JPH11196873A - 薬剤結合蛋白 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 サイトカイン抑制抗炎症薬（ＣＳＡＩＤ）結
合タンパク質（ＣＳＢＰβ）、そのタンパク質をコード
する遺伝子およびこの薬理学的クラスの薬物の評価およ
び特徴付けに有用なアッセイおよびスクリーンが望まれ
ている。 【解決手段】 本発明は、 （ａ）配列番号２のアミ
ノ酸からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドに対して少なくとも７５％の同一性を有するポリヌク
レオチド；（ｂ）遺伝暗号の重複性により、配列番号２
と同じアミノ酸をコードするポリヌクレオチド；（ｃ）
（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対して相補性
のポリヌクレオチド；および（ｄ）（ａ）、（ｂ）また
は（ｃ）のポリヌクレオチドの少なくとも連続した１５
塩基からなるポリヌクレオチドからなる群より選択され
るメンバーからなる単離ポリヌクレオチドを提供するも
のである。
合タンパク質（ＣＳＢＰβ）、そのタンパク質をコード
する遺伝子およびこの薬理学的クラスの薬物の評価およ
び特徴付けに有用なアッセイおよびスクリーンが望まれ
ている。 【解決手段】 本発明は、 （ａ）配列番号２のアミ
ノ酸からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドに対して少なくとも７５％の同一性を有するポリヌク
レオチド；（ｂ）遺伝暗号の重複性により、配列番号２
と同じアミノ酸をコードするポリヌクレオチド；（ｃ）
（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対して相補性
のポリヌクレオチド；および（ｄ）（ａ）、（ｂ）また
は（ｃ）のポリヌクレオチドの少なくとも連続した１５
塩基からなるポリヌクレオチドからなる群より選択され
るメンバーからなる単離ポリヌクレオチドを提供するも
のである。
Description
【０００１】本発明は、１９９３年９月１７日出願の米
国特許出願番号０８／１２３１７５の一部継続出願であ
る、１９９４年５月３１日出願の米国特許出願番号０８
／２５０９７５の一部継続出願である、１９９５年６月
６日出願の米国特許出願番号０８／４６８９０２の一部
継続出願である。
国特許出願番号０８／１２３１７５の一部継続出願であ
る、１９９４年５月３１日出願の米国特許出願番号０８
／２５０９７５の一部継続出願である、１９９５年６月
６日出願の米国特許出願番号０８／４６８９０２の一部
継続出願である。
【０００２】
【発明の属する技術分野】本発明は、とりわけ、薬剤結
合タンパク質、そのタンパク質をコードする遺伝子、お
よび医薬をスクリーニングするためのアッセイおよび方
法に関する。さらに詳しくは、本発明はサイトカイン抑
制抗炎症薬（Cytokine Suppressive Anti-Inflammatory
Drug（ＣＳＡＩＤ））結合タンパク質（ＣＳＢＰ
β）、そのタンパク質をコードする遺伝子およびこの薬
理学的クラスの薬物の評価および特徴付けに有用なアッ
セイおよびスクリーンに関する。
合タンパク質、そのタンパク質をコードする遺伝子、お
よび医薬をスクリーニングするためのアッセイおよび方
法に関する。さらに詳しくは、本発明はサイトカイン抑
制抗炎症薬（Cytokine Suppressive Anti-Inflammatory
Drug（ＣＳＡＩＤ））結合タンパク質（ＣＳＢＰ
β）、そのタンパク質をコードする遺伝子およびこの薬
理学的クラスの薬物の評価および特徴付けに有用なアッ
セイおよびスクリーンに関する。
【０００３】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】サイ
トカインは炎症および他の免疫機能の間の細胞応答を制
御するにおいて重要な役割を果たす。特に興味のあるサ
イトカインは、インターロイキン−１（ＩＬ−１αおよ
びβ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦαおよびβ）であ
り、それは炎症応答カスケードの初期工程に関与する細
胞内タンパク質である（Araiら、Ann.Rev.Biochem. 5
9：783−836（1990））。かくして、最近では、炎症性
刺激に応答するＩＬ−１およびＴＮＦの産生を妨げよう
とする研究が実質的な範囲でなされている。ある治療方
法は、転写および／または翻訳および／または分泌のレ
ベルでＩＬ−１およびＴＮＦの産生を抑制するものであ
る。ある種のピリジニルイミダゾールに関与する活性
は、「ＣＳＡＩＤ」またはCytokine Suppressing Anti-
Inflammatory Drugsと称される一連の化合物に通じる。
転写ではより小さな作用が観察され、他の工程での作用
も除外できないが、これらの化合物は翻訳レベルで優先
的にＩＬ−１およびＴＮＦの発現を阻止するようであ
る。
トカインは炎症および他の免疫機能の間の細胞応答を制
御するにおいて重要な役割を果たす。特に興味のあるサ
イトカインは、インターロイキン−１（ＩＬ−１αおよ
びβ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦαおよびβ）であ
り、それは炎症応答カスケードの初期工程に関与する細
胞内タンパク質である（Araiら、Ann.Rev.Biochem. 5
9：783−836（1990））。かくして、最近では、炎症性
刺激に応答するＩＬ−１およびＴＮＦの産生を妨げよう
とする研究が実質的な範囲でなされている。ある治療方
法は、転写および／または翻訳および／または分泌のレ
ベルでＩＬ−１およびＴＮＦの産生を抑制するものであ
る。ある種のピリジニルイミダゾールに関与する活性
は、「ＣＳＡＩＤ」またはCytokine Suppressing Anti-
Inflammatory Drugsと称される一連の化合物に通じる。
転写ではより小さな作用が観察され、他の工程での作用
も除外できないが、これらの化合物は翻訳レベルで優先
的にＩＬ−１およびＴＮＦの発現を阻止するようであ
る。
【０００４】ピリジニルイミダゾール、５−（４−ピリ
ジル）−６−（４−フルオロフェニル）−２，３−ジヒ
ドロイミダゾ（２，１−ｂ）チアゾール（ＳＫ＆Ｆ ８
６００２）は原型ＣＳＡＩＤと同定された。その活性に
ついての基本事項は確立され、特徴付けられている（Le
eら、Int'l J.Immunopharm. 10（７）：835−843（198
8）；Agents and Actions 27（3／4）：277−279（198
9）およびInt'l J.Immunother. 6（1）：1−12（199
0））。ＳＡＲの研究は、ピリジニルイミダゾールのサ
イトカイン抑制作用が、エイコサノイドおよびロイコト
リエン産生に対するその阻害作用とは独立した、独特な
活性を示すことを示唆する。実質的にＣＳＡＩＤが新規
な抗炎症治療剤である可能性があるため、分子レベルで
の作用機構を特徴付けること、ならびに高度な選択性お
よび効能を有する化合物を得ることは非常に重要なこと
である。詳細には、ＣＳＡＩＤ分子標的の同定および特
徴付けは、炎症に関与する生物学的工程の理解を深め、
さらに強力な抗炎症薬の設計およびスクリーニングを助
けるであろう。本発明は、とりわけ、さらなるＣＳＡＩ
Ｄ結合タンパク質（ＣＳＢＰ）の精製および特徴付けを
開示する。
ジル）−６−（４−フルオロフェニル）−２，３−ジヒ
ドロイミダゾ（２，１−ｂ）チアゾール（ＳＫ＆Ｆ ８
６００２）は原型ＣＳＡＩＤと同定された。その活性に
ついての基本事項は確立され、特徴付けられている（Le
eら、Int'l J.Immunopharm. 10（７）：835−843（198
8）；Agents and Actions 27（3／4）：277−279（198
9）およびInt'l J.Immunother. 6（1）：1−12（199
0））。ＳＡＲの研究は、ピリジニルイミダゾールのサ
イトカイン抑制作用が、エイコサノイドおよびロイコト
リエン産生に対するその阻害作用とは独立した、独特な
活性を示すことを示唆する。実質的にＣＳＡＩＤが新規
な抗炎症治療剤である可能性があるため、分子レベルで
の作用機構を特徴付けること、ならびに高度な選択性お
よび効能を有する化合物を得ることは非常に重要なこと
である。詳細には、ＣＳＡＩＤ分子標的の同定および特
徴付けは、炎症に関与する生物学的工程の理解を深め、
さらに強力な抗炎症薬の設計およびスクリーニングを助
けるであろう。本発明は、とりわけ、さらなるＣＳＡＩ
Ｄ結合タンパク質（ＣＳＢＰ）の精製および特徴付けを
開示する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本明細書に開示されてい
る特定の配列などの、本発明のＤＮＡは、そのＤＮＡが
新規なＣＳＢＰβの発現に必要な遺伝的情報をコードす
る点で有用である。加えて、該配列はＣＳＢＰβ科の別
のメンバーを単離し、同定するためのプローブとして用
いてもよく、ならびにＣＳＢＰβ遺伝子の非典型的発現
により特徴付けられる病態のアンチセンス療法の基礎を
形成する。新規なタンパク質それ自体は、直接、治療剤
または診断剤として、ならびにＣＳＡＩＤ結合活性のア
ンタゴニストまたはアゴニストである化合物に対するス
クリーニング系の成分として有用である。該タンパク質
はまた、異種の種における抗体産生を惹起するのに有用
であり、その抗体は前記した診断、治療およびスクリー
ニングに用いるのに有用である。本明細書に記載の試薬
に関するこれらの使用および他の使用は、この明細書を
読むことにより当業者に明らかとなるであろう。
る特定の配列などの、本発明のＤＮＡは、そのＤＮＡが
新規なＣＳＢＰβの発現に必要な遺伝的情報をコードす
る点で有用である。加えて、該配列はＣＳＢＰβ科の別
のメンバーを単離し、同定するためのプローブとして用
いてもよく、ならびにＣＳＢＰβ遺伝子の非典型的発現
により特徴付けられる病態のアンチセンス療法の基礎を
形成する。新規なタンパク質それ自体は、直接、治療剤
または診断剤として、ならびにＣＳＡＩＤ結合活性のア
ンタゴニストまたはアゴニストである化合物に対するス
クリーニング系の成分として有用である。該タンパク質
はまた、異種の種における抗体産生を惹起するのに有用
であり、その抗体は前記した診断、治療およびスクリー
ニングに用いるのに有用である。本明細書に記載の試薬
に関するこれらの使用および他の使用は、この明細書を
読むことにより当業者に明らかとなるであろう。
【０００６】
【発明の実施の形態】図１ないし３に示されるポリヌク
レオチド配列などの本明細書に示す情報を用いると、Ｃ
ＳＢＰβをコードする本発明のポリヌクレオチドは、出
発物質としての精巣およびＴ細胞からのｍＲＮＡを用い
てｃＤＮＡをクローニングする方法などの、標準的クロ
ーニングおよびスクリーニング法を用いて得ることがで
きる。本発明の代表例である、図１ないし３に示される
ポリヌクレオチドの部分フラグメントは、発現配列タグ
（ＥＳＴ）分析を用いてヒト精巣の細胞から由来のｃＤ
ＮＡライブラリーにて見つけた（Adams,M.D.ら、Scienc
e、252：1651-1656（1991）；Adams,M.D.ら、Nature、3
55：632-634（1992）；Adams,M.D.ら、Nature、377 Sup
p：3-174（1995））。その後、図１ないし３の配列に対
応し、表示されるようなタンパク質翻訳のための読み枠
を有する長いｃＤＮＡを、活性化Ｔ細胞ライブラリーよ
り標準的クローニングおよびスクリーニング操作を用い
るハイブリダイゼーションを介してクローンした。本発
明のＣＳＢＰβは、構造的に、ＣＳＢＰ科の他のタンパ
ク質に関連付けられる。本発明のＣＳＢＰβをコードす
るヌクレオチド配列は、ＭＡＰキナーゼ科の他のヒトメ
ンバーと、その全体にわたって、約５８−７３％の同一
性を有する。
レオチド配列などの本明細書に示す情報を用いると、Ｃ
ＳＢＰβをコードする本発明のポリヌクレオチドは、出
発物質としての精巣およびＴ細胞からのｍＲＮＡを用い
てｃＤＮＡをクローニングする方法などの、標準的クロ
ーニングおよびスクリーニング法を用いて得ることがで
きる。本発明の代表例である、図１ないし３に示される
ポリヌクレオチドの部分フラグメントは、発現配列タグ
（ＥＳＴ）分析を用いてヒト精巣の細胞から由来のｃＤ
ＮＡライブラリーにて見つけた（Adams,M.D.ら、Scienc
e、252：1651-1656（1991）；Adams,M.D.ら、Nature、3
55：632-634（1992）；Adams,M.D.ら、Nature、377 Sup
p：3-174（1995））。その後、図１ないし３の配列に対
応し、表示されるようなタンパク質翻訳のための読み枠
を有する長いｃＤＮＡを、活性化Ｔ細胞ライブラリーよ
り標準的クローニングおよびスクリーニング操作を用い
るハイブリダイゼーションを介してクローンした。本発
明のＣＳＢＰβは、構造的に、ＣＳＢＰ科の他のタンパ
ク質に関連付けられる。本発明のＣＳＢＰβをコードす
るヌクレオチド配列は、ＭＡＰキナーゼ科の他のヒトメ
ンバーと、その全体にわたって、約５８−７３％の同一
性を有する。
【０００７】本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡの
ごときＲＮＡの形態であってもよく、あるいは、例えば
クローニングにより得られるか、または化学合成法もし
くはその組み合わせにより産生されるｃＤＮＡおよびゲ
ノムＤＮＡを含め、ＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮ
Ａは２本鎖または１本鎖であってもよい。１本鎖ＤＮＡ
はセンス鎖としても知られているコーディング鎖であっ
てもよく、または、アンチセンス鎖とも称される非コー
ディング鎖であってもよい。ポリペプチドをコードする
コーディング配列は、図１ないし３（配列番号１）に示
されるポリヌクレオチドのコーディング配列と同じであ
ってもよい。そのコーディング配列はまた、遺伝暗号の
重複性（縮重性）の結果として、図１ないし３（配列番
号２）のポリペプチドをもコードする、別の配列を有す
るポリヌクレオチドであってもよい。
ごときＲＮＡの形態であってもよく、あるいは、例えば
クローニングにより得られるか、または化学合成法もし
くはその組み合わせにより産生されるｃＤＮＡおよびゲ
ノムＤＮＡを含め、ＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮ
Ａは２本鎖または１本鎖であってもよい。１本鎖ＤＮＡ
はセンス鎖としても知られているコーディング鎖であっ
てもよく、または、アンチセンス鎖とも称される非コー
ディング鎖であってもよい。ポリペプチドをコードする
コーディング配列は、図１ないし３（配列番号１）に示
されるポリヌクレオチドのコーディング配列と同じであ
ってもよい。そのコーディング配列はまた、遺伝暗号の
重複性（縮重性）の結果として、図１ないし３（配列番
号２）のポリペプチドをもコードする、別の配列を有す
るポリヌクレオチドであってもよい。
【０００８】図１ないし３（配列番号２）のポリペプチ
ドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、成熟ポリ
ペプチド用のコーディング配列自体；成熟ポリペプチド
用のコーディング配列および付加的なコーディング配
列、例えば、プレ−、プロ−またはプレプロ−タンパク
質配列などのリーダー配列または分泌配列をコードする
配列；および前記した付加的なコーディング配列を有す
るか、または有することなく、例えば、限定されるもの
ではないが、転写およびスプライシングを含め、ｍＲＮ
Ａプロセッシングにて役割を果たす、転写かつ非翻訳の
配列および、例えば、ｍＲＮＡのリボソーム結合および
安定性のためのポリアデニル化シグナルなどのイントロ
ンおよび非コーディング５’および３’配列を包含する
付加的な非コーディング配列を有する成熟ポリペプチド
のコーディング配列を包含するが、これに限定されるも
のではない。付加的な官能性を付与するコーディング配
列をポリペプチドに組み入れてもよい。かくして、例え
ば、ポリペプチドを、融合ポリペプチドの精製を容易に
する、ペプチドなどのマーカー配列に融合させてもよ
い。本発明のこの態様の特定の好ましい具体例におい
て、マーカー配列は、ｐＱＥベクター（Qiagen,Inc.）
で供給されるタグなどのヘキサヒスチジンペプチドであ
る。Gentzら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA、86：821-824
（1989）に記載されているように、例えば、ヘキサヒス
チジンは融合タンパク質を精製するのに都合がよい。別
の具体例において、マーカー配列はＨＡタグである。そ
のＨＡタグはインフルエンザ・赤血球凝集素タンパク質
由来のエピトープに対応するものであり、例えば、Wils
onら、Cell 37：767 (1984) に記載されている。他の多
くのそのようなタグが市販されている。
ドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、成熟ポリ
ペプチド用のコーディング配列自体；成熟ポリペプチド
用のコーディング配列および付加的なコーディング配
列、例えば、プレ−、プロ−またはプレプロ−タンパク
質配列などのリーダー配列または分泌配列をコードする
配列；および前記した付加的なコーディング配列を有す
るか、または有することなく、例えば、限定されるもの
ではないが、転写およびスプライシングを含め、ｍＲＮ
Ａプロセッシングにて役割を果たす、転写かつ非翻訳の
配列および、例えば、ｍＲＮＡのリボソーム結合および
安定性のためのポリアデニル化シグナルなどのイントロ
ンおよび非コーディング５’および３’配列を包含する
付加的な非コーディング配列を有する成熟ポリペプチド
のコーディング配列を包含するが、これに限定されるも
のではない。付加的な官能性を付与するコーディング配
列をポリペプチドに組み入れてもよい。かくして、例え
ば、ポリペプチドを、融合ポリペプチドの精製を容易に
する、ペプチドなどのマーカー配列に融合させてもよ
い。本発明のこの態様の特定の好ましい具体例におい
て、マーカー配列は、ｐＱＥベクター（Qiagen,Inc.）
で供給されるタグなどのヘキサヒスチジンペプチドであ
る。Gentzら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA、86：821-824
（1989）に記載されているように、例えば、ヘキサヒス
チジンは融合タンパク質を精製するのに都合がよい。別
の具体例において、マーカー配列はＨＡタグである。そ
のＨＡタグはインフルエンザ・赤血球凝集素タンパク質
由来のエピトープに対応するものであり、例えば、Wils
onら、Cell 37：767 (1984) に記載されている。他の多
くのそのようなタグが市販されている。
【０００９】前記によれば、本明細書にて用いられる
「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる語
はまた、コーディングおよび／または非コーディング配
列を含んでいてもよい、付加的な領域と共に、該ポリペ
プチドをコードする単一の連続領域または不連続領域
（例えば、イントロンにより分断されている）を含むポ
リヌクレオチドも包含する。さらに本発明は、図１ない
し３（配列番号2）の推定アミノ酸配列を有するポリペ
プチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコード
するポリヌクレオチドの変種に関する。ポリヌクレオチ
ドの変種は、天然の対立遺伝子変種などの天然に存在す
る変種であってもよく、あるいは、天然に存在すること
が知られていない変種であってもよい。かかるポリヌク
レオチドの天然に存在しない変種は、ポリヌクレオチ
ド、細胞または生物に用いる方法を含め、突然変異誘発
法により製造してもよい。
「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる語
はまた、コーディングおよび／または非コーディング配
列を含んでいてもよい、付加的な領域と共に、該ポリペ
プチドをコードする単一の連続領域または不連続領域
（例えば、イントロンにより分断されている）を含むポ
リヌクレオチドも包含する。さらに本発明は、図１ない
し３（配列番号2）の推定アミノ酸配列を有するポリペ
プチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコード
するポリヌクレオチドの変種に関する。ポリヌクレオチ
ドの変種は、天然の対立遺伝子変種などの天然に存在す
る変種であってもよく、あるいは、天然に存在すること
が知られていない変種であってもよい。かかるポリヌク
レオチドの天然に存在しない変種は、ポリヌクレオチ
ド、細胞または生物に用いる方法を含め、突然変異誘発
法により製造してもよい。
【００１０】この点で変種には、ヌクレオチド置換、欠
失または付加により前記したポリヌクレオチドと異なる
変種がある。置換、欠失または付加には１個またはそれ
以上のヌクレオチドが関与しているかもしれない。変種
は、コーディング配列または非コーディング配列あるい
はそれらの両方において変化していてもよい。コーディ
ング配列の変化により、同類または非同類アミノ酸置
換、欠失または付加が生じてもよい。この点で本発明の
特に好ましい具体例には、図１ないし３（配列番号２）
に示されるＣＳＢＰβのアミノ酸配列を有するポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド；その変種、アナロ
グ、誘導体およびフラグメント、ならびにその変種、ア
ナログおよび誘導体のフラグメントがある。
失または付加により前記したポリヌクレオチドと異なる
変種がある。置換、欠失または付加には１個またはそれ
