JP5683434B2

JP5683434B2 - 身長増加用組成物

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Publication number: JP5683434B2
Application number: JP2011245743A
Authority: JP
Inventors: 一和中尾; 明宏八十田; 北村　秀智; 秀智北村
Original assignee: 一和中尾
Priority date: 2004-03-31
Filing date: 2011-11-09
Publication date: 2015-03-11
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Also published as: WO2005094890A1; KR20070007842A; US8815803B2; JP4972403B2; EP3446711A1; JP2012087127A; US20080312142A1; EP3620530A1; EP1743653A4; CN1960757A; EP1743653A1; JPWO2005094890A1

Description

本発明は、グアニルシクラーゼB（GC-B）を活性化する物質を有効成分として含む身長増加用組成物に関する。具体的には、本発明の組成物は、FGFR3異常を有しない、低身長症患者に対する治療用途又は低身長症患者以外の個体での伸長用途に使用しうる。
本発明はまた、GC-Bを活性化することによる身長増加方法に関する。

本発明はさらに、GC-Bの活性を指標とした身長増加剤のスクリーニング方法に関する。本発明はさらにGC-Bを活性化することによりFGFR3異常を有しない軟骨性骨を伸長させる方法に関する。

医学的な低身長症とは、「同性、同年齢の身長の平均値より-2SD（SD：標準偏差）以下」と定義され、この基準に該当する場合に低身長症として診断されている。そして低身長症には、成長ホルモンやインシュリン様成長因子-I (IGF-I)分泌不全などに伴う内分泌性低身長症と、家族性低身長、胎内発育不全性低身長、染色体異常などの非内分泌性低身長症、さらに薬物治療や放射線療法による二次性低身長症に大別される。

従来、低身長症の治療として成長ホルモンの投与や、股関節の人工関節置換や脚延長術などの整形外科手術が行われてきた。脚延長術は、10歳以降に骨を切って特殊な機械（脚延長器）により、半年くらいかけて徐々に身長を伸ばすが、この手術は患者に大きな苦痛を与える。また成長ホルモン療法は幼児期からの定期的な成長ホルモン注射により身長の伸びは改善するが、注射を止めると伸びは止まってしまう。これらのいずれの治療法も病気を治すものではなく、患者のQOLの観点からも理想的ではないと考えられている（非特許文献１、非特許文献２）。低身長症のうち内分泌性低身長症は遺伝子組み替え成長ホルモンやIGF-Iなどの薬剤での治療が可能な疾患であるが、非内分泌性低身長症である家族性低身長症、胎内発育不全性低身長症の原因は明らかではなく、成長ホルモンは非内分泌性低身長症には効果が認められていないことから、有効な治療薬は存在しなかった（非特許文献３）。これらの状況から新しい機序に基づく治療薬の開発が望まれてきた。

グアニルシクラーゼ（GC）は、GTPからセカンドメッセンジャーであるｃGMPの合成を触媒する酵素ファミリーに属する膜蛋白質であり、GC-A, GC-B,…, GC-Fが知られている。GC-Bは主に血管内皮細胞に見出され、平滑筋の弛緩に関与すると考えられている。

ナトリウム利尿ペプチド(NP)類は、ANP（心房性ナトリウムペプチド）、BNP（脳性ナトリウム利尿ペプチド）およびCNP（C型ナトリウム利尿ペプチド）の３種類からなり、２種類のグアニリルシクラーゼ共役受容体（ANPおよびBNPに対するNPR-A、CNPに対するNPR-B）を介して細胞内cGMP濃度を上昇させ、さらに複数のｃGMPエフェクター分子の仲介によって細胞内シグナル伝達が行われると考えられている(非特許文献４)。NP類は、体液の恒常性の制御や血圧の調節に重要な役割を果たすと報告されているが(非特許文献５、非特許文献６)、心臓血管系以外の様々な組織での発現とその生理活性も知られている(非特許文献７、非特許文献８)。軟骨に関しては、BNP (非特許文献９)またはCNPの関節部位における過剰発現が、繊維芽細胞増殖因子レセプター3（FGFR3）遺伝子の変異に起因する軟骨無形成症の治療に有効であることが報告されている(非特許文献１０、特許文献１)。

特開2003-113116号公報

American Journal of Medical Genetics 1997; 72: 71-76 European Journal of Endocrinology 1998; 138: 275-280 メルクマニュアル第17版 1999年日経ＢＰ社／日経ＢＰ出版センター Ann Rev Biochem 1991;60: 229-255 J Clin Invest 1987;93:1911-1921 J Clin Invest 1994; 87: 1402-1412 Endocrinol 1991;129:1104-1106 Ann Rev Biochem 1991;60: 553-575 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998;95:2337-2342 Nat Med 2004;10(1):80-86

本発明の目的は、FGFR3異常を有しない、低身長症患者又は低身長症患者以外の個体において治療又は美容等のために身長を増加させるための組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、GC-Bを活性化することにより、FGFR3異常を有しない、低身長症患者又は低身長症患者以外の個体の身長を増加させる方法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、GC-Bの活性を指標として身長増加剤をスクリーニングする方法を提供することである。
本発明のさらに別の目的はGC-Bを活性化することによりFGFR3異常を有しない軟骨性骨を伸長させる方法に関することである。

