KR20180088459A

KR20180088459A - 골관절염을 치료하기 위한 c-형 나트륨이뇨 펩타이드 변이체의 용도

Info

Publication number: KR20180088459A
Application number: KR1020187019166A
Authority: KR
Inventors: 찰스 에이. 오닐; 토드 엠. 오페니어; 제이슨 케이. 핑크스태프
Original assignee: 바이오마린 파머수티컬 인크.
Priority date: 2015-12-08
Filing date: 2016-12-08
Publication date: 2018-08-03
Also published as: EP3386531B1; US20220160836A1; RU2018124600A3; AU2016365751B2; EP4019038A3; RU2759679C2; ES2901769T3; JP2019505486A; PL3386531T3; WO2017100400A2; US20190247467A1; EP3386531A2; IL259690B; DK3386531T3; WO2017100400A3; CA3007315A1; AU2016365751A1; IL259690A; PT3386531T; CN108697766A

Abstract

본 발명은 골관절염을 치료하고, 골관절염의 하나 이상의 증상을 개선하고, 골관절염 성분을 갖는 장애를 치료하기 위한 C-형 나트륨이뇨 펩타이드(CNP)의 변이체의 용도에 관한 것이다.

Description

골관절염을 치료하기 위한 C-형 나트륨이뇨 펩타이드 변이체의 용도

골관절염(OA)은 관절의 퇴행성 질환이다. 이는 60세 이상 남성의 약 10%와 여성의 18%에 영향을 미치는 가장 흔한 관절 질환이다. 사실, OA는 노화 성인의 고통과 장애의 주요 원인 중 하나이다. 그것은 단일 원인을 가지고 있지는 않지만 오히려 관절 외상, 연령 및 비만을 포함하는 많은 선행 요인의 최종 종점인 복잡한 질병이다. OA 관절의 가장 흔한 병리학적 변화는 관절 연골의 퇴행, 활막의 염증, 연골하 골의 깊이 증가, 골증식체의 발달이다. 현재 OA용 약제 요법은 질환의 염증성 측면을 목표로 하지만, 관절의 근본적인 퇴행 또는 변형된 구조를 목표로 하지 않는다. 이러한 항-염증 치료는 일시적인 통증 완화만을 제공한다. 대조적으로, 관절의 퇴행을 감소시키거나 역전시키는 치료는 환자의 통증 및 이동성에 더 오래 지속되고 호의적인 효과를 갖는 것으로 생각된다. 따라서, OA 환자에서 관절의 퇴행을 감소시키고/감소시키거나 관절의 연골 및 관절 구조를 회복시킬 수 있는 약제가 필요하다.

C-형 나트륨이뇨 펩타이드(CNP)(CNB 전구체 단백질에 대한 GenBank 수탁번호 NP_077720, NPPC)는 중추 신경계, 생식 기관, 뼈 및 혈관의 내피에 의해 가장 현저하게, 광범위하게 발현되는 작은 단일-사슬 펩타이드이다. CNP는 나트륨이뇨 펩타이드 수용체 B(NPR-B)와 나트륨이뇨 펩타이드 수용체 C(NPR-C)의 두 가지 별개의 수용체에 결합한다. NPR-B는 막 결합된 구아닐일 사이클라제 다중-유전자 패밀리의 구성원이고, CNP 결합에 의해 활성화될 때 두 번째 메신저 사이클릭 구아노신 모노포스페이트(cGMP)를 생성한다. 대조적으로, NPR-C에는 임의의 세포내 신호전달 도메인이 없으며, 대신 세포외 공간에서 나트륨이뇨 펩타이드를 제거하는 작용을 한다. 따라서, CNP가 NPR-C에 결합할 때 수용체가 내재화되어 CNP를 리소좀에 전달하여, 그곳에서 분해되어 CNP의 유효 세포외 농도를 낮춘다.

CNP는 초기에 나트륨이뇨 펩타이드 전구체 C(NPPC) 유전자로부터 126-아미노산 프리-프로 폴리펩타이드로서 생산된다. 신호 펩타이드를 제거하면 프로-CNP가 생성되며, 엔도프로테아제 퓨린에 의해 추가로 쪼개지면 생물학적으로 활성인 53-아미노산 펩타이드(CNP-53)를 생성하며, 이는 분비되고 추가로 처리되어, 성숙한 22-아미노산 펩타이드(CNP-22)를 생성한다. CNP-53과 CNP-22는 분포가 상이하며, CNP-53이 주로 조직에서 발견되는 반면, CNP-22는 주로 혈장과 뇌척수액에서 발견된다. 연골에서 우세한 CNP 형태는 현재 알려져 있지 않다. CNP-53과 CNP-22는 모두 유사한 동역학으로 NPR-B에 결합하며, 둘 다 cGMP 생산을 용량-의존적 방식으로 유도한다. cGMP에 의해 매개되는 하류 신호전달은 연골내 골화를 비롯한 다양한 종류의 생물학적 과정에 영향을 미친다. 따라서, 이 경로에 있는 구성요소 중 하나의 상승 또는 저하 수준은 비정상적인 뼈 또는 연골 성장을 초래할 수 있다. 예를 들어, 마우스 모델에서 CNP 또는 NPR-B의 녹아웃으로 인해 동물은 짧아진 긴 뼈 및 척추를 갖는 왜소해진 표현형을 갖는다. 또한, CNP 신호전달을 차단하는 인간 NPR-B의 돌연변이가 왜소증을 유발한다. 대조적으로, 상승된 수준의 CNP를 생산하도록 조작된 마우스는 길어진 긴 뼈와 척추를 나타낸다.

CNP의 치료 가능성은 짧은 반감기에 의해 제한된다. CNP는 두 가지 메커니즘에 의해 제거된다: 1) CNP를 급속히 분해하는, 막-결합 중성 엔도펩티다제의 작용(NEP)을 통해, 및 2) CNP를 그것이 분해되는 리소좀으로 표적화하는 NPR-C 결합을 통해. 이 두 가지 제거 메커니즘은 CNP의 짧은 반감기(~ 2.6분)의 원인이 된다. 인간 혈장에서 전형적으로 발견되는 수준(~ 5 pM)을 초과하여 CNP 농도를 증가시키기 위해서는 치료적 잠재력을 심각하게 제한하는 지속적인 주입이 필요하다. 이 문제를 극복하기 위해, 보다 긴 반감기를 갖는 CNP 변이체가 개발되었다. 연골 성장 촉진에 있어 잠재적인 역할을 감안할 때, CNP 변이체는 OA 환자에게 오래 지속되는 완화를 제공하기 위한 새로운 종류의 치료제를 대표한다.

본 발명은 1차 또는 2차 골관절염 또는 하나 이상의 골관절염-관련 증상(들)을 치료하기 위한 CNP 변이체의 용도에 관한 것이다. CNP 변이체의 투여가 치료되는 동물의 연골, 석회화 연골 또는 연골하 뼈에 대한 손상된 관절의 개선된 운동 범위 및 골관절염-관련 손상의 늦춰짐 또는 감소를 유도할 수 있음이 본 명세서에 개시되어 있다. 다양한 구현예에서, CNP 변이체는 Gly-CNP-37 또는 Pro-Gly-CNP-37이다.

다양한 구현예에서, 본 발명은 CNP 변이체 또는 CNP 변이체를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 1차 또는 2차 골관절염 또는 하나 이상의 골관절염-관련 증상(들)을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 투여는 1차 또는 2차 골관절염 또는 상기 질병의 하나 이상의 증상을 치료한다. CNP 변이체 또는 CNP 변이체를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 연골, 석회화 연골 또는 연골하 뼈의 성장을 증가시키는 방법도 또한 고려된다. 본 발명은 또한 CNP 변이체 또는 CNP 변이체를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 연골, 석회화 연골 또는 연골하 뼈의 골관절염-관련 퇴행을 감속, 예방 또는 억제하는 방법을 고려한다. 또한, 본 발명은 CNP 변이체를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 골관절염에 의해 영향받는 관절의 운동 범위를 증가시키거나 경직을 감소시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 골관절염이 있는 대상체에게 CNP 변이체를 투여하는 단계를 포함하는, 골관절염에 의해 영향받는 관절내 골아세포 성장을 감소시키는 방법을 제공한다.

다양한 구현예에서, CNP 변이체는 하기로 구성된 그룹에서 선택된다:

다양한 구현예에서, 연골, 석회화 연골, 또는 연골하 뼈 성장에 있어서 증가 또는 연골, 석회화 연골 또는 연골하 뼈 퇴행의 늦춰짐이 대상체의 무릎, 어깨, 팔꿈치, 손가락, 손, 손목, 엉덩이, 목, 발목, 척추 및/또는 대상체의 허리에서 관찰된다. 다양한 구현예에서, 연골 손상 또는 성장은 연골세포의 죽음/손실, 프로테오글리칸(PG) 손실, 및 콜라겐 손실 또는 피브릴화에 의해 분석된다.

또한, CNP 변이체를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 골관절염이 있는 대상체에서 관절의 운동 범위를 증가시키는 방법이 제공된다. 다양한 구현예에서, 상기 CNP 변이체는 고관절 굴곡, 고관절 신전, 고관절 외전, 고관절 내전, 슬관절 굴곡, 또는 슬관절 신전에 의해 측정되는 바와 같이, 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75%까지 운동범위를 증가시킨다. CNP 변이체의 투여는 상세한 설명에서 보다 상세히 기술된 바와 같이, 다양한 환자 및 통증 척도에 대해 평가된 바와 같이, 골관절염을 비롯한 관절염의 증상을 개선시키는 것으로 또한 고려된다. 다양한 구현예에서, CNP 변이체는 Gly-CNP-37 또는 Pro-Gly-CNP-37이다.

본 발명의 또 다른 구현예는 CNP 변이체를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서의 골증식체의 성장 또는 형성을 예방, 억제 또는 감속시키는 방법에 관한 것이다. 다양한 구현예에서, 골증식체 형성 또는 성장은 대상체내 골관절염과 관련된다. 골증식체의 형성 또는 성장, 및 그의 형성 또는 성장의 예방 또는 억제는 시간 경과에 따라 및 CNP 변이체 치료 요법의 과정 동안 골증식체 크기의 물리적 측정에 의해 결정될 수 있다. 다양한 구현예에서, CNP 변이체는 Gly-CNP-37 또는 Pro-Gly-CNP-37이다.

본 발명의 또 다른 구현예는 CNP 변이체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 연골하 또는 골단 소주 뼈의 이상 성장을 예방, 억제 또는 감속시키는 방법에 관한 것이다. 일 양태에서 연골하 또는 골단 뼈의 비정상적인 성장은 뼈가 두꺼워짐으로써 나타난다. 또 다른 양태에서, 연골하 또는 골단 소주 뼈의 비정상적인 성장은 골관절염, 골다공증 또는 골경화증과 관련되어 있다. 다양한 구현예에서, CNP 변이체는 Gly-CNP-37 또는 Pro-Gly-CNP-37이다.

본 발명의 또 다른 구현예는 CNP 변이체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물내 활액성 염증(즉, 활막염)을 예방, 억제 또는 감속시키는 방법에 관한 것이다. 일 양태에서, 활액성 염증은 영향을 받는 관절 내로의 단핵 세포 침윤에 의해 적어도 명백해진다. 다른 양태에서, 활액성 염증은 골관절염과 관련된다. 다양한 구현예에서, CNP 변이체는 Gly-CNP-37 또는 Pro-Gly-CNP-37이다.

일 구현예에서, CNP 변이체는 관절내 투여된다. 또한 CNP 변이체는 다른 경로에 의해 투여되는 것으로 고려된다. 예시적인 투여 경로는 피하, 관절내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피부내, 복강내, 근육내, 피부내, 경막내, 국소, 경피 또는 경점막 투여를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

또 다른 구현예에서, CNP 변이체는 관절 외상 또는 상해에 대응하여 투여된다. 추가의 구현예에서, CNP 변이체는 관절 외상 또는 상해후 1개월 내에 투여된다. 또 다른 구현예에서, CNP 변이체는 관절 외상 또는 상해후 1주일 이내에 투여된다. 다른 구현예에서, CNP 변이체는 연골 퇴행이 발생한 후에 투여된다.

다양한 구현예에서, 본 발명은 골관절염이 있는 대상체내 적어도 하나의 연골-관련 바이오마커의 수준에 대한 CNP 변이체의 영향을 평가하는 방법을 제공하며, 이 방법은 CNP 펩타이드 또는 변이체가 투여된 골관절염이 있는 대상체의 생물학적 샘플내 적어도 하나의 연골-관련 바이오마커의 수준을 분석하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, CNP 변이체는 적어도 하나의 연골-관련 바이오마커의 수준을 분석하기 전에 대상체에게 투여된다.

다양한 구현예에서, 본 명세서에서는 CNP 변이체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 골관절염 또는 하나 이상의 골관절염-관련 증상(들) 또는 징후(들)을 치료하는 방법이 고려되며, 상기 대상체는 상승된 수준의 적어도 하나의 연골-관련 바이오마커를 갖는 것으로 확인되었다. 다양한 구현예에서, 적어도 하나의 연골-관련 바이오마커는 CNP, cGMP, II형 콜라겐의 프로펩타이드 및 그의 단편, II형 콜라겐 및 그의 단편, 신데칸-3, 아넥신 VI, 증식성 세포핵 항원(PCNA), I형 프로콜라겐의 프로펩타이드(PINP) 및 그 단편, I형 콜라겐 및 그의 단편, 및 아그레칸 콘드로이틴 설페이트로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

다양한 구현예에서, 본 발명은 CNP 변이체를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 일 구현예에서, 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 조성물은 약 4 내지 약 6의 pH를 갖는 시트르산/시트레이트 완충액 또는 아세트산/아세테이트 완충액을 포함하는 제형으로부터 제조된 동결건조 제형이다.

또한, 제2 약제의 투여단계를 추가로 포함하는 본 명세서에 기술된 치료 방법이 고려된다. 다양한 구현예에서, 제2 약제는 항염증제, NSAID, 코르티코스테로이드 및 히알루론산으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

다양한 구현예에서, 본 방법에 사용된 CNP 변이체는 소수성 산에 부착되거나, 하나 이상의 소수성 산에 부착될 수 있다. 소수성 산의 비-제한적인 예는 직쇄 또는 분지의, 포화 또는 불포화 C₅-C₁₂ 카르복실산(예를 들어, 펜탄산, 헵탄산 등) 및 천연 지방산을 포함한다. 소수성 산은 하나 이상의 아미노산 잔기의 N-말단, C-말단 및/또는 측쇄에 부착될 수 있다. 일 구현예에서, 소수성 산은 N-말단에 접합된다.

또 다른 구현예에서, 본 방법에 사용된 CNP 변이체는 CNP 변이체 및 절단가능한 펩타이드 또는 단백질, 또는 펩타이드 태그를 포함하는 키메라 또는 융합 단백질이다. 예시적인 절단가능한 단백질 또는 펩타이드는 히스티딘(예를 들어, 헥사-His) 태그; TAF12: 인간 전사 인자 TAF12; KSI: 케토스테로이드 이소메라아제; MBP: 말토스-결합 단백질; β-Gal: β-갈락토시다아제; GST: 글루타티온-S-전이효소; Trx: 티오레독신; CBD: 키틴 결합 도메인; BMPM: BMP-2 돌연변이, SUMO, CAT, TrpE, 포도상구균 단백질 A, 연쇄상구균 단백질, 전분-결합 단백질, 엔도글루카나제 A의 셀룰로오스-결합 도메인, 엑소글루카나제 Cex의 셀룰로오스-결합 도메인, 바이오틴-결합 도메인, recA, Flag, c-Myc, 폴리(His), 폴리(Arg), 폴리(Asp), 폴리(Gln), 폴리(Phe), 폴리(Cys), 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 황색 형광 단백질, 시안 형광 단백질, 바이오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 항체 에피토프 및 이들의 단편을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

다양한 구현예에서, CNP 변이체는 단량체 또는 이량체일 수 있다. 관련 구현예에서, 이량체 CNP 변이체의 단량체는 링커를 통해 또는 링커 없이 N-말단에서 N-말단으로, 링커를 통해 또는 링커 없이 N-말단에서 C-말단으로, 또는 링커를 통해 또는 링커 없이 C-말단에서 C-말단으로 부착될 수 있다.

본 명세서에 개시된 임의의 구현예에서, CNP 변이체는 야생형 CNP-22와 실질적으로 동일하거나 더 우수한 생물학적 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, CNP 변이체는 야생형 CNP-22의 활성의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상 보유할 수 있거나, 예를 들어 cGMP의 생성을 자극하기 위한, NPR-B와의 상호작용과 관련하여 CNP-22보다 더 큰 활성을 가질 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, CNP 변이체는 야생형 CNP-22의 활성의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상을 보유할 수 있거나, 연골세포 증식, 연골세포 분화, 미토겐 활성 단백질(MAP) 키나아제/MEK(Raf-1) 키나아제 신호전달 경로의 억제 및 연골내 골화 촉진을 포함하지만, 이에 한정되지 않는, 연골성 뼈 성장 및 연골세포 활성을 조절하는 것과 관련하여, CNP-22보다 더 큰 활성을 가질 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 구현예에서, CNP 변이체는 야생형 CNP-22의 아미노산 6-22 또는 1-22와 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

다양한 구현예에서, CNP 변이체는 연골 표적화를 용이하게 하고, 신장클리어런스를 감소시키며, 및/또는 NEP 저하에 대한 내성을 증가시키기 위해 예를 들어, N-말단 및/또는 C-말단에 접합체(들) 또는 연장체(들)을 선택적으로 가질 수 있다. 상기 접합체(들) 또는 연장체(들)은 예를 들어 폴리Asp, 폴리Glu, 연골-표적화 펩타이드, 시알로단백질, PEG, 탄수화물, 소수성 산, NPPC 또는 비-CNP (폴리) 펩타이드, 또는 이들의 조합으로부터 형성되거나 유도된 분자 또는 서열을 포함할 수 있다.

CNP 변이체는 예를 들어, 헵탄산, 펜탄산 또는 지방산과 같은 소수성 중합체 또는 비-중합체 모이어티에 접합될 수 있다는 것이 또한 고려된다. 소수성 모이어티는 리신, 세린, 시스테인 또는 트레오닌을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 아미노산 잔기의 측쇄에 접합되거나, 또는 CNP 변이체의 N-말단 및/또는 C-말단에 부착될 수 있다.

다양한 구현예에서, 본 방법에 유용한 CNP 변이체는 약 8 내지 약 10.5 또는 약 8.5 내지 약 10의 범위의 pI를 갖는다.

다양한 구현예에서, 본 발명은 CNP 변이체, 임의로 또 다른 생물학적 활성제, 및 임의로 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물의 용도를 제공한다. 다양한 구현예에서, 조성물은 비경구 투여에 적합한 멸균 약학적 조성물이다. 일부 구현예에서, 조성물은 예를 들면, 적어도 약 90% 또는 95%의 순도로, 실질적으로 순수한 CNP 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 (원하는 CNP 변이체 이외에) 다른 인간 단백질, 돼지 단백질 또는 CNP-53 또는 그의 단편과 같은 약 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 0.5% 미만의 오염물을 함유한다. 특정 구현예에서, 멸균 조성물은 본 명세서에 개시된 임의의 CNP-반응성 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위해 대상체에게 투여된다.

본 발명에서 유용한 CNP 변이체는 유리하게는 CNP 활성을 유지하고, 증가된 혈청 반감기를 나타낸다. CNP 활성의 유지는 예를 들어, 원하는 생체내 생물학적 효과의 보유로서, 또는 동일한 농도(예를 들어, 1 μM의 CNP 펩타이드 또는 ED80보다 큰)하에 CNP-22의 cGMP 자극 활성의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 적어도 약 100%의 보유로서 나타날 수 있다. 일부 구현예에서, CNP 변이체는 CNP-22에 비해 혈청 반감기에 있어서 적어도 약 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 35배 또는 40배 증가를 나타낸다.

관련된 구현예에서, 본 명세서에 기술된 CNP 변이체는 증가된 NEP 내성을 가지며, 야생형 CNP-22에 비해 증가된 반감기를 나타낸다. 일 구현예에서, CNP 변이체의 반감기는 야생형 CNP-22와 비교하여 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 약 100% 증가된다.

특정 구현예에서, 본 방법에서 사용하기 위한 본 명세서에 기술된 CNP 변이체는 시험관내에서 cGMP 생산을 증가시키고, 생체내에서 cGMP 생산을 증가시키며, 연골 또는 뼈 형성 또는 성장과 관련된 하나 이상의 바이오마커의 수준을 생체내에서 증가시키고, 시험관내에서 NEP 절단에 대한 내성을 증가시키거나, 생체내에서 혈장 또는 혈청 반감기를 증가시키거나, 생체내에서 생체이용률을 증가시키거나, 생체내에서 연골의 성장 또는 재생을 증가시키거나, 또는 야생형 CNP-22와 비교하여 약 1.5배, 약 2배, 약 2.5배, 약 3배, 약 3.5배, 약 4배, 약 4.5배 또는 약 5배까지 이러한 증가의 조합을 수행한다.

다양한 구현예에서, 본 명세서에 기술된 CNP 변이체는 약 5 또는 10 nmol/kg 내지 약 300 nmol/kg, 또는 약 20 nmol/kg 내지 약 200 nmol/kg 범위의 투여량으로 투여된다. 일부 구현예에서, CNP 변이체는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750 또는 2000 nmol/kg의 투여량 또는 의료진이 적절하다고 판단하는 기타 투여량으로 투여된다. 다른 구현예에서, CNP 변이체는 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750 또는 800 μg/kg, 또는 약 1mg/kg, 약 1.25mg/kg, 1.5mg/kg, 2 mg/kg의 투여량 또는 의료진이 적절하다고 판단하는 기타 투여량으로 투여된다.

다양한 구현예에서, CNP 변이체는 단일 처리 또는 다중 투여량으로 투여된다. 다회 투여량은 매일 투여하거나, 치료 과정 동안 여러 번 투여될 수 있다. 다양한 구현예에서, CNP 변이체는 단일 용량 또는 다중 용량으로, 매일, 격일, 3일마다, 주 2회, 주 3회, 주 1회, 격주 1회, 3주마다, 매월, 6주마다, 2개월마다, 3개월마다 또는 의료진이 적절하다고 판단한 경우 투여되는 것으로 고려된다.

특정 구현예에서, CNP 변이체의 투여는 예방적 또는 치료적 치료 기간 후에 회복 기간을 허용하도록 조정된다. 예를 들어, CNP 변이체는 관절내, 피하, 정맥내 또는 다른 방식으로 일정 기간 동안 매일 또는 일주일에 여러 번 투여될 수 있으며, 그후 일정 기간 처리하지 않고, 그후 사이클이 반복된다. 일부 구현예에서, 치료의 초기 기간(예컨대, CNP 변이체의 투여는 매일 또는 1주일에 여러 번)은 3일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주 또는 12주이다. 관련된 구현예에서, 무처리 기간은 3일, 1주, 2주, 3주 또는 4주간 지속된다. 특정 구현예에서, CNP 변이체의 투여 요법은 3일 동안 매일, 이어서 3일간 중단되고; 또는 1주일 동안 매일 또는 1주일에 여러 번, 이어서 3일 또는 1주일간 중단되고; 또는 2주일 동안 매일 또는 1주일에 여러 번, 이어서 1주 또는 2주간 중단되고; 또는 3주일 동안 매일 또는 1주일에 여러 번, 이어서 1주, 2주 또는 3주간 중단되고; 또는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12주간 매일 또는 1주일에 여러 번, 이어서 1, 2, 3 또는 4주간 중단된다.

추가의 구현예에서, 본 발명은 CNP 변이체를 대상체에게 투여하는 단계 및 상기 대상체에서(예를 들어, 대상체의 생물학적 샘플내) 적어도 하나의 연골-관련 바이오마커의 수준을 모니터링하는 단계를 포함하는, 골관절염 또는 골관절염-관련 증상을 갖는 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 연골-관련 바이오마커의 수준의 증가 또는 감소는 대상체에 대한 CNP 변이체의 치료 효과를 나타낸다. 일부 구현예에서, 연골, 석회화 연골 또는 연골하 뼈 형성 또는 성장과 관련하여 바이오마커의 수준이 증가하는 경우, 상기 바이오마커의 수준의 증가는 대상체에 대한 CNP 변이체의 치료 효과를 나타낸다. 다른 구현예에서, 연골, 석회화 연골 또는 연골하 뼈 형성 또는 성장과 관련하여 바이오마커의 수준이 감소하는 경우, 상기 바이오마커의 수준의 감소는 대상체에 대한 CNP 변이체의 치료 효과를 나타낸다.

추가의 구현예에서, 치료 방법은 CNP 변이체의 투여량(또는 용량) 또는 투여 빈도를 조절하는 단계를 추가로 포함하며:

(i) 적어도 하나의 연골-관련 바이오마커의 수준이 연골 형성 또는 성장과 관련하여 증가하는 목표 수준 이하인 경우, CNP 변이체의 투여량(또는 용량) 또는 빈도가 증가되거나; 또는

(ii) 적어도 하나의 연골-관련 바이오마커의 수준이 연골 형성 또는 성장과 관련하여 증가하는 목표 수준 이상인 경우, CNP 변이체의 투여량(또는 용량) 또는 빈도가 감소되거나; 또는

(iii) 적어도 하나의 연골-관련 바이오마커의 수준이 연골 형성 또는 성장과 관련하여 감소하는 목표 수준 이상인 경우, CNP 변이체의 투여량(또는 용량) 또는 빈도가 증가되거나; 또는

(iv) 적어도 하나의 연골-관련 바이오마커의 수준이 연골 형성 또는 성장과 관련하여 감소하는 목표 수준 이하인 경우, CNP 변이체의 투여량(또는 용량) 또는 빈도가 감소된다.

바이오마커의 목표 수준은 대상체에서의 치료 효과 및/또는 장애 또는 질환의 증상을 경감시키거나 완화시키는 유익한 효과와 관련된 바이오마커의 수준 또는 수준의 범위를 의미하는 것으로 고려된다. 특정 구현예에서, 표적 수준 이상 또는 이하의 바이오마커의 수준은 대상체에게 해로울 수 있다.

다른 구현예에서, 본 발명은 연골, 석회화 연골 또는 연골하 뼈 형성 또는 성장에 대한 CNP 변이체의 투여 효과를 평가하는 방법을 고려한다. 일 구현예에서, 본 방법은 생체내 연골, 석회화 연골 또는 연골하 뼈 형성 또는 성장에 대한 CNP 변이체의 효과를 평가하기 위해 CNP 변이체를 투여한 대상체에서 적어도 하나의 연골-관련 바이오마커의 수준을 분석 또는 측정하는 것을 제공한다. 관련 구현예에서, 적어도 하나의 연골-관련 바이오마커의 수준 증가는 CNP 변이체의 투여가 연골, 석회화 연골 또는 연골하 뼈 형성 또는 성장에 긍정적인 효과를 가지며, 골관절염 및 감소된 CNP 활성과 관련된 다른 연골-관련 질병 또는 장애의 치료에 유용한 치료임을 나타낼 수 있다. 예시적인 연골-관련 바이오마커는 CNP(예를 들어, 내인성 수준의 CNP-22 또는 CNP-53), cGMP, II형 콜라겐의 프로펩타이드 및 그의 단편, II형 콜라겐 및 그의 단편, 신데칸-3, 아넥신 VI, 증식성 세포핵 항원(PCNA), I형 프로콜라겐의 프로펩타이드(PINP) 및 그의 단편, I형 콜라겐 및 그의 단편 및 아그레칸 콘드로이틴 설페이트를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 CNP 변이체가 투여된 대상체의 생물학적 샘플내 연골-관련 바이오마커의 수준을 분석하거나 측정하는 단계를 포함하는, 대상체에서 적어도 하나의 연골-관련 바이오마커의 수준에 대한 CNP 변이체의 효과를 평가하는 방법을 고려한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 연골-관련 바이오마커의 수준을 분석하거나 측정하기 전에 CNP 변이체를 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

연골-관련 바이오마커에 관한 방법(예를 들어, 치료, 진단 및 분석 방법)의 일부 구현예에서, CNP 변이체는 Gly-CNP-37이며, 또한 Gly-CNP-37, 또는 본 명세서에 기술된 CNP 변이체를 포함하는, 본 명세서에 기술된 CNP 펩타이드 및 CNP 변이체 중 하나로 지칭된다. 상기 방법의 특정 구현예에서, CNP 펩타이드 또는 변이체는 CNP-22 또는 CNP-53이 아니다. 특정 구현예에서, CNP 변이체는 Pro-Gly-CNP-37이다.

골관절염 및 골관절염과 관련하여 본 명세서에 기술된 증상 또는 다른 생리적 징후의 치료를 위한 약제의 제조에서 본 명세서에 기술된 상기 CNP 변이체 중 임의의 것을 사용하는 것이 또한 고려된다. 주사기, 예를 들어, 일회용 또는 미리 채워진 주사기, 멸균 밀폐 용기, 예를 들면, 바이알, 병, 용기 및/또는 선택적으로 사용을 위한 적합한 지침서와 함께, 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드 중 임의의 것을 포함하는 키트 또는 패키지가 또한 고려된다.

본 명세서에 기술된 각각의 특징은 본 발명의 양태들 중 임의의 것에 대한 비-한정적이고 예시적인 예이며, 본 명세서에 기술된 임의의 다른 특징들과 조합될 수 있는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들어, "일 구현예", "특정 구현예", "일부 구현예", "추가 구현예", "특정 예시적 구현예" 및/또는 "다른 구현예"와 같은 언어로 특징이 기술되는 경우, 이들 특징 각각은 가능한 모든 조합을 나열하지 않고 본 명세서에 설명된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다. 범위 내에 속하는 값의 예가 개시된 경우, 이러한 예들 중 하나는 범위의 가능한 끝점으로 간주되며, 상기 끝점 사이의 모든 숫자 값은 고려되며, 상한 및 하한 끝점의 임의의 및 모든 조합이 구상된다.

도 1은 낮은(35.5 μg) 또는 높은(110 ㎍) 투여량에서의 Gly-CNP-37 투여가 경골에서 연골 퇴행의 유의한 감소를 나타냈다는 것을 예시한다. * 비히클에 대한 p≤0.05 ANOVA.
도 2는 Gly-CNP-37 처리군에서 깊이 비율(depth ratio)이 개선되었음을 보여준다. * 비히클에 대한 p≤0.05 ANOVA.
도 3은 Gly-CNP-37 처리군에서 임의의 퇴행에 의해 영향을 받는 연골의 폭이 개선되었음을 보여주는 그래프이다. * 비히클에 대한 p≤0.05 ANOVA.
도 4는 Gly-CNP-37 처리된 동물이 상당한 경골 연골 퇴행에서 50% 초과의 개선을 나타냈다는 것을 예시한다.
도 5는 110μg에서의 Gly-CNP-37이 전체 관절 점수(대퇴골을 포함하지 않음)를 유의하게 감소시켰음을 보여준다. * 비히클에 대한 p≤0.05 ANOVA.
도 6은 대퇴골 점수가 계산에 포함될 때 Gly-CNP-37 처리된 동물에 대한 전체 관절 점수를 나타내는 그래프이다.
도 7은 Gly-CNP-37 처리된 및 처리되지 않은 대조군 동물에서의 내측 및 외측 성장판 두께를 나타내는 그래프이다. * 비히클에 대한 p≤0.05 ANOVA.
도 8은 도 7의 데이터를 나타내는 그래프로서, 외측 두께가 내측으로부터 차감되어 그 둘 사이의 차이를 결정한다. * 비히클에 대한 p≤0.05 ANOVA.
도 9는 Gly-CNP-37 처리된 또는 처리되지않은 대조군 래트에서 보행 점수의 진행을 나타낸다. * 비히클에 대한 p≤0.05 ANOVA.
도 10은 도 9의 보행 점수의 곡선 하 면적(AUC)을 나타내는 그래프이다. 모든 값은 비히클에 대한 p≤0.05 ANOVA이다.
도 11은 Pro-Gly-CNP-37 또는 Gly-CNP-37로 처리된 동물에 대한 총 연골 퇴행 폭의 측정치를 나타낸다. * 비히클에 대한 p≤0.05 ANOVA.
도 12는 Pro-Gly-CNP-37 또는 Gly-CNP-37로 처리된 동물에 대한 실질적인 연골 퇴행 폭의 측정치를 나타낸다. † 비히클 SC에 대한 p <0.05 t-테스트.
도 13은 Pro-Gly-CNP-37 또는 Gly-CNP-37로 처리된 동물에 대한 평균 내측 경골 골증식체 점수를 나타낸다. † 비히클 SC에 대한 p <0.05 t-테스트.
도 14는 Pro-Gly-CNP-37 또는 Gly-CNP-37로 처리된 동물에 대한 평균 성장판 두께를 마이크로미터 단위로 나타낸 것이다. * 비히클에 대한 p≤0.05 ANOVA. † 비히클 SC에 대한 p <0.05 t-테스트.
도 15는 Pro-Gly-CNP-37 또는 Gly-CNP-37로 처리된 동물에 대한 평균 전체 관절 점수(대퇴골 차감)를 나타낸다. * 비히클에 대한 p≤0.05 ANOVA. † 비히클 SC에 대한 p <0.05 t-테스트.
도 16은 Pro-Gly-CNP-37 또는 Gly-CNP-37로 처리된 동물에 대한 평균 활막염 점수를 나타낸다.
도 17은 Pro-Gly-CNP-37 또는 Gly-CNP-37로 처리된 동물에 대한 체중의 평균 변화를 나타낸다. * 비히클에 대한 p≤0.05 ANOVA.
도 18은 Pro-Gly-CNP-37 또는 Gly-CNP-37로 처리된 동물에 대한 평균 보행 점수를 나타낸다. 값은 비히클 SC에 대한 p <0.05 t-테스트이다.
도 19는 각 연구 그룹에 대한 관절내 또는 피하 경로를 통한 Pro-Gly-CNP-37의 투여 후 동물에서의 Pro-Gly-CNP-37의 평균 혈장 농도에 대한 시간 경과를 나타낸다. 각 라인마다 해당 스터디 그룹 번호가 해당 데이터 라인 바로 위에 표시된다.
도 20은 말기 골관절염 모델에서 Pro-Gly-CNP-37(관절내("IA") 및 피하("SC") 모두)로 처리된 동물에 대한 평균 전체 경골 연골 퇴행 폭을 나타낸다(처리 투여는 수술 후 21일에 개시하였으며, 데이터는 40일에 수집됨).
도 21은 말기 골관절염 모델에서 Pro-Gly-CNP-37(관절내("IA") 및 피하("SC") 모두)로 처리된 동물에 대한 평균 실질적 경골 연골 퇴행 폭을 나타낸다(처리 투여는 수술 후 21일에 개시하였으며, 데이터는 40일에 수집됨).
도 22는 말기 골관절염 모델에서 Pro-Gly-CNP-37(관절내("IA") 및 피하("SC") 모두)로 처리된 동물에 대한 3개의 구역 각각 및 전체에 대한 평균 경골 연골 퇴행 점수를 나타낸다(처리 투여는 수술 후 21일에 개시함). * p <0.05 K-W 테스트(Dunn's 사후검정) 대 각 IA 또는 SC 비히클(40일) 대조군. † p <0.05 M-W 테스트 대 IA 비히클(40일). ‡ p <0.05 M-W 테스트 대 SC 비히클(40일).
도 23은 말기 골관절염 모델에서 Pro-Gly-CNP-37(관절내("IA") 및 피하("SC") 모두)로 처리된 동물에 대한 3개의 구역 각각에 대한 평균 경골 연골 퇴행 깊이 비율 및 평균을 나타낸다(처리 투여는 수술 후 21일에 개시함). * p <0.05 K-W 테스트(Dunn's 사후검정) 대 각 IA 또는 SC 비히클(40일) 대조군. † p <0.05 M-W 테스트 대 IA 비히클(40일). ‡ p <0.05 M-W 테스트 대 SC 비히클(40일).
도 24는 말기 골관절염 모델에서 Pro-Gly-CNP-37(관절내("IA") 및 피하("SC") 모두)로 처리된 동물에 대한 3개의 구역 각각에 대한 대퇴골 포함 전체 관절 점수 및 평균을 나타낸다(처리 투여는 수술 후 21일에 개시함). † p <0.05 M-W 테스트 대 IA 비히클(40일). ‡ p <0.05 M-W 테스트 대 SC 비히클(40일).
도 25는 말기 골관절염 모델에서 Pro-Gly-CNP-37(관절내("IA") 및 피하("SC") 모두)로 처리된 동물에 대한 3개의 구역 각각에 대한 대퇴골 미포함 전체 관절 점수 및 평균을 나타낸다(처리 투여는 수술 후 21일에 개시함). † p <0.05 M-W 테스트 대 IA 비히클(40일). ‡ p <0.05 M-W 테스트 대 SC 비히클(40일).
도 26은 말기 골관절염 모델에서 Pro-Gly-CNP-37(관절내("IA") 및 피하("SC") 모두)로 처리된 동물에 대한 골증식체 점수를 나타낸다(치료 투여는 수술 후 21일에 개시, 데이터는 40일에 수집됨).
도 27은 말기 골관절염 모델에서 Pro-Gly-CNP-37(관절내("IA") 및 피하("SC") 모두)로 처리된 동물에 대한 체중 변화를 나타낸다(치료 투여는 수술 후 21일에 개시함). * p <0.05 K-W 테스트(Dunn's 사후검정) 대 각 IA 또는 SC 비히클(40일) 대조군. † p <0.05 M-W 테스트 대 IA 비히클(40일).

