KR102158759B1 - 사이토카인 분석을 통한 관절염 치료제 스크리닝 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 사이토카인 분석을 통한 관절염 치료의 예측 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 관절염 치료 효능 예측 방법은 염증성 사이토카인 및 염증조절 사이토카인의 변화 패턴 분석을 통해 처리 물질의 관절염 치료 효능을 미리 예측함으로써, 관절염 치료제 개발에 따른 막대한 시간과 비용을 절약할 수 있는 효과가 있다.

Description

사이토카인 분석을 통한 관절염 치료제 스크리닝 방법{Screening methods for therapeutic agents of arthritis through cytokine analysis}
본 발명은 사이토카인 분석을 통한 관절염 치료제 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 관절염과 관련된 사이토카인의 분비 패턴 분석 결과를 바탕으로 처리 물질에 의한 관절염 치료 가능성을 예측하는 방법에 관한 것이다.
관절염과 관련된 사이토카인은 많은 연구가 진행되어 있는 분야이며, 염증을 조절할 수 있는 사이토카인의 균형은 관련 질병을 치유하는데 있어서 중요한 요소이다.
특히, 최근 연구결과에서는 질병을 치료하기 위한 전략으로 염증을 억제하는데 치중하기 보다 면역반응을 조절할 수 있는 염증조절 사이토카인의 균형에 초점을 맞추는 방법들을 제시하고 있다.
구체적으로, 상기 연구결과에서는 관절염에서 염증조절 사이토카인으로 IL-4, IL-5, IL-13을 사용하는 방법, IL-9과 IL-33을 사용하는 방법, IL-27, IL-10을 사용하는 방법에 의한 관절염 치료 가능성을 제안하고 있다(Chen Z. et al. Anti-inflammatory and immune-regulatory cytokines in rheumatoid arthritis.Nat Rev Rheumatol. 2018 Oct 19.).
또 다른 연구 결과는, 인터페론 감마(Interferon gamma, IFN-γ)에 의하여 관절염 진행에 있어서 중요한 과정인 파골세포형성(osteoclastogenesis)을 억제할 수 있는 기전을 제시하고 있다(Tang M. et al. Interferon-Gamma-Mediated Osteoimmunology. Front Immunol. 2018 Jun 29;9:1508.).
한편, IL-6와 IL-21은 관절염 진행에 관여하는 사이토카인으로 매우 잘 알려져 있다(Roeleveld DM. et al. Higher efficacy of anti-IL-6/IL-21 combination therapy compared to monotherapy in the induction phase of Th17-driven experimental arthritis.PLoS One. 2017 Feb 3;12(2).).
그러나 상기 연구 결과들은 관절염에 있어 사이토카인의 작용들을 제시하고 있을 뿐, 관련 사이토카인 분비 패턴 분석을 통한 관절염 치료 효능 예측 방법에 대해서는 제시하고 있지 않다.
특히, 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-21와 염증조절 사이토카인인 IFN-γ, IL-27, IL-10의 분비 패턴 분석을 통하여 관절염 치료 효능을 예측하는 방법에 관해서는 연구되어진 바 없다.
Chen Z. et al. Anti-inflammatory and immune-regulatory cytokines in rheumatoid arthritis.Nat Rev Rheumatol. 2018 Oct 19. Tang M. et al. Interferon-Gamma-Mediated Osteoimmunology. Front Immunol. 2018 Jun 29;9:1508. Roeleveld DM. et al. Higher efficacy of anti-IL-6/IL-21 combination therapy compared to monotherapy in the induction phase of Th17-driven experimental arthritis.PLoS One. 2017 Feb 3;12(2).