本発明者らは、グアニルシクラーゼB（GC-B）活性化物質の１種であるC型ナトリウム利尿性ペプチド（CNP）が全身で発現し、血中濃度が上昇するCNPトランスジェニックマウスを作製し、身長への影響および成長軟骨への影響を検証した結果、CNP トランスジェニックマウスでは、身長増加が促進されていることおよび大腿骨成長軟骨が有意に肥厚していること、また、これらのCNPトランスジェニックマウスの性状解析から、FGFR3異常を有しない場合においてCNPが血行性に作用することで身長増加が促進されることを見出した。

したがって、本発明は、下記の発明からなる。
本発明は、第１の態様において、GC-Bを活性化する物質を有効成分として含む、FGFR3異常を有しない個体に投与する身長増加用組成物を提供する。

本発明の一の実施態様において、上記組成物がFGFR3異常を有しない低身長症患者に使用される。

本発明の別の実施態様において、上記組成物がFGFR3異常を有しない低身長症患者以外の個体に使用される。

本発明の別の実施態様において、上記身長増加が軟骨性骨の伸長である。
本発明の別の実施態様において、上記身長増加が大腿骨、脛骨、橈骨及び/又は尺骨の伸長である。

本発明の別の実施態様において、上記物質がペプチドである。
本発明の別の実施態様において、上記ペプチドがCNP又はその誘導体である。

本発明の別の実施態様において、上記CNPが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のCNP-22及びCNP-53から選択される。

本発明の別の実施態様において、上記CNPが配列番号１のCNP-22又は配列番号２のCNP-53である。

本発明の別の実施態様において、上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつCNP活性を有するものである。

本発明は、第２の態様において、GC-Bを活性化することによって、FGFR3異常を有しない個体の身長を増加することを特徴とする、身長増加方法を提供する。

本発明の一の実施態様において、上記身長増加が軟骨性骨の伸長である。
本発明の別の実施態様において、上記身長増加が大腿骨、脛骨、橈骨及び/又は尺骨の伸長である。

本発明の別の実施態様において、上記GC-Bが、CNP又はその誘導体によって活性化される。

本発明の別の実施態様において、上記CNPが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のCNP-22又はCNP-53である。

本発明の別の実施態様において、上記CNPが、配列番号１のCNP-22又は配列番号２のCNP-53である。

本発明は、第３の態様において、GC-Bの活性を指標として身長増加剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、身長増加剤のスクリーニング方法を提供する。

本発明の一の実施態様において、上記GC-Bの活性が、細胞内ｃGMP産生量として測定される。

本発明の別の実施態様において、上記方法が、ヒトGC-Bを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を被験物質の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内ｃGMPの産生量を測定し、該被験物質の存在下と非存在化での細胞内ｃGMP産生量の差を指標として身長増加剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む。

本発明はさらに、GC-Bを活性化することによりFGFR3異常を有しない軟骨性骨を伸長させる方法を提供する。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2004-107871号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。

図１は、CNP トランスジェニックマウス作製用ベクターの構築を示す。図1A：pGEM-T Easyベクターに組み込まれたマウスCNPのcDNAをPstIで切り出し両末端を平滑化した。図１B：pSG1をEco RIで処理して断端を平滑化した。図１C：図１Aで得られたマウスCNPのcDNAを図１Bで得られたpSG1に組み込んだ。図２は、インジェクション用DNAフラグメントを示す。図１CのｐSG1-CNPから、HindIIIおよびXhoIで処理した後、CNP遺伝子を含む断片(約2.3kb)を切り出し、インジェクション用のフラグメントとした。図３は、CNPトランスジェニックマウスの遺伝子型解析結果を示す。野生型マウス（WT）では３本のシグナル（野生型 CNP遺伝子）が検出され、トランスジェニックマウス（Tgm）では野生型CNP遺伝子に加えて、導入遺伝子由来のシグナル（トランスジーン）が2本検出された図４は、CNP トランスジェニックマウスの成長曲線の推移を示す。雌のCNP トランスジェニックマウス(TG)は、２週齢以降継続して正常同腹仔（WT）に対して有意に鼻肛長が長かった(図4A)。雄では、４週齢以降継続して正常同腹仔（WT）に対して有意に鼻肛長が長かった(図4B)。*: p<0.05, **: p<0.01 vs. WT, 対応のないStudent t検定。図５は、CNPトランスジェニックマウスの大腿骨成長軟骨の肥厚を示す。CNPトランスジェニックマウス（CNP tgm）は、休止層(Resting)、増殖層(Proliferating)、肥大層（Hypertrophy）およびこれらの合計（Total）のすべてについて正常同腹仔（Wild）に対して有意に厚かった。*: p<0.05, **: p<0.01 vs. 野生型, 対応のないStudent t検定。

図面を参照しながら、本発明をさらに具体的に説明する。
本発明者らが後述の実施例２に記載のように作製したCNP-トランスジェニックマウス（CNPTgm）についてサザンブロット法を用いて遺伝子型解析を行ったところ、図３に示されるように、野生型マウスでは３本のシグナル（野生型 CNP遺伝子）が検出され、CNPTgmでは野生型CNP遺伝子に加えて、導入遺伝子由来の２本のシグナル(トランスジーン)が検出された。CNPTgmでのCNPの発現を検討するため、導入した遺伝子の高発現が予想される臓器である肝臓および血漿でのCNPの濃度を調べたところ、CNP Tgmは野生型に対し、肝臓で約10倍、血漿で約24倍のCNP濃度を示しており、統計学的に有意にCNPペプチドが過剰発現されていることが確認された(実施例４の表１)。

