はその誘導体である、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の治療剤又は予防剤。
（１０）上記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３から選択される、上記（９）に記載の治療剤又は予防剤。
（１１）上記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である、上記（９）に記載の治療剤又は予防剤。
（１２）上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである、上記（９）に記載の治療剤又は予防剤。
（１３）少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含む、上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の治療剤又は予防剤。
（１４）ＧＣ−Ｂ活性化物質を有効成分として含むことを特徴とする、関節軟骨細胞増殖促進剤。
（１５）前記ＧＣ−Ｂ活性化物質が、ＣＮＰ又はその誘導体である、上記（１４）に記載の増殖促進剤。
（１６）前記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３である、上記（１５）に記載の増殖促進剤。
（１７）前記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である、上記（１５）に記載の増殖促進剤。
（１８）前記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである、上記（１５）に記載の増殖促進剤。
（１９）少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含む、上記（１４）〜（１８）のいずれかに記載の増殖促進剤。
（２０）ＧＣ−Ｂを活性化することによって関節炎症を抑制することを特徴とする、関節炎症の抑制方法。
（２１）前記ＧＣ−Ｂが、ＣＮＰ又はその誘導体によって活性化される、上記（２０）に記載の抑制方法。
（２２）前記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３である、上記（２１）に記載の抑制方法。
（２３）前記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である、上記（２１）に記載の抑制方法。
（２４）前記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである、請求項２１に記載の抑制方法。
（２５）前記ＧＣ−Ｂが、ＣＮＰ又はその誘導体と少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬との組み合わせによって活性化される、上記（２０）〜（２４）のいずれかに記載の抑制方法。
（２６）ＧＣ−Ｂを活性化することによって関節軟骨細胞の増殖を促進することを特徴とする、関節軟骨細胞の増殖促進方法。
（２７）前記ＧＣ−Ｂが、ＣＮＰ又はその誘導体によって活性化される、上記（２６）に記載の増殖促進方法。
（２８）前記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３である、上記（２７）に記載の増殖促進方法。
（２９）前記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である、上記（２７）に記載の増殖促進方法。
（３０）前記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである、上記（２７）に記載の増殖促進方法。
（３１）前記ＧＣ−Ｂが、ＣＮＰ又はその誘導体と少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬との組み合わせによって活性化される、上記（２６）〜（３０）のいずれかに記載の増殖促進方法。
（３２）ＧＣ−Ｂの活性を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む、関節軟骨細胞増殖促進剤のスクリーニング方法。
（３３）ＧＣ−Ｂを発現する培養細胞又は関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞のＧＣ−Ｂ活性を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む、上記（３２）に記載のスクリーニング方法。
（３４）前記ＧＣ−Ｂ活性が、細胞内ｃＧＭＰ産生量として測定される、上記（３２）又は（３３）に記載のスクリーニング方法。
（３５）ＧＣ−Ｂを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内ｃＧＭＰの産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内ｃＧＭＰ産生量の差を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む、上記（３２）〜（３４）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（３６）ＧＣ−Ｂの活性を指標として、変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤のスクリーニング方法。
（３７）ＧＣ−Ｂを発現する培養細胞又は関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞のＧＣ−Ｂ活性を指標として変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、上記（３６）に記載のスクリーニング方法。
（３８）前記ＧＣ−Ｂ活性が、細胞内ｃＧＭＰ産生量として測定される、上記（３６）又は（３７）に記載のスクリーニング方法。
（３９）ＧＣ−Ｂを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内ｃＧＭＰの産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内ｃＧＭＰ産生量の差を指標として変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、上記（３６）〜（３８）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（４０）グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質を有効成分として含む、変形性関節症の治療剤又は予防剤。
（４１）少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含む、上記（４０）に記載の変形性関節症の治療剤又は予防剤。
（４２）グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質を有効成分として含む、関節リウマチの治療剤又は予防剤。
（４３）少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含む、請求項４２に記載の、関節リウマチの治療剤又は予防剤。
（４４）関節炎症の治療を必要とする患者にＧＣ−Ｂ活性化物質を投与することを含む、該関節炎症の治療方法。
（４５）上記ＧＣ−Ｂ活性化物質がＣＮＰ又はその誘導体である、上記（４４）に記載の治療方法。
（４６）上記関節炎症が変形性関節症である、上記（４４）又は（４５）に記載の治療方法。
（４７）上記変形性関節症が荷重関節の変形性関節症又は非荷重関節の変形性関節症である、上記（４６）に記載の治療方法。
（４８）上記変形性関節症が変形性膝関節症、変形性股関節症又は顎関節症である、上記（４７）に記載の治療方法。
（４９）上記関節炎症が関節リウマチに起因する、上記（４４）に記載の治療方法。
（５０）上記関節炎症が変形性関節症に起因する、上記（４４）に記載の治療方法。
（５１）上記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３から選択される、上記（４５）〜（５０）のいずれかに記載の治療方法。
（５２）上記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である、上記（４５）〜（５０）のいずれかに記載の治療方法。
（５３）上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである、上記（４５）〜（５０）のいずれかに記載の治療方法。
（５４）上記ＧＣ−Ｂ活性化物質を、少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬と組み合わせて含む、上記（４４）〜（５３）のいずれかに記載の治療方法。
（５５）非ステロイド性活性化剤を含む、ＧＣ−Ｂ活性化物質に対する活性化促進剤。
（５６）上記ＧＣ−Ｂ活性化物質が、ＣＮＰ又はその誘導体である、上記（５５）に記載の活性化促進剤。
（５７）上記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３から選択される、上記（５６）に記載の活性化促進剤。
（５８）上記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である、上記（５６）に記載の活性化促進剤。
（５９）上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである、上記（５６）に記載の活性化促進剤。
（６０）上記非ステロイド性活性化剤がシクロオキシゲナーゼ酵素抑制剤である、上記（５５）に記載の活性化促進剤。
（６１）上記シクロオキシゲナーゼ酵素抑制剤がインドメタシン、イブプロフェン、ピロキシカム、サリチル酸、ジクロフェナク、ケトプロフェン、ナプロキセン及びピロキシカムからなる群より選択される、上記（６０）に記載の活性化促進剤。
（６２）上記（５５）〜（６１）のいずれかに記載の活性化促進剤を使用することを特徴とする、ＧＣ−Ｂ活性化物質の活性化方法。
以下の実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は単に例示を目的としたものであって、本発明を制限するものではない。それゆえ、本発明は、これらの実施例によって制限されないものとする。
図２は、インジェクション用ＤＮＡフラグメントを示す。図１ＣのｐＳＧ１−ＣＮＰから、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで処理した後、ＣＮＰ遺伝子を含む断片（約２．３ｋｂ）を切り出し、インジェクション用のフラグメントとした。
図３は、サザンブロット法による導入遺伝子の存在に関するＣＮＰ トランスジェニックマウスの遺伝子型解析結果を示す。野生型マウス（ＷＴ）では３本のシグナル（野生型ＣＮＰ遺伝子）が検出され、トランスジェニックマウス（Ｔｇｍ）で野生型ＣＮＰ遺伝子に加えて、導入遺伝子由来のシグナル（トランスジーン）が２本検出された。
図４は、ＣＮＰ トランスジェニックマウスにおける関節軟骨の肥厚を示す。大腿骨膝蓋面の関節軟骨の厚さについて、正常同腹仔（Ｗｉｌｄ）とＣＮＰ トランスジェニックマウス（ＣＮＰ ｔｇｍ）の間で比較した。ＣＮＰ トランスジェニックマウスは統計学的に有意に関節軟骨が厚いことを示している。＊＊：ｐ＜０．０１、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定。
図５は、ＣＮＰ トランスジェニックマウスにおける関節軟骨細胞数の増加を示す。大腿骨膝蓋面の関節軟骨における光学顕微鏡下（対物１０倍）１視野あたりの軟骨細胞数について、正常同腹仔（Ｗｉｌｄ）とＣＮＰ トランスジェニックマウス（ＣＮＰ ｔｇｍ）の間で比較した。ＣＮＰ トランスジェニックマウスは統計学的に有意に１視野あたりの軟骨細胞数が多いことを示す。＊：ｐ＜０．０５、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定。
図６は、ＣＮＰ トランスジェニックマウスのコラゲナーゼＯＡモデルにおける関節腫脹抵抗性を示す。ＣＮＰ トランスジェニックマウス（Ｔｇｍ）および野生型マウス（ＷＴ）の右膝関節に３％コラゲナーゼ生理食塩液を投与後、左右の膝関節幅を計測し、その左右差を膝関節腫脹の指標として推移（図６Ａ）とその曲線下面積（ＡＵＣ）（図６Ｂ）を評価した。ＣＮＰ トランスジェニックマウスは右膝関節の腫脹が弱い傾向にあり、ＡＵＣは野生型に対して有意に小さかった。＊＊：ｐ＜０．０１，Ｎ．Ｓ．：有意差なし。対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定。
図７は、コラゲナーゼＯＡモデルにおける右膝関節滑膜の組織学的変化を示す。ＣＮＰ トランスジェニックマウスおよび野生型マウスの右膝関節に３％コラゲナーゼ生理食塩液を投与後、２８日での右膝関節滑膜の組織像である。野生型マウスに３％コラゲナーゼを投与すると、滑膜上皮細胞の増生、肉芽組織形成および炎症性細胞浸潤が認められた（図７Ｂ）。一方、ＣＮＰ トランスジェニックマウスではこれら所見はきわめて軽微であった（図７Ｃ）。図７Ａは正常滑膜組織を示す。
図８は、コラゲナーゼＯＡモデルにおける右大腿骨内顆関節軟骨の組織学的変化を示す。ＣＮＰ トランスジェニックマウスおよび野生型マウスの右膝関節に３％コラゲナーゼ生理食塩液を投与後、２８日での右大腿骨内顆関節軟骨の組織像である。野生型マウスでは軟骨基質のサフラニン０染色性が低下し、プロテオグリカン含量低下が認められた（図８Ｂ）のに対し、ＣＮＰ トランスジェニックマウスではサフラニン０染色性は保たれていた（図８Ｃ）。図８Ａは正常関節軟骨を示す。
図９は、Ｉｎｆｕｓｉｏｎ投与したＣＮＰのマウスコラゲナーゼＯＡモデルにおける関節腫脹抑制効果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６ Ｊ Ｊｃｌ系マウスにＣＮＰ−２２を皮下に持続投与し、右膝関節に１．５％コラゲナーゼ生理食塩液を投与して６日後に測定した右膝関節腫脹を示す。ＣＮＰ−２２は６０，６００ｎｇ／日群ともに溶媒対照群（ビヒクル）に対して有意に右膝関節の腫脹を抑制した。対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定。