以上のヌクレオチドが関与しているかもしれない。変種
は、コーディング配列または非コーディング配列あるい
はそれらの両方において変化していてもよい。コーディ
ング配列の変化により、同類または非同類アミノ酸置
換、欠失または付加が生じてもよい。この点で本発明の
特に好ましい具体例には、図１ないし３（配列番号２）
に示されるＣＳＢＰβのアミノ酸配列を有するポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド；その変種、アナロ
グ、誘導体およびフラグメント、ならびにその変種、ア
ナログおよび誘導体のフラグメントがある。
【００１１】さらには、数個、わずかな、５ないし１
０、１ないし５、１ないし３、２、１個または０個のア
ミノ酸残基が、いずれかの組み合わせで置換、欠失また
は付加されている、図１ないし３（配列番号２）のＣＳ
ＢＰβポリペプチドのアミノ酸配列を有する、ＣＳＢＰ
β変種、アナログ、誘導体およびフラグメント、ならび
にそのフラグメントの変種、アナログおよび誘導体をコ
ードするポリヌクレオチドが特に好ましい。これらのう
ち特に好ましいのは、ＣＳＢＰβの特性および活性を変
化させないサイレント置換、付加および欠失である。ま
たこの点において、同類置換が特に好ましい。置換され
ていない、図１ないし３（配列番号２）のアミノ酸配列
を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが
最も好ましい。
０、１ないし５、１ないし３、２、１個または０個のア
ミノ酸残基が、いずれかの組み合わせで置換、欠失また
は付加されている、図１ないし３（配列番号２）のＣＳ
ＢＰβポリペプチドのアミノ酸配列を有する、ＣＳＢＰ
β変種、アナログ、誘導体およびフラグメント、ならび
にそのフラグメントの変種、アナログおよび誘導体をコ
ードするポリヌクレオチドが特に好ましい。これらのう
ち特に好ましいのは、ＣＳＢＰβの特性および活性を変
化させないサイレント置換、付加および欠失である。ま
たこの点において、同類置換が特に好ましい。置換され
ていない、図１ないし３（配列番号２）のアミノ酸配列
を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが
最も好ましい。
【００１２】本発明のさらに好ましい具体例は、図１な
いし３に示されるアミノ酸配列を有するＣＳＢＰβポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なく
とも７５％の同一性を有するポリヌクレオチド、および
かかるポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドで
ある。寄託クローンのヒトｃＤＮＡのＣＳＢＰβポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドおよびそれに相補
的なポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％同一で
ある領域からなるポリヌクレオチドが非常に好ましい。
この点において、そのポリペプチドに対して少なくとも
９０％同一であるポリヌクレオチドが特に好ましく、特
に好ましいのは、少なくとも９５％同一のものである。
さらには、少なくとも９７％同一のものが非常に好まし
く、少なくとも９８−９９％同一のものがさらに好まし
く、少なくとも９９％同一のものが最も好ましい。この
点において、さらに特に好ましい具体例は、図１ないし
３（配列番号２）のｃＤＮＡによりコードされる成熟ポ
リペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保
持しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオ
チドである。
いし３に示されるアミノ酸配列を有するＣＳＢＰβポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なく
とも７５％の同一性を有するポリヌクレオチド、および
かかるポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドで
ある。寄託クローンのヒトｃＤＮＡのＣＳＢＰβポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドおよびそれに相補
的なポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％同一で
ある領域からなるポリヌクレオチドが非常に好ましい。
この点において、そのポリペプチドに対して少なくとも
９０％同一であるポリヌクレオチドが特に好ましく、特
に好ましいのは、少なくとも９５％同一のものである。
さらには、少なくとも９７％同一のものが非常に好まし
く、少なくとも９８−９９％同一のものがさらに好まし
く、少なくとも９９％同一のものが最も好ましい。この
点において、さらに特に好ましい具体例は、図１ないし
３（配列番号２）のｃＤＮＡによりコードされる成熟ポ
リペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保
持しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオ
チドである。
【００１３】本発明はさらに本発明のポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリ
ヌクレオチドに関する。この点において、本発明は、特
に、ストリンジェントな条件下、本明細書にて前記した
ポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌクレオ
チドに関する。本明細書にて用いる「ストリンジェント
な条件」なる語は、ハイブリッド形成が、配列間で少な
くとも９５％、好ましくは少なくとも９７％同一である
場合にのみ生じることを意味する。本発明のポリヌクレ
オチドは、成熟タンパク質に、付加的なアミノまたはカ
ルボキシ末端アミノ酸が加わるか、成熟ポリペプチドの
内部にアミノ酸が加わった（例えば、成熟形態が一つ以
上のポリペプチド鎖を有する場合）ポリペプチドをコー
ドすることができる。このような配列は、とりわけ、前
駆体から成熟形態へのタンパク質のプロセッシングにお
いて役割を果たし、タンパク質を運ぶことを容易にし、
タンパク質の半減期を長くしたり、短くしたり、あるい
はアッセイまたは生産のためのタンパク質の操作を容易
にすることができる。インシテューで一般的なように、
該付加アミノ酸は細胞酵素により成熟タンパク質からプ
ロセッシングにより除かれる。
ードするポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリ
ヌクレオチドに関する。この点において、本発明は、特
に、ストリンジェントな条件下、本明細書にて前記した
ポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌクレオ
チドに関する。本明細書にて用いる「ストリンジェント
な条件」なる語は、ハイブリッド形成が、配列間で少な
くとも９５％、好ましくは少なくとも９７％同一である
場合にのみ生じることを意味する。本発明のポリヌクレ
オチドは、成熟タンパク質に、付加的なアミノまたはカ
ルボキシ末端アミノ酸が加わるか、成熟ポリペプチドの
内部にアミノ酸が加わった（例えば、成熟形態が一つ以
上のポリペプチド鎖を有する場合）ポリペプチドをコー
ドすることができる。このような配列は、とりわけ、前
駆体から成熟形態へのタンパク質のプロセッシングにお
いて役割を果たし、タンパク質を運ぶことを容易にし、
タンパク質の半減期を長くしたり、短くしたり、あるい
はアッセイまたは生産のためのタンパク質の操作を容易
にすることができる。インシテューで一般的なように、
該付加アミノ酸は細胞酵素により成熟タンパク質からプ
ロセッシングにより除かれる。
【００１４】一またはそれ以上のプロ配列に融合したポ
リペプチドの成熟形態を有する前駆体タンパク質は該ポ
リペプチドの不活性形でもよい。プロ配列が除かれる
と、そのような不活性前駆体は一般に活性化される。プ
ロ配列の幾らかまたは全体を、活性化の前に除去でき
る。一般に、そのような前駆体はプロタンパク質と称さ
れる。総じて、本発明のポリヌクレオチドは成熟タンパ
ク質、リーダー配列の加わった成熟タンパク質（プレタ
ンパク質とも称される）、プレタンパク質のリーダー配
列ではない１またはそれ以上のプロ配列を有する成熟タ
ンパク質の前駆体、またはリーダー配列と、一般に、ポ
リペプチドの活性な成熟形態を生成するプロセッシング
工程の間に除去される１またはそれ以上のプロ配列を有
するプロタンパク質の前駆体であるプレプロタンパク質
をコードする。
リペプチドの成熟形態を有する前駆体タンパク質は該ポ
リペプチドの不活性形でもよい。プロ配列が除かれる
と、そのような不活性前駆体は一般に活性化される。プ
ロ配列の幾らかまたは全体を、活性化の前に除去でき
る。一般に、そのような前駆体はプロタンパク質と称さ
れる。総じて、本発明のポリヌクレオチドは成熟タンパ
ク質、リーダー配列の加わった成熟タンパク質（プレタ
ンパク質とも称される）、プレタンパク質のリーダー配
列ではない１またはそれ以上のプロ配列を有する成熟タ
ンパク質の前駆体、またはリーダー配列と、一般に、ポ
リペプチドの活性な成熟形態を生成するプロセッシング
工程の間に除去される１またはそれ以上のプロ配列を有
するプロタンパク質の前駆体であるプレプロタンパク質
をコードする。
【００１５】ポリペプチド 本発明は、さらに図１ないし３（配列番号２）の推定ア
ミノ酸配列を有するＣＳＢＰβポリペプチドに関する。
本発明はまた、これらのポリペプチドのフラグメント、
アナログおよび誘導体にも関する。「フラグメント」、
「誘導体」および「アナログ」なる語は、図１ないし３
のポリペプチドについて言う場合、かかるポリペプチド
と実質的に同じ生物学的機能または活性を保持してい
る、すなわち、ＣＳＢＰβとして機能するポリペプチ
ド、または、たとえそのポリペプチドがＣＳＢＰβとし
て機能しなくてもそのリガンドまたは結合分子に結合す
る能力を保持している、ポリペプチドを意味する。かく
して、アナログは、例えば、プロタンパク質部分の開裂
により活性化され、活性成熟ポリペプチドを産生しうる
プロタンパク質を包含する。本発明のポリペプチドは、
組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリ
ペプチドであってもよい。特定の好ましい具体例におい
て、本発明のポリペプチドは組換えポリペプチドであ
る。
ミノ酸配列を有するＣＳＢＰβポリペプチドに関する。
本発明はまた、これらのポリペプチドのフラグメント、
アナログおよび誘導体にも関する。「フラグメント」、
「誘導体」および「アナログ」なる語は、図１ないし３
のポリペプチドについて言う場合、かかるポリペプチド
と実質的に同じ生物学的機能または活性を保持してい
る、すなわち、ＣＳＢＰβとして機能するポリペプチ
ド、または、たとえそのポリペプチドがＣＳＢＰβとし
て機能しなくてもそのリガンドまたは結合分子に結合す
る能力を保持している、ポリペプチドを意味する。かく
して、アナログは、例えば、プロタンパク質部分の開裂
により活性化され、活性成熟ポリペプチドを産生しうる
プロタンパク質を包含する。本発明のポリペプチドは、
組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリ
ペプチドであってもよい。特定の好ましい具体例におい
て、本発明のポリペプチドは組換えポリペプチドであ
る。
【００１６】図１ないし３（配列番号２）のポリペプチ
ドのフラグメント、誘導体またはアナログは、（ｉ）１
個またはそれ以上のアミノ酸残基が保存または非保存ア
ミノ酸残基（好ましくは、保存アミノ酸残基）で置換さ
れており、かかる置換アミノ酸残基は遺伝暗号によりコ
ードされているものであっても、なくてもよいもの；
（ｉｉ）１個またはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を
含むもの；（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが別の化合物、
例えば、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例
えば、ポリエチレングリコール）と融合しているもの；
または（ｉｖ）リーダーもしくは分泌配列または成熟ポ
リペプチドの精製用に利用される配列またはプロタンパ
ク質配列などの、付加的なアミノ酸が成熟ポリペプチド
に融合しているものであってもよい。かかるフラグメン
ト、誘導体およびアナログは、本明細書の教示から当業
者に自明であると考えられる。この点において、本発明
の特に好ましい具体例には、図１ないし３（配列番号
２）に示されるＣＳＢＰβのアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド、その変種、アナログ、誘導体およびフラグメ
ント、ならびに該フラグメントの変種、アナログおよび
誘導体である。さらに、この点において本発明の特に好
ましい具体例は、ＣＳＢＰβのアミノ酸配列を有するポ
リペプチド、その変種、アナログ、誘導体およびフラグ
メント、ならびにＣＳＢＰβ結合活性／ＣＳＢＰβの機
能を保持しているフラグメントの変種、アナログおよび
誘導体である。
ドのフラグメント、誘導体またはアナログは、（ｉ）１
個またはそれ以上のアミノ酸残基が保存または非保存ア
ミノ酸残基（好ましくは、保存アミノ酸残基）で置換さ
れており、かかる置換アミノ酸残基は遺伝暗号によりコ
ードされているものであっても、なくてもよいもの；
（ｉｉ）１個またはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を
含むもの；（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが別の化合物、
例えば、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例
えば、ポリエチレングリコール）と融合しているもの；
または（ｉｖ）リーダーもしくは分泌配列または成熟ポ
リペプチドの精製用に利用される配列またはプロタンパ
ク質配列などの、付加的なアミノ酸が成熟ポリペプチド
に融合しているものであってもよい。かかるフラグメン
ト、誘導体およびアナログは、本明細書の教示から当業
者に自明であると考えられる。この点において、本発明
の特に好ましい具体例には、図１ないし３（配列番号
２）に示されるＣＳＢＰβのアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド、その変種、アナログ、誘導体およびフラグメ
ント、ならびに該フラグメントの変種、アナログおよび
誘導体である。さらに、この点において本発明の特に好
ましい具体例は、ＣＳＢＰβのアミノ酸配列を有するポ
リペプチド、その変種、アナログ、誘導体およびフラグ
メント、ならびにＣＳＢＰβ結合活性／ＣＳＢＰβの機
能を保持しているフラグメントの変種、アナログおよび
誘導体である。
【００１７】さらにこの点において特に好ましいのは、
数個、わずかな、５ないし１０、１ないし５、１ないし
３、２、１個または０個のアミノ酸残基が、いずれかの
組み合わせで置換、欠失または付加されている、図１な
いし３のＣＳＢＰβポリペプチドのアミノ酸配列を有す
る変種、アナログ、誘導体およびフラグメント、ならび
に該フラグメントの変種、アナログおよび誘導体であ
る。これらのうち特に好ましいのは、ＣＳＢＰβの性質
および活性を変化させないサイレント置換、付加および
欠失である。またこの点において、同類置換が特に好ま
しい。最も好ましいのは、置換されていない図１ないし
３のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
数個、わずかな、５ないし１０、１ないし５、１ないし
３、２、１個または０個のアミノ酸残基が、いずれかの
組み合わせで置換、欠失または付加されている、図１な
いし３のＣＳＢＰβポリペプチドのアミノ酸配列を有す
る変種、アナログ、誘導体およびフラグメント、ならび
に該フラグメントの変種、アナログおよび誘導体であ
る。これらのうち特に好ましいのは、ＣＳＢＰβの性質
および活性を変化させないサイレント置換、付加および
欠失である。またこの点において、同類置換が特に好ま
しい。最も好ましいのは、置換されていない図１ないし
３のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００１８】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、好ましくは、単離形態にて提供され、好ましく
は、等質性になるまで精製される。本発明のポリペプチ
ドは、配列番号２のポリペプチド（詳細には成熟ポリペ
プチド）、ならびに配列番号２のポリペプチドに対して
少なくとも８０％の同一性を有し、より好ましくは配列
番号２のポリペプチドに対して少なくとも９０％の類似
性（より好ましくは少なくとも９０％の同一性）を有
し、さらにより好ましくは配列番号２のポリペプチドに
対して少なくとも９５％の類似性（さらにより好ましく
は少なくとも９５％の同一性）を有するポリペプチドを
包含する。また、一般に、少なくとも３０個のアミノ
酸、好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を含有する
ポリペプチドの部分を有するそのようなポリペプチドの
部分を有する。
チドは、好ましくは、単離形態にて提供され、好ましく
は、等質性になるまで精製される。本発明のポリペプチ
ドは、配列番号２のポリペプチド（詳細には成熟ポリペ
プチド）、ならびに配列番号２のポリペプチドに対して
少なくとも８０％の同一性を有し、より好ましくは配列
番号２のポリペプチドに対して少なくとも９０％の類似
性（より好ましくは少なくとも９０％の同一性）を有
し、さらにより好ましくは配列番号２のポリペプチドに
対して少なくとも９５％の類似性（さらにより好ましく
は少なくとも９５％の同一性）を有するポリペプチドを
包含する。また、一般に、少なくとも３０個のアミノ
酸、好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を含有する
ポリペプチドの部分を有するそのようなポリペプチドの
部分を有する。
【００１９】ポリペプチドフラグメント 本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分を、ペ
プチド合成により対応する完全長のポリペプチドの製造
に使用してもよい；従って、フラグメントを完全長のポ
リペプチドの製造のための中間体として使用してもよ
い。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントまたは部
分を用いて本発明の完全長のポリヌクレオチドを合成し
てもよい。フラグメントは、「自立している」、すなわ
ち、他のアミノ酸またはポリペプチドの一部でなく、ま
たは、それらに融合しておらず、あるいは、かかるフラ
グメントが大きなポリペプチド中に含まれていてその一
部分または領域となっていてもよい。大きなポリペプチ
ド中に含まれている場合、このフラグメントは、最も好
ましくは単一の連続した領域を形成する。しかしなが
ら、いくつかのフラグメントが、単一のより大きなポリ
ペプチド中に含まれていてもよい。例えば、特定の好ま
しい具体例は、宿主中での発現のために設計された前駆
体ポリペプチド中に含まれていて、ＣＳＢＰβフラグメ
ントのアミノ末端に融合した異種プレおよびプロ−ポリ
ペプチド領域、および、該フラグメントのカルボキシル
末端に融合した付加的な領域を有している、本発明のＣ
ＳＢＰβポリペプチドのフラグメントに関する。従っ
て、本明細書の意図する１つの態様において、フラグメ
ントは、ＣＳＢＰβから由来の融合ポリペプチドまたは
融合タンパク質の一部または部分をいう。
プチド合成により対応する完全長のポリペプチドの製造
に使用してもよい；従って、フラグメントを完全長のポ
リペプチドの製造のための中間体として使用してもよ
い。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントまたは部
分を用いて本発明の完全長のポリヌクレオチドを合成し
てもよい。フラグメントは、「自立している」、すなわ
ち、他のアミノ酸またはポリペプチドの一部でなく、ま
たは、それらに融合しておらず、あるいは、かかるフラ
グメントが大きなポリペプチド中に含まれていてその一
部分または領域となっていてもよい。大きなポリペプチ
ド中に含まれている場合、このフラグメントは、最も好
ましくは単一の連続した領域を形成する。しかしなが
ら、いくつかのフラグメントが、単一のより大きなポリ
ペプチド中に含まれていてもよい。例えば、特定の好ま
しい具体例は、宿主中での発現のために設計された前駆
体ポリペプチド中に含まれていて、ＣＳＢＰβフラグメ
ントのアミノ末端に融合した異種プレおよびプロ−ポリ
ペプチド領域、および、該フラグメントのカルボキシル
末端に融合した付加的な領域を有している、本発明のＣ
ＳＢＰβポリペプチドのフラグメントに関する。従っ
て、本明細書の意図する１つの態様において、フラグメ
ントは、ＣＳＢＰβから由来の融合ポリペプチドまたは
融合タンパク質の一部または部分をいう。
【００２０】本発明のポリペプチドフラグメントの典型
例として、長さが約５ないし１５個、１０ないし２０
個、１５ないし４０個、３０ないし５５個、４１ないし
７５個、４１ないし８０個、４１ないし９０個、５０な
いし１００個、７５ないし１００個、９０ないし１１５
個、１００ないし１２５個、および１１０ないし１１３
個のアミノ酸のものを挙げることができる。この意味に
おいて、「約」とは、特に列挙した範囲、ならびに数
個、わずかな、５、４、３、２、１個のアミノ酸残基の