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 염증성 사이토카인과 염증조절 사이토카인의 분비 패턴 분석을 통해 처리물질의 관절염 치료 효능을 예측하는 관절염 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 혈액으로부터 분리된 세포에 피검물질을 처리한 시료군과 피검물질을 처리하지 않은 대조군을 준비하는 단계;
상기 시료군과 대조군에서 염증성 사이토카인 및 염증조절 사이토카인의 분비량을 측정하는 단계;
상기 시료군에서 측정된 각각의 사이토카인 분비량을 대조군에서 측정된 각각의 사이토카인 분비량으로 나누어 사이토카인 상대비를 얻는 단계; 및
상기 사이토카인 상대비를 분석하여 관절염 치료제를 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 관절염 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 관절염 치료 효능 예측 방법은 염증성 사이토카인 및 염증조절 사이토카인의 변화 패턴 분석을 통해 처리 물질의 관절염 치료 효능을 미리 예측함으로써, 관절염 치료제 개발에 따른 막대한 시간과 비용을 절약할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 관절염 치료 효능이 있는 펩타이드(P9)와 일반 펩타이드(AES16-2M)처리에 의한 사이토카인 분비 패턴을 비교한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본 명세서 및 청구범위에 사용되는 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
본 발명은 염증성 사이토카인 및 염증조절 사이토카인 분비 패턴 분석 결과를 바탕으로 처리물질에 의한 관절염 치료 가능성을 예측하는 관절염 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명은 혈액으로부터 분리된 세포에 피검물질을 처리한 시료군과 피검물질을 처리하지 않은 대조군을 준비하는 단계;
상기 시료군과 대조군에서 염증성 사이토카인 및 염증조절 사이토카인의 분비량을 측정하는 단계;
상기 시료군에서 측정된 각각의 사이토카인 분비량을 대조군에서 측정된 각각의 사이토카인 분비량으로 나누어 사이토카인 상대비를 얻는 단계; 및
상기 사이토카인 상대비를 분석하여 관절염 치료제를 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 관절염 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 관절염 치료제 스크리닝 방법의 첫번째 단계는, 혈액으로부터 분리된 세포에 피검물질을 처리한 시료군과 피검물질을 처리하지 않은 대조군을 준비하는 단계이다.
상기 혈액으로부터 분리된 세포는 건강한 성인 혈액으로부터 분리된 말초 혈액 단핵구 세포(Peripheral blood mononuclear cell)를 사용할 수 있다.
상기 시료군 및 대조군에는 사이토카인 분비 유도 물질을 처리할 수 있고, 바람직하게는 지질다당질(Lipopolysaccharide)을 처리할 수 있다.
상기 시료군은 혈액으로부터 분리된 세포에 피검물질과 사이토카인 분비 유도 물질을 처리한 후, CO2 인큐베이터에서 10 ~ 30 시간 동안 배양하여 얻은 배양 상청액을 사용할 수 있다.
상기 피검물질은 관절염 치료제의 후보물질로, 펩타이드, 단백질, 추출물, 화합물 및 조성물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
이어지는 단계는, 상기 시료군과 대조군에서 염증성 사이토카인 및 염증조절 사이토카인의 분비량을 측정하는 단계이다.
상기 염증성 사이토카인은 염증 반응을 유도하는 사이토카인을 의미하며, 상기 염증조절 사이토카인은 면역반응 조절과 관련된 사이토카인을 의미한다.