図１０は、Ｉｎｆｕｓｉｏｎ投与したＣＮＰのマウス外科的ＯＡモデルにおける関節腫脹抑制効果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６ Ｊ Ｊｃｌ系マウスにＣＮＰ−２２を皮下に持続投与し、右膝関節に前十字靭帯切除、内側則副靭帯切除および内側半月板全切除の外科処置を加えて変形性関節症を惹起した。術後４、８、１１日後に左右膝関節幅を測定、その差のＡＵＣを示した。ＣＮＰ−２２は６０，６００ｎｇ／日群ともに溶媒対照群（ビヒクル）に対して有意に右膝関節の腫脹を抑制した。対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定。
図１１は、Ｃ５７ＢＬ／６ Ｊ Ｊｃｌ系マウスコラゲナーゼＯＡモデルにおける膝関節腫脹に対する、ＣＮＰ−２２（６ｎｇ／日、皮下持続投与）、インドメタシン（Ｉｎｄｏ．，１ｍｇ／ｋｇ、経口投与）、およびこれらを併用した場合の抑制効果を示す。図１１Ａはマウス右膝関節に０．１５％と１．５％コラゲナーゼ生理食塩液を投与したあとの７日間の経日的な右膝関節腫脹推移を表す。図１１Ｂは、図１１Ａのグラフの曲線下面積（ＡＵＣ）を表す。ＡＵＣの比較において、ＣＮＰ−２２は溶媒対照群（ビヒクル）に対して有意に右膝関節の腫脹を抑制したが、インドメタシンは抑制しなかった。一方、ＣＮＰ−２２とインドメタシンを併用した群は顕著な抑制を示し、ＣＮＰ−２２単独群に対しても有意な抑制を示した。対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定。＊：ｐ＜０．０５（ｖｓ．ビヒクル），＊＊：ｐ＜０．０１（ｖｓ．ビヒクル）。
図１２は、ラットアジュバント関節炎モデルに対する、ＣＮＰ−２２の四肢末端の関節炎と体重推移に対する効果を示す。図１２Ａは四肢末端の関節炎スコアの推移を表しており、ＣＮＰ−２２群では関節炎スコアが低い傾向が認められる。図１２Ｂは体重の推移を表しており、抗原感作後７、１０日においてＣＮＰ−２２群が溶媒対照群（ビヒクル）に比して有意に体重が重いことが示されている。対応のないＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定。＊：ｐ＜０．０５（ｖｓ．ビヒクル）。
図１３は、ラットコラーゲン関節炎モデル体重に対するＣＮＰ−２２の作用を示す。正常群に対して、溶媒対照群（ビヒクル）は抗原感作後２１，２４，２８日で有意に体重が軽かったが、このときＣＮＰ−２２群（ＣＮＰ ６μｇ／日）では溶媒対照群に対して有意に体重が重かったことが示されている。対応のないＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定。＃＃：ｐ＜０．０１（ｖｓ．正常），＊：ｐ＜０．０５（ｖｓ．ビヒクル）。
発明の詳細な説明
図面を参照しながら、本発明をさらに具体的に説明する。
本発明者らが後述の実施例２に記載のように作製したＣＮＰ−トランスジェニックマウス（ＣＮＰＴｇｍ）についてサザンブロット法を用いて遺伝子型解析を行ったところ、図３に示されるように、野生型マウスでは３本のシグナル（野生型ＣＮＰ遺伝子）が検出され、ＣＮＰＴｇｍでは野生型ＣＮＰ遺伝子に加えて、導入遺伝子由来の２本のシグナル（トランスジーン）が検出された。ＣＮＰＴｇｍでのＣＮＰの発現を検討するため、導入した遺伝子の高発現が予想される臓器である肝臓および血漿でのＣＮＰの濃度を調べたところ、ＣＮＰ Ｔｇｍは野生型に対し、肝臓で約１０倍、血漿で約２４倍のＣＮＰ濃度を示しており、統計学的に有意にＣＮＰペプチドが過剰発現されていることが確認された（実施例４の表１）。
さらにＣＮＰＴｇｍの関節軟骨の組織学的解析を行うために、関節軟骨の厚さおよび軟骨細胞数を組織学的に調べたところ、関節軟骨の厚さは、ＣＮＰＴｇｍにおいて統計学的に有意に厚いこと（図４）、また関節軟骨細胞数もＣＮＰＴｇｍにおいて統計学的に有意に多いこと（図５）が確認された。これらの結果から、ＣＮＰなどのＧＣ−Ｂ活性化物質は軟骨細胞数を増加させることによって関節軟骨の厚さを増加させることが示された。
後述の実施例６では、マウスを用いて膝関節内へのコラゲナーゼ注射により膝関節の靭帯および半月板を不安定化させて変形性関節症を惹起する変形性関節炎病態モデル動物を作製した（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９８９；１３５：１００１−１４）。ＣＮＰＴｇｍの関節炎症および関節軟骨変性に対する抵抗性を評価する目的で、ＣＮＰＴｇｍおよび正常マウスを用いて作製した各変形性関節炎モデル動物を用いて検討を行ったところ、ＣＮＰＴｇｍを用いて作製したモデル動物では、正常マウスを用いて作製したモデル動物と比べて、膝関節腫脹が有意に小さかったこと、関節軟骨変性が有意に抑制されていたこと、滑膜における滑膜細胞増勢、肉芽組織形成、炎症性細胞浸潤の変化が著しく弱かったこと、および関節軟骨中のプロテオグリカン含量にはほとんど変化はなかったことが確認された（図６〜図８）。これらの結果から、ＧＣ−Ｂ活性化物質が、変形性関節症において関節炎症抑制作用と関節軟骨変性抑制作用を有することが判明した。
さらにまた、オスモティックポンプを移植した正常マウスを用いて、変形性関節炎モデルを作製し、インフュージョン投与したＣＮＰの変形性関節炎モデルに対する治療効果の検討を行った。ＣＮＰ投与群では膝関節腫脹に抵抗性であること、関節軟骨変性が有意に抑制されていたこと、滑膜における滑膜細胞増勢、肉芽組織形成、炎症性細胞浸潤の変化が著しく弱かったことが確認された（図９）。これらの結果から、ＧＣ−Ｂ活性化物質は変形性関節症に対する治療効果を有することが判明した。
さらに、オスモティックポンプを移植した正常マウスの右膝関節に対して前十字靭帯切断、内側則副靭帯切断および内側半月板全切除の外科処置を施し、変形性関節症を惹起し、インフュージョン投与したＣＮＰの変形性関節炎モデルに対する治療効果の検討を行った。その結果、ＣＮＰ投与群のＡＵＣ（曲線下面積）はいずれの用量とも溶媒対照群に対し有意に小さかったことが確認された（図１０）。この結果から、ＧＣ−Ｂ活性化物質が外科処置により惹起される、膝関節への物理的過荷重にもとづく変形性関節症における関節炎症に対しても抑制作用を有することが明らかになった。
さらにまた、コラゲナーゼＯＡモデルマウスに、ＣＮＰを単独でまたは非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）と併用して投与したとき、使用したＮＳＡＩＤ単独では膝関節腫張を抑制しなかったが、ＣＮＰ単独投与では有意に膝関節腫張を抑制し、ＣＮＰとＮＳＡＩＤとの併用投与では、より大きい相乗的腫張抑制効果を示すことが判った（実施例９、図１１）。
さらにまた、関節リウマチ（ＲＡ）モデルとしてラボで汎用されているアジュバント関節炎モデルおよびコラーゲン関節炎モデル（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，２７：７９７−８０６，１９８４；Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，３３：７９８−８０７，１９９４）を用いて、ＣＮＰの効果をさらに調べた結果、ＣＮＰ投与群（ラット）では、関節炎が有意に抑制されるとともに、対照と比べて体重増加が観察され、一般状態の有意な改善が認められた（実施例１０、１１、及び図１２、１３）。これらの結果は、ＣＮＰが関節リウマチによる関節炎に対して効能があることを示している。
このような実証例に基づき、本発明者らは、特定の理論や特定の実験例に拘束されることなく、ＣＮＰなどのＧＣ−Ｂ活性化物質が関節炎症抑制作用と関節軟骨に対する同化的作用の両者を併せもつことを見出した。
したがって、本発明は、ＧＣ−Ｂ活性化物質を有効成分として含むことを特徴とする、関節炎症の治療剤又は予防剤を提供する。
本発明において治療又は予防可能な関節炎症は、特に関節軟骨に関わる疾患であり、例えば、変形性関節症に起因する関節炎症、滑膜炎、関節リウマチ（例えば慢性関節リウマチ（成人）や若年性関節リウマチ（子供））、骨関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、痛風、強皮症、乾癬（乾癬性関節炎）、ブラストミセス症などの真菌感染、強直性脊推炎、ライター症候群、敗血症性関節炎、成人スティル病、第三次ライム病（後期）、結核（結核性関節炎）、ウイルス感染（ウイルス性関節炎）、淋疾（淋菌性関節炎）もしくはバクテリアによる感染（非りん菌性細菌性関節炎）などに起因する関節炎症が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の実施態様において、好ましい関節炎症は変形性関節症、あるいは、変形性関節症に起因する関節炎症である。
変形性関節症は、関節軟骨の変性と破壊に起因する疾患であり、適応可能な変形性関節症には例えば、（１）荷重関節である膝関節、股関節、足関節、脊椎などにおける変形性膝関節症、変形性股関節症、変形性足関節症、及び変形性脊椎症などの荷重関節における変形性関節症、並びに（２）非荷重関節である肩関節、肘関節、手関節、顎関節などにおける変形性肩関節症、変形性肘関節症、変形性手関節症（例えばヘバーデン結節、ブシャール結節、変形性母指ＣＭ関節症など）、顎関節症などの非荷重関節における変形性関節症が含まれる。
本発明の実施態様において、変形性関節症は、荷重関節における変形性関節症であり、好ましくは変形性膝関節症及び変形性股関節症である。
本発明の別の実施態様において、変形性関節症は、非荷重関節における変形性関節症であり、好ましくは顎関節症である。
本発明の治療剤又は予防剤はまた、関節リウマチの治療又は予防にも適応可能である。関節リウマチは、自己免疫疾患であると考えられており、変形性関節症とは病因を異にするが、その病状の進行に伴って変形性関節症と同様に関節軟骨表面の変性と軟骨の破壊が起こる。このため、本発明の治療剤を投与することによって、関節炎症を抑制又は軽減することができる。
本明細書中で使用する「治療」、「治療方法」、「治療剤」なる用語は、本発明に係る関節炎症をもつ患者の症状を除去、抑制又は軽減すること、あるいはそのための方法又は医薬を意味する。また、「予防」、「予防剤」なる用語は、関節炎症を予防すること、あるいはそのための医薬を意味する。
本発明においてグアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）とは、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｂ（ＮＰＲ−Ｂ）と同義の用語として使用する。
本発明においてＧＣ−Ｂ活性とは、グアニルシクラーゼ活性と同義の用語として使用する。本発明において、グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質又はＧＣ−Ｂ活性化物質は、ＣＮＰの受容体として知られるＧＣ−Ｂと結合してこれを活性化するペプチド又は非ペプチド性低分子化合物であり、好ましくはＣＮＰペプチド又はその誘導体である。ここでペプチドは、複数の（Ｌ−、Ｄ−及び／又は修飾）アミノ酸のアミド結合連鎖からなる物質を指し、この中にはポリペプチド及び蛋白質も包含される。ＧＣ−Ｂ活性化物質は、例えば、ＣＯＳ−７等の培養細胞株にＧＣ−Ｂ受容体を発現させ、培地に候補薬剤を添加し、一定の温度及び一定の時間（例えば３７℃、５分後）細胞株を培養したのち、細胞内のｃＧＭＰ産生量を測定する方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１；２５２：１２０−１２３）によって同定されうる。すなわち、このようなアッセイ系を使用して細胞内ｃＧＭＰの産生量を指標としてＧＣ−Ｂ活性化物質を同定し、それを本発明に使用することができる。
本発明の実施態様において、ＧＣ−Ｂ活性化物質は、ペプチドでありＣＮＰ又はその誘導体である。好ましいＣＮＰは、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３から選択されるものであり、さらに好ましくは、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである。あるいは、上記ＣＮＰ誘導体は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列と約７０％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の％同一性を有する配列を含みかつＣＮＰ活性を有するものである。
本明細書中で使用される「１〜数個」という用語は、通常１〜１０、好ましくは１〜５、さらに好ましくは１〜３の任意の整数を表す。また、２つのアミノ酸配列間の「％同一性」は、当業者に公知のＢＬＡＳＴタンパク質検索などの手法を用いて決定することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｇｉｓｈ，Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９０）“Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）。
本発明で使用可能なＣＮＰには、ヒトを含む哺乳類由来ＣＮＰ（ＣＮＰ−２２：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９０；１６８：８６３−８７０，国際公開ＷＯ９１／１６３４２、ＣＮＰ−５３：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９０；１７０：９７３−９７９，特開平４−７４１９８号公報、特開平４−１３９１９９号公報、特開平４−１２１１９０号公報）、鳥類由来ＣＮＰ（特開平４−１２００９４号公報）、両生類由来ＣＮＰ（特開平４−１２００９５号公報）、並びに、特開平６−９６８８号公報、国際公開ＷＯ０２／０７４２３４に開示されるＣＮＰ類似体ペプチドのようなＣＮＰ誘導体が含まれる。