分だけ大きいまたは小さい範囲であって、上限または下
限、あるいはそれらの両方の範囲を包含する。例えば、
この意味においては、約４０ないし９０個のアミノ酸
は、４０プラスまたはマイナス数個、わずかな、５、
４、３、２、１個のアミノ酸残基から、９０プラスまた
はマイナス数個、わずかな、５、４、３、２、１個のア
ミノ酸残基までのポリペプチドフラグメントを意味し、
すなわち、最大４０マイナス数個のアミノ酸から９０プ
ラス数個のアミノ酸、最小４０プラス数個のアミノ酸か
ら９０マイナス数個のアミノ酸の範囲である。この点に
おいて好ましくは、上限または下限、あるいはそれらの
両方の範囲において、列挙した範囲プラスまたはマイナ
ス５個程度のアミノ酸である。上限または下限、あるい
はそれらの両方の範囲において、列挙した範囲プラスま
たはマイナス３個程度のアミノ酸が特に非常に好まし
い。上限または下限、あるいはそれらの両方の範囲にお
いて、列挙した範囲プラスまたはマイナス１個程度のア
ミノ酸、または列挙した範囲に付加または欠失のないも
のが特に非常に好ましい。この点において、約５ないし
１５個、１０ないし２０個、１５ないし４０個、３０な
いし５５個、４１ないし７５個、４１ないし８０個、４
１ないし９０個、５０ないし１００個、７５ないし１０
０個、９０ないし１１５個、１００ないし１２５個、お
よび１１０ないし１１３個のアミノ酸の長さのフラグメ
ントが、すべてのうちで最も好ましい。
例として、長さが約５ないし１５個、１０ないし２０
個、１５ないし４０個、３０ないし５５個、４１ないし
７５個、４１ないし８０個、４１ないし９０個、５０な
いし１００個、７５ないし１００個、９０ないし１１５
個、１００ないし１２５個、および１１０ないし１１３
個のアミノ酸のものを挙げることができる。この意味に
おいて、「約」とは、特に列挙した範囲、ならびに数
個、わずかな、５、４、３、２、１個のアミノ酸残基の
分だけ大きいまたは小さい範囲であって、上限または下
限、あるいはそれらの両方の範囲を包含する。例えば、
この意味においては、約４０ないし９０個のアミノ酸
は、４０プラスまたはマイナス数個、わずかな、５、
４、３、２、１個のアミノ酸残基から、９０プラスまた
はマイナス数個、わずかな、５、４、３、２、１個のア
ミノ酸残基までのポリペプチドフラグメントを意味し、
すなわち、最大４０マイナス数個のアミノ酸から９０プ
ラス数個のアミノ酸、最小４０プラス数個のアミノ酸か
ら９０マイナス数個のアミノ酸の範囲である。この点に
おいて好ましくは、上限または下限、あるいはそれらの
両方の範囲において、列挙した範囲プラスまたはマイナ
ス５個程度のアミノ酸である。上限または下限、あるい
はそれらの両方の範囲において、列挙した範囲プラスま
たはマイナス３個程度のアミノ酸が特に非常に好まし
い。上限または下限、あるいはそれらの両方の範囲にお
いて、列挙した範囲プラスまたはマイナス１個程度のア
ミノ酸、または列挙した範囲に付加または欠失のないも
のが特に非常に好ましい。この点において、約５ないし
１５個、１０ないし２０個、１５ないし４０個、３０な
いし５５個、４１ないし７５個、４１ないし８０個、４
１ないし９０個、５０ないし１００個、７５ないし１０
０個、９０ないし１１５個、１００ないし１２５個、お
よび１１０ないし１１３個のアミノ酸の長さのフラグメ
ントが、すべてのうちで最も好ましい。
【００２１】本発明の特に好ましい具体例には、ＣＳＢ
Ｐβの平滑末端の変異体がある。平滑末端の変異体は、
アミノ末端を含む連続した一連の残基（すなわち、連続
領域、一部または部分）またはカルボキシル末端を含む
連続した一連の残基の欠失、あるいは両平滑末端の変異
体のような、２つの連続した一連の残基の欠失、すなわ
ち、アミノ末端における欠失およびカルボキシル末端に
おける欠失を除く、図１ないし３（配列番号２）のアミ
ノ酸配列を有するＣＳＢＰβポリペプチド、またはその
変種または誘導体を包含する。本発明の膜結合レセプタ
ーの特に好ましいフラグメントとして、付随するトラン
スメンブランのない細胞外ドメインからなる可溶形のレ
セプターが挙げられ、細胞質ドメインまたはトランスメ
ンブラン領域が欠失していることで、細胞外ドメインを
細胞質ドメインに直接融合させるレセプターが得られ
る。する。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０３６２
０を参照のこと。前記した範囲の大きさを有するフラグ
メントもまた平滑末端フラグメントの好ましい具体例で
あり、フラグメントのうちそのフラグメントが特に好ま
しい。
Ｐβの平滑末端の変異体がある。平滑末端の変異体は、
アミノ末端を含む連続した一連の残基（すなわち、連続
領域、一部または部分）またはカルボキシル末端を含む
連続した一連の残基の欠失、あるいは両平滑末端の変異
体のような、２つの連続した一連の残基の欠失、すなわ
ち、アミノ末端における欠失およびカルボキシル末端に
おける欠失を除く、図１ないし３（配列番号２）のアミ
ノ酸配列を有するＣＳＢＰβポリペプチド、またはその
変種または誘導体を包含する。本発明の膜結合レセプタ
ーの特に好ましいフラグメントとして、付随するトラン
スメンブランのない細胞外ドメインからなる可溶形のレ
セプターが挙げられ、細胞質ドメインまたはトランスメ
ンブラン領域が欠失していることで、細胞外ドメインを
細胞質ドメインに直接融合させるレセプターが得られ
る。する。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０３６２
０を参照のこと。前記した範囲の大きさを有するフラグ
メントもまた平滑末端フラグメントの好ましい具体例で
あり、フラグメントのうちそのフラグメントが特に好ま
しい。
【００２２】本発明のこの態様において、ＣＳＢＰβの
構造的または機能的属性によって特徴づけられるフラグ
メントも好ましい。この点において本発明の好ましい具
体例は、ＣＳＢＰβのアルファ−ヘリックスおよびアル
ファ−ヘリックス形成領域（「アルファ−領域」）、ベ
ータ−シートおよびベータ−シート形成領域（「ベータ
−領域」）、ターンおよびターン形成領域（「ターン領
域」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイル−領
域」）、親水領域、疎水領域、アルファ両親媒性領域、
ベータ両親媒性領域、可動性領域、界面形成領域および
高抗原性指数領域を含んでなるフラグメントを包含す
る。
構造的または機能的属性によって特徴づけられるフラグ
メントも好ましい。この点において本発明の好ましい具
体例は、ＣＳＢＰβのアルファ−ヘリックスおよびアル
ファ−ヘリックス形成領域（「アルファ−領域」）、ベ
ータ−シートおよびベータ−シート形成領域（「ベータ
−領域」）、ターンおよびターン形成領域（「ターン領
域」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイル−領
域」）、親水領域、疎水領域、アルファ両親媒性領域、
ベータ両親媒性領域、可動性領域、界面形成領域および
高抗原性指数領域を含んでなるフラグメントを包含す
る。
【００２３】この点において、非常に好ましい具体例に
は、いくつかの構造特性、例えば、前記した特性のいく
つかを組み合わせたＣＳＢＰβの領域からなるものがあ
る。この点において、図１ないし３の約１０ないし約２
０、約４０ないし約５０、約７０ないし約９０および約
１００ないし約１１３の残基によって限定される領域が
特に好ましい領域であり、そのすべては、ターン領域、
親水領域、可動性領域、界面形成領域および高抗原性指
数領域の高度に特徴的なアミノ酸組成物によって特徴づ
けられる。かかる領域はより大きなポリペプチド中に含
まれていてもよく、あるいは前記のごとくそれら自体本
発明の好ましいフラグメントであってもよい。このパラ
グラフにて用いる「約」なる語は、一般に、フラグメン
トに関して前記した意味を有することが理解されよう。
は、いくつかの構造特性、例えば、前記した特性のいく
つかを組み合わせたＣＳＢＰβの領域からなるものがあ
る。この点において、図１ないし３の約１０ないし約２
０、約４０ないし約５０、約７０ないし約９０および約
１００ないし約１１３の残基によって限定される領域が
特に好ましい領域であり、そのすべては、ターン領域、
親水領域、可動性領域、界面形成領域および高抗原性指
数領域の高度に特徴的なアミノ酸組成物によって特徴づ
けられる。かかる領域はより大きなポリペプチド中に含
まれていてもよく、あるいは前記のごとくそれら自体本
発明の好ましいフラグメントであってもよい。このパラ
グラフにて用いる「約」なる語は、一般に、フラグメン
トに関して前記した意味を有することが理解されよう。
【００２４】さらに好ましい領域はＣＳＢＰβの活性を
媒介する領域である。この点において、類似活性または
改善された活性を有するものまたは望ましくない活性の
減少したものを含め、ＣＳＢＰβの化学的、生物学的活
性または他の活性を有するフラグメントが最も好まし
い。この点において、関連するポリペプチドの活性領域
に対して配列または位置、あるいは両方が相同的である
領域を含むフラグメントが非常に好ましい。本発明はま
た、とりわけ、前記したフラグメントをコードするポリ
ヌクレオチド、該フラグメントをコードするポリヌクレ
オチドとハイブリッド形成するポリヌクレオチド、特に
ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成するも
の、および該フラグメントをコードするポリヌクレオチ
ドを増幅するためのＰＣＲプライマーなどのポリヌクレ
オチドに関する。これらの点において、好ましいポリヌ
クレオチドは、前記のような好ましいフラグメントに対
応するポリヌクレオチドである。
媒介する領域である。この点において、類似活性または
改善された活性を有するものまたは望ましくない活性の
減少したものを含め、ＣＳＢＰβの化学的、生物学的活
性または他の活性を有するフラグメントが最も好まし
い。この点において、関連するポリペプチドの活性領域
に対して配列または位置、あるいは両方が相同的である
領域を含むフラグメントが非常に好ましい。本発明はま
た、とりわけ、前記したフラグメントをコードするポリ
ヌクレオチド、該フラグメントをコードするポリヌクレ
オチドとハイブリッド形成するポリヌクレオチド、特に
ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成するも
の、および該フラグメントをコードするポリヌクレオチ
ドを増幅するためのＰＣＲプライマーなどのポリヌクレ
オチドに関する。これらの点において、好ましいポリヌ
クレオチドは、前記のような好ましいフラグメントに対
応するポリヌクレオチドである。
【００２５】ベクター、宿主細胞、発現 本発明のタンパク質は、組換え遺伝子工学技法により製
造されるのが好ましい。ＤＮＡを遺伝子発現に要求され
る必須の発現調節領域（例えば、調節領域）に機能的に
連結させることにより、単離した核酸、好ましくは、Ｄ
ＮＡを発現ベクターに導入することができる。ベクター
は、当該分野にて周知の方法（Ausubelら、前掲）によ
り、原核生物（例えば、細菌）または真核生物（例え
ば、酵母または哺乳動物）細胞などの適当な宿主細胞に
導入することができる。製造または単離した所望のタン
パク質についてのコーディング配列をいずれか適当なベ
クターまたはレプリコンにクローンすることができる。
多くのクローニングベクターが知られており、問題は適
当なクローニングベクターを選択することである。クロ
ーニング用組換えＤＮＡベクターおよび該ベクターが形
質転換できる宿主細胞は、バクテリオファージλ（Ｅ.c
oli）、ｐＢＲ（Ｅ.coli）、ｐＡＣＹＣ１７７（Ｅ.col
i）、ｐＫＴ２３０（グラム陰性菌）、ｐＧＶ１１０６
（グラム陰性菌）、ｐＬＡＦＲ１（グラム陰性菌）、ｐ
ＭＥ２９０（非−Ｅ.coliグラム陰性菌）、ｐＨＶ１４
（Ｅ.coliおよびBacillus subtilis）、ｐＢＤ９（Baci
llus）、ｐＵ６１（Streptomyces）、ｐＵＣ６（Strept
omyces）、Ylp５（Saccharomyces）、バキュロウイルス
昆虫細胞系、ＹＣｐ１９（Saccharomyces）を包含す
る。一般には、「ＤＮＡ Cloning」 Vols.Ｉ＆ＩＩ、Gl
overら編、ＩＲＬ Press Oxford（1985）（1987）およ
びT.Maniatisら、「Molecular Cloning」、Cold Spring
Harbor Laboratory（1982）を参照のこと。
造されるのが好ましい。ＤＮＡを遺伝子発現に要求され
る必須の発現調節領域（例えば、調節領域）に機能的に
連結させることにより、単離した核酸、好ましくは、Ｄ
ＮＡを発現ベクターに導入することができる。ベクター
は、当該分野にて周知の方法（Ausubelら、前掲）によ
り、原核生物（例えば、細菌）または真核生物（例え
ば、酵母または哺乳動物）細胞などの適当な宿主細胞に
導入することができる。製造または単離した所望のタン
パク質についてのコーディング配列をいずれか適当なベ
クターまたはレプリコンにクローンすることができる。
多くのクローニングベクターが知られており、問題は適
当なクローニングベクターを選択することである。クロ
ーニング用組換えＤＮＡベクターおよび該ベクターが形
質転換できる宿主細胞は、バクテリオファージλ（Ｅ.c
oli）、ｐＢＲ（Ｅ.coli）、ｐＡＣＹＣ１７７（Ｅ.col
i）、ｐＫＴ２３０（グラム陰性菌）、ｐＧＶ１１０６
（グラム陰性菌）、ｐＬＡＦＲ１（グラム陰性菌）、ｐ
ＭＥ２９０（非−Ｅ.coliグラム陰性菌）、ｐＨＶ１４
（Ｅ.coliおよびBacillus subtilis）、ｐＢＤ９（Baci
llus）、ｐＵ６１（Streptomyces）、ｐＵＣ６（Strept
omyces）、Ylp５（Saccharomyces）、バキュロウイルス
昆虫細胞系、ＹＣｐ１９（Saccharomyces）を包含す
る。一般には、「ＤＮＡ Cloning」 Vols.Ｉ＆ＩＩ、Gl
overら編、ＩＲＬ Press Oxford（1985）（1987）およ
びT.Maniatisら、「Molecular Cloning」、Cold Spring
Harbor Laboratory（1982）を参照のこと。
【００２６】遺伝子は、所望のタンパク質をコードする
ＤＮＡ配列がこの発現構築物を含有するベクターにより
形質転換される宿主細胞のＲＮＡ中に転写されるよう
に、プロモーター、リボソーム結合部位（細菌発現用）
および所望によりオペレーター（包括的に本明細書にて
「制御（control）」因子と称される）の制御下に置く
ことができる。コーディング配列はシグナルペプチドま
たはリーダー配列を有していてもいなくてもよい。本発
明のサブユニット抗原は、例えば、Ｅ.coli tacプロモ
ーターまたはタンパク質Ａ遺伝子（ｓｐａ）プロモータ
ーおよびシグナル配列を用いて発現させることができ
る。リーダー配列は、細菌宿主により翻訳後プロセッシ
ングにより除去することができる。例えば、米国特許第
4431739号；第4425437号；第4338397号を参照のこと。
ＤＮＡ配列がこの発現構築物を含有するベクターにより
形質転換される宿主細胞のＲＮＡ中に転写されるよう
に、プロモーター、リボソーム結合部位（細菌発現用）
および所望によりオペレーター（包括的に本明細書にて
「制御（control）」因子と称される）の制御下に置く
ことができる。コーディング配列はシグナルペプチドま
たはリーダー配列を有していてもいなくてもよい。本発
明のサブユニット抗原は、例えば、Ｅ.coli tacプロモ
ーターまたはタンパク質Ａ遺伝子（ｓｐａ）プロモータ
ーおよびシグナル配列を用いて発現させることができ
る。リーダー配列は、細菌宿主により翻訳後プロセッシ
ングにより除去することができる。例えば、米国特許第
4431739号；第4425437号；第4338397号を参照のこと。
【００２７】制御配列に加えて、宿主細胞の増殖に関連
してタンパク質配列の発現を調節することのできる調節
配列を加えることが望ましい。調節配列は当業者に知ら
れており、例えば、調節化合物の存在を含め、化学的ま
たは物理的刺激に応答してターンオンまたはオフされる
ように遺伝子の発現を引き起こすものが挙げられる。別
の型の調節因子、例えば、エンハンサー配列もまた、ベ
クター中にあってもよい。
してタンパク質配列の発現を調節することのできる調節
配列を加えることが望ましい。調節配列は当業者に知ら
れており、例えば、調節化合物の存在を含め、化学的ま
たは物理的刺激に応答してターンオンまたはオフされる
ように遺伝子の発現を引き起こすものが挙げられる。別
の型の調節因子、例えば、エンハンサー配列もまた、ベ
クター中にあってもよい。
【００２８】発現ベクターは特定のコーディング配列が
適当な調節配列を有するベクター中に配置されるように
構築される。コーディング配列が制御配列の「制御」下
で転写されるように、制御配列に関してそのコーディン
グ配列を位置付けかつ配向させる（すなわち、制御配列
のＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼがコーディ
ング配列を転写する）。目的とする特定のタンパク質を
コードする配列を修飾することがこの目的を達成するの
に望ましいかもしれない。例えば、ある場合には、すな
わち、読み枠を維持するために、適当な配向を有する制
御配列に結合するように配列を修飾する必要があるかも
しれない。前記したクローニングベクターなどのベクタ
ーに挿入する前に、制御配列および他の調節配列をコー
ディング配列にライゲートすることもできる。別法とし
て、既に制御配列および適当な制限部位を有する発現ベ
クターに直接的にそのコーディング配列をクローン化さ
せることもできる。
適当な調節配列を有するベクター中に配置されるように
構築される。コーディング配列が制御配列の「制御」下
で転写されるように、制御配列に関してそのコーディン
グ配列を位置付けかつ配向させる（すなわち、制御配列
のＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼがコーディ
ング配列を転写する）。目的とする特定のタンパク質を
コードする配列を修飾することがこの目的を達成するの
に望ましいかもしれない。例えば、ある場合には、すな
わち、読み枠を維持するために、適当な配向を有する制
御配列に結合するように配列を修飾する必要があるかも
しれない。前記したクローニングベクターなどのベクタ
ーに挿入する前に、制御配列および他の調節配列をコー
ディング配列にライゲートすることもできる。別法とし
て、既に制御配列および適当な制限部位を有する発現ベ
クターに直接的にそのコーディング配列をクローン化さ
せることもできる。
【００２９】ある場合には、ポリペプチドを宿主生物か
ら分泌させ、つづいて分泌シグナルの切断を生じさせる
配列を加えることが望ましい。別法として、遺伝子融合
を、目的とする結合タンパク質をコードする遺伝子を他
の所望の特性を有する産物をコードする遺伝子に融合さ
せることで形成させてもよい。例えば、融合対は、結合
タンパク質を選択する別の手段として用いることのでき
る公知のアッセイ可能な活性（例えば、酵素活性）を付
与することができる。結合タンパク質（一般に、サイト
ゾル成分）を細胞表面に融合タンパク質の形態で表すこ
とができるように、融合対は細胞表面因子などの構造因
子とすることができる。また、その融合対は、特異的抗
体および試薬で検出でき、精製の補助剤として作用して
もよい、ペプチドまたはタンパク質フラグメントとする
こともできる（例えば、His尾部、グルタチオンＳ-トラ
ンスフェラーゼ融合）。目的とするタンパク質の変異体
またはアナログを産生することも望ましい。変異体また
はアナログは、タンパク質をコードする配列の一部の欠
失により、一の配列の挿入により、および／またはその
配列内での１またはそれ以上のヌクレオチドの置換によ
り製造できる。部位定方向突然変異誘発などのヌクレオ
チド配列を修飾する技法および融合タンパク質を形成す
る方法は当業者に周知である。例えば、Ｔ.Maniatis
ら、前掲；ＤＮＡ Cloninng、Vols.ＩおよびＩＩ、前
掲；Nucleic Acid Hybridization、前掲を参照のこと。
ら分泌させ、つづいて分泌シグナルの切断を生じさせる
配列を加えることが望ましい。別法として、遺伝子融合
を、目的とする結合タンパク質をコードする遺伝子を他
の所望の特性を有する産物をコードする遺伝子に融合さ
せることで形成させてもよい。例えば、融合対は、結合
タンパク質を選択する別の手段として用いることのでき
る公知のアッセイ可能な活性（例えば、酵素活性）を付
与することができる。結合タンパク質（一般に、サイト
ゾル成分）を細胞表面に融合タンパク質の形態で表すこ
とができるように、融合対は細胞表面因子などの構造因
子とすることができる。また、その融合対は、特異的抗
体および試薬で検出でき、精製の補助剤として作用して
もよい、ペプチドまたはタンパク質フラグメントとする
こともできる（例えば、His尾部、グルタチオンＳ-トラ
ンスフェラーゼ融合）。目的とするタンパク質の変異体
またはアナログを産生することも望ましい。変異体また
はアナログは、タンパク質をコードする配列の一部の欠
失により、一の配列の挿入により、および／またはその
配列内での１またはそれ以上のヌクレオチドの置換によ
り製造できる。部位定方向突然変異誘発などのヌクレオ
チド配列を修飾する技法および融合タンパク質を形成す
る方法は当業者に周知である。例えば、Ｔ.Maniatis
ら、前掲；ＤＮＡ Cloninng、Vols.ＩおよびＩＩ、前
掲；Nucleic Acid Hybridization、前掲を参照のこと。
【００３０】多数の原核細胞発現ベクターが当該分野に
て知られている。例えば、米国特許第4578355号；第444
0859号；第4436815号；第4431740号；第4431739号；第4
428941号；第4425437号；第4418149号；第4411994号；