상기 염증성 사이토카인은 IL-6 및 IL-21 중 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 IL-6(interleukin-6)는 T 림프구, B 림프구, 대식세포, 섬유아세포 등 여러 세포에서 생산되는 사이토카인으로, 면역응답, 조혈계와 신경계 세포의 증식 및 분화, 급성 반응 등에 관여하며, IL-6의 과잉 생산은 여러 가지 면역이상증, 염증성 질환, 림프계 종양의 발증과 깊은 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 특히, IL-6는 류마티스관절염의 병인에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
상기 IL-21(interleukin-21)은 알파-헬릭스(α-helix) 구조를 갖는 사이토카인의 한 종류로서, IL-21의 수용체와 감마쇄(γ-chain)를 이용한 신호전달과정을 통해서 염증성 반응을 일으키며, 자연 살해 세포(NK 세포) 및 세포 독성 T세포를 포함하여 면역계 세포에 강력한 조절 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
또한, 상기 염증조절 사이토카인은 IFN-γ, IL-10 및 IL-27로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 IFN-γ(interferon-γ)는 IFN-α나 IFN-β와는 상동성이 없어 Ⅱ형 인터페론으로 분류되며, T림프구의 분열촉진제 혹은 특이항원 처리에 의해 유발되어 면역인터페론이라고도 한다. IFN-γ는 면역조절기능 뿐만 아니라 항바이러스 및 항종양의 성질이 있으며, 최근 관절염 진행과 관련하여 IFN-γ의 파골세포 형성 억제 기전이 밝혀진 바 있다.
상기 IL-10(interleukin-10)은 주로 Th2 세포에서 생산되는 사이토카인으로,면역억제와 면역촉진의 양면성을 나타낸다. 즉, Th1세포의 IFN-γ생성을 항원제시세포인 대식세포를 통해 억제하지만, B세포의 생존율을 높이고 비만세포의 증식을 촉진하는 것으로 알려져 있다.
상기 IL-27(Interleukin-27)은 IL-12 계열의 사이토카인으로 EBI3와 p28의 두 서브유닛으로 구성되어 있으며, 면역계에서 T 세포의 다양한 개체군을 분화시키고 IL-10을 상향 조절하는 것으로 알려져 있다.
상기 사이토카인의 분비량은 시료군 및 대조군에서 각각의 사이토카인에 대해 측정된다.
상기 사이토카인의 분비량은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역형광법(immunofluorescence), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis), 단백질 칩 분석법(protein chip technology assay) 등을 사용하여 의해 측정될 수 있고, 시중에 판매되는 인간 사이토카인 어레이 키트를 사용하여 측정될 수 있다.
상기 측정 결과가 최종적으로 화학 발광 분석 방법에 의해 얻어질 경우, 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 각 스팟(spot)의 normalized volume값을 구하고 각 사이토카인에 해당하는 스팟(spot)의 normalized volume 평균값을 사용하여 분석될 수 있다.
다음 단계는, 상기 시료군에서 측정된 각각의 사이토카인 분비량을 대조군에서 측정된 각각의 사이토카인 분비량으로 나누어 사이토카인 상대비를 얻는 단계이다.
구체적으로, 시료군에서 측정된 어느 하나의 사이토카인 분비량을 대조군에서 측정된 동일한 사이토카인 분비량으로 나누어 사이토카인 종류에 따라 각각의 상대비를 얻는다.
본 발명에 따른 스크리닝 방법은 각 사이토카인의 상대비를 사용하여 분석함으로써, 측정 조건이나 측정 방법에 영향을 받지 않으며 염증성 사이토카인 및 염증조절 사이토카인의 분비 패턴을 동시에 분석할 수 있는 장점이 있다.
이어지는 단계는, 상기 사이토카인 상대비를 분석하여 관절염 치료제를 선별하는 단계이다.
상기 사이토카인 상대비는 레이다 그래프(Radar graph)로 패턴화하여 분석하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 레이다 그래프(Radar graph)는 평가항목이 여러 개일 때 항목 수에 따라 원을 같은 간격으로 나누고, 중심으로부터 일정 간격으로 동심으로 척도를 재는 칸을 나누어 각 평가항목의 정량화된 점수에 따라 그 위치에 점을 찍고 평가항목간 점을 이어 선으로 만들어 항목 간 균형을 한눈에 볼 수 있도록 해주는 도표이다.
상기 각각의 사이토카인 상대비를 레이다 그래프로 패턴화할 경우, 각 패턴의 형태가 직관적으로 파악되어 패턴 분석이 용이하며, 관절염 치료제군과의 패턴 비교를 통해 신속하게 관절염 치료제를 선별할 수 있는 장점이 있다.