天然由来ＣＮＰとして、２２及び５３アミノ残基からなるＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３が知られており、鳥類及びヒトを含む哺乳類由来の各ＣＮＰを比較すると種を超えて配列相同が高いため、本発明においては、鳥類又はヒトを含む哺乳類由来のＣＮＰ、好ましくはヒトを含む哺乳類由来のＣＮＰ、さらに好ましくはヒト由来のＣＮＰが使用されうる。ヒトＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３のアミノ酸配列は、下記の配列番号１及び配列番号２：
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ（ヒトＣＮＰ−２２：配列番号１）；
Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ（ヒトＣＮＰ−５３：配列番号２）
として示される配列を有しており、いずれも分子内ジスルフィド結合を有し、すなわちヒトＣＮＰ−２２では６位のシステイン残基と２２位のシステイン残基との間で、またヒトＣＮＰ−５３では３７位のシステイン残基と５３位のシステイン残基との間でそれぞれ分子内ジスルフィド結合を有し、環状ペプチド構造を形成している。
ブタＣＮＰ−２２及びラットＣＮＰ−２２は、ヒトＣＮＰ−２２と同一のアミノ酸配列を有するが、一方、ブタＣＮＰ−５３及びラットＣＮＰ−５３では１７位及び２８位のアミノ酸残基がそれぞれＨｉｓ及びＧｌｙであるのに対しヒトＣＮＰ−５３ではそれぞれＧｌｎ及びＡｌａであり、２つのアミノ酸が相違する（特開平４−１３９１９９号公報、特開平４−１２１１９０号公報、特開平４−７４１９８号公報）。さらにまた、ニワトリＣＮＰ−２２は、９位のアミノ酸残基ＶａｌのみがヒトＣＮＰ−２２と異なる以外は同じ一次構造を有している（特開平４−１２００９４号公報）。
本発明で使用しうる上記ＣＮＰは、天然からの精製ＣＮＰ、既知の遺伝子工学的手法で製造された遺伝子組換えＣＮＰ、既知の化学合成法（例えばペプチド合成機を用いる固相合成法）で製造されたＣＮＰを含み、好ましくは遺伝子工学的手法で製造されたヒトＣＮＰ−２２およびヒトＣＮＰ−５３である。遺伝子工学的手法によるヒトＣＮＰの製造は、例えば、ヒトＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３のＤＮＡ配列（特開平４−１３９１９９号公報）をプラスミド、ファージなどのベクターに組み込み、大腸菌や酵母などの原核もしくは真核生物宿主細胞に形質転換したのち、適する培地中で発現し、好ましくは細胞外にＣＮＰペプチドを分泌させ、産生したＣＮＰペプチドを回収し精製する各工程を含む。また、目的ＤＮＡの増幅のために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用することができる。
遺伝子組換え技術、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ技術などの基本的な手法は当業者には公知であり、例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９９８）などに記載されており、そこに開示される技術を本発明のために利用することができる。またベクターとしては、市販のベクターあるいは刊行物記載のベクターが使用できる。
本発明で使用しうるＣＮＰ誘導体は、ＣＮＰ活性を有するとともに、ヒトＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３と同一の２つのシステイン残基間のジスルフィド結合による環状ペプチド構造を有するものであって、上記ＣＮＰのフラグメント、上記ＣＮＰ又はそのフラグメントの構成アミノ酸の少なくとも１つをその他のアミノ酸に置換したペプチド、上記ＣＮＰそのもの又はその部分ペプチドの構成アミノ酸の少なくとも１つを欠失したペプチド、及び上記ＣＮＰそのもの又はその部分ペプチドの構成アミノ酸に１つ以上のアミノ酸を付加したペプチドを含む。アミノ酸の置換、欠失、付加とは、ＣＮＰ活性を損なわない限り、部位特異的突然変異誘発法などの周知の方法にてアミノ酸の置換、欠失又は付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失又は付加されることを意味する。このようなＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３の誘導体は例えば、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである。
アミノ酸の置換については、一般的に保存的アミノ酸置換が好ましい。保存的アミノ酸は、例えば極性度（または疎水性度）や電荷の種類によって分類されることができる。例えば、非極性の非電荷型アミノ酸にはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリンなど、芳香族アミノ酸にはフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、極性の非電荷型アミノ酸にはセリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンなど、負電荷アミノ酸にはアスパラギン酸、グルタミン酸、正電荷アミノ酸にはリジン、アルギニン、ヒスチジンが、それぞれ含まれる。
本発明においてＣＮＰ活性とは、ＧＣ−Ｂに作用してグアニルシクラーゼ活性を上昇させる活性や変形性関節症を含む関節炎症を除去、抑制又は軽減する活性あるいは関節軟骨の増殖を促進させる活性をいう。ＣＮＰ活性は、細胞のグアニルシクラーゼ活性、たとえば細胞内ｃＧＭＰの産生量を測定することによること、及び／又は、マウス、ラットなどの関節炎症、変形性関節症もしくは関節リウマチモデル動物に一定期間ＣＮＰ又はその誘導体を投与したのち、後述の実施例７から１０に記載されるように関節炎症抑制効果又は関節軟骨変性抑制効果の程度を測定すること、によって決定しうる。
ＣＮ−２２類似ペプチドには、例えば特開平６−９６８８号公報や国際公開ＷＯ０２／０７４２３４に記載されるような下記の環状ペプチドが含まれる（なお、配列中の下線はヒトＣＮＰ−２２からの変異を表す）。
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ（配列番号３）
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ（配列番号４）
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ（配列番号５）
Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ（配列番号６）
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ（配列番号７）
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｙｒ（配列番号８）
Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｙｒ（配列番号９）
Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｘａａ Ｘｂｂ ＸｃｃＡｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｘｄｄ Ｘｅｅ Ｓｅｒ Ｘｆｆ Ｘｇｇ Ｇｌｙ Ｃｙｓ（ここで、Ｘａａ＝Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ；Ｘｂｂ＝Ｌｙｓ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ；Ｘｃｃ＝Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ａｌａ，Ｖａｌ；Ｘｄｄ＝Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｔｈｒ，Ａｓｎ；Ｘｅｅ＝Ｍｅｔ，Ａｌａ，Ｔｒｐ，Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ｓｅｒ，Ｇｌｙ；Ｘｆｆ：Ｇｌｙ，Ｌｙｓ，Ａｌａ，Ｌｅｕ；Ｘｇｇ＝Ｌｅｕ，Ｍｅｔである。）（配列番号１０）
また、ＣＮＰ−５３類似ペプチドには、上記のＣＮＰ−２２類似ペプチドに対応するアミノ酸の同様の変異を含む環状ペプチドが含まれる。
本発明はさらに、ＧＣ−Ｂ活性化物質を有効成分として含むことを特徴とする、関節軟骨細胞増殖促進剤を提供する。この発明は、ＧＣ−Ｂ活性化物質が関節軟骨細胞を増加させる働きがあることに基づく。ＧＣ−Ｂ活性化物質の具体例は、上記定義のＣＮＰ又はその誘導体である。ＣＮＰは、好ましくは、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３であり、さらに好ましくは、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である。また、ＣＮＰ誘導体は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものを含む。他のＧＣ−Ｂ活性化物質は、例えば、ＣＯＳ−７等の培養細胞株にＧＣ−Ｂ受容体を発現させ、培地に候補薬剤を添加し、一定の温度及び一定の時間（例えば３７℃、５分後）細胞株を培養したのち、細胞内のｃＧＭＰ産生量を測定する方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１；２５２：１２０−１２３）によって同定されうる。すなわち、このようなアッセイ系を使用して細胞内ｃＧＭＰの産生量を指標としてＧＣ−Ｂ活性化物質を同定し、それを本発明に使用することができる。
本発明はまた、ＧＣ−Ｂを活性化することによって関節炎症を抑制することを特徴とする、関節炎症の抑制方法を提供する。さらに本発明は、ＧＣ−Ｂを活性化することによって関節軟骨細胞の増殖を促進することを特徴とする、関節軟骨細胞の増殖促進方法を提供する。これらの発明は、ＧＣ−Ｂ活性化物質によって、言い換えればＧＣ−Ｂを活性化することによって、上記定義の関節炎症、好ましくは変形性関節症を抑制することができるという知見、また関節軟骨細胞の増殖を促進するという知見に基づく。本発明の実施態様により、ＧＣ−Ｂは、上記定義のＣＮＰ又はその誘導体によって活性化されうる。
本発明はさらに、ＧＣ−Ｂの活性を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む、関節軟骨細胞増殖促進剤のスクリーニング方法を提供する。ＧＣ−Ｂは、グアニルシクラーゼ活性によりＧＴＰからセカンドメッセンジャーであるｃＧＭＰの合成を触媒することが知られているので、ＧＣ−Ｂの活性は、細胞内ｃＧＭＰ産生量として測定されうる。
本発明の実施態様において、上記スクリーニング方法は、ＧＣ−Ｂを発現する細胞や関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞のグアニルシクラーゼ活性、たとえば細胞内ｃＧＭＰの産生量を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることからなる工程を含むことができる。
本発明の実施態様においてより好ましくは、ＧＣ−Ｂを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内ｃＧＭＰの産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内ｃＧＭＰ産生量の差を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む。
本発明のスクリーニング方法は、例えば、ＣＯＳ−７等の培養細胞株にＧＣ−Ｂを発現させ、培地に候補薬剤を添加し、一定の温度及び一定の時間（例えば３７℃、５分間）細胞株を培養したのち、細胞内のｃＧＭＰ産生量を測定する方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１；２５２：１２０−１２３）によって関節軟骨細胞増殖促進剤をスクリーニングすることができる。
本発明はさらに、ＧＣ−Ｂの活性を指標として、変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤のスクリーニング方法を提供する。上記と同様に、ＧＣ−Ｂの活性は、グアニルシクラーゼ活性、たとえば細胞内ｃＧＭＰ産生量として測定されうる。
本発明の実施態様において、上記スクリーニング方法は、ＧＣ−Ｂを発現する培養細胞や関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞のグアニルシクラーゼ活性、たとえば細胞内ｃＧＭＰの産生量を指標として変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることからなる方法を含むことができる。
本発明の実施態様においてより好ましくは、ＧＣ−Ｂを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内ｃＧＭＰの産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内ｃＧＭＰ産生量の差を指標として変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む。
本発明のスクリーニング方法は、例えば、ＣＯＳ−７等の培養細胞株にＧＣ−Ｂを発現させ、培地に候補薬剤を添加し、一定の温度及び一定の時間（例えば３７℃、５分間）細胞株を培養したのち、細胞内のｃＧＭＰ産生量を測定する方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１；２５２：１２０−１２３）によって変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤をスクリーニングすることができる。
本発明の変形性関節症等の関節炎症の治療剤又は予防剤は、有効成分としての上記定義のＧＣ−Ｂ活性化物質を、製薬上許容可能な担体、賦形剤、添加剤などと組み合わせて、経口投与用又は非経口投与用に製剤化される。