さらに雌雄のCNPTgmおよびその正常同腹仔の鼻肛長を、２〜９週間にわたり経時的に測定した結果、雌雄ともにCNPTgmは鼻肛長が正常同腹仔よりも大きく、身長が増加していることが判明した(図4；A：雌、B：雄)。従って血中のCNP濃度を上昇させることで身長増加が促進されることが確認された。

CNPTgmの成長軟骨の厚さを組織学的に解析する目的で、大腿骨膝蓋面の成長軟骨の休止層、増殖層、肥大層の厚さの平均値および成長軟骨の厚さとして前記３層の合計値を用いて解析を行ったところ、CNPTgmにおいては、休止層、増殖層、肥大層およびその合計のすべてについて統計学的に有意に厚いことが確認された(図５)。CNPは、大腿骨の軟骨性骨以外にも、例えば脛骨、橈骨、尺骨等の他の軟骨性骨の休止層、増殖層、肥大層各層を厚くすることによっても動物の身長増加を促進することが示された。

従って、本発明は、GC-Bを活性化する物質を有効成分として含む、FGFR3異常を有しない個体に投与する身長増加用組成物を提供する。

本発明において、「FGFR3異常」とは、FGFR3(繊維芽細胞増殖因子レセプター３)遺伝子の変異による軟骨の成長抑制に起因する軟骨無形成症及び軟骨形成不全症や、FGFR3遺伝子の変異によるFGFR3の機能亢進を含み、さらにはFGFR3の機能抑制不全、又はFGFR3遺伝子の発現亢進などを原因とする軟骨無形成症及び軟骨形成不全症を意味する（特開2003-113116、Nat Med 2004, 10(1):80-86、国際公開WO02/074234）。

本発明の実施態様において、上記組成物はFGFR3異常を有しない低身長症患者に使用される。本発明において「低身長症」として、FGFR3異常を除いた低身長症をいい、例えば(1)成長ホルモン分泌不全性低身長症（下垂体性小人症）、甲状腺機能低下症、副腎皮質機能亢進症等による内分泌性低身長症、(2)家族性低身長、胎内発育不全性低身長、染色体異常(ターナー症候群、プラーダー・ヴィリ症候群など)などによる非内分泌性低身長症、並びに(3)薬物治療や放射線療法による二次性低身長症を包含する。

本発明の別の実施態様において、上記組成物はさらにFGFR3異常を有しない、低身長症患者以外の個体にも使用されうる。本発明において、FGFR3異常を有しない低身長症患者以外の個体での使用又は伸長用途としては、美容医療分野及びスポーツ分野、さらには身長増加を望むヒトでの使用を包含する。

本発明で使用を意図する個体は、ヒトを含む哺乳動物、例えばヒト、ブタ、ウシなどを含むが、これらの特定例によって制限されない。好ましい個体は、ヒトである。

本発明の別の実施態様において、上記身長増加は軟骨性骨の伸長である。
本発明のさらに別の実施態様において、上記身長増加は大腿骨、脛骨、橈骨及び/又は尺骨の伸長である。

本発明においてグアニルシクラーゼB(GC-B)とは、ナトリウム利尿ペプチド受容体B(NPR-B)と同義の用語として使用する。
本発明においてGC-B活性とは、グアニルシクラーゼ活性と同義の用語として使用する。

本発明において、グアニルシクラーゼB（GC-B）活性化物質又はGC-B活性化物質は、CNPの受容体として知られるGC-Bと結合してこれを活性化するペプチド又は非ペプチド性低分子化合物であり、好ましくはCNPペプチド又はその誘導体である。ここでペプチドは、複数の（L-、D-及び/又は修飾）アミノ酸のアミド結合連鎖からなる物質を指し、この中にはポリペプチド及び蛋白質も包含される。GC-B活性化物質は、例えば、COS-7等の培養細胞株にGC-B受容体を発現させ、培地に候補薬剤を添加し、一定の温度及び一定の時間(例えば37℃、5分間)細胞株を培養したのち、細胞内のｃGMP産生量を測定する方法(Science 1991; 252: 120-123)によって同定されうる。すなわち、このようなアッセイ系を使用して細胞内ｃGMPの産生量を指標としてGC-B活性化物質を同定し、それを本発明に使用することができる。

本発明の実施態様において、GC-B活性化物質はペプチドであり、好ましくはCNP又はその誘導体である。好ましいCNPは、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のCNP-22及びCNP-53から選択されるものであり、さらに好ましくは、配列番号１のCNP-22又は配列番号２のCNP-53である。

本発明の別の実施態様において、上記CNP誘導体は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつCNP活性を有するものである。あるいは、上記CNP誘導体は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列と約70％以上、約80％以上、約85％以上、約90％以上、約95％以上、約97％以上、約98％以上、約99％以上の％同一性を有する配列を含みかつCNP活性を有するものである。

本明細書中で使用される「１〜数個」という用語は、通常１〜10、好ましくは１〜５、さらに好ましくは１〜３の任意の整数を表す。また、２つのアミノ酸配列間の「％同一性」は、当業者に公知のBLASTタンパク質検索などの手法を用いて決定することができる(Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) “Basic Local Alignment Search Tool” J. Mol. Biol. 215:403-410)。