본 발명은 골관절염, 골관절염의 하나 이상의 증상 및 골관절염-관련 증상 또는 요소를 갖는 다른 장애를 치료하기 위해 CNP 변이체를 사용하는 방법에 관한 것이다.

A. 정의

달리 언급되지 않는 한, 명세서 및 청구범위를 포함하는 본 명세서에서 사용된 하기 용어들은 하기의 정의를 갖는다.

"약" 또는 "대략"이라는 용어는 값이 어떻게 측정되거나 결정되는지에 부분적으로 의존하는, 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대한 허용가능한 오차를 의미한다. 특정 구현예에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 1, 2, 3 또는 4 표준 편차 이내를 의미한다. 특정 구현예에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.05% 이내를 의미한다. "약" 또는 "대략"이라는 용어가 일련의 둘 이상의 숫자 값에서 첫 번째 숫자 값보다 선행할 때마다, "약" 또는 "대략"이라는 용어는 해당 시리즈의 수치 값 각각에 적용된다는 것으로 이해된다.

표준 화학 용어의 정의는 Carey and Sundberg, Advanced Organic Chemistry, 3^rd Edition, Vols. A 및 B(Plenum Press, New York 1992)를 포함하는 참고문헌에서 찾을 수 있다. 본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에서 합성 유기 화학, 질량 분광법, 분취 및 분석 크로마토그래피, 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 약리학의 특정의 통상적인 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., 4^th Edition, 2004); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2^nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^t ^h Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)을 참조한다.

본 명세서에 인용된 모든 공보들, 특허 및 특허 출원은 전술 또는 후술여부와 상관 없이 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.

"폴리펩타이드" 및 "단백질"은 펩타이드 결합 또는 펩타이드 결합 등배전자체를 통해 연결된 아미노산 잔기, 관련 천연 발생 구조 변이체 및 그의 합성 비-천연 발생 유사체로 구성된 중합체를 지칭한다. 합성 폴리펩타이드는 예를 들어 자동화된 폴리펩타이드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 생성물의 최소 길이로 제한되지 않는다.

폴리펩타이드 서열을 나타내기 위해 통상적인 표기법이 본 명세서에서 사용된다: 폴리펩타이드 서열의 좌단(left-hand end)은 아미노-말단이고; 폴리펩타이드 서열의 우단(right-hand end)은 카르복실-말단이다.

"보존적 치환"은 기능적으로, 구조적으로 또는 화학적으로 유사한 천연 또는 비 천연 아미노산에 의해 폴리펩타이드 내의 아미노산을 치환시키는 것을 지칭한다. 일 구현예에서, 하기 기들은 각각 서로 보존적 치환인 천연 아미노산을 함유한다:

(1) 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T);

(2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);

(3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);

(4) 아르기닌(R), 리신(K);

(5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 및

(6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W).

또 다른 구현예에서, 하기 기들은 각각 서로 보존적 치환인 천연 아미노산을 함유한다:

(1) 글리신(G), 알라닌(A);

(2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);

(3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);

(4) 아르기닌(R), 리신(K);

(5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V), 알라닌(A);

(6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 및

(7) 세린(S), 트레오닌(T), 시스테인(C).

추가의 구현예에서, 아미노산은 하기 개시한 바와 같이 분류될 수 있다.

(1) 소수성: Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) 백본 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe, His.

일 구현예에서, 본 방법에 유용한 본 명세서에 기술된 CNP 변이체는 CNP 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 재조합 수단을 통해 생성된다. 이러한 폴리뉴클레오타이드에 의해 발현된 CNP 변이체는 CNP 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 발현에 적합한 조건하에 배양 배지에서 숙주 세포를 성장시키는 단계, 및 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 발현 생성물을 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성될 수 있다. 실제 발현 생성물은 번역 후 가공에 따라 코딩된 단백질 생성물과 약간 다를 수 있다.

"폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드 단위로 구성된 중합체를 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드는 핵산 유사체뿐만 아니라 데옥시리보핵산("DNA") 및 리보핵산("RNA")과 같은 자연 발생 생체고분자(분자 유형과 관련하여, 반드시 생체고분자 서열인 것은 아님)를 포함한다. "cDNA"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 mRNA와 상보적이거나 동일한 DNA를 지칭한다.

"발현 조절 서열"은 거기에 작동가능하게 연결된 뉴클레오타이드 서열의 발현을 조절하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. "작동가능하게 연결된"은 한 부분의 활성(예를 들어, 전사를 조절하는 능력)이 다른 부분(예를 들어, 서열의 전사)에 작용하는 두 부분 간의 기능적 관계를 지칭한다. 발현 조절 서열은 예를 들어 제한없이 프로모터 서열(예를 들어, 유도성 또는 구성적), 3'UTR, 인핸서, 전사 종결인자, 개시 코돈(즉, ATG), 인트론용 스플라이싱 신호 및 정지 코돈을 포함할 수 있다.

"재조합 폴리뉴클레오타이드"는 함께 자연적으로 결합되지 않은 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 증폭 또는 조립된 재조합 폴리뉴클레오타이드는 적합한 벡터에 포함될 수 있으며, 벡터는 적합한 숙주 세포를 형질전환하는 데 사용될 수 있다. 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포는 "재조합 숙주 세포"로 지칭된다. 그다음, 유전자는 재조합 숙주 세포에서 발현되어, 예를 들어 "재조합 폴리펩타이드"를 생산한다. 재조합 폴리뉴클레오타이드는 비-코딩 기능(예를 들어, 프로모터, 복제기점, 리보솜-결합 부위 등)도 또한 제공할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "키메라"는 당 분야에 일반적으로 공지된 기술, 예를 들어 재조합 발현 또는 화학적 가교결합을 사용하여 함께 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 또는 함께 결합된 적어도 2개의 이종 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열(즉, 상이한 공급원으로부터 유래되었거나 또는 천연-발생 서열로서 서로 결합되지 않음)을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일 구현예에서, 이종 서열은 CNP 변이체로부터 절단가능한 단백질 또는 펩타이드를 포함하여, CNP 변이체에 직접 또는 간접적으로 결합된 단백질 또는 펩타이드를 포함할 수 있다. 관련된 구현예에서, CNP 변이체는 본 명세서에 기술된 바와 같은 키메라이다.

특정 구현예에서, 키메라는 절단가능한 담체 단백질 또는 펩타이드 태그를 포함하는 CNP 융합 단백질을 포함한다. "절단가능한 담체 단백질" 또는 "절단가능한 펩타이드 태그"라는 용어는 이종 폴리펩타이드 서열에 링커를 통해 직접적으로 또는 간접적으로 융합될 수 있고, 또는 이종 폴리펩타이드 또는 단백질로부터 절단가능한 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 절단 또는 분리하는 제제를 사용하여 이종 서열로부터 제거가능한, 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 절단가능한 담체 단백질 또는 펩타이드 태그는 융합 단백질 또는 이종 폴리펩타이드의 생성, 정제 및/또는 검출을 향상시킨다. 예시적인 절단가능한 담체 단백질 및 펩타이드 태그는 인간 전사 인자 TAF12(TAF12), 케토스테로이드 이소메라아제(KSI), 말토스-결합 단백질(MBP), β-갈락토시다아제(β-Gal), 글루타티온-S-전이효소(GST), 티오레독신(Trx), 키틴-결합 도메인(CBD), BMP-2 돌연변이(BMPM), SUMO, CAT, TrpE, 포도상구균 단백질 A, 연쇄상구균 단백질, 전분-결합 단백질, 엔도글루카나제의 셀룰로오스-결합 도메인, 엔도글루카나제 Cex의 셀룰로오스-결합 도메인, 바이오틴-결합 도메인, recA, FLAG®, c-Myc, 폴리(His), 폴리(Arg), 폴리(Asp), 폴리(Gln), 폴리(Phe), 폴리(Cys), 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 황색 형광 단백질, 시안 형광 단백질, 바이오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 항체 에피토프 및 이들의 단편을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

"운동 범위"는 관절의 완전한 이동 전위, 전형적으로 그의 굴곡 및/또는 신장 범위를 의미한다. 운동 범위는 일반적으로 각도계를 사용하여 측정되며, 원호 각도로 표시된다. 당업자에게 공지된 임의의 측정 방법을 사용하여 대상체의 관절의 운동 범위를 측정할 수 있다. 관절의 운동 범위를 측정하는 하나의 예시적인 방법은 예를 들어 Norkin, C.C. and White D.J., Measurement of joint motion: a guide to goniometry (F.A. Davis Company, 2^nd ed. Philadelphia)(1995)에 제공되어 있다.

"관절 경직(joint stiffness)"은 관절을 움직이기 어려운 느낌 또는 눈에 띄게 드러나는 관절의 운동 범위의 손실을 의미한다.

"절단제"는 이종 폴리펩타이드 또는 단백질로부터 예를 들어 절단가능한 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 절단 또는 분리하는 데 유용한 제제이다. 절단제는 팔라듐, 시아노겐 브로마이드(CNBr), 포름산, 하이드록실아민, 클로스트리파인, 트롬빈, 키모트립신, 트립신, 트립신-유사 프로테아제, 카르복시펩티다아제, 엔테로키나아제(엔테로펩티다아제), Kex 2 프로테아제, Omp T 프로테아제, 인자 Xa 프로테아제, 서브틸리신, 프로TEV, SUMO 프로테아제, V8 프로테아제, HIV 프로테아제, 라이노바이러스 프로테아제, 퓨리리신 프로테아제, IgA 프로테아제, 인간 페이스 프로테아제, 콜라게나제, Nia 프로테아제, 폴리오바이러스 2Apro 프로테아제, 폴리오바이러스 3C 프로테아제, 게네나제, 퓨린, 엘라스타제, 프로테이나제 K, 펩신, 렌닌(키모신), 미생물 아스파르틱 프로테아제, 파파인, 칼파인, 키모파파인, 피신(피카인), 브로멜라인(브로멜라제), 카테스피신 B, 카스파제, 써모리신, 엔도프로테아제 Arg-C, 엔도프로테아제 Glu-C, 엔도프로테아제 Lys-C, 칼리크라인 및 플라스민을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

둘 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열과 관련하여 "동일" 및 "동일성"이란 용어는 최대 대응을 위해 비교 및 정렬될 때 동일한 또는 특정 비율의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기를 갖는 2개 이상의 서열 또는 서브서열을 지칭한다.

2개의 핵산 또는 폴리펩타이드와 관련하여 "실질적으로 동종인" 또는 "실질적으로 동일한"이란 문구는 일반적으로 전체적으로 정렬될때 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기 동일성을 갖는 2개 이상의 서열 또는 서열들을 나타낸다.

비교를 위한 서열의 전체 정렬은 기본 매개변수(단백질의 경우: 매트릭스 = BLOSUM62, 갭 오픈 = 10, 갭 연장 = 0.5, 출력 포맷 = 쌍, 말단 갭 페널티 = 거짓, 말단 갭 오픈 = 10, 말단 갭 연장 = 0.5; 뉴클레오타이드의 경우, 매트릭스 = DNAfull, 갭 오픈 = 10, 갭 연장 = 0.5, 출력 포맷 = 쌍, 말단 갭 페널티 = 거짓, 말단 갭 연장 = 10, 말단 갭 연장 = 0.5)를 사용하여 EMBOSS Needle 프로그램(예를 들어, 웹 인터페이스를 통해 EMBL-EBI에 의해 구현됨)을 사용하여 진행된다.

2개의 핵산 서열 또는 폴리펩타이드가 실질적으로 상동이거나 동일하다는 추가 징후는 후술하는 바와 같이, 제1 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩타이드가 제2 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩타이드와 면역학적으로 교차 반응한다는 것이다. 따라서, 폴리펩타이드는 전형적으로 제2 폴리펩타이드와 실질적으로 동일하며, 예를 들어 2개의 폴리펩타이드는 보존적 치환에 의해서만 상이하다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 징후는 본 명세서에 기술된 바와 같이 엄격한 조건 하에서 두 분자가 서로 혼성화된다는 것이다.

"실질적으로 순수한" 또는 "단리된"은 대상 종이 존재하는 우세한(즉, 몰 기준으로, 조성물 중 임의의 다른 개별적인 거대분자 종보다 풍부한) 종이며, 실질적으로 정제된 분획은 대상 종이 존재하는 모든 거대분자 종의 적어도 약 50%(몰 기준으로)를 구성하는 조성물임을 의미한다. 다양한 구현예에서, 관심 종은 몰 또는 중량 기준으로 조성물에 존재하는 거대분자 종의 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%를 구성한다. 기존의 검출 방법으로 조성물내 오염물질 거대분자 종을 검출할 수 없는 경우, 대상 종은 "필수 균질성"으로 정제된다. 용매 종류, 소분자들(<500 달톤), 안정화제(예를 들어, BSA) 및 원소 이온 종은 본 정의의 목적상 거대분자 종으로 간주되지 않는다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 실질적으로 순수하거나 단리된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 화합물은 그의 생산에 사용된 거대분자 출발 물질에 관해 실질적으로 순수하거나 단리된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 희석제 및 임의로 다른 생물학적 활성제와 혼합된, 실질적으로 순수하거나 단리된 CNP 변이체를 포함한다.

"야생형"(wt)은 한 종에서 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 서열을 포함하는 천연 형태를 나타내는 용어이다. 야생형 형태는 유전적 돌연변이(들)로 인해 발생하는 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 돌연변이체 형태와 구별된다.

일 구현예에서, 제2 폴리펩타이드의 "유사체" 또는 "변이체" 또는 "유도체"인 제1 폴리펩타이드는 제2 폴리펩타이드와 적어도 약 50%, 60% 또는 70%의 서열 동일성을 갖지만 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드이다. 이러한 유사체, 변이체 또는 유도체는 자연 발생 아미노산 잔기뿐만 아니라 호모아르기닌, 오르니틴, 페니실라민 및 노르발린을 제한없이 포함하는 비-자연 발생 아미노산 잔기로 구성될 수 있다. 이러한 유사체, 변이체 또는 유도체는 또한 하나 또는 다수의 D-아미노산 잔기로 구성될 수 있으며, 또한 2개 이상의 아미노산 또는 펩타이드 모방 잔기 사이의 비-펩타이드 결합과 같은 펩타이드 모방체 또는 펩타이드 결합 등배전자체를 함유할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 제1 폴리펩타이드가 제2 폴리펩타이드의 공지된 절단 산물이 아니거나 제2 폴리펩타이드의 공지된 전구체가 아닌 경우, 심지어 제1 폴리펩타이드가 제2 폴리펩타이드와 100% 서열 동일성을 갖거나 야생형 서열을 갖는 경우에도 제1 폴리펩타이드는 제2 폴리펩타이드의 "유사체", "변이체" 또는 "유도체"이다.

일 구현예에서, 본 명세서에서 사용된 용어 "유래된"은 야생형 또는 자연 발생 폴리펩타이드 또는 펩타이드 서열에 기초하고, 하나 이상의 결실, 첨가 및/또는 천연 아미노산, 비 천연 아미노산 또는 펩타이드 모방체에 의한 치환을 갖는 폴리펩타이드 또는 펩타이드 서열을 지칭한다. 일 구현예에서, 유도체 서열은 야생형 또는 자연 발생 서열과 적어도 약 40%, 50%, 60% 또는 70%, 그러나 100% 미만의 서열 동일성을 공유한다. 또 다른 구현예에서, 유도체는 폴리펩타이드의 단편일 수 있으며, 상기 단편은 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개 아미노산 길이에 걸쳐 야생형 폴리펩타이드와 실질적으로 동일하다(예를 들어, 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일). 또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드에 야생형 폴리펩타이드 상에 존재하지 않는 부분(예를 들어, PEG와 같은 중합체)이 직접 또는 간접적으로 부착된 경우, 심지어 두 폴리펩타이드가 그들의 아미노산 서열에서 100% 동일성을 공유한다 할지라도, 폴리펩타이드는 야생형 폴리펩타이드"로부터 유래"된다.

나트륨이뇨 펩타이드 전구체 C(NPPC) 폴리펩타이드는 단일 사슬 126-아미노산 프리-프로 폴리펩타이드이고, 후술하는 바와 같이, 처리 후 궁극적으로 야생형 CNP-22(wtCNP-22)를 생성한다. NPPC에서 신호 펩타이드를 제거하면, pro-CNP가 생성되고, 엔도프로테아제 퓨린에 의해 추가 절단되면 활성 53-아미노산 펩타이드(CNP-53)가 생성되며, 이는 분비되고 다시 분열되어 성숙한 22-아미노산 펩타이드(CNP, 또는 CNP-22)를 생성한다. 일 구현예에서, "CNP 변이체"는 아미노산 잔기의 동일한 번호에 대해 야생형 NPPC와 적어도 약 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다.

"유효량"이란 용어는 대상체의 건강 상태, 병리학 또는 질병에 대해, 또는 진단 목적으로 원하는 결과를 생성하기에 충분한 투여량을 의미한다. 원하는 결과는 투여량을 받은 대상의 주관적 또는 객관적인 개선을 포함할 수 있다. "치료적 유효량"은 건강에 의도된 유익한 효과를 발생시키는 데 효과적인 제제의 양을 지칭한다. 임의의 특정 환자에 대한 투여량의 특정 투여 수준 및 빈도는 다양할 수 있으며, 사용된 특정 화합물의 활성; 그 화합물의 생체이용률, 대사 안정성, 배설 속도 및 작용 길이; 화합물의 투여 방식 및 시간; 환자의 나이, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이요법; 및 특정 상태의 중증도를 포함하는 다양한 인자에 좌우될 것이라는 것을 이해할 것이다.

"치료"는 예방적 치료 또는 치료적 치료 또는 진단적 치료를 의미한다. 특정 구현예에서, "치료"는 치료, 예방 또는 진단 목적을 위해 화합물 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 지칭한다.

"예방적" 치료는 병리 발생 위험을 줄이기 위해 질병의 증상을 보이지 않거나 질병의 초기 증상만을 나타내는 대상체에게 투여되는 치료이다. 본 발명의 화합물 또는 조성물은 병리가 발현될 가능성을 줄이거나 발병된 경우 병리의 심각성을 최소화하기 위한 예방적 치료로서 제공될 수 있다.

"치료적" 치료는 증상 또는 징후를 감소시키거나 제거하기 위하여 병리적 증상 또는 징후를 나타내는 대상체에게 투여되는 치료이다. 증상 또는 징후는 생화학적, 세포성, 조직학적, 기능적 또는 물리적, 주관적 또는 객관적일 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 치료적 치료로서 또는 진단을 위해 제공될 수 있다.

"진단적"이란 병리적 상태의 존재, 범위 및/또는 성질을 확인하는 것을 의미한다. 진단 방법은 그들의 특이성과 선택성에 있어서 상이하다. 특정 진단 방법이 상태의 최종 진단을 제공하지는 못하지만, 진단을 돕는 긍정적인 지표를 제공한다면 충분하다. 진단적 치료는 대상체의 진단을 돕기 위해 본 발명의 화합물을 투여하는 것이다.

"연골-관련 바이오마커" 또는 "연골-관련 마커"는 성장 인자, 효소, 단백질, 핵산, 또는 예를 들어 연골 회전율, 연골 형성 및/또는 연골 성장과 관련하여 수준이 증가되거나 감소된 기타 검출가능한 생물학적 물질 또는 부분을 지칭한다. 상기 바이오마커는 본 명세서에 기술된 바와 같은 CNP 변이체의 투여 전, 투여 중 및/또는 투여 후 측정될 수 있다. 예시적인 연골-관련 바이오마커는 CNP, cGMP, II형 콜라겐 및 그의 단편의 프로펩타이드, II형 콜라겐 및 그의 단편, I형 콜라겐 및 그의 단편의 프로펩타이드, I형 콜라겐 및 그의 단편, 증식성 세포핵 항원(PCNA), 아그레칸 콘드로이틴 설페이트, 신데칸-3 및 아넥신 VI을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 연골-관련 바이오마커는 조직, 혈액, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 활액 및 소변을 포함 하지만, 이에 한정되지 않는 임의의 적당한 생물학적 샘플에서 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 효능/약력학 생체내 연구를 거친 동물로부터, 및/또는 생체외 연구의 조건화된 배지로부터의 혈액, 혈장 또는 혈청에서 측정된다.

특정 구현예에서, 적어도 하나의 연골-관련 바이오마커의 수준을 측정하고, 대상체에게 투여된 CNP 변이체의 투여량 또는 횟수를 측정된 바이오마커의 수준에 따라 조정할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이오마커의 수준은 "목표 수준 이하" 또는 "목표 수준 이상"이다. 바이오마커의 목표 수준은 CNP 변이체를 투여받은 대상체에서 치료 효과가 관찰되는 바이오마커의 수준 또는 수준 범위이다. 특정 구현예에서, 골관절염이 있는 대상체를 위한 바이오마커의 목표 수준은 정상적인, 영향을 받지 않는 대상체에서 관찰되는 바이오마커의 수준 또는 수준 범위이다. 다양한 구현예에서, 치료 효과를 나타내기 위해, 바이오마커의 목표 수준은 정상 대상체에서 관찰되는 바이오마커의 수준 또는 수준 범위와 균등할 필요는 없지만, 예를 들어 영향을 받지 않는 대상체에서 관찰된 "정상" 수준 또는 바이오마커 수준 범위의 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 이내에 있을 수 있다.

예를 들어, 연골 형성 또는 성장과 관련하여 바이오마커의 수준이 증가하는 경우, 치료 효과를 나타내는 바이오마커의 목표 수준은 CNP 변이체가 투여되지 않은 골관절염 환자의 바이오마커의 수준보다 높을 수 있으며, 선택적으로 그 장애를 앓고 있지 않은 대상체에서의 바이오마커의 "정상" 수준(들) 미만, "정상" 수준(들), 또는 "정상" 수준(들) 초과일 수 있다. 일 구현예에서, 바이오마커의 수준이 목표 수준 미만인 경우, 투여된 CNP 변이체의 투여량 또는 빈도의 증가를 필요로 할 수 있는 부적절한 치료 효과를 나타낸다. 관련된 양태에서, 바이오마커가 목표 수준 이상인 경우, 필요한 것보다 많은 CNP 변이체가 투여되었고, 이는 투여된 CNP 변이체의 투여량 또는 빈도의 감소를 필요로 할 수 있음을 나타낸다.

다른 예로서, 연골 형성 또는 성장과 관련하여 바이오마커의 수준이 감소하는 경우, 치료 효과를 나타내는 바이오마커의 목표 수준은 CNP 변이체를 투여받지 않은 골관절염을 앓고 있는 환자의 바이오마커 수준보다 낮을 수 있으며, 선택적으로 그 질병으로 고통을 받지 않는 대상체에서의 바이오마커의 "정상" 수준(들)보다 높거나, 약 "정상" 수준(들)이거나, 또는 "정상" 수준(들) 미만일 수 있다. 그러한 경우, CNP 변이체 양과 투여 빈도에 대한 상기 조정의 반대가 적용될 수 있다.

"약학적 조성물"은 사람 및 포유동물을 비롯한 대상 동물에서 약학적 용도에 적합한 조성물을 지칭한다. 약학적 조성물은 치료적 유효량의 CNP 변이체, 임의로 또 다른 생물학적 활성제, 및 임의로 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함한다. 일 구현예에서, 약학적 조성물은 활성 성분(들), 및 담체를 구성하는 불활성 성분(들)을 포함하는 조성물뿐만 아니라, 임의의 2개 이상의 성분들의 조합, 복합체화 또는 응집으로부터, 또는 하나 이상의 성분들의 해리로부터, 또는 하나 이상의 성분의 다른 유형의 반응 또는 상호작용으로부터 직접 또는 간접적으로 생성되는 임의의 생성물을 포함한다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 화합물과 약학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 혼합하여 제조된 임의의 조성물을 포함한다.

"약학적으로 허용가능한 담체"는 인산 완충 식염용액, 덱스트로스의 5% 수용액 및 에멀젼(예를 들어, 오일/물 또는 물/오일 에멀젼)과 같은 임의의 표준 약학적 담체, 완충제 등을 의미한다. 부형제의 비-제한적인 예는 보조제, 결합제, 충전제, 희석제, 붕해제, 유화제, 습윤제, 윤활제, 활택제, 감미제, 향미제 및 착색제를 포함한다. 적합한 약학적 담체, 부형제 및 희석제는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed.(Mack Publishing Co., Easton, 1995)에 기술되어 있다. 바람직한 약학적 담체는 활성제의 의도된 투여 방식에 의존한다. 전형적인 투여 방식은 장내(예를 들어, 경구) 또는 비경구(예를 들어, 피하, 근육내, 정맥내 또는 복강 내 주사; 또는 국소, 경피 또는 경점막 투여)를 포함한다.

"약학적으로 허용가능한 염"은 금속염(예를 들어, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등) 및 암모니아 또는 유기 아민의 염을 포함하는 약학적 용도의 화합물로 제형화될 수 있는 염이다.

"약학적으로 허용가능한" 또는 "약리학적으로 허용가능한"은 생물학적으로 또는 다른 방식으로 바람직하지 않지 않은 물질을 의미하며, 즉, 상기 물질은 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발시키지 않거나, 또는 개인의 신체에 또는 체내에 존재하는 임의의 성분과 함께 또는 성분이 함유된 조성물의 성분과 삭제 방식으로 상호작용하지 않으면서, 개인에게 투여될 수 있다.

용어 "단위 투약 형태"는 인간 및 동물 대상체에 대한 단일 투여물로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 소망하는 효과를 발생시키기에 충분한 양으로 계산된 소정량의 개시 화합물을 함유하며, 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제, 담체 또는 비히클과 결합시킬 수 있다. 본 발명의 신규 단위 투약 형태에 대한 명시는 사용된 특정 화합물 및 달성될 효과, 및 숙주에서 각 화합물과 관련된 약동학에 좌우된다.

"생리적 조건"은 동물(예를 들어, 인간)의 신체의 조건을 의미한다. 생리적 조건은 체온 및 생리적 이온 강도, pH 및 효소의 수성 환경을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 인간 및 비-인간 포유동물 및 비-포유동물을 포함하여, 본 명세서에 개시된 조성물이 상기 비-인간 동물 종에 투여되는 경우에 유용하다. 포유동물의 예로는 포유동물 등급의 임의의 구성원: 인간, 비-인간 영장류, 예컨대 침팬지, 및 다른 원숭이 및 원숭이 종; 소, 말, 양, 염소, 돼지와 같은 사육 동물; 토끼, 개, 및 고양이와 같은 가축; 래트, 마우스 및 기니아 피그와 같은 설치류를 비롯한 실험용 동물 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 비-포유동물의 예로는 새와 물고기와 같은 척추동물을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 이 용어는 특정 연령이나 성별을 나타내지 않는다.

"폴리에틸렌 글리콜", "PEG", "폴리에틸렌 옥사이드" 및 "PEO"라는 용어는 달리 명시하지 않는 한 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 아미노기를 통해 번호 n과 관련된 "PEOn" 중합체에 접합된 CNP 변이체는 일반적으로 화학식: CH₃-[-O-CH₂CH₂-]_n-C(=O)-NHR을 가지며, 여기에서 n은 에틸렌 옥사이드 단위수를 나타내고, R은 펩타이드의 나머지를 나타낸다. "PEOn" 중합체는 카르보닐 탄소와 반복 에틸렌 옥사이드 단위 사이에 임의로 알킬렌기, (CH₂)_m(여기에서, m은 1 내지 5의 정수임)을 가질 수 있다. 상기 "PEOn"(예를 들어, PEO12 또는 PEO24) 중합체는 단분산되며, 즉 특정 분자량의 단일 이산 중합체이다. 유사하게, 번호 nK와 관련된 "PEGnK" 중합체에 아미노기를 통해 접합된 CNP 변이체는 일반적으로 화학식: CH₃-[-O-CH₂CH₂-]_p-C(=O)-NHR(여기에서, p는 1 초과의 정수임)을 가진다. "PEGnK" 중합체는 카르보닐 탄소와 반복 에틸렌 옥시드 단위 사이에 알킬렌기, (CH₂)_m(여기에서, m은 1 내지 5의 정수임)를 임의로 가질 수 있다. 그러나, 상기 "PEGnK"(예를 들어, PEG1K, PEG2K, PEG5K 또는 PEG20K) 중합체는 다분산되며, 즉 분자량 분포를 갖는 중합체의 혼합물을 함유하며, 여기서 번호 nK는 킬로 달톤 단위의 중합체 수-평균 분자량(M_n)을 나타낸다. 예를 들어, CNP 변이체에 접합된 "PEG2K"는 약 2 kDa의 중합체 수-평균 분자량을 갖는 다분산 PEG 중합체를 나타낸다.

중합체(예를 들어, PEG)의 질량 범위(예를 들어, kDa 단위)가 주어지는 경우, 범위는 중합체 수-평균 분자량의 범위를 지칭하며, 달리 명시되지 않는 한, 다분산된 혼합물 중의 다중 중합체의 분자량 범위를 지칭하지 않는다.

용어 "할로겐", "할라이드" 또는 "할로"는 불소, 염소, 브롬 및/또는 요오드를 나타낸다.

용어 "알킬"은 선형 또는 분지형 포화 1가 탄화수소 라디칼을 지칭하며, 여기서 알킬은 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 치환기 Q로 임의로 치환될 수 있다. 특정 구현예에서, 알킬은 1 내지 20개(C_1-20), 1 내지 15개(C_1-15), 1 내지 12개(C_1-12), 1 내지 10개(C_1- ₁₀), 또는 1 내지 6개(C_1-6)의 탄소원자를 갖는 선형 포화 1가 탄화수소 라디칼, 또는 3 내지 20개(C_3-20), 3 내지 15개(C_3-15), 3 내지 12개(C_3-12), 3 내지 10개(C_3-10) 또는 3 내지 6개(C_3-6)의 탄소 원자의 분지형 포화 1가 탄화수소 라디칼이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 선형 C_1-6 및 분지형 C_3-6 알킬기는 또한 "저급 알킬"로 지칭된다. 알킬기의 예는 메틸, 에틸, 프로필(n-프로필 및 이소프로필을 포함하는 모든 이성질체 형태를 포함), 부틸(n-부틸, 이소부틸, sec-부틸 및 tert-부틸을 포함하는 모든 이성질체 형태를 포함), 펜틸(모든 이성질체 형태를 포함) 및 헥실(모든 이성질체 형태를 포함)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, C_1-6 알킬은 1 내지 6개의 탄소 원자의 선형 포화 1가 탄화수소 라디칼 또는 3 내지 6개의 탄소 원자의 분지형 포화 1가 탄화수소 라디칼을 지칭한다.

"알콕시"란 용어는 -O-알킬기를 지칭한다. 특정 구현예에서, 알콕시기는 본명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 치환기 Q로 임의로 치환될 수 있다.

"할로알킬"이란 용어는 하나 이상의 할라이드 원자로 치환된 알킬기를 지칭한다. 특정 구현예에서, 할로알킬기는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 할라이드 원자로 치환된다. 특정 구현예에서, 할로알킬기는 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 추가 치환기 Q로 임의로 치환될 수 있다.

용어 "사이클로알킬"은 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 치환기 Q로 임의로 치환될 수 있는 고리형 포화 가교 및/또는 비-가교 1가 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 특정 구현예에서, 사이클로알킬은 3 내지 20개(C_3-20), 3 내지 15개(C_3-15), 3 내지 12개(C_3-12), 3 내지 10개(C_3-10) 또는 3 내지 7개(C_3-7)의 탄소 원자를 갖는다. 사이클로알킬기의 예는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 데칼리닐 및 아다만틸을 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다.