第4366246号；第4342832号を参照；さらに、英国特許出
願GB2121054；GB2008123；GB2007675；および欧州特許
出願103395を参照のこと。酵母発現ベクターも知られて
いる。例えば、米国特許第4446235号；第4443539号；第
4430428号を参照；さらに、欧州特許出願103409；10056
1；96491を参照のこと。ＳＶ４０後期プロモーターを用
いて哺乳動物細胞にて発現を起こさせるｐＳＶ２ｎｅｏ
（Ｊ.Mol.Appl.Genet. １：327-341に記載）またはｐＣ
ＤＮＡ１ｎｅｏ、ＣＭＶプロモーターを用いて発現を起
こさせるｐＣＤＮＡ１より由来のベクター（Mol.Cell.B
iol. 7：4125-29）。これら後者の２つのベクターを哺
乳動物細胞における一時的または安定的（例えば、G418
またはヒドロマイシン耐性を用いて）発現に用いること
ができる。昆虫細胞発現系、例えば、Drosophila（例え
ば、ＰＣＴ出願ＵＳ８９／０５１５５およびＵＳ９１／
０６８３８ならびにＥＰ出願８８／３０４０９３．３を
参照のこと）およびバキュロウイスル発現系も有用であ
る。
て知られている。例えば、米国特許第4578355号；第444
0859号；第4436815号；第4431740号；第4431739号；第4
428941号；第4425437号；第4418149号；第4411994号；
第4366246号；第4342832号を参照；さらに、英国特許出
願GB2121054；GB2008123；GB2007675；および欧州特許
出願103395を参照のこと。酵母発現ベクターも知られて
いる。例えば、米国特許第4446235号；第4443539号；第
4430428号を参照；さらに、欧州特許出願103409；10056
1；96491を参照のこと。ＳＶ４０後期プロモーターを用
いて哺乳動物細胞にて発現を起こさせるｐＳＶ２ｎｅｏ
（Ｊ.Mol.Appl.Genet. １：327-341に記載）またはｐＣ
ＤＮＡ１ｎｅｏ、ＣＭＶプロモーターを用いて発現を起
こさせるｐＣＤＮＡ１より由来のベクター（Mol.Cell.B
iol. 7：4125-29）。これら後者の２つのベクターを哺
乳動物細胞における一時的または安定的（例えば、G418
またはヒドロマイシン耐性を用いて）発現に用いること
ができる。昆虫細胞発現系、例えば、Drosophila（例え
ば、ＰＣＴ出願ＵＳ８９／０５１５５およびＵＳ９１／
０６８３８ならびにＥＰ出願８８／３０４０９３．３を
参照のこと）およびバキュロウイスル発現系も有用であ
る。
【００３１】選択した発現系および宿主に応じて、前記
した発現系により形質転換された宿主細胞を目的とする
タンパク質を発現させる条件下で増殖させることで本発
明のタンパク質を産生する。ついで、該タンパク質を宿
主細胞より単離して精製する。発現系がタンパク質を増
殖培地に分泌するならば、タンパク質はその培地より直
接精製することができる。タンパク質が分泌されないな
らば、細胞ライゼートより単離するか、または細胞膜フ
ラクションより回収される。適当な培養条件および回収
方法の選択は当業者の範囲内である。
した発現系により形質転換された宿主細胞を目的とする
タンパク質を発現させる条件下で増殖させることで本発
明のタンパク質を産生する。ついで、該タンパク質を宿
主細胞より単離して精製する。発現系がタンパク質を増
殖培地に分泌するならば、タンパク質はその培地より直
接精製することができる。タンパク質が分泌されないな
らば、細胞ライゼートより単離するか、または細胞膜フ
ラクションより回収される。適当な培養条件および回収
方法の選択は当業者の範囲内である。
【００３２】本発明のタンパク質を同定する別法は、遺
伝子ライブラリーを構築し、その得られたクローンを用
いてＥ.coliを形質転換させ、プールし、所望の結合タ
ンパク質に対するポリクローナル血清またはモノクロー
ナル抗体を用いて個々のコロニーをスクリーニングする
ことによる。本発明のタンパク質はまた、公知アミノ酸
配列または目的とする遺伝子のＤＮＡ配列から由来のア
ミノ酸配列を用いて、固相ペプチド合成などの化学合成
により産生することもできる。かかる方法は当業者に知
られている。特に、ペプチドの化学合成は好ましくはな
い。
伝子ライブラリーを構築し、その得られたクローンを用
いてＥ.coliを形質転換させ、プールし、所望の結合タ
ンパク質に対するポリクローナル血清またはモノクロー
ナル抗体を用いて個々のコロニーをスクリーニングする
ことによる。本発明のタンパク質はまた、公知アミノ酸
配列または目的とする遺伝子のＤＮＡ配列から由来のア
ミノ酸配列を用いて、固相ペプチド合成などの化学合成
により産生することもできる。かかる方法は当業者に知
られている。特に、ペプチドの化学合成は好ましくはな
い。
【００３３】アッセイ本発明はまた、ＣＳＢＰβに結合
することが知られていないリガンドがそのようなタンパ
ク質に結合することができるかどうかを測定する方法を
提供するものである。該方法は、同定すべきリガンドを
哺乳動物細胞からのサイトゾルフラクションと接触さ
せ、ＣＳＡＩＤ結合アッセイ（Leeら、Nature 372：739
-746；および以前のＣＳＢＰファイリング）にて、既知
の放射性ＣＳＡＩＤと競合するその能力を測定すること
からなる。別法は、同定すべきリガンドを、かかるレセ
プターに結合すると前に同定されたリガンドと結合する
のに十分な条件下で、ＣＳＢＰβのコーディング配列を
発現する全細胞と接触させることからなる。他の具体例
において、細胞膜あるいはＣＳＢＰβ融合体または単離
した遊離もしくは固体支持体に固定したＣＳＢＰβを有
するサイトゾルフラクションを用いて試験すべきリガン
ドの結合能を測定することもできる。ＣＳＢＰβを発現
させる目的に組換え細胞を用いる場合、あるとしても結
合が目的とする発現タンパク質の存在に起因するよう
に、内因的ＣＳＢＰβ活性のほとんどないまたは全くな
い細胞を用いることが好ましい。また、ＣＳＢＰβを、
結合に寄与するかもしれない内因性細胞タンパク質から
分離できるペプチドまたはタンパク質フラグメントとの
融合体として設計する。前記したように、特異的に設計
されたレセプター結合のインヒビターを構築することが
できる。例えば、融合タンパク質は本発明のＣＳＢＰβ
をＣＳＢＰβ／リガンド結合に感受的なタンパク質ドメ
インと融合させることで製造できる。本明細書でインヒ
ビタードメインと称されるそのようなドメインは、それ
自身で、または補助分子と一緒になって、レセプター・
リガンド結合を指示する分析的に検出できるシグナルを
発する能力を有する。この方法の変法は、ＣＳＢＰβを
ＴＨＰ．１または他の哺乳細胞にて融合タンパク質（例
えば、ＦＬＡＧペプチドと融合した）として発現させ、
ＴＨＰ．１細胞を適当に刺激し、前処理した後、その融
合ペプチドを組換えＣＳＢＰβを刺激する手段として用
いることである。かかる発現は、ウイルスプロモータ
ー、例えば、ＣＭＶ、ＲＳＶおよびポリアデニル化配
列、et.ＳＶ４０、ウシ成長ホルモンおよびG４１８など
の選択可能なマーカーまたは安定したトランスフェクタ
ントを選択するためのヒグロマイシンを利用する多くの
哺乳動物発現ベクターで達成することができる。
することが知られていないリガンドがそのようなタンパ
ク質に結合することができるかどうかを測定する方法を
提供するものである。該方法は、同定すべきリガンドを
哺乳動物細胞からのサイトゾルフラクションと接触さ
せ、ＣＳＡＩＤ結合アッセイ（Leeら、Nature 372：739
-746；および以前のＣＳＢＰファイリング）にて、既知
の放射性ＣＳＡＩＤと競合するその能力を測定すること
からなる。別法は、同定すべきリガンドを、かかるレセ
プターに結合すると前に同定されたリガンドと結合する
のに十分な条件下で、ＣＳＢＰβのコーディング配列を
発現する全細胞と接触させることからなる。他の具体例
において、細胞膜あるいはＣＳＢＰβ融合体または単離
した遊離もしくは固体支持体に固定したＣＳＢＰβを有
するサイトゾルフラクションを用いて試験すべきリガン
ドの結合能を測定することもできる。ＣＳＢＰβを発現
させる目的に組換え細胞を用いる場合、あるとしても結
合が目的とする発現タンパク質の存在に起因するよう
に、内因的ＣＳＢＰβ活性のほとんどないまたは全くな
い細胞を用いることが好ましい。また、ＣＳＢＰβを、
結合に寄与するかもしれない内因性細胞タンパク質から
分離できるペプチドまたはタンパク質フラグメントとの
融合体として設計する。前記したように、特異的に設計
されたレセプター結合のインヒビターを構築することが
できる。例えば、融合タンパク質は本発明のＣＳＢＰβ
をＣＳＢＰβ／リガンド結合に感受的なタンパク質ドメ
インと融合させることで製造できる。本明細書でインヒ
ビタードメインと称されるそのようなドメインは、それ
自身で、または補助分子と一緒になって、レセプター・
リガンド結合を指示する分析的に検出できるシグナルを
発する能力を有する。この方法の変法は、ＣＳＢＰβを
ＴＨＰ．１または他の哺乳細胞にて融合タンパク質（例
えば、ＦＬＡＧペプチドと融合した）として発現させ、
ＴＨＰ．１細胞を適当に刺激し、前処理した後、その融
合ペプチドを組換えＣＳＢＰβを刺激する手段として用
いることである。かかる発現は、ウイルスプロモータ
ー、例えば、ＣＭＶ、ＲＳＶおよびポリアデニル化配
列、et.ＳＶ４０、ウシ成長ホルモンおよびG４１８など
の選択可能なマーカーまたは安定したトランスフェクタ
ントを選択するためのヒグロマイシンを利用する多くの
哺乳動物発現ベクターで達成することができる。
【００３４】そのような融合体を発現するトランスフェ
クションまたは形質転換した細胞からのサイトゾル調製
物を利用してもよい。リガンドを同定するのに有用な前
記した技法はすべて、薬物スクリーニングおよび薬物開
発プロトコルにおいても有用である。
クションまたは形質転換した細胞からのサイトゾル調製
物を利用してもよい。リガンドを同定するのに有用な前
記した技法はすべて、薬物スクリーニングおよび薬物開
発プロトコルにおいても有用である。
【００３５】また、ＳＢ２０２１９０または関連する化
合物との競合結合アッセイにおいて、粗製ＴＨＰ．１細
胞ライゼートの代わりに精製した組換えタンパク質を用
いることもできる（Leeら、Nature 372：739-746）。こ
のアッセイはＣＳＢＰβと結合する新規化合物について
スクリーニングするのに、あるいは結合することがわか
っている化合物の変化を評価する方法として有用であ
る。精製したタンパク質の有効性は粗製材料について前
記したアッセイから選択的にアッセイを設定できること
である。例えば、タンパク質が、比色定量アッセイにお
ける設定のためのタンパク質結合部位などのタグ、例え
ば、複合抗体に、または酵素活性を直接検出するための
酵素、例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ
もしくはアルカリ性ホスファターゼに共有結合するとす
れば、固体マトリックス上に見られる新規な化合物への
結合が検出できる。かかる化合物は低分子量有機分子、
ペプチド、ペプトイドおよびタンパク質を包含し得る。
後者においては、該タンパク質を、そのシグナル化カス
ケードにおける他のタンパク質、例えば、活性化単球に
おけるサイトカイン翻訳の活性化についての経路にある
ものを単離する方法として用いることができる。また、
ＣＳＡＩＤ結合機構により作用する哺乳動物細胞内にあ
る天然の調節分子を単離するのに該タンパク質を用いて
もよい。最後に、該タンパク質を用いてファージ表面に
見られる標的ペプチドを同定することができる。
合物との競合結合アッセイにおいて、粗製ＴＨＰ．１細
胞ライゼートの代わりに精製した組換えタンパク質を用
いることもできる（Leeら、Nature 372：739-746）。こ
のアッセイはＣＳＢＰβと結合する新規化合物について
スクリーニングするのに、あるいは結合することがわか
っている化合物の変化を評価する方法として有用であ
る。精製したタンパク質の有効性は粗製材料について前
記したアッセイから選択的にアッセイを設定できること
である。例えば、タンパク質が、比色定量アッセイにお
ける設定のためのタンパク質結合部位などのタグ、例え
ば、複合抗体に、または酵素活性を直接検出するための
酵素、例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ
もしくはアルカリ性ホスファターゼに共有結合するとす
れば、固体マトリックス上に見られる新規な化合物への
結合が検出できる。かかる化合物は低分子量有機分子、
ペプチド、ペプトイドおよびタンパク質を包含し得る。
後者においては、該タンパク質を、そのシグナル化カス
ケードにおける他のタンパク質、例えば、活性化単球に
おけるサイトカイン翻訳の活性化についての経路にある
ものを単離する方法として用いることができる。また、
ＣＳＡＩＤ結合機構により作用する哺乳動物細胞内にあ
る天然の調節分子を単離するのに該タンパク質を用いて
もよい。最後に、該タンパク質を用いてファージ表面に
見られる標的ペプチドを同定することができる。
【００３６】ＣＳＢＰβがタンパク質キナーゼをコード
するという理解は、組換え形態を用いてタンパク質キナ
ーゼ活性を確立することができることを示唆する。典型
的には、これはＣＳＢＰβをγ−32Ｐ−ＡＴＰの存在下
でタンパク質またはペプチド基質と共に直接インキュベ
ートし、つづいて分離し、計数することにより基質中に
取り込まれた放射性活性を測定することからなる。分離
法は、免疫沈降法、基質と遠心分離により分離させたビ
ーズとの結合操作またはシンチレーション近接アッセイ
による取り込み量の測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥつづいてオ
ートラジオグラフィーまたはバイオセンサー分析を包含
する。特異的な基質はいまなおわかっていないが、候補
基質として、ＣＳＢＰβそれ自体（オートリン酸化）、
ミエリン塩基性タンパク質、ＡＴＦ２、ＭＡＰＫＡＰキ
ナーゼ−２、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−３（McLaughlin
ら、J.Biol.Chem. 271：8488−8492（1996）およびその
中の引用文献）および公知ＭＡＰキナーゼ基質に関連す
るペプチドが挙げられる。他の基質は、ＣＳＢＰβを、
固体支持体に結合するかまたはファージに見られる（上
記参照）無作為なペプチドとインキュベートすることに
より、またはＣＳＢＰβを哺乳動物細胞ライゼート（例
えば、ＴＨＰ．１細胞ライゼート）およびγ−32Ｐ−Ａ
ＴＰと一緒にインキュベートし、つづいて標識化標的タ
ンパク質を分離し、配列決定することにより判明するか
もしれない。キナーゼ活性はまた、アンチホスホチロシ
ン抗体を用いることで検出される。ＣＳＢＰβのタンパ
ク質キナーゼ活性は特異的ＭＡＰキナーゼとのインキュ
ベートを必要とするかもしれない。これはＣＳＢＰβを
刺激した真核細胞（例えば、ＬＰＳ処理ＴＨＰ．１細
胞）からのライゼートおよびＡＴＰとプレインキュベー
トに付すことで達成できる。別法として、高容量オスモ
ル濃度条件にて増殖させた、ヒトＣＳＢＰβを発現する
酵母のＨＯＧ１欠失株からより活性な形態のＣＳＢＰβ
を単離することも可能である（例えば、Kumarら、J.Bio
l.Chem. 270：29043−29046（1995）を参照のこと）。
するという理解は、組換え形態を用いてタンパク質キナ
ーゼ活性を確立することができることを示唆する。典型
的には、これはＣＳＢＰβをγ−32Ｐ−ＡＴＰの存在下
でタンパク質またはペプチド基質と共に直接インキュベ
ートし、つづいて分離し、計数することにより基質中に
取り込まれた放射性活性を測定することからなる。分離
法は、免疫沈降法、基質と遠心分離により分離させたビ
ーズとの結合操作またはシンチレーション近接アッセイ
による取り込み量の測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥつづいてオ
ートラジオグラフィーまたはバイオセンサー分析を包含
する。特異的な基質はいまなおわかっていないが、候補
基質として、ＣＳＢＰβそれ自体（オートリン酸化）、
ミエリン塩基性タンパク質、ＡＴＦ２、ＭＡＰＫＡＰキ
ナーゼ−２、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−３（McLaughlin
ら、J.Biol.Chem. 271：8488−8492（1996）およびその
中の引用文献）および公知ＭＡＰキナーゼ基質に関連す
るペプチドが挙げられる。他の基質は、ＣＳＢＰβを、
固体支持体に結合するかまたはファージに見られる（上
記参照）無作為なペプチドとインキュベートすることに
より、またはＣＳＢＰβを哺乳動物細胞ライゼート（例
えば、ＴＨＰ．１細胞ライゼート）およびγ−32Ｐ−Ａ
ＴＰと一緒にインキュベートし、つづいて標識化標的タ
ンパク質を分離し、配列決定することにより判明するか
もしれない。キナーゼ活性はまた、アンチホスホチロシ
ン抗体を用いることで検出される。ＣＳＢＰβのタンパ
ク質キナーゼ活性は特異的ＭＡＰキナーゼとのインキュ
ベートを必要とするかもしれない。これはＣＳＢＰβを
刺激した真核細胞（例えば、ＬＰＳ処理ＴＨＰ．１細
胞）からのライゼートおよびＡＴＰとプレインキュベー
トに付すことで達成できる。別法として、高容量オスモ
ル濃度条件にて増殖させた、ヒトＣＳＢＰβを発現する
酵母のＨＯＧ１欠失株からより活性な形態のＣＳＢＰβ
を単離することも可能である（例えば、Kumarら、J.Bio
l.Chem. 270：29043−29046（1995）を参照のこと）。
【００３７】これらのアッセイで、インビトロにおける
ＣＳＢＰβキナーゼ活性、ＣＳＡＩＤＳの公知特性を阻
害する化合物を発見し、修飾することができる（Lee
ら、Nature、前掲）。かかる化合物は前記した化合物と
の比較方法でサイトカイン合成を遮断するであろう。そ
の化合物はまた、それ自体がサイトカイン生成を遮断す
る新規な化合物を発見するための実現可能な標的である
新規な基質の発見をもたらしうる。
ＣＳＢＰβキナーゼ活性、ＣＳＡＩＤＳの公知特性を阻
害する化合物を発見し、修飾することができる（Lee
ら、Nature、前掲）。かかる化合物は前記した化合物と
の比較方法でサイトカイン合成を遮断するであろう。そ
の化合物はまた、それ自体がサイトカイン生成を遮断す
る新規な化合物を発見するための実現可能な標的である
新規な基質の発見をもたらしうる。
【００３８】他のＭＡＰキナーゼと同様、ＣＳＢＰβは
ＭＡＰキナーゼキナーゼにより活性化され、したがって
組換えタンパク質はＣＳＢＰβのＭＡＰキナーゼキナー
ゼと推定されるものでリン酸化される能力を測定する第
2アッセイを確立させると考えられる。この場合、刺激
細胞ライゼートからのフラクション（例えば、ＬＰＳで
刺激したＴＨＰ．１細胞）を、γ−32Ｐ−ＡＴＰの存在
下でＣＳＢＰβとインキュベートし、32Ｐ−標識のＣＳ
ＢＰβへの取り込み量を分離および計数により測定す
る。分離は多くの方法で行うことができる：一の方法
は、ペプチドまたはタンパク質に融合したＣＳＢＰβを
用い、そのペプチドまたはタンパク質依存性抗体とのア
フィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降を介し
て分離することにある。別法として、ＣＳＢＰβをビー
ズに直接接合させるか、または融合ペプチドまたはタン
パク質（例えば、ＦＬＡＧ（ペプチド）、グルタチオニ
ン−Ｓ−トランスフェラーゼ）を介して結合させ、細胞
ライゼートとインキュベートした後で遠心分離により分
離することもできる。さらに、ＣＳＢＰβのチロシンリ
ン酸化は市販されている抗ホスホチロシン抗体を用いる
免疫沈降またはイムノブロットで検出できる。
ＭＡＰキナーゼキナーゼにより活性化され、したがって
組換えタンパク質はＣＳＢＰβのＭＡＰキナーゼキナー
ゼと推定されるものでリン酸化される能力を測定する第
2アッセイを確立させると考えられる。この場合、刺激
細胞ライゼートからのフラクション（例えば、ＬＰＳで
刺激したＴＨＰ．１細胞）を、γ−32Ｐ−ＡＴＰの存在
下でＣＳＢＰβとインキュベートし、32Ｐ−標識のＣＳ
ＢＰβへの取り込み量を分離および計数により測定す
る。分離は多くの方法で行うことができる：一の方法
は、ペプチドまたはタンパク質に融合したＣＳＢＰβを
用い、そのペプチドまたはタンパク質依存性抗体とのア
フィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降を介し
て分離することにある。別法として、ＣＳＢＰβをビー
ズに直接接合させるか、または融合ペプチドまたはタン
パク質（例えば、ＦＬＡＧ（ペプチド）、グルタチオニ
ン−Ｓ−トランスフェラーゼ）を介して結合させ、細胞
ライゼートとインキュベートした後で遠心分離により分
離することもできる。さらに、ＣＳＢＰβのチロシンリ
ン酸化は市販されている抗ホスホチロシン抗体を用いる
免疫沈降またはイムノブロットで検出できる。
【００３９】これらのアッセイを用いてＣＳＢＰβキナ
ーゼ活性の活性化を遮断する化合物を見い出すこと、既
に発見されている化合物の効能を改良することができ
る。これら化合物はサイトカイン合成を遮断することに
有用性があると考えられる。ヒトＣＳＢＰβは高容量オ
スモル濃度条件下で増殖させたＨＯＧ１欠失株を救う能
力を有するため、インビボにおけるＣＳＢＰβ活性を遮
断する化合物を直接スクリーニングすることができる。
例えば、化合物は高容量オスモル濃度にてＣＳＢＰβ＋
／ＨＯＧ１−酵母株の増殖を遮断するその能力について
スクリーニングすることができるが、標準的な容量オス
モル濃度での同じ株または高容量オスモル濃度でのＣＳ
ＢＰβ−／ＨＯＧ１＋株での増殖については効果がな
い。酵母をベースとするアッセイの感度は、細胞膜およ
び透過性に影響を及ぼす宿主変異を導入することにより
増大させることができる（Gaberら、Mol.Cell.Biol.