本発明で使用可能なCNPには、ヒトを含む哺乳類由来CNP(CNP-22:Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990;168:863-870, 国際公開WO91/16342、CNP-53: Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990; 170:973-979, 特開平4-74198号公報、特開平4-139199号公報、特開平4-121190号公報)、鳥類由来CNP(特開平4-120094号公報)、両生類由来CNP(特開平4-120095号公報)、並びに、特開平6-9688号公報、国際公開WO02/074234に開示されるCNP類似体ペプチドのようなCNP誘導体が含まれる。

天然由来CNPとして、22及び53アミノ残基からなるCNP-22及びCNP-53が知られており、鳥類及びヒトを含む哺乳類由来の各CNPを比較すると種を超えて配列相同が高いため、本発明においては、鳥類又はヒトを含む哺乳類由来のCNP、好ましくはヒトを含む哺乳類由来のCNP、さらに好ましくはヒト由来のCNPが使用されうる。ヒトCNP-22及びCNP-53のアミノ酸配列は、下記の配列番号１及び配列番号２：
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys（ヒトCNP-22:配列番号１）；
Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys（ヒトCNP-53:配列番号２）
として示される配列を有しており、いずれも分子内ジスルフィド結合を有し、すなわちヒトCNP-22では6位のシステイン残基と22位のシステイン残基との間で、またヒトCNP-53では37位のシステイン残基と53位のシステイン残基との間でそれぞれ分子内ジスルフィド結合を有し、環状ペプチド構造を形成している。

ブタCNP-22及びラットCNP-22は、ヒトCNP-22と同一のアミノ酸配列を有するが、一方、ブタCNP-53及びラットCNP-53では17位及び28位のアミノ酸残基がそれぞれHis及びGlyであるのに対しヒトCNP-53ではそれぞれGln及びAlaであり、２つのアミノ酸が相違する（特開平4-139199号公報、特開平4-121190号公報、特開平4-74198号公報）。さらにまた、ニワトリCNP-22は、9位のアミノ酸残基ValのみがヒトCNP-22と異なる以外は同じ一次構造を有している(特開平4-120094号公報)。

本発明で使用しうる上記CNPは、天然からの精製CNP、既知の遺伝子工学的手法で製造された遺伝子組換えCNP、既知の化学合成法（例えばペプチド合成機を用いる固相合成法）で製造されたCNPを含み、好ましくは遺伝子工学的手法で製造されたヒトCNP-22およびヒトCNP-53である。遺伝子工学的手法によるヒトCNPの製造は、例えば、ヒトCNP-22又はCNP-53のDNA配列(特開平4-139199号公報)をプラスミド、ファージなどのベクターに組み込み、大腸菌や酵母などの原核もしくは真核生物宿主細胞に形質転換したのち、適する培地中で発現し、好ましくは細胞外にCNPペプチドを分泌させ、産生したCNPペプチドを回収し精製する各工程を含む。また、目的DNAの増幅のために、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を使用することができる。

遺伝子組換え技術、部位特異的突然変異誘発法、PCR技術などの基本的な手法は当業者には公知であり、例えばJ. Sambrookら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); Ausubelら, Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998)などに記載されており、そこに開示される技術を本発明のために利用することができる。またベクターとしては、市販のベクターあるいは刊行物記載のベクターが使用できる。

本発明で使用しうるCNP誘導体は、CNP活性を有するとともに、ヒトCNP-22又はCNP-53と同一の２つのシステイン残基間のジスルフィド結合による環状ペプチド構造を有するものであって、上記CNPのフラグメント、上記CNP又はそのフラグメントの構成アミノ酸の少なくとも１つをその他のアミノ酸に置換したペプチド、上記CNPそのもの又はその部分ペプチドの構成アミノ酸の少なくとも１つを欠失したペプチド、及び上記CNPそのもの又はその部分ペプチドの構成アミノ酸に１つ以上のアミノ酸を付加したペプチドを含む。アミノ酸の置換、欠失、付加とは、CNP活性を損なわない限り、部位特異的突然変異誘発法などの周知の方法にてアミノ酸の置換、欠失又は付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失又は付加されることを意味する。このようなCNP-22又はCNP-53の誘導体は例えば、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつCNP活性を有するものである。

アミノ酸の置換については、一般的に保存的アミノ酸置換が好ましい。保存的アミノ酸は、例えば極性度（または疎水性度）や電荷の種類によって分類されることができる。例えば、非極性の非電荷型アミノ酸にはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリンなど、芳香族アミノ酸にはフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、極性の非電荷型アミノ酸にはセリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンなど、負電荷アミノ酸にはアスパラギン酸、グルタミン酸、正電荷アミノ酸にはリジン、アルギニン、ヒスチジンが、それぞれ含まれる。

本明細書中で使用される「CNP活性」とは、GC-Bに作用してグアニルシクラーゼ活性を上昇させる活性あるいは身長を有意に増加させる活性をいう。CNP活性は、細胞のグアニルシクラーゼ活性、たとえば細胞内ｃGMPの産生量を測定することによること、あるいはマウス、ラットなどの動物に一定期間GC-B活性化物質を投与したのち、後述の実施例５に記載されるように鼻肛長を測定すること、によって決定しうる。