"헤테로사이클릴" 또는 "헤테로사이클릭"이라는 용어는 적어도 하나의 비-방향족 고리 원자를 함유하는 단일고리형 비-방향족 고리 시스템 또는 다중고리형 고리 시스템을 지칭하며, 하나 이상의 비-방향족 고리 원자가 O, S 또는 N으로부터 독립적으로 선택되는 헤테로원자이며, 나머지 비-방향족 고리 원자는 탄소 원자이다. 특정 구현예에서, 헤테로사이클릴 또는 헤테로사이클릭 기는 3 내지 20개, 3 내지 15개, 3 내지 10개, 3 내지 8개, 4 내지 7개 또는 5 내지 6개의 고리 원자를 갖는다. 특정 구현예에서, 헤테로사이클릴은 융합되거나 가교된 고리 시스템을 포함할 수 있는 모노사이클릭, 바이사이클릭, 트리사이클릭 또는 테트라사이클릭 고리 시스템이며, 질소 또는 황 원자는 선택적으로 산화될 수 있고, 질소 원자는 임의로 4급화될 수 있으며, 일부 고리는 부분적으로 또는 완전히 포화되거나 방향족일 수 있다. 헤테로사이클릴은 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자에서 주 구조에 부착되어, 안정한 화합물을 생성시킬 수 있다. 헤테로사이클릭기의 예들은 아크리디닐, 아제피닐, 벤즈이미다졸일, 벤즈인돌일, 벤조이속사졸일, 벤즈이속사지닐, 벤조디옥사닐, 벤조디옥솔릴, 벤조푸라노닐, 벤조푸라닐, 벤조나프토푸라닐, 벤조피라노닐, 벤조피라닐, 벤조테트라하이드로푸라닐, 벤조테트라하이드로티에닐, 벤조티아디아졸일, 벤조티아졸일, 벤조티오페닐, 벤조트리아졸일, 벤조티오피라닐, 벤즈옥사지닐, 벤즈옥사졸일, 벤조티아졸일, β-카르볼리닐, 카르바졸일, 크로마닐, 크로모닐, 신놀리닐, 쿠마리닐, 데카하이드로이소퀴놀리닐, 디벤조푸라닐, 디하이드로벤즈이소티아지닐, 디하이드로벤즈이속사지닐, 디하이드로퓨릴, 디하이드로피라닐, 디옥솔라닐, 디하이드로피라지닐, 디하이드로피리디닐, 디하이드로피라졸일, 디하이드로피리미디닐, 디하이드로피롤릴, 디옥솔라닐, 1,4-디티아닐, 퓨라노닐, 퓨라닐, 이미다졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸일, 이미다조피리디닐, 이미다조티아졸일, 인다졸일, 인돌리닐, 인돌리지닐, 인돌릴, 이소벤조테트라하이드로퓨라닐, 이소벤조테트라하이드로티에닐, 이소벤조티에닐, 이소크로마닐, 이소쿠마리닐, 이소인돌리닐, 이소인돌릴, 이소퀴놀리닐, 이소티아졸리디닐, 이소티아졸일, 이속사졸리디닐, 이속사졸일, 모르폴리닐, 나프티리디닐, 옥타하이드로인돌릴, 옥타하이드로이소인돌릴, 옥사디아졸일, 옥사졸리디노닐, 옥사졸리디닐, 옥사졸로피리디닐, 옥사졸일, 옥시라닐, 페리미디닐, 페난트리디닐, 페나트롤리닐, 페나르사지닐, 페나지닐, 페노티아지닐, 페녹사지닐, 프탈라지닐, 피페라지닐, 피페리디닐, 4-피페리도닐, 프테리디닐, 퓨리닐, 피라지닐, 피라졸리디닐, 피라졸일, 피리다지닐, 피리디닐, 피리도피리디닐, 피리미디닐, 피롤리디닐, 피롤리닐, 피롤릴, 퀴나졸리닐, 퀴놀리닐, 퀴녹살리닐, 퀴누클리디닐, 테트라하이드로푸릴, 테트라하이드로푸라 닐, 테트라하이드로이소퀴놀리닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로티에닐, 테트라졸일, 티아디아졸로피리미디닐, 티아디아졸일, 티아모르폴리닐, 티아졸리디닐, 티아졸일, 티에닐, 트리아지닐, 트리아졸일 및 1,3,5-트리티아닐을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 헤테로사이클릭 기는 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 치환기 Q로 선택적으로 치환될 수 있다.

용어 "아릴"은 적어도 하나의 방향족 탄화수소 고리를 함유하는 모노사이클릭 방향족 기 또는 멀티사이클릭 1가 방향족기를 지칭한다. 특정 구현예에서, 아릴은 6 내지 20개(C_6-20), 6 내지 15개(C_6-15) 또는 6 내지 10개(C_6-10)개의 고리 원자를 갖는다. 아릴기의 예로는 페닐, 나프틸, 플루오레닐, 아줄레닐, 안트릴, 페난트릴, 피레닐, 비페닐 및 터페닐이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 아릴은 또한 고리 중 적어도 하나가 방향족이고 다른 것들이 포화, 부분 불포화 또는 방향족일 수 있는 바이사이클릭 또는 트리사이클릭 탄소 고리를 지칭하며, 예를 들어 디하이드로나프틸, 인데닐, 인다닐, 및 테트라하이드로나프틸(테트라리닐)일 수 있다. 특정 구현예에서, 아릴기는 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 치환기 Q로 선택적으로 치환될 수 있다.

"헤테로아릴"이란 용어는 상기 적어도 하나의 방향족 고리를 함유하는 모노사이클릭 방향족 기 또는 멀티사이클릭 방향족기를 지칭하며, 상기 적어도 하나의 방향족 고리가 O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 함유한다. 헤테로아릴 기의 각 고리는 1개 또는 2개의 O 원자, 1개 또는 2개의 S 원자 및/또는 1 내지 4개의 N 원자를 함유할 수 있으며, 각 고리 내의 헤테로원자의 총수는 4 이하이고, 각 고리는 적어도 하나의 탄소 원자를 함유한다. 헤테로아릴은 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자에서 주 구조에 부착되어 안정한 화합물을 생성시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 헤테로아릴은 5 내지 20개, 5 내지 15개 또는 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는다. 모노사이클릭 헤테로아릴기의 예들은 피롤, 피라졸일, 피라졸리닐, 이미다졸일, 옥사졸일, 이속사졸일, 티아졸일, 티아디아졸일, 이소티아졸일, 푸라닐, 티에닐, 옥사디아졸일, 피리딜, 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐 및 트리아지닐을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 바이사이클릭 헤테로아릴 기의 예들은 인돌릴, 벤조티아졸일, 벤즈옥사졸일, 벤조티에닐, 퀴놀리닐, 테트라하이드로이소퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 벤즈이미다졸일, 벤조피라닐, 인돌리지닐, 벤조푸라닐, 이소벤조푸라닐, 크로모닐, 쿠마리닐, 신놀리닐, 퀴녹살리닐, 인다졸일, 퓨리닐, 피롤로피리디닐, 퓨로피리디닐, 티에노피리디닐, 디하이드로이소인돌일 및 테트라하이드로퀴놀리닐을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 트리사이클릭 헤테로아릴 기의 예는 카르바졸일, 벤즈인돌일, 페난트롤리닐, 아크리디닐, 페난트리디닐 및 크산테닐을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 특정 구현예에서, 헤테로아릴 기는 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 치환기 Q로 임의로 치환될 수 있다.

용어 "임의로 치환된"은 알킬, 알콕시, 할로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴을 포함하는 기가 하나 이상의 치환기 Q(일 구현예에서, 1, 2, 3 또는 4개의 치환기 Q임)로 임의로 치환될 수 있으며, 여기에서, 각 Q는 시아노, 할로, 옥소, 니트로, C_1-6 알킬, C_1-6 알콕시, 할로-C_1-6 알킬, C_3-7 시클로알킬, 헤테로사이클릴, C_6-14 아릴, 헤테로아릴, -C(O)R^e, -C(O)OR^e, -C(O)NR^fR^g, -C(NR^e)NR^fR^g, -OR^e, -OC(O)R^e, -OC(O)OR^e, -OC(O)NR^fR^g, -OC(=NR^e)NR^fR^g, -OS(O)R^e, -OS(O)₂R^e, -OS(O)NR^fR^g, -OS(O)₂NR^fR^g, -NR^fR^g, -NR^eC(O)R^f, -NR^eC(O)OR^f, -NR^eC(O)NR^fR^g, -NR^eC(=NR^h)NR^fR^g, -NR^eS(O)R^f, -NR^eS(O)₂R^f, -NR^eS(O)NR^fR^g, -NR^eS(O)₂NR^fR^g, -SR^e, -S(O)R^e, -S(O)₂R^e, 및 -S(O)₂NR^fR^g로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택되며, 상기 각각의 R^e, R^f, R^g 및 R^h는 독립적으로 수소, C_1-6 알킬, C_3-7 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, C_6-14 아릴 또는 헤테로아릴이고; 또는 R^f 및 R^g는 이들이 부착된 N 원자와 함께 헤테로사이클릴을 형성한다.

B. CNP 변이체

치료제로서의 CNP22의 사용은 혈장 내 짧은 반감기에 의해 제한된다(J. Clin. Endocrinol. Metab., 78: 1428-35(1994)). 인간 혈장에서, CNP22의 농도는 전형적으로 5 피코몰 미만이다. CNP22는 인간에서 NEP와 NPR-C에 의해 순환으로부터 제거되고 분해된다(Growth Hormone & IGF Res., 16: S6-S14). 전신 투여된 CNP22를 사용하는 모든 인간 및 동물 연구에서, 연속 주입은 대상체내 CNP22 농도를 증가시키는 데 사용되었다. 더 긴 반감기 및 적어도 유사한 수준의 작용기를 갖는 CNP 펩타이드는 CNP-기초 치료 전략에 유익할 것이다. CNP 변이체는 또한 관련된 발행된 특허에 개시되어있다: 미국 특허 제8,377,884호; 미국 특허 제8,198,242호; 및 미국 특허 제8,598,121호. 인용된 특허 각각은 그 전체가 참고로 본 명세서에 구체적으로 인용된다.

본 발명은 NEP 및/또는 NPR-C에 대한 감소된 친화도를 갖고, NEP에 의한 절단 및/또는 NPR-C에 의한 제거에 대한 감소된 민감성을 갖지만, 야생형 CNP22와 실질적으로 유사하거나 더 우수한 작용능을 갖는 CNP 변이체를 제공한다. NEP에 의한 절단 및/또는 NPR-C에 의한 제거에 대한 CNP 변이체의 민감성 감소는 변이체의 혈장 또는 혈청 반감기를 증가시켜서, 변이체가 표적 조직 및 부위에 분포할 기회를 증가시키고 원하는 약리학적 효과를 유발한다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 기술된 CNP 변이체는 wtCNP22의 기능의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%를 유지하면서, 또는 wtCNP22보다 적어도 약 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배 또는 5배 더 큰 기능을 가지면서, 시험관내 또는 생체내에서 NEP에 의한 절단 및/또는 NPR-C에 의한 제거에 대한 민감성을 wtCNP22와 비교하여 적어도 약 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배 또는 5배 감소시키고, 생체내에서 혈장 또는 혈청 반감기를 wtCNP22와 비교하여 적어도 약 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배 또는 5배 증가시킨다. CNP 기능성은 예를 들어, 시험관내 또는 생체내 연구에서 연골 형성 또는 성장과 관련된, 예를 들어 하나 이상의 바이오마커(예를 들어, cGMP)의 수준으로 평가될 수 있다. 또한, CNP 기능성 검사는 생체외 또는 생체내 연구 등에서 골관절염 연골 퇴행의 예방을 결정함으로써 평가될 수 있다.

NEP의 천연 기질은 작고, 나트륨이뇨 펩타이드(약 2.2 내지 약 3.2 kDa)는 NEP의 천연 기질 중 가장 크다. X-선 결정학적 분석에 따르면, NEP 활성-부위는 중앙 공동의 깊은 곳에서 묻혀 기질 분자의 크기를 약 3 kDa 이하로 효과적으로 제한한다(Oefner et al., J. Mol. Biol., 296: 341-349(2000)). NPR-B 신호전달 연구에 기초하여, CNP-17(CNP22의 사이클릭 도메인, Cys6-Cys22만 보유) 및 CNP-53(N-말단에서 31개의 아미노산 연장을 갖는 CNP-22)와 같은 CNP-22의 변이체는 여전히 2.2 kDa wtCNP-22와 유사하게 NPR-B에 결합하고 활성화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 CNP22 또는 그의 변이체의 N-말단 및/또는 C-말단에서 천연(예를 들어, 펩타이드) 및/또는 합성(예를 들어, PEG) 중합체에 접합된 CNP 변이체를 포함하며, 증가된 NEP 저항성을 나타내지만 NPR-B 신호전달 수용체에 결합하고 활성화시키는 능력을 보유한다.

일 구현예에서, 본 발명은 하기 식으로 나타내는 CNP 변이체를 포함한다:

(x)-Cys₆-Phe₇-Gly₈-Leu₉-Lys₁₀-Leu₁₁-Asp₁₂-Arg₁₃-Ile₁₄-Gly₁₅-Ser₁₆-Met₁₇-Ser₁₈-Gly₁₉-Leu₂₀-Gly₂₁-Cys₂₂-(z)(SEQ ID NO: 129), 또는

(x)-Gly₁-Leu₂-Ser₃-Lys₄-Gly₅-Cys₆-Phe₇-Gly₈-Leu₉-Lys₁₀-Leu₁₁-Asp₁₂-Arg₁₃-Ile₁₄-Gly₁₅-Ser₁₆-Met₁₇-Ser₁₈-Gly₁₉-Leu₂₀-Gly₂₁-Cys₂₂-(z)(SEQ ID NO: 130),

상기 (x) 및 (z)는 각각 독립적으로 본 명세서에 기술된 바와 같은 천연 중합체(예를 들어, 적어도 하나의 아미노산을 함유하는 펩타이드 서열) 및/또는 합성 중합체(예를 들어, PEG)이고, 따라서 CNP 변이체의 총 질량은 예를 들어, 약 2.6 kDa 또는 2.8 kDa 내지 약 6 또는 7 kDa 범위의 본 명세서에서 일반적으로 기술된 범위를 특징으로 한다. 일 구현예에서, Cys6 내지 Cys22의 잔기는 사이클릭 부분을 형성한다. 일 구현예에서, (x) 및/또는 (z)는 NPPC 또는 비-CNP 폴리펩타이드(예를 들어, ANP, BNP, IgG 등)로부터 유도된 아미노산 확장을 포함하며, 여기서 상기 확장은 1 내지 40개, 1 내지 35개, 1 내지 31개, 5 내지 35개, 5 내지 31개 또는 5 내지 15개의 아미노산을 함유한다. 또 다른 구현예에서, CNP 변이체는 CNP22의 위치들: Gly1, Lys4, Gly5, Cys6, Phe7, Gly8, Leu9, Lys10, Leu11, Ile14, Gly15, Ser16, Met17, Gly19, Leu20, 및 Gly21 중 하나 이상에서 또 다른 천연 아미노산, 비 천연 아미노산, 펩타이드 모방체 및/또는 펩타이드 결합 등배전자체와 하나 이상의 변형 및/또는 치환을 포함한다.

또 다른 구현예에서, NEP 분해에 대한 증가된 저항성을 위해 설계된, 본 명세서에서 일반적으로 기술된 범위, 예를 들어 약 2.6 kDa 또는 2.8 kDa 내지 약 6 또는 7 kDa를 특징으로 하는 총 질량을 갖는 CNP 변이체는 일반적으로 하기 식으로 나타낸다:

(x)-Cys₆-Phe₇-Gly₈-Leu₉-(h)₁₀-Leu₁₁-Asp₁₂-Arg₁₃-Ile₁₄-Gly₁₅-Ser₁₆-Met₁₇-Ser₁₈-Gly₁₉-Leu₂₀-Gly₂₁-Cys₂₂-(z)(SEQ ID NO: 131), 또는

(x)-Gly₁-Leu₂-Ser₃-(b)₄-Gly₅-Cys₆-Phe₇-Gly₈-Leu₉-(h)₁₀-Leu₁₁-Asp₁₂-Arg₁₃-Ile₁₄-Gly₁₅-Ser₁₆-Met₁₇-Ser₁₈-Gly₁₉-Leu₂₀-Gly₂₁-Cys₂₂-(z)(SEQ ID NO: 132),

여기에서:

(x)는 합성 또는 천연 중합체 그룹, 또는 이들의 조합이며, 합성 중합체 그룹의 비-제한적인 예는 PEG(또는 PEO)이며, 천연 중합체 그룹의 비-제한적인 예는 1 내지 35개의 아미노산을 함유하고 NPPC 또는 치환 및/또는 결실을 갖는 그의 변이체, ANP, BNP, 또는 예를 들어 혈청 알부민, IgG, 히스티딘이 풍부한 당 단백질, 피브로넥틴, 피브리노겐, 아연 핑거-함유 폴리펩타이드, 오스테오크린 또는 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2)와 같은 다른 비-CNP (폴리) 펩타이드로부터 유도된 아미노산 서열이며;

(z)는 존재하지 않거나 또는 합성 또는 천연 중합체 그룹, 또는 이들의 조합일 수 있으며, 합성 중합체 그룹의 비-제한적인 예는 PEG이고, 천연 중합체 그룹의 비-제한적인 예는 나트륨이뇨 폴리펩타이드(예를 들어, NPPC, CNP, ANP 또는 BNP) 또는 비-나트륨이뇨 폴리펩타이드(예를 들어, 혈청 알부민 또는 IgG)로부터 유도된 아미노산 서열이며; 및

(b) 및 (h)는 독립적으로 그 위치에서 야생형 Lys일 수 있거나 또는 측쇄 상에 반응성 1차 아민을 갖지 않는 보존적 아미노산 치환 또는 임의의 천연 또는 비 천연 아미노산 또는 펩타이드 모방체로 대체될 수 있으며, Arg, Gly, 6-하이드록시-노르류신, 시트룰린(Cit), Gln, Glu 또는 Ser를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 일 구현예에서, (b)는 Arg이다. 또 다른 구현예에서, 개선된 NEP 저항성을 위해, (b)는 Gly가 아니다.

또 다른 구현예에서, (h)는 Arg가 아니다.

NPPC 또는 그의 변이체로부터 유도된 아미노산 서열의 비-제한적인 예는 하기를 포함한다:

Arg,

Glu-Arg;

Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(SEQ ID NO: 133);

Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(SEQ ID NO: 134);

Gly-Ala-Asn-Pro-Arg(SEQ ID NO: 135);

Gly-Ala-Asn-Gln-Gln(SEQ ID NO: 136);

Gly-Ala-Asn-Ser-Ser(SEQ ID NO: 137);

Gly-Ala-Asn-Arg-Gln(SEQ ID NO: 138);

Gly-Ala-Asn-Arg-Met(SEQ ID NO: 139);

Gly-Ala-Asn-Arg-Thr(SEQ ID NO: 140);

Gly-Ala-Asn-Arg-Ser(SEQ ID NO: 141);

Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala(SEQ ID NO: 142);

Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg(SEQ ID NO: 143);

Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg(SEQ ID NO: 144);

Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(SEQ ID NO: 145);

Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(SEQ ID NO: 146);

Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(SEQ ID NO: 147); 및

Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(SEQ ID NO: 148).

비-CNP 폴리펩타이드, 예컨대 예를 들어 ANP, BNP, 혈청 알부민 및 IgG로부터 유도된 아미노산 서열의 비-제한적인 예는 하기를 포함한다:

Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser(SEQ ID NO: 149);

Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr(SEQ ID NO: 150);

Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO: 151);

Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO: 152);

Lys-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr(SEQ ID NO: 153);

Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His(SEQ ID NO: 154);

Gly-Gln-His-Lys-Asp-Asp-Asn-Pro-Asn-Leu-Pro-Arg(SEQ ID NO: 155);

Gly-Val-Pro-Gln-Val-Ser-Thr-Ser-Thr(SEQ ID NO: 156);

Gly-Glu-Arg-Ala-Phe-Lys-Ala-Trp-Ala-Val-Ala-Arg-Leu-Ser-Gln(SEQ ID NO: 157); 및

Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO: 158).

일 구현예에서, 본 명세서에 기술된 (x) 및/또는 (z) 기를 갖는 임의의 CNP 변이체의 N-말단 (x) 기 및/또는 C-말단 (z) 기는 독립적으로, 존재한다면, 소수의 산성 천연 또는 비 천연 아미노산(예를 들어, Asp 또는 Glu)을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, (x) 및/또는 (z)는 CNP22(pI 8.9)의 pI와 유사한 알칼리성 pI를 유지하기 위해 염기성 천연 또는 비 천연 아미노산(예를 들어, Lys, Arg 또는 His)이 풍부하다. 일 구현예에서, CNP 변이체의 pI는 CNP 변이체가 골관절염 관절의 연골세포를 둘러싼 세포외 기질을 통해 보다 쉽게 확산할 수 있도록 설계된 약 8 내지 약 10.5의 범위이다. 더 좁은 구현예에서, CNP 변이체의 pI는 약 8.5 내지 약 10.5, 또는 약 8.5 내지 약 10, 또는 약 9 내지 약 10이다.

또 다른 구현예에서, (x) 및/또는 (z)는 증가된 수용성을 위해 설계된 극성의 천연 또는 비 천연 아미노산이 풍부하다. 또 다른 구현예에서, (x) 및/또는 (z)는 존재한다면, 소수의 소수성 천연 또는 비 천연 아미노산(예를 들어, Ala, Val, Leu, Ile 또는 Met)을 함유한다.

또 다른 구현예에서, CNP 변이체의 N-말단은 증가된 혈청 반감기를 위해 설계된 적어도 하나의 글리신 잔기에서 종결된다. 관련 구현예에서, 피로글루타민 형성을 방지하기 위해, 글루타민에서 종결될 경우 CNP 변이체의 N-말단은 글리신 잔기에서 종결된다. 일 구현예에서, (x) 기는 N-말단이 적어도 하나의 글리신 잔기에서 종결되는 아미노산 확장을 함유한다. 또 다른 구현예에서, (x) 및/또는 (z)는 프로테아제 퓨린에 의한 절단에 대한 민감성을 감소시키도록 설계된 2개의 인접한 염기성 천연 또는 비 천연 아미노산(예를 들어, Lys-Lys 또는 Arg-Arg)을 함유하지 않는다. 일 구현예에서, (x)는 CNP22의 Gly1에 상응하는 위치 직전에 2개의 인접한 염기성 아미노산을 함유하지 않는다.

또 다른 구현예에서, CNP 변이체의 (x) 기 및/또는 (z) 기는 NPPC로부터 유래된(예를 들어, CNP53으로부터 유래된) 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, (x)는 ANP 또는 BNP의 N-말단 테일로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, (z)는 ANP 또는 BNP의 C-말단 테일로부터 유도된 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 구현예에서, (x) 및/또는 (z)는 예를 들어 IgG, 인간 혈청 알부민(HSA), 히스티딘이 풍부한 당 단백질, 피브로넥틴, 피브리노겐, 아연 핑거-함유 폴리펩타이드, FGF-2, 및 골-표지 단백질(오스테오크린, 오스테오폰틴, 오스테오칼신, 및 시알로단백질 등)과 같은 비-나트륨이뇨 폴리펩타이드로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.

CNP22 또는 그의 변이체가 N-말단 (x) 기 및/또는 C-말단 (z) 기를 가질 수 있는 본 명세서에 기술된 임의의 구현예에서, (x) 및/또는 (z)는 독립적으로 골형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP)의 기능성 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열을 함유할 수 있다. BMP의 기능적 도메인으로부터 유래된 N-말단 및/또는 C-말단 아미노산 확장은 CNP 변이체의 전체 질량을 본 명세서에 일반적으로 기술된 범위, 예를 들어, 약 2.6 kDa 또는 2.8 kDa 내지 약 6 또는 7 kDa의 범위로 특징지어 지도록 증가시킴으로써 NEP 내성을 증가시킬 수 있고 이러한 이유로 상기 CNP 변이체의 혈장 반감기를 증가시킬 수 있다. 또한, 특정 BMP는 뼈 및 연골의 형성을 유도하는 성장 인자 및 사이토카인이기 때문에, BMP의 기능성 도메인으로부터 유래된 단편은 CNP22 또는 그 변이체의 사이클릭 도메인에 의한 NPR-B의 구아닐릴 시클라제 기능의 활성화와 구별되는 메커니즘에 의해 연골세포, 연골 또는 뼈의 성장을 촉진할 수 있다. 뼈 형성 및 발달, 연골 형성 및 발달 및/또는 골아세포 분화를 촉진시키는 BMP의 비-제한적인 예는 BMP1, BMP2, BMP3, BMP5, BMP7 및 BMP8a를 포함한다. 일 구현예에서, CNP22 또는 그의 변이체의 N-말단 및/또는 C-말단은 BMP1, BMP2, BMP3, BMP5, BMP7 또는 BMP8a의 C-말단 부분의 마지막 140개의 아미노산으로부터 유래된 아미노산 서열에 독립적으로 접합된다.

일 구현예에서, CNP 변이체는 하기를 포함하지만 이에 한정되지 않는, CNP22 또는 CNP17의 N-말단 및/또는 C-말단에 아미노산 확장을 함유한다:

DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-53)(SEQ ID NO: 6);

QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37, 유사체 BL)(SEQ ID NO: 22);

AAWARLLQEHPNAGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(유사체 CA)(SEQ ID NO: 68);

AAWARLLQEHPNARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(유사체 CB)(SEQ ID NO: 69);

DLRVDTKSRAAWARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(유사체 CC)(SEQ ID NO: 70);

RGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO: 71);

ERGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO: 72);

GANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO: 73);

GANRRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO: 74);

GANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO: 75);

GANSSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO: 76);

GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO: 48); 및

SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH(유사체 CD)(BNP로부터 유래된 N-말단 및 C-말단 테일을 갖는 CNP17)(SEQ ID NO: 77).

또 다른 구현예에서, CNP 변이체는 CNP22의 4 번 위치에서 K4R 치환체를 갖는다. CNP(K4R) 변이체의 비-제한적인 예는 다음을 포함한다 :

GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(유사체 AY)(SEQ ID NO: 52);

GANPRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(유사체 CI)(SEQ ID NO: 78);

RGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(유사체 AZ)(SEQ ID NO: 79);

ERGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(유사체 BA)(SEQ ID NO: 80);

GANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(유사체 CH)(SEQ ID NO: 81); 및

GANSSGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(유사체 CG)(SEQ ID NO: 82)

또 다른 구현예에서, CNP 변이체는 CNP22, 또는 아미노산 첨가(들), 결실(들) 및/또는 치환(들)을 갖는 그의 변이체, 및 폴리펩타이드 또는 CNP 이외의 단백질로부터 유래된 펩타이드 단편 또는 전체 비-CNP 폴리펩타이드 또는 단백질을 CNP 펩타이드의 N-말단에 포함하는 키메라이며, CNP22 또는 그의 변이체는 선택적으로 하나 이상의 아미노산 잔기의 N-말단 아미노산 확장을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, CNP 키메라는 하나 이상의 아미노산 잔기의 N-말단 아미노산 확장을 갖는 CNP22 또는 그의 변이체를 포함한다. 특정 구현예에서, CNP 키메라는 CNP22 또는 그의 변이체의 첫번째 위치(CNP22의 경우 Gly) 바로 앞의 리신-리신(KK) 잔기 또는 GANKK 잔기를 함유한다. 다른 구현예에서, CNP 키메라는 CNP22 또는 그의 변이체의 첫번째 위치 바로 앞의 리신-리신과 상이한 1 또는 2개의 잔기를 함유한다. CNP22 또는 그의 변이체의 첫번째 위치 바로 앞에 올 수 있는 잔기의 비-제한적인 예는 KP, PK, PR, PQ, QK, QQ, RR, SS, GANKP, GANPK, GANPR, GANPQ, GANQK, GANQQ, GANRR, 및 GANSS를 포함한다.

또 다른 구현예에서, CNP 변이체는 CNP22 및 N-말단 펩타이드 단편을 포함하는 키메라이며, 하기를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다:

GHHSHEQHPHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(유사체 CQ)(히스티딘-풍부 당 단백질(HRGP) 단편-CNP22 키메라)(SEQ ID NO: 83);

GAHHPHEHDTHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(유사체 CR)(HRGP 단편-CNP22 키메라)(SEQ ID NO: 84);

GHHSHEQHPHGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(유사체 CX)(HRGP 단편-CNP22 키메라)(SEQ ID NO: 85);

GQPREPQVYTLPPSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(유사체 CF)(IgG₁(Fc) 단편-CNP22 키메라)(SEQ ID NO: 86);

GQHKDDNPNLPRGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(유사체 CY)(인간 혈청 알부민(HSA) 단편-CNP22 키메라)(SEQ ID NO: 87);

GERAFKAWAVARLSQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(유사체 CE)(HSA 단편-CNP22 키메라)(SEQ ID NO: 88);

FGIPMDRIGRNPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(유사체 CZ)(오스테오크린 "NPR C 억제제" 단편-CNP22 키메라)(SEQ ID NO: 89); 및

GKRTGQYKLGSKTGPGPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(유사체 DA)(FGF2 "헤파린-결합 도메인" 단편-CNP22 키메라)(SEQ ID NO: 90).

또 다른 구현예에서, CNP 변이체는 N-말단 펩타이드 단편 및 CNP22의 Lys4에 대해 아르기닌이 치환된 CNP22("CNP22(K4R)")를 포함하는 키메라이며, 하기를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다:

GQPREPQVYTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(유사체 CK)(IgG₁(Fc) 단편-CNP22(K4R) 키메라)(SEQ ID NO: 91);

GVPQVSTSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(유사체 CL)(HSA 단편-CNP22(K4R) 키메라)(SEQ ID NO: 92);

GQPSSSSQSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(유사체 CM)(피브로넥틴 단편-CNP22(K4R) 키메라)(SEQ ID NO: 93);

GQTHSSGTQSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(유사체 CN)(피브리노겐 단편-CNP22(K4R) 키메라)(SEQ ID NO: 94);

GSTGQWHSESGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(유사체 CO)(피브리노겐 단편-CNP22(K4R) 키메라)(SEQ ID NO: 95); 및

GSSSSSSSSSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(유사체 CP)(아연-핑거 단편-CNP22(K4R) 키메라)(SEQ ID NO: 96).

IgG 및 CNP22 또는 그의 변이체를 포함하는 키메라는 특히 NEP 분해에 대한 증가된 내성 및 혈청 알부민에 대한 감소된 결합을 위해 설계된다. HSA의 표면 단편을 포함하는 CNP 키메라는 특히 감소된 면역원성 및 혈청 알부민에 대한 감소된 결합을 위해 설계된다. N-말단에 양이온 성, 히스티딘이 풍부한, 비-리신, 비-아르기닌 서열을 포함하는, HRGP-CNP22 및 HRGP-CNP22(K4R) 키메라는 특히 프로테아제에 대한 증가된 안정성을 위해 설계된다. 오스테오크린 단편을 함유하는 키메라는 단편이 간극 수용체인 NPR-C를 억제하는 뼈 성장판에서의 프로테아제(예를 들어, 퓨린) 절단시에 오스테오크린 단편을 방출하도록 설계된다. FGF2 헤파린-결합 단편을 포함하는 키메라와 관련하여, 단편에 결합하는 헤파린은 키메라를 분해로부터 보호하여 보다 긴 혈청 반감기를 제공하도록 설계된다. 피브로넥틴, 피브리노겐 또는 아연-핑거 단편을 함유하는 키메라는 다른 특징들 중에서 혈청 알부민에 대한 감소된 결합을 위해 설계된다.

이론에 결부시키려는 의도는 아니지만, NEP 분해에 대한 증가된 내성을 갖고 wtCNP22와 비교할때 유사하거나 개선된 작용성(예를 들어, NPR-B와의 결합 및 cGMP 신호전달의 자극)을 갖는 약 2.6 또는 2.8 kDa 내지 약 6 또는 7 kDa의 분자량의 CNP 변이체는 혈청 알부민과 같은 혈장 단백질에 단단히 결합하지 않으면, 보다 효과적일 수 있다. 혈장 단백질(예를 들어, 혈청 알부민)에 단단히 결합하지 않는 CNP 변이체는 연골을 통한 확산, 골관절염 관절 연골세포로의 유도, cGMP 신호전달에 대한 NPR-B 결합 및 활성화에 보다 효과적일 수 있다. 일 구현예에서, 혈장 단백질(예를 들어, 혈청 알부민)에 대한 감소된 결합을 위해 설계된 CNP 변이체는 CNP22 또는 그의 변이체 및 IgG로부터의 펩타이드 단편을 포함하는 키메라이다. 또 다른 구현예에서, 혈장 단백질에 대한 감소된 결합을 위해 설계된 CNP 변이체는 CNP22 또는 CNP22(K4R), 및 폴리펩타이드(예를 들어, IgG, HSA, 피브로넥틴, 피브리노겐, 아연 핑거-함유 폴리펩타이드 등)로부터의 단편을 포함하는 키메라이다. 또 다른 구현예에서, 혈장 단백질에 대한 감소된 결합을 위해 설계된 CNP 변이체는 친수성 또는 수용성 중합체에 접합된 CNP22 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 친수성 또는 수용성 중합체는 PEG(또는 PEO)이다. 또 다른 구현예에서, 친수성 또는 수용성 중합체(예를 들어, PEG)는 생리적 조건 하에 중합체에 음전하를 부여하는 하나 이상의 작용기, 예컨대, 예를 들어 카르복실, 설페이트 또는 포스페이트 기 또는 그의 조합으로 작용화된다.

추가의 구현예에서, 본 발명의 CNP 변이체는 인간 CNP-17(hCNP-17)에서 인간 CNP-53(hCNP-53)까지의 절단된 CNP 펩타이드를 포함하고, hCNP-53로부터 유래된 야생형 아미노산 서열을 갖는다. 상기 절단된 CNP 펩타이드는 하기를 포함한다:

DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-53)(SEQ ID NO: 6);

LRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-52)(SEQ ID NO: 7);

RVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-51)(SEQ ID NO: 8);

VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-50)(SEQ ID NO: 9);

DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-49)(SEQ ID NO: 10);

TKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-48)(SEQ ID NO: 11);

KSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-47)(SEQ ID NO: 12);

SRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-46)(SEQ ID NO: 13);

RAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-45)(SEQ ID NO: 14);

AAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-44)(SEQ ID NO: 15);

AWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-43)(SEQ ID NO: 16);

WARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-42)(SEQ ID NO: 17);

ARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-41)(SEQ ID NO: 18);

RLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-40) (SEQ ID NO: 19) ;

LLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-39)(SEQ ID NO: 20);

LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO: 21);

QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO: 22);

EHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-36)(SEQ ID NO: 23);

HPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-35)(SEQ ID NO: 24);

PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(SEQ ID NO: 25);

NARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-33)(SEQ ID NO: 26);

ARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-32)(SEQ ID NO: 27);

RKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-31)(SEQ ID NO: 28);

KYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-30)(SEQ ID NO: 29);

YKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-29)(SEQ ID NO: 30);

KGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-28)(SEQ ID NO: 31);

GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-27)(SEQ ID NO: 32);

ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-26)(SEQ ID NO: 33);

NKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-25)(SEQ ID NO: 34);

KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-24)(SEQ ID NO: 35);

KGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-23)(SEQ ID NO: 36);

GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-22)(SEQ ID NO: 37);

LSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-21)(SEQ ID NO: 38);

SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-20)(SEQ ID NO: 39);

KGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-19)(SEQ ID NO: 40);

GCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-18)(SEQ ID NO: 41); 및

CFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-17)(SEQ ID NO: 42).

특정 구현예에서, CNP 변이체는 CNP-17, CNP-22 또는 CNP-53을 포함하지 않는다.