製剤用の担体や賦形剤としては、例えば、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、オリーブ油、ゴマ油、カカオバター、エチレングリコールなどやその他常用されるものをあげることができる。
経口投与のための固体組成物としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤などが用いられる。このような固体組成物においては、少なくともひとつの有効成分が少なくともひとつの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶性セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合される。組成物は、常法にしたがって不活性な希釈剤以外の添加物、例えば、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、繊維素グリコール酸カルシウムのような崩壊剤、グルタミン酸又はアスパラギン酸のような溶解補助剤を含んでいてもよい。錠剤又は丸剤は、必要によりショ糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートなどの糖衣や胃溶性又は腸溶性物質のフィルムで被覆してもよいし、２つ以上の層で被覆してもよい。さらに、ゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも含まれる。
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤などを含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水、エタノールなどを含んでいてもよい。この組成物は、不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤などを含んでいてもよい。
非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤が含まれる。水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば、注射用水及び注射用生理食塩液が含まれる。非水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート８０（登録商標）などが含まれる。このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えば、乳糖）、溶解補助剤（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）のような補助剤を含んでいてもよい。これらは、例えば、精密ろ過膜によるろ過滅菌、高圧蒸気滅菌のような加熱滅菌、あるいは、殺菌剤の配合などの通常の滅菌方法によって無菌化することが可能である。注射剤は溶液製剤であっても、使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥のための賦形剤としては例えばマンニトール、ブドウ糖などの糖アルコールや糖類を使用することができる。
本発明の治療剤又は予防剤は、医薬に一般に使用されている経口投与方法又は非経口投与方法のいずれかによって投与される。好ましくは非経口投与方法、例えば注射による投与（皮下注射、静脈注射、筋肉注射、腹腔内への注射などによる投与）、経皮投与、経粘膜投与（経鼻投与、経直腸投与など）、経肺投与などであるが、経口投与方法による投与も可能である。
本発明の製剤中に含まれる有効成分であるＧＣ−Ｂ活性化物質、好ましくは上記定義のＣＮＰ又はその誘導体、の量は、治療すべき疾患の種類、疾患の重症度、患者の年齢などに応じて決定できるが、一般に０．００５μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲で投与することができるが、０．０２μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇで投与することが好ましい。さらに０．０２μｇ／ｋｇ〜０．２５ｍｇ／ｋｇでの投与が好ましい。しかしながら本発明のＣＮＰを含有する薬剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
本発明の治療剤又は予防剤は、抗炎症薬、ヒアルロン酸や副腎皮質ステロイドなどの従来又は新規の治療剤と組み合わせたり、また関節鏡視下手術、人工関節置換や骨切り術などの整形外科手術と組み合わせて使用することができる。
特に、抗炎症薬、例えば少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をＧＣ−Ｂ活性化物質（例えば、上記定義のＣＮＰ又はその誘導体）と併用するときには、関節炎に対する相乗的抑制効果がある（実施例１０）。
本明細書で使用する「非ステロイド性抗炎症薬」は、ステロイド骨格をもたない抗炎症薬を指し、プロスタグランジンの産生に関わるシクロオキシゲナーゼ酵素を抑制する作用をもつものが好ましい。本発明で使用可能な非ステロイド性抗炎症薬には、以下のものに限定されないが、例えばインドメタシン（インダシン（商標）など）、イブプロフェン（ブルフェン（商標）など）、ピロキシカム、サリチル酸、ジクロフェナク（ボルタレン（商標）など）、ケトプロフェン、ナプロキセン、ピロキシカムなどを含む。
さらにまた、上記のＧＣ−Ｂ活性化物質を非ステロイド性抗炎症薬と併用するときの相乗効果は、ＧＣ−Ｂ活性化物質を単独に使用したときと比べてＧＣ−Ｂの活性化が促進されること、言い換えれば、上記の非ステロイド性抗炎症薬の有効成分がＧＣ−Ｂ活性化物質によるＧＣ−Ｂの活性化の際の活性化促進剤となること、を示している。
したがって、本発明はさらに、非ステロイド性活性化剤を含む、ＧＣ−Ｂ活性化物質に対する活性化促進剤を提供する。
ＧＣ−Ｂ活性化物質には、上述したような、ＣＮＰ又はその誘導体が含まれる。ＣＮＰの例は、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３であり、さらに具体的には、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である。また、ＣＮＰの誘導体の例は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである。
本発明において、上記非ステロイド性活性化剤は、好ましくはシクロオキシゲナーゼ酵素抑制剤である。シクロオキシゲナーゼ酵素抑制剤には、例えばインドメタシン、イブプロフェン、ピロキシカム、サリチル酸、ジクロフェナク、ケトプロフェン、ナプロキセン、ピロキシカムなどが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の活性化促進剤の剤型、用量、投与方法は、本発明の治療剤及び予防剤について上で説明した事項をそのまま適用できる。
本発明はまた、上記の活性化促進剤を使用することを特徴とするＧＣ−Ｂ活性化物質の活性化方法も提供する。
上記の本発明の活性化促進剤および方法は、患者において、例えばＧＣ−Ｂ活性化を介して関節炎症などの疾患を治療する場合などに有効に使用することができる。
本発明として以下の事項を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
（１）グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質を有効成分として含むことを特徴とする、関節炎症の治療剤又は予防剤。
（２）上記関節炎症が変形性関節症である、上記（１）に記載の治療剤又は予防剤。
（３）上記変形性関節症が荷重関節の変形性関節症又は非荷重関節の変形性関節症である、上記（２）に記載の治療剤又は予防剤。
（４）上記変形性関節症が変形性膝関節症である、上記（３）に記載の治療剤又は予防剤。
（５）上記変形性関節症が変形性股関節症である、上記（３）に記載の治療剤又は予防剤。
（６）上記変形性関節症が顎関節症である、上記（３）に記載の治療剤又は予防剤。
（７）上記関節炎症が関節リウマチに起因する、上記（１）に記載の治療剤又は予防剤。
（８）上記関節炎症が変形性関節症に起因する、上記（１）に記載の治療剤又は予防剤。
（９）上記ＧＣ−Ｂ活性化物質が、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）又はその誘導体である、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の治療剤又は予防剤。
（１０）上記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３から選択される、上記（９）に記載の治療剤又は予防剤。
（１１）上記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である、上記（９）に記載の治療剤又は予防剤。
（１２）上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである、上記（９）に記載の治療剤又は予防剤。
（１３）少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含む、上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の治療剤又は予防剤。
（１４）ＧＣ−Ｂ活性化物質を有効成分として含むことを特徴とする、関節軟骨細胞増殖促進剤。
（１５）前記ＧＣ−Ｂ活性化物質が、ＣＮＰ又はその誘導体である、上記（１４）に記載の増殖促進剤。
（１６）前記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３である、上記（１５）に記載の増殖促進剤。
（１７）前記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である、上記（１５）に記載の増殖促進剤。
（１８）前記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである、上記（１５）に記載の増殖促進剤。
（１９）少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含む、上記（１４）〜（１８）のいずれかに記載の増殖促進剤。
（２０）ＧＣ−Ｂを活性化することによって関節炎症を抑制することを特徴とする、関節炎症の抑制方法。
（２１）前記ＧＣ−Ｂが、ＣＮＰ又はその誘導体によって活性化される、上記（２０）に記載の抑制方法。
（２２）前記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３である、上記（２１）に記載の抑制方法。
（２３）前記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である、上記（２１）に記載の抑制方法。
（２４）前記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである、請求項２１に記載の抑制方法。
（２５）前記ＧＣ−Ｂが、ＣＮＰ又はその誘導体と少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬との組み合わせによって活性化される、上記（２０）〜（２４）のいずれかに記載の抑制方法。
（２６）ＧＣ−Ｂを活性化することによって関節軟骨細胞の増殖を促進することを特徴とする、関節軟骨細胞の増殖促進方法。
（２７）前記ＧＣ−Ｂが、ＣＮＰ又はその誘導体によって活性化される、上記（２６）に記載の増殖促進方法。
（２８）前記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３である、上記（２７）に記載の増殖促進方法。
（２９）前記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である、上記（２７）に記載の増殖促進方法。
（３０）前記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである、上記（２７）に記載の増殖促進方法。
（３１）前記ＧＣ−Ｂが、ＣＮＰ又はその誘導体と少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬との組み合わせによって活性化される、上記（２６）〜（３０）のいずれかに記載の増殖促進方法。
（３２）ＧＣ−Ｂの活性を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む、関節軟骨細胞増殖促進剤のスクリーニング方法。
（３３）ＧＣ−Ｂを発現する培養細胞又は関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞のＧＣ−Ｂ活性を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む、上記（３２）に記載のスクリーニング方法。
（３４）前記ＧＣ−Ｂ活性が、細胞内ｃＧＭＰ産生量として測定される、上記（３２）又は（３３）に記載のスクリーニング方法。
（３５）ＧＣ−Ｂを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内ｃＧＭＰの産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内ｃＧＭＰ産生量の差を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む、上記（３２）〜（３４）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（３６）ＧＣ−Ｂの活性を指標として、変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤のスクリーニング方法。