본 발명에 따른 관절염 치료제 스크리닝 방법은 상기 염증성 사이토카인의 상대비가 상기 염증조절 사이토카인 상대비보다 큰 경우, 피검물질을 관절염 치료제로 선별하는 것을 특징으로 할 수 있다.
구체적으로, 상기 염증성 사이토카인의 상대비는 1 ~ 100 이고, 상기 염증조절 사이토카인 상대비는 0.01 ~ 10 인 경우, 피검물질을 관절염 치료제로 선별할 수 있다.
바람직하게는, 상기 염증성 사이토카인의 상대비는 5 ~ 50 이고, 상기 염증조절 사이토카인 상대비는 0.01 ~ 5 인 경우, 피검물질을 관절염 치료제로 선별할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 관절염 치료제 스크리닝 방법은 염증성 사이토카인인 상기 IL-6의 상대비가 15 ~ 50 인 경우, 피검물질을 관절염 치료제로 선별하는 것을 특징으로 할 수 있다.
바람직하게는, 상기 IL-6의 상대비가 20 ~ 50 인 경우 피검물질을 관절염 치료제로 선별할 수 있고, 바람직하게는 IL-6의 상대비가 40 ~ 45인 경우 피검물질을 관절염 치료제로 선별할 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예 및 실험예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
<실시예> 펩타이드 처리에 따른 사이토카인 분석
(1) 펩타이드 처리
세포에서 분비하는 사이토카인을 측정하기 위하여 먼저 건강한 성인 혈액으로부터 말초 혈액 단핵구 세포(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 분리하고 1 X 106/mL의 농도로 준비하였다. 이후, 사이토카인 분비를 유도하기 위하여 지질다당질(Lipopolysaccharide,LPS)를 10 ng/mL의 농도로 처리하였다.
이때, 처리 물질인 펩타이드에 의한 변화를 보기 위해 100 ng/mL의 농도로 관절염 치료 효과가 있는 펩타이드(P9)을 LPS와 함께 처리하였다. 24시간 동안 CO2 incubator에서 배양한 후, 배양 상청액(culture supernatant)을 수거하여 사이토카인 분석을 위한 시료로 이용하였다.
비교 물질로, 일반 펩타이드(AES16-2M)를 동일하게 처리하여 분석 시료로 사용하였으며, 사용된 펩타이드의 아미노산 서열을 표 1에 나타내었다.
아미노산 서열
P9 PSPPSPPSP
AES16-2M REGRT
(2) 사이토카인 분비 측정
수거한 배양 상청액(culture supernatant)은 Human cytokine array(R&D Systems_ARY005B)를 제공하는 프로토콜에 따라 수행하였다.
간략하게 제공하는 array buffer 4를 2 mL 처리하여 멤브레인을 1시간 동안 rocking shaker에서 bloking 하였다. 샘플은 1 mL의 배양 상청액과 제공하는 Array buffer 4 500 uL를 섞고, 제공하는 Detection antibody cocktail 15 uL를 처리하여 상온에서 1시간 동안 pre-binding 시켰다. 멤브레인을 워싱하여 남아있는 blocking buffer를 제거한 후, 샘플을 처리하고 하룻밤 동안 방치해 두었다. 다음날 샘플을 워싱하여 제거한 뒤에 제공하는 Streptavidin-HRP를 2 mL 처리하여 30 분 동안 binding 시켰다. 멤브레인을 워싱하여 남아있는 Streptavidin-HRP를 제거하고 detection을 위한 HCL 웨스턴 블로팅 검출시약(Western blotting detection reagent, GE Healthcare_RPN2232)를 처리한 후, 30초 간격으로 멤브레인을 방출 광원(emission light)에 노출시켜 화학 발광 분석(chemiluminescent detection)에 따른 방법으로 검출하여 Tiff 이미지로 저장하였다(Fuji_LAS-3000).