또 다른 구현예에서, hCNP-17에서 hCNP-53까지 범위의 절단된 CNP 펩타이드는 특정 절단된 CNP 펩타이드의 임의의 하나 이상의 아미노산 위치에 본 명세서에 기술된 바와 같이, 천연 또는 비 천연 아미노산(들) 또는 펩타이드 모방체(들)(예를 들어, 펩타이드 결합 등배전자체(들))에 의한 아미노산 첨가(들), 결실(들) 및/또는 치환(들)을 함유할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 야생형 서열 또는 아미노산 첨가(들), 결실(들) 및/또는 치환(들)을 갖는 절단된 CNP 펩타이드는 활막- 또는 연골-표적화 모이어티(예를 들어, 비스포스포네이트, 뼈- 또는 연골-표적화 펩타이드 서열(예를 들어, 폴리Asp, 폴리Glu), 뼈 단백질(예를 들어, 오스테오폰신, 오스테오칼신, 시알로단백질)의 뼈-표적화 도메인으로부터 유래된 펩타이드 서열), 뼈 형성 단백질(예를 들어, BMP2, BMP3, BMP5, BMP7, BMP8a)의 기능적 도메인으로부터 유래된 펩타이드 서열, 나트륨이뇨 폴리펩타이드(예를 들어, NPPC, ANP, BNP)로부터 유래된 펩타이드 서열, 비-나트륨이뇨 기원의 폴리펩타이드(예를 들어, 혈청 알부민, IgG, 히스티딘이 풍부한 당 단백질, 피브로넥틴, 피브리노겐, 아연 핑거-함유 폴리펩타이드, FGF-2, 오스테오크린)로부터 유래된 펩타이드 서열, 신장클리어런스를 감소시키는 모이어티(예를 들어, 음하전된 PEG 모이어티), 친수성 중합체(예를 들어, PEG), 탄수화물(골관절염 관절내 세포의 표면 상에서 수용체에 의해 인식되는 탄수화물), 소수성 산(예를 들어, C₅-C₁₂ 카르복실산, 천연 지방산), 인지질, 및 이들의 조합들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 본 명세서에 기술된 모이어티 중 어느 하나에 대한 N-말단, C-말단 및/또는 내부에 접합될 수 있다. 일 구현예에서, 야생형 서열 또는 N-말단, C-말단 및/또는 내부에 하나 이상의 모이어티에 선택적으로 접합된 아미노산 첨가(들), 결실(들) 및/또는 치환(들)을 갖는, 절단된 CNP 펩타이드는 본 명세서에서 일반적으로 기술된 범위, 예를 들어, 약 2.6 kDa 또는 2.8 kDa 내지 약 6 또는 7 kDa를 특징으로 하는 총 질량을 갖는다.

또 다른 구현예에서, CNP 변이체는 QEHPNARKYKGANKK-CNP22(SEQ ID NO: 22)인 CNP37의 유도체이다. CNP37 변이체는 CNP37의 37개 위치 중 하나 이상에서 천연 또는 비 천연 아미노산(들) 또는 펩타이드 모방체(들)(예를 들어, 펩타이드 결합 등배전자체)에 의한 아미노산 첨가(들), 결실(들) 및/또는 치환(들)을 함유할 수 있다. CNP22의 넘버링에 기초하여 CNP37에서 이루어질 수 있는 치환의 비-제한적인 예는 K4R, G5S, GSR, G8S, K10R, G15S, S16Q, M17N, G19R 및 이들의 조합을 포함한다. 일 구현예에서, CNP37 유도체는 메티오닌의 황 원자의 산화를 부분적으로 피하도록 설계된 천연(예를 들어, 아스파라긴) 또는 비 천연 아미노산 또는 펩타이드 모방체에 대한 Met17의 치환을 함유한다. 또 다른 구현예에서, CNP37 변이체는 알부민 결합을 부분적으로 감소시키기 위해 설계된 비-염기성 천연 또는 비 천연 아미노산(들) 또는 펩타이드 모방체에 대한 Lys8, Lys10, Lys14 및/또는 Lys15(CNP37의 N-말단으로부터의 넘버링에 기초함)의 치환(들)을 함유한다.

아미노산 첨가(들), 결실(들) 및/또는 치환(들)에 부가적으로 또는 대안적으로, CNP37 유도체는 뼈- 또는 연골-표적화 모이어티(예를 들어, 뼈-표적화 펩타이드 도메인), 신장클리어런스를 감소시키는 모이어티(예를 들어, 음하전된 PEG 모이어티), 친수성 중합체(예를 들어, PEG), 하나 이상의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열(예를 들어, 오스테오크린 "NPR-C 억제제" 단편), 탄수화물(예를 들어, 뼈 성장판의 세포 표면 상에서 수용체에 의해 인식되는 탄수화물), 소수성 산(예를 들어, C₅-C₁₂ 카르복실산 및 천연 지방산) 및 이들의 조합물을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 본 명세서에 기술된 임의의 모이어티에 대한 N-말단, C-말단 및/또는 내부 부위에 접합될 수 있다.

일 구현예에서, CNP 변이체는 퓨린 프로테아제에 대한 생체내 저항성을 개선시키기 위해 설계된 돌연변이(들)/치환(들)을 퓨린 분열 부위(밑줄표기)에 갖고, 및/또는 플라스마 안정성을 향상시키고 피로글루타민 형성을 방지하기 위해 설계된 글리신(밑줄표기)을 N-말단에 함유하는 변형된 CNP37이다. 상기 CNP37 변이체는 하기를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다:

GQEHPNARKYKGANPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(An. CS)(SEQ ID NO: 97);

GQEHPNARKYKGANQKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(An. CT)(SEQ ID NO: 98);

GQEHPNARKYKGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(An. CU)(SEQ ID NO: 99);

GQEHPNARKYKGANKPGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(An. CW)(SEQ ID NO: 100);

GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP37, An. DB)(SEQ ID NO: 2); 및

PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP37)(SEQ ID NO: 1).

추가의 구현예에서, 본 명세서의 CNP 변이체는 본 명세서에 기술된 융합 단백질 공정에 의해 생성될 수 있는 CNP 펩타이드 및 그의 변이체를 포함한다. 화학적 또는 단백질분해성 절단 또는 단백질 자체-절단을 사용하여 본 명세서에 기술된 융합 단백질 공정에 의해 생성될 수 있는 CNP 변이체의 비-제한적인 예는 하기를 포함한다:

GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-wtCNP53)(SEQ ID NO: 3);

GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-wtCNP37)(SEQ ID NO: 2);

QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(wtCNP37)(SEQ ID NO: 22);

GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(HSA 단편-wtCNP27)(SEQ ID NO: 48);

GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [CNP27(K4,5,9R)](SEQ ID NO: 52);

DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP53(M48N)](SEQ ID NO: 6);

GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP37(M32N)](SEQ IS NO: 46);

QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP37(M32N)](SEQ ID NO: 43);

GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[HSA-CNP27(M22N)](SEQ ID NO: 49);

GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP27(K4,5,9R, M22N)](SEQ ID NO: 53);

PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-wtCNP53)(SEQ ID NO: 4);

PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-wtCNP37)(SEQ ID NO: 1);

PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-wtCNP37)(SEQ ID NO: 44);

PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(wtCNP34)(SEQ ID NO: 25);

P-GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-HSA-wtCNP27)(SEQ ID NO: 50);

PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Pro-CNP27(K4,5,9R)](SEQ ID NO: 54);

MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-wtCNP53)(SEQ ID NO: 5);

MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-Gly-wtCNP37)(SEQ ID NO: 47);

MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-wtCNP37)(SEQ ID NO: 45);

M-GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-HSA-wtCNP27)(SEQ ID NO: 51);

MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Met-CNP27(K4,5,9R)](SEQ ID NO: 55).

hCNP-17에서 hCNP-53까지 범위의 절단된 CNP 펩타이드를 포함하고, 야생형 서열 또는 아미노산 첨가(들), 결실(들) 및/또는 치환(들)을 갖는 다른 CNP 변이체는 또한 융합 단백질의 화학적 또는 단백질분해성 절단의 의도된 부위가 표적 CNP 변이체 자체의 아미노산 서열 내에 존재하지 않는 한, 본 명세서에 기술된 융합 단백질 공정에 의해 생성될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 본 명세서에 기술된 융합 단백질 공정은 포름산 절단을 이용하여 절단된 wtCNP34를 생성하는 데 사용될 수 있다.

추가의 구현예에서, 아스파라긴(Asn/N) 잔기(들) 및/또는 글루타민(Gln/Q) 잔기(들)를 갖는 본 명세서에 기술된 CNP 펩타이드 및 CNP 변이체 중 임의의 것에 대해, 이들이 야생형 서열을 갖든지, 또는 비-천연 아미노산 서열을 갖든지, 임의의 Asn 잔기(들) 및/또는 임의의 Gln 잔기(들)는 Asn 내지 Gln과 같은 보존적 치환을 포함하는 임의의 다른 천연 또는 비 천연 아미노산에 의해 독립적으로 치환될 수 있다. 상기 치환(들)은 아스파라긴 및/또는 글루타민의 잠재적인 탈아미드화를 부분적으로 최소화 또는 회피하도록 설계된다. 임의의 Asn 잔기(들) 및/또는 임의의 Gln 잔기(들)가 Asn 내지 Gln과 같은 보존적 치환을 포함하는 임의의 다른 천연 또는 비 천연 아미노산으로 독립적에 의해 치환될 수 있는 CNP 펩타이드 및 변이체의 비-제한적인 예는 wtCNP34, wtCNP37, Gly-wtCNP37, Pro-wtCNP37, Pro-Gly-wtCNP37, GHKSEVAHRFK-wtCNP27(SEQ ID NO: 48), Pro-GHKSEVAHRFK-wtCNP27(SEQ ID NO: 50) , PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO: 101), 및 PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO: 102)를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 기술된 CNP 펩타이드 및 CNP 변이체의 아스파라긴 잔기는 글루타민, 아스파르트산 또는 글루탐산에 의해 치환되지 않는다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 기술된 CNP 펩타이드 및 CNP 변이체의 글루타민 잔기는 아스파라긴, 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환되지 않는다.

비-제한적인 예로서, 아스파라긴 잔기가 아스파르트산 또는 이소아스파르트산으로 잠재적으로 탈아미드화되는 것을 피하기 위해, Pro-Gly-wtCNP37(PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC)(SEQ ID NO: 1)의 아스파라긴 잔기 7 및/또는 15는 글루타민을 포함한 임의의 다른 천연 또는 비 천연 아미노산에 의해 독립적으로 치환될 수 있다. 특정 구현예에서, Pro-Gly-wtCNP37의 아스파라긴 잔기 7 및/또는 15는 글루타민, 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환되지 않는다.

그러나, 본 발명은 탈아미드화 또는 탈아미드화-유사 반응(예를 들어, 이성질체화)에 민감한 임의의 하나 이상의, 모든 잔기가 탈아미드화 또는 탈아미드화 반응을 통해 어느 정도까지, 전환된 잔기 당 100%까지 다른 잔기(들)로 전환될 수 있는 CNP 변이체를 포함하는 것으로 이해된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 (1) 임의의 하나 이상의, 모든 아스파라긴(Asn/N) 잔기가 탈아미드화를 통해, 전환된 잔기 당 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 전환율까지 아스파르트산 또는 아스파테이트로, 및/또는 이소아스파르트산 또는 이소아스파테이트로 전환될 수 있고; (2) 임의의 하나 이상의, 모든 글루타민(Gln/Q) 잔기가 탈아미드화를 통해, 전환된 잔기 당 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 전환율까지 글루탐산 또는 글루타메이트로, 및/또는 이소글루탐산 또는 이소글루타메이트로 전환될 수 있고; (3) 임의의 하나 이상의, 모든 아스파르트산 또는 아스파테이트(Asp/D) 잔기가 탈아미드화-유사 반응(또한 이성질체화라고도 함)을 통해, 전환된 잔기 당 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 전환율까지 이소아스파르트산 또는 이소아스파테이트로 전환될 수 있고; (4) 임의의 하나 이상의, 모든 글루탐산 또는 글루타메이트(Glu/E) 잔기가 탈아미드화-유사 반응(또한 이성질체화라고도 함)을 통해, 전환된 잔기 당 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 전환율까지 이소글루탐산 또는 이소글루타메이트로 전환될 수 있고; 또는 (5) 상기의 조합인, CNP 변이체를 포함한다.

비-제한적인 예로서, 본 발명은 Pro-Gly-wtCNP37[PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC](SEQ ID NO: 1)의 임의의 하나 이상의, 모든 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산 및/또는 글루탐산 잔기가: 전술한 바와 같이, 탈아미드화 또는 탈아미드화-유사 반응을 통해, 전환된 잔기 당 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 전환율까지 (1) 아스파르트산/아스파테이트 및/또는 이소아스파르트산/이소아스파테이트, (2) 글루탐산/글루타메이트 및/또는 이소글루탐산/이소글루타메이트, (3) 이소아스파르트산/이소아스파테이트, 및/또는 (4) 이소글루탐산/이소글루타메이트로 각각 전환될 수 있는 CNP 변이체를 포함한다.

또 다른 예로서, 본 발명은 Pro-Gly-wtCNP37[PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC](SEQ ID NO: 1)의 임의의 하나 이상의, 모든 아스파라긴 및/또는 아스파르트산 잔기가: 탈아미드화 또는 탈아미드화-유사 반응을 통해, 전환된 잔기 당 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 전환율까지 (1) 아스파르트산/아스파테이트 및/또는 이소아스파르트산/이소아스파테이트, 및/또는 (2) 이소아스파르트산/이소아스파테이트로 각각 전환될 수 있는 CNP 변이체를 포함한다.

또 다른 예로서, 본 발명은 Gly-wtCNP37[GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC](SEQ ID NO: 2)의 임의의 하나 이상의, 모든 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산 및/또는 글루탐산 잔기가: 탈아미드화 또는 탈아미드화-유사 반응을 통해, 전환된 잔기 당 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 전환율까지 (1) 아스파르트산/아스파테이트 및/또는 이소아스파르트산/이소아스파테이트, (2) 글루탐산/글루타메이트 및/또는 이소글루탐산/이소글루타메이트, (3) 이소아스파르트산/이소아스파테이트, 및/또는 (4) 이소글루탐산/이소글루타메이트로 각각 전환될 수 있는 CNP 변이체를 포함한다.

또 다른 예로서, 본 발명은 wtCNP37[QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC](SEQ ID NO: 22)의 임의의 하나 이상의, 모든 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산 및/또는 글루탐산 잔기가: 탈아미드화 또는 탈아미드화-유사 반응을 통해, 전환된 잔기 당 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 전환율까지 (1) 아스파르트산/아스파테이트 및/또는 이소아스파르트산/이소아스파테이트, (2) 글루탐산/글루타메이트 및/또는 이소글루탐산/이소글루타메이트, (3) 이소아스파르트산/이소아스파테이트, 및/또는 (4) 이소글루탐산/이소글루타메이트로 각각 전환될 수 있는 CNP 변이체를 포함한다.

또 다른 예로서, 본 발명은 HSA-wtCNP27 키메라, GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO: 48)의 임의의 하나 이상의, 모든 아스파라긴, 아스파르트산 및/또는 글루탐산 잔기가: 탈아미드화 또는 탈아미드화-유사 반응을 통해, 전환된 잔기 당 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 전환율까지 (1) 아스파르트산/아스파테이트 및/또는 이소아스파르트산/이소아스파테이트, (2) 이소아스파르트산/이소아스파테이트 및/또는 (3) 이소글루탐산/이소글루타메이트로 각각 전환될 수 있는 CNP 변이체를 포함한다.

또 다른 예로서, 본 발명은 Pro-HSA-wtCNP27 키메라, PGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO: 50)의 임의의 하나 이상의, 모든 아스파라긴, 아스파르트산 및/또는 글루탐산 잔기가: 탈아미드화 또는 탈아미드화-유사 반응을 통해, 전환된 잔기 당 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 전환율까지 (1) 아스파르트산/아스파테이트 및/또는 이소아스파르트산/이소아스파테이트, (2) 이소아스파르트산/이소아스파테이트 및/또는 (3) 이소글루탐산/이소글루타메이트로 각각 전환될 수 있는 CNP 변이체를 포함한다.

또한, 본 발명은 임의의 하나 이상의 모든 메티오닌(Met/M) 잔기가 산화된 잔기 당 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 전환율까지 임의의 화학적으로 실현가능한 산화된 형태(예를 들어, 설폭사이드 및/또는 설폰)으로 산화될 수 있는 CNP 변이체를 포함한다.

또 다른 구현예에서, CNP 변이체는 세포막 또는 세포 장벽을 가로 지르는 변이체의 전좌를 촉진시키는 부분(들)에 대하여 N-말단 및/또는 C-말단에 접합된, CNP22 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, CNP 변이체는 활성 펩타이드 수송체를 통한 세포막 또는 세포 장벽을 가로지르는 변이체의 수송을 촉진시키는 펩타이드 서열(들)에 대한 N-말단 및/또는 C-말단에서 접합된다.

추가의 구현예에서, CNP22 또는 그의 변이체의 N-말단 및/또는 C-말단은 화학적 모이어티, 예컨대, 예를 들어 천연 및/또는 합성 중합체에 접합되어, 본 명세서에 일반적으로 기술된 범위, 예를 들어, 약 2.6 또는 2.8 kDa 내지 약 6 또는 7 kDa의 범위로, 변형된 CNP 펩타이드의 총 질량을 증가시킨다. 일 구현예에서, 화학적 모이어티는 생체에 적합한 친수성 또는 수용성 천연(예를 들어, 펩타이드, 탄수화물) 또는 합성(예를 들어, PEG(또는 PEO)) 중합체이다.

특정 구현예에서, CNP22 또는 그의 변이체의 N-말단 및/또는 C-말단은 PEG(또는 PEO) 중합체에 접합되어 본 명세서에 일반적으로 기술된 범위, 예를 들어, 약 2.6 또는 2.8 kDa 내지 약 6 또는 7 kDa의 범위의 총 질량을 생성한다. CNP22 또는 그의 변이체의 페길화는 특히 신장클리어런스를 감소시키고 프로테아제 내성을 증가시킴으로써 면역원성을 감소시키고 반감기를 개선시키기 위해 설계된다. PEG 모이어티는 CNP-17(CNP22의 Cys6-Cys22 고리화 부분), CNP37, 및 N- 및/또는 C-말단 아미노산 확장(들), 아미노산 치환(들) 및/또는 아미노산 결실(들)을 갖는 CNP17, CNP22 또는 CNP37의 변이체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는, CNP22 또는 본 명세서에 기술된 임의의 변이체의 N- 및/또는 C-말단에 부착될 수 있다. 일 구현예에서, CNP17, CNP22 또는 CNP37, 또는 그의 변이체의 Lys4 및/또는 Lys10 잔기는 천연 또는 비 천연 아미노산(예를 들어, Arg, Gly, Ser, Gln, Glu 또는 Cit), 또는 상기 리신 잔기의 임의의 잠재적 페길화를 배제하기 위해, 측쇄 상에 반응성 1차 아민을 함유하지 않는 펩타이드 모방체에 의해 치환된다. 일 구현예에서, CNP 펩타이드의 Lys4 및/또는 Lys10 잔기는 Arg에 의해 치환된다. 다른 구현예에서, Lys10 잔기는 Arg에 의해 치환되지 않는다.

추가의 구현예에서, PEG(또는 PEO) 모이어티 및 N-말단에서의 아미노산 확장을 갖는 CNP 변이체(CNP22 및 그의 변이체 포함)는 CNP22의 Gly1에 상응하는 위치 바로 앞의 위치에 아르기닌을 함유한다. 상기 페길화된 CNP 변이체는 NEP 분해에 대한 증가된 저항성, 혈청 알부민에 대한 감소된 결합 및 향상된 CNP 기능적 활성(예를 들어, cGMP 신호전달의 활성화)을 위해 설계된다. 페길화된 CNP 변이체의 비-제한적인 예는 PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO: 102), PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO: 101), PEO24-GANRR-CNP22(SEQ ID NO: 103), PEO12-GANRR-CNP22(SEQ ID NO: 104), PEO24-GANPR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO: 105), PEO12-GANPR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO: 106), PEO24-GANPR-CNP22(SEQ ID NO: 107), PEO12-GANPR-CNP22(SEQ ID NO: 108), PEO24-GANQQ-CNP22(SEQ ID NO: 109), PEO12-GANQQ-CNP22(SEQ ID NO: 110), PEO24-ER-CNP22(K4R)(SEQ ID NO: 111), PEO12-ER-CNP22(K4R)(SEQ ID NO: 112), PEO24-ER-CNP22(SEQ ID NO: 113), PEO12-ER-CNP22(SEQ ID NO: 114), PEO24-R-CNP22(K4R)(SEQ ID NO: 115), PEO12-R-CNP22(K4R)(SEQ ID NO: 116), PEO24-R-CNP22(SEQ ID NO: 117), 및 PEO12-R-CNP22(SEQ ID NO: 118)를 포함하며, 상기 PEO24는 단분산된 1.2 kDa PEG 중합체이고, PEO12는 단분산된 0.6 kDa PEG 중합체이다. 일 구현예에서, PEG(또는 PEO) 중합체는 CNP 변이체의 N-말단에 접합된다.

본 발명은 유형(예컨대, 단일중합체 또는 공중합체; 랜덤, 교대 또는 블록 공중합체; 선형 또는 분지형; 단분산된 또는 다분산된), 결합(예를 들어, 가수분해가능한 또는 안정한 결합, 예를 들어, 아미드, 이민, 아미날, 알킬렌 또는 에스테르 결합), 접합 부위(예를 들어, N-말단 및/또는 C-말단, 바람직하게는 CNP의 고리화된 영역의 잔기(CNP22의 잔기 6-22에 상응함)의 부위는 아님) 및 길이(예를 들어, 약 0.2, 0.4 또는 0.6 kDa 내지 약 2, 3, 4 또는 5 kDa)가 다양할 수 있는 친수성 또는 수용성 중합체(예를 들어, PEG)를 사용하는 것을 고려한다. 친수성 또는 수용성 중합체는 당업계에 알려져 있는 바와 같이, N-하이드록시 숙신이미드(NHS)- 또는 알데히드-기반 화학 또는 다른 화학에 의해 CNP 펩타이드에 접합될 수 있다. 상기 CNP 변이체는 예를 들어, wtCNP22(2.2 kDa), wtCNP22의 고리화된 영역(잔기 6-22)만을 보유하는 CNP17, CNP22 또는 CNP17의 N-말단 및/또는 C-말단에 아미노산 확장을 갖는 CNP 변이체, 또는 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실을 갖는 변이체, 예컨대 예를 들어, GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO: 119), GANPR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO: 78), R-CNP22(SEQ ID NO: 71), R-CNP22(K4R)(SEQ ID NO: 79), ER-CNP22(SEQ ID NO: 72), 및 ER-CNP22(K4R)(SEQ ID NO: 80)를 사용하여 생성될 수 있다. 일 구현예에서, 본 명세서에서 일반적으로 기술된 범위, 예를 들어, 약 2.6 또는 2.8 kDa 내지 약 6 또는 7 kDa의 총 질량을 갖는 PEG-CNP 변이체는 NHS-또는 알데히드-기반 화학을 통해 N-말단 및/또는 C-말단에 접합된 단일분산된 선형 PEG(또는 PEO) 모이어티, 또는 NHS-기반 화학을 통한 N-말단 및/또는 C-말단에서 접합된 2가(two-arm) 또는 3가(three-arm) 분지형 PEG 모이어티를 함유한다. 본 발명은 또한 카르복실화, 설페이트화 및 인산화 화합물을 포함하지만, 이에 한정되지 않는, 감소된 신장클리어런스를 위해 설계된 음전하를 띠는 PEG-CNP 변이체들을 포함한다(Caliceti, Adv. Drug Deliv. Rev., 55: 1261-77 (2003); Perlman, J. Clin. Endo. Metab., 88: 3227-35 (2003); Pitkin, Antimicrob. Ag. Chemo., 29: 440-444 (1986); Vehaskari, Kidney Intl, 22: 127-135 (1982)). 일 구현예에서, PEG(또는 PEO) 모이어티는 카르복실기(들), 설페이트기(들) 및/또는 포스페이트 기(들)를 함유한다.

또 다른 구현예에서, 본 명세서에 기술된 CNP 변이체의 N-말단, C-말단 및/또는 내부 부위(들)에 접합된 PEG(또는 PEO) 모이어티는 생리적 조건하에 양전하를 띠는 하나 이상의 작용기를 함유한다. 상기 PEG 모이어티는 특히 페길화된 CNP 변이체의 연골 조직으로의 분포를 개선하도록 설계된다. 일 구현예에서, 상기 PEG 모이어티는 하나 이상의 1차, 2차 또는 3차 아미노기, 4차 암모늄 기 및/또는 다른 아민-함유(예를 들어, 요소)기를 함유한다.

일 구현예에서, 본 발명은 NHS- 또는 알데히드-기반 화학을 통해 화학식 (CH₂CH₂O)_n(여기에서, n은 약 6 내지 약 100의 정수임)의 PEG(또는 PEO)에 접합된 CNP22 또는 그의 변이체를 포함하며, PEG 중합체는 약 0.3 kDa 내지 약 5 kDa이다. 다른 구현예에서, n은 약 12 내지 약 50의 정수이고, PEG 중합체는 약 0.6 kDa 내지 약 2.5 kDa이다. 또 다른 구현예에서, n은 약 12 내지 약 24이고, PEG 중합체는 약 0.6 kDa 내지 약 1.2 kDa이다. 또 다른 구현예에서, PEG 중합체의 말단 하이드록시기는 비-반응성 기로 캡핑된다. 특정 구현예에서, 말단-캡핑 기는 알킬기, 예를 들어 메틸과 같은 저급 알킬기이다.

추가의 구현예에서, 본 발명은 중성 엔도펩티다아제(NEP)를 포함하는 펩티다아제에 의한 절단에 대한 민감성이 감소된 하나 이상의 펩타이드 결합 또는 펩타이드 결합 등배전자체를 갖는 CNP 변이체를 제공한다. NEP는 큰 소수성 잔기의 아미노 말단에서 기질 펩타이드 결합을 절단하는 막-결합 아연-의존성 엔도펩티다아제이다. 따라서, NEP의 절단 부위에서 펩타이드 결합을 비 천연 펩타이드 또는 비-펩타이드 결합으로 변형시키는 것은 NEP 절단 효율을 불가능하게 하거나 감소시킬 수 있다.

ANP 및 CNP의 경우, NEP 절단은 고리화된 영역 내의 Cys6-Phe7 결합에서 먼저 발생하고, 나머지 구조의 다른 곳에서 일어나는 것으로 보고되어 있다. BNP의 경우, 절단은 먼저 펩타이드 N-말단에서 일어난 다음, 고리형 구조 내에서 일어나는 것으로 보고되어 있다. CNP 상의 1차 NEP 절단 부위가 Cys6-Phe7 결합인 것으로보고되었지만, wtCNP22가 시험관내에서 2.5분 동안 NEP 분해에 노출되었을 때, Cys6-Phe7 및 Gly8-Leu9 펩타이드 결합이 약간 불안정한 상태에서, 모든 가능한 부위가 예기치 않게 가수분해되었다.

NEP의 기질 특이성은 주로 2개의 기질-결합 서브부위 S1' 및 S2'에 의해 결정된다(Oefner et al., J. Mol. Biol. 296: 341-349(2000)). S1' 부위는 N-말단 펩타이드 결합이 가수분해되는 큰 소수성 P1' 잔기(예를 들어, Phe, Leu, Ile 및 Met)를 수용한다. S2' 부위는 일반적으로 P2'(예를 들어, Gly 또는 Ser)로 지칭되는 더 작은 잔기를 선호한다. CNP의 경우, Phe7은 NEP S1' 부위에 대해 바람직한 P1' 잔기인 것으로 보고되어 있으며, Gly8은 S2' 부위에 대해 바람직한 P2' 잔기이다. 이 2개의 서브부위가 함께 특정 전체 측쇄 크기만 수용할 수 있기 때문에, CNP의 P1'-P2' 잔기의 전체 크기가 증가하면 NEP 결합이 잠재적으로 손상될 수 있다. 예를 들어, P1' Phe7 방향족 고리(즉, 3-Cl-Phe7)의 3-위치에 클로라이드 원자를 첨가하면, CNP와 NEP 절단 부위, 예를 들어 S1' 서브부위 사이의 상호작용을 잠재적으로 변형(예를 들어, 불안정화)시킬 수 있다. 더 작은 P2' 잔기인 Gly8(즉, tBu-Gly8)에 tert-부틸기를 첨가하면 CNP와 S2' 서브부위 사이의 상호작용을 잠재적으로 방해할 수 있다.

따라서, 일 구현예에서, 본 발명의 CNP 변이체는 Phe7-Gly8과 같은 P1'-P2' 잔기의 크기가 증가된 CNP를 포함하여 활성 부위에서 기질 인식을 방해함으로써 NEP 절단에 대한 민감성을 감소시킨다. Phe7, Leu9, Leu11, Ile14, Met17 및 Leu20을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는 하나 이상의 큰 P1' 소수성 잔기에 대해, 및/또는 Cys6, Gly8, Gly15, Ser16 및 Gly19를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 더 작은 P2' 잔기에 대하여, 천연 아미노산, 비 천연 아미노산 및/또는 펩타이드모방 모이어티가 치환된다.

본 발명은 적어도 하나의 변형된 아미노산 및/또는 적어도 하나의 변형된 펩타이드 결합, NEP에 의한 기질 인식 및/또는 절단에 연관된 적어도 하나의 잔기를 포함하는 CNP 변이체를 포함하며, 상기 변형된 아미노산 및 변형된 펩타이드 결합은 천연 아미노산, 비 천연 아미노산, 펩타이드모방제 및/또는 펩타이드 결합 등배전자체일 수 있다. 일 구현예에서, Cys6와 Phe7 사이의 CNP 상의 NEP 절단 부위는 변형된다. 관련된 구현예에서, Cys6와 Phe7 사이의 펩타이드 결합(--C(=O)--NH--)은 하기 펩타이드 결합 등배전자체들 중 하나에 의해 치환된다:

--CH₂--NH--,

--C(=O)--N(R)--(여기에서, 아미드 기가 하기 R 기: 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 사이클로프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 또는 tert-부틸 중 하나에 의해 알킬화됨),

--C(=O)--NH--CH₂--,

--CH₂--S--,

--CH₂--S(O)_n--,(여기에서, n은 1 또는 2임)

--CH₂--CH₂--,

--CH=CH--,

--C(=O)--CH₂--,

--CH(CN)--NH--,

--CH(OH)--CH₂--,

--O--C(=O)--NH--, 또는

--NHC(=O)NH--.

다른 구현예에서, CNP 변이체는 하기 식으로 표시된다: (x)-Gly₁-Leu₂-Ser₃-Lys₄-Gly₅-(b)₆-(c)₇-(d)₈-Leu₉-Lys₁₀-Leu₁₁-Asp₁₂-Arg₁₃-Ile₁₄-Gly₁₅-Ser₁₆-Met₁₇-Ser₁₈-Gly₁₉-Leu₂₀-Gly₂₁-Cys₂₂-(z)(SEQ ID NO: 120), 여기에서:

(x) 및 (z)는 독립적으로 존재하지 않거나, 합성 뼈-표적화 화합물, 예컨대 예를 들어, 비스포스포네이트; 관절 또는 연골 표적화에 유용한 아미노산 서열, 예컨대 예를 들어, 폴리Asp 및 폴리Glu; 뼈 단백질, 예컨대 예를 들어, 오스테오폰신, 오스테오칼신 및 시알로단백질의 뼈-표적화 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열(Wang et al., Adv. Drug Delivery Rev., 57: 1049-76(2005)); 신장클리어런스를 감소시키는 중합체성 및 비-중합체성 분자, 예컨대 예를 들어, 음으로 하전된 PEG; 및 CNP 변이체의 전체 질량을 본 명세서에 일반적으로 기술된 범위, 예를 들어, 약 2.6 또는 2.8 kDa 내지 약 6 또는 7 kDa로 증가시킴으로써 CNP 변이체의 NEP 분해에 대한 저항성을 증가시키는 천연 중합체(예를 들어, 아미노산, 지방산 및/또는 탄수화물을 함유하는 것) 및 합성 중합체(예를 들어, PEG);로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있으며;

(b) 및 (c)는 야생형 Cys6 및 Phe7, 또 다른 천연 아미노산 또는 비 천연 아미노산일 수 있거나, 또는 NEP 절단에 대한 저항성을 증가시키기 위해 본 명세서에 기술된 바와 같은 펩타이드 결합 등배전자체를 함유할 수 있으며; 및

(d)는 야생형 Gly8일 수 있거나, NEP와의 결합을 감소시키기 위해 더 큰 천연 또는 비 천연(예를 들어, t-Bu-Gly) 아미노산 또는 펩타이드 모방체일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 CNP 변이체는 (b), (c) 및/또는 (d)에서 적어도 하나의 변형된 아미노산을 함유한다.

Gly8-Leu9, Lys10-Leu11, Arg13-Ile14, Ser16-Met17 및 Gly19-Leu20 결합을 포함하는, Cys6-Phe7에서 CNP22 또는 그의 변이체가 NEP-내성 펩타이드 결합 또는 펩타이드 결합 등배전자체를 가지더라도 CNP 내의 다른 펩타이드 결합은 절단될 수 있다. 따라서, 본 발명은 Cys6-Phe7 결합 이외에 하나 이상의 다른 NEP 절단 부위에서 펩타이드 결합 등배전자체(들)를 갖는 CNP 변이체를 포함하며, 펩타이드 결합 등배전자체들은 본 명세서에 기술된 것들을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 호모시스테인, 페니실라민, 2-메르캅토프로피온산 및 3-메르캅토프로피온산을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 Cys6 및/또는 Cys22에서 시스테인 유사체를 갖는 CNP 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 CNP 변이체는 야생형 Cys6 또는 유사체와 Cys22 또는 유사체 사이의 디설파이드 결합에 의해 형성된 사이클릭 도메인을 갖는다. 또 다른 구현예에서, CNP22 또는 그의 변이체의 하나 이상의 잔기, 모든 잔기는 D-아미노산에 의해 치환된다. D-아미노산에 의한 L-아미노산의 치환은 본질적으로 측쇄를 그의 원래의 위치로부터 약 120도 이동시키므로 NEP에 대한 CNP 펩타이드의 결합을 잠재적으로 방해한다. 특정 구현예에서, Phe7에서 L-Phe는 그의 D-거울상체, D-Phe에 의해 치환된다.

또 다른 구현예에서, 예를 들어, 3-아미노-2-페닐프로피온산(또는 2-페닐-β-알라닌)과 같은 베타 아미노산이 야생형 α-아미노산 Phe7을 대체한다. β-아미노산의 사용은 펩타이드 백본 길이를 하나의 메틸렌 단위만큼 효과적으로 증가시킨다. 프로테아제 저항성은 기질 형태의 변화 또는 아미노산 측쇄 간의 거리 증가로 인해 발생할 수 있다.