9：3447−3456（1989））。
ーゼ活性の活性化を遮断する化合物を見い出すこと、既
に発見されている化合物の効能を改良することができ
る。これら化合物はサイトカイン合成を遮断することに
有用性があると考えられる。ヒトＣＳＢＰβは高容量オ
スモル濃度条件下で増殖させたＨＯＧ１欠失株を救う能
力を有するため、インビボにおけるＣＳＢＰβ活性を遮
断する化合物を直接スクリーニングすることができる。
例えば、化合物は高容量オスモル濃度にてＣＳＢＰβ＋
／ＨＯＧ１−酵母株の増殖を遮断するその能力について
スクリーニングすることができるが、標準的な容量オス
モル濃度での同じ株または高容量オスモル濃度でのＣＳ
ＢＰβ−／ＨＯＧ１＋株での増殖については効果がな
い。酵母をベースとするアッセイの感度は、細胞膜およ
び透過性に影響を及ぼす宿主変異を導入することにより
増大させることができる（Gaberら、Mol.Cell.Biol.
9：3447−3456（1989））。
【００４０】本発明の化合物をスクリーニングする場合
において、単離した形態、固定した形態または細胞結合
した形態のＣＳＢＰβを複数の候補分子と接触させ、そ
のタンパク質と結合し、かつ相互反応する候補分子を選
択する。結合または相互反応は、目的とする放射性活性
標識した候補分子を用いることで直接的に、または候補
化合物の相互反応または結合の結果得られる効果を測定
することにより間接的に測定できる。また、候補化合物
を競合スクリーニングアッセイ、すなわち、好ましくは
分析して検出可能な試薬、最適には放射性活性で標識し
た公知のリガンドを試験すべき化合物と一緒に導入し、
その標識したリガンドの結合を阻害または亢進する化合
物の能力を測定するアッセイに付すことができる。ＣＳ
ＢＰβとのアフィニティーおよび選択性の増加について
化合物をスクリーニングする。
において、単離した形態、固定した形態または細胞結合
した形態のＣＳＢＰβを複数の候補分子と接触させ、そ
のタンパク質と結合し、かつ相互反応する候補分子を選
択する。結合または相互反応は、目的とする放射性活性
標識した候補分子を用いることで直接的に、または候補
化合物の相互反応または結合の結果得られる効果を測定
することにより間接的に測定できる。また、候補化合物
を競合スクリーニングアッセイ、すなわち、好ましくは
分析して検出可能な試薬、最適には放射性活性で標識し
た公知のリガンドを試験すべき化合物と一緒に導入し、
その標識したリガンドの結合を阻害または亢進する化合
物の能力を測定するアッセイに付すことができる。ＣＳ
ＢＰβとのアフィニティーおよび選択性の増加について
化合物をスクリーニングする。
【００４１】本発明のこの態様を明らかにするために、
天然物のスクリーンを行ってもよい。ミニカラムを用い
る排除クロマトグラフィーにより結合リガンドを遊離リ
ガンドから分離する標準アッセイを用いて、スクリーニ
ング操作を開始する。海洋抽出物、微生物抽出物および
植物抽出物をＴＨＰ．１サイトゾルとの3Ｈ−ＣＳＡＩ
Ｄ結合の阻害について試験する。結合が約８０−２００
μｇ／ｍｌのＩＣ50で特徴付けられれば、抽出物はアン
タゴニストと確認される。選択された一群のいずれかの
「抑制（nuisance）抽出物」による阻害を観察すること
ができないことと関連してヒット率が低いことは、該ア
ッセイがスクリーニング操作を支持するのに十分に選択
的かつ効果的であることを示唆する。高処理スクリーニ
ング能を容易にする結合アッセイのさらなる改良はスピ
ンカラムを用いて遊離リガンドから結合リガンドを分離
するマイナーな修飾により達成することができる。
天然物のスクリーンを行ってもよい。ミニカラムを用い
る排除クロマトグラフィーにより結合リガンドを遊離リ
ガンドから分離する標準アッセイを用いて、スクリーニ
ング操作を開始する。海洋抽出物、微生物抽出物および
植物抽出物をＴＨＰ．１サイトゾルとの3Ｈ−ＣＳＡＩ
Ｄ結合の阻害について試験する。結合が約８０−２００
μｇ／ｍｌのＩＣ50で特徴付けられれば、抽出物はアン
タゴニストと確認される。選択された一群のいずれかの
「抑制（nuisance）抽出物」による阻害を観察すること
ができないことと関連してヒット率が低いことは、該ア
ッセイがスクリーニング操作を支持するのに十分に選択
的かつ効果的であることを示唆する。高処理スクリーニ
ング能を容易にする結合アッセイのさらなる改良はスピ
ンカラムを用いて遊離リガンドから結合リガンドを分離
するマイナーな修飾により達成することができる。
【００４２】阻害剤 本発明のＣＳＢＰβがセリン−トレオニンタンパク質キ
ナーゼのＣＳＢＰ−ＭＡＰキナーゼ種に相同的であると
いう知見により、広範囲に及ぶ急性および慢性炎症疾患
を治療するための理論的根拠が得られる。従って、サイ
トカイン介在疾患を患っている患者をＣＳＢＰβ阻害量
のＣＳＡＩＤで治療することも本発明のさらなる態様で
ある。かかる疾患の代表例として、アルツハイマー型の
老人性痴呆症（ＳＤＡＴ）、多発性硬化症、脳性マラリ
ア、発作、脳外傷および脊髄障害などの中枢神経系に付
随する疾患；再狭窄およびアテローム性動脈硬化症など
の心臓血管疾患；成人呼吸疾患症候群（ＡＲＤＳ）、慢
性リウマチ関節症、変形性関節症、炎症性腸疾患疾患
（ＩＢＤ）、乾癬、皮膚炎、喘息などの炎症疾患；およ
び骨粗鬆症、外科的または外傷的インシデントによる敗
血症、慢性腎不全、ＡＩＤＳ、カヘキシーおよび自己免
疫疾患、例えば、エリトマトーデス、宿主移植片拒絶反
応および移植片対宿主疾患などの異常機能または過剰サ
イトカインに伴う疾患または症状が挙げられるが、これ
に限定されるものではない。かくして、本発明は、ＣＳ
ＢＰβ阻害量の化合物を投与することによりかかる疾患
を治療および／または改善することを意図とする。本発
明のＣＳＢＰβの機能に関する理論に拘束されることな
く、ＣＳＢＰβ機能を阻害する有用なものには、ＣＳＢ
Ｐβのキナーゼ活性を阻害する化合物があると考えられ
る。他の阻害部位が、もちろん、シグナルトランスダク
ションカスケードにあるとの立場を取ることも可能であ
る。したがって、ＣＳＢＰβとその上流または下流にあ
る１またはそれ以上の基質との相互作用を阻害すること
も本発明の意図するところである。
ナーゼのＣＳＢＰ−ＭＡＰキナーゼ種に相同的であると
いう知見により、広範囲に及ぶ急性および慢性炎症疾患
を治療するための理論的根拠が得られる。従って、サイ
トカイン介在疾患を患っている患者をＣＳＢＰβ阻害量
のＣＳＡＩＤで治療することも本発明のさらなる態様で
ある。かかる疾患の代表例として、アルツハイマー型の
老人性痴呆症（ＳＤＡＴ）、多発性硬化症、脳性マラリ
ア、発作、脳外傷および脊髄障害などの中枢神経系に付
随する疾患；再狭窄およびアテローム性動脈硬化症など
の心臓血管疾患；成人呼吸疾患症候群（ＡＲＤＳ）、慢
性リウマチ関節症、変形性関節症、炎症性腸疾患疾患
（ＩＢＤ）、乾癬、皮膚炎、喘息などの炎症疾患；およ
び骨粗鬆症、外科的または外傷的インシデントによる敗
血症、慢性腎不全、ＡＩＤＳ、カヘキシーおよび自己免
疫疾患、例えば、エリトマトーデス、宿主移植片拒絶反
応および移植片対宿主疾患などの異常機能または過剰サ
イトカインに伴う疾患または症状が挙げられるが、これ
に限定されるものではない。かくして、本発明は、ＣＳ
ＢＰβ阻害量の化合物を投与することによりかかる疾患
を治療および／または改善することを意図とする。本発
明のＣＳＢＰβの機能に関する理論に拘束されることな
く、ＣＳＢＰβ機能を阻害する有用なものには、ＣＳＢ
Ｐβのキナーゼ活性を阻害する化合物があると考えられ
る。他の阻害部位が、もちろん、シグナルトランスダク
ションカスケードにあるとの立場を取ることも可能であ
る。したがって、ＣＳＢＰβとその上流または下流にあ
る１またはそれ以上の基質との相互作用を阻害すること
も本発明の意図するところである。
【００４３】組成物／投与 本発明はまた、前記した方法により同定した化合物と、
医薬上許容される担体とからなる医薬組成物を意図す
る。本発明のタンパク質様薬物の医薬組成物は、特に、
非経口投与、すなわち、皮下投与、筋肉内投与または静
脈内投与に有用である。非経口投与用組成物は、一般
に、許容される担体、好ましくは水性担体に溶かした本
発明の化合物の溶液またはそのカクテルからなる。種々
の水性担体、例えば、水、緩衝水、０．４％食塩水、
０．３％グリシンなどを用いることができる。これらの
溶液は滅菌されており、粒状物のないのが一般的であ
る。これらの溶液は慣用的な周知の滅菌技法により滅菌
処理することができる。組成物は、要すれば、適当な生
理学的条件まで、ｐＨ調節および緩衝剤などの医薬上許
容される補助物質を含んでいてもよい。そのような医薬
組成物における本発明の化合物の濃度は極めて広く、す
なわち、約０．５重量％以下から、通常、または少なく
とも１重量％、１５または２０重量％と同じ量まで変化
させることができ、選択される個々の投与経路に従っ
て、主に流体容量、粘度などに基づいて選択される。
医薬上許容される担体とからなる医薬組成物を意図す
る。本発明のタンパク質様薬物の医薬組成物は、特に、
非経口投与、すなわち、皮下投与、筋肉内投与または静
脈内投与に有用である。非経口投与用組成物は、一般
に、許容される担体、好ましくは水性担体に溶かした本
発明の化合物の溶液またはそのカクテルからなる。種々
の水性担体、例えば、水、緩衝水、０．４％食塩水、
０．３％グリシンなどを用いることができる。これらの
溶液は滅菌されており、粒状物のないのが一般的であ
る。これらの溶液は慣用的な周知の滅菌技法により滅菌
処理することができる。組成物は、要すれば、適当な生
理学的条件まで、ｐＨ調節および緩衝剤などの医薬上許
容される補助物質を含んでいてもよい。そのような医薬
組成物における本発明の化合物の濃度は極めて広く、す
なわち、約０．５重量％以下から、通常、または少なく
とも１重量％、１５または２０重量％と同じ量まで変化
させることができ、選択される個々の投与経路に従っ
て、主に流体容量、粘度などに基づいて選択される。
【００４４】かくして、筋肉内注射の場合の医薬組成物
は１ｍＬの滅菌緩衝水および５０ｍｇの化合物を含有す
るように調製できる。同様に、静脈内注入の場合の医薬
組成物は２５０ｍｌの滅菌リンガー（Ringer）溶液およ
び１５０ｍｇの化合物を含有するように調製できる。非
経口投与可能な組成物の製法は周知であるか、または当
業者にとっては自明であり、例えば、Remington's Phar
maceutical Science、第15版、Mack Publishing Compan
y、Easton、Pennsylvaniaにてさらに詳細に記載されて
いる。本明細書に記載の化合物は貯蔵のために凍結乾燥
させ、使用前に適当な担体で復元することができる。通
常のタンパク質でこの方法が効果的であることがわかっ
ており、当該分野にて公知の凍結乾燥法および復元法を
用いることができる。
は１ｍＬの滅菌緩衝水および５０ｍｇの化合物を含有す
るように調製できる。同様に、静脈内注入の場合の医薬
組成物は２５０ｍｌの滅菌リンガー（Ringer）溶液およ
び１５０ｍｇの化合物を含有するように調製できる。非
経口投与可能な組成物の製法は周知であるか、または当
業者にとっては自明であり、例えば、Remington's Phar
maceutical Science、第15版、Mack Publishing Compan
y、Easton、Pennsylvaniaにてさらに詳細に記載されて
いる。本明細書に記載の化合物は貯蔵のために凍結乾燥
させ、使用前に適当な担体で復元することができる。通
常のタンパク質でこの方法が効果的であることがわかっ
ており、当該分野にて公知の凍結乾燥法および復元法を
用いることができる。
【００４５】同定される薬物が非タンパク質様である場
合には、それは単独でまたは医薬上許容される担体と組
み合わせて投与できる。その割合は、化合物の溶解度お
よび化学特性、選択される投与経路および標準的製薬慣
習により決定される。例えば、澱粉、乳糖、特定の種類
のクレイなどの賦形剤を含有する錠剤またはカプセルの
形態にて経口投与してもよい。活性成分をショ糖および
コーンのシロップ、フレーバー剤および染料と混合し、
ついで十分に脱水し、固体形に打錠するのに適するよう
にしたトローチまたはロゼンジの形態にて舌下投与して
もよい。非経口的に、すなわち、筋肉内、静脈内または
皮下的に注射してもよい溶液の形態にて経口投与しても
よい。非経口投与する場合、他の成分、例えば滅菌溶液
を等張にするのに十分な食塩水またはグルコースを含有
する溶液の形態にて用いることができる。
合には、それは単独でまたは医薬上許容される担体と組
み合わせて投与できる。その割合は、化合物の溶解度お
よび化学特性、選択される投与経路および標準的製薬慣
習により決定される。例えば、澱粉、乳糖、特定の種類
のクレイなどの賦形剤を含有する錠剤またはカプセルの
形態にて経口投与してもよい。活性成分をショ糖および
コーンのシロップ、フレーバー剤および染料と混合し、
ついで十分に脱水し、固体形に打錠するのに適するよう
にしたトローチまたはロゼンジの形態にて舌下投与して
もよい。非経口的に、すなわち、筋肉内、静脈内または
皮下的に注射してもよい溶液の形態にて経口投与しても
よい。非経口投与する場合、他の成分、例えば滅菌溶液
を等張にするのに十分な食塩水またはグルコースを含有
する溶液の形態にて用いることができる。
【００４６】顧問医は最適と思われる治療薬の量を決定
する。その量は投与形および選択される個々の化合物で
変化し、さらには治療される個々の患者で変化するであ
ろう。顧問医は、一般に、最適量よりも実質的に少ない
量の化合物で治療を開始し、その状況下で最適な効果が
得られるまで用量を少量ずつ増加させるであろう。一般
に、組成物を経口投与すると、非経口投与と同じ効果を
得るのにより多量の活性剤が必要とされるであろう。該
化合物は他のセロトネルジック（serotonergic）剤と同
じ方法にて有用であり、その投与量レベルはこれらの他
の治療剤で通常用いられるのと同じ大きさである。治療
用量は、一般に、一日当たり１ないし１０ｍｇまたはそ
れ以上であるが、数個の異なる投与単位を投与してもよ
い。０．５ないし１０ｍｇの活性剤を含有する錠剤が特
に有用である。
する。その量は投与形および選択される個々の化合物で
変化し、さらには治療される個々の患者で変化するであ
ろう。顧問医は、一般に、最適量よりも実質的に少ない
量の化合物で治療を開始し、その状況下で最適な効果が
得られるまで用量を少量ずつ増加させるであろう。一般
に、組成物を経口投与すると、非経口投与と同じ効果を
得るのにより多量の活性剤が必要とされるであろう。該
化合物は他のセロトネルジック（serotonergic）剤と同
じ方法にて有用であり、その投与量レベルはこれらの他
の治療剤で通常用いられるのと同じ大きさである。治療
用量は、一般に、一日当たり１ないし１０ｍｇまたはそ
れ以上であるが、数個の異なる投与単位を投与してもよ
い。０．５ないし１０ｍｇの活性剤を含有する錠剤が特
に有用である。
【００４７】患者の症状に応じて、予防的および／また
は治療的処理のために本発明の医薬組成物を投与するこ
とができる。治療に用いるには、組成物を既に疾患に罹
患している患者にその疾患およびその合併症を治癒する
かまたは少なくともいくらか改善するのに十分な量にて
投与する。予防に用いるには、本発明の化合物を含有す
る組成物またはそのカクテルをまだ発病していない患者
に投与し、その患者の耐性を強化させる。医薬組成物の
一回投与または複数回投与は、顧問医により選択される
投与レベルおよびパターンで実施することができる。い
ずれにしても、本発明の医薬組成物は、患者を効果的に
治療するのに十分な一定量の本発明の化合物を供給しな
ければならない。
は治療的処理のために本発明の医薬組成物を投与するこ
とができる。治療に用いるには、組成物を既に疾患に罹
患している患者にその疾患およびその合併症を治癒する
かまたは少なくともいくらか改善するのに十分な量にて
投与する。予防に用いるには、本発明の化合物を含有す
る組成物またはそのカクテルをまだ発病していない患者
に投与し、その患者の耐性を強化させる。医薬組成物の
一回投与または複数回投与は、顧問医により選択される
投与レベルおよびパターンで実施することができる。い
ずれにしても、本発明の医薬組成物は、患者を効果的に
治療するのに十分な一定量の本発明の化合物を供給しな
ければならない。
【００４８】プローブ 本発明の核酸は、ヒトＣＳＢＰβ配列との特異的ハイブ
リッド形成能を有するプローブを提供するのに特に有用
である。プローブ法は当該分野にて周知であり、プロー
ブの大きさは大きく変化するが、それは大きさが少なく
とも１５個のヌクレオチドであることが好ましいことは
明らかである。また、プローブの同定を容易にするため
に、かかるプローブは分析的に検出可能な試薬で標識化
でき、かつそれが好ましいことは明らかである。有用な
試薬は、限定するものではないが、放射性活性体、蛍光
染料、検出可能な生成物の形成の触媒能を有する酵素を
包含する。本発明は、例えば、異常な、すなわち増加ま
たは減少レベルのレセプター遺伝子発現により特徴付け
られる病態を診断するにおいてレセプターをコードする
プローブを用いることに関する。また、該プローブを用
い、そのレセプターをコードする遺伝子にて染色体また
は分子変異を有する個体を同定することができる。当業
者が使用する条件に応じて、そのプローブを用い、他の
細胞型および個体よりこの付加的な例示としてのレセプ
ター（そのゲノム形またはｃＤＮＡ形）を同定かつ回収
することができる。概して、ハイブリッド形成条件を厳
格にすればするほど、より密接に関連する遺伝子が回収
されるであろう。
リッド形成能を有するプローブを提供するのに特に有用
である。プローブ法は当該分野にて周知であり、プロー
ブの大きさは大きく変化するが、それは大きさが少なく
とも１５個のヌクレオチドであることが好ましいことは
明らかである。また、プローブの同定を容易にするため
に、かかるプローブは分析的に検出可能な試薬で標識化
でき、かつそれが好ましいことは明らかである。有用な
試薬は、限定するものではないが、放射性活性体、蛍光
染料、検出可能な生成物の形成の触媒能を有する酵素を
包含する。本発明は、例えば、異常な、すなわち増加ま
たは減少レベルのレセプター遺伝子発現により特徴付け
られる病態を診断するにおいてレセプターをコードする
プローブを用いることに関する。また、該プローブを用
い、そのレセプターをコードする遺伝子にて染色体また
は分子変異を有する個体を同定することができる。当業
者が使用する条件に応じて、そのプローブを用い、他の
細胞型および個体よりこの付加的な例示としてのレセプ
ター（そのゲノム形またはｃＤＮＡ形）を同定かつ回収
することができる。概して、ハイブリッド形成条件を厳
格にすればするほど、より密接に関連する遺伝子が回収
されるであろう。
【００４９】アンチセンス ＣＳＢＰβについて本明細書に開示されている配列に基
づくアンチセンスオリゴヌクレオチドも本発明の範囲内
にある。レセプター遺伝子をコードする標的核酸を認識
して特異的に結合し、遺伝子発現、例えば、標的核酸が
ｍＲＮＡである場合、遺伝子の翻訳を阻害するように、
合成オリゴヌクレオチドまたは関連するアンチセンス化
学構造アナログを設計する。アンチセンス薬物の作用機
構について特定の理論で拘束するつもりはないが、かか
る薬物は１またはそれ以上の以下の機構：ｍＲＮＡに結
合し、ＲＮａｓｅＩなどの内因性ヌクレアーゼによる分
解を誘発することによるか、または産生的タンパク質合
成に不可欠な調節因子もしくはリボソーム成分への結合
を阻害することによりｍＲＮＡの翻訳を阻害することに
より作用していると考えられる。加えて、アンチセンス
配列は、そのアンチセンス配列がリボザイム配列または
反応基と一緒になり、目的とするｍＲＮＡを特異的に標
的とするように用いられ、そのｍＲＮＡを分解するかま
たは化学的に修飾する、複合的巨大分子アレイの成分と
して用いることができる。アンチセンス技法の一般的分
野は、以下の文献にて示されている。その内容を出典明
示により本明細書の一部とする（Cohen,Ｊ.Ｓ.、Trends
in Pharm. Sci. 10：435（1989）およびWeintraub,H.