CNP-22類似ペプチドには、例えば特開平6-9688号公報や国際公開WO02/074234に記載されるような下記の環状ペプチドが含まれる（なお、配列中の下線はヒトCNP-22からの変異を表す）。
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ala Met Ser Gly Leu Gly Cys(配列番号3)
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Gln Ser Gly Leu Gly Cys(配列番号4)
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Ala Ser Gly Leu Gly Cys(配列番号5)
Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys(配列番号6)
Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys(配列番号7)
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr(配列番号8)
Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr(配列番号9)
Cys Phe Gly Xaa Xbb Xcc Asp Arg Ile Gly Xdd Xee Ser Xff Xgg Gly Cys
（ここで、Xaa=Leu, Ile, Val; Xbb=Lys, Leu, Met; Xcc=Leu, Ile, Ala, Val; Xdd=Ser, Ala, Gly, Thr, Asn; Xee=Met, Ala, Trp, His, Lys, Ser, Gly; Xff=Gly, Lys, Ala, Leu; Xgg=Leu, Metである。）(配列番号10)

また、CNP-53類似ペプチドには、上記のCNP-22類似ペプチドに対応するアミノ酸の同様の変異を含む環状ペプチドが含まれる。

本発明はまた、GC-Bを活性化することによって、FGFR3異常を有しない個体の身長を増加することを特徴とする、身長増加方法を提供する。この発明は、GC-B活性化物質が、FGFR3異常を有しない個体の身長を増加するという知見に基づくものである。具体的には、上記身長増加は軟骨性骨の伸長であり、さらに具体的には、大腿骨、脛骨、橈骨及び/又は尺骨の伸長である。GC-B活性化物質の具体例は、上記定義のCNP又はその誘導体である。CNPは、好ましくは、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のCNP-22又はCNP-53であり、さらに好ましくは、配列番号１のCNP-22又は配列番号２のCNP-53である。また、CNP誘導体は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつCNP活性を有するものを含む。他のGC-B活性化物質は、例えば、COS-7等の培養細胞株にGC-B受容体を発現させ、培地に候補薬剤を添加し、一定の温度及び一定の時間(例えば37℃、5分間)細胞株を培養したのち、細胞内のｃGMP産生量を測定する方法(Science 1991; 252: 120-123)によって同定されうる。すなわち、このようなアッセイ系を使用して細胞内ｃGMPの産生量を指標としてGC-B活性化物質を同定し、それを本発明に使用することができる。

本発明はさらに、GC-Bの活性を指標として身長増加剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、身長増加剤のスクリーニング方法を提供する。本発明の実施態様により、GC-Bは、上記定義のCNP又はその誘導体によって活性化されうる。GC-Bは、グアニルシクラーゼ活性によりGTPからセカンドメッセンジャーであるｃGMPの合成を触媒することが知られているので、GC-Bの活性は、細胞内ｃGMP産生量として測定されうる。

本発明の実施態様において、上記スクリーニング方法はGC-Bを発現する培養細胞又は関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞のGC-B活性を指標として身長増加剤の候補薬剤をスクリーニングすることからなる方法を含む。

本発明の実施態様において好ましくは、GC-Bを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内ｃGMPの産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内ｃGMP産生量の差を指標として身長増加について候補薬剤をスクリーニングすることからなる方法を含む。

本発明のスクリーニング方法は、例えば、COS-7等の培養細胞株にGC-B受容体を発現させ、培地に被験物質を添加し、一定の温度及び一定の時間(例えば37℃、5分間)細胞株を培養したのち、細胞内のｃGMP産生量を測定する方法(Science 1991; 252: 120-123)によって身長増加剤をスクリーニングすることができる。

本発明はさらにGC-Bを活性化することによりFGFR3異常を有しない軟骨性骨を伸長させる方法を提供する。本発明の実施態様においては、GC-Bを活性化することによりin vivo、ex vivoあるいはin vitroにて軟骨性骨の伸長を促進することができる。本発明の実施態様においては好ましくは培養骨、培養軟骨の培養時においてGC-Bを活性化する物質を添加することによりFGFR3異常を有しない軟骨性骨の伸長を促進する方法を含む。

本発明の組成物は、有効成分としての上記定義のGC-B活性化物質を、製薬上許容可能な担体、賦形剤、添加剤などと組み合わせて、経口投与用又は非経口投与用に製剤化される。

本発明の組成物は、上記定義のGC-B活性化物質を有効成分として含み、さらに通常の製剤化の際に用いられる担体や賦形剤、その他の添加剤を用いて調製される。

製剤用の担体や賦形剤としては、例えば、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、オリーブ油、ゴマ油、カカオバター、エチレングリコールなどやその他常用されるものをあげることができる。

経口投与のための固体組成物としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤などが用いられる。このような固体組成物においては、少なくともひとつの有効成分が少なくともひとつの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶性セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合される。組成物は、常法にしたがって不活性な希釈剤以外の添加物、例えば、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、繊維素グリコール酸カルシウムのような崩壊剤、グルタミン酸又はアスパラギン酸のような溶解補助剤を含んでいてもよい。錠剤又は丸剤は、必要によりショ糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートなどの糖衣や胃溶性又は腸溶性物質のフィルムで被覆してもよいし、２つ以上の層で被覆してもよい。さらに、ゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも含まれる。

経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤などを含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水、エタノールなどを含んでいてもよい。この組成物は、不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤などを含んでいてもよい。