비 천연 α-아미노산, β-아미노산 또는 펩타이드 결합 등배전자체를 갖는 CNP22의 변이체의 비-제한적인 예는 하기를 포함한다:

GLSKGC(CH₂NH)FGLKLDRIGSMSGLGC(유사체 A)(SEQ ID NO: 121);

GLSKGC-(N-Me-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC(유사체 B)(SEQ ID NO: 122);

GLSKGC-(D-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC(유사체 E)(SEQ ID NO: 123);

GLSKGCF-(tBu-Gly)-LKLDRIGSMSGLGC(유사체 F)(SEQ ID NO: 124);

GLSKGC-(3-Cl-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC(유사체 G)(SEQ ID NO: 125); 및

GLSKGC-[NHCH₂CH(Ph)CO]-GLKLDRIGSMSGLGC(유사체 H, 3-아미노-2-페닐프로피온산을 사용하여 형성됨)(SEQ ID NO: 126).

추가의 구현예에서, CNP 변이체는 NEP 분해에 대한 증가된 저항성을 위해 설계된, 본 명세서에서 일반적으로 기술된 범위, 예를 들어 약 2.6 또는 2.8 kDa 내지 약 6 또는 7 kDa를 특징으로 하는 총 질량을 가지며, 하기 식으로 나타낸다: (x)-Gly₁-Leu₂-Ser₃-(a)₄-Gly₅-(b)₆-(c)₇--(d)₈-(e)₉-(f)₁₀-(g)₁₁-Asp₁₂-Arg₁₃-(h)₁₄-Gly₁₅-Ser₁₆-(i)₁₇-Ser₁₈-Gly₁₉-(j)₂₀-Gly₂₁-Cys₂₂-(z) (SEQ ID NO: 127), 여기에서:

(x) 및 (z)는 독립적으로 존재하지 않거나, 합성 뼈-표적화 화합물, 예컨대 예를 들어, 비스포스포네이트; 뼈 또는 연골 표적화에 유용한 아미노산 서열, 예컨대 예를 들어, 폴리Asp 및 폴리Glu; 뼈 단백질, 예컨대 예를 들어, 오스테오폰틴, 오스테오칼신 및 시알로단백질의 뼈-표적화 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열; 신장클리어런스를 감소시키는 중합체성 및 비-중합체성 모이어티, 예컨대 예를 들어, 음으로 하전된 PEG; 예를 들어, 아미노산, 소수성 산 및/또는 탄수화물을 함유하는 중합체; 및 합성 친수성 중합체, 예컨대 예를 들어, PEG;로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있으며;

(a)는 그 위치에서 야생형 Lys일 수도 있거나, Arg, Gly, 6-하이드록시-노르류신, 시트룰린(Cit), Gln, Ser 또는 Glu를 포함하지만, 이에 한정되지 않는, 반응성 1차 아민을 측쇄 상에 갖지 않는, 보존적 아미노산 치환 또는 천연 또는 비 천연 아미노산 또는 펩타이드 모방체로 치환될 수 있고, 일 구현예에서 (a)는 Arg이고;

(b)는 Cys 및 Cys6과 Phe7 사이의 펩타이드-결합 등배전자체, 예컨대 예를 들어, Cys-CH₂--NH로 구성된 그룹으로부터 선택되며;

(c)는 L-Phe; D-Phe; 3-아미노-2-페닐프로피온산; Phe의 N-알킬화 유도체; 및 Phe 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되고, 상기 N-알킬기는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 사이클로프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸 또는 tert-부틸이고, 여기에서, Phe 유사체의 벤젠 고리의 하나 이상의 오르토-, 메타- 및/또는 파라-위치는 할로겐, 하이드록시기, 시아노, 선형 또는 분지형 C_1-6 알킬, 선형 또는 분지형 C_1-6 알콕시, 선형 또는 분지형 할로-C_1-6 알킬, C_3-10 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, C_6-14 아릴 및 헤테로아릴(예는, 티로신, 3-클로로페닐알라닌, 2,3-클로로-페닐알라닌, 3-클로로-5-플루오로-페닐알라닌, 2-클로로-6-플루오로-3-메틸-페닐알라닌을 포함하지만, 이에 한정되지 않음)로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되거나, 또는 Phe 유사체의 벤젠 고리는 다른 아릴기(비-제한적인 예는 1- 및 2-나프틸알라닌을 포함함) 또는 헤테로아릴기(비-제한적인 예는 피리딜알라닌, 티에닐알라닌 및 퓨릴알라닌을 포함함)에 의해 치환될 수 있으며;

(d)는 Gly, tert-부틸-Gly(tBu-Gly), Thr, Ser, Val 및 Asn으로 구성된 그룹으로부터 선택되고;

(e)는 Leu, Ser, Thr 및 예컨대 N-Me-Leu와 같은 펩타이드-결합 등배전자체로 구성된 그룹으로부터 선택되고;

(f)는 그 위치에서 야생형 Lys일 수도 있거나, Arg, Gly, 6-하이드록시-노르류신, 시트룰린(Cit), Gln, Ser 또는 Glu를 포함하지만, 이에 한정되지 않는, 반응성 1차 아민을 측쇄 상에 갖지 않는, 보존적 아미노산 치환 또는 천연 또는 비 천연 아미노산 또는 펩타이드 모방체로 치환될 수 있고, 일 구현예에서 (f)는 Arg이 아니고;

(g)는 Leu 및 펩타이드-결합 등배전자체, 예컨대 예를 들어, N-Me-Leu로 구성된 그룹으로부터 선택되고;

(h)는 Ile, tBu-Gly 및 펩타이드-결합 등배전자체, 예컨대 예를 들어, N-Me-Ile로 구성된 그룹으로부터 선택되고;

(i)는 Met, Val, Asn, 베타-Cl-Ala, 2-아미노부티르산(Abu) 및 2-아미노-이소부티르산(Aib)으로 구성된 그룹으로부터 선택되고; 및

(j)는 Leu, 노르류신(Nle), 호모류신(Hleu), Val, tert-부틸-Ala(tBu-Ala), Ser, Thr, Arg 및 펩타이드-결합 등배전자체, 예컨대 예를 들어, N-Me-Leu로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

또 다른 구현예에서, CNP 변이체는 NEP 분해에 대한 증가된 저항성을 위해 설계된, 본 명세서에서 일반적으로 기술된 범위, 예를 들어 약 2.6 또는 2.8 kDa 내지 약 6 또는 7 kDa를 특징으로 하는 총 질량을 가지며, 하기 식으로 나타낸다: (x)-Gly₁-Leu₂-Ser₃-(a)₄-Gly₅-(b)₆-(c)₇-(d)₈-(e)₉-(f)₁₀-(g)₁₁-Asp₁₂-Arg₁₃-(h)₁₄-(i)₁₅-Ser₁₆-(j)₁₇-Ser₁₈-Gly₁₉-(k)₂₀-Gly₂₁-Cys₂₂-(z)(SEQ ID NO: 128), 여기에서:

(x) 및 (z)는 독립적으로 존재하지 않거나, 합성 뼈-표적화 화합물, 예컨대 예를 들어, 비스포스포네이트; 뼈 또는 연골 표적화에 유용한 아미노산 서열, 예컨대 예를 들어, 폴리Asp 및 폴리Glu; 뼈 단백질 및 이의 유도체, 예컨대 예를 들어, 오스테오폰틴, 오스테오칼신 및 시알로단백질 등의 융합 단백질 또는 펩타이드 서열의 뼈-표적화 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열; 친수성 또는 수용성 중합체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는, 신장클리어런스를 감소시키는 모이어티, 예컨대 예를 들어, 하전된 PEG 분자; 및 예를 들어, PEG, 아미노산, 탄수화물 및/또는 소수성 산을 포함하는 모이어티;로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있으며;

(b)는 Cys 및 Cys6과 Phe7 사이의 펩타이드 결합 등배전자체, 예컨대 예를 들어, Cys-CH₂--NH로 구성된 그룹으로부터 선택되며;

(c)는 L-Phe; D-Phe; 3-아미노-2-페닐프로피온산; Phe의 N-알킬화 유도체; 및 Phe 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되고, 상기 N-알킬기는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 사이클로프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸 또는 tert-부틸이고, 여기에서, Phe 유사체의 벤젠 고리의 하나 이상의 오르토-, 메타- 및/또는 파라-위치는 할로겐, 하이드록시기, 시아노, 선형 또는 분지형 C_1-6 알킬, 선형 또는 분지형 C_1-6 알콕시, 선형 또는 분지형 할로-C_1-6 알킬, C_3-10 사이클로알킬, C_6-14 아릴, 헤테로사이클릴, 및 헤테로아릴(예는, 티로신, 3-클로로페닐알라닌, 2,3-클로로-페닐알라닌, 3-클로로-5-플루오로-페닐알라닌, 2-클로로-6-플루오로-3-메틸-페닐알라닌을 포함하지만, 이에 한정되지 않음)로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되거나, 또는 Phe 유사체의 벤젠 고리는 다른 아릴기(비-제한적인 예는 1- 및 2-나프틸알라닌을 포함함) 또는 헤테로아릴기(비-제한적인 예는 피리딜알라닌, 티에닐알라닌 및 퓨릴알라닌을 포함함)에 의해 치환될 수 있으며;

(d)는 Gly, tert-부틸-Gly, Thr, Ser, Val 및 Asn으로 구성된 그룹으로부터 선택되고;

(e)는 Leu, Ser, Thr 및 펩타이드 결합 등배전자체, 예컨대 예를 들어, N-Me-Leu로 구성된 그룹으로부터 선택되고;

(f)는 Lys, Arg, Gly, 6-하이드록시-노르류신, 시트룰린(Cit), Gln 및 Ser로 구성된 그룹으로부터 선택되고;

(g)는 Leu, Asn 및 펩타이드 결합 등배전자체, 예컨대 예를 들어, N-Me-Leu로 구성된 그룹으로부터 선택되고;

(h)는 Ile, tert-부틸-Gly(tBu-Gly), Asn 및 펩타이드-결합 등배전자체, 예컨대 예를 들어, N-Me-Ile로 구성된 그룹으로부터 선택되고;

(i)는 Gly, Arg, Ser 및 Asn으로 구성된 그룹으로부터 선택되고;

(j)는 Met, Val, Asn, β-Cl-Ala, 2-아미노부티르산(Abu) 및 2-아미노-이소부티르산(Aib)으로 구성된 그룹으로부터 선택되고; 및

(k)는 Leu, 노르류신(Nle), 호모류신(Hleu), Val, tert-부틸-Ala(tBu-Ala), Arg, Thr, Ser, 및 펩타이드-결합 등배전자체, 예컨대 예를 들어, N-Me-Leu로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

관절-관련 장애(예를 들어, 골관절염)의 표적 부위에 대한 CNP 변이체의 전달을 개선시키기 위해, CNP 변이체는 뼈- 또는 연골-표적화 모이어티에 (예를 들어, N-말단 및/또는 C-말단)에 부착될 수 있다. 뼈- 또는 연골-표적화 모이어티의 비-제한적인 예로는 비스포스포네이트; 하이드록시아파타이트; 글루코사민; 콜라겐(예를 들어, 콜라겐 타입 X); 폴리Asp; 폴리Glu; 및 뼈 단백질, 예컨대 예를 들어, 오스테오크린, 오스테오폰틴, 오스테오칼신 및 시알로단백질의 뼈-표적화 도메인로부터 유도된 아미노산 서열을 포함한다.

CNP 변이체는 CNP 기능을 유지하면서 NEP 절단에 덜 취약하다는 것 이외에 잠재적으로 NPR-C 간극 수용체에 대한 감소된 친화도를 가진다. NEP-매개된 분해 외에, CNP22의 반감기는 NPR-B의 세포외 펩타이드-결합 도메인과 58% 서열 상동성을 공유하는 간극 수용체, NPR-C에 의해 영향을 받는다. CNP22는 NPR-B(7-30pM 친화도)뿐만 아니라 NPR-C(11-140 pM)에 강하게 결합한다(Bennett, B. D. et al., J. Biol. Chem., 266: 23060-67 (1991); Koller, K. J. & Goeddel, D. V., Circulation, 86: 1081-88 (1992); Suga, S. et al., Endocrinology, 130: 229-39 (1992)). NPR-B 결정 구조는 아직 보고되지 않았지만, NPR-C와 NPR-A 결정 구조 사이의 유사성뿐만 아니라 서열상동성은 (He, X.-L. et al., Science, 293(5535): 1657-62 (2001); Ogawa, H. et al., J. Biol. Chem., 279(27): 28625-31 (2004); He, X.-L., J. Mol. Biol., 361(4): 698-714 (2006)) NPR-B가 유사한 전체적인 구조적 겹침을 나타낼 가능성이 있음을 제시한다.

따라서, 하기 관련 시스템: NPR-C에 결합된 CNP, NPR-A에 결합된 ANP, 및 NPR-C에 결합된 ANP의 구조-기반 서열 정렬 및 결정학적 구조에 기초하여 NPR-B 상동성 모델이 구축되었다(He, X.-L. et al., Science, 293(5535): 1657-62 (2001); Ogawa, H. et al., J. Biol. Chem., 279(27): 28625-31 (2004); He, X.-L., J. Mol. Biol., 361(4): 698-714 (2006)). 수용체가 결합된 펩타이드 형태를 결정하는 것으로 보이고, NPR-B가 1차 구조 및 기능적 특성에 대해 NPR-A와 가장 유사하다는 관찰에 기초하여, 모델로서 NPR-A/ANP 결정 구조를 갖는 NPR-B/CNP 상동성 모델이 생성되었다. CNP 변이체의 공개된 신호전달 데이터(미국 특허 제5,434,133호 및 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0138134 A1) 및 NPR-C에 더 이상 결합하지 않는 기능적 ANP 변이체(Cunningham, EMBO 13(11) 2508-15, 1994)는 NPR-B/CNP 모델을 정제하고 해석하는 데 사용되었다.

본 발명은 NPR-B/CNP 복합체의 상동성-기반 구조 모델에 기초하여 개선된 NPR-B 선택성을 위해 설계된 CNP 변이체를 포함한다. 다양한 수용체에 결합된 나트륨이뇨 펩타이드의 실험 및 계산 구조 데이터를 공개된 기능적 데이터와 조합하여, NPR-B에 대한 결합을 계속하는 CNP 변이체가 생성되지만, NPR-C 간극 수용체에 대한 친화도가 잠재적으로 감소될 수 있다. 예를 들어, NPR-C는 NPR-A 및 NPR-B의 각각의 루프 잔기와 비교하여, 펩타이드-결합 부위의 루프 구조에 고유한 삽입을 가지며, 루프 잔기를 CNP Gly8(또는 ANP Gly9)와 같은 펩타이드 잔기에 더 가깝게 배치한다. 이전 연구에 따르면, ANP의 G9T 돌연변이가 NPR-C에 대한 친화도를 감소시켜, NPR-A 선택성을 향상시키는 데 기여한다고 밝혀졌다(Cunningham, EMBO J., 13(11): 2508-15 (1994)). 따라서, NPR-B와의 결합에 영향을 주지 않으면서 NPR-C에 대한 CNP 결합을 방해하기 위해 더 큰 잔기(Ser, Val, Thr 또는 Asn)에 의해 대응하는 Gly8 잔기를 대체하도록 CNP 변이체가 생성되었다. 또한, 수용체/펩타이드 복합체의 상세한 구조 분석에 기초하여, 수용체-특이적 잔기와 상호작용할 것으로 예측되는, Gly15 내지 Gly21을 포함하는 CNP의 C-말단에 하나 이상의 돌연변이가 도입되었다. 예를 들어, CNP22의 G19R 돌연변이는 NPR-B 신호전달 활성의 유의한 손실을 초래하지 않는다. 그러나, 이 돌연변이는 인접한 잔기의 구조를 변경시키지 않으면서 NPR-C/CNP의 이용가능한 결정 구조로 모델링될 수 없다. 이러한 관찰은 G19R 돌연변이가 NPR-C와 같은 특정 수용체에 대한 CNP의 결합을 선택적으로 파괴할 수 있음을 시사한다.

일 구현예에서, CNP 변이체는 위치 1, 5, 8, 15, 19 및 21의 하나 이상의 Gly 부위에 치환체(들)를 가지므로, 구조 유연성을 감소시켜 수용체 특이성을 증가시킨다. NPR-C 및 NPR-A에 결합된 ANP의 결정 구조의 비교 분석(Ogawa, H. et al., J. Biol. Chem., 279: 28625-31 (2004); He, X.-L., J. Mol. Biol., 361: 698-714 (2006))은 ANP의 구조 유연성이 수용체 선택성을 결정하는 데 중요한 역할을 할 수 있음을 나타낸다.

일 구현예에서, NPR-C에 대해 잠재적으로 감소된 친화도를 갖는 기능성 CNP 변이체는 하기 아미노산 치환들: G1R, G1E, GSR, G5Q, G5S, F7Y, G8T, G8S, G8V, G8N, L9S G19S, G19T, G19S, G19R, G19R, G20R, G20S, G21S, G21T 및 G21R 중 하나 이상을 갖는다. 일 구현예에서, CNP 변이체는 위치 1, 5, 7, 8, 9, 10, 14, 15, 16, 17, 19, 20 및/또는 21에 다 지점 치환을 가지며, 변이체의 펩타이드 서열의 다른 위치 중 하나에 선택적으로 변형을 가질 수 있다.

추가의 구현예에서, 본 명세서에 기술된 CNP 변이체는 본 명세서에서 일반적으로 기술된 범위, 예를 들어, 약 2.6 또는 2.8 kDa 내지 약 6 또는 7 kDa의 범위를 특징으로 하는 총 질량까지 N-말단, C-말단 및/또는 내부 부위에서 모이어티에 접합될 수 있어, 관절/연골 표적화를 촉진하고, NPR-C 및 신장클리어런스를 감소시키며, NEP 분해에 대한 내성을 증가시키고, 및/또는 CNP 기능을 개선시킨다. 일 구현예에서, CNP 변이체는 (CNP22의 Cys6 내지 Cys22에 상응하는) 사이클릭 영역 내의 부위에서 중합체 모이어티에 접합되지 않는다. CNP 변이체에 접합될 수 있는 중합체 또는 비-중합체 모이어티의 비-제한적인 예로는 합성 뼈-표적화 화합물, 예컨대 예를 들어, 비스포스포네이트; 뼈/연골 표적화 펩타이드 서열, 예컨대 예를 들어, 폴리Asp 및 폴리Glu; 뼈 단백질, 예컨대 예를 들어, 오스테오폰틴, 오스테오칼신 및 시알로단백질의 뼈-표적화 도메인으로부터 유래된 펩타이드 서열; 뼈 형성 단백질, 예컨대 예를 들어, BMP2, BMP3, BMP5, BMP7 및 BMP8a의 기능적 도메인으로부터 유래된 펩타이드 서열; 나트륨이뇨성 기원의 폴리펩타이드, 예컨대 예를 들어, NPP, ANP 및 BNP로부터 유래된 펩타이드 서열; 다른 천연 중합체성 또는 비-중합체성 모이어티, 예컨대 예를 들어, 탄수화물, 지방산 및 인지질; 생체적합성 합성 친수성 중합체, 예컨대 예를 들어, PEG(또는 PEO); 소수성 중합체성 또는 비-중합체성 모이어티, 예컨대 예를 들어, 헵탄산 및 펜탄산; 및 이들의 조합을 포함한다.

본 명세서에 기술된 CNP 변이체는 예를 들어 cGMP 생산 및 신호전달의 자극과 관련하여, CNP22와 실질적으로 유사하거나 더 우수한 기능적 활성을 가질 수 있다. 일 구현예에서, 시험관내 또는 생체내 CNP 변이체는 동일한 농도의 wtCNP22(예컨대, 1μM)하에 생성된 cGMP 수준의 적어도 약 50%의 생산을 자극한다. 특정 구현예에서, CNP 변이체는 시험관내 또는 생체내에서 야생형 CNP22의 cGMP-자극 활성의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%를 보유한다. 또 다른 구현예에서, CNP 변이체는 CNP22와 비교하여 개선된 cGMP-자극 활성을 갖는다. 특정 구현예에서, 시험관내 또는 생체내에서 CNP 변이체는 wtCNP22의 동일 농도(예를 들어, 1 μM)에서 생성된 cGMP 수준의 적어도 약 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450 100%, 500% 또는 그 이상의 생성을 자극한다.

C. CNP 변이체의 합성 및 정제

일부 구현예에서, 본 명세서에서 유용한 CNP 변이체는 특정 구현예에서 당 분야에 공지된 특정 기술을 사용하여 재조합 발현에 의해 생산된다. 예를 들어, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition., Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, D. N. Glover, Ed.(1985); 및 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.(1994)를 참조한다.

특정 구현예에서, CNP 변이체는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 융합 단백질을 발현시키는 조건하에, 절단가능한 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드에 연결된 CNP 변이체 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 재조합 방법에 의해 생산되며, 상기 융합 폴리펩타이드는 절단가능한 펩타이드 또는 단백질에 직접 결합되거나 링커를 통해 간접적으로 연결된 CNP 변이체 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 절단가능한 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 연결된 CNP 변이체 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터에 의해 형질전환된다. 특정 구현예에서, 융합 폴리펩타이드는 가용성 단백질 또는 봉입체로서 발현된다. 발현된 융합 폴리펩타이드는 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 단리될 수 있고, 상기 단리된 융합 폴리펩타이드는 절단제와 접촉되어 CNP 변이체를 방출할 수 있다.

CNP 변이체의 생성 방법은 본 명세서에 참고로 인용된 미국 특허 제8,198,242호, 제8,377,884호 및 제8,598,121호에 기술되어있다.

D. 화학적으로 변형된 CNP 변이체

CNP 변이체의 화학적 변형은 변형된 CNP 펩타이드에 증가된 안정성 및 반감기 및 감소된 면역원성과 같은 (치료용 단백질의 화학적 변형에 대한 일반적인 논의를 위해, Pharmazie, 57(1): 5-29 (2002) 참조) 유리한 성질을 잠재적으로 부여할 수 있다. 페길화 이외에도 글리코실화 및 다른 화학적 유도 과정들, 예를 들어 인산화, 아미드화, 카르복실화, 아세틸화, 메틸화, 산-부가 염, 아미드, 에스테르 및 N-아실 유도체의 생성은 잠재적으로 면역원성 영역 및/또는 단백질분해적으로 민감한 영역을 차폐할 수 있다(Science, 303: 480-482(2004)).

화학적 변형의 예로는 안정성 및 프로테아제 내성을 개선하고 면역원성을 감소시키기 위한, Bednarsaki의 중합체 첨가 방법 및 Altus Corporation의 가교-결합 방법이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. Bednarsaki는 중합체 첨가가 단백질 온도 안정성을 향상시킬 수 있음을 보여주었으며(J. Am. Chem. Soc., 114(1): 378-380(1992)), Altus Corporation은 글루타르알데히드 가교-결합이 효소 안정성을 향상시킬 수 있음을 발견했다.

폴리펩타이드의 화학적 변형은 비특이적인 방식(유도체화된 종의 혼합물을 유도) 또는 (예를 들어, 부위-유도성 돌연변이 유발 및 화학적 변형의 조합을 이용한, 야생형 거대분자 반응성-유도된 유도체화 및/또는 부위-선택적 변형에 기반을 둔) 부위-특이적인 방식으로, 또는 대안적으로는 발현된 단백질 리게이션 방법(Curr. Opin. Biotechnol., 13(4): 297-303(2002))을 사용하여 수행될 수 있다.

페길화된 CNP 변이체

일 구현예에서, 증가된 안정성을 위해 (아미노산 첨가, 치환 및/또는 결실을 갖는 것을 포함하는) CNP 변이체는 친수성, 천연 또는 합성 중합체에 접합된다. 일 구현예에서, 수성(예를 들어, 생리적) 환경에서, 친수성 중합체는 그에 접합된 CNP 펩타이드가 침전되지 않도록 수용성이다. 또한, 친수성 중합체는 생체적합성이며, 즉 생체내 에서 상해, 독성 또는 면역 반응을 일으키지 않는다. 친수성 중합체는 분지형 또는 비 분지형일 수 있다. 일 구현예에서, 친수성 중합체는 분지형이 아니다.

친수성 중합체에 대한 CNP 변이체의 다양한 접합 부위가 가능하지만, 다음에 한정되는 것은 아니다: (1) N-말단에서만; (2) C-말단에서만; (3) 내부 부위에서만(예를 들어, Lys4); (4) N-말단 및 C-말단 모두에서; (5) N-말단 및 내부 부위에서; 및 (6) C-말단 및 내부 부위에서. 일 구현예에서, CNP 변이체는 N-말단에서만 친수성 중합체에 접합된다. 또 다른 구현예에서, 접합은 단지 내부 부위(예를 들어, Lys4)에서만 일어난다. 또 다른 구현예에서, 접합은 N-말단 및 내부 부위(예를 들어, Lys4)에서 일어난다. 또 다른 구현예에서, 보다 양호한 기능을 위해, CNP 변이체는 사이클릭 도메인(CNP-22의 Cys6 내지 Cys22에 상응함) 내의 부위(예를 들어, Lys10)에서 친수성 중합체에 접합되지 않는다. 친수성 고분자와의 접합이 CNP 변이체 상의 반응성 1차 아미노기와의 결합 형성을 기반으로 하는 경우, 내부 부위(예를 들어, Lys4 및/또는 Lys10)에서의 접합은 측쇄 상에 반응성 1차 아미노기, 예컨대, 예를 들어, Gly, Ser, Arg, Asn, Gln, Asp, Glu 또는 시트룰린(Cit)을 함유하지 않는 천연 또는 비 천연 아미노산 또는 펩타이드 모방체에 의한 Lys4 및/또는 Lys10의 치환에 의해 예방될 수 있다. 특정 구현예에서, Lys4 및/또는 Lys10은 Arg에 의해 대체된다. 다른 구현예에서, Lys10은 Arg에 의해 대체되지 않는다.

친수성 중합체의 비-제한적인 예는 카르복실산-함유 단량체로부터 형성된 중합체(예를 들어, 메타크릴산(MA) 및 아크릴산(AA)), 폴리비닐 알콜, 하이드록시기-함유 단량체로부터 형성된 중합체(예를 들어, 하이드록시에틸 메타크릴레이트(HEMA), 하이드록시프로필 메타크릴레이트(HPMA), 하이드록시프로필 메타크릴아미드 및 3-트리메틸실일프로필 메타크릴레이트(TMSPMA)), 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리옥시에틸화 폴리올(예를 들어, 글리세롤), 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG), 폴리(프로필렌 글리콜), 모노-C₁-C₁₀ 알콕시-PEG(예를 들어, 모노메톡시-PEG), 트레실 모노메톡시-PEG, 아릴옥시-PEG, PEG 아크릴레이트(PEGA), PEG 메타크릴레이트, PEG 프로피온알데하이드, 비스-숙신이미딜 카르보네이트 PEG, 2-메타크릴로일옥시에틸-포스포릴콜린(MPC) 및 N-비닐 피롤리돈(VP)의 공중합체, 하이드록시 기능성 폴리(N-비닐 피롤리돈)(PVP), SIS-PEG(SIS는 폴리스티렌-폴리이소부틸렌-폴리스티렌 블록 공중합체임), 폴리스티렌-PEG, 폴리이소부틸렌-PEG, PCL-PEG(PCL은 폴리카프로락톤임), PLA-PEG(PLA는 폴리락트산임), PMMA-PEG(PMMA는 폴리(메틸 메타크릴레이트)임), PDMS-PEG(PDMS는 폴리디메틸옥사논임), PVDF-PEG(PVDF는 폴리비닐리덴 플루오라이드임), PLURONIC™ 계면활성제(폴리프로필렌 옥사이드-co-폴리에틸렌 글리콜), 폴리(테트라메틸렌 글리콜), 폴리(L-리신-g-에틸렌 글리콜)(PLL-g-PEG), 폴리(L-리신-g-히알루론산)(PLL-g-HA), 폴리(L-리신-g-포스포릴 콜린)(PLL-g-PC), 폴리(L-리신-g-비닐 피롤리돈)(PLL-g-PVP), 폴리(에틸이민-g-에틸렌 글리콜)(PEI-g-PEG), 폴리(에틸이민-g-히알루론산)(PEI-g-HA), 폴리(에틸이민-g-포스포릴 콜린)(PEI-g-PC), 폴리(에틸이민-g-비닐 피롤리돈)(PEI-g-PVP), PLL-co-HA, PLL-co-PC, PLL-co-PVP, PEI-co-PEG, PEI-co-HA, PEI-co-PC, PEI-co-PVP, 셀룰로오스 및 이들의 유도체(예를 들어, 하이드록시에틸 셀룰로스), 덱스트란, 덱스트린, 히알루론산 및 이들의 유도체(예를 들어, 소듐 히알루로네이트), 엘라스틴, 키토산, 아크릴산 설페이트, 아크릴산 설포네이트, 아크릴산 설파메이트, 메타크릴산 설페이트, 메타크릴산 설포네이트, 메타크릴산 설파메이트, 이들의 중합체 및 공중합체 및 이들의 조합의 중합체 및 공중합체를 포함한다.

특정 구현예에서, 친수성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)이며, 폴리(에틸렌 옥사이드)(PEO)라고도 한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "PEG" 또는 "PEO"는 제한없이 모노-(C₁-C₁₀) 알콕시-PEG 및 아릴옥시-PEG를 포함하는, 폴리펩타이드를 유도체화하는 데 사용될 수 있는, 분지형 및 비분지형 PEG의 모든 형태를 포함한다.

일 구현예에서, PEG-CNP 접합체는 화학식 (CH₂CH₂O)_n의 PEG(또는 PEO) 중합체를 포함하며, 여기서 n은 약 6 내지 약 100의 정수이고, PEG 중합체는 약 0.3 kDa 내지 약 5 kDa이다. 다른 구현예에서, n은 약 12 내지 약 50의 정수이고, PEG 중합체는 약 0.6 kDa 내지 약 2.5 kDa이다. 또 다른 구현예에서, n은 약 12 내지 약 24이고, PEG 중합체는 약 0.6 kDa 내지 약 1.2 kDa이다. 추가의 구현예에서, PEG 중합체의 말단 하이드록실기는 비-반응성기로 캡핑된다. 특정 구현예에서, 말단-캡핑 기는 PEG 중합체가 알콕시 기에서 종결되도록, 알킬기, 예를 들어 메틸과 같은 저급 알킬기이다. 일 구현예에서, PEG 중합체는 분지형이 아니다. 또 다른 구현예에서, CNP-22 또는 그의 변이체는 N-말단에서만 PEG 중합체에 접합된다.

PEG 및 PEO는 분자량 분포를 갖는 분자를 잠재적으로 포함하며, 즉, 이들 분자는 제조 방법에 따라 잠재적으로 다분산된다. 중합체성 제제의 크기/질량 분포는 그의 중량 평균 분자량(M_w) 및 그의 수 평균 분자량(M_n)에 의해 통계적으로 특징지어 질 수 있으며, 그의 비율은 다분산 지수(M_w/M_n)로 지칭된다. M_w 및 M_n은 질량 분광법에 의해 측정될 수 있다. 1.5kDa보다 큰 PEG 모이어티에 접합된 PEG-CNP 변이체는 모체 PEG 분자의 다분산 특성으로 인해 분자량의 범위를 나타낼 수 있다. 예를 들어, mPEG2K(Sunbright ME-020HS, NOF Co.)의 경우, PEG 분자의 분자량은 약 1.5 kDa 내지 약 3 kDa 범위에 분포하며, 다분산 지수는 1.036이다. 대조적으로, Pierce Biotechnology(Rockford, 일리노이 소재)제 MS(PEG)_n 제제(n = 4, 8, 12 또는 24, 예를 들어 "PEO12" 또는 "PEO24"로 표기됨)을 사용하여 CNP-22 또는 그의 변이체에 접합된 PEG는 별개의 사슬 길이 및 정의된 분자량을 갖는 단분산이다.

PEG 모이어티를 포함하는 폴리펩타이드를 생성시키는 방법은 당 분야에 공지되어있다(예를 들어, 미국 특허 제5,824,784호 참조). 페길화 CNP 펩타이드를 제조하는 방법은 일반적으로 (a) CNP 펩타이드(예를 들어, N-말단)에 PEG를 부착시키는 데 적합한 조건하에 CNP-22 또는 그의 변이체를 페길화 제제와 반응시키는 단계, 및 (b) 반응 생성물(들)을 얻는 단계를 포함한다. CNP 펩타이드의 페길화는 PEG 모이어티의 크기 및 페길화 위치에 따라 NPR-B와의 결합을 크게 변화시킬 수 있기 때문에, 다양한 종류의 PEG 및 페길화 반응 조건이 연구될 수 있다. CNP 펩타이드의 페길화에 사용될 수 있는 화학 반응은 메톡시-PEG(O-[(N-숙신이미딜옥시카르보닐)-메틸]-O'-메틸폴리에틸렌 글리콜)의 NHS-에스테르를 사용한 펩타이드의 반응성 1차 아민의 아실화를 포함한다. 메톡시-PEG-NHS 또는 메톡시-PEG-SPA에 의한 아실화는 아미드 결합으로 이루어져, 원래의 1차 아민의 전하를 제거한다. 기호 "PEG1K", "PEG2K", "PEG5K" 또는 "PEG20K"로 표시된 것들뿐만 아니라 기호 "PEO12" 또는 "PEO24"로 표시된 PEG-CNP 변이체는 펩타이드 상에서의 1차 아미노기와 NHS 에스테르-활성화된, 메톡시-말단 캡핑된 PEG 제제의 반응을 통해 페길화된다. PEG-CNP 변이체는 또한 다른 방법, 예를 들어, 펩타이드상의 1차 아미노기 및 PEG 알데히드, 예컨대 예를 들어, PEG-프로피온알데히드, 또는 그의 모노-C₁-C₁₀ 알콕시 또는 그의 아릴옥시 유도체와 관련된 환원성 아민화를 통해 제조될 수 있다(미국 특허 제5,252,714호 참조).

리보솜 단백질 합성과는 달리, 합성 펩타이드 합성은 C-말단에서 N-말단으로 진행한다. 따라서, Boc-PEG(tert-부틸옥시카르보닐(Boc)을 함유함)는 PEG를 펩타이드의 C-말단에 부착시키는 한 방법이다(R. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85(14): 2149-2154 (1963)). 대안적으로, Fmoc(플루오레닐메톡시카르보닐) 화학을 사용할 수 있다(E. Atherton and R.C. Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach, IRL Press (Oxford, England (1989)).

PEG-CNP 변이체를 제조하는 방법은 중합체-단백질 접합체의 실질적으로 균질 한 혼합물을 제공한다. 정제 후, 별개의 PEG-CNP 제제는 생물학적 특성의 시험관내 및 생체내 시험을 위해 충분히 순수하다. 페길화의 성질 및 정도는 예를 들어 PAGE 및 HPLC 분석을 사용하여 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, CNP 변이체의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%가 N-말단에서 모노-페길화된다. CNP의 생물학적 성질에 대한 페길화의 유리한 효과를 최적화하기 위해, PEG 모이어티의 중합체 길이, 형태(예를 들어, 분지형 또는 선형) 및/또는 관능화(예를 들어, 음으로 하전된 기의 첨가)가 다양할 수 있다. 페길화된 CNP 변이체는 NEP 내성, 약물동력학 및 생체활성(예를 들어, NPR-B에 결합하고 cGMP의 생성을 자극하는 능력)에 대해 시험된다. 개선된 NEP 내성 및 CNP-22의 cGMP-자극 활성의 약 50% 이상을 나타내는 페길화된 CNP 변이체는 예를 들어 래트 연골육종 세포-기반 연골형성 모델에서 시험관내 및 뮤린 연골형성 동물 모델에서 생체내에서 추가로 시험될 수 있다.