（３７）ＧＣ−Ｂを発現する培養細胞又は関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞のＧＣ−Ｂ活性を指標として変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、上記（３６）に記載のスクリーニング方法。
（３８）前記ＧＣ−Ｂ活性が、細胞内ｃＧＭＰ産生量として測定される、上記（３６）又は（３７）に記載のスクリーニング方法。
（３９）ＧＣ−Ｂを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内ｃＧＭＰの産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内ｃＧＭＰ産生量の差を指標として変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、上記（３６）〜（３８）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（４０）グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質を有効成分として含む、変形性関節症の治療剤又は予防剤。
（４１）少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含む、上記（４０）に記載の変形性関節症の治療剤又は予防剤。
（４２）グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質を有効成分として含む、関節リウマチの治療剤又は予防剤。
（４３）少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含む、請求項４２に記載の、関節リウマチの治療剤又は予防剤。
（４４）関節炎症の治療を必要とする患者にＧＣ−Ｂ活性化物質を投与することを含む、該関節炎症の治療方法。
（４５）上記ＧＣ−Ｂ活性化物質がＣＮＰ又はその誘導体である、上記（４４）に記載の治療方法。
（４６）上記関節炎症が変形性関節症である、上記（４４）又は（４５）に記載の治療方法。
（４７）上記変形性関節症が荷重関節の変形性関節症又は非荷重関節の変形性関節症である、上記（４６）に記載の治療方法。
（４８）上記変形性関節症が変形性膝関節症、変形性股関節症又は顎関節症である、上記（４７）に記載の治療方法。
（４９）上記関節炎症が関節リウマチに起因する、上記（４４）に記載の治療方法。
（５０）上記関節炎症が変形性関節症に起因する、上記（４４）に記載の治療方法。
（５１）上記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３から選択される、上記（４５）〜（５０）のいずれかに記載の治療方法。
（５２）上記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である、上記（４５）〜（５０）のいずれかに記載の治療方法。
（５３）上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである、上記（４５）〜（５０）のいずれかに記載の治療方法。
（５４）上記ＧＣ−Ｂ活性化物質を、少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬と組み合わせて含む、上記（４４）〜（５３）のいずれかに記載の治療方法。
（５５）非ステロイド性活性化剤を含む、ＧＣ−Ｂ活性化物質に対する活性化促進剤。
（５６）上記ＧＣ−Ｂ活性化物質が、ＣＮＰ又はその誘導体である、上記（５５）に記載の活性化促進剤。
（５７）上記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３から選択される、上記（５６）に記載の活性化促進剤。
（５８）上記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である、上記（５６）に記載の活性化促進剤。
（５９）上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである、上記（５６）に記載の活性化促進剤。
（６０）上記非ステロイド性活性化剤がシクロオキシゲナーゼ酵素抑制剤である、上記（５５）に記載の活性化促進剤。
（６１）上記シクロオキシゲナーゼ酵素抑制剤がインドメタシン、イブプロフェン、ピロキシカム、サリチル酸、ジクロフェナク、ケトプロフェン、ナプロキセン及びピロキシカムからなる群より選択される、上記（６０）に記載の活性化促進剤。
（６２）上記（５５）〜（６１）のいずれかに記載の活性化促進剤を使用することを特徴とする、ＧＣ−Ｂ活性化物質の活性化方法。
以下の実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は単に例示を目的としたものであって、本発明を制限するものではない。それゆえ、本発明は、これらの実施例によって制限されないものとする。
ＣＮＰ トランスジェニックマウス作製用ベクターの構築
図１Ａに示すように、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にマウスＣＮＰ ｃＤＮＡ（５２６ｂｐ；ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２７６：２０９−２１３，１９９０）をサブクローニングさせたものをＰｓｔ Ｉで切断し、断端を平滑化してマウスＣＮＰ ｃＤＮＡを調製した。ＰＳＧ１ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製；図１Ｂ）をＥｃｏ ＲＩで切断し断端を平滑化して、図１ＣのようにマウスＣＮＰ ｃＤＮＡをｌｉｇａｔｉｏｎし、ＳＡＰ−ｍＣＮＰベクター（ｐＳＧ１−ＣＮＰ）を作製した。
図１Ａに示すように、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にマウスＣＮＰ ｃＤＮＡ（５２６ｂｐ；ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２７６：２０９−２１３，１９９０）をサブクローニングさせたものをＰｓｔ Ｉで切断し、断端を平滑化してマウスＣＮＰ ｃＤＮＡを調製した。ＰＳＧ１ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製；図１Ｂ）をＥｃｏ ＲＩで切断し断端を平滑化して、図１ＣのようにマウスＣＮＰ ｃＤＮＡをｌｉｇａｔｉｏｎし、ＳＡＰ−ｍＣＮＰベクター（ｐＳＧ１−ＣＮＰ）を作製した。
ＣＮＰ トランスジェニックマウスの作製
インジェクション用ＤＮＡフラグメントは、次のようにして調製した。まずＣＮＰ遺伝子を挿入したＳＡＰ−ｍＣＮＰベクター（ｐＳＧ１−ＣＮＰ；図１Ｃ）を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで処理した後、ＣＮＰ遺伝子を含む断片（約２．３ｋｂ）を切り出した。この断片を、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により回収し、３ｎｇ／μｌになるようにＰＢＳ−で希釈してインジェクション用ＤＮＡフラグメント（図２）とした。
ＤＮＡフラグメントを注入するマウス前核期卵は、次のようにして回収した。すなわち、まずＣ５７ＢＬ／６雌マウス（日本クレア）に５ｉ．ｕの妊馬血清性性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ）を腹腔内投与、さらに４８時間後５ｉ．ｕのヒト絨毛ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を腹腔内投与することによって、過排卵処理した。この雌マウスを同系統の雄マウスと交配させた。交配の翌朝、プラグを確認したマウスの卵管を潅流してマウス前核期卵を回収した。
インジェクション用ＤＮＡフラグメントは、マイクロマニピュレーターを用いて前核期卵へ注入した（ジーンターゲティングの最新技術（羊土社）、１９０−２０７、２０００）。ＤＮＡフラグメントを６６０個のＣ５７ＢＬ／６Ｊ胚へ注入し、翌日、２細胞期に発生していた胚５６１個を、偽妊娠１日目の受容雌の卵管に片側当たり１０個前後（１匹あたり２０個前後）を移植した。
分娩予定日に至っても産仔を娩出しなかった受容雌については、帝王切開を施し里親に哺育させた。１３６例の産仔が得られ、そのうちの５例がＣＮＰ遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスであった。以下、最初に得られたマウスをＦｏｕｎｄｅｒと記載する。
Ｆｏｕｎｄｅｒは全て雄マウスで、これら５ラインのうち４ラインから、次世代（Ｆ１マウス）の産仔が得られた。
インジェクション用ＤＮＡフラグメントは、次のようにして調製した。まずＣＮＰ遺伝子を挿入したＳＡＰ−ｍＣＮＰベクター（ｐＳＧ１−ＣＮＰ；図１Ｃ）を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで処理した後、ＣＮＰ遺伝子を含む断片（約２．３ｋｂ）を切り出した。この断片を、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により回収し、３ｎｇ／μｌになるようにＰＢＳ−で希釈してインジェクション用ＤＮＡフラグメント（図２）とした。
ＤＮＡフラグメントを注入するマウス前核期卵は、次のようにして回収した。すなわち、まずＣ５７ＢＬ／６雌マウス（日本クレア）に５ｉ．ｕの妊馬血清性性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ）を腹腔内投与、さらに４８時間後５ｉ．ｕのヒト絨毛ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を腹腔内投与することによって、過排卵処理した。この雌マウスを同系統の雄マウスと交配させた。交配の翌朝、プラグを確認したマウスの卵管を潅流してマウス前核期卵を回収した。
インジェクション用ＤＮＡフラグメントは、マイクロマニピュレーターを用いて前核期卵へ注入した（ジーンターゲティングの最新技術（羊土社）、１９０−２０７、２０００）。ＤＮＡフラグメントを６６０個のＣ５７ＢＬ／６Ｊ胚へ注入し、翌日、２細胞期に発生していた胚５６１個を、偽妊娠１日目の受容雌の卵管に片側当たり１０個前後（１匹あたり２０個前後）を移植した。
分娩予定日に至っても産仔を娩出しなかった受容雌については、帝王切開を施し里親に哺育させた。１３６例の産仔が得られ、そのうちの５例がＣＮＰ遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスであった。以下、最初に得られたマウスをＦｏｕｎｄｅｒと記載する。
Ｆｏｕｎｄｅｒは全て雄マウスで、これら５ラインのうち４ラインから、次世代（Ｆ１マウス）の産仔が得られた。
ＣＮＰ トランスジェニックマウスの遺伝子型解析
遺伝子型解析は下記に示す手順に従ってサザンブロット法によって行った。３週齢になったマウスの尾（約１５ｍｍ）を採取してｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ処理（５５℃、１００ｒｐｍで１昼夜振盪）して溶解液を得た。この溶解液を核酸自動分離装置（ＫＵＲＡＢＯＮＡ−１０００）にかけてゲノムＤＮＡを調製した。ゲノムＤＮＡ１５μｇをＰｖｕ ＩＩ（２００Ｕ）で処理してからフェノール・クロロホルム処理によって制限酵素を除いた後にエタノール沈殿でＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡを２５μＬのＴＥに溶解して０．７％アガロースゲル電気泳動（５０Ｖ定電圧）にかけ、泳動終了後、ゲルを０．２５Ｍ ＨＣｌ溶液で１５分間処理してＤＮＡを切断し、水洗してから０．４Ｍ ＮａＯＨ溶液でナイロンメンブレンに一晩ブロッティングした。その後、メンブレン上のＤＮＡをＵＶクロスリンク法で固定した。メンブレンをハイブリダイゼーション溶液（５０％ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、０．５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．５％ ＳＤＳ、５ｘＳＳＰＥ）で処理（４２℃、２時間）してから、ＣＮＰのｃＤＮＡ（約０．５ｋｂ）を鋳型としてＢｃａＢＥＳＴ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）で調製した３２ｐ標識プローブを加えて４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした。その後、洗浄溶液（２ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ）で５５℃、２０分間処理してからＩｍａｇｉｎｇ Ｐｌａｔｅ（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ）に一晩露光し、導入遺伝子のシグナルをＢＡＳ２０００（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ）で検出した（図３）。野生型マウス（ＷＴ）では３本のシグナル（野生型ＣＮＰ遺伝子）が検出され、トランスジェニックマウスでは野生型ＣＮＰ遺伝子に加えて、導入遺伝子由来のシグナル（トランスジーン）が２本検出された。