M.、Scientific American Jan. （1990）、40頁）。
づくアンチセンスオリゴヌクレオチドも本発明の範囲内
にある。レセプター遺伝子をコードする標的核酸を認識
して特異的に結合し、遺伝子発現、例えば、標的核酸が
ｍＲＮＡである場合、遺伝子の翻訳を阻害するように、
合成オリゴヌクレオチドまたは関連するアンチセンス化
学構造アナログを設計する。アンチセンス薬物の作用機
構について特定の理論で拘束するつもりはないが、かか
る薬物は１またはそれ以上の以下の機構：ｍＲＮＡに結
合し、ＲＮａｓｅＩなどの内因性ヌクレアーゼによる分
解を誘発することによるか、または産生的タンパク質合
成に不可欠な調節因子もしくはリボソーム成分への結合
を阻害することによりｍＲＮＡの翻訳を阻害することに
より作用していると考えられる。加えて、アンチセンス
配列は、そのアンチセンス配列がリボザイム配列または
反応基と一緒になり、目的とするｍＲＮＡを特異的に標
的とするように用いられ、そのｍＲＮＡを分解するかま
たは化学的に修飾する、複合的巨大分子アレイの成分と
して用いることができる。アンチセンス技法の一般的分
野は、以下の文献にて示されている。その内容を出典明
示により本明細書の一部とする（Cohen,Ｊ.Ｓ.、Trends
in Pharm. Sci. 10：435（1989）およびWeintraub,H.
M.、Scientific American Jan. （1990）、40頁）。
【００５０】遺伝子治療 本発明はまた、遺伝子治療における本明細書に開示のＤ
ＮＡ配列の使用に関する。ＣＳＢＰβはタンパク質キナ
ーゼであるため、キナーゼとして不活性であるが、同じ
細胞にて共同発現される内因性ＣＳＢＰβの活性化を遮
断する部位特異的変異体を製造することが可能である。
すなわち、それは優性陰性変異体である（Kolchら、Nat
ure 349：426−428（1991））。この変異体タンパク質
をコードするＤＮＡを遺伝子治療にて用い、慢性炎症を
減少させることができた。ＤＮＡをインビボにて標的細
胞、例えばアデノウイルス、レトロウイルスに方向づけ
るのに利用することのできる多くのベクターおよびデリ
バリー系がある。
ＮＡ配列の使用に関する。ＣＳＢＰβはタンパク質キナ
ーゼであるため、キナーゼとして不活性であるが、同じ
細胞にて共同発現される内因性ＣＳＢＰβの活性化を遮
断する部位特異的変異体を製造することが可能である。
すなわち、それは優性陰性変異体である（Kolchら、Nat
ure 349：426−428（1991））。この変異体タンパク質
をコードするＤＮＡを遺伝子治療にて用い、慢性炎症を
減少させることができた。ＤＮＡをインビボにて標的細
胞、例えばアデノウイルス、レトロウイルスに方向づけ
るのに利用することのできる多くのベクターおよびデリ
バリー系がある。
【００５１】抗体 本発明はまた、ＣＳＢＰβから本明細書に開示されてい
るアミノ酸配列に対応するエピトープに方向付けられる
モノクローナルまたはポリクローナル抗体を包含する。
免疫学的に、レセプターの特に重要な領域は、タンパク
質のリガンド結合ドメインに結合する領域である。該領
域に方向付けられる抗体は、タンパク質−リガンド相互
反応に対するその効果のため、診断および治療に用いる
のに特に有用である。ポリクローナルおよびモノクロー
ナル抗体を産生する方法は周知である。例えば、Ausube
lらのChap．11（前掲）を参照のこと。本発明はまた、
ＣＳＢＰβ活性化に伴う病態を治療または改善するため
に、天然のリガンドが該タンパク質に結合することを遮
断する、ＣＳＢＰβに拮抗するように方向付けられた有
効量の抗体またはそのフラグメントからなる組成物を提
供する。
るアミノ酸配列に対応するエピトープに方向付けられる
モノクローナルまたはポリクローナル抗体を包含する。
免疫学的に、レセプターの特に重要な領域は、タンパク
質のリガンド結合ドメインに結合する領域である。該領
域に方向付けられる抗体は、タンパク質−リガンド相互
反応に対するその効果のため、診断および治療に用いる
のに特に有用である。ポリクローナルおよびモノクロー
ナル抗体を産生する方法は周知である。例えば、Ausube
lらのChap．11（前掲）を参照のこと。本発明はまた、
ＣＳＢＰβ活性化に伴う病態を治療または改善するため
に、天然のリガンドが該タンパク質に結合することを遮
断する、ＣＳＢＰβに拮抗するように方向付けられた有
効量の抗体またはそのフラグメントからなる組成物を提
供する。
【００５２】本発明の結合タンパク質または少なくとも
１つのエピトープを有してなるそのフラグメントを用い
て、ポリクローナルおよびモノクローナルの両方の抗体
を産生することができる。ポリクローナル抗体が望まし
い場合、選択した哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、
ヤギ、ウマなど）を本発明の結合タンパク質またはその
フラグメントあるいは変異した結合タンパク質で免疫処
理する。免疫化動物からの血清を公知方法に従って収集
して処理する。ポリクローナル抗体を含有する血清を用
いると、ポリクローナル抗体をイムノアフィニティーク
ロマトグラフィーまたは他の公知操作により精製するこ
とができる。
１つのエピトープを有してなるそのフラグメントを用い
て、ポリクローナルおよびモノクローナルの両方の抗体
を産生することができる。ポリクローナル抗体が望まし
い場合、選択した哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、
ヤギ、ウマなど）を本発明の結合タンパク質またはその
フラグメントあるいは変異した結合タンパク質で免疫処
理する。免疫化動物からの血清を公知方法に従って収集
して処理する。ポリクローナル抗体を含有する血清を用
いると、ポリクローナル抗体をイムノアフィニティーク
ロマトグラフィーまたは他の公知操作により精製するこ
とができる。
【００５３】本発明のタンパク質およびそのフラグメン
トに対するモノクローナル抗体もまた、当業者であれば
容易に産生することができる。ハイブリドーマ技法を用
いることでモノクローナル抗体を産生する方法論がよく
知られている。不死抗体産生細胞系は、細胞融合によ
り、およびまたＢリンパ球を腫瘍ＤＮＡで直接形質転換
するか、またはEpstein−Barrウイルスでトランスフェ
クションするような他の方法により形成させることがで
きる。例えば、M.Schreierら、「Hybridoma Technique
s」（1980）；Hammerlingら、「Monoclonal Antibodies
and T−cell Hybridomas」（1981）；Kennettら、「Mo
noclonal Antibodies」（1980）を参照のこと；また、
米国特許第4341761号；第4399121号；第4427783号；第4
444887号；第4452570号；第4466917号；第4472500号；
第4491632号；および第4493890号を参照のこと。目的と
するタンパク質またはそのフラグメントに拮抗して産生
されるモノクローナル抗体のパネルは、種々の特性につ
いて、すなわち、イソタイプ、エピトープ、アフィニテ
ィーなどについてスクリーニングすることができる。別
法として、目的とするモノクローナル抗体をコードする
遺伝子は当該分野にて知られているＰＣＲ技法によりハ
イブリドーマから単離し、適当なベクターにてクローン
し、発現させることができる。モノクローナル抗体は、
イムノアフィニティー技法を用い、その抗体が対抗する
ように方向付けられる個々のタンパク質の精製において
有用である。本発明の抗体は、ポリクローナルまたはモ
ノクローナルのいずれでも、イムノアッセイ、ＲＩＡ、
ＥＬＩＳＡなどで試薬として用いることができるという
点で付加的な有用性を有する。加えて、該抗体を用いて
ヒト細胞からＣＳＢＰβを単離し、内因性ＣＳＢＰβの
リン酸化状態およびタンパク質キナーゼ活性に対する異
なる刺激および化合物の効果を測定することができる。
該抗体を用いて、ＣＳＢＰβのリン酸化またはキナーゼ
活性を遮断する新規な化合物を発見または修飾するため
の組織培養を基礎とするアッセイを確立することができ
る。かかるアッセイの一例は、ＣＳＢＰβを発現するヒ
ト細胞系を化合物または化合物の混合物と一緒にインキ
ュベートし、所定の期間適当なＬＰＳ刺激（例えば、Ｌ
ＰＳ、浸透性ストレス）で処理し、つづいてＣＳＢＰβ
を抗体と免疫沈降に付し、イムノブロットまたはクロマ
トグラフィーまたは適当なタンパク質もしくはペプチド
基質でのそのキナーゼ活性の測定を介してそのリン酸化
状態を評価することである。
トに対するモノクローナル抗体もまた、当業者であれば
容易に産生することができる。ハイブリドーマ技法を用
いることでモノクローナル抗体を産生する方法論がよく
知られている。不死抗体産生細胞系は、細胞融合によ
り、およびまたＢリンパ球を腫瘍ＤＮＡで直接形質転換
するか、またはEpstein−Barrウイルスでトランスフェ
クションするような他の方法により形成させることがで
きる。例えば、M.Schreierら、「Hybridoma Technique
s」（1980）；Hammerlingら、「Monoclonal Antibodies
and T−cell Hybridomas」（1981）；Kennettら、「Mo
noclonal Antibodies」（1980）を参照のこと；また、
米国特許第4341761号；第4399121号；第4427783号；第4
444887号；第4452570号；第4466917号；第4472500号；
第4491632号；および第4493890号を参照のこと。目的と
するタンパク質またはそのフラグメントに拮抗して産生
されるモノクローナル抗体のパネルは、種々の特性につ
いて、すなわち、イソタイプ、エピトープ、アフィニテ
ィーなどについてスクリーニングすることができる。別
法として、目的とするモノクローナル抗体をコードする
遺伝子は当該分野にて知られているＰＣＲ技法によりハ
イブリドーマから単離し、適当なベクターにてクローン
し、発現させることができる。モノクローナル抗体は、
イムノアフィニティー技法を用い、その抗体が対抗する
ように方向付けられる個々のタンパク質の精製において
有用である。本発明の抗体は、ポリクローナルまたはモ
ノクローナルのいずれでも、イムノアッセイ、ＲＩＡ、
ＥＬＩＳＡなどで試薬として用いることができるという
点で付加的な有用性を有する。加えて、該抗体を用いて
ヒト細胞からＣＳＢＰβを単離し、内因性ＣＳＢＰβの
リン酸化状態およびタンパク質キナーゼ活性に対する異
なる刺激および化合物の効果を測定することができる。
該抗体を用いて、ＣＳＢＰβのリン酸化またはキナーゼ
活性を遮断する新規な化合物を発見または修飾するため
の組織培養を基礎とするアッセイを確立することができ
る。かかるアッセイの一例は、ＣＳＢＰβを発現するヒ
ト細胞系を化合物または化合物の混合物と一緒にインキ
ュベートし、所定の期間適当なＬＰＳ刺激（例えば、Ｌ
ＰＳ、浸透性ストレス）で処理し、つづいてＣＳＢＰβ
を抗体と免疫沈降に付し、イムノブロットまたはクロマ
トグラフィーまたは適当なタンパク質もしくはペプチド
基質でのそのキナーゼ活性の測定を介してそのリン酸化
状態を評価することである。
【００５４】トランスジェニック 適当な受精卵または宿主の胎児を本明細書に開示のＣＳ
ＢＰβをコードする核酸でトランスフェクションするこ
とにより、ヒト以外のトランスジェニック動物を得ても
よい。例えば、米国特許第4736866号；第5175385号；第
5175384号および第5175386号を参照のこと。得られたト
ランスジェニック動物をＣＳＢＰβ／リガンド相互反応
を研究するためのモデルとして用いることができる。特
に有用な動物は、タンパク質の発現に伴い検出可能な表
現型を示す動物である。ついでその関連する表現型を逆
進または悪化させる薬物の能力について、薬物をスクリ
ーニングすることができる。本発明はまた、ＣＳＢＰβ
をコードする遺伝子を、種々の温度または代謝条件に特
異的に応答する調節因子に機能的に連結させ、それによ
りその条件に応答して表現形発現を効果的にターンオン
またはオフさせることを意図とする。
ＢＰβをコードする核酸でトランスフェクションするこ
とにより、ヒト以外のトランスジェニック動物を得ても
よい。例えば、米国特許第4736866号；第5175385号；第
5175384号および第5175386号を参照のこと。得られたト
ランスジェニック動物をＣＳＢＰβ／リガンド相互反応
を研究するためのモデルとして用いることができる。特
に有用な動物は、タンパク質の発現に伴い検出可能な表
現型を示す動物である。ついでその関連する表現型を逆
進または悪化させる薬物の能力について、薬物をスクリ
ーニングすることができる。本発明はまた、ＣＳＢＰβ
をコードする遺伝子を、種々の温度または代謝条件に特
異的に応答する調節因子に機能的に連結させ、それによ
りその条件に応答して表現形発現を効果的にターンオン
またはオフさせることを意図とする。
【００５５】本明細書に開示の核酸プローブを用い、所
望の実験動物種からヒトＣＳＢＰβ遺伝子の同族体バー
ジョン、例えばネズミバージョンをクローンすることが
できる。その遺伝子が保存的遺伝子ノックアウト技法に
より排除されているマウス株を発育させることができ
る。ついで、該遺伝子を本発明のＣＳＢＰβ ＤＮＡと
置換／交換し、インビボにて候補薬物をスクリーニング
するためのマウスを獲得する。同様の遺伝子ノックアウ
トおよびヒトタンパク質阻害の研究を酵母で行うことも
できる。
望の実験動物種からヒトＣＳＢＰβ遺伝子の同族体バー
ジョン、例えばネズミバージョンをクローンすることが
できる。その遺伝子が保存的遺伝子ノックアウト技法に
より排除されているマウス株を発育させることができ
る。ついで、該遺伝子を本発明のＣＳＢＰβ ＤＮＡと
置換／交換し、インビボにて候補薬物をスクリーニング
するためのマウスを獲得する。同様の遺伝子ノックアウ
トおよびヒトタンパク質阻害の研究を酵母で行うことも
できる。
【００５６】
【実施例】本発明を実施例を用いてさらに詳しく説明す
る。実施例は、特定の具体例を参照することにより本発
明を説明するためにのみ提供される。これらの例示説明
は本発明の特定の態様を説明するものであるが、開示し
た発明の範囲を限定または制限するものではない。本明
細書中の特定の用語は、上記の定義において説明されて
いる。すべての実施例は標準的方法を用いて行われ、特
記しないかぎり、それらの方法は当業者によく知られて
おり、通常的なものである。以下の実施例の通常的方法
は、例えばSambrookらの標準的な実験室マニュアルに記
載されているようにして行うことができる。
る。実施例は、特定の具体例を参照することにより本発
明を説明するためにのみ提供される。これらの例示説明
は本発明の特定の態様を説明するものであるが、開示し
た発明の範囲を限定または制限するものではない。本明
細書中の特定の用語は、上記の定義において説明されて
いる。すべての実施例は標準的方法を用いて行われ、特
記しないかぎり、それらの方法は当業者によく知られて
おり、通常的なものである。以下の実施例の通常的方法
は、例えばSambrookらの標準的な実験室マニュアルに記
載されているようにして行うことができる。
【００５７】実施例１−組織分布 ノーザンブロットをClontechからのヒトマルチ組織ノー
ザン上で前記した部分ＣＳＢＰ ｃＤＮＡを用いて行っ
た（Lee,J.C.，Laydon,J.T.，McDonnell,P.C.，Gallagh
er,T.F.，Kumer,S.，Green,D.，McNulty,D.，Blumentha
l,M.J.，Heys,J.R.，Landvatter,S.W.，Strickler,J.