E. CNP 변이체, CNP 변이체의 약학적 조성물 및 투여 경로의 사용 방법

CNP 변이체 사용 방법

하기 실시예에 기술된 바와 같이, 본 명세서에 기술된 실험은 본 명세서에 개시된 CNP 변이체가 골관절염의 치료에 유용하다는 증거를 제공한다. 따라서, 본 발명의 구현예는 골관절염으로 진단된 대상체에게 CNP 변이체를 투여하는 단계를 포함한다. 결과적으로, 대상체에서 연골 퇴행의 속도는 감소될 수 있고, 경우에 따라 역전될 수 있다(즉, 연골이 재생되도록 유도될 수 있음). 따라서, 골관절염과 연관된 다양한 증상 및 바이오마커가 개선될 수 있다. 실시예는 Gly-CNP-37 및 Pro-Gly-CNP-37의 유용성을 예시하고 있지만, 본 명세서에 개시된 다른 변이체들 또한 효능이 시험될 수 있고 유사한 방식으로 사용될 수 있다. 특히, Gly-CNP-37 및 Pro-Gly-CNP-37은 연골 성장, 이동성 및 운동 능력이 현저하게 개선되고 연골 퇴행이 현저하게 감소됨을 보여준다.

골관절염은 상술한 바와 같은 환자로부터의 징후 및 증상의 보고 및 특정 관절에서 연골 손상을 측정하기 위한 의료용 이미징에 기초하여 진단될 수 있다. 이미징의 방법으로는 방사선 촬영, 자기 공명 영상(MRI), 광간섭 단층촬영장치(OCT) 및 초음파(US)를 포함한다(Gold et al., Bone J. 51: 278-88, 2012). 이미징은 관절 영역에서 관절의 협착, 골증식체 및 연골하낭종, 관절 연골의 가늘어짐, 퇴행성 연골하 골수 변화 및 뼈 융합을 종종 감지할 수 있다. 다양한 구현예에서, 본 명세서에서 고려되는 바와 같은 CNP 변이체의 투여는 연골 퇴행, 연골 성장, 환자의 이동성, 관절 영역에서의 관절 협착, 골증식체 및 연골하낭종, 관절 연골의 가늘어짐, 퇴행성 연골하 골수 변화 및 뼈 융합뿐만 아니라 당 분야의 당업자에게 공지된 다른 것들을 포함하는 본 명세서에 기술된 바와 같은 골관절염의 하나 이상의 증상을 개선시킨다.

특정 경우, 골관절염은 1차 및 2차 골관절염으로 분류된다(Stacy et al., 1차 골관절염 이미징, 2012). 1차 관절염은 특발성 현상을 가리키며, 분명한 개시 인자가 없는 고령 개인과 이전의 손상되지 않은 관절에서 흔히 발생된다. 2차 골관절염은 일부 소인적 조건들, 일반적으로 영향을 받는 관절의 관절 연골 및/또는 연골하 뼈에 부정적인 영향을 미치는 외상에 기인하는 활막 관절의 퇴행성 질환을 의미할 수 있다. 2차 골관절염은 상대적으로 젊은 사람들에게서 발생할 수 있다. 1차 및 2차 골관절염의 치료가 본 명세서에서 고려된다.

관절염의 중증도는 웨스턴 온타리오 및 맥마스터 대학의 골관절염 지수(WOMAC)(Kirkley et al., N Engl J Med 359:1097-1107, 2008), Short Form-36(SF-36) 물리적 성분 개요(Physical Component Summary)(Ware et al., Med Care 30: 473-483, 1992) 및 관절염 자기-효능 규모(Arthritis Self-Efficacy Scale, ASES)(Lorig et al., Arthritis Rheum 32: 37-44, 1989) 상에서 점수매겨질 수 있다. 방사선검사의 중증도는 수정된 Kellgren-Lawrence 분류(Kellgren et al., Ann Rheum Dis 1957, 16: 494-502; Blackburn et al., J Rheumatol; 21: 675-679, 1994)에 의해 평가될 수 있다.

골관절염은 무릎, 어깨, 팔꿈치, 손가락, 손, 손목, 엉덩이, 발목, 목, 척추 및/또는 허리를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 관절의 연골에 영향을 미칠 수 있다. 골관절염의 증상은 등 관절염이 있는 경우, 관절통, 관절 경직, 관절 부종, 운동 범위 감소, 팔, 다리의 약화 또는 감각 상실 등을 포함한다. 현재 골관절염의 새롭고 효과적인 치료법에 대한 필요성이 충족되지 못하고 있다. 기질 생성 및 연골세포의 성장과 분화를 촉진시킴으로써, 본 명세서에 기술된 CNP 변이체는 골관절염을 비롯한 관절염을 앓고 있는 대상체에서 FGF-2의 바람직하지 않은 효과를 대처하고 기질 합성을 증가시키는데 유용하여 골관절염을 비롯한 관절염을 치료하는 데 유용한 것으로 나타났다.

다양한 구현예에서, 연골 손상 또는 성장은 연골세포 죽음/손실, 프로테오글리칸(PG) 손실, 및 콜라겐 소실 또는 피브릴화에 의해 분석된다. 연골 손상 및 치료 후 개선은 또한 본 명세서에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 연골-특이적 바이오마커의 수준을 측정함으로써 평가할 수 있다. 이동성 개선은 본 명세서에 기술되고 당 분야에 공지된 임의의 이동도와 평가 척도에 의해 모니터링될 수 있다.

골관절염의 치료는 항염증제, 예컨대 아스피린, 나프록센 또는 이부프로펜을 포함하는 NSAIDS, 아세트아미노펜, 글루코코르티코이드, 스테로이드 및 히알루론산을 사용하는 통증 관리를 종종 포함한다. 중간 정도에서 중증 형태의 관절염도 감염된 관절을 대체하거나, 통증을 유발할 수 있는 연골을 제거하는 수술로 치료될 수 있다(Kirkey et al., N Engl J Med 359: 1097-1107, 2008). 본 명세서의 CNP 변이체는 본 명세서에 기술되거나 치료 담당의에게 공지된 바와 같은, 골관절염 치료에 일반적으로 사용되는 다른 치료법으로 투여될 수 있다.

CNP 변이체의 약학적 조성물

추가의 구현예에서, 본 발명은 CNP 변이체, 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물의 용도를 고려한다. 특정 구현예에서, 본 조성물은 하나 이상의 다른 생물학적 활성제(예를 들어, 프로테아제의 억제제, 수용체 티로신 키나아제 및/또는 간극 수용체 NPR-C)를 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 조성물은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 순도의 목적하는 CNP 변이체를 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 다른 포유동물(예를 들어, 인간) 단백질 및 다른 CNP 변이체와 같은 거대분자 오염물질을 약 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 0.5% 미만으로 함유한다.

부형제, 담체 및 희석제의 비-제한적인 예는 비히클, 액체, 완충액, 등장 제, 첨가제, 안정화제, 방부제, 가용화제, 계면활성제, 유화제, 습윤제, 보조제 등을 포함한다. 상기 조성물은 액체(예를 들어, 물, 에탄올); 다양한 완충액 함량(예를 들어, Tris-HCl, 인산염, 아세테이트 완충액, 시트레이트 완충액), pH 및 이온 강도의 희석제; 세제 및 가용화제(예를 들어, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80); 항산화제(예를 들어, 메티오닌, 아스코르브산, 소듐 메타비설파이트); 방부제(예를 들어, 티메로솔, 벤질 알콜, m-크레졸); 및 벌킹 물질(예를 들어, 락토오스, 만니톨, 수크로스)을 함유할 수 있다. 약학적 조성물의 제형에서 부형제, 희석제 및 담체의 사용은 당 분야에 공지되어있으며; 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th Edition, pages 1435-1712, Mack Publishing Co.(Easton, Pennsylvania(1990))를 참조하며, 이는 본 명세서에 참고로 전문통합된다.

예를 들어, 담체는 희석제, 비히클 및 보조제뿐만 아니라 임플란트 담체, 및 활성 성분(들)과 반응하지 않는 비활성, 무독성 고형 또는 액상 충전제 및 캡슐화 물질을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 담체의 비-제한적인 예는 인산염 완충 식염수, 생리 식염수, 물 및 유화액(예를 들어, 오일/물 에멀젼)을 포함한다. 담체는 예를 들어 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 식물성 오일 및 이들의 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다.

일부 구현예에서, 조성물은 액체 제형이다. 특정 구현예에서, 제형은 약 0.1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml, 또는 약 0.5 mg/ml 내지 약 20 mg/ml, 또는 약 1 mg/ml 내지 20 mg/ml, 또는 약 0.1 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 또는 약 0.5 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 또는 약 1 mg/ml 내지 약 10 mg/ml 범위의 농도의 CNP 변이체를 포함한다.

추가의 구현예에서, 조성물은 CNP-함유 용액 또는 현탁액의 pH를 원하는 범위 내로 유지시키기 위해 완충 용액 또는 완충제를 포함한다. 완충 용액의 비-제한적인 예는 인산 완충 식염수, 트리스 완충 식염수 및 행크 완충 식염수를 포함한다. 완충제는 아세트산 나트륨, 인산 나트륨 및 시트르산 나트륨을 제한없이 포함한다. 완충제의 혼합물도 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 완충제는 아세트산/아세테이트 또는 시트르산/시트레이트이다. 조성물에 적합한 완충제의 양은 사용된 특정 완충액 및 용액 또는 현탁액의 원하는 pH에 부분적으로 의존한다. 예를 들어, 아세테이트는 pH 6에서보다 pH 5에서 더 효율적인 pH 완충액이므로, pH 6에서보다 pH 5의 용액에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 완충제의 농도는 약 10 mM ± 5 mM이다. 특정 구현예에서, 조성물의 pH는 약 pH 3 내지 약 pH 7.5, 또는 약 pH 3.5 내지 약 pH 7, 또는 약 pH 3.5 내지 약 pH 6.5, 또는 약 pH 4 내지 약 pH 6, 또는 약 pH 4 내지 약 pH 5이거나, 또는 약 pH 5.0 ± 1.0이다.

다른 구현예에서, 조성물은 용액 또는 현탁액을 등장성으로 하고, 주사에 보다 양립시키기 위해 등장성-조절제를 함유한다. 등장성 제제의 비-제한적인 예는 NaCl, 덱스트로스, 글루코스, 글리세린, 소르비톨, 자일리톨 및 에탄올을 포함한다. 특정 구현예에서, 등장성 제제는 NaCl이다. 특정 구현예에서, NaCl의 농도는 약 160 ± 20 mM, 또는 약 140 mM ± 20 mM, 또는 약 120 ± 20 mM, 또는 약 100 mM ± 20 mM, 또는 약 80 mM ± 20 mM, 또는 약 60 mM ± 20 mM이다.

다양한 구현예에서, 조성물은 방부제를 포함한다. 방부제는 m-크레졸 및 벤질 알콜을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 방부제의 농도는 약 0.4% ± 0.2%, 또는 약 1% ± 0.5%, 또는 약 1.5% ± 0.5%, 또는 약 2.0% ± 0.5%이다.

다양한 구현예에서, 조성물은 (예를 들어, 유리 또는 플라스틱에 대한 CNP 변이체의 흡착을 완화시키기 위한) 항-흡착제를 함유한다. 항-흡착제는 벤질 알콜, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80을 제한없이 포함한다. 특정 구현예에서, 항-흡착제의 농도는 약 0.001% 내지 약 0.5%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.5%, 또는 약 0.1% 내지 1%, 또는 0.5% 내지 1%, 또는 0.5% 내지 1.5%, 또는 0.5% 내지 2%, 또는 1% 내지 2%이다.

다양한 구현예에서, 조성물은 안정화제를 포함한다. 안정화제의 비-제한적인 예는 글리세린, 글리세롤, 티오글리세롤, 메티오닌 및 아스코르브산 및 그의 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 안정화제가 티오글리세롤 또는 아스코르브산 또는 그의 염인 경우, 안정화제의 농도는 약 0.1% 내지 약 1%이다. 다른 구현예에서, 안정화제가 메티오닌인 경우, 안정화제의 농도는 약 0.01% 내지 약 0.5%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.2%이다. 또 다른 구현예에서, 안정화제가 글리세린인 경우, 안정화제의 농도는 약 5% 내지 약 100%(순수)이다.

다양한 구현예에서, 조성물은 항산화제를 함유한다. 예시적인 항산화제는 메티오닌 및 아스코르브산을 제한없이 포함한다. 특정 구현예에서, CNP 변이체에 대한 항산화제의 몰비는 약 0.1:1 내지 약 15:1, 또는 약 1:1 내지 약 15:1, 또는 약 0.5:1 내지 약 10:1, 또는 약 1:1 내지 약 10:1, 또는 약 3:1 내지 약 10:1이다.

무기산 염(예를 들어, 염산염, 브롬화수소산염, 인산염, 황산염), 유기산 염(예를 들어, 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트, 메실레이트, 토실레이트) 및 아민 염(예를 들어, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디시클로헥실아민, 디에탄올아민)을 제한없이 포함하는 약학적으로 허용가능한 염이 조성물에 사용될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염의 철저한 논의는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th Edition, Mack Publishing Company, (Easton, Pennsylvania (1990))에서 찾아볼 수 있다.

약학적 조성물은 정제, 캡슐, 과립, 분말, 용액, 현탁액, 에멀젼, 연고 및 경피 패치와 같은 다양한 형태로 투여될 수 있다. 조성물의 투여 형태는 조성물의 바람직한 투여 방식에 맞추어질 수 있다. 경구 투여의 경우, 조성물은 예를 들어 정제 또는 캡슐(소프트 겔 캡슐 포함)의 형태를 취할 수 있거나, 예를 들어 수성 또는 비 수성 용액, 현탁액 또는 시럽일 수 있다. 경구 투여용 정제 및 캡슐은 하나 이상의 통상 사용되는 부형제, 희석제 및 담체, 예컨대 만니톨, 락토오스, 글루코스, 수크로스, 전분, 옥수수 전분, 나트륨 사카린, 탈크, 셀룰로스, 탄산 마그네슘 및 윤활제(예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 스테아릴 푸마레이트)를 포함할 수 있다. 원한다면, 향료, 착색제 및/또는 감미제가 고체 및 액체 제형에 첨가될 수 있다. 경구 제형을 위한 다른 임의의 성분은 보존제, 현탁제 및 증점제를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 경구용 제형은 또한 위장의 산성 환경으로부터 CNP 변이체를 보호하기 위해 장용 코팅을 가질 수 있다. 고체 및 액체 투여 형태를 제조하는 방법은 당업자에게 공지되어 있거나 명백할 것이다(예를 들어, 상기 언급된 Remington's Pharmaceutical Sciences 참조).

비경구 투여용 제형은 예를 들어, 액체 용액 또는 현탁액으로서, 주사 전에 액체 매질에서의 가용화 또는 현탁에 적합한 고체 형태로서, 또는 에멀젼으로서 제조될 수 있다. 예를 들어, 멸균 주사가능한 용액 및 현탁액은 적합한 희석제, 담체, 용매(예를 들어, 완충된 수용액, 링거액, 등장성 염화나트륨 용액), 분산제, 습윤제, 유화제, 현탁화제 등을 사용하여 당 분야에 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 또한, 멸균 고정 오일, 지방 에스테르, 폴리올 및/또는 다른 불활성 성분이 사용될 수 있다. 추가의 예로서, 비경구 투여를 위한 제형은 항산화제, 완충액, 정균제, 및 제형을 의도된 수용체의 혈액과 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 무균 주사 용액; 및 현탁화제 및 증점제를 함유할 수 있는 수성 및 비 수성 무균 현탁액을 포함한다.

예시적인 CNP 제형은 미국 특허 제8,198,242호 및 제8,598,121호에 기술되어있다. 약 4 내지 약 6 범위의 pH를 갖는 CNP 제형의 사용이 고려된다.

다양한 구현예에서, CNP 변이체는 골관절염 또는 골관절염 증상에 의해 영향을 받는 대상체에게 투여하기 위해 약학적 담체에 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, CNP 변이체의 액체 제형은 하기 기술된 성분 및 이들의 양 또는 농도의 임의의 조합에 따라 제형화된다:

¹글리세린은 CNP 변이체의 물에 의한 가수분해, 탈아미드화, 이성질체화 또는 절단을 최소화하거나 방지하기 위해 사용된다. 동결건조된 제형의 경우, 4-6% 또는 6-20%의 만니톨 또는 수크로스가 NaCl을 대체할 수 있다.

CNP 변이체를 포함하는 조성물은 또한 동결건조된 제형일 수 있다. 특정 구현예에서, 동결건조된 제형은 완충제 및 벌킹제, 및 선택적으로 항산화제를 포함한다. 예시적인 완충제는 아세테이트 완충액 및 시트레이트 완충액을 제한없이 포함한다. 예시적인 벌킹제는 만니톨, 수크로스, 덱스트란, 락토오스, 트레할로스 및 포비돈(PVP K24)을 제한없이 포함한다. 특정 구현예에서, 만니톨은 약 3% 내지 약 10%, 또는 약 4% 내지 약 8%, 또는 약 4% 내지 약 6%의 양으로 존재한다. 특정 구현예에서, 수크로스는 약 6% 내지 약 20%, 또는 약 6% 내지 약 15%, 또는 약 8% 내지 약 12%의 양으로 존재한다.

다양한 구현예에서, CNP 변이체의 동결건조된 제형은 하기 기술된 성분 및 이들의 양 또는 농도의 임의의 조합에 따라 제형화된 제형으로부터 제조된다:

¹글리세린은 CNP 변이체의 물에 의한 가수분해, 탈아미드화, 이성질체화 또는 절단을 최소화하거나 방지하기 위해 사용된다.

다양한 구현예에서, CNP 변이체를 포함하는 제형은 약 3 내지 7, 또는 약 3 내지 6, 또는 약 3.5 내지 6.5, 또는 약 4 내지 6, 또는 약 4 내지 5, 또는 약 4.5 내지 5.5의 pH를 가진다. 일부 구현예에서, pH 4 내지 5.5의 경우, 적합한 완충제는 아세트산/아세테이트(예를 들어, 아세트산 나트륨)이고, pH 5.5 내지 6의 경우, 적합한 완충제는 시트르산/시트레이트이다. 시트르산/시트레이트(예를 들어, 시트르산 나트륨)는 또한 pH 3 내지 6 또는 pH 4 내지 6의 범위에 적합한 완충제이다. 특정 구현예에서, 완충제의 제형내 농도는 약 2 내지 50 mM, 또는 약 2 내지 40 mM, 또는 약 2 내지 30 mM, 또는 약 5 내지 30 mM, 또는 약 2 내지 20 mM, 또는 약 5 내지 20 mM 또는 약 5 내지 15 mM이다.

CNP 변이체의 탈아미드화를 최소화하거나 회피하기 위해, 상기 변이체는 글리세린, 에탄올 및 프로필렌 글리콜과 같은 약학적으로 허용가능한 유기 공용매 내에서 제형화될 수 있다. 탈아미드화는 가수분해에 의해 발생하기 때문에, 물에 대한 유기 공용매의 치환은 CNP 변이체와 물의 접촉을 최소화한다. 유기-수성 용매 시스템 내 하나 이상의 유기 용매의 농도는 물을 사용하지 않는 경우, 예를 들어 약 10% 내지 약 99%, 또는 약 100%일 수 있다.

또한, CNP 변이체의 탈아미드화를 최소화하거나 회피하기 위해, 동결건조에 의해 제형으로부터 물을 제거할 수 있다. 일부 구현예에서, 동결건조된 제형은 하기 성분들의 임의의 조합을 함유한다: 완충액: 아세트산 나트륨 및 아세트산, 또는 시트르산 나트륨 및 시트르산; 등장성/벌킹제: 만니톨(예를 들어, 3 내지 10%, 2 내지 8% 또는 4 내지 6%); 수크로스(예를 들어, 6 내지 20%, 5 내지 15% 또는 8 내지 12%); 항산화제: 약 0.1:1 내지 약 1:1, 또는 약 0.5:1 내지 약 5:1, 또는 약 1:1 내지 약 15:1, 또는 약 1:1 내지 약 10:1, 또는 약 3:1 내지 약 10:1의 각 산화방지제 대 CNP 변이체의 몰 비율을 갖는 메티오닌 및/또는 아스코르브산.

탈아미드화는 또한 보다 낮은 온도, 예컨대 약 5℃, 0℃, -10℃, -20℃, -30℃, -40℃, -50℃, -60℃, -70℃, -80℃, -90℃ 또는 -100℃에서 CNP 조성물(예를 들어, 액상 제형 또는 동결건조 제형)을 저장함으로써 최소화되거나 회피될 수 있다.

CNP 변이체에서 산화가능한 잔기(예를 들어, 메티오닌)의 산화를 최소화하거나 회피하기 위해, 상기 변이체는 하나 이상의 항산화제와 제형화될 수 있다. 예시적인 항산화제는 메티오닌, 아스코르브산 및 티오글리세롤을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 메티오닌 잔기의 산화는 또한 질소 또는 아르곤으로 액체 매질(액체 제형인 경우)로부터 산소를 퍼징함으로써 및/또는 용기로부터 산소를 퍼징함으로써 또는 질소 또는 아르곤으로 포장함으로써 최소화 또는 방지될 수 있다.

일부 구현예에서, 흡착(예를 들어, 플라스틱 또는 유리에 대한 CNP 변이체의 흡착)을 최소화 또는 방지하기 위해, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 또는 벤질 알콜, 또는 이들의 조합을 CNP 제형에 첨가한다. 특정 구현예에서, 항-흡착제(들) 각각의 농도는 약 0.001% 내지 약 0.5%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.5%, 또는 약 0.1% 내지 약 1%, 또는 약 0.5% 내지 약 1%, 또는 약 0.5% 내지 약 1.5%, 또는 약 0.5% 내지 약 2%, 또는 약 1% 내지 약 2%이다. 제형 내의 항-흡착제(들)의 예시적인 범위는 약 0.001% 내지 약 0.5%의 폴리소르베이트 20, 약 0.001% 내지 약 0.5%의 폴리소르베이트 80 및/또는 약 0.5% 내지 약 1.5%의 벤질 알콜을 제한없이 포함한다.

특정 구현예에서, 액체 CNP 제형이, (1) 약 30 mM ± 5 또는 10 mM의 완충제의 농도 및 약 4 ± 0.5 또는 1의 pH를 갖는 아세트산/아세테이트(예를 들어, 아세트산 나트륨) 완충액, 및 (2) 약 1% ± 0.5%의 농도의 벤질 알콜(예를 들어, 방부제 및/또는 항-흡착제), 및 선택적으로 (3) 약 10% ± 5%의 농도의 수크로스를 포함하는 제형을 포함하거나, 또는 이를 포함하는 제형으로부터 동결건조된 CNP 제형이 제조된다.

본 발명은 또한 액체(예를 들어, 멸균 주사용) 제형 또는 고체(예를 들어, 동결건조된) 제형을 포함하는, 예를 들어, 병, 바이알, 앰플, 튜브, 카트리지 및/또는 주사기를 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 주사용 주사기 또는 농축액을 보다 낮은 농도로 희석시키기 위한 주사기에서 동결건조된 제제를 재구성하는 것을 제한없이 포함하는, 고체(예를 들어, 동결건조된) 제형을 (예를 들어, 주사에 의해) 투여하기 위한 투여용 용액 또는 현탁액으로 재구성하기 위한 약학적으로 허용가능한 비히클 또는 담체(예를 들어, 용매, 용액 및/또는 완충액)를 함유할 수 있다. 또한, 즉석 주사 용액 및 현탁액은 예를 들어 CNP-함유 조성물을 포함하는 멸균 분말, 과립 또는 정제로부터 제조될 수 있다. 키트는 에어로졸 또는 주사 투여 장치, 펜 주사기, 자동 주사기, 바늘없는 주사기, 주사기 및/또는 바늘과 같은 투여 장치를 포함할 수도 있다.

비-제한적인 예로서, 키트는 단일 챔버 또는 이중 챔버를 갖는 주사기를 포함할 수 있다. 단일-챔버 주사기의 경우, 단일 챔버는 주사 용액 또는 현탁액으로 재구성될 수 있는 비교적 소량의 적당한 용매 시스템(예를 들어, 글리세린)에 주사를 위해 준비된 액체 CNP 제형, 또는 CNP 변이체의 고체(예를 들어, 동결건조된) CNP 제형 또는 액체 제형을 함유할 수 있다. 이중-챔버 주사기의 경우, 하나의 챔버는 약학적으로 허용가능한 비히클 또는 담체(예를 들어, 용매계, 용액 또는 완충액)를 함유할 수 있으며, 다른 챔버는 주사를 위해, 제1 챔버로부터의 비히클 또는 담체를 사용하여 용액 또는 현탁액으로 재구성될 수 있는 비교적 소량의 적당한 용매 시스템(예를 들어, 글리세린)에 CNP 변이체의 고체(예를 들어, 동결건조된) CNP 제형 또는 액체 제형을 함유할 수 있다.

추가 예로서, 키트는 하나 이상의 펜 주사기 또는 자동 주사기 장치 및 이중-챔버 카트리지를 포함할 수 있다. 카트리지의 하나의 챔버는 약학적으로 허용가능한 비히클 또는 담체(예를 들어, 용매계, 용액 또는 완충액)를 함유할 수 있고, 다른 챔버는 주사를 위해, 제1 챔버로부터의 비히클 또는 담체를 사용하여 용액 또는 현탁액으로 재구성될 수 있는 비교적 소량의 적당한 용매 시스템(예를 들어, 글리세린)에 CNP 변이체의 고체(예를 들어, 동결건조된) CNP 제형 또는 액체 제형을 함유할 수 있다. 카트리지는 원하는 기간(예를 들어, 1일, 2일, 3일, 1주, 2주, 3주, 4주 등)에 걸쳐 투여하기에 충분한 양의 CNP 변이체를 포함할 수 있다. 펜 주사기 또는 자동 주사기는 카트리지로부터 원하는 양의 CNP 제형을 투여하도록 조정될 수 있다.

또한, CNP 변이체를 포함하는 약학적 조성물은 원하는 기간, 예컨대 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월 또는 3개월에 걸쳐 비교적 일정한 수준의 투여량을 유지하기 위한 서방성, 제어 방출 또는 지효성 시스템으로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 서방성, 제어 방출 및 지효성 제형은 {예를 들어, 친수성 중합체[예를 들어, 폴리락티드, 폴리글리콜라이드, 폴리(락티드-글리콜라이드)]를 포함할 수 있는} 예를 들어, 생분해성 중합체 시스템을 사용하여 제조될 수 있으며, 당 분야에 공지된 바와 같이, 예를 들어, 미립자, 마이크로스피어 또는 리포솜의 형태를 취할 수 있다.

투여량 및 투여 빈도

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 활성제(예를 들어, CNP 변이체)의 "치료적 유효량"이란 용어는 환자에게 치료 효과를 제공하는 양을 지칭한다. 상기 양은 개인마다 다를 수 있으며, 환자의 전반적인 신체 상태를 포함하여 여러 가지 요인에 따라 달라질 수 있다. CNP 변이체의 치료적 유효량은 대중적으로 이용가능한 재료 및 절차를 사용하여 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다. 예를 들어, 치료에 사용되는 CNP 변이체의 양은 연골 퇴행의 반전 또는 연골 성장의 증가를 허용하는 수준을 제공해야 한다.

특정 대상체에 대한 투여 빈도는 치료되는 장애 및 치료에 대한 개체의 상태 및 반응을 비롯한 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다. 특정 구현예에서, CNP 변이체를 함유하는 약학적 조성물은 1일에 약 1회, 2일에 1회, 3일에 1회, 또는 주 1회, 주 2회, 주 3회, 2주일에 1회, 또는 매월 대상체에게 투여된다.

본 명세서에서 사용하기 위해 고려되는 CNP 변이체는 골관절염 및 골관절염-관련 증상을 갖는 다른 상태를 치료, 개선 또는 예방하기 위한 치료적 유효량으로 환자에게 투여될 수 있다. CNP 변이체의 안전성 및 치료 효능은 세포 배양 또는 실험 동물에서의 표준 약리학적 절차에 의해, 예컨대 예를 들어, LD₅₀(집단의 50%에 치사되는 투여량) 및 ED₅₀(집단의 50%에서 치료 효과가 있는 투여량)을 측정함으로써, 측정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 간의 투여 비율은 치료 지수이며, LD₅₀/ED₅₀ 비율로 표현할 수 있다. 일반적으로 큰 치료 지수를 나타내는 활성제가 바람직하다.

세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에서 사용하기 위한 투여량 범위를 공식화하는 데 사용될 수 있다. 투여량은 일반적으로 독성이 거의 없거나 적은 ED₅₀을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 투여량은 사용된 투여 형태 및 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 변할 수 있다. 치료 유효량은 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 결정될 수 있다.

특정 구현예에서, 본 명세서에 기술된 CNP 변이체는 약 5 또는 10 nmol/kg 내지 약 300 nmol/kg, 또는 약 20 nmol/kg 내지 약 200 nmol/kg 범위의 투여량으로 투여된다. 일부 구현예에서, CNP 변이체는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 175, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750 또는 2000 nmol/kg의 투여량 또는 치료 의사가 적당하다고 간주하는 다른 투여량으로 투여된다. 다른 구현예에서, CNP 변이체는 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000 μg/kg, 또는 약 1, 1.25, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 또는 10 mg/kg의 투여량 또는 치료 의사가 적당하다고 간주하는 다른 투여량으로 투여된다. 본 명세서에 기술된 CNP 변이체의 투여량은 매일, 주 2회 또는 3회, 매주, 매 2주마다, 매 3주마다, 매월 등을 제한없이 포함하여, 본 명세서에 기술된 투약 빈도/투여 빈도에 따라 투여될 수 있다.

특정 대상체에 대한 CNP 변이체의 투약/투여 빈도는 치료되는 장애 및 치료 대상체의 상태 및 반응을 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다. CNP 변이체는 단일 용량으로 또는 투약마다 다중 용량으로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, CNP 변이체는 단일 용량 또는 다중 용량으로, 매일, 격일로, 3일마다, 주 2회, 주 3회, 매주, 격주로, 3주마다, 매월, 6주마다, 2개월마다, 3개월마다, 또는 치료 의사가 적절하다고 판단한 경우 투여된다.

일부 구현예에서, CNP 변이체는 성장 기간(예를 들어, 연골 형성)이 가능하게끔 회복 기간이 뒤따르도록 투여된다. 예를 들어, CNP 변이체는 정맥내, 피하, 관절내 또는 매일 다른 모드로, 또는 일주일에 여러 번 일정시간 동안 투여한 후, 치료하지 않는 기간을 두고 사이클을 반복한다. 일부 구현예에서, 치료의 초기 기간(예컨대, 매일 또는 1주일에 여러번 CNP 변이체 투여)은 3일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주 또는 12주이다. 관련된 구현예에서, 무 처리 기간은 3일, 1주, 2주, 3주 또는 4주간 지속된다. 특정 구현예에서, CNP 변이체의 투여 요법은 3일 동안 매일, 이어서 3일간 중단되고; 또는 1주일간 매일 또는 1주일에 여러번, 이어서 3일 또는 1주일간 중단되고; 또는 2주일간 매일 또는 1주일에 여러번, 이어서 1 또는 2주간 중단되고; 또는 2주일간 매일 또는 1주일에 여러번, 이어서 1, 2 또는 2주간 중단되고; 또는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12주간 매일 또는 1주일에 여러번, 이어서 1, 2, 3 또는 4주간 중단된다.

투여 모드

CNP 변이체 또는 이들을 포함하는 약학적 조성물은 예를 들어, 피하, 관절내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피부내 또는 경막내 주사와 같은 다양한 방법으로 대상체에게 투여될 수 있다. 일 구현예에서, CNP 변이체는 하루에 1회, 2일에 1회, 3일에 1회 또는 일주일에 1회, 단일 피하, 관절내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피부내 또는 경막내 주사에 의해 투여된다.

CNP 변이체는 또한 질병 부위 또는 그 근처에서의 직접 주사에 의해 투여될 수 있다. 또한, CNP 변이체는 표적 작용 부위(예를 들어, 비정상적 또는 퇴행성 관절 또는 연골 영역)에서 저장소를 이식함으로써 투여될 수 있다. 대안적으로, CNP 변이체는 혀(예를 들어, 설하 정제) 또는 폐 흡입(예를 들어, 흡입기 또는 에어로졸 스프레이), 비강 내로의 전달(예를 들어, 비내 스프레이), 눈(예를 들어, 점안제)으로의 전달에 의해, 또는 경피 전달(예를 들어, 피부 패치에 의해)에 의해 투여될 수 있다. CNP 변이체는 또한 마이크로스피어, 마이크로캡슐, 리포솜(하전되지 않거나 하전된(예를 들어, 양이온)), 중합체성 미립자(예를 들어, 폴리아미드, 폴리락티드, 폴리글리콜라이드, 폴리(락티드-글리콜라이드)), 마이크로에멀젼 등의 형태로 경구 투여될 수도 있다.

추가 투여 방법은 삼투압 펌프(예를 들어, Alzet 펌프) 또는 미니-펌프(예를 들어, Alzet 미니-삼투압 펌프)에 의해 이루어지며, 예정된 기간 동안 CNP 변이체 또는 약학적 조성물의 제어된, 연속적 및/또는 서방성 전달을 허용한다. 삼투압 펌프 또는 미니-펌프는 피하 또는 표적 부위 부근(예를 들어 사지의 긴 뼈, 골단 등)에 이식될 수 있다.

CNP 변이체 또는 이의 조성물이 다른 방식으로 투여될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. CNP 변이체 또는 이의 조성물의 가장 효과적인 투여 방식의 결정은 당업자의 기술 범위 내에 있다.

CNP 변이체는 예를 들어 경구(협측 및 설하 포함), 직장, 비강, 국소, 폐, 질 또는 비경구(근육내, 동맥내, 경막내, 피하, 관절내 및 정맥내 포함) 투여에 적합한 약학적 제형으로서, 또는 흡입 또는 통기에 의한 투여에 적합한 형태로 투여될 수 있다. 의도된 투여 방식에 따라, 약학적 제형은 고체, 반고체 또는 액체 투여 형태, 예컨대 정제, 좌약, 환제, 캡슐, 분말, 액체, 현탁액, 에멀젼, 크림, 연고, 로션 등의 형태일 수 있다. 제형은 정확한 투여량의 단일 투여에 적합한 단위 투여 형태로 제공될 수 있다. 상기 제형은 유효량의 CNP 변이체, 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체 및/또는 희석제 및 선택적으로 하나 이상의 다른 생물학적 활성제를 포함한다.