非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤が含まれる。水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば、注射用水及び注射用生理食塩液が含まれる。非水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート80（登録商標）などが含まれる。このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えば、乳糖）、溶解補助剤（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）のような補助剤を含んでいてもよい。これらは、例えば、精密ろ過膜によるろ過滅菌、高圧蒸気滅菌のような加熱滅菌、あるいは、殺菌剤の配合などの通常の滅菌方法によって無菌化することが可能である。注射剤は溶液製剤であっても、使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥のための賦形剤としては例えばマンニトール、ブドウ糖などの糖アルコールや糖類を使用することが出来る。

本発明の治療剤又は予防剤は、医薬に一般に使用されている経口投与方法又は非経口投与方法のいずれかによって投与される。好ましくは非経口投与方法、例えば注射による投与（皮下注射、静脈注射、筋肉注射、腹腔内への注射などによる投与）、経皮投与、経粘膜投与(経鼻投与、経直腸投与など)、経肺投与などであるが、経口投与方法による投与も可能である。

本発明の製剤中に含まれる有効成分であるGC-B活性化物質、好ましくは上記定義のCNP又はその誘導体、の量は、治療すべき疾患の種類、疾患の重症度、患者の年齢などに応じて決定できるが、一般に0.005μg/kg〜100mg/kgの範囲で投与することができるが、0.02μg/kg〜5mg/kgで投与することが好ましい。しかしながら本発明のGC-B活性化物質を含有する医薬剤はこれらの投与量に制限されるものではない。

本発明として以下の事項を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
(1) GC-B活性化物質を有効成分として含む、FGFR3異常を有しない個体に投与する身長増加用組成物。
(2)低身長症患者に使用される、上記(1)に記載の組成物。
(3)低身長症患者以外の個体に使用される、上記(1)に記載の組成物。
(4)上記身長増加が軟骨性骨の伸長である、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の組成物。
(5)上記身長増加が大腿骨、脛骨、橈骨及び/又は尺骨の伸長である、上記(1)〜(4)のいずれかに記載の組成物。

(6)上記物質がペプチドである、上記(1)〜(5)のいずれかに記載の組成物。
(7)上記ペプチドがCNP又はその誘導体である、上記(6)に記載の組成物。
(8)上記CNPが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のCNP-22及びCNP-53から選択される、上記(7)に記載の組成物。
(9)上記CNPが配列番号１のCNP-22又は配列番号２のCNP-53である、上記(7)に記載の組成物。

(10)上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつCNP活性を有するものである、上記(7)に記載の組成物。
(11)GC-Bを活性化することによって、FGFR3異常を有しない個体の身長を増加することを特徴とする、身長増加方法。
(12)上記身長増加が軟骨性骨の伸長である、上記(11)に記載の身長増加方法。
(13)上記身長増加が大腿骨、脛骨、橈骨及び/又は尺骨の伸長である、上記(11)又は(12)に記載の身長増加方法。
(14)上記GC-Bが、CNP又はその誘導体によって活性化される、上記(11)〜(13)のいずれかに記載の身長増加方法。
(15)上記CNPが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のCNP-22又はCNP-53である、上記(14)に記載の身長増加方法。
(16)上記CNPが、配列番号１のCNP-22又は配列番号２のCNP-53である、上記(14)に記載の身長増加方法。
(17)上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつCNP活性を有するものである、(14)に記載の身長増加方法。

(18)GC-Bの活性を指標として身長増加剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、身長増加剤のスクリーニング方法。
(19)GC-Bを発現する培養細胞又は関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞のGC-B活性を指標として身長増加剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、(18)に記載のスクリーニング方法。
(20)上記GC-Bの活性が、細胞内ｃGMP産生量として測定される、上記(18)又は(19)に記載のスクリーニング方法。
(21)GC-Bを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を被験物質の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内ｃGMPの産生量を測定し、該被験物質の存在下と非存在化での細胞内ｃGMP産生量の差を指標として身長増加剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、上記(18)〜(20)に記載のスクリーニング方法。
(22) GC-Bを活性化することによりFGFR3異常を有しない軟骨性骨を伸長させる方法。

以下の実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は単に例示を目的としたものであって、本発明を制限するものではない。それゆえ、本発明は、これらの実施例によって制限されないものとする。

＜CNP トランスジェニックマウス作製用ベクターの構築＞
図１Aに示すように、pGEM-T easy vector ( Promega社製)にマウスCNP cDNA (526 bp; FEBS Lett. 276:209-213, 1990)をサブクローニングさせたものをPst Iで切断し、断端を平滑化してマウスCNP cDNAを調製した。pSG Iベクター（Promega社製；図１B）をEco RIで切断し断端を平滑化して、図１CのようにマウスCNP cDNAをligationし、SAP-mCNPベクター（pSG1-CNP）を作製した。

＜CNP トランスジェニックマウスの作製＞
インジェクション用DNAフラグメントは、次のようにして調製した。まずCNP遺伝子を挿入したSAP-mCNPベクター(pSG1-CNP；図1C)を、HindIIIおよびXhoIで処理した後、CNP遺伝子を含む断片(約2.3kb)を切り出した。この断片を、Gel Extraction Kit (QIAGEN)により回収し、３ng/μlになるようにPBS^-で希釈してインジェクション用DNAフラグメント(図2)とした。