遺伝子型解析は下記に示す手順に従ってサザンブロット法によって行った。３週齢になったマウスの尾（約１５ｍｍ）を採取してｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ処理（５５℃、１００ｒｐｍで１昼夜振盪）して溶解液を得た。この溶解液を核酸自動分離装置（ＫＵＲＡＢＯＮＡ−１０００）にかけてゲノムＤＮＡを調製した。ゲノムＤＮＡ１５μｇをＰｖｕ ＩＩ（２００Ｕ）で処理してからフェノール・クロロホルム処理によって制限酵素を除いた後にエタノール沈殿でＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡを２５μＬのＴＥに溶解して０．７％アガロースゲル電気泳動（５０Ｖ定電圧）にかけ、泳動終了後、ゲルを０．２５Ｍ ＨＣｌ溶液で１５分間処理してＤＮＡを切断し、水洗してから０．４Ｍ ＮａＯＨ溶液でナイロンメンブレンに一晩ブロッティングした。その後、メンブレン上のＤＮＡをＵＶクロスリンク法で固定した。メンブレンをハイブリダイゼーション溶液（５０％ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、０．５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．５％ ＳＤＳ、５ｘＳＳＰＥ）で処理（４２℃、２時間）してから、ＣＮＰのｃＤＮＡ（約０．５ｋｂ）を鋳型としてＢｃａＢＥＳＴ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）で調製した３２ｐ標識プローブを加えて４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした。その後、洗浄溶液（２ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ）で５５℃、２０分間処理してからＩｍａｇｉｎｇ Ｐｌａｔｅ（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ）に一晩露光し、導入遺伝子のシグナルをＢＡＳ２０００（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ）で検出した（図３）。野生型マウス（ＷＴ）では３本のシグナル（野生型ＣＮＰ遺伝子）が検出され、トランスジェニックマウスでは野生型ＣＮＰ遺伝子に加えて、導入遺伝子由来のシグナル（トランスジーン）が２本検出された。
ＣＮＰ トランスジェニックマウスにおけるＣＮＰの発現
ＣＮＰ濃度の測定には、ＣＮＰ−２２ ＥＩＡ測定キット（ＰＨＯＥＮＩＸ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＩＮＣ．社製）を用いた。
７週齢の雌雄ＣＮＰ トランスジェニックマウスおよび雌雄の正常同腹マウス各３例をエーテル麻酔下で後大静脈から全採血して安楽死させた。
導入した遺伝子の高発現が予想される臓器である肝臓を採取し、肝重量０．１ｇに対して、上記測定キットのＥＩＡ ａｓｓａｙバッファー１ｍＬを加え氷冷した。ワーリングブレンダー（ヒスコトロン社製）でホモジナイズし、遠心分離（２，０００ｒｐｍ、５分間）した上清をＣＮＰ−２２濃度測定サンプルとした。
採取した血液に、１ｍｇのエチレンジアミン４酢酸・４ナトリウム塩（純正化学社製）と２トリプシン阻害単位のアプロチニン（Ｓｉｇｍａ社製）を添加して攪拌して血漿を分離し、ＣＮＰ−２２濃度測定サンプルとした。
測定結果を表１に示した。
ＣＮＰ トランスジェニックマウス（ＣＮＰ ｔｇｍ）は野生型（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）に対する平均値±標準偏差（ｍｅａｎ±ＳＤ）の比較では肝臓（Ｌｉｖｅｒ）で約１０倍、血漿（Ｐｌａｓｍａ）で約２４倍のＣＮＰ−２２濃度を示しており、いずれも統計学的に有意な差であった。これらの結果より、ＣＮＰ トランスジェニックマウスにおいて、ＣＮＰペプチドが過剰発現されていることが確認された。
ＣＮＰ濃度の測定には、ＣＮＰ−２２ ＥＩＡ測定キット（ＰＨＯＥＮＩＸ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＩＮＣ．社製）を用いた。
７週齢の雌雄ＣＮＰ トランスジェニックマウスおよび雌雄の正常同腹マウス各３例をエーテル麻酔下で後大静脈から全採血して安楽死させた。
導入した遺伝子の高発現が予想される臓器である肝臓を採取し、肝重量０．１ｇに対して、上記測定キットのＥＩＡ ａｓｓａｙバッファー１ｍＬを加え氷冷した。ワーリングブレンダー（ヒスコトロン社製）でホモジナイズし、遠心分離（２，０００ｒｐｍ、５分間）した上清をＣＮＰ−２２濃度測定サンプルとした。
採取した血液に、１ｍｇのエチレンジアミン４酢酸・４ナトリウム塩（純正化学社製）と２トリプシン阻害単位のアプロチニン（Ｓｉｇｍａ社製）を添加して攪拌して血漿を分離し、ＣＮＰ−２２濃度測定サンプルとした。
測定結果を表１に示した。
ＣＮＰ トランスジェニックマウス関節軟骨の組織学的解析
関節軟骨の厚さおよび軟骨細胞数を組織学的に解析する目的で、９週齢のＣＮＰ トランスジェニックマウスおよび同腹の正常マウスの雌各５例、計１０例をエーテル麻酔下で後大静脈から全採血して安楽死させ、大腿骨を２０％ホルマリンにより１週間固定した。その後２０％ＥＤＴＡ−４Ｎａ（純正化学社製）水溶液（ｐＨ７．４）に浸漬して脱灰した後、大腿骨膝蓋面を正中矢状断して常法に従いパラフィン包埋し、パラフィンブロックを作製した。厚さ４ｍｍの切片をミクロトームを用いて薄切してパラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色した。関節軟骨の厚さは、対物レンズ１０倍での１視野を画像解析ソフト（ＩＰＡＰ，住化テクノサービス社製）に取り込み、同ソフトを用いて視野中の５点について長さを計測して平均値を算出し、その個体の関節軟骨の厚さとした。この計測に用いた同一の視野について、軟骨細胞数を計測した。これら項目について、同性の正常マウスとＣＮＰ トランスジェニックマウスの間で平均値および標準偏差を算出し（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ２０００，マイクロソフト社製）、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって統計学的解析を行った（ＳＡＳ ｖｅｒ．６．１２，ＳＡＳ インスティチュートジャパン社製）。
関節軟骨の厚さは、雌雄ともにＣＮＰ トランスジェニックマウスにおいて統計学的に有意に厚いことが判明した（図４）。また、１視野あたりの関節軟骨細胞数も雌雄ともにＣＮＰ トランスジェニックマウスにおいて統計学的に有意に多いことが判明した（図５）。
これらの結果から、ＣＮＰなどのＧＣ−Ｂ（ＮＰＲ−Ｂ）を活性化する物質が、公知である個々の軟骨細胞の肥大化［Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００３；２７８（２１）：１８８２４−３２］による細胞容積の増加でなく、軟骨細胞数の増加を伴って関節軟骨の厚さを増加させることが明らかになった。
関節軟骨の厚さおよび軟骨細胞数を組織学的に解析する目的で、９週齢のＣＮＰ トランスジェニックマウスおよび同腹の正常マウスの雌各５例、計１０例をエーテル麻酔下で後大静脈から全採血して安楽死させ、大腿骨を２０％ホルマリンにより１週間固定した。その後２０％ＥＤＴＡ−４Ｎａ（純正化学社製）水溶液（ｐＨ７．４）に浸漬して脱灰した後、大腿骨膝蓋面を正中矢状断して常法に従いパラフィン包埋し、パラフィンブロックを作製した。厚さ４ｍｍの切片をミクロトームを用いて薄切してパラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色した。関節軟骨の厚さは、対物レンズ１０倍での１視野を画像解析ソフト（ＩＰＡＰ，住化テクノサービス社製）に取り込み、同ソフトを用いて視野中の５点について長さを計測して平均値を算出し、その個体の関節軟骨の厚さとした。この計測に用いた同一の視野について、軟骨細胞数を計測した。これら項目について、同性の正常マウスとＣＮＰ トランスジェニックマウスの間で平均値および標準偏差を算出し（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ２０００，マイクロソフト社製）、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって統計学的解析を行った（ＳＡＳ ｖｅｒ．６．１２，ＳＡＳ インスティチュートジャパン社製）。
関節軟骨の厚さは、雌雄ともにＣＮＰ トランスジェニックマウスにおいて統計学的に有意に厚いことが判明した（図４）。また、１視野あたりの関節軟骨細胞数も雌雄ともにＣＮＰ トランスジェニックマウスにおいて統計学的に有意に多いことが判明した（図５）。
これらの結果から、ＣＮＰなどのＧＣ−Ｂ（ＮＰＲ−Ｂ）を活性化する物質が、公知である個々の軟骨細胞の肥大化［Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００３；２７８（２１）：１８８２４−３２］による細胞容積の増加でなく、軟骨細胞数の増加を伴って関節軟骨の厚さを増加させることが明らかになった。
ＣＮＰ トランスジェニックマウスの変形性関節炎モデルに対する抵抗性
膝関節内へのコラゲナーゼ注射により膝関節の靭帯および半月板を不安定化させ変形性関節症を惹起する変形性関節炎動物モデル［Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９８９；１３５：１００１−１４］を作成した。ＣＮＰの変形性関節炎に対する予防及び治療効果を確認する目的で、ＣＮＰ トランスジェニックマウスを用いた変形性関節炎動物モデルの関節炎症および関節軟骨変性に対する抵抗性を評価した。ＣＮＰ トランスジェニックマウスおよび同腹の野生型Ｃ５７ＢＬ／６系マウスの右膝関節内に６マイクロリットルの３％タイプＩＩコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）生理食塩溶液を２回投与（投与開始当日と投与開始後７日）した。左右の膝関節幅をノギス（ミツトヨ社製）を用いて投与後２８日まで経時的に測定し、左右の差を算出して膝関節腫脹を表す値とした。その経時的推移曲線下面積（ＡＵＣ）を台形法により算出し、ＣＮＰ トランスジェニックマウスと野生型マウスの間でＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定で比較した。その結果、ＣＮＰ トランスジェニックマウスにおけるＡＵＣは野生型よりも有意に小さく、ＣＮＰ トランスジェニックマウスがコラゲナーゼによる膝関節腫脹に抵抗性であることが判明した（図６）。関節炎症および関節軟骨変性を病理組織学的に評価するため、コラゲナーゼ投与後２８日にエーテル麻酔下に全採血による安楽死後に膝関節を採取し、実施例５に記載した方法でヘマトキシリン・エオジン染色標本およびサフラニン０染色標本を作成し、組織学的に解析した。その結果、野生型マウスではコラゲナーゼにより滑膜における滑膜細胞増勢、肉芽組織形成、炎症性細胞浸潤が顕著であったのに対し、ＣＮＰ トランスジェニックマウスではこれら変化が著しく弱かった（図７）。関節軟骨変性については、野生型マウスではサフラニン０染色性が低下し、関節軟骨中のプロテオグリカン含量が低下したのに対し、ＣＮＰ トランスジェニックマウスではその変化は軽微であり、ＣＮＰ トランスジェニックマウスはコラゲナーゼ投与による関節軟骨変性に抵抗性であることが病理組織学的に示された（図８）。このとき、血漿中ＣＮＰ濃度をＥＩＡキット（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社製）を用いて測定したところ、野生型マウスの平均値は０．２１ｎｇ／ｍＬであったのに対し、ＣＮＰ トランスジェニックマウスでは０．５０ｎｇ／ｍＬであった。
これらの結果から、ＣＮＰの変形性関節症における関節炎症抑制作用と関節軟骨変性抑制作用を有することが判明した。
膝関節内へのコラゲナーゼ注射により膝関節の靭帯および半月板を不安定化させ変形性関節症を惹起する変形性関節炎動物モデル［Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９８９；１３５：１００１−１４］を作成した。ＣＮＰの変形性関節炎に対する予防及び治療効果を確認する目的で、ＣＮＰ トランスジェニックマウスを用いた変形性関節炎動物モデルの関節炎症および関節軟骨変性に対する抵抗性を評価した。ＣＮＰ トランスジェニックマウスおよび同腹の野生型Ｃ５７ＢＬ／６系マウスの右膝関節内に６マイクロリットルの３％タイプＩＩコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）生理食塩溶液を２回投与（投与開始当日と投与開始後７日）した。左右の膝関節幅をノギス（ミツトヨ社製）を用いて投与後２８日まで経時的に測定し、左右の差を算出して膝関節腫脹を表す値とした。その経時的推移曲線下面積（ＡＵＣ）を台形法により算出し、ＣＮＰ トランスジェニックマウスと野生型マウスの間でＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定で比較した。その結果、ＣＮＰ トランスジェニックマウスにおけるＡＵＣは野生型よりも有意に小さく、ＣＮＰ トランスジェニックマウスがコラゲナーゼによる膝関節腫脹に抵抗性であることが判明した（図６）。関節炎症および関節軟骨変性を病理組織学的に評価するため、コラゲナーゼ投与後２８日にエーテル麻酔下に全採血による安楽死後に膝関節を採取し、実施例５に記載した方法でヘマトキシリン・エオジン染色標本およびサフラニン０染色標本を作成し、組織学的に解析した。その結果、野生型マウスではコラゲナーゼにより滑膜における滑膜細胞増勢、肉芽組織形成、炎症性細胞浸潤が顕著であったのに対し、ＣＮＰ トランスジェニックマウスではこれら変化が著しく弱かった（図７）。関節軟骨変性については、野生型マウスではサフラニン０染色性が低下し、関節軟骨中のプロテオグリカン含量が低下したのに対し、ＣＮＰ トランスジェニックマウスではその変化は軽微であり、ＣＮＰ トランスジェニックマウスはコラゲナーゼ投与による関節軟骨変性に抵抗性であることが病理組織学的に示された（図８）。このとき、血漿中ＣＮＰ濃度をＥＩＡキット（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社製）を用いて測定したところ、野生型マウスの平均値は０．２１ｎｇ／ｍＬであったのに対し、ＣＮＰ トランスジェニックマウスでは０．５０ｎｇ／ｍＬであった。
これらの結果から、ＣＮＰの変形性関節症における関節炎症抑制作用と関節軟骨変性抑制作用を有することが判明した。
インフュージョン投与したＣＮＰの変形性関節炎モデルに対する治療効果（１）
９週齢のＣ５７ＢＬ／６ Ｊ系の雄マウスの背部皮下に、以下の溶液を含むオスモティックポンプ（２００４型、Ｄｕｒｅｃｔ社製）を移植した。