E.，McLaughlin,M.M.，Siemers,I.R.，Fisher,S.M.，Li
vi,G.P.，White,J.R.，Adams,J.L.およびYoung,P.R.
（1994）Nature 372、739−746）。ＣＳＢＰβはヒト精
巣で最も多く発現し、膵臓、前立腺および小腸ではより
少なく量で発現した。弱い発現が脾臓、胸腺、ＰＢＬお
よび骨格筋で見られた。
ザン上で前記した部分ＣＳＢＰ ｃＤＮＡを用いて行っ
た（Lee,J.C.，Laydon,J.T.，McDonnell,P.C.，Gallagh
er,T.F.，Kumer,S.，Green,D.，McNulty,D.，Blumentha
l,M.J.，Heys,J.R.，Landvatter,S.W.，Strickler,J.
E.，McLaughlin,M.M.，Siemers,I.R.，Fisher,S.M.，Li
vi,G.P.，White,J.R.，Adams,J.L.およびYoung,P.R.
（1994）Nature 372、739−746）。ＣＳＢＰβはヒト精
巣で最も多く発現し、膵臓、前立腺および小腸ではより
少なく量で発現した。弱い発現が脾臓、胸腺、ＰＢＬお
よび骨格筋で見られた。
【００５８】実施例２−ＭＡＰキナーゼ種に対するホモ
ロジーおよび発現 ＣＳＢＰβはセリン−トレオニン・タンパク質キナーゼ
のＭＡＰキナーゼ種のメンバーである（Marshall,Ｃ.
Ｊ.（1994）Curr.Opinion Genet.Develop. 4、82−8
9）。ＭＡＰキナーゼ種のメンバーは、活性部位付近の
活性化ループにて「ＴｘＹ」アミノ酸モチーフ（Ｔ＝ト
レオニン、Ｙ＝チロシンおよびｘ＝いずれかのアミノ
酸）を有することで特徴付けられる。適当な刺激に応答
してＭＡＰキナーゼキナーゼによりチロシンおよびトレ
オニンの両方がリン酸化されるには、ＭＡＰキナーゼ活
性の活性化が必要とされる。「ｘ」アミノ酸の特性およ
び活性化ループの大きさにより区別される3種のＭＡＰ
キナーゼがある（Cano,Ｅ.およびMahadevan,L.C. （199
5） Trends Biochem.Sci. 20、117−122）。かくして、
ｅｒｋはTEYを有し、ＪＮＫ／ＳＡＰＫはＴＰＹを有
し、ＣＳＢＰ／ｐ３８はＴＧＹを有する。これらの違い
は、活性化ＭＡＰキナーゼキナーゼ、および各ＭＡＰキ
ナーゼを活性化する細胞刺激における違いに反映してい
る。各種内で、活性化刺激は非常に似ているようであ
る。したがって、ｅｒｋは主にミトゲン性刺激（例え
ば、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ）に応答するのに対して、ＪＮＫ
／ＳＡＰＫおよびＣＳＢＰ／ｐ３８は数種の細胞性スト
レス（例えば、ＵＶ、浸透性、熱または化学ストレス、
低酸素症、酸化剤など）およびプロ炎症性刺激（例え
ば、ＬＰＳ、ＩＬ−１、ＴＮＦなど）に応答する。
ロジーおよび発現 ＣＳＢＰβはセリン−トレオニン・タンパク質キナーゼ
のＭＡＰキナーゼ種のメンバーである（Marshall,Ｃ.
Ｊ.（1994）Curr.Opinion Genet.Develop. 4、82−8
9）。ＭＡＰキナーゼ種のメンバーは、活性部位付近の
活性化ループにて「ＴｘＹ」アミノ酸モチーフ（Ｔ＝ト
レオニン、Ｙ＝チロシンおよびｘ＝いずれかのアミノ
酸）を有することで特徴付けられる。適当な刺激に応答
してＭＡＰキナーゼキナーゼによりチロシンおよびトレ
オニンの両方がリン酸化されるには、ＭＡＰキナーゼ活
性の活性化が必要とされる。「ｘ」アミノ酸の特性およ
び活性化ループの大きさにより区別される3種のＭＡＰ
キナーゼがある（Cano,Ｅ.およびMahadevan,L.C. （199
5） Trends Biochem.Sci. 20、117−122）。かくして、
ｅｒｋはTEYを有し、ＪＮＫ／ＳＡＰＫはＴＰＹを有
し、ＣＳＢＰ／ｐ３８はＴＧＹを有する。これらの違い
は、活性化ＭＡＰキナーゼキナーゼ、および各ＭＡＰキ
ナーゼを活性化する細胞刺激における違いに反映してい
る。各種内で、活性化刺激は非常に似ているようであ
る。したがって、ｅｒｋは主にミトゲン性刺激（例え
ば、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ）に応答するのに対して、ＪＮＫ
／ＳＡＰＫおよびＣＳＢＰ／ｐ３８は数種の細胞性スト
レス（例えば、ＵＶ、浸透性、熱または化学ストレス、
低酸素症、酸化剤など）およびプロ炎症性刺激（例え
ば、ＬＰＳ、ＩＬ−１、ＴＮＦなど）に応答する。
【００５９】最近になって、新規な形態のＣＳＢＰが数
種同定された。ＣＳＢＰの2種のスプライス変種、ＣＳ
ＢＰ１およびＣＳＢＰ２に加えて、核タンパク質Ｍａｘ
を用いる酵母２−ハイブリッド相互反応スクリーンを介
して、さらなるスプライス化変種が同定された（Zervo
s,Ａ.Ｓ.、Faccio,L.、Gatto,J.P.、Kyriakis,J.M.およ
びBrent,R. （1995） Proc.Natl.Acad.Sci. USA 92、10
531−10534）。最近になってまた、ＣＳＢＰ種の特徴で
ある「ＴＧＹ」モチーフも保持している、有意なアミノ
酸同一性を有する２つの相同体が同定された：ｐ３８β
（Jiang,Ｙ.、Chen,C.、Li,Z.、Guo,W.、Gegner,J.A.、
Lin,S.およびHan,J. （1996） J.Biol.Chem. 271、1792
0−17926）およびＥＲＫ６／ＳＡＰＫ３（Lechner,
Ｃ.、Zahalka,M.A.、Giot,J.-F.、Moller,N.P.H.および
Ullrich,A. （1996） Proc.Natl.Acad.Sci. USA 93、43
55-4359；Mertens,S.、Craxton,M.およびGoedert,M.
（1996）FEBS Lett.（In Press））。
種同定された。ＣＳＢＰの2種のスプライス変種、ＣＳ
ＢＰ１およびＣＳＢＰ２に加えて、核タンパク質Ｍａｘ
を用いる酵母２−ハイブリッド相互反応スクリーンを介
して、さらなるスプライス化変種が同定された（Zervo
s,Ａ.Ｓ.、Faccio,L.、Gatto,J.P.、Kyriakis,J.M.およ
びBrent,R. （1995） Proc.Natl.Acad.Sci. USA 92、10
531−10534）。最近になってまた、ＣＳＢＰ種の特徴で
ある「ＴＧＹ」モチーフも保持している、有意なアミノ
酸同一性を有する２つの相同体が同定された：ｐ３８β
（Jiang,Ｙ.、Chen,C.、Li,Z.、Guo,W.、Gegner,J.A.、
Lin,S.およびHan,J. （1996） J.Biol.Chem. 271、1792
0−17926）およびＥＲＫ６／ＳＡＰＫ３（Lechner,
Ｃ.、Zahalka,M.A.、Giot,J.-F.、Moller,N.P.H.および
Ullrich,A. （1996） Proc.Natl.Acad.Sci. USA 93、43
55-4359；Mertens,S.、Craxton,M.およびGoedert,M.
（1996）FEBS Lett.（In Press））。
【００６０】ＣＳＢＰ１およびＣＳＢＰ２について前記
したのと同じ方法にて、ＣＳＢＰβを酵母発現について
遺伝子操作してもよい（Kumar,Ｓ.、McLaughlin,M.M.、
McDonnell,P.C.、Lee,J.C.、Livi,G.P.およびYoung,P.
R. （1995） J.Biol.Chem. 270、29043-29046）。Ｘｈ
ｏＩ部位をポリメラーゼ連鎖反応によりＣＳＢＰβの初
期コドンで遺伝子操作する（MullisおよびFallona、Met
h.Enymol. 155：335-50（1987））。ついで、ＣＳＢＰ
β含有のＸｈｏＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントをｐ１３８
ＮＢＵの同じ部位にライゲートし、Ｔｒｐ選択可能なマ
ーカーをＵＲＡ３で置換する、ｐ１３８ＮＢ（McHale
ら、Mol.Pharｍ. 39：109-113（１９９１））の修飾を
行った。また、ＸｈｏＩ部位、ＦＬＡＧエピトープおよ
びＣＳＢＰβのアミノ末端ヌクレオチド配列を含むポリ
メラーゼ連鎖反応を用いることで、ＣＳＢＰβのアミノ
末端をＦＬＡＧエピトープなどのエピトープ・タグに融
合させることができる（例えば、試薬はIBI-Kodakより
入手）。
したのと同じ方法にて、ＣＳＢＰβを酵母発現について
遺伝子操作してもよい（Kumar,Ｓ.、McLaughlin,M.M.、
McDonnell,P.C.、Lee,J.C.、Livi,G.P.およびYoung,P.
R. （1995） J.Biol.Chem. 270、29043-29046）。Ｘｈ
ｏＩ部位をポリメラーゼ連鎖反応によりＣＳＢＰβの初
期コドンで遺伝子操作する（MullisおよびFallona、Met
h.Enymol. 155：335-50（1987））。ついで、ＣＳＢＰ
β含有のＸｈｏＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントをｐ１３８
ＮＢＵの同じ部位にライゲートし、Ｔｒｐ選択可能なマ
ーカーをＵＲＡ３で置換する、ｐ１３８ＮＢ（McHale
ら、Mol.Pharｍ. 39：109-113（１９９１））の修飾を
行った。また、ＸｈｏＩ部位、ＦＬＡＧエピトープおよ
びＣＳＢＰβのアミノ末端ヌクレオチド配列を含むポリ
メラーゼ連鎖反応を用いることで、ＣＳＢＰβのアミノ
末端をＦＬＡＧエピトープなどのエピトープ・タグに融
合させることができる（例えば、試薬はIBI-Kodakより
入手）。
【００６１】ＣＳＢＰβのアミノ末端をＦＬＡＧエピト
ープと融合させることにより、ＣＳＢＰβをまた、Ｈｅ
ＬａおよびＪＵＲＫＡＴなどの哺乳動物細胞における発
現用に遺伝子操作させることができる。ヒトＣＳＢＰβ
の完全な読み枠を含有するＸｂａＩ／ＸｈｏＩ制限フラ
グメントを、そのフラグメントが当初はクローンされて
いるBluescriptプラスミドより除去し、ＸｂａＩおよび
ＳａｌＩで切断したベクターｐＳＰＯＲＴ（ＧＩＢＣＯ
-ＢＲＬ）に挿入した。ついで、得られたベクターｐＳ
ＰＯＲＴ−ＣＳＢＰβをＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで切
断し、次の２つのオリゴヌクレオチド：５’ＧＡＴＣＣ
ＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＴＡＡＡＧＡＴＧＡＴＧ
ＡＴＧＡＴＡＡＡＡＧＣＣＴＣＡＴＣＣＧＧＡＡＡＡＡ
ＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＣＴ−３’
（配列番号３）および５’−ＣＣＴＧＣＴＴＧＴＡＧＡ
ＡＧＣＣＣＴＴＴＴＴＣＣＧＧＡＴＧＡＧＧＣＴＴＴＴ
ＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＡＴＡＡＴＣＣＡＴＧ
ＧＴＡＣＣＧ−３’（配列番号４）を一緒にハイブリッ
ド形成することで調製した合成オリゴヌクレオチドリン
カーにライゲートし、ｐＳＰＯＲＴ−ＦＬＡＧ ＣＳＢ
Ｐβを形成させた。ついで、ＦＬＡＧ−ＣＳＢＰβ融合
体全体をＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩ制限フラグメントの
ｐＳＰＯＲＴ−ＦＬＡＧ ＣＳＢＰβより除去し、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶで切断したｐＣＤＮにライ
ゲートし、ｐＣＤＮ−ＦＬＡＧＣＳＢＰβを形成させ
た。ついで、これは、多くの確立されたプロトコル、例
えば、リポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を用
い、ＨｅＬａまたはＪＵＲＫＡＴなどの哺乳動物細胞に
トランスフェクションすることができる。細胞を適当な
刺激（例えば、浸透性ショック、ＵＶ、ＩＬ−１）で処
理し、ＦＬＡＧ−ＣＳＢＰβの活性化を誘導し、ＣＳＡ
ＩＤのＣＳＢＰβのキナーゼ活性を阻害する能力を介し
てＣＳＡＩＤ結合を検出することができる。かくして、
ＦＬＡＧ ＣＳＢＰβをトランスフェクションされた哺
乳動物細胞からＦＬＡＧエピトープ（ＩＢＩ―Kodak）
に対する抗体との免疫沈降に付すことができ、前記した
ようにインビトロ・キナーゼ・アッセイをＣＳＡＩＤの
存在または不在下で適当な基質（例えば、ミエリン塩基
性タンパク質、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２または−３）
を用いて行うことができる（Leeら、（1994） Nature 3
72：739−746；McLaugjlinら、J.Biol.Chem. 271：8488
−8492（1996））。
ープと融合させることにより、ＣＳＢＰβをまた、Ｈｅ
ＬａおよびＪＵＲＫＡＴなどの哺乳動物細胞における発
現用に遺伝子操作させることができる。ヒトＣＳＢＰβ
の完全な読み枠を含有するＸｂａＩ／ＸｈｏＩ制限フラ
グメントを、そのフラグメントが当初はクローンされて
いるBluescriptプラスミドより除去し、ＸｂａＩおよび
ＳａｌＩで切断したベクターｐＳＰＯＲＴ（ＧＩＢＣＯ
-ＢＲＬ）に挿入した。ついで、得られたベクターｐＳ
ＰＯＲＴ−ＣＳＢＰβをＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで切
断し、次の２つのオリゴヌクレオチド：５’ＧＡＴＣＣ
ＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＴＡＡＡＧＡＴＧＡＴＧ
ＡＴＧＡＴＡＡＡＡＧＣＣＴＣＡＴＣＣＧＧＡＡＡＡＡ
ＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＣＴ−３’
（配列番号３）および５’−ＣＣＴＧＣＴＴＧＴＡＧＡ
ＡＧＣＣＣＴＴＴＴＴＣＣＧＧＡＴＧＡＧＧＣＴＴＴＴ
ＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＡＴＡＡＴＣＣＡＴＧ
ＧＴＡＣＣＧ−３’（配列番号４）を一緒にハイブリッ
ド形成することで調製した合成オリゴヌクレオチドリン
カーにライゲートし、ｐＳＰＯＲＴ−ＦＬＡＧ ＣＳＢ
Ｐβを形成させた。ついで、ＦＬＡＧ−ＣＳＢＰβ融合
体全体をＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩ制限フラグメントの
ｐＳＰＯＲＴ−ＦＬＡＧ ＣＳＢＰβより除去し、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶで切断したｐＣＤＮにライ
ゲートし、ｐＣＤＮ−ＦＬＡＧＣＳＢＰβを形成させ
た。ついで、これは、多くの確立されたプロトコル、例
えば、リポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を用
い、ＨｅＬａまたはＪＵＲＫＡＴなどの哺乳動物細胞に
トランスフェクションすることができる。細胞を適当な
刺激（例えば、浸透性ショック、ＵＶ、ＩＬ−１）で処
理し、ＦＬＡＧ−ＣＳＢＰβの活性化を誘導し、ＣＳＡ
ＩＤのＣＳＢＰβのキナーゼ活性を阻害する能力を介し
てＣＳＡＩＤ結合を検出することができる。かくして、
ＦＬＡＧ ＣＳＢＰβをトランスフェクションされた哺
乳動物細胞からＦＬＡＧエピトープ（ＩＢＩ―Kodak）
に対する抗体との免疫沈降に付すことができ、前記した
ようにインビトロ・キナーゼ・アッセイをＣＳＡＩＤの
存在または不在下で適当な基質（例えば、ミエリン塩基
性タンパク質、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２または−３）
を用いて行うことができる（Leeら、（1994） Nature 3
72：739−746；McLaugjlinら、J.Biol.Chem. 271：8488
−8492（1996））。
【００６２】実施例３−Ｅ.coliにおける発現 本発明の単離ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質が
ＣＳＡＩＤに結合しうることを確認するために、ｃＤＮ
ＡをＥ.coli、酵母および哺乳動物細胞（例えば、Ｈｅ
Ｌａ、ＣＨＯ、３Ｔ３）にて発現させることができる。
Ｅ.coliにおいて、ＣＳＢＰは、例えばβ―ガラクトシ
ダーゼ、エンテロキナーゼ切断可能なＦＬＡＧエピトー
プタグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼまたはヘ
キサヒスチジン尾部との融合タンパク質として同定され
る。（ＦＬＡＧはその試薬がIBI−Kodakより入手可能な
市販のエピトープである。）後者の場合、これは開始部
位、抗原認識配列およびエンテロキナーゼ切断部位を有
する合成オリゴヌクレオチドリンカーを設計することに
より達成される。タンパク質をｐＬａｃ（例えば、Blue
scipt KSベクター（Stratagene、LaJolla、CA）または
λｐＬ（Shatzmanら、N.Y.Acad.Sci.、478：233−248
（1986））プロモーターのいずれかの制御の下で発現さ
せ、細胞ライゼートにて予期される大きさのタンパク質
と特異的に連結することが知られているラジオフォトア
フィニティーＣＳＡＩＤでプローブに付す。Ｅ.coliに
て発現したタンパク質は、製造者の指示に従って、ＦＬ
ＡＧエピトープに対するモノクローナル抗体を含有する
アフィニティーマトリックス、グルタチオン・ビーズま
たはＮｉＮＴＡカラムに通すことで精製される。
ＣＳＡＩＤに結合しうることを確認するために、ｃＤＮ
ＡをＥ.coli、酵母および哺乳動物細胞（例えば、Ｈｅ
Ｌａ、ＣＨＯ、３Ｔ３）にて発現させることができる。
Ｅ.coliにおいて、ＣＳＢＰは、例えばβ―ガラクトシ
ダーゼ、エンテロキナーゼ切断可能なＦＬＡＧエピトー
プタグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼまたはヘ
キサヒスチジン尾部との融合タンパク質として同定され
る。（ＦＬＡＧはその試薬がIBI−Kodakより入手可能な
市販のエピトープである。）後者の場合、これは開始部
位、抗原認識配列およびエンテロキナーゼ切断部位を有
する合成オリゴヌクレオチドリンカーを設計することに
より達成される。タンパク質をｐＬａｃ（例えば、Blue
scipt KSベクター（Stratagene、LaJolla、CA）または
λｐＬ（Shatzmanら、N.Y.Acad.Sci.、478：233−248
（1986））プロモーターのいずれかの制御の下で発現さ
せ、細胞ライゼートにて予期される大きさのタンパク質
と特異的に連結することが知られているラジオフォトア
フィニティーＣＳＡＩＤでプローブに付す。Ｅ.coliに
て発現したタンパク質は、製造者の指示に従って、ＦＬ
ＡＧエピトープに対するモノクローナル抗体を含有する
アフィニティーマトリックス、グルタチオン・ビーズま
たはＮｉＮＴＡカラムに通すことで精製される。
【００６３】
【配列表】（１）一般的情報： （ｉ）出願人：マックドンネル，ピーター ヤング，ピーター （ｉｉ）発明の名称： 薬剤結合蛋白 （ｉｉｉ）配列の数：４ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）宛名： スミスクライン・ビーチャム・コーポレ
イション （Ｂ）通り名： スウェード・ランド７０９番 （Ｃ）都市名： キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名： ペンシルベニア州 （Ｅ）国名： アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号： １９４０６−０９３９ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体形態：ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ コンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：FastＳＥＱ Version１．５ （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ （Ａ）出願番号：０８／４６８９０２ （Ｂ）出願日：１９９５年６月６日 （Ａ）出願番号：０８／１２３１７５ （Ｂ）出願日：１９９３年９月１７日 （Ａ）出願番号：０８／２５０９７５ （Ｂ）出願日：１９９４年５月３１日 （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：シュレック、パトリシア・エイ （Ｂ）登録番号：３３,７７７ （Ｃ）代理人等における処理番号：ＡＴＧ５００３６ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０ ２７０ ５０３１ （Ｂ）テレファックス番号：６１０ ２７０ ５０９０
イション （Ｂ）通り名： スウェード・ランド７０９番 （Ｃ）都市名： キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名： ペンシルベニア州 （Ｅ）国名： アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号： １９４０６−０９３９ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体形態：ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ コンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：FastＳＥＱ Version１．５ （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ （Ａ）出願番号：０８／４６８９０２ （Ｂ）出願日：１９９５年６月６日 （Ａ）出願番号：０８／１２３１７５ （Ｂ）出願日：１９９３年９月１７日 （Ａ）出願番号：０８／２５０９７５ （Ｂ）出願日：１９９４年５月３１日 （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：シュレック、パトリシア・エイ （Ｂ）登録番号：３３,７７７ （Ｃ）代理人等における処理番号：ＡＴＧ５００３６ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０ ２７０ ５０３１ （Ｂ）テレファックス番号：６１０ ２７０ ５０９０