DNAフラグメントを注入するマウス前核期卵は、次のようにして回収した。すなわち、まずC57BL/6雌マウス(日本クレア)に5 i.uの妊馬血清性性腺刺激ホルモン（PMSG）を腹腔内投与、さらに48時間後5 i.uのヒト絨毛ゴナドトロピン（hCG）を腹腔内投与することによって、過排卵処理した。この雌マウスを同系統の雄マウスと交配させた。交配の翌朝、プラグを確認したマウスの卵管を潅流してマウス前核期卵を回収した。

インジェクション用DNAフラグメントは、マイクロマニピュレーターを用いて前核期卵へ注入した（ジーンターゲティングの最新技術（羊土社）,190-207, 2000）。DNAフラグメントを660個のC57BL/6J胚へ注入し、翌日、2細胞期に発生していた胚561個を、偽妊娠1日目の受容雌の卵管に片側当たり10個前後（1匹あたり20個前後）を移植した。

分娩予定日に至っても産仔を娩出しなかった受容雌については、帝王切開を施し里親に哺育させた。136例の産仔が得られ、そのうちの5例がCNP遺伝子が導入されたトランスジェニックマウス（以下、Tgmと記載する）であった。以下、最初に得られたマウスをFounderと記載する。

Founderは全て雄マウスで、これら5ラインの内4ラインから、次世代（F1マウス）の産仔が得られた。

＜CNPトランスジェニックマウスの遺伝子型解析＞
遺伝子型解析は下記に示す手順に従ってサザンブロット法によって行った。
３週齢になったマウスの尾（約15mm）を採取してproteinase K処理（55℃、100 rpmで1昼夜振盪）して溶解液を得た。この溶解液を核酸自動分離装置（KURABO NA-1000）にかけてゲノムDNAを調製した。ゲノムDNA15μgをPvu II（200 U）で処理してからフェノール・クロロホルム処理によって制限酵素を除いた後にエタノール沈殿でDNAを回収した。回収されたDNAを25μLのTEに溶解して0.7％アガロースゲル電気泳動（50V定電圧）にかけ、泳動終了後、ゲルを0.25 M HCl溶液で15分間処理してDNAを切断し、水洗してから0.4 M NaOH溶液でナイロンメンブレンに一晩ブロッティングした。その後、メンブレン上のDNAをUVクロスリンク法で固定した。メンブレンをハイブリダイゼーション溶液（50％ホルムアミド、0.5 x Denhardt’s、0.5％ SDS、5x SSPE）で処理（42℃、2時間）してから、CNPのcDNA（約0.5kb）を鋳型としてBcaBEST Labeling Kit（TaKaRa）で調製した³²P標識プローブを加えて42℃で一晩ハイブリダイゼーションした。その後、洗浄溶液（2 x SSC、0.1% SDS）で55℃、20分間処理してからImaging Plate（Fuji Film）に一晩露光し、導入遺伝子のシグナルをBAS2000（Fuji Film）で検出した（図３）。野生型マウス（WT）では3本のシグナル（野生型CNP遺伝子）が検出され、トランスジェニックマウス（Tgm）では野生型CNP遺伝子に加えて、導入遺伝子由来のシグナル（トランスジーン）が２本検出された。

＜CNPトランスジェニックマウスにおけるCNPの発現＞
CNP濃度の測定には、CNP-22 EIA測定キット (PHOENIX PHARMACEUTICALS INC.社製)を用いた。

７週齢の雌雄CNP トランスジェニックマウスおよび雌雄の正常同腹マウス各３例をエーテル麻酔下で後大静脈から全採血して安楽死させた。

導入した遺伝子の高発現が予想される臓器である肝臓を採取し、肝重量0.1ｇに対して、上記測定キットのEIA assay バッファー1 mLを加え氷冷した。ワーリングブレンダー（ヒスコトロン社製）でホモジナイズし、遠心分離（2,000 rpm、5分間）した上清をCNP-22濃度測定サンプルとした。

採取した血液に、1 mgのエチレンジアミン４酢酸・４ナトリウム塩（純正化学社製）と2 トリプシン阻害単位のアプロチニン（Sigma社製）を添加して攪拌して血漿を分離し、CNP-22濃度測定サンプルとした。
測定結果を表１に示した。

CNPトランスジェニックマウスは野生型に対する平均値±標準偏差(mean±SD)の比較では肝臓で約10倍、血漿で約24倍のCNP-22濃度を示しており、いずれも統計学的に有意な差であった。これらの結果より、CNPトランスジェニックマウスにおいて、CNPペプチドが過剰発現されていることが確認された。

＜CNPトランスジェニックマウスにおける成長曲線＞
雌雄のCNPトランスジェニックマウスおよびその正常同腹仔の鼻肛長(naso-anal length, cm)を、2〜9週間にわたり経時的に測定した（図４）。その結果、雌雄ともにCNPトランスジェニックマウスは鼻肛長が正常同腹仔よりも大きく、身長増加が促進されていることが判明した。また、この結果は、血中のCNP濃度を上昇させることで身長増加が促進されることも同時に示すものである。