・溶媒：５％ デキストロース（純正化学社製）、１０％ マンノース（ナカライテスク社製）および５ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸（和光純薬社製）を含有する蒸留水。
・ＣＮＰ−２２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製）１０ｍｇ／ｍＬ溶液（６０ｎｇ／日）。
・ＣＮＰ−２２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製）１００ｍｇ／ｍＬ溶液（６００ｎｇ／日）。
移植後６日に１．５％タイプＩＩコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）溶液６ｍＬを右膝関節内に投与し、６日後まで膝左右の膝関節幅をノギス（ミツトヨ社製）を用いて投与後２８日まで経時的に測定し、左右の差を算出した。この差を膝関節腫脹を表す値とし、そのＡＵＣを溶媒対照群とＣＮＰ投与群の間でＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定で比較した（ＳＡＳｖｅｒ．６．１２）。その結果、ＣＮＰ−２２投与群のＡＵＣはいずれの用量とも溶媒対照群に対し有意に小さかった。また、実施例５に記載した方法でヘマトキシリン・エオジン染色標本およびサフラニン０染色標本を作成し、病理組織学的に解析した。
その結果、溶媒対照群ではコラゲナーゼにより滑膜における滑膜細胞増勢、肉芽組織形成、炎症性細胞浸潤が顕著であったのに対し、ＣＮＰ投与群ではこれら変化が著しく弱いことが判明した（図９）。滑膜組織膝関節のこの結果から、ＣＮＰが変形性関節症に対して治療効果を有することが判明した。
９週齢のＣ５７ＢＬ／６ Ｊ系の雄マウスの背部皮下に、以下の溶液を含むオスモティックポンプ（２００４型、Ｄｕｒｅｃｔ社製）を移植した。
・溶媒：５％ デキストロース（純正化学社製）、１０％ マンノース（ナカライテスク社製）および５ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸（和光純薬社製）を含有する蒸留水。
・ＣＮＰ−２２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製）１０ｍｇ／ｍＬ溶液（６０ｎｇ／日）。
・ＣＮＰ−２２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製）１００ｍｇ／ｍＬ溶液（６００ｎｇ／日）。
移植後６日に１．５％タイプＩＩコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）溶液６ｍＬを右膝関節内に投与し、６日後まで膝左右の膝関節幅をノギス（ミツトヨ社製）を用いて投与後２８日まで経時的に測定し、左右の差を算出した。この差を膝関節腫脹を表す値とし、そのＡＵＣを溶媒対照群とＣＮＰ投与群の間でＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定で比較した（ＳＡＳｖｅｒ．６．１２）。その結果、ＣＮＰ−２２投与群のＡＵＣはいずれの用量とも溶媒対照群に対し有意に小さかった。また、実施例５に記載した方法でヘマトキシリン・エオジン染色標本およびサフラニン０染色標本を作成し、病理組織学的に解析した。
その結果、溶媒対照群ではコラゲナーゼにより滑膜における滑膜細胞増勢、肉芽組織形成、炎症性細胞浸潤が顕著であったのに対し、ＣＮＰ投与群ではこれら変化が著しく弱いことが判明した（図９）。滑膜組織膝関節のこの結果から、ＣＮＰが変形性関節症に対して治療効果を有することが判明した。
インフュージョン投与したＣＮＰの変形性関節炎モデルに対する治療効果（２）
９週齢のＣ５７ＢＬ／６ Ｊ系の雄マウス（日本クレア社製）の背部皮下に、以下の溶液を含むオスモティックポンプ（２００４型、Ｄｕｒｅｃｔ社製）を移植した。
・溶媒：５％ デキストロース（純正化学社製）、１０％ マンノース（ナカライテスク社製）および５ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸（和光純薬社製）を含有する蒸留水。
・ＣＮＰ−２２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製）１０ｍｇ／ｍＬ溶液（６０ｎｇ／日）。
・ＣＮＰ−２２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製）１００ｍｇ／ｍＬ溶液（６００ｎｇ／日）。
移植翌日にマウスをエーテル麻酔し、右膝関節に対して前十字靭帯切断、内側則副靭帯切断および内側半月板全切除の外科処置を施し、変形性関節症を惹起した。左右膝関節幅をノギス（ミツトヨ社製）を用いて投与後１１日まで経時的に測定し、左右の差を算出した。この差を膝関節腫脹を表す値とし、そのＡＵＣを溶媒対照群とＣＮＰ投与群の間でＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定で比較した（ＳＡＳ前臨床パッケージ、ＳＡＳインスティチュートジャパン社製）。その結果、ＣＮＰ−２２投与群のＡＵＣはいずれの用量とも溶媒対照群に対し有意に小さかった（図１０）。
この結果から、ＣＮＰが外科処置により惹起される、膝関節への物理的過荷重にもとづく変形性関節症における関節炎症に対しても抑制作用を有することが明らかになった。
９週齢のＣ５７ＢＬ／６ Ｊ系の雄マウス（日本クレア社製）の背部皮下に、以下の溶液を含むオスモティックポンプ（２００４型、Ｄｕｒｅｃｔ社製）を移植した。
・溶媒：５％ デキストロース（純正化学社製）、１０％ マンノース（ナカライテスク社製）および５ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸（和光純薬社製）を含有する蒸留水。
・ＣＮＰ−２２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製）１０ｍｇ／ｍＬ溶液（６０ｎｇ／日）。
・ＣＮＰ−２２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製）１００ｍｇ／ｍＬ溶液（６００ｎｇ／日）。
移植翌日にマウスをエーテル麻酔し、右膝関節に対して前十字靭帯切断、内側則副靭帯切断および内側半月板全切除の外科処置を施し、変形性関節症を惹起した。左右膝関節幅をノギス（ミツトヨ社製）を用いて投与後１１日まで経時的に測定し、左右の差を算出した。この差を膝関節腫脹を表す値とし、そのＡＵＣを溶媒対照群とＣＮＰ投与群の間でＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定で比較した（ＳＡＳ前臨床パッケージ、ＳＡＳインスティチュートジャパン社製）。その結果、ＣＮＰ−２２投与群のＡＵＣはいずれの用量とも溶媒対照群に対し有意に小さかった（図１０）。
この結果から、ＣＮＰが外科処置により惹起される、膝関節への物理的過荷重にもとづく変形性関節症における関節炎症に対しても抑制作用を有することが明らかになった。
コラゲナーゼＯＡモデルにおける非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）とＣＮＰの併用効果
９週齢のＣ５７ＢＬ／６ Ｊ系の雄マウスの背部皮下に、以下の溶液を含むオスモティックポンプ（２００４型、Ｄｕｒｅｃｔ社製）を移植した。
・溶媒：５％ デキストロース（純正化学社製）、１０％ マンノース（ナカライテスク社製）および５ｍｍｏｌ／塩酸（和光純薬社製）を含有する蒸留水。
・ＣＮＰ−２２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製）１μｇ／ｍＬ溶液（６ｎｇ／日）。
また、ＮＳＡＩＤであるインドメタシン（Ｓｉｇｍａ社製）の効果と、ＣＮＰと併用したときの効果を検討するために、上記のポンプ移植日から１日１回、連日４日間１ｍｇ／ｋｇの用量でインドメタシンの０．２％カルボキシメチルセルロース（ナカライテスク社製）溶液への懸濁液を強制経口投与した。
実験群は以下の如く設定した。
溶媒対照（インフュージョン溶媒、経口投与溶媒）
ＣＮＰ ６ｎｇ／日
インドメタシン １ｍｇ／ｋｇ
ＣＮＰ ６ｎｇ／日 ＋ インドメタシン １ｍｇ／ｋｇ
ポンプの移植当日に０．１５％ タイプＩＩコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）溶液６μＬ、翌日に１．５％ タイプＩＩコラゲナーゼ溶液６μＬを右膝関節内に投与し、膝左右の膝関節幅をノギス（ミツトヨ社製）を用いて投与後７日まで経日的に測定し、左右の差を算出した。この差を膝関節腫脹を表す値とし、そのＡＵＣを溶媒対照群とＣＮＰ投与群の間でＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定で比較した（ＳＡＳ ｖｅｒ．６．１２）。
その結果、インドメタシン単独では膝関節腫脹を抑制しなかった。このとき、ＣＮＰ ６ｎｇ／日群は有意に膝関節腫脹を抑制した。しかし、ＣＮＰとインドメタシンを併用した群ではＣＮＰ単独群に対しても有意に膝関節腫脹を抑制していた（図１１）。この結果から、ＣＮＰによる膝関節腫脹抑制は、単独投与では関節炎治療の標準薬であるＮＳＡＩＤに比して有意な効果を有することに加え、ＮＳＡＩＤとの併用投与では相乗的な効果を有することが判明した。
９週齢のＣ５７ＢＬ／６ Ｊ系の雄マウスの背部皮下に、以下の溶液を含むオスモティックポンプ（２００４型、Ｄｕｒｅｃｔ社製）を移植した。
・溶媒：５％ デキストロース（純正化学社製）、１０％ マンノース（ナカライテスク社製）および５ｍｍｏｌ／塩酸（和光純薬社製）を含有する蒸留水。
・ＣＮＰ−２２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製）１μｇ／ｍＬ溶液（６ｎｇ／日）。
また、ＮＳＡＩＤであるインドメタシン（Ｓｉｇｍａ社製）の効果と、ＣＮＰと併用したときの効果を検討するために、上記のポンプ移植日から１日１回、連日４日間１ｍｇ／ｋｇの用量でインドメタシンの０．２％カルボキシメチルセルロース（ナカライテスク社製）溶液への懸濁液を強制経口投与した。
実験群は以下の如く設定した。
溶媒対照（インフュージョン溶媒、経口投与溶媒）
ＣＮＰ ６ｎｇ／日
インドメタシン １ｍｇ／ｋｇ
ＣＮＰ ６ｎｇ／日 ＋ インドメタシン １ｍｇ／ｋｇ
ポンプの移植当日に０．１５％ タイプＩＩコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）溶液６μＬ、翌日に１．５％ タイプＩＩコラゲナーゼ溶液６μＬを右膝関節内に投与し、膝左右の膝関節幅をノギス（ミツトヨ社製）を用いて投与後７日まで経日的に測定し、左右の差を算出した。この差を膝関節腫脹を表す値とし、そのＡＵＣを溶媒対照群とＣＮＰ投与群の間でＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定で比較した（ＳＡＳ ｖｅｒ．６．１２）。
その結果、インドメタシン単独では膝関節腫脹を抑制しなかった。このとき、ＣＮＰ ６ｎｇ／日群は有意に膝関節腫脹を抑制した。しかし、ＣＮＰとインドメタシンを併用した群ではＣＮＰ単独群に対しても有意に膝関節腫脹を抑制していた（図１１）。この結果から、ＣＮＰによる膝関節腫脹抑制は、単独投与では関節炎治療の標準薬であるＮＳＡＩＤに比して有意な効果を有することに加え、ＮＳＡＩＤとの併用投与では相乗的な効果を有することが判明した。
ラットアジュバント関節炎モデルに対するＣＮＰの作用
６週齢のＬＥＷ／Ｃｒｊ系オスラット（日本チャールズ・リバー社製）の背部皮下に、以下の溶液を含むオスモティックポンプ（２００４型、Ｄｕｒｅｃｔ社製）を移植した。
・溶媒：５％ デキストロース（純正化学社製）、１０％ マンノース（ナカライテスク社製）および５ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸（和光純薬社製）を含有する蒸留水。
ＣＮＰ−２２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製）１０μｇ／ｍＬ溶液（６０ｎｇ／日）。
移植翌日に、結核死菌粉末（Ｍ．ＴＵＢＥＲＣＵＬＯＳＩＳ ＤＥＳ．Ｈ３７ ＲＡ、ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製を３ｍｇ／ｍＬの濃度で流動パラフィン（純正化学社製）に懸濁し、５０μＬをラット尾根部に皮内接種した。接種後、四肢末端の状態を以下の基準に従って経日的にスコア評価し、四肢末端スコアを合計したスコアをその個体の関節炎スコアとした。
スコア０：病変なし
スコア１：１つ以上の指関節に発赤・腫脹が認められる。または甲の部分が赤変しているが腫脹は認められない。
スコア２：前肢または後肢の甲に軽度の腫脹が認められる。
スコア３：前肢または後肢の甲に高度な腫脹が認められるが、全ての指にはそれが認められない。
スコア４：前肢または後肢の甲および指に高度の腫脹が認められる。
その結果、ＣＮＰ投与群では関節炎スコアが溶媒対照群に対して低下する傾向が認められた（図１２Ａ）。
体重の推移も経日的に測定した。その結果、溶媒対照群に対して、ＣＮＰ投与群は有意に体重の増加高かった（図１２Ｂ）。
これらの結果から、ＣＮＰはラットアジュバントモデルにおいても関節炎を抑制し、一般状態を改善することが判明した。
６週齢のＬＥＷ／Ｃｒｊ系オスラット（日本チャールズ・リバー社製）の背部皮下に、以下の溶液を含むオスモティックポンプ（２００４型、Ｄｕｒｅｃｔ社製）を移植した。
・溶媒：５％ デキストロース（純正化学社製）、１０％ マンノース（ナカライテスク社製）および５ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸（和光純薬社製）を含有する蒸留水。
ＣＮＰ−２２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製）１０μｇ／ｍＬ溶液（６０ｎｇ／日）。
移植翌日に、結核死菌粉末（Ｍ．ＴＵＢＥＲＣＵＬＯＳＩＳ ＤＥＳ．Ｈ３７ ＲＡ、ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製を３ｍｇ／ｍＬの濃度で流動パラフィン（純正化学社製）に懸濁し、５０μＬをラット尾根部に皮内接種した。接種後、四肢末端の状態を以下の基準に従って経日的にスコア評価し、四肢末端スコアを合計したスコアをその個体の関節炎スコアとした。