조합 요법

일 구현예에서, CNP 변이체는 골관절염의 치료, 개선 또는 예방에 유용한 하나 이상의 다른 활성제와 조합하여 사용될 수 있다. 다른 활성제는 CNP 변이체의 효과를 향상시킬 수 있고, 및/또는 CNP 변이체 이외의 다른 약리학적 효과를 발휘할 수 있다. 본 명세서에 기술된 CNP 변이체와 조합하여 사용될 수 있는 활성제의 비-제한적인 예는 펩티다아제 및 프로테아제(예를 들어, NEP 및 퓨린), NPR-C 및 티로신 키나아제(예를 들어, FGFR-3)의 다른 나트륨이뇨 펩타이드(예를 들어, BNP) 및 억제제(예를 들어, 길항제)이다. NEP 억제제의 예로는 티오르판(thiorphan) 및 칸독사트릴(candoxatril)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. NPR-C 억제제의 공동 사용은 또한 NPR-C에 의한 변이체 제거의 억제를 통한 CNP 변이체의 반감기를 연장시킬 수 있다.

CNP 변이체는 소염제, 또는 통증 완화제, 예컨대 항염증제, NSAID, 코르티코스테로이드 및 히알루론산과 조합하여 투여될 수 있다.

조합 요법에서 적당한 치료 결과를 달성하기 위해, 일반적으로 목적하는 치료 결과(예를 들어, 회복된 연골 또는 감소된 연골 퇴행)를 생성시키는 데 효과적인 조합량으로 CNP 조성물 및 다른 치료제를 대상체에게 투여할 것이다. 이 과정은 CNP 조성물 및 다른 치료제(들)를 동시에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 동시 투여는 CNP 변이체 및 다른 치료제(들) 모두를 포함하는 단일 조성물 또는 약리학적 단백질 제형을 투여함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 다른 치료제(들)는 CNP 변이체의 약리학적 제제(예를 들어, 정제, 주사 또는 음료)와 거의 동시에 별도로 섭취될 수 있다. CNP 변이체는 또한 브라우니, 팬케이크 또는 케익과 같은 식료품으로 섭취할 수 있다.

다른 대안에서, CNP 변이체의 투여는 수분 내지 수 시간 범위의 간격으로 다른 치료제(들)의 투여를 선행시키거나 따라갈 수 있다. 다른 치료제(들) 및 CNP 조성물이 별도로 투여되는 구현예에서, 일반적으로 CNP 변이체 및 다른 치료제(들)가 서로의 적당한 시간 내에 투여되어, CNP 변이체 및 다른 치료제(들)는 환자에게 유익한 효과를 상승적으로 또는 부가적으로 발휘할 수 있다. 예를 들어, 다른 치료제(들)의 약 0.5 내지 6 시간(전 또는 후) 내에 CNP 조성물을 투여할 수 있다. 일 구현예에서, CNP 조성물은 다른 치료제(들)의 약 1 시간 이내에(전 또는 후에) 투여된다.

환자 집단 확인 및 모니터링

프로토콜은 CNP 치료에 적합한 대상체를 확인하기 위해 확립될 수 있다. 예를 들어, 적당한 환자는 관절천자/활액 분석, X-선 및/또는 MRI 기술을 사용하여 확인될 수 있다. 주어진 환자가 CNP 치료에 반응하는지 여부를 결정하기 위한 프로토콜을 설정할 수도 있다. 예를 들어, 골관절염 치료를 위해 연골 성장 측정 및 이동성 평가와 같은 성장 지표를 측정할 수 있다.

하나의 CNP 신호전달 마커는 cGMP(구아노신 3',5' 사이클릭 모노포스페이트)이다. 이 세포내 신호전달 분자의 수준은 CNP가 동족 수용체인 NPR-B에 결합하여 이를 활성화시킨 후에 증가한다. cGMP의 높은 수준은 CNP 노출 후 세포 배양 추출물(시험관내)로부터 측정될 수 있으며, CNP 노출 후 뼈 외식(ex-plant) 연구(생체외)로부터 배지를 조건화시키고, 및 CNP 투여 후 몇 분 내에 혈장내(생체내) 피하로, 정맥내로 또는 당 분야에 공지된 다른 투여 경로를 통해 투여될 수 있다.

CNP 효능을 평가하기 위해 연골-특이적 피분석물(또는 연골-관련 마커) 또한 측정될 수 있다. 예를 들어, 절단된 II형 콜라겐의 단편은 연골 전환(turnover)에 대한 연골-특이적 마커이다. II형 콜라겐은 연골의 주요 유기 구성성분이며, II형 콜라겐의 단편(절단된 콜라겐)은 순환으로 방출되고, 연골 전환에 따라 소변으로 분비된다. 연골 전환은 새로운 뼈 형성을 선행한다.

연골 형성 및 성장 또는 퇴행에 대한 다른 잠재적인 바이오마커는 아그레칸 콘드로이틴 설페이트(연골 전환에 대한 연골-특이적 마커), II형 콜라겐의 프로펩타이드(연골 형성에 대한 연골-특이적 마커, 증식성 세포핵 항원(PCNA), 아그레칸 콘드로이틴 설페이트, 신데칸-3 및 아넥신 VI을 포함한다. 연골-관련 바이오마커는 상업적으로 입수할 수 있는 키트를 사용하여, 예를 들어, 효능/약동학적 생체내 연구로부터의 혈청 및 생체외 연구의 조건화 배지로부터의 혈청에서 측정될 수 있다.

일 구현예에서, 생체내 연골 형성 및 성장에 대한 CNP 변이체의 영향을 모니터링하기 위해, CNP 변이체를 투여한 대상체에서 적어도 하나의 연골-관련 바이오마커의 수준이 분석되거나 측정된다. 예를 들어, 적어도 하나의 뼈- 또는 연골-관련 바이오마커의 수준 증가는 CNP 변이체의 투여가 뼈 성장에 긍정적인 효과를 가지며, 골격 형성 이상 및 기타 뼈- 또는 연골-관련 질환, 또는 CNP 활성 감소와 관련된 질병에 유용한 치료임을 나타낼 수 있다. 예시적인 연골-관련 바이오마커는 CNP(예를 들어, CNP의 내인성 수준), cGMP, II형 콜라겐의 프로펩타이드 및 그의 단편, II형 콜라겐 및 그의 단편, I형 콜라겐의 프로펩타이드 및 그의 단편, I형 콜라겐 및 그의 단편, 증식성 세포핵 항원(PCNA), 아그레칸 콘드로이틴 설페이트, 신데칸-3 및 아넥신 VI를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

다양한 구현예에서, 바이오마커는 CNP 변이체가 투여될, 투여되고 있는, 투여되어온 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득함으로써 측정된다. 바이오마커는 웨스턴 블롯, 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 및 효소 활성 분석을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는 당 분야에 공지된 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 소변 또는 기타 생물학적 체액일 수 있다.

본 발명의 추가적인 양태 및 세부 사항은 하기 실시예로부터 명백할 것이며, 이는 제한하기보다는 예시적인 것으로 의도된다.

F. 실시예

실시예 1

래트 골관절염 모델

275-300 g 래트에서 일측성 내측 반월판 파열은 연골세포 및 프로테오글리칸 손실, 피브릴화, 골증식체 형성 및 연골세포 클로닝을 특징으로 하는 급속 진행성 연골 퇴행을 초래할 것이다. 이 모델은 내측 측부 인대를 반월판에 부착한 직후에 절개하여, 관절 간격이 열리면 반월판이 대퇴부쪽으로 반사되도록 수행된다. 반월판은 경골 표면을 손상시키지 않고 결과적인 절개가 자유롭고 움직일 수 있는 전방 및 후방 반월판 반을 별도로 생성하도록 주의하면서 가장 좁은 지점(골반에서 멀리 떨어진 위치)에서 절단된다.

진행성 연골 퇴행성 변화가 발생하고 수술 후 3-6 주까지, 경골 연골 퇴행은 중간 및 내측 1/3에서 덜 중증인 퇴행성 변화와 함께 경골의 외부 1/3에 중심적으로 심각해질 수 있다. 골증식체는 궁극적으로 꽤 크고(내측 경골), 크기가 점차적으로 증가한다. 이 모델은 점진적이며, 거의 모든 래트에서 12개월 만에 전체 연골 손상(뼈가 마비된 상태까지)이 발생하며, 합리적으로 일관된 병변을 보인다. 래트는 수술 후 즉시 체중 부하를 재개하고, 보행 분석은 수술된 무릎의 하중 지지력의 변화가 거의 없음을 시사한다. 연골 퇴행의 급속한 진행으로 인해, 보호 효과가 경골 연골의 외부 1/3에서 항상 분명하지는 않으나, 구역 분석은 중간 및 내부 1/3에서의 치료 효과를 나타낼 수 있다. 가장 큰 심각도 병변의 영역에 인접한 중간 경골에서 실질적인 연골하 뼈 및 골단 뼈 변화가 발생한다. 이들은 뼈의 주위 경화와 함께 연골하 뼈로 작은 골절이 있는 석회화 연골 층의 증가된 호염기구 증가증에서 골단에서 뼈 흡수의 영역으로의 관절 연골의 명백한 붕괴에 이르기까지 크기와 유형이 다양하다. 따라서, 이 모델은 약물의 연골보호 효과뿐만 아니라 뼈 보존 활성을 평가할 수 있는 기회를 제공한다. 이 모델은 비교적 짧은 지속 시간을 가지며, 동물들은 수술에 대한 반응이 매우 일정하다.

이 래트 모델은 CNP가 관절 손상 또는 외상에 반응하여 전달되는 경우, 골관절염에서 연골 손상을 느리게 하거나 회복시키는 데 있어서 CNP 변이체의 효과를 결정하는 데 사용되었다. 이 모델에서는 연골 퇴행 및 골관절염을 유발하는 관절 손상을 유발하기 위해 반월판에 파열을 도입하였다(Janusz et al., Osteoarthritis Cartilage, 10: 785-791, 2002). 수컷 루이스(Lewis) 래트는 0일째에 일측성 내측 반월판 절제술을 받았으며; 대조군 비히클 또는 CNP 변이체 Gly-CNP-37의 투여가 7일째에 시작되었으며; 29일째에 그 동물을 안락사시켜 영향을 받는 관절의 조직병리학적 분석을 하였다. Gly-CNP-37(대조군 비히클에서 0.71 또는 2.2 mg/mL로 제공) 또는 대조군 비히클 단독이 관절내(IA) 주사를 통해 3주간 주당 3회(M, W, F) 투여되었다. 치료 효능은 무릎에서의 연골세포 죽음/연골 퇴행의 보행 분석 및 조직병리학적 검사로 평가하였다.

수술

특히, 수술 동물을 이소플루란으로 마취시키고, 오른쪽 무릎 및 하부 다리 영역을 수술을 위해 준비하였다. 반월판 파열의 경우, 무릎의 내측면에 피부 절개가 이루어졌고, 내측 측부 인대는 비절개박리로 노출된 후 절개되었다. 내측 반월판을 완전한 두께로 절단하여 완전한 파열을 모의실험하고, 상처를 봉합하였다. 수술 후 90분(90 min)후, 1% CMC(2 mL/kg, 50 mg/mL)의 아세트아미노펜의 용량(100 mg/kg, PO)으로 동물을 치료했다. (필요에 따라) 수술 후 24시간 동안 후속 투여를 하였다.

조직병리학

조직병리학적 분석을 위해, 안락사된 래트로부터 수술된 관절을 수확하였다. 5% 포름산 탈회제(decalcifier)에서 4-6일 후에, 상기 수술된 관절을 정면에서 두개의 대략 동일한 절반으로 절단하고, 파라핀에 매립한다. 약 160 μm 간격으로 각 수술된 오른쪽 무릎에서 절개부를 절단하고, 톨루이딘 블루로 염색하였다. 골관절염 발병에 대한 Gly-CNP-37의 영향을 평가하기 위해, 치료된 관절의 각각에 대해 다음 매개변수를 측정하거나 점수를 매기고, 비히클 처리된 대조군 관절과 비교하였다: 연골 퇴행, 병변 깊이, 병변 폭, 석회화 연골층 및 연골하 뼈 손상, 내경골 연골하/골단 소주 뼈 비대/경화증, 골증식체 두께, 콜라겐 손상, 성장판 두께 및 내측 측부 인대/활막 복원.

일부 매개변수(언급된 경우)에 대해, 경골 고평부를 가로지르는 지역적 차이는 각 절개부를 3개의 구역(1-외부, 2-중간, 3-내부)으로 분할함으로써 고려된다.

데이터는 Student's t-테스트 또는 Mann-Whitney U 테스트(비-매개변수)를 사용하여 분석되었다. 적절하다면, 데이터는 일원 분산 분석(1-way ANOVA) 또는 Kruskal-Wallis 테스트(비-매개변수)를 사용하여, 적당한 다중 비교 사후 테스트와 함께 모든 그룹에서 추가로 분석될 수 있다. 통계적 테스트는 데이터의 정규성과 변동 균질성에 관한 일정한 가정을 하고, 테스트가 이러한 가정을 위반하게 되면 추가 분석이 필요할 수 있다. 모든 검사에 대한 유의성은 p <0.05로 설정되었다.

내측 경골 및 대퇴부의 일반적인 연골 퇴행

연골세포 죽음/손실, 프로테오글라이칸(PG) 손실 및 콜라겐 소실 또는 피브릴화의 평가에 의해 각 관절에 대한 일반적인 연골 퇴행을 측정하고, 표 1에 제공된 바와 같이 점수를 매겼다.

연골 퇴행에 대한 조직병리학적 점수 판정 기준
점수	점수판정 기준
0	퇴행없음.
1	기질의 구역 5-10%내에서 최소 퇴행은 상당한 연골세포 손실(정상 세포 밀도의 50% 초과)의 결과로 생존할 수 없는 것으로 나타남. PG 손실은 이러한 세포 손실 영역에 보통 존재하며, 콜라겐 매트릭스 손실이 있을 수 있다.
2	기질의 구역 11-25%내에서 경미한 퇴행은 상당한 연골세포 손실(정상 세포 밀도의 50% 초과)의 결과로 생존할 수 없는 것으로 나타남. PG 손실은 이러한 세포 손실 영역에 보통 존재하며, 콜라겐 매트릭스 손실이 있을 수 있다.
3	기질의 구역 26-50%내에서 중간정도 퇴행은 상당한 연골세포 손실(정상 세포 밀도의 50% 초과)의 결과로 생존할 수 없는 것으로 나타남. PG 손실은 이러한 세포 손실 영역에 보통 존재하며, 콜라겐 매트릭스 손실이 있을 수 있다.
4	기질의 구역 51-75%내에서 현저한 퇴행은 상당한 연골세포 손실(정상 세포 밀도의 50% 초과)의 결과로 생존할 수 없는 것으로 나타남. PG 손실은 이러한 세포 손실 영역에 보통 존재하며, 콜라겐 매트릭스 손실이 있을 수 있다.
5	기질의 구역 76-100%내에서 중증의 퇴행은 상당한 연골세포 손실(정상 세포 밀도의 50% 초과)의 결과로 생존할 수 없는 것으로 나타남. PG 손실은 이러한 세포 손실 영역에 보통 존재하며, 콜라겐 매트릭스 손실이 있을 수 있다.

연골 퇴행에 대한 3-구역 합계가 각 구역에 대한 데이터를 나타낼뿐만 아니라 계산되었다. 저용량(35.5 μg/투여량) 또는 고용량(110 μg/투여량)의 Gly-CNP-37로 처리한 래트는 치료하지 않은 대조군 래트와 비교하여 경골에서 연골 퇴행이 유의하게 감소되었다(도 1).

내측 경골 병변 깊이와 폭

임의의 유형의 병변의 깊이(병변 깊이) 및 타이드마크 깊이(전체 깊이)는 경골 고평부 영역의 3개의 구역 각각에서 가장 큰 병변의 중증도 영역에서 접안 마이크로미터로 측정되었다. 이 측정들로부터 병변 깊이를 전체 깊이로 나눔으로써 각 관절에 대한 깊이 비율이 계산되었다. 타이드마크의 전체 깊이는 구역의 중간 지점에서 측정할 때 아나볼릭(anabolics)을 비교하기 위해 3개의 구역 각각에서 연골 두께의 평균 척도로 사용될 수 있다. 도 2는 비히클 처리 대조군과 비교하여 Gly-CNP-37 처리군에서 깊이 비율이 개선되었음을 보여준다. 접안 마이크로미터에 의해 측정된 임의의 퇴행(세포 손실, 프로테오글리칸 손실, 또는 콜라겐 손상)으로 인해 영향을 받은 연골의 폭 또한 CNP 투여군에서 개선되었다(도 3). 이 측정은 표면을 가로지르는 인접한 연골 퇴행(외측 1/3)이 있는 골증식체의 기원으로부터 접선 층과 기저 연골이 조직학적으로 정상인 것으로 나타나는 지점까지 확장된다.

실질적인 연골 퇴행은 접안 마이크로미터에 의해 측정된 연골 두께의 50% 초과로 연장되는 연골세포 및 프로테오글리칸 손실로 정의된다. 전형적으로, 이 모델에서 콜라겐 손상은 경도(~ 25% 깊이로 정의됨) 이상이지만, 연골세포 및 프로테오글리칸 손실은 상당하며, 영구적인 구조적 변화가 일어나는 영역을 나타내는 연골 깊이의 적어도 50% 이상으로 확장된다. 상당한 연골 퇴행을 나타내는 수술된 관절의 폭을 Gly-CNP-37 처리된 동물 및 비히클 처리 대조군에서 측정하여 상당한 퇴행을 감소시키는 CNP 변이체의 능력을 평가하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 비히클 처리된 대조군은 퇴행 폭의 감소를 거의 보이지 않았으며, Gly-CNP-37 처리된 동물은 상당한 경골 연골 퇴행에서 50% 초과의 개선을 보였다.

석회화된 연골 층 및 연골하 뼈 손상

석회화 연골 층 및 연골하 뼈에 대한 손상을 표 2의 기준을 사용하여 점수매겼다.

연골 층 및 연골하 뼈 손상에 대한 조직병리학적 점수판정 기준.
점수	점수판정 기준
0	변화없음.
1	타이드마크에서 증가된 호염기구증가증,타이드마크 분열 없음, 골수 변화가 없거나, 최소한이고 집중적인 경우, 타이드마크 선폭의 10% 미만에 영향을 준다.
2	타이드마크에서 증가된 호염기구증가증,타이드마크의 석회화 연골의 최소 내지 경미한 병변 분열은 타이드마크의 선형 폭의 약 1 내지 10%에 영향을 미침, 골수내 중간엽 변화는 전체 면적의 1/4 이하를 차지하지만, 일반적으로 병변아래 연골하 영역으로 국한되고, 골단 뼈로의 연골 붕괴 없음.
3	타이드마크에서 증가된 호염기구증가증, 석회화 연골/연골하 뼈(다병변성)의 경미한 내지 중간정도의 병변 또는 다병변성 분열은 타이드마크의 선형 폭의 약 11 내지 25%에 영향을 미침, 골수내 중간엽 변화는 전체 면적의 3/4 이하를 차지하며, 골수 연골형성의 면적은 200 μm 미만의 깊이의 골단 뼈로의 관절 연골의 병변 붕괴에 의해 입증될 수 있음.
4	타이드마크에서 증가된 호염기구증가증, 석회화 연골/연골하 뼈의 뚜렷한 내지 심각한 분열 및 또는 손실은 타이드마크의 선형 폭의 약 26 내지 50%에 영향을 미침, 골수 중간엽 변화는 면적의 3/4 이하를 차지하며, 관절 연골은 200-350 μm의 깊이 또는 타이드마크 미만으로 골단으로 붕괴될 수 있음.
5	타이드마크에서 증가된 호염기구증가증, 석회화 연골/연골하 뼈의 뚜렷한 내지 심각한 분열 및 또는 손실은 타이드마크의 폭의 50% 초과에 영향을 미침, 골수 중간엽 변화는 면적의 3/4 이하를 차지하며, 관절 연골은 타이드마크로부터 350 μm 초과의 깊이로 골단으로 붕괴될 수 있음.

고 용량(110㎍/투여량)의 Gly-CNP-37 처리는, 석회화 연골 및 연골하 뼈에 대한 손상을 비히클 처리된 동물에서 약 2.4의 점수로부터 Gly-CNP-37 처리된 동물에서는 1.3으로 감소시켰다. 저용량(35.5 μg/투여량)의 Gly-CNP-37 처리 또한 석회화 연골과 연골하 뼈에 대한 손상을 감소시켰지만, 고용량보다는 적은 정도로 감소시켰다.

경골 뼈 비후 , 골증식체 두께, 전체 관절 점수

외측 경골 및/또는 정상 좌측 내측 경골에 대한 비교를 이용하여 표 3에 제시된 기준에 기초하여 내측 경골 연골하/골단 소주 뼈 비후/경화증을 점수매겼다.

뼈 비후의 조직병리학적 점수판정
점수	점수판정 기준
0	정상, 내측 대 외측에서 연골하 또는 골단 소주 뼈 두께의 관찰 가능한 차이 없음.
1	내측 대 외측에서 연골하 또는 골단 소주 뼈 두께의 5-10% 증가.
2	내측 대 외측에서 연골하 또는 골단 소주 뼈 두께의 11-25% 증가.
3	내측 대 외측에서 연골하 또는 골단 소주 뼈 두께의 26-50% 증가, 내측 경골의 외부 3/4에서 골수 공간의 명백한 감소
4	내측 대 외측에서 연골하 또는 골단 소주 뼈 두께의 51-75% 증가, 일반적으로 내측 경골의 외부 3/4에서 골수 공간이 거의 없으며, 골수 공간은 십자선에 인접하여 남아있음.
5	내측 대 외측에서 연골하 또는 골단 소주 뼈 두께의 76-100% 증가, 일반적으로 내측 경골내에 골수 공간이 거의 남아있지 않음.

두 가지 투여량의 Gly-CNP-37로 처리한 결과, 비히클 처리 대조군과 비교하여, 내측 경골의 연골하/골단 소주 뼈 비후/경화증의 관찰가능한 감소가 나타났지만, 현재 연구에 의해 설정된 바와 같은 유의성을 나타내지는 않았다.

골증식체 두께(활막 쪽으로 연장되는 가장 먼 지점까지의 타이드마크)를 접안 마이크로미터로 측정하였다. 점수는 표 4의 기준에 따라 각 섹션(일반적으로 경골에서 발견됨)에서 가장 큰 골증식체에 할당되었다.

골증식체 두께 점수판정
점수	점수판정 기준
0	200 μm 미만.
1	소형 200-299 μm.
2	중간 300-399 μm.
3	대형 400-499 μm.
4	극대형 500-599 μm.
5	극대형 ≥600 μm.

고용량(110 ㎍/투여량)의 Gly-CNP-37로 처리한 결과, 경골 골증식체 측정치가 약 24%(p <0.05) 감소하였고, 경골 골증식체 점수는 약 34% 감소하였다(p <0.05). 골증식체는 OA 관절에서 발생하는 뼈의 성장이다. 골증식체 점수 데이터는 CNP 변이체가 골증식체, 즉 뼈의 성장을 감소시킬 수 있음을 입증한다. CNP와 CNP 변이체의 뼈 성장을 촉진시키는 알려진 역할을 감안할 때, 이 관찰은 놀랍고 예기치 않은 것이다.

경골 및 대퇴 연골 퇴행의 3-구역 점수와 골증식체 점수(대퇴골포함 전체 관절 점수)를 각각 합산하고, 경골 연골 퇴행의 3-구역 점수와 골증식체 점수(대퇴골 미포함 전체 관절 점수)를 각각 합산함으로써 각 관절에 대한 "전체 관절 점수"를 계산하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 110 μg/투여량의 Gly-CNP-37은 대퇴골 미포함 전체 관절 점수를 크게 감소시켰다. 저용량의 35.5 μg/투여량의 Gly-CNP-37 처리 또한, 더 높은 용량에 비해 적은 정도이기는 하나, 대퇴골 미포함 전체 관절 점수를 나타내고 개선시켰다. 대퇴골에 대한 점수가 포함되면(도 6), Gly-CNP-37은 두 가지 투여량에서 전체 관절 점수를 감소시키지만 유의 수준으로는 감소시키지 않음을 보여준다.

콜라겐 손상, 성장판 두께 및 인대/활막 복원

내측 경골 고평부(두개의 반부 중 가장 심각하게 영향을 받는 부분)에 걸친 콜라겐 손상을 접안 마이크로미터 및 다음의 파라미터를 사용하여 다음의 전체 폭을 측정하여 평가하였다: 임의의 손상(외상에서 전체 두께 손실까지의 피브릴화); 중증 손상(콜라겐이 타이드마크까지 전체 또는 거의 전체 손실, > 90% 두께); 현저한 손상(연골 두께의 61 내지 90%까지 확장); 중간 정도의 손상(연골 두께의 31 내지 60%까지 확장); 경미한 손상(연골 두께의 11 내지 30%까지 확장); 및 최소한의 손상(매우 표면적이며, 상위 10%에만 영향을 미침).

저 용량 및 고 용량 모두에서 Gly-CNP-37로 처리한 결과, 치료되지 않은 대조군과 비교하여 중증, 현저한 및 중간 정도의 퇴행을 갖는 영역이 더 적어졌다.

성장판 두께는 접안 마이크로미터를 사용하여 내측 및 외측 성장판의 대략 중간 지점(섹션의 접선이 아닌 영역을 가정함)에서 내측 및 외측(관절당 2개의 측정)의 모든 무릎에서 측정되었다. 110 μg의 용량으로 Gly-CNP-37을 투여하면, 내측 성장판 두께가 유의하게 감소했다. 35.5 μg의 용량으로 Gly-CNP-37을 투여하면, 내측 두께가 감소했지만 통계 분석을 통한 유의한 감소는 보이지 않았다(도 7). 차동 분석도 또한 결정되었는 데, 외측 두께를 중간에서 빼서 둘 사이의 차이를 결정했다. 도 8은 이 분석을 사용하여 높은 투여량의 Gly-CNP-37은 성장판 두께를 크게 감소시키는 반면, 낮은 투여량은 성장판 두께가 줄어들었지만 높은 투여량과 같은 정도는 아니라는 것을 보여준다.

내측 측부 인대/활막 복원은 또한 접안 마이크로미터를 사용하여 섹션의 비-접선 영역에서 내측 활액/측부 인대 복원의 두께를 측정하여 분석하였다. 이러한 측정은 치료군간에 차이를 보이지 않았다.

보행 분석

보행 분석은 발의 아랫면에 잉크를 도포하고, 종이를 가로 질러 이동(발자국)하는 동안 체중부하를 기록함으로써 수행되었다. 래트의 뒷발을 잉크에 넣은 다음, 래트를 종이 위에 올려 놓고 전체 길이로 걷게 했다. 보행은 시각적으로 표 5의 기준(질병/영향을 받는 다리에 대한 설명 참조)을 사용하여 점수를 매겼다.

보행 분석 점수판정 기준
점수	점수판정 기준
0	정상, 정상적인 발에 거의 같은 잉크 염색.
1	약간의 절뚝거림/통증 = 정상적인 발에 비해 잉킹 영역이 감소되었지만 전체 영역이나 구조가 누락되지 않음.
2	가벼운 절뚝거림/통증 = 발자국은 "curlicue"구조의 끝이나 끝 부근까지 확장된다. 정상 발에 발 뒤꿈치 염색이 거의 없는 경우(래트는 주로 발가락/발바닥으로 걸음), 약간 덜 염색됨.
3	중간정도 절뚝거림/통증 = 발가락과 발바닥, "curlicue" 발의 맨 위로 확장. 정상 발에 발 뒤꿈치 염색이 거의 없는 경우(래트는 주로 발가락/발바닥으로 걸음), 발가락이 발의 작은 부분을 차지함.
4	뚜렷한 절뚝거림/통증 = 발가락과 발바닥, 발 뒤꿈치 또는 뒷발 없음. 정상 발에 발 뒤꿈치 염색이 거의 없는 경우(래트는 주로 발가락/발바닥으로 걸음), 발가락 만 있음.
5	심각한 절뚝거림/통증 = 발가락에만, 발바닥에는 발 뒤꿈치가 없다. 정상 발에 발 뒤꿈치 염색이 거의 없는 경우(래트는 주로 발가락/발바닥으로 걸음), 부분 발가락 또는 비-특이적 마크로 함.
6	다리를 호핑하거나, 또는 운반함, 발자국이 분명하지 않음.

더 높거나 낮은 용량으로 Gly-CNP-37 처리된 동물은 연구의 대략 15일에서 28일까지 이동성과 보행 향상을 나타냈다(도 9). 보행 점수의 곡선 아래 면적(AUC)도 계산하였다. 도 10은 저용량의 Gly-CNP-37이 보다 높은 CNP 투여량보다 더 큰 범위로 보행 점수를 감소시켰으며, 보행 점수는 치료되지 않은 대조군과 비교하여 치료된 집단 모두에서 더 낮았다.

본 실시예 1에 제시된 결과는 외상 직후 Gly-CNP-37 변이체와 같은 CNP 변이체에 의한 골관절염 치료가 감염된 대상체의 연골 퇴행 및 이동성을 포함한, 관절염 증상에 이로운 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.

실시예 2

골관절염 치료에 있어서 제2 CNP 변이체인 Pro-Gly-CNP-37의 사용을 조사하기 위해, 및 이를 Gly-CNP-37과 비교하기 위해, 래트 모델 및 실시예 1의 실험 방법을 이용하여 추가 래트 연구를 수행하였다.

연구 설계 및 그룹
그룹	수컷 수	처리	투여 경로	투여 요법	투여 수준	농도 (mg/mL)	투여 용량
1	12	비히클	IA	TIWx3W	0 μg	0	50 μL
2	12	Pro-Gly-CNP-37	IA	TIWx3W	10.5 μg	0.21	50 μL
3	12	Pro-Gly-CNP-37	IA	TIWx3W	35.5 μg	0.71	50 μL
4	12	Pro-Gly-CNP-37	IA	TIWx3W	105 μg	2.1	50 μL
5	12	Gly-CNP-37	IA	TIWx3W	105 μg	2.1	50 μL
6	15	비히클	SC	QDx3W	0 μg/kg	0	0.83 mL/kg
7	15	Pro-Gly-CNP-37	SC	QDx3W	150 μg/kg	0.18	0.83 mL/kg

표 6에 요약된 바와 같이, 래트 그룹을 비히클, Pro-Gly-CNP-37 또는 Gly-CNP-37로 처리하였다. 투여 경로는 관절내(IA) 또는 피하(SC)였다. 투여용량 스케줄링은 관절내 투여 약 3주간 주 3회(M, W 및 F)(TIWx3W) 또는 피하 투여 약 3주간 매일 1회(QDx3W)였다. 래트는 연구 0일째에 수술을 받고; 그룹 1-5는 그룹 6-7 약 1주일 전에 수술을 받았다(즉, 연구가 엇갈린 방식으로 수행됨). IA 주사는 고정 용량으로 투여되었지만, SC 주사는 가장 최근에 기록된 체중을 기준으로 중량당 주어진 용량으로 제공하였다. 모든 래트에 대해, 체중을 투여전에 측정하였다. 300-g 래트의 경우, 낮은, 중간, 높은 수준에 대한 매주 IA 용량 요법은 각각 대략 15, 50, 150 μg/kg/일과 동일했다. 최종 투여 후 25일째에 래트를 안락사시키고, 조직병리학적 분석 및 점수판정을 위해 그 관절을 수확했다.

혈장 약동학 및 약력학

CNP 변이체의 약동학(PK) 및 약력학(PD) 특성을 평가하였다. PK/PD 분석을 위해, 3래트/그룹/시간 지점에 대하여 정기적인 혈액 수집을 다음과 같이 수행하였다: IA 그룹의 경우 투여후 15, 30, 60 및 120분 후 및 SC 그룹의 경우 투여후 5, 15, 30, 60 및 120분 후. 혈액 수집 후, 각 래트의 왼쪽(정상)과 오른쪽(수술된) 무릎에서 활액 세척액(synovial lavage fluid(SLF), ~ 50 μL/무릎)을 수집했다.

조직병리학 및 면역조직화학

무릎을 조직병리학 및 면역조직화학(IHC) 분석을 위해 보존하였다. 1차 평가 기준은 증식성 세포핵 항원(PCNA)에 대한 IHC를 포함하여 무릎에서 연골세포 죽음과 연골 퇴행에 대한 조직병리학적 검사였다. 다양한 조직병리학적 특징을 실시예 1에서 기술한 바와 같이 측정하고 점수를 매겼으며, 특히 점수판정 기준에 대해 표 1 내지 표 5를 참조한다.

임의의 퇴행(세포 손실, 프로테오글라이칸 손실 또는 콜라겐 손상)에 의해 영향받은 경골 연골의 전체 폭을 접안 마이크로미터로 측정하였다. 도 11에 도시된 바와 같이, 중간 및 높은 투여량에서 IA로 투여한 Pro-Gly-CNP-37은 전체 연골 퇴행 폭을 각각 약 26% 및 32%까지 크게 두드러지게 감소시켰다. 따라서, IA 35.5 μg 및 105 μg 용량은 경골 연골 퇴행 폭에 통계적으로 유의미했다.

연골 두께의 50% 초과까지 연장되는 연골세포 및 프로테오글리칸 손실에 의해 정의되는 실질적인 연골 퇴행에 대한 CNP 변이체의 효과를 접안 마이크로미터에 의해 경골 고평부에서 측정하였다. 관절내 경로(도 12)에 의해 전달된 Pro-Gly-CNP-37에 대하여 실질적인 연골 퇴행의 용량-반응 감소가 관찰되었는데, 35.5μg IA 투여량으로 볼 때 폭이 32% 감소하고, 105 μg IA 투여량으로 볼 때 36% 감소하였다. 3주간 매일 피하 투여된 150μg/kg Pro-Gly-CNP-37에 대해 통계적으로 유의한 감소가 관찰되었다(폭의 42% 감소).

골증식체 두께(활막쪽으로 연장되는 가장 먼 지점까지의 타이드마크)를 접안 마이크로미터로 측정하였다. IA 경로를 통해 투여된 Pro-Gly-CNP-37에 대해 중간 경골 골증식체 점수에서 용량-반응성 경향이 관찰되었으며(도 13), 35.5 μg IA에서 15% 감소, 105 μg IA에서 14% 감소하였다. 또한, 피하 투여된 Pro-Gly-CNP-37의 경우 26%의 통계적으로 유의한 감소(t-test에 의한 p <0.05)가 관찰되었다. 골증식체 점수 감소는 CNP 변이체가 OA 관절내 뼈(골증식체)의 비정상적인 성장을 감소시킬 수 있음을 보여준다. 다시 말하면, CNP와 CNP 변이체는 장골 성장을 촉진시키는 것으로 알려졌었으므로, 이 관찰은 놀랍고 예기치 않은 것이다.

성장판의 두께를 각 그룹에 대하여 측정하였다. 내측 및 외측 성장판 두께는 Pro-Gly-CNP-37의 35.5 μg IA 및 105 μg IA에 의해 처리한 동물에서 상당히 더 컸다(도 14). 또한, 내측 및 외측 성장판 두께는 비히클 대비 Pro-Gly-CNP-37로 SC 처리된 동물에서 더 컸다.