＜CNPトランスジェニックマウス成長軟骨の組織学的解析＞
成長軟骨の厚さを組織学的に解析する目的で、９週齢のCNPトランスジェニックマウスおよび同腹の正常マウスの雌５例をエーテル麻酔下で後大静脈から全採血して安楽死させ、大腿骨を20％ホルマリンにより１週間固定した。その後20％EDTA-4Na（純正化学社製）水溶液（pH7.4）に浸漬して脱灰した後、大腿骨膝蓋面を正中矢状断して常法に従いパラフィン包埋し、パラフィンブロックを作製した。厚さ４μmの切片をミクロトームを用いて薄切してパラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色した。成長軟骨の厚さは、対物レンズ10倍での１視野を画像解析ソフト（IPAP, 住化テクノサービス社製）に取り込み、同ソフトを用いて視野中の５点について、休止層、増殖層、肥大層の厚さを計測して平均値を算出し、その個体の各層の厚さとした。また、上記３層の合計値をその個体の成長軟骨の厚さとした。これら項目について、正常同腹仔とCNPトランスジェニックマウスの間で平均値および標準偏差を算出し（Microsoft Excel2000, マイクロソフト社製）、対応のないStudent のt検定によって統計学的解析を行った（SAS ver. 6.12, SASインスティチュートジャパン社製）。

CNPトランスジェニックマウス(CNP tgm)においては、正常マウス(野生型)に比して休止層(Resting)、増殖層(Proliferating)、肥大層(Hypertrophy)およびその合計(Total)のすべてについて統計学的に有意に成長軟骨層が厚いことが判明した（図５）。これらの結果から、GC-B活性化物質の1種であるCNPは成長軟骨の各層を厚くすることにより、哺乳動物の身長増加を促進することが判明した。

本発明の、GC-B活性化物質を有効成分として含む組成物は、FGFR3異常を有しない個体における内分泌性低身長症、非内分泌性低身長症及び二次性低身長症などの低身長症を治療することを可能にする。この組成物は、成長ホルモンやインシュリン様成長因子-I (IGF-I)の注射や骨切り術などの整形外科手術と比べて患者の負担、苦痛が少なく、患者のQOLに配慮した優れた治療剤となりうる。本発明の組成物はまた、FGFR3異常を有しない、低身長症患者以外の個体での伸長用途に用いることができる。本発明はまたGC-Bを活性化することによりin vivo、ex vivoあるいはin vitroにてFGFR3異常を有しない軟骨性骨を伸長させることができる。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

配列番号１の説明：6-Cysと22-Cysの間でジスルフィド結合が形成されている。
配列番号２の説明：37-Cysと53-Cysの間でジスルフィド結合が形成されている。
配列番号３の人工配列の説明：CNP-22誘導体(ここで、6-Cysと22-Cysの間でジスルフィド結合が形成される)。
配列番号４の人工配列の説明：CNP-22誘導体(ここで、6-Cysと22-Cysの間でジスルフィド結合が形成される)。
配列番号５の人工配列の説明：CNP-22誘導体(ここで、6-Cysと22-Cysの間でジスルフィド結合が形成される)。
配列番号６の人工配列の説明：CNP-22誘導体(ここで、1-Cysと17-Cysの間でジスルフィド結合が形成される)。
配列番号７の人工配列の説明：CNP-22誘導体(ここで、7-Cysと23-Cysの間でジスルフィド結合が形成される)。
配列番号８の人工配列の説明：CNP-22誘導体(ここで、6-Cysと22-Cysの間でジスルフィド結合が形成される)。
配列番号９の人工配列の説明：CNP-22誘導体(ここで、1-Cysと17-Cysの間でジスルフィド結合が形成される)。
配列番号10の人工配列の説明：CNP-22誘導体（ここで、4-Xaa=Leu, Ile, Val; 5-Xaa=Lys, Leu, Met; 6-Xaa=Leu, Ile, Ala, Val; 11-Xaa=Ser, Ala, Gly, Thr, Asn; 12-Xaa=Met, Ala, Trp, His, Lys, Ser, Gly;14-Xaa=Gly, Lys, Ala, Leu; 15-Xaa=Leu, Met。また、1-Cysと17-Cysの間でジスルフィド結合が形成されている。）。

Claims

グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質であるＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）又はその誘導体を有効成分として含む、かつ、ＦＧＦＲ３異常を有しない個体（但し、低身長症患者を除く）に該有効成分の血中濃度を上昇させるように投与し、それによって該個体の身長を増加させることを特徴とする、但し該誘導体が配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである、ＦＧＦＲ３異常を有しない個体（但し、低身長症患者を除く）の身長増加のための組成物。
前記身長増加が軟骨性骨の伸長である、請求項１に記載の組成物。
前記身長増加が大腿骨、脛骨、橈骨及び／又は尺骨の伸長である、請求項１に記載の組成物。
前記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
前記ＣＮＰが配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
ＦＧＦＲ３異常を有しない個体（但し、低身長症患者を除く）の身長増加のための医薬の製造における、グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質であるＣＮＰ又はその誘導体の使用であって、該ＧＣ−Ｂ活性化物質は、該個体に、該物質の血中濃度を上昇させるように投与し、それによって該個体の身長を増加させるものである、ならびに、該誘導体が配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである、使用。
前記身長増加が軟骨性骨の伸長である、請求項６に記載の使用。
前記身長増加が大腿骨、脛骨、橈骨及び／又は尺骨の伸長である、請求項６に記載の使用。
前記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の使用。
前記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の使用。
ＦＧＦＲ３異常を有しない個体（但し、低身長症患者を除く）の軟骨性骨伸長のための医薬の製造における、グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質であるＣＮＰ又はその誘導体の使用であって、該ＧＣ−Ｂ活性化物質は、該個体に、該物質の血中濃度を上昇させるように投与し、それによって該個体の身長を増加させるものである、ならびに、該誘導体が配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである、使用。