スコア０：病変なし
スコア１：１つ以上の指関節に発赤・腫脹が認められる。または甲の部分が赤変しているが腫脹は認められない。
スコア２：前肢または後肢の甲に軽度の腫脹が認められる。
スコア３：前肢または後肢の甲に高度な腫脹が認められるが、全ての指にはそれが認められない。
スコア４：前肢または後肢の甲および指に高度の腫脹が認められる。
その結果、ＣＮＰ投与群では関節炎スコアが溶媒対照群に対して低下する傾向が認められた（図１２Ａ）。
体重の推移も経日的に測定した。その結果、溶媒対照群に対して、ＣＮＰ投与群は有意に体重の増加高かった（図１２Ｂ）。
これらの結果から、ＣＮＰはラットアジュバントモデルにおいても関節炎を抑制し、一般状態を改善することが判明した。
ラットコラーゲン関節炎モデルに対するＣＮＰの作用
１０週齢のＤＡ／Ｓｌｃ系メスラット（日本エスエルシー社製）の背部皮下に、以下の溶液を含むオスモティックポンプ（２００４型、Ｄｕｒｅｃｔ社製）を移植した。
・溶媒：５％ デキストロース（純正化学社製）、１０％ マンノース（ナカライテスク社製）および５ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸（和光純薬社製）を含有する蒸留水。
・ＣＮＰ−２２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製）１ｍｇ／ｍＬ溶液（６μｇ／日）。
移植直後に、ウシＩＩ型コラーゲン（コラーゲン技術研修会社製）を１．５ｍｇ／ｍＬになるよう０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸水に溶解し、等用量のＡｄｊｕｖａｎｔ Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）と懸濁した液４００μＬをラット背部に皮内接種した。接種後、体重の推移も経日的に測定した。また、ポンプ移植も接種も行わない正常群も設定し、同様に体重の推移を測定した。
その結果、正常群に対して溶媒対照群は有意に体重が減少するのに対して、ＣＮＰ投与群は溶媒対照群に対して有意に体重減少が少なかった（図１３）。この結果から、ＣＮＰはラットコラーゲン関節炎モデルにおいて、一般状態を改善することが判明した。
１０週齢のＤＡ／Ｓｌｃ系メスラット（日本エスエルシー社製）の背部皮下に、以下の溶液を含むオスモティックポンプ（２００４型、Ｄｕｒｅｃｔ社製）を移植した。
・溶媒：５％ デキストロース（純正化学社製）、１０％ マンノース（ナカライテスク社製）および５ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸（和光純薬社製）を含有する蒸留水。
・ＣＮＰ−２２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製）１ｍｇ／ｍＬ溶液（６μｇ／日）。
移植直後に、ウシＩＩ型コラーゲン（コラーゲン技術研修会社製）を１．５ｍｇ／ｍＬになるよう０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸水に溶解し、等用量のＡｄｊｕｖａｎｔ Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）と懸濁した液４００μＬをラット背部に皮内接種した。接種後、体重の推移も経日的に測定した。また、ポンプ移植も接種も行わない正常群も設定し、同様に体重の推移を測定した。
その結果、正常群に対して溶媒対照群は有意に体重が減少するのに対して、ＣＮＰ投与群は溶媒対照群に対して有意に体重減少が少なかった（図１３）。この結果から、ＣＮＰはラットコラーゲン関節炎モデルにおいて、一般状態を改善することが判明した。
本発明の、ＧＣ−Ｂ活性化物質を有効成分として含む治療剤又は予防剤は、関節軟骨の厚さおよび関節軟骨細胞数が有意に増加させること、関節腫脹に抵抗性であること、関節軟骨変性が抑制されること、滑膜細胞増勢、肉芽組織形成、炎症性細胞浸潤の変化が著しく弱いこと、並びに、関節軟骨中のプロテオグリカン含量が低下しないことなどの効能をもつことから、変形性膝関節症、変形性股関節症、変形性肘関節症、変形性脊椎症、顎関節症などの変形性関節症を含む関節炎症の治療又は予防のために有用である。本発明の医薬の投与によって、関節患部における関節軟骨基質および軟骨細胞数の減少抑制又は再生が起こり、関節軟骨変性と関節部の腫脹が抑制され、これによって関節炎症が抑制又は軽減される。特に本発明の変形性関節症治療剤は、従来の関節鏡視下手術、人工関節置換や骨切り術などの整形外科手術と比べて患者の負担や苦痛が少ないために、患者のＱＯＬに配慮した、優れた治療剤となりうる。
ＧＣ−Ｂ活性化物質が上記のような効能をもつという新規の知見から、ＧＣ−Ｂを活性化することによって、関節炎症を抑制すること及び関節軟骨細胞の増殖を促進させることが可能である。また、ＧＣ−Ｂの活性（たとえば細胞内ｃＧＭＰ産生量）を指標とすることによって、関節軟骨細胞増殖促進剤や関節炎症治療剤をスクリーニングすることも可能である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
ＧＣ−Ｂ活性化物質が上記のような効能をもつという新規の知見から、ＧＣ−Ｂを活性化することによって、関節炎症を抑制すること及び関節軟骨細胞の増殖を促進させることが可能である。また、ＧＣ−Ｂの活性（たとえば細胞内ｃＧＭＰ産生量）を指標とすることによって、関節軟骨細胞増殖促進剤や関節炎症治療剤をスクリーニングすることも可能である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
配列番号１の説明：６−Ｃｙｓと２２−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される。
配列番号２の説明：３７−Ｃｙｓと５３−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される。
配列番号３の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、６−Ｃｙｓと２２−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される）。
配列番号４の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、６−Ｃｙｓと２２−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される）。
配列番号５の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、６−Ｃｙｓと２２−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される）。
配列番号６の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、１−Ｃｙｓと１７−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される）。
配列番号７の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、７−Ｃｙｓと２３−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される）。
配列番号８の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、６−Ｃｙｓと２２−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される）。
配列番号９の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、１−Ｃｙｓと１７−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される）。
配列番号１０の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、４−Ｘａａ＝Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ；５−Ｘａａ＝Ｌｙｓ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ；６−Ｘａａ＝Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ａｌａ，Ｖａｌ；１１−Ｘａａ＝Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｔｈｒ，Ａｓｎ；１２−Ｘａａ＝Ｍｅｔ，Ａｌａ，Ｔｒｐ，Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ｓｅｒ，Ｇｌｙ；１４−Ｘａａ＝Ｇｌｙ，Ｌｙｓ，Ａｌａ，Ｌｅｕ；１５−Ｘａａ＝Ｌｅｕ，Ｍｅｔ。また、１−Ｃｙｓと１７−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される。）。
配列番号２の説明：３７−Ｃｙｓと５３−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される。
配列番号３の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、６−Ｃｙｓと２２−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される）。
配列番号４の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、６−Ｃｙｓと２２−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される）。
配列番号５の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、６−Ｃｙｓと２２−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される）。
配列番号６の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、１−Ｃｙｓと１７−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される）。
配列番号７の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、７−Ｃｙｓと２３−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される）。
配列番号８の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、６−Ｃｙｓと２２−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される）。
配列番号９の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、１−Ｃｙｓと１７−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される）。
配列番号１０の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、４−Ｘａａ＝Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ；５−Ｘａａ＝Ｌｙｓ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ；６−Ｘａａ＝Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ａｌａ，Ｖａｌ；１１−Ｘａａ＝Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｔｈｒ，Ａｓｎ；１２−Ｘａａ＝Ｍｅｔ，Ａｌａ，Ｔｒｐ，Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ｓｅｒ，Ｇｌｙ；１４−Ｘａａ＝Ｇｌｙ，Ｌｙｓ，Ａｌａ，Ｌｅｕ；１５−Ｘａａ＝Ｌｅｕ，Ｍｅｔ。また、１−Ｃｙｓと１７−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される。）。
Claims (12)
- Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）又は、その誘導体であってＣＮＰ活性を有するもの、を有効成分として含むことを特徴とする、関節炎症の治療剤又は予防剤。
- 前記関節炎症が変形性関節症である、請求項１に記載の治療剤又は予防剤。
- 前記変形性関節症が荷重関節の変形性関節症又は非荷重関節の変形性関節症である、請求項２に記載の治療剤又は予防剤。
- 前記変形性関節症が変形性膝関節症である、請求項３に記載の治療剤又は予防剤。
- 前記変形性関節症が変形性股関節症である、請求項３に記載の治療剤又は予防剤。
- 前記変形性関節症が顎関節症における変形性関節症である、請求項３に記載の治療剤又は予防剤。
- 前記関節炎症が関節リウマチに起因する、請求項１に記載の治療剤又は予防剤。
- 前記関節炎症が変形性関節症に起因する、請求項１に記載の治療剤又は予防剤。
- 前記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の治療剤又は予防剤。
- 前記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の治療剤又は予防剤。
- 前記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の治療剤又は予防剤。
- 少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の治療剤又は予防剤。
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