전체 관절 점수(대퇴부 제외)는 경골 연골 퇴행 및 골증식체 점수의 3-구역 점수 각각을 합산함으로써 계산되었다. 도 15에 도시된 바와 같이, 35.5 및 105 μg Pro-Gly-CNP-37의 IA 투여 및 105 μg Gly-CNP-37의 IA 투여에 대한 관절 점수 중증도의 유의한 감소가 관찰되었다. SC를 투여한 Pro-Gly-CNP-37의 경우 전체 관절 점수(마이너스 대퇴부)의 유의한 감소가 관찰되었다.

도 16은 활막염 점수를 나타낸다. 표 7의 기준을 사용하여 활막 염증(주로 내측에 집중된 단핵 세포 침윤)을 기록했다.

활막염 점수판정
점수	점수판정 기준
0	정상적인 활막.
0.5	아주 최소한의 활막염(일반적으로 국소적 또는 분산된 최소 확산).
1	최소한의 활막염(일반적으로 국소적 또는 분산된 최소 확산).
2	경미한 활막염(경도의 단핵 세포 침윤의 다발성 에서 융합성 영역).
3	중등도 활막염(중등도의 단핵 세포 침윤의 융합성 영역).
4	현저한 활막염(현저한 단핵 세포 침윤의 융합성 영역).
5	중증의 활막염(중증의 단핵 세포 침윤의 융합성 영역).

활막염 점수판정 중증도의 유의한 증가는 모든 투여그룹에 걸쳐 관찰되지 않았다. 엔도톡신은 Gly-CNP-37(0.78 EU/mL)을 제외하고 모든 제형에서 정량 한계(<0.5 EU/mL)보다 적었다.

도 17은 상이한 그룹에 대해 -4일에서 25일까지의 체중(g)의 평균 변화를 나타낸다. Pro-Gly-CNP-37을 35.5 및 105μg/용량으로 IA 투여하고, 150μg/kg/일 용량으로 SC 투여한 경우 체중 증가가 유의하게 감소했다.

도 18은 그룹으로부터의 보행 분석 점수를 나타낸다. 피하 투여된 Pro-Gly-CNP-37에 대한 보행 점수는 8일째에 비히클에 비해 유의하게 감소하였다(48%).

도 19 및 표 8은 Pro-Gly-CNP-37(그룹 2, 3 및 4(IA 투여) 및 그룹 7(SC 투여))로 처리된 동물에 대한 혈장 약동학을 보여준다. 개별 혈장 샘플을 Pro-Gly-SNP-37 수준에 대해 분석하고, 평균 농도 대 시간 프로파일을 Phoenix WinNonlin 소프트웨어의 혈관외 투여를 위한 비-구획 모델을 사용하여 분석하였다. 각 그룹에 대한 데이터를 플로팅하고, 도 19에서 대응하는 수 그룹으로 표지하였다(각 라인 위에). Pro-Gly-CNP-37은 IA 주사와 SC 주사 후 모두 전신 순환계에서 급속하게 나타났다. IA 주사(그룹 2, 3, 4)에 대한 노출은 일반적으로 용량에 비례하여, t_1/2 및 CL에 현저한 변화가 없었다. 노출량은 조사된 가장 낮은 IA 투여량과 유사했지만, 1일 1회 SC 주사(그룹 7)는 주당 3회 투여된 2 개의 최고 투여량 IA 주사와 효능면에서 유사한 반응을 나타내는 것으로 나타났다.

CNP 변이체의 약동학
그룹	C_max(ng/mL)	AUC_last (ng-분/mL)	T_max(분)	t_1/2(분)	CL(mL/분)
2	33.8	1719	15	27.0	5.77
3	110	5939	15	34.9	5.36
4	357	8827	15	38.1	9.19
7	28.4	980	15	23.8	121

상기 데이터는 Pro-Gly-CNP-37(35.5 및 105㎍) 또는 Gly-CNP-37(105㎍)을 사용한 관절내 치료가 래트에서 내측 반월판 파열에 의해 유발된 골관절염의 조직병리학적 병변에 유의한 유익한 효과를 나타냈다는 것을 나타낸다.

150μg/㎏/일의 Pro-Gly-CNP-37에 의한 1일 1회 피하 처리는 관절내 치료와 유사하거나 더 우수한 효능을 제공하였다. 전체적으로, 이 연구는 연골보호 효과의 증거를 보여준다.

실시예 3

성장전 골관절염(즉, 1차 골관절염)에서의 Pro-Gly-CNP-37의 효능을 평가하기 위해 말기 골관절염의 모델을 사용하였다. 상기 실시예 1 및 2에서 기술된 바와 같이, 골관절염은 반월판을 절단하여 래트의 뒷다리에서 유도되었다. 그러나, 실시예 1 및 2와는 대조적으로, Pro-Gly-CNP-37에 의한 IA 또는 SC 치료 전에 병변 병리학을 3주 동안 진행하여, 기존의 OA(즉, 1차 골관절염)를 모의 실험하였다. 전체 연구 디자인은 표 9에 요약되어있다. 특히, 수컷 루이스 래트는 연구 0일째에 일측성 내측 반월판 파열 수술을 받았으며; 대조군 비히클 또는 Pro-Gly-CNP-37의 투여는 연구 21일째에 시작되었으며; 연구 22일(그룹 1-4) 또는 연구 40일(그룹 5-11)째에 마지막 투여 후 예정된 시간에 동물들을 안락사시켰다. 평가된 1차 평가변수는 무릎의 연골세포 죽음/연골 퇴행에 대한 조직병리학적 검사를 포함하였다.

말기 골관절염 연구 디자인 및 그룹
그룹	수술받음	처리	투여량 수준	ROA	종결
1 & 6	예	비히클	0 μg	IA	22 또는 41일째
7	예	Pro-Gly-CNP-37	35.5 μg	IA	41일째
2 & 8	예	Pro-Gly-CNP-37	105 μg	IA	22 또는 41일째
3 & 9	예	비히클	0 μg/kg	SC	22 또는 41일째
10	예	Pro-Gly-CNP-37	50 μg/kg	SC	41일째
4	예	Pro-Gly-CNP-37	150 μg/kg	SC	22 또는 41일째
5	아니오	없음	N/A	N/A	41일째

모든 동물은 예정된 연구 종결 지점까지 생존했다. 연구가 끝나면 래트를 안락사시키고, 조직병리학적 분석을 위해 무릎을 수집하고, 고정 및 절개하여 표 1 내지 5 및 7에서와 같이 점수를 매겼다. 연구 결과 요약은 표 10에 제시되어있다.

IA, TIWx3W 투여된 Pro-Gly-CNP-37(35.5 또는 105 μg)의 처리 및 SC, QDx3W 투여된 Pro-Gly-CNP-37(150 ㎍/kg)의 처리는 무릎 조직병리학의 평가에 의해 결정된 말기 래트 반월판 파열-유도성 골관절염에서 유의미한 유익한 효과를 나타냈다. Pro-Gly-CNP-37의 IA 처리 결과는 용량 반응성이었다.

SC 처리된 래트에서 감소한 활막염을 제외하고는 병변의 중증도가 IA 대조군에 비해 SC 대조군에서 약간 증가했지만, 관절염 매개변수는 비히클 대조군간에 유사했다. 체중 증가는 IA 대조군과 비교하여 수술 후 40일째의 SC 비히클 대조군에서 유의하게 증가하였다.

임상 및 조직병리학 데이터의 요약
그룹	처리	전체 경골 CD 폭(μm)	상당한 경골 CD 폭(μm)	전체 경골 CD 점수	골증식체 측정(μm)	전체 관절 점수 w/대퇴골
1	비히클 IA, 1x(d21) 22일째 검시	1633.3 (195.88)	480.56 (113.89)	4.83 (0.76)	341.67 (24.25)	7.89 (0.99)
2	Pro-Gly-CNP-37(105 μg) IA, 1x(d21) 22일째 검시	1694.44 (134.83)	480.56 (92.64)	4.81 (0.49)	402.78 (25.61)	8.97 (0.64)
3	비히클 SC, 1x(d21) 22일째 검시	1577.78 (110.78)	569.44 (92.04)	5.39 (0.65)	375.00 (18.63)	9.36 (1.02)
4	Pro-Gly-CNP-37(150 μg/kg) SC, 1x(d21) 22일째 검시	1550.00 (109.80)	572.22 (58.95)	5.14 (0.34)	383.33 (23.96)	8.86 (0.62)
5	정상 40일째 검시	111.11†‡ (37.18)	0.00†‡ (0.00)	0.08†‡ (0.04)	0.00†‡ (0.00)	0.08†‡ (0.04)
6	비히클 IA, TIWx3W 40일째 검시	1622.22 (107.88)	509.72 (57.79)	4.93 (0.43)	441.67 (15.56)	9.07 (0.65)
7	Pro-Gly-CNP-37(35.5 μg) IA, TIWx3W 40일째 검시	1605.56 (71.38)	358.33 (71.38)	3.96 (0.46)	452.78 (22.74)	8.44 (0.60)
8	Pro-Gly-CNP-37 IA, TIWx3W 40일째 검시	1200.00* (69.63)	313.89 (51.12)	3.43* (0.32)	423.61 (28.53)	7.38 (0.73)
9	비히클 SC, QDx3W 40일째 검시	1741.67 (75.22)	526.39 (51.84)	5.06 (0.39)	472.22 (22.41)	9.75 (0.69)
10	Pro-Gly-CNP-37(50 μg) SC, QDx3W 40일째 검시	1847.22 (46.14)	498.61 (60.18)	4.83 (0.41)	473.61 (0.41)	9.82 (0.73)
11	Pro-Gly-CNP-37(150 μg) SC, QDx3W 40일째 검시	1375.00* (98.91)	443.06 (80.70)	4.43 (0.59)	444.44 (18.95)	9.03 (0.85)

CD = 연골 퇴행, IA = 관절내, SC = 피하, TIWx3W = 3주 동안 주 3회, QDx3W = 약 3주(20일) 동안 매일 1회.

(SE) = 표준 오차는 괄호 안에 표시됨.

각각의 IA 또는 SC 비히클(40일째) 대조군에 비해 * p <0.05 ANOVA/K-W 검사(Dunnett's/Dunn's 사후검정).

† p <0.05 Student's t-테스트/M-W 테스트 대 IA 비히클(40일).

‡ p <0.05 Student's t-테스트/M-W 테스트 대 SC 비히클(40일).

35.5 μg Pro-Gly-CNP-37에 의해 IA 처리된 래트는 IA 비히클 대조군과 비교하여 구역-2 경골 연골 퇴행성 점수가 현저히(31%) 감소되었다. 경골 연골 퇴행 합산 점수와 실질 경골 연골 퇴행 폭은 각각 20%와 30%만큼 크게 감소하지 않았다. 병변이 존재하는 경우 일반적으로 최소 또는 가벼운 정도였음에도 불구하고, 구역-3 내측 경골 연골 퇴행 점수와 구역-1 대퇴 연골 퇴행 점수는 유의하게 증가하였다.

105 ㎍ Pro-Gly-CNP-37에 의해 IA 처리된 래트는 IA 비히클 대조군에 비해 현저히 감소된 체중 증가를 보였다. 105 ㎍ Pro-Gly-CNP-37에 의한 IA 처리는 구역-2 내측 경골 연골 퇴행(44% 감소), 구역-3 내측 경골 연골 퇴행(93%), 합산된 내측 경골 연골 퇴행(31%), 및 전체 경골 연골 퇴행 폭(28%)을 IA 비히클 대조군에 비해 유의하게 감소시켰다. 상당한 경골 연골 퇴행 폭은 처리에 의해 유의하게 감소하지 않았다(38%).

150 ㎍/kg Pro-Gly-CNP-37에 의해 SC 처리된 래트는 SC 비히클 대조군에 비해 현저히 감소된 체중 증가를 보였다. 105 ㎍ Pro-Gly-CNP-37에 의한 처리(SC)는 SC 비히클 대조군에 비해 전체 경골 연골 퇴행 폭(22% 감소)을 유의하게 감소시켰다. 상당한 경골 연골 퇴행 폭은 처리에 의해 유의하게 감소하지 않았다(16%). 내측 및 외측 성장판 두께는 처리에 의해 유의하게 증가되어, 내측 및 외측 두께의 차이를 유의하게 감소시켰다.

도 20에 나타낸 바와 같이, 105 μg IA 및 150 μg/kg SC에서의 Pro-Gly-CNP-37 처리는 평균 경골 연골 퇴행의 감소를 초래하였다. 그러나 상당한 경골 연골 퇴행은 IA 처리 투여량 뿐만 아니라 최고 SC 투여량 모두에 의해 감소되었다(도 21). 또한, IA 투여된 Pro-Gly-CNP-37은 내측 경골 연골 퇴행 점수(도 22)와 내측 경골 연골 퇴행 깊이 비율(도 23)에서 통계적으로 유의한 감소를 가져왔다.

상기 실시예 1 및 2에서 설명한 바와 같이, 전체 관절 점수는 조직병리학적 분석 및 점수판정에 의해 각 관절(대퇴골 포함 및 비포함)에 대해 계산하였다. IA 투여된 Pro-Gly-CNP-37은 대퇴골을 포함한 관절 점수에서 7%(35.5 μg)와 19%(105 μg) 감소를 보였고, 대퇴골 없이 계산시 11%(35.5 μg)와 21%(105 μg) 감소를 보였다(도 24(대퇴골 포함) 및 25(대퇴골 미포함)). SC 투여한 Pro-Gly-CNP-37은 7%(대퇴골 포함)와 10%(대퇴골 미포함)의 최고 용량 수준(150 μg/kg)에서 더 완만한 감소를 보였다(도 24 및 25).

도 26에서 볼 수 있는 바와 같이, Pro-Gly-CNP-37 처리는 모든 투여량 및 투여 경로에서 골증식체 점수에 약간의 영향을 미쳤다. 실시예 2에 기술된 초기 골관절염 연구에서와 같이, Pro-Gly-CNP-37 처리는 처리된 동물에서 체중 변화를 감소시켰다(도 27).

본 발명은 본 발명의 진정한 범주를 벗어나지 않으면서 다른 특정 형태로 구현될 수 있다. "발명"에 대한 임의의 언급은 본 발명의 예시적인 구현예를 나타내는 것으로 의도되며, 문맥에 달리 요구되지 않는 한 본 발명의 모든 구현예를 지칭하는 것으로 해석되어서는 안된다. 기술된 구현예들은 모든 면에서 단지 예시적인 것으로 고려되어야하며, 제한적이지는 않으며; 많은 변형 및 수정이 당업자에게 명백할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Biomarin Pharmaceutical Inc. <120> USE OF C-TYPE NATRIURETIC PEPTIDE VARIANTS TO TREAT OSTEOARTHRITIS <130> 30610/49583 <150> US 62/264682 <151> 2015-12-08 <160> 158 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> Pro-Gly-CNP37 <220> <221> MISC_FEATURE <223> Pro-Gly-wtCNP37 <400> 1 Pro Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys 1 5 10 15 Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly 20 25 30 Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 <210> 2 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> Gly-CNP-37 <220> <221> MISC_FEATURE <223> Gly-wtCNP37 <400> 2 Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys 1 5 10 15 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser 20 25 30 Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 <210> 3 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> CNP-26 <400> 33 Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp 1 5 10 15 Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 25 <210> 34 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> CNP-25 <400> 34 Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg 1 5 10 15 Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 25 <210> 35 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> CNP-24 <400> 35 Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile 1 5 10 15 Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 36 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> CNP-23 <400> 36 Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 37 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> PEG1K <400> 57 Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu 1 5 10 15 Asp Arg Ile Gly Ser Asn Ser Gly Leu Gly Cys 20 25 <210> 58 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> PEG1K-Pro-CNP-27(K4,5,9R) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> PEG1 <400> 58 Pro Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys 1 5 10 15 Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 25 <210> 59 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> PEG1K-Met-CNP-27(K4,5,9R) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> PEG1K <400> 59 Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu 1 5 10 15 Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 25 <210> 60 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> PEO12-CNP-27(K4,5,9R) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> PEO12 <400> 60 Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu 1 5 10 15 Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 25 <210> 61 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> PEO12-CNP-27(K4,5,9R, M22N) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> PEO12 <400> 61 Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu 1 5 10 15 Asp Arg Ile Gly Ser Asn Ser Gly Leu Gly Cys 20 25 <210> 62 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> PEO12-Pro-CNP-27(K4,5,9R) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> PEO12 <400> 62 Pro Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys 1 5 10 15 Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 25 <210> 63 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> PEO12-Met-CNP-27(K4,5,9R) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> PEO12 <400> 63 Pro Glu Met Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly 1 5 10 15 Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 25 30 <210> 64 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> PEO24-CNP-27(K4,5,9R) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> PEO24 <400> 64 Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu 1 5 10 15 Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 25 <210> 65 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> PEO24-CNP-27(K4,5,9R, M22N) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> PEO24 <400> 65 Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu 1 5 10 15 Asp Arg Ile Gly Ser Asn Ser Gly Leu Gly Cys 20 25 <210> 66 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> PEO24-Pro-CNP-27(K4,5,9R) <220> 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C-terminal tails derived from BNP <400> 77 Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp 1 5 10 15 Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His 20 25 30 <210> 78 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> Analog CI <220> <221> MISC_FEATURE <223> GANPR-CNP22(K4R) <400> 78 Gly Ala Asn Pro Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu 1 5 10 15 Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 25 <210> 79 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> Analog AZ <220> <221> MISC_FEATURE <223> R-CNP22(K4R) <400> 79 Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 80 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> Analog BA <220> <221> MISC_FEATURE <223> ER-CNP22(K4R) <400> 80 Glu Arg Gly Leu Ser Arg Gly 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CZ <220> <221> MISC_FEATURE <223> osteocrin "NPR C inhibitor" fragment-CNP22 chimera <400> 89 Phe Gly Ile Pro Met Asp Arg Ile Gly Arg Asn Pro Arg Gly Leu Ser 1 5 10 15 Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly 20 25 30 Leu Gly Cys 35 <210> 90 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> Analog DA <220> <221> MISC_FEATURE <223> FGF2 "heparin-binding domain" fragment-CNP22 chimera <400> 90 Gly Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly 1 5 10 15 Pro Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile 20 25 30 Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 40 <210> 91 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> Analog CK <220> <221> MISC_FEATURE <223> IgG1(Fc) fragment-CNP22(K4R) chimera <400> 91 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Gly Ala Asn Gln Gln Gly 1 5 10 15 Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly 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polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> Analog CS <400> 97 Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Pro Lys 1 5 10 15 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser 20 25 30 Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 <210> 98 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> Analog CT <400> 98 Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Gln Lys 1 5 10 15 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser 20 25 30 Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 <210> 99 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> Analog CU <400> 99 Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Gln Gln 1 5 10 15 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser 20 25 30 Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 <210> 100 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> Analog CW <400> 100 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(1)..(1) <223> PEO24 <400> 103 Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu 1 5 10 15 Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 25 <210> 104 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> PEO12-GANRR-CNP22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> PEO12 <400> 104 Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu 1 5 10 15 Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 25 <210> 105 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> PEO24-GANPR-CNP22(K4R) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> PEO24 <400> 105 Gly Ala Asn Pro Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu 1 5 10 15 Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 25 <210> 106 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> PEO12-GANPR-CNP22(K4R) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> PEO12 <400> 106 Gly Ala Asn Pro Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu 1 5 10 15 Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 25 <210> 107 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> PEO24-GANPR-CNP22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> PEO24 <400> 107 Gly Ala Asn Pro Arg Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu 1 5 10 15 Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 25 <210> 108 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> PEO12-GANPR-CNP22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> PEO12 <400> 108 Gly Ala Asn Pro Arg Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu 1 5 10 15 Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 25 <210> 109 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> PEO24-GANQQ-CNP22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> PEO24 <400> 109 Gly Ala Asn Gln Gln Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu 1 5 10 15 Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 25 <210> 110 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> PEO12-GANQQ-CNP22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> PEO12 <400> 110 Gly Ala Asn Gln Gln Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu 1 5 10 15 Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 25 <210> 111 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> PEO24-ER-CNP22(K4R) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> PEO24 <400> 111 Glu Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile 1 5 10 15 Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 112 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> PEO12-ER-CNP22(K4R) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> PEO12 <400> 112 Glu Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile 1 5 10 15 Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 113 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> PEO24-ER-CNP22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> PEO24 <400> 113 Glu Arg Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile 1 5 10 15 Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 114 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> PEO12-ER-CNP22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> PEO12 <400> 114 Glu Arg Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile 1 5 10 15 Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 115 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> PEO24-R-CNP22(K4R) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> PEO24 <400> 115 Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 116 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> PEO12-R-CNP22(K4R) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> PEO12 <400> 116 Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 117 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> PEO24-R-CNP22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> PEO24 <400> 117 Arg Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 118 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> PEO12-R-CNP22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> PEO12 <400> 118 Pro Glu Arg Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg 1 5 10 15 Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 25 <210> 119 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> GANRR-CNP22(K4R) <400> 119 Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu 1 5 10 15 Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 25 <210> 120 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N terminus may be modified by a synthetic bone-targeting compound or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Cys, or any natural or unnatural Amino Acid or peptide bond isotere <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(7) <223> Peptide Bond <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is Phe, or any natural or unnatural Amino Acid or peptide bond isotere <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is Gly or any natural or unnatural amino acid or petidomimetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> C terminus may be modified by a synthetic bone-targeting compound or absent <400> 120 Gly Leu Ser Lys Gly Xaa Xaa Xaa Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser 1 5 10 15 Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 121 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> Analog A <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> CH2NH <400> 121 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser 1 5 10 15 Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 122 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> Analog B <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> N-Methyl-Phe <400> 122 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met 1 5 10 15 Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 123 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> Analog E <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> D-Phe <400> 123 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met 1 5 10 15 Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 124 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> Analog F <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> tBu-Gly <400> 124 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Leu Tyr Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 125 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> Analog G <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> 3-Cl-Phe <400> 125 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met 1 5 10 15 Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 126 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> Analog H <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> NHCH2CH(Ph)CO <400> 126 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met 1 5 10 15 Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 127 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N terminus may be modified by a synthetic bone-targeting compound or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is any natural or unnatural Amino Acid or peptidomimetic that does not have a reactive primary amine on a side chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Cys or peptide-bond isosteres <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(7) <223> Peptide bond <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is L-Phe; D-Phe; 3-amino-2-phenylpropionic acid; or N-alkylated derivatives of Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is Gly, tert-butyl-Gly (tBu-Gly), Thr, Ser, Val, or Asn <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is natural or unnatural amino acid or peptidomimetic that does not have a reactive primary amine on a side chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is Leu or peptide-bond isosteres <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is Ile, tBu-Gly, or peptide-bond isosteres <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa is Met, Val, Asn, beta-Cl-Ala, 2-aminobutyric acid (Abu), or 2-amino-isobutyric acid (Aib) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa is Leu, norleucine (Nle), homoleucine (Hleu), Val, tert-butyl-Ala (tBu-Ala), Ser, Thr, Arg, or peptide-bond isosteres <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> C terminus may be modified by a synthetic bone-targeting compound or absent <400> 127 Gly Leu Ser Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Arg Xaa Gly Ser 1 5 10 15 Xaa Ser Gly Xaa Gly Cys 20 <210> 128 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N terminus may be modified by a synthetic bone-targeting compound or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Lys, a conservative amino acid substitution, any natural or unnatural amino acid or peptidomimetic that does not have a reactive primary amine on a side chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Cys or peptide bond isoteres <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(7) <223> Peptide Bond <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is L-Phe; D-Phe; 3-amino-2-phenylpropionic acid; N-alkylated derivatives of Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is Gly, tert-butyl-Gly, Thr, Ser, Val, or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is Leu, Ser, Thr, or peptide bond isosteres <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is Lys, Arg, Gly, 6-hydroxy-norleucine, citrulline (Cit), Gln, or Ser <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is Ile, tert-butyl-Gly (tBu-Gly), Asn, or peptide bond isosteres <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa is Gly, Arg, Ser, or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa is Met, Val, Asn, beta-Cl-Ala, 2-aminobutyric acid (Abu), or 2-amino-isobutyric acid (Aib) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa is Leu, norleucine (Nle), homoleucine (Hleu), Val, tert-butyl-Ala (tBu-Ala), Arg, Thr, Ser, and peptide bond isosteres <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> C terminus may be modified by a synthetic bone-targeting compound or absent <400> 128 Gly Leu Ser Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Arg Xaa Xaa Ser 1 5 10 15 Xaa Ser Gly Xaa Gly Cys 20 <210> 129 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N terminus is a natural or synthetic polymer <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> C terminus is a natural or synthetic polymer <400> 129 Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly 1 5 10 15 Cys <210> 130 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N terminus is a natural or synthetic polymer <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> C terminus is a natural or synthetic polymer <400> 130 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser 1 5 10 15 Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 131 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N terminus is a synthetic or natural polymeric group, or a combination thereof <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Lys or a conservative amino acid substitution or any natural or unnatural amino acid or peptidomimetic that does not have a reactive primary amine on a side chain <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> C terminus is a synthetic or natural polymeric group, or a combination thereof <400> 131 Cys Phe Gly Leu Xaa Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly 1 5 10 15 Cys <210> 132 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N terminus is a synthetic or natural polymeric group, or a combination thereof <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Lys or a conservative amino acid substitution or any natural or unnatural amino acid or peptidomimetic that does not have a reactive primary amine on a side chain <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> C terminus is a synthetic or natural polymeric group, or a combination thereof <400> 132 Gly Leu Ser Xaa Gly Cys Phe Gly Leu Xaa Leu Asp Arg Ile Gly Ser 1 5 10 15 Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 133 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 133 Gly Ala Asn Lys Lys 1 5 <210> 134 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 134 Gly Ala Asn Arg Arg 1 5 <210> 135 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 135 Gly Ala Asn Pro Arg 1 5 <210> 136 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 136 Gly Ala Asn Gln Gln 1 5 <210> 137 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 137 Gly Ala Asn Ser Ser 1 5 <210> 138 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 138 Gly Ala Asn Arg Gln 1 5 <210> 139 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 139 Gly Ala Asn Arg Met 1 5 <210> 140 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 140 Gly Ala Asn Arg Thr 1 5 <210> 141 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 141 Gly Ala Asn Arg Ser 1 5 <210> 142 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 142 Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala 1 5 10 <210> 143 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 143 Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg 1 5 10 <210> 144 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 144 Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg 1 5 10 <210> 145 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 145 Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys 1 5 10 15 <210> 146 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 146 Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Arg Arg 1 5 10 15 <210> 147 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 147 Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu 1 5 10 15 Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys 20 25 30 <210> 148 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 148 Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu 1 5 10 15 Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Arg Arg 20 25 30 <210> 149 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 149 Ser Leu Arg Arg Ser Ser 1 5 <210> 150 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 150 Asn Ser Phe Arg Tyr 1 5 <210> 151 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 151 Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly 1 5 <210> 152 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 152 Met Val Gln Gly Ser Gly 1 5 <210> 153 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 153 Lys Val Leu Arg Arg Tyr 1 5 <210> 154 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 154 Lys Val Leu Arg Arg His 1 5 <210> 155 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 155 Gly Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg 1 5 10 <210> 156 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 156 Gly Val Pro Gln Val Ser Thr Ser Thr 1 5 <210> 157 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 157 Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln 1 5 10 15 <210> 158 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 158 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 1 5 10

Claims

CNP 변이체를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 골관절염 치료 방법.
CNP 변이체를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 연골 성장을 증가시키는 방법.
CNP 변이체를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 연골 퇴행을 늦추는 방법.
CNP 변이체를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 골관절염이 있는 대상체의 골관절염 증상을 완화시키는 방법.
CNP 변이체를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 골관절염이 있는 환자의 운동 기능(또는 이동성)을 증가시키는 방법.
CNP 변이체를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 골관절염이 있는 환자의 이동성 퇴행을 억제하는 방법.
CNP 변이체를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 골관절염이 있는 대상체의 영향을 받는 관절내 운동 범위를 증가시키는 방법.
CNP 변이체를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 골관절염이 있는 대상체의 영향을 받는 관절내 경직을 감소시키는 방법.
CNP 변이체를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 활막염증을 감소시키는 방법.
CNP 변이체를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 골관절염 발병을 예방하는 방법.
CNP 변이체를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 골증식체 성장을 감소시키는 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CNP 변이체가 하기로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법:
PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP37)(SEQ ID NO: 1);
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP-37)(SEQ ID NO: 2);
GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP53)(SEQ ID NO: 3);
PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP53)(SEQ ID NO: 4);
MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP53)(SEQ ID NO: 5);
DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP-53(M48N)](SEQ ID NO: 6);
LRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-52)(SEQ ID NO: 7);
RVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-51)(SEQ ID NO: 8);
VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-50)(SEQ ID NO: 9);
DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-49)(SEQ ID NO: 10);
TKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-48)(SEQ ID NO: 11);
KSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-47)(SEQ ID NO: 12);
SRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-46)(SEQ ID NO: 13);
RAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-45)(SEQ ID NO: 14);
AAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-44)(SEQ ID NO: 15);
AWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-43)(SEQ ID NO: 16);
WARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-42)(SEQ ID NO: 17);
ARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-41)(SEQ ID NO: 18);
RLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-40)(SEQ ID NO: 19);
LLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-39)(SEQ ID NO: 20);
LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO: 21);
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO: 22);
EHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-36)(SEQ ID NO: 23);
HPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-35)(SEQ ID NO: 24);
PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(SEQ ID NO: 25);
NARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-33)(SEQ ID NO: 26);
ARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-32)(SEQ ID NO: 27);
RKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-31)(SEQ ID NO: 28);
KYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-30)(SEQ ID NO: 29);
YKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-29)(SEQ ID NO: 30);
KGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-28)(SEQ ID NO: 31);
GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-27)(SEQ ID NO: 32);
ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-26)(SEQ ID NO: 33);
NKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-25)(SEQ ID NO: 34);
KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-24)(SEQ ID NO: 35);
KGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-23)(SEQ ID NO: 36);
LSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-21)(SEQ ID NO: 38);
SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-20)(SEQ ID NO: 39);
KGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-19)(SEQ ID NO: 40);
GCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-18)(SEQ ID NO: 41);
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP-37(M32N)](SEQ ID NO: 43);
PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP-37)(SEQ ID NO: 44);
MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP-37)(SEQ ID NO: 45);
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP-37(M32N)](SEQ ID NO: 46);
MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-Gly-CNP-37)(SEQ ID NO: 47);
GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(HSA-CNP-27)(SEQ ID NO: 48);
GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[HSA-CNP-27(M22N)](SEQ ID NO: 49);
PGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-HSA-CNP-27)(SEQ ID NO: 50);
MGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-HSA-CNP-27)(SEQ ID NO: 51);
GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[CNP-27(K4,5,9R)](SEQ ID NO: 52);
GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP-27(K4,5,9R, M22N)](SEQ ID NO: 53);
PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Pro-CNP-27(K4,5,9R)](SEQ ID NO: 54);
MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Met-CNP-27(K4,5,9R)](SEQ ID NO: 55);
PEGIK-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEG1K-CNP-27(K4,5,9R)](SEQ ID NO: 56);
PEGIK-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[PEG1K-CNP-27(K4,5,9R, M22N)](SEQ ID NO: 57);
PEG1K-PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEG1K-Pro-CNP-27(K4,5,9R)](SEQ ID NO: 58);
PEG1K-MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEG1K-Met-CNP-27(K4,5,9R)](SEQ ID NO: 59);
PE012-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEO12-CNP-27(K4,5,9R)]
(SEQ ID NO: 60);
PE012-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[PEO12-CNP-27(K4,5,9R, M22N)](SEQ ID NO: 61);
PEO12-PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEO12-Pro-CNP-27(K4,5,9R)](SEQ ID NO: 62);
PEO12-MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEO12-Met-CNP-27(K4,5,9R)](SEQ ID NO: 63);
PEO24-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEO24-CNP-27(K4,5,9R)](SEQ ID NO: 64);
PEO24-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[PEO24-CNP-27(K4,5,9R, M22N)](SEQ ID NO: 65);
PEO24-PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEO24-Pro-CNP-27(K4,5,9R)](SEQ ID NO: 66); 및
PEO24-MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEO24-Met-CNP-27(K4,5,9R)](SEQ ID NO: 67).
제12항에 있어서, 상기 CNP 변이체가 하기로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 방법:
PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37)(SEQ ID NO: 1);
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP-37)(SEQ ID NO: 2);
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP-37(M32N)](SEQ ID NO: 43);
MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP-37)(SEQ ID NO: 45);
PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP-37)(SEQ ID NO: 44);
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC(Gly-CNP-37(M32N))(SEQ ID NO: 46); 및
MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-Gly-CNP-37)(SEQ ID NO: 47)
제1항에 있어서, 상기 골관절염이 1차 골관절염인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 골관절염이 2차 골관절염인, 방법.
제14항에 있어서, 연골 퇴행이 일어난 후 상기 CNP 변이체가 투여되는, 방법.
제15항에 있어서, 관절 손상 또는 외상에 대응하여 상기 CNP 변이체가 투여되는, 방법.
제17항에 있어서, 관절 손상 또는 외상 1개월내에 상기 CNP 변이체가 투여되는, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CNP 변이체를 포함하는 조성물이 관절내 투여되는, 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CNP 변이체를 포함하는 조성물이 피하 투여되는, 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CNP 변이체를 포함하는 조성물이 주 3회, 주 2회, 주 1회, 또는 매 2주에 1회 투여되는, 방법.
제2항 또는 제3항에 있어서, 대상체의 관절에서 연골 성장을 증가시키거나 연골 퇴행을 늦추는 것이 관찰되는, 방법.
제22항에 있어서, 상기 관절은 무릎, 어깨, 팔꿈치, 손가락, 손, 손목, 엉덩이, 목, 척추 및 허리로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 방법.
제2항 또는 제3항에 있어서, 연골 손상 또는 성장은 연골세포 죽음/손실, 프로테오글라이칸(PG) 손실, 또는 콜라겐 손실 또는 피브릴화(fibrillation)에 의해 분석되는, 방법.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CNP 변이체를 포함하는 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 추가로 포함하는, 방법.
제25항에 있어서, 상기 조성물은 약 4 내지 약 6의 pH를 갖는 시트르산/시트레이트 완충액 또는 아세트산/아세테이트 완충액을 포함하는 제형으로부터 제조된 동결건조된 제형인, 방법.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제27항에 있어서, 상기 제2 제제는 항염증제, NSAID, 코르티코스테로이드, 및 히알루론산으로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 방법.
제7항에 있어서, 영향을 받는 관절의 운동 범위는 고관절 굴곡, 고관절 신전, 고관절 외전, 고관절 내전, 슬관절 굴곡, 또는 슬관절 신전 측정에 의해 결정되는, 방법.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 적어도 하나의 연골-관련 바이오마커의 증가된 수준을 갖는 것으로 확인되는, 방법.
제30항에 있어서, 상기 적어도 하나의 연골-관련 바이오마커는 CNP, cGMP, II형 콜라겐의 프로펩타이드 및 그의 단편, II형 콜라겐 및 그의 단편, 오스테오칼신, 증식성 세포핵 항원(PCNA), I형 프로콜라겐의 프로펩타이드(PINP) 및 그의 단편, I형 콜라겐 및 그의 단편, 및 아그레칸 콘드로이틴 설페이트로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 방법.