(3) 사이토카인 분석
저장한 이미지 파일은 Totallab (CLIQS 1D) 프로그램을 이용하여 수치화하여 spot의 normalized volume값을 구하였다.
이후, 구하고자 하는 사이토카인에 해당하는 spot의 normalized volume의 평균값을 구하고 분석을 위하여 relative ratio로 계산하여 나타내었다. 간략하게는 LPS와 펩타이드를 처리한 샘플의 사이토카인에 대한 normalized volume 값을 LPS만 처리한 샘플의 타겟 사이토카인에 대한 normalized volume 값으로 나누어 ratio를 계산하고 radar graph를 그려 패턴을 비교하였다.
(4) 사이토카인 array 분석 결과
실제 관절염 치료에 효과가 있는 펩타이드(P9)을 최종 계산된 ratio 값을 분석하여 치료 효능 예측 가능성을 검증하였다.
표 1에 나타낸 바와 같이, 염증성 사이토카인의 경우 각각 IL-6는 41.18배, IL-21은 6.75배 증가하였다. 반면에 염증조절 사이토카인의 경우에는 IFN-gamma가 0.61배, IL-10이 0.29배, IL-27이 1.35배 증가한 것으로 나왔다.
또한, 도 1에 나타낸 바와 같이 일반 펩타이드인 AES16-2M(Sci Rep. 2018 Sep 26;8(1):14398)인 경우에는 상기 사이토카인 중, IL-6만 12.71배 증가하여 펩타이드(P9)과는 전혀 다른 패턴을 나타내었다. 이를 통해, 펩타이드(P9)의 관절염 효능을 입증하였다.
Cytokine Control LPS+P9 Ratio
IFN-g 0.70 0.43 0.61
IL-6 0.09 3.50 41.18
IL-10 0.46 0.14 0.29
IL-21 0.02 0.14 6.75
IL-27 0.10 0.14 1.35
Cytokine Control LPS+AES16-2M Ratio
IFN-g 0.70 0 -
IL-6 0.09 1.08 12.7
IL-10 0.46 0 -
IL-21 0.02 0 -
IL-27 0.03 0 -
<110> Korea University Industry and Academy Cooperation Foundation <120> Screening methods for therapeutic agents of arthritis through cytokine analysis <130> SP-1903 <150> KR 10-2018-0151344 <151> 2018-11-29 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P9 <400> 1 Pro Ser Pro Pro Ser Pro Pro Ser Pro 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AES16-2M <400> 2 Arg Glu Gly Arg Thr 1 5

Claims (7)

  1. 혈액으로부터 분리된 세포에 피검물질과 사이토카인 분비 유도 물질을 처리한 시료군과 피검물질을 처리하지 않고 사이토카인 분비 유도 물질만 처리한 대조군을 준비하는 단계;
    상기 시료군과 대조군에서 IL-6 및 IL-21로 이루어진 염증성 사이토카인, 및 IFN-γ, IL-10 및 IL-27로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 염증조절 사이토카인의 분비량을 측정하는 단계;
    상기 시료군에서 측정된 각각의 사이토카인 분비량을 대조군에서 측정된 각각의 사이토카인 분비량으로 나누어 사이토카인 상대비를 얻는 단계; 및
    상기 염증성 사이토카인의 상대비가 상기 염증조절 사이토카인 상대비보다 큰 경우, 피검물질을 관절염 치료제로 선별하는 단계를 포함하는 관절염 치료제 스크리닝 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 사이토카인 상대비는 레이다 그래프(Radar graph)로 패턴화하여 분석하는 것을 특징으로 하는 관절염 치료제 스크리닝 방법.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 IL-6의 상대비가 15 ~ 50인 경우, 피검물질을 관절염 치료제로 선별하는 것을 특징으로 하는 관절염 치료제 스크리닝 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 피검물질은 펩타이드, 단백질, 추출물, 화합물 및 조성물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 관절염 치료제 스크리닝 방법.
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