【００６４】（２） 配列番号１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１８３８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ヒポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号１： GCACGAGCGC AGCCGCCACG CCGGGGCCGC CGAGATCGGG TGCCCGGGAT GAGCCTCATC 60 CGGAAAAAGG GCTTCTACAA GCAGGAGCTC AACAAGACCG CCTGGGAGCT GCCCAAGACC 120 TACGTCTCCC CGACGCACGT CGGCAGCGGG GCCTATGGCT CCTGGTGCTC GGCCATCGAC 180 AAGCGGTCAG GGGAGAAGGT GGCCATCAAG AAGCTGAGCC GACCCTTTCA GTCCGAGATT 240 TTCGCCAAGC GCGCCTACCG GGAGCTGCTG CTGCTGAAGC ACATGCAGCA TGAGAACGTC 300 ATTGGGCTCC TGGATGTTTT CACCCCAGCC TCCTCCCTGC GCAACTTCTA TGACTTCTAC 360 CTGGTGATGC CCTTCATGCA GACGGATCTG CAGAAGATCA TGGGGATGGA GTTCAGTGAG 420 GAGAAGATCC AGTACCTGGT GTATCAGATG CTCAAAGGCC TTAAGTACAT CCACTCTGCT 480 GGGGTCGTGC ACAGGGACCT GAAGCCAGGC AACCTGGCTG TGAATGAGGA CTGTGAACTG 540 AAGATTCTGG ATTTTGGGCT GGCGCGACAT GCAGACGCCG AGATGACTGG CTACGTGGTG 600 ACCCGCTGGT ACCGAGCCCC CGAGGTGATC CTCAGCTGGA TGCACTACAA CCAGACAGTG 660 GACATCTGGT CTGTGGGCTG TATCATGGCA GAGATGCTGA CAGGGAAAAC TCTGTTCAAG 720 GGGAAAGATT ACCTGGACCA GCTGACCCAG ATCCTGAAAG TGACCGGGGT GCCTGGCACG 780 GAGTTTGTGC AGAAGCTGAA CGACAAAGCG GCCAAATCCT ACATCCAGTC CCTGCCACAG 840 ACCCCCAGGA AGGATTTCAC TCAGCTGTTC CCACGGGCCA GCCCCCAGGC TGCGGACCTG 900 CTGGAGAAGA TGCTGGAGCT AGACGTGGAC AAGCGCCTGA CGGCCGCGCA GGCCCTCACC 960 CATCCCTTCT TTGAACCCTT CCGGGACCCT GAGGAAGAGA CGGAGGCCCA GCAGCCGTTT 1020 GATGATTCCT TAGAACACGA GAAACTCACA GTGGATGAAT GGAAGCAGCA CATCTACAAG 1080 GAGATTGTGA ACTTCAGCCC CATTGCCCGG AAGGACTCAC GGCGCCGGAG TGGCATGAAG 1140 CTGTAGGGAC TCATCTTGCA TGGCACCGCC GGCCAGACAC TGCCCAAGGA CCAGTATTTG 1200 TCACTACCAA ACTCAGCCCT TCTTGGAATA CAGCCTTTCA AGCAGAGGAC AGAAGGGTCC 1260 TTCTCCTTAT GTGGGAAATG GGCCTAGTAG ATGCAGAATT CAAAGATGTC GGTTGGGAGA 1320 AACTAGCTCT GATCCTAACA GGCCACGTTA AACTGCCCAT CTGGAGAATC GCCTGCAGGT 1380 GGGGCCCTTT CCTTCCCGCC AGAGTGGGGC TGAGTGGGCG CTGAGCCAGG CCGGGGGCCT 1440 ATGGCAGTGA TGCTGTGTTG GTTTCCTAGG GATGCTCTAA CGAATTACCA CAAACCTGGT 1500 GGATTGAAAC AGCAGAACTT GATTCCCTTA CAGTTCTGGA GGCTGGAAAT YTGGGATGGA 1560 GGTGTTGGCA GGGCTGTGGT CCCTTTGAAG GCTCTGGGGA AGAATCCTTC CTTGGCTCTT 1620 TTTAGCTTGT GGCGGCAGTG GGCAGTCCGT GGCATTCCCC AGCTTATTGC TGCATCACTC 1680 CAGTCTCTGT CTCTTCTGTT CTCTCCTCTT TTAACAACAG TCATTGGATT TAGGGCCCAC 1740 CCTAATCCTG TGTGATYTTA TYTTGATCCT TATTAATTAA ACCTGCAAAT ACTCTAGTTC 1800 CAAATAAAGT CACATTCTCA GGTTCCAGGT GGACATGA 1838
【００６５】（２） 配列番号２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３６５アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉｉ）ヒポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）フラグメントの型：Ｎ−末端 （ｖｉ）起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号２： Met Ser Leu Ile Arg Lys Lys Gly Phe Tyr Lys Gln Glu Leu Asn Lys 1 5 10 15 Thr Ala Trp Glu Leu Pro Lys Thr Tyr Val Ser Pro Thr His Val Gly 20 25 30 Ser Gly Ala Tyr Gly Ser Trp Cys Ser Ala Ile Asp Lys Arg Ser Gly 35 40 45 Glu Lys Val Ala Ile Lys Lys Leu Ser Arg Pro Phe Gln Ser Glu Ile 50 55 60 Phe Ala Lys Arg Ala Tyr Arg Glu Leu Leu Leu Leu Lys His Met Gln 65 70 75 80 His Glu Asn Val Ile Gly Leu Leu Asp Val Phe Thr Pro Ala Ser Ser 85 90 95 Leu Arg Asn Phe Tyr Asp Phe Tyr Leu Val Met Pro Phe Met Gln Thr 100 105 110 Asp Leu Gln Lys Ile Met Gly Met Glu Phe Ser Glu Glu Lys Ile Gln 115 120 125 Tyr Leu Val Tyr Gln Met Leu Lys Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala 130 135 140 Gly Val Val His Arg Asp Leu Lys Pro Gly Asn Leu Ala Val Asn Glu 145 150 155 160 Asp Cys Glu Leu Lys Ile Leu Asp Phe Gly Leu Ala Arg His Ala Asp 165 170 175 Ala Glu Met Thr Gly Tyr Val Val Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu 180 185 190 Val Ile Leu Ser Trp Met His Tyr Asn Gln Thr Val Asp Ile Trp Ser 195 200 205 Val Gly Cys Ile Met Ala Glu Met Leu Thr Gly Lys Thr Leu Phe Lys 210 215 220 Gly Lys Asp Tyr Leu Asp Gln Leu Thr Gln Ile Leu Lys Val Thr Gly 225 230 235 240 Val Pro Gly Thr Glu Phe Val Gln Lys Leu Asn Asp Lys Ala Ala Lys 245 250 255 Ser Tyr Ile Gln Ser Leu Pro Gln Thr Pro Arg Lys Asp Phe Thr Gln 260 265 270 Leu Phe Pro Arg Ala Ser Pro Gln Ala Ala Asp Leu Leu Glu Lys Met 275 280 285 Leu Glu Leu Asp Val Asp Lys Arg Leu Thr Ala Ala Gln Ala Leu Thr 290 295 300 His Pro Phe Phe Glu Pro Phe Arg Asp Pro Glu Glu Glu Thr Glu Ala 305 310 315 320 Gln Gln Pro Phe Asp Asp Ser Leu Glu His Glu Lys Leu Thr Val Asp 325 330 335 Glu Trp Lys Gln His Ile Tyr Lys Glu Ile Val Asn Phe Ser Pro Ile 340 345 350 Ala Arg Lys Asp Ser Arg Arg Arg Ser Gly Met Lys Leu 355 360 365
【００６６】（２） 配列番号３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：７６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ヒポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）フラグメントの型： （ｖｉ）起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号３： GATCCGGTAC CATGGATTAT AAAGATGATG ATGATAAAAG CCTCATCCGG AAAAAGGGCT 60 TCTACAAGCA GGAGCT 76
【００６７】（２） 配列番号４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：６８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ヒポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）フラグメントの型： （ｖｉ）起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号４： CCTGCTTGTA GAAGCCCTTT TTCCGGATGA GGCTTTTATC ATCATCATCT TTATAATCCA 60 TGGTACCG 68
【図１】 ＣＳＢＰβの核酸配列およびアミノ配列を示
す。
す。
【図２】 ＣＳＢＰβの核酸配列およびアミノ配列を示
す。
す。
【図３】 ＣＳＢＰβの核酸配列およびアミノ配列を示
す。
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/48 Ｚ 1/48 1/68 Ａ 1/68 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ピーター・ロナルド・ヤング アメリカ合衆国08648ニュージャージー州 ローレンスビル、ヘンドリクソン・ロード 32番
Claims (41)
- 【請求項１】（ａ）配列番号２のアミノ酸からなるポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なく
とも７５％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）遺伝暗号の重複性により、配列番号２と同じアミ
ノ酸をコードするポリヌクレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対して
相補性のポリヌクレオチド；および （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド
の少なくとも連続した１５塩基からなるポリヌクレオチ
ドからなる群より選択されるメンバーからなる単離ポリ
ヌクレオチド。 - 【請求項２】 ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項
１記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項
１記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項４】 配列番号１に示されるヌクレオチドから
なる請求項２記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項５】 配列番号１に示されるヌクレオチド１−
１８３８からなる請求項２記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項６】 配列番号２のアミノ酸からなるポリペプ
チドをコードする請求項２記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項７】 請求項２記載のＤＮＡからなるベクタ
ー。 - 【請求項８】 請求項７記載のベクターからなる宿主細
胞。 - 【請求項９】 請求項８記載の宿主細胞からそのＤＮＡ
によってコードされるポリペプチドを発現させることを
特徴とするポリペプチドの製造法。 - 【請求項１０】 ポリペプチドを発現する細胞の製造法
であって、細胞がベクター中に含まれるヒトｃＤＮＡに
よりコードされるポリペプチドを発現するように、該細
胞を請求項７に記載のベクターで形質転換またはトラン
スフェクションすることからなる方法。 - 【請求項１１】 配列番号２のアミノ酸配列に対して少
なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる
ポリペプチド。 - 【請求項１２】 配列番号２に示されるアミノ酸配列か
らなるポリペプチド。 - 【請求項１３】 請求項１１記載のポリペプチドに対す
るアゴニスト。 - 【請求項１４】 請求項１１記載のポリペプチドに対す
る抗体。 - 【請求項１５】 請求項１１記載のポリペプチドに対す
るアンタゴニスト。 - 【請求項１６】 ＣＳＢＰβを必要とする患者の治療方
法であって、請求項１１記載のポリペプチドの治療上有
効量を該患者に投与することからなる治療方法。 - 【請求項１７】 ポリペプチドをコードするＤＮＡを患
者に付与し、インビボにて該ポリペプチドを発現させる
ことにより、該ポリペプチドの治療上有効量を投与する
ことからなる請求項１６記載の方法。 - 【請求項１８】 ＣＳＢＰβポリペプチドを必要とする
患者の治療方法であって、請求項１５記載のアンタゴニ
ストの治療上有効量を該患者に投与することからなる方
法。 - 【請求項１９】 請求項１１に記載のポリペプチドの発
現に関与する疾患または該疾患に対する罹病性の診断方
法であって、該ポリペプチドをコードする核酸配列にお
ける変異を測定することからなる方法。 - 【請求項２０】 宿主から由来のサンプル中の請求項１
１記載のポリペプチドの存在について分析することから
なる診断方法。 - 【請求項２１】 請求項１１記載のポリペプチドに対す
るレセプターに結合し、そのレセプターを活性化または
阻害する化合物を診断する方法であって、 ａ．細胞表面に該ポリペプチドに対するレセプター（化
合物の該レセプターへの結合に応じて、検出可能なシグ
ナルを発することのできる第2成分と関与する）を発現
する細胞を、該レセプターへの結合を可能とする条件下
でスクリーンすべき化合物と接触させ； ｂ．該化合物とレセプターとの相互反応より生じるシグ
ナルの有無を検出することにより、該化合物がレセプタ
ーに結合し、そのレセプターを活性化するか阻害するか
どうかを測定することからなる方法。 - 【請求項２２】 化合物をＣＳＢＰβと同定する方法で
あって、 ａ．分析的に検出可能な試薬で標識化した既知のＣＳＡ
ＩＤを、ＣＳＡＩＤ／ＣＳＢＰβ複合体を形成するのに
十分な条件下で、ＣＳＢＰβと接触させ； ｂ．該複合体を同定すべき化合物を有してなる試料と接
触させ：および ｃ．その複合体中の標識化ＣＳＡＩＤの量を変える該化
合物の能力を検出することにより、該化合物をＣＳＡＩ
Ｄと同定することからなる方法。 - 【請求項２３】 ＣＳＢＰβが全細胞、サイトソル細胞
フラクション、膜細胞フラクションからなる群より選択
される形態であり、精製または一部精製された形態であ
る請求項２２記載の方法。 - 【請求項２４】 化合物をＣＳＡＩＤと同定する方法で
あって、 ａ．可溶性サイトソルフラクションをＣＳＢＰβを発現
する細胞より形成させ； ｂ．該フラクションを、ＣＳＡＩＤ／ＣＳＢＰβ複合体
を形成するのに十分な条件下で、分析的に検出可能な試
薬で標識化したＣＳＡＩＤと接触させ； ｃ．該複合体をＣＳＡＩＤを含有する試料と接触させ：
および ｃ．標識化ＣＳＡＩＤ／ＣＳＢＰβ複合体中の試薬の減
少量を測定することにより、ＣＳＡＩＤと検出すること
からなる方法。 - 【請求項２５】 細胞がヒト単球である請求項２４記載
の方法。 - 【請求項２６】 細胞が組換え宿主細胞である請求項２
４記載の方法。 - 【請求項２７】 試薬が放射性標識である請求項２４記
載の方法。 - 【請求項２８】 ＣＳＢＰβとの結合能を有するリガン
ドの同定法であって、 ａ．ＣＳＢＰβを発現する組換え宿主細胞を、結合を可
能とする条件下で同定すべきリガンドと接触させ；およ
び ｂ．リガンド結合タンパク質の存在を検出することから
なる方法。 - 【請求項２９】 組換え宿主細胞がその細胞表面でＣＳ
ＢＰβを発現する請求項２８記載の方法。 - 【請求項３０】 タンパク質またはタンパク質含有の膜
フラクションを、同定すべきリガンドと接触させる前に
細胞より単離する請求項２８記載の方法。 - 【請求項３１】 請求項２２記載の方法により同定され
るアンタゴニストまたはアゴニスト化合物。 - 【請求項３２】 請求項２２記載の方法により同定され
る化合物と、医薬上許容される担体とからなる医薬組成
物。 - 【請求項３３】 請求項1記載のＤＮＡを、そのいずれ
かの細胞にて発現する能力を有するヒト以外のトランス
ジェニック哺乳動物。 - 【請求項３４】 ヒトＣＳＢＰβに結合する化合物を同
定するためのそれら化合物のスクリーニング方法であっ
て； ａ．ＣＳＢＰβ領域および結合タンパク質／リガンド結
合インジケーター領域を有する融合タンパク質を、ＣＳ
ＢＰβ領域との結合を可能とする条件下で複数の化合物
と接触させ；および ｂ．そのタンパク質／リガンド結合インジケーター領域
の活性を強化または阻害する能力を有する候補薬剤を同
定することからなる方法。 - 【請求項３５】 ヒトＣＳＢＰβと結合し、そのキナー
ゼ活性を阻害する化合物を同定するためのそれら化合物
のスクリーニング方法であって； ａ．ＣＳＢＰβを、ＣＳＢＰβとの結合を可能とする条
件下で複数の化合物と接触させ；および ｂ．ＣＳＢＰβのキナーゼ活性を強化または阻害する能
力を有する候補薬剤を同定することからなる方法。 - 【請求項３６】 ヒトＣＳＢＰβと結合し、そのキナー
ゼ活性の活性化を阻害する化合物を同定するためのそれ
ら化合物のスクリーニング方法であって； ａ．ＣＳＢＰβを、ＣＳＢＰβとの結合を可能とする条
件下で複数の化合物と接触させ；および ｂ．ＣＳＢＰβのキナーゼ活性の活性化を強化または阻
害する能力を有する候補薬剤を同定することからなる方
法。 - 【請求項３７】 サイトカイン介在の炎症疾患の治療法
であって、ＣＳＢＰβ−阻害量のＣＳＡＩＤをその治療
を必要とする患者に投与することからなる方法。 - 【請求項３８】 疾患が、ＳＤＡＴ、ＭＳ、脳性マラリ
ア、発作、脳外傷、脊髄損傷、アテローム性動脈硬化
症、再狭窄、ＡＲＤＳ、ＲＡ．ＯＡ、ＩＢＤ、乾癬、皮
膚炎、喘息、骨粗鬆症、敗血症、慢性腎不全、移植片拒
絶反応、狼瘡、移植片対宿主疾患、ＡＩＤＳおよびカヘ
キシーからなる群より選択される請求項３５記載の方
法。 - 【請求項３９】 ＣＳＡＩＤがＣＳＢＰβのキナーゼ活
性を阻害する請求項３５記載の方法。 - 【請求項４０】 ＣＳＡＩＤがＣＳＢＰβとその基質と
の結合を阻害する請求項３５記載の方法。 - 【請求項４１】 ＣＳＢＰβのキナーゼ活性および／ま
たはＣＳＢＰβとその基質との結合を阻害することによ
り機能するＣＳＡＩＤ。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CA002223075A CA2223075A1 (en) | 1997-12-02 | 1997-12-02 | Drug binding protein |
| EP97309793A EP0922762A1 (en) | 1997-12-02 | 1997-12-04 | Drug binding protein |
| JP9369757A JPH11196873A (ja) | 1997-12-02 | 1997-12-09 | 薬剤結合蛋